KR100866925B1 - 경구 파지 디스플레이 방법으로 동정된 소장 상피세포흡수촉진 유도 펩타이드 및 이를 이용한 경구투약 시스템 - Google Patents

Abstract

본 발명은 경구 파지 디스플레이 기법을 통해 동정된 CQPAPGKQC 및 CTADQQRQC의 아미노산 서열을 가지는 펩타이드에 관한 것으로, 전자는 경구 주입 시 소장 점막층에 도달하여 배상 세포와 같은 특정 세포 경로를 통해 파지와 같은 거대 분자 물질의 체내 흡수 효율을 크게 증진 시키고, 후자의 경우에는 경구 주입 시 소장 상피세포 층과 효율적으로 결합할 수 있는 점막 점착성이 높은 펩타이드이다. 또한, 본 발명은 동정된 펩타이드를 단백질계 기능성 물질에 도입하여, 생체막에서의 흡수효율을 획기적으로 증진시킨 효율적인 경구 투약 시스템에 관한 것으로, 단백질 약물의 이용성 확대와 더불어 의학, 약학, 축산 및 수의 분야에 지대한 파급효과를 가져올 수 있다.

경구투약시스템, 소장점막층, 수용체매개물질흡수기전, 트랜스사이토시스, 파지디스플레이, 소장상피세포흡수촉진유도 펩타이드

Description

경구 파지 디스플레이 방법으로 동정된 소장 상피세포 흡수촉진 유도 펩타이드 및 이를 이용한 경구투약 시스템{Enterocyte-Transcytotic peptide identified by the Peroral Pharge Display Process and Peroral drug delivery systems using the same}

도 1은 단백질계 약물의 경구투여 시 문제점을 나타내는 개략도이다.

도 2는 소장 상피세표에서의 FcRn 수용체에 의한 IgG의 트랜스사이토시스 기전을 모식적으로 나타낸 것이다.

도 3은 트랜스사이토시스 기전을 이용한 단백질 약물의 소장 점막층 흡수촉진 유도 개념을 모식적으로 나타낸 것이다.

도 4는 무작위 파지 라이브러리의 개념 및 전형적인 in vitro 파지 디스플레이 과정을 모식적으로 나타낸 것이다.

도 5는 기관 특이적 펩타이드 서열을 탐색하기 위한 in vivo 파지 디스플레이 기법의 개념을 나타낸 것이다.

도 6은 소장 점막층을 효율적으로 통과하는 펩타이드 서열을 탐색하기 위한 “경구 파지 디스플레이”기법의 개념을 모식적으로 나타낸 것이다.

도 7 (a)는 트랜스사이토시스 유도 펩타이드를 도입한 경구용 단백질 약물의 모식적으로 나타낸 것이고, (b)는 트랜스사이토시스에 의한 단백질 약물의 소장 점막층에서의 흡수를 모식적으로 나타낸 것이다.

도 8은 (a)는 본 발명의 경구 파지 디스플레이 과정을 모식적으로 나타낸 것이고, (b)는 경구 파지 디스플레이 방법의 주요 공정을 과정별로 나타낸 것이다.

도 9는 경구 파지 디스플레이 바이오패닝 결과를 나타낸 그래프이다.

도 10은 개별적인 파지의 플라크를 대장균에 감염시켜 개체수를 증폭한 후 펩타이드 서열을 분석하기 위해 파지의 유전체를 정제하는 과정을 모식적으로 나타낸 것이다.

도 11은 (a) 파지의 유전체 중 pIII 단백질을 생산하는 유전자(gIII)의 N- 말단에 7개의 무작위 펩타이드 서열을 삽입하고 발현 시에 이황화결합을 통해 고리형 펩타이드가 될 수 있도록 펩타이드 양쪽에 시스테인 아미노산을 도입한 것을 나타낸 것이고, (b) 본 파지-펩타이드 라이브러리에 사용된 아미노산 합성 유전자 코드를 나타낸 것이다.

도 12는 경구 파지 디스플레이를 통해 선발된 펩타이드 서열에 대한 ClustalX 프로그램을 이용한 서열분석을 나타낸 것이다.

도 13은 유리 작용기 경합 분석의 개념을 나타낸 것이다.

도 14의 (a)는 CQPAPGKQC 펩타이드 서열을 가지는 파지에 대한 유리 작용기 경합 분석을 나타낸 그래프이고, (b)는 CTADQQRQC 펩타이드 서열을 가지는 파지에 대한 유리 작용기 경합 분석을 나타낸 그래프이고, (C)는 CSKSSDYQC 펩타이드 서열을 가지는 파지에 대한 유리 작용기 경합 분석을 나타낸 그래프이다[***: 각 시험 군은 unpaired 2-tailed t-test 결과, 2 ㎍의 펩타이드 처리구에 비해 뚜렷한 통계적 차이를 보여준다(P<0.001)].

도 15는 펩타이드 서열을 포함하는 재조합 파지와 인서트리스 파지 간의 내부 장기에 대한 ex vivo 파지 결합 분석을 나타낸 그래피이다[재조합 파지와 인서트리스 파지 간의 내부 장기에 대한 결합력은 통계적 유의차를 보이지 않았다].

도 16의 (a)는 회장에 파지 클론의 주입 위치를 나타낸 것이고, (b) 래트 회장에 파지를 주입하고 40분 후 간과 지라중의 파지 클론의 적정 농도 분포를 비교한 그래프이다[***: 각 시험군은 unpaired 2-tailed t-test 결과 간과 지라중의 인서트리스 파지 적정 농도 보다 뚜렷한 통계적 유의차를 보여준다(P<0.001). +++: CSKSSDYQC는 CQPAPGKQC에 비해 간과 지라에서 통계적 우의를 나타낸다(간에서 P<0.0001, 지라에서 P=0.003].

도 17은 기존 경구용 고분자 약물 담지체에 본 발명의 소장 점막층 결합 펩타이드를 도입함으로써 기대할 수 있는 체내 약물 흡수 효과에 대한 모식도이다.

본 발명은 소장 상피세포 흡수촉진 유도 펩타이드 및 경구 약물전달 시스템(oral drug delivery system)에 관한 것으로, 보다 상세하게는 경구 파지 디스플레이 기법(peroral phage display technique)을 이용하여 동정한 소장 상피세포 흡 수촉진 유도 펩타이드 및 트랜스사이토시스(transcytosis) 기전을 통해 소장상피세포 층을 효과적으로 통과하도록 상기 소장 상피세포 흡수촉진 유도 펩타이드 작용기를 단백질 약물에 도입한 효율적인 경구 투약 시스템에 관한 것이다.

경구투여는 투약의 용이성과 환자나 대상가축의 복약 순응도를 높일 수 있다는 측면에서 가장 이상적인 투여경로이다. 그럼에도 불구하고 현재까지 경구를 통한 단백질계 약물의 흡수율은 1% 미만으로, 소화장관 통과시의 높은 분해율과, 소장점막에서의 낮은 투과성 등은 아직도 해결하지 못한 난제로 남아있는 실정이다. 최근 생명공학의 비약적인 발전으로 인해 다양한 단백질계 약물이 화학요법을 대체할 차세대 약물로써 개발되고 있는 현 시점에서, 개발된 단백질계 약물의 이용성을 획기적으로 증진시키기 위해서는 무엇보다도 기존의 번거로운 주사방식에 의한 투여를 대체하여 안정적으로 약물을 체내로 이송할 수 있는 효율성 높은 경구 약물전달 시스템(oral drug delivery system)을 개발하는 것이 시급하다고 할 수 있다.

수용체 매개 물질운송 기전(receptor mediated endocytosis)은 특정한 작용기(ligand)를 가진 물질이 세포에 존재하는 수용체 분자와 특이적으로 결합하여 소포체 형태로 세포질 내로 진입하는 과정을 의미한다. 특히 수용체 매개 물질운송 기전 중 하나인 트랜스사이토시스(transcytosis)는 소장 상피세포와 같은 극성세포(polarized cell) 표면에서 수용체와 결합한 특정한 물질이 기능을 유지한 채 세포를 통과하여 혈류까지 도달할 수 있도록 하는 기전으로 소장 상피세포를 통한 효과적인 약물전달 시스템 개발에 응용할 수 있는 높은 잠재력을 가지고 있다.

1. 단백질약물의 현황

인슐린(Insulin), 성장호르몬(Growth hormone), EPO(Erythropoietin) 등의 단백질계 약물은 기존의 화학계 약물에 비해 독성이 적고 강한 효과와 생체 친화적 특성으로 인해 최근 개발이 가속화되고 있는 추세이다. 이러한 단백질계 약물 산업은 21세기 국가 핵심전략산업인 생명공학산업에서 가장 비중이 큰 분야로, 국내 전체 생명공학산업의 약 55%를 차지하고 있고, 향 후 전체 의약품 시장의 10% 이상을 점유할 전망이며, 최근 유전공학, 분자생물학, 생물정보학 등의 비약적인 발전에 힘입어 신 의약품 개발 가능성과 그 성공확률이 매우 높은 산업이다. 세계 단백질계 약물 시장은 2011년도까지 약 885억불의 성장이 예상되며 이에 따라 현재 다국적 기업과 바이오 전문회사의 집중적 연구/개발 투자가 이루어지고 있다 (표 1 참조).

단백질 제제의 국내/외 시장규모 현황과 전망

세계 시장규모 (단위: 억불)				국내 시장규모 (단위: 억원)
년도	의약용 단백질	산업용 단백질	합계	년도	의약용 단백질	산업용 단백질	합계
1997	125	63	188	1997	1,274	1,273	2,547
2000	195	135	330	2000	2,750	1,330	4,080
2001	222	141	363	2001	3,555	1,447	5,002
2006	437	173	610	2006	13,663	2,220	15,883
2011	885	215	1,100	2011	61,800	3,430	65,230

(자료인용: 산업자원부 산업기술개발사업 보고서, 2001)

그러나, 상기와 같은 단백질계 약물은 생체효소에 의해 쉽게 분해 되고 비교적 거대분자(macromolecule)이기 때문에 생체막 투과에 제약을 받는 단점이 있어 이러한 문제점을 극복 할 수 있는 새로운 약물전달 시스템이 요구되고 있다.

2. 단백질약물의 경구투여시 문제점

단백질계 약물의 체내 흡수율을 증진시키기 위한 새로운 약물전달시스템의 개발은 이미 세계적인 이슈로써 다각적인 연구를 통해, 피하삽입형 겔(injectable gel)을 이용한 서방형제제, 비강이나 호흡기를 통한 분무방식(nasal, pulmonary spray), 나노입자(nano-particle), PEG(polyethylene glycol) 등의 고분자 접합, 리포좀(liposome)에 의한 코팅 등의 기법을 통해 단백질계 약물의 체내 흡수율을 높이는 방법 등이 주사 방식을 대체하기 위한 대안으로 제시되고 있다.

한편, 질병 또는 상처의 치료나 건강증진을 목적으로 약물을 투여하는 방법에는 주사, 경구투여, 연고, 패치(patch) 등의 여러 가지 방법이 있는데, 그 중에서 주사 투약방식은 약물의 빠른 효과로 인해 의학 및 동물산업에서 널리 이용되고 있다. 그러나 주사방식은 약물을 정기적으로 투여해야 하는 경우 통증 및 과민반응 등을 야기하기도 하여 환자나 대상 가축에게 많은 스트레스를 주고 번거로운 단점이 있다. 반면에, 경구투약 방식은 거부감이 적고 숙련된 인력이나 주사기, 링거(Ringer's solution)등의 별도의 기구가 필요하지 않기 때문에 가장 편리하고 수용하기 쉬운 경제적인 투약 형태라고 할 수 있다. 그러나 단백질계 약물을 경구투여 할 경우에는 생체의 소화기관을 통과하면서 위산이나 장내에서 분비되는 각종 소화효소의 공격을 받아 대부분 그 활성을 잃게 되며, 비록 그 중 일부가 온전한 형태로 소장 내에 도달하더라도 외부물질을 선택적으로 받아들이는 장 상피세포 층의 효과적인 차단에 의해 체내로 흡수되어 제 기능을 발휘하기는 매우 어렵다. 따라서 현재까지는 이러한 약물의 투약을 여전히 번거로운 주사방식에 의존하고 있다. 위와 같이 경구투여는 투약의 편이성과 환자나 대상가축의 복약 순응도가 높다는 측면에서 가장 이상적인 투여경로임에도 불구하고, 현재까지 경구를 통한 단백질계 약물의 흡수율은 1%미만으로, 소화관 통과시의 불안정성, 낮은 장점막 투과성 등은 아직도 해결하지 못한 난제로 남아있는 실정이다(도 1 참조).

최근 생명공학의 발전으로 인해 다양한 단백질계 약물이 화학요법을 대체할 차세대 약물로써 개발되고 있는 현 시점에서 개발된 단백질계 약물의 이용성을 획기적으로 증진시키기 위해서는 무엇보다도 안정적으로 약물을 체내로 이송할 수 있는 효율성 높은 경구투약시스템을 개발하는 것은 시급한 과제이다.

3. 트랜스사이토시스 ( transcytosis ) 기전

수용체 매개 물질운송 기전(receptor mediated endocytosis)은 특정한 작용기를 가진 물질이 세포에 존재하는 수용체 분자와 특이적인 결합을 통해 소포체 형태로 세포질내로 진입하는 과정을 의미한다. 이러한 기전에는 다양한 세포막 수용체 및 소포체 형성 단백질(클라트린, 아답틴 등) 세포질 내 물질의 분배를 담당하는 다양한 신호전달 단백질(vesicular sorting signal)등이 관여하며, 펩타이드계 호르몬, 성장인자, 면역항체 등의 거대 분자 단백질도 이러한 기전을 통해 분해되지 않은 형태로 세포 내로의 운송이 가능하다. 특히 이러한 수용체 매개 물질운송 기전 중 하나인 트랜스사이토시스(transcytosis)는 소장 상피세포와 같은 극성세포 표면에서 수용체와 결합한 특정한 물질이 기능을 유지한 채 세포를 통과하여 혈류까지 도달할 수 있도록 하는 기전으로 소장 상피세포를 통한 효과적인 약물전달 시스템 개발에 응용할 수 있는 높은 잠재력을 가지고 있다 (Okamoto CT. Endocytosis and transcytosis. Advanced Drug Delivery Reviews. 29:215-228, 1998)(도 2). 즉, 목적하는 약물의 체내 흡수를 증진시키기 위해 트랜스사이토시스를 유도하는 작용기를 화학적 접합이나 유전자 재조합 기술 등으로 약물과 결합시키는 방안을 생각해 볼 수 있다. 현재까지 소장에서 트랜스사이토시스 되는 것으로 알려진 물질은 IgG(immunoglobulin G), 락토페린(lactoferrin), 트랜스페린(transferrin) 등의 단백질과 엽산, 리보플라빈(riboflavin)과 같은 비타민 B군 등이 있는데, 실제로 인슐린에 트랜스페린을 화학적 접합으로 결합시킨 화합물을 당뇨병을 유도시킨 마우스(mouse)에 경구투여 한 결과 혈중 글루코스의 농도를 28% 감소시킨 예가 보고된 바 있으며(Wang J, Shen D, Shen WC. Oral delivery of an insulin-transferrin conjugate in streptozotocin-treated CF/1 mice. Pharmaceutical Research . 14:469-474. 1997), 비타민 B₁₂와 결합시킨 다양한 호르몬, 사이토카인(cytokine) 등이 소장상피세포 층을 통과하는 것을 확인한 바 있다 (Swaan P. Recent advances in intestinal macromolecular drug delivery via receptor-mediated transport pathways. Pharmaceutical Research . 15:826-834. 1998)(도 3).

그러나 기존의 트랜스사이토시스를 유도하는 것으로 알려진 물질을 특정 기능성 단백질 약물에 도입하여 소장 점막층에서의 흡수율을 증진 시키는 전략에는 몇 가지 고려해야 할 문제점이 있다.

첫째, 약물 효과의 감소에 대한 문제로, 기존의 트랜스사이토시스를 유도하는 것으로 알려진 물질을 체내로 흡수시키고자 하는 단백질 약물에 도입할 경우 약물의 구조변화에 따른 기능저하가 초래될 수 있다. 이러한 문제는 단백질과 단백질의 유전자 재조합을 통해 단일 사슬로 약물을 제조할 경우 흔히 나타날 수 있는데, 흡수효율 증진을 위해 도입한 물질 또한 고분자일 경우 이들에 의해 약물 고유의 기능이 차폐(masking)되거나 단백질 생산과정에서 활성화되지 않아(misfolding) 불활성 단백질화 되는 경우이다. 이러한 문제를 해결하기 위해서는 흡수효율 증진을 위해 도입되는 물질이 약물 단백질과 단일 사슬로 생산되더라도 약물의 구조나 기능을 방해하지 않는 수준의 저분자 물질이어야만 한다.

다음으로는 운송효율의 문제인데, 이는 소장 점막층에서 특정 물질의 트랜스사이토시스에 관여하는 수용체의 발현양과 관계가 있다. 약물전달에 있어서 중요한 관건은 흡수가 가능한지 불가능한지의 여부에서 한 단계 더 나아가 얼마나 효율적으로 흡수가 되는가에 있으므로 트랜스사이토시스를 유도하는 것으로 이미 알려져 있는 물질이라도 소장 점막층에 수용체의 발현양이 저조하여 흡수효율이 떨어진다면 약물 전달 파트너로써의 의미가 퇴색될 수 밖에 없다. 따라서 기존의 트랜스사이토시스를 유도하는 것으로 알려진 물질 중에 어떤 것이 약물-결합 파트너(drug-conjugation partner)로써의 최적의 선택일 것인가에 대한 추가검증이 불가피해 진다. 그러나 기존에 알려진 각각의 물질에 대해 일일이 소장 점막층에서의 흡수효율을 비교하여 우열을 가리는 것은 매우 어려운 일이기 때문에 이를 극복하기 위해서는 소장 점막층에서 효율적으로 트랜스사이토시스를 유도하는 수용체를 표적하는 물질을 빠르고 효과적으로 탐색할 수 있는 새로운 연구기법을 정립해야 할 필요가 있다.

4. 파지 디스플레이 기법( phage display technique )

단백질과 단백질간의 상호작용(protein-protein interaction)을 탐색하는 기술에는 여러 가지가 있는데, 그 중 파지 디스플레이(phage display)는 박테리아(bacteria)에 특이적으로 감염하는 기생체인 박테리오파지(bacteriophage)의 유전자에 인위적으로 다양한 아미노산 서열을 생산하는 유전자를 도입하여 생산한 재조합 박테리오파지를 이용해 특정 단백질과 결합능력이 있는 미지의 아미노산 서열을 선발하는 기술로써, 항원 결정기의 동정(epitope mapping), 백신 개발, 작용기-수용체 결합능력 확인(ligand-receptor affinity research), 생리활성 펩타이드 선발 등 다양한 분야에서 그 활용성이 검증되어 있다(Smith GP, Scott JK. Libraries of peptides and proteins displayed on filamentous phage. Methods Enzymol . 279:377-380. 1993). 대표적으로 쓰이는 M13 파지 디스플레이 시스템의 경우에는 M13 박테리오파지의 게놈중에서 코트 단백질(coat protein)의 일종인 pIII 또는 pVIII를 생산하는 유전자 말단에 7 ~ 15개의 무작위 아미노산 서열의 펩타이드가 발현되도록 인위적으로 유전자 서열을 삽입한 후, 대장균(E. coli)에 감염시켜 얻은 수억 종 이상의 서로 다른 펩타이드를 발현한 재조합 박테리오파지를 이용해 바이오패닝(biopanning)이라는 일련의 과정을 거쳐 특정 단백질과 강한 결합능력을 보이는 파지를 선발하도록 고안되어 있다. 이렇게 선발된 박테리오파지로부터 게놈 DNA를 추출해 인위적으로 삽입했던 특정 펩타이드를 발현하는 DNA 염기서열을 분석하면 목적하는 작용기 펩타이드를 얻을 수 있게 된다(도 4).

5. 파지 디스플레이 기술을 이용한 조직 특이적 결합 펩타이드의 탐색

한편, 이러한 파지 디스플레이 기술을 이용하면 조직이나 기관 특이적으로 결합하는 펩타이드 서열(organ homing peptide)의 동정도 가능하다. 생체의 각 조직이나 기관도 모세혈관으로부터 기능유지에 필요한 다양한 물질을 수용체 매개 물질 운송 기전(receptor -mediated endocytosis)을 통해 공급받고 있기 때문에 이들 모세혈관 내막에는 각 조직이나 기관 특이적인 다양한 수용체 분자들이 발현되어 있다. 따라서 이러한 수용체와 결합할 수 있는 작용기를 찾아서 특정 약물에 도입할 수 있다면 조직이나 기관에 특이적으로 작용하는 약물의 개발이 가능해진다 (Kolonin M, Pasqualini R, Arap W. Molecular addresses in blood vessels as targets for therapy. Current Opinion in Chemical Biology . 5:308-313. 2001).

이러한 배경을 바탕으로 Pasqualini 등은 마우스(mouse)를 이용한 in vivo 파지 디스플레이 기술을 새롭게 고안하여 특정 기관에 특이적으로 결합하는 펩타이드 서열을 대량으로 동정하는데 성공하였고 (Pasqualini R, Ruoslahti E. Organ targeting in vivo using phage display peptide libraries. Nature . 380:364-366. 1996; Rajotte D, Arap W, Hagedorn M, Koivunen E, Pasqualini R, Ruoslahti E. Molecular heterogeneity of the vascular endothelium revealed by in vivo phage display. J. Clin . Invest . 102:430-437. 1998), 이러한 조직 특이적 펩타이드 모티프를 항암제에 도입할 경우 암세포 특이적인 약효가 있음이 보고되기도 하였다 (Arap W, Pasqualini R, Ruoslahti E. Treatment by targeted drug delivery to tumor vasculature in a mouse model. Science . 279:377-380. 1998). 마우스를 이용한 특정 기관 표적형 펩타이드를 선발하기 위한 In vivo 파지 디스플레이 기술의 개념은 첨부한 도 5와 같다.

전술한 바와 같이 Pasqualini 등은 파지 라이브러리를 생쥐의 혈관을 통해 주입한 후 일정시간 동안 혈류를 통해 순환시킨 다음, 적출된 각 기관으로부터 결합되어 있는 파지를 동정하고 그들이 가지고 있는 펩타이드 서열을 분석해 각각의 기관에 특이적으로 결합하는 펩타이드 서열을 선발하였다. 소장 상피조직도 하나의 기관이라고 볼 때, 파지 디스플레이 기법을 응용하면 장점막에 특이적으로 결합한 뒤 트랜스사이토시스 되는 펩타이드 서열도 찾을 수 있을 것으로 예상할 수 있다. 예를 들어, 파지 라이브러리를 쥐에게 경구주입한 후 일정시간 동안 정치한 다음 혈액 및 체내 기관을 채취 했을 때, 만약 경구 주입한 파지의 일부가 혈액이나 체내 기관 내에서 동정이 된다면 이러한 파지는 소장 점막층을 통과한 것으로 그들이 가지고 있는 펩타이드 서열은 장점막에 특이적으로 결합하여 트랜스사이토시스 되는 펩타이드일 가능성이 높을 것이다. 따라서 이러한 펩타이드 서열을 특정 단백질계 약물에 도입하게 되면 펩타이드의 트랜스사이토시스 능력에 의해 장점막에서의 흡수효율이 증진될 것으로 예측할 수 있다.

이와 같이 본 발명은 전술한 단백질계 약물의 경구투여 시 야기되는 문제점을 해결하기 위해, (1) 기존의 파지 디스플레이 기법을 응용한 경구 파지 디스플레이 기법(peroral phage display technique)을 고안하여 그 기술적인 조건을 최적화 하고, (2) 확립된 기법을 이용해 트랜스사이토시스(transcytosis) 기전을 통해 소장상피세포 층을 효과적으로 통과하는 펩타이드 작용기(peptide ligand)를 탐색한 후, (3) 이들의 특성을 다각적인 방법을 통해 규명함으로써 향후 이러한 표적형 펩타이드 작용기를 특정 단백질 약물에 도입한 효율적인 경구 약물전달 시스템의 기반을 구축 하는 데에 있다.

본 발명은 경구 파지 디스플레이 방법을 이용하여 동정한 소장 상피세포 흡수촉진 유도 펩타이드에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 상기의 소장 상피세포 흡수촉진 펩타이드를 단백질계 약물에 도입시킨 경구 투약 시스템에 관한 것이다.

이하, 바람직한 실시형태에 따라 본 발명을 상세하게 설명한다. 하지만 이로부터 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다.

1. 파지 디스플레이 펩타이드 라이브러리( Phage display peptide library )

본 발명에서 사용된 파지 디스플레이 펩타이드 라이브러리는 “ph.D.-C7C^TM (New England BioLab.)”으로, 이는 M13 박테리오파지의 게놈중에서 코트 단백질(coat protein)의 일종인 pIII를 생산하는 유전자 말단에 7개의 무작위 아미노산 서열의 펩타이드가 발현되도록 인위적으로 유전자 서열을 삽입한 후, 대장균(E.coli)에 감염시켜 얻은 수억 종 이상의 서로 다른 펩타이드를 발현한 재조합 박테리오파지로 구성되어 있다.

한편, M13 파지에 도입되어 있는 7개의 무작위 아미노산 서열은 양쪽에 시스테인(cysteine) 잔기를 보유하도록 설계되어, 펩타이드 발현시 자연적으로 이황화 결합(disulfide bond)을 형성함으로써 고리모양(loop shape)을 이루도록 하여 목적 단백질과 더욱 강한 결합을 유도할 수 있게 고안되어 있다[도 4(a)].

2. 경구 파지 디스플레이( Peroral phage display ) 기법

기존의 in vitro 파지 디스플레이와 in vivo 파지 디스플레이 연구기법을 응용하여 소장 점막층에서 트랜스사이토시스 된 후 각 장기조직으로 분포되는 펩타이드 작용기를 효과적으로 탐색하는 “경구 파지 디스플레이 기법”의 공정을 확립하고 이를 이용해 실제 파지-펩타이드 라이브러리를 래트에 경구주입 한 후 각 장기조직에 분포하는 재조합 파지를 동정함으로써 확립된 실험기법의 효용성을 검정하였다.

경구 파지 디스플레이 기법은 1.2× 10¹² pfu의 파지-펩타이드 라이브러리 (개별 재조합 파지 클론 약 1,000 카피) 또는 말단에 펩타이드를 가지고 있지 않는 인서트리스 파지(insertless phage) (야생형: 음성 대조구)를 절식(overnight)시킨 래트에 경구주입 한 후, 1시간 뒤에 대표적인 내부 장기 조직(간, 폐, 콩팥, 지라)을 적출하여 소장 점막층을 통과한 뒤 혈류를 따라 각 장기로 분포한 파지를 회수하여 정량하는 순서로 이루어져 있다. 이러한 과정을 수차례 반복 수행(round of biopanning)한 다음 높은 효율로 체내로 유입되는 파지 개체군이 어떠한 펩타이드 서열을 가지고 있는지에 대해 파지 게놈에 대한 염기서열을 분석함으로써 소장 점막층에서 트랜스사이토시스를 효과적으로 유도하는 펩타이드 작용기를 동정하였다.

본 발명에서 사용한 경구 파지 디스플레이 기법의 구체적인 과정과 실험 조건은 도 8 및 표 2에 나타내었다.

경구 파지 디스플레이 기법 최적 조건

대상	Spargue-Dawley 래트(12주, 350g, 수컷)
파지 펩타이드 라이브러리 유형	PhD-C7CTM 파지 디스플레이 펩타이드 라이브러리(NEB)
라이브러리 변위	1.2×109
라이브러리 투여량	1.2× 1012 pfu/PBS 500ul(각 서열의 약 1,000 카피)
유지시간	1 시간
혈액 관주 조건	헤파린-첨가 DMEM(12mh/h)를 좌측 용기에 첨가, 우심방 조각 배양 헤파린 첨가 DMEM을 12ml/h의 속도로 좌심실에 주입한 후 우심방을 절개하여 방혈
조직 세척 조건	조직 절단 후 PBS 완충용액으로 냉각(30ml 3회) 조직 세절 후 냉각된 PBS 완충용액으로 조직 세척 (30ml, 3회)
파지 용리 조건	조직-균질화 후 산성 용리 (1.0M 글리신 2ml, 8분 간 원심분리, 2M 트리스-염기 55-60 ul를 이용하여 중화)
적용 기관 및 조직	간, 폐, 심장, 콩팥, 지라 및 혈액

3. 확립된 경구 파지 디스플레이 기법에 의한 바이오패닝

확립된 경구 파지 디스플레이 기법을 이용하여 총 4 회에 걸쳐 순차적인 바이오패닝을 실시하여 각각의 회에서 소장 점막층을 통과 한 후 4개의 대표적 내부 기관(간, 폐, 콩팥, 지라)에 분포한 파지를 정량하였다. 각 회는 총 4 마리의 서로 다른 래트를 이용한 독립적인 실험으로 구성되어 있으므로 각 회의 파지 역가는 4번의 반복실험을 통해 얻어진 결과의 평균 값을 나타낸다.

일반적으로 파지 디스플레이 기법을 통한 바이오패닝을 실시할 경우 목적하는 타깃과 강한 결합능력(binding affinity)을 가지는 파지 개체수가 횟수를 거듭할수록 증가하기 때문에 횟수에 따른 파지 역가의 증가 현상은 파지 디스플레이 실험에 있어서 실험이 의도한 방향으로 진행되고 있는지를 판가름하는 가장 기본적인 파라미터라고 할 수 있다.

도 9에 나타난 바와 같이, 그러한 현상은 본 발명을 통해서도 확인 할 수 있었는데, 확립된 경구 파지 디스플레이 기법에 의해 바이오패닝을 실시한 결과, 횟수를 거듭할수록 각 내부 장기에서 회수한 파지의 적정농도(titer)가 3회 차까지 급격히 증가하는 양상을 보였다. 1회 차에 비해 3회 차의 파지 적정농도는 기관에 따라 약 100배에서 1,000배 증가하였으며, 말단에 펩타이드 서열을 포함하지 않는 인서트리스 파지의 경우에는 1회 차에 비해서도 낮은 적정농도를 보였다.

바이오패닝의 횟수를 거듭함에 따라 각 기관에 분포하는 파지의 수가 증가하는 이유는 소장 점막층을 효율적으로 통과할 수 있는 펩타이드 서열을 가진 파지의 비율이 회차의 진행에 따라 점차 증가하기 때문인 것으로 추정할 수 있었다.

4. 펩타이드 서열의 동정

경구 파지 디스플레이 바이오패닝 과정을 통해 소장 점막층을 통과하여 각 내부 장기로 분포되는 파지의 적정농도가 3회 차에서 가장 높은 수준을 보였기 때문에 3회 차 바이오패닝 과정에서 회수한 파지 개체군을 아가 플레이트(agar plate)에 도말한 후 각각의 개별적인 파지 플라크를 취해 게놈 DNA(genomic DNA)를 추출하고 염기서열을 분석함으로써 각각 어떠한 펩타이드 서열을 보유하고 있는지를 동정하였다(도 10 및 11).

간, 폐, 콩팥 및 지라에서 각각 회수한 파지 개체군에서 총 850개(각 기관 당 200여개)의 펩타이드 서열을 동정한 결과,“CQPAPGKQC”의 아미노산 서열을 가진 펩타이드가 간에서 3번, 폐, 콩팥 및 지라에서 각각 2번, 도합 9번의 출현 빈도수를 보이는 것을 확인할 수 있었고, "CTADQQRQC"의 아미노산 서열을 가진 펩타이드는 간에서 1번, 폐 및 지라에서 3번, 콩팥에서 2번, 도합 9번의 출현 빈도수를 보이는 것을 확인할 수 있었다. 3회 차에서 각 내부 기관에 분포한 파지의 역가가 10⁶~10⁷(pfu/조직g) 수준인 것을 감안할 때 이러한 거대 모집단에서 850개의 표본추출을 통해 9번의 출현 빈도수를 보였다는 것은 모집단 내에 이러한 펩타이드 서열을 가진 파지의 비율이 매우 높다는 것으로 해석할 수 있으며 이러한 펩타이드 서열은 소장 점막층에서의 흡수를 효과적으로 유도할 수 있는 잠재력이 매우 높을 것으로 추정할 수 있었다.

5. " CQPAPGKQC ”및 " CTADQQRQC " 서열에 대한 소장 점막층 흡수효율 검정

경구 파지 디스플레이 기법을 이용하여 파지 디스플레이 펩타이드 라이브러리를 래트에 경구주입 한 후 소장 점막층을 통과하는 파지로부터 동정한 "CQPAPGKQC”및 "CTADQQRQC" 펩타이드 서열에 대해 실제 소장 점막층에서의 효과적인 흡수 여부, 흡수될 경우 특정 흡수경로의 존재 가능성을 검정하기 위하여 다음과 같은 실험을 수행하였다.

(1) Ex - vivo 파지 결합 분석 및 유리 작용기 경합 분석

특정 물질이 경구적으로 투여된 후 소장 점막층에서 특정 수용체에 의한 ‘수용체 매개 물질 운송 기전 (receptor-mediated endocytosis or transcytois)’을 통하여 체내로 흡수되기 위해서는 우선 소장 점막층의 특정 수용체에 특이적으로 결합하여야 한다. 따라서 본 실험에서는 래트(Sprague-Dawley, male, 350g)의 소장 점막 조직을 추출하여 "CQPAPGKQC”및 "CTADQQRQC" 펩타이드 서열을 말단에 보유하고 있는 파지와 인서트리스 파지(야생형) 간의 소장 점막 조직에 대한 결합력 차이를 비교하였다. 아울러 합성된 "CQPAPGKQC”및 "CTADQQRQC" 펩타이드의 첨가 유무에 따른 결합력의 변화를 관찰하였다. 만약 이러한 결합이 실제 수용체의 매개에 의해 이루어지는 것이라면 유리 작용기 (유리 작용기: 합성 "CQPAPGKQC”또는 "CTADQQRQC" 작용기)의 첨가량이 증가할수록 첨가된 합성 CSKSSDYQC 펩타이드와 CSKSSDYQC-파지 간의 수용체에 대한 경합(competition)으로 인해 소장 점막층과 결합하는 파지의 적정 농도가 감소하게 된다 (도 12). 따라서 이러한 경합 유무는 이러한 결합이 수용체 매개에 의한 것인지에 대한 간접적인 증거가 될 수 있다. 한편, 소장 점막층을 통과하여 체내로 유입된 각각의 파지가 특정 장기 조직과의 결합력이 있는지 여부를 살펴보기 위해 간, 폐, 콩팥 및 지라의 조직을 적출하여 이들 조직에 대한 결합력 차이도 비교하였다.

그 결과, "CQPAPGKQC”및 "CTADQQRQC" 서열를 보유한 파지의 경우 래트의 소장 점막조직에 대한 결합능력이 인서트리스 파지에 비해 유의적으로 높은 수준을 보였고, 합성 "CQPAPGKQC” 펩타이드를 첨가하였을 때 CQPAPGKQC-파지는 소장 점막층에 결합한 파지의 적정 농도가 펩타이드의 첨가량이 증가 할수록 감소한 반면, 인서트리스 파지의 경우에는 적정 농도의 변화를 보이지 않았다. 이를 통해 CQPAPGKQC는 래트의 소장 점막조직에서 미지의 특정 수용체(receptor)를 매개로 하여 특이적으로 결합하는 것으로 추론할 수 있었다 [도 14 (a)].

CTADQQRQC 서열을 보유한 파지의 경우에도 래트의 소장 점막조직에 대한 결합능력은 인서트리스 파지에 비해 유의적으로 높은 수준을 보였지만, 인서트리스 파지와 마찬가지로 합성 CTADQQRQC 펩타이드의 첨가 수준에 따른 경합 (competition) 양상은 나타나지 않았다. 이로써 CTADQQRQC이 래트의 소장 점막조직에서 높은 수준으로 결합하는 능력은 특정 수용체를 매개로 하는 결합이 아닌 또 다른 기전을 통해 얻어지는 것으로 예상되었다 [도 14 (b)].

CQPAPGKQC 또는 CTADQQRQC 펩타이드 서열을 가지는 파지와 인서트리스 파지의 유일한 차이는 파지 말단의 펩타이드 서열의 유무이므로 이러한 두 파지 군간의 소장 점막층에서의 결합능력의 차이는 바로 각각의 재조합 파지에 도입된 펩타이드 서열에서 비롯되는 것으로 추정할 수 있었다.

한편, 내부 장기(간, 폐, 콩팥, 지라)에 대한 결합력은 펩타이드를 보유한 재조합 파지와 인서트리스 파지 간에 유의적인 차이를 볼 수 없었다 (도 15).

이러한 결과로 미루어 볼 때 CQPAPGKQC 와 CTADQQRQC 펩타이드는 소장 점막층에는 특이적으로 결합하는 능력을 보유하고 있지만 체내의 특정 장기를 표적하는 특성을 가지고 있지는 않다는 사실을 확인할 수 있었다. 이러한 결과는 경구 파지 디스플레이를 통해 선발된 높은 출현 빈도수를 보이는 이들 펩타이드 서열들이 특정 장기에서 편향되어 출현한 것이 아니라 분석대상이었던 4개의 내부 장기(간, 폐, 콩팥, 지라)에서 골고루 출현했었다는 사실과도 부합되고 있음을 알 수 있다 (도 12).

(2) 소장 점막층 -통과 파지의 In - vivo 트랙킹

특정 펩타이드 작용기(peptide ligand)가 소장 점막층에 효과적으로 결합한다고 해서 반드시 소장 점막층을 효율적으로 통과할 것으로 결론을 내리는 것은 지나친 논리적 비약이라고 할 수 있다. 따라서 본 실험에서는 절식시킨 래트(Sprague-Dawley, male, 350g)를 개복한 후, 소장(회장 부분)의 장관 내부(intestinal lumen)에 CQPAPGKQC 및 CTADQQRQC 펩타이드 서열을 발현하는 파지와 인서트리스 파지를 각각 2.0x10¹¹ pfu/500㎕ 수준으로 주입한 다음 40분 뒤에 대표적인 내부 장기인 간과 지라를 적출하여 소장 점막층을 통과하여 혈류를 따라 내부 장기로 유입되는 파지를 정량하였다[도 16 (a)]. 그 결과 CQPAPGKQC 펩타이드 서열을 말단에 보유한 파지는 인서트리스 파지에 비해 간과 지라 모두에서 약 100배 높은 체내 유입 효율을 가지는 것으로 확인되었다 ('CSKSSDYQC' 서열의 경우 1,000배의 높은 효율, 특허출원번호: 2006-47714). 그러나 CTADQQRQC 펩타이드 서열을 가지는 파지의 경우에는 소장 점막층에서의 높은 결합효율[도 14 (b)]에도 불구하고 펩타이드를 가지지 않는 인서트리스 파지와 유사한 체내 유입 정도를 나타내었다 [도 16 (b)].

이상의 결과로 경구 파지 디스플레이 기법을 이용하여 선발한 CQPAPGKQC 및 CTADQQRQC 펩타이드 중에서 CQPAPGKQC는 소장 점막층에서 고분자 물질(M13 파지의 경우 16MDa의 고분자)의 체내 흡수효율을 크게 증진 시키는 효과를 나타내는 것을 확인할 수 있었고, CTADQQRQC의 경우는 소장 점막층에서 고분자 물질의 체내 흡수율을 증진 시키지는 못하지만 소장 점막층에서의 점착효과가 높은 것을 알 수 있었다.

7. 경구 투약 시스템

상기에서 경구 파지 디스플레이 기법에 의해 선발된 소장 점막층에서 효과적으로 트랜스사이토시스를 유도하는 펩타이드 서열을 단백질계 약물과 유전자 재조합 기법으로 하나의 유전자로 접합시켜 단백질 발현 숙주세포를 통해 단일사슬의 재조합 단백질 약물로 생산할 수 있다.

선발된 펩타이드 중에서 CQPAPGKQC의 아미노산 서열을 가지는 펩타이드는 소장 점막층에서 파지 입자와 고분자 복합체를 체내로 이송 시키는 효율을 크게 증진시킬 수 있는 것으로 확인되었다. 이러한 펩타이드를 현재까지 주사에 의한 투여방법에 의존하고 있는 인슐린, GH, 등의 호르몬, 인터페론, 인터류킨 등의 사이토카인 및 생리활성을 조절하는 각종 효소 등, 기존의 단백질계 기능성 물질에 도입하여 생체막에서의 흡수효율을 획기적으로 증진시킨 효율적인 경구투약 시스템이 확립될 경우 단백질 약물의 이용성 확대와 더불어 의학, 약학, 축산 및 수의 분야에 지대한 파급효과를 예상할 수 있다 (도 7 참조).

한편, 본 연구를 통해 선발된 또 하나의 펩타이드인 CTADQQRQC의 경우에는 소장 점막층에서 고분자 물질의 체내 흡수율을 증진 시키지는 못하지만 소장 점막층에 높은 점착효과를 나타내는 것으로 나타났다. 현재까지 경구용 약물 전달에 이용하는 고분자 담지체 [예: PLA (poly lactic acid), PGA (poly glycolic acid), PLA-PGA 공중합체]의 경우에는 생체 적합성이 우수하여 면역반응 유발 등의 부작용이 적은 반면, 약물의 방출을 단지 이들 고분자 담지체의 소화장관 내에서의 생분해 속도에만 의존하기 때문에 체외로 배설되기까지 소장 점막층을 통해 전달할 수 있는 유효 약물의 양이 제한적인 측면이 있었다. 따라서 소장 점막층에 특이적으로 결합하는 능력을 지닌 CTADQQRQC와 같은 펩타이드를 기존의 경구용 약물 전달에 이용되는 고분자 담지체에 도입하게 되면 약물 전달체의 소장 내 체류시간을 연장함으로써 소장 점막층으로의 약물 흡수효율을 크게 증진 시킬 수 있을 것으로 기대된다 (도 17 참조).

본 발명에서는 경구 파지 디스플레이 기법을 통해 소장 점막층을 통해 효과적으로 체내로 흡수되는 펩타이드 서열을 선발하고 그 특성을 규명하였다. 선발된 펩타이드 중에서 CQPAPGKQC의 아미노산 서열을 가지는 펩타이드는 경구 주입 시 소장 점막층에 도달하여 파지와 같은 거대 분자 물질의 체내 흡수 효율을 크게 증진 시키는 것으로 확인되었고, CTADQQRQC의 아미노산 서열을 가지는 펩타이드는 경구 주입 시 소장 상피세포 층과 효율적으로 결합할 수 있는 점막 점착성이 우수한 것으로 확인되었다. 또한, 본 발명에서는 선발된 펩타이드를 단백질계 기능성 물질에 도입하여, 생체막에서의 흡수효율을 획기적으로 증진시킨 효율적인 경구 투약 시스템을 설계하여 단백질 약물의 이용성 확대와 더불어 의학, 약학, 축산 및 수의 분야에 지대한 파급효과를 가져올 수 있다.

Claims (3)

1. CQPAPGKQC의 아미노산 서열을 갖는 것인 소장 상피세포 흡수촉진 유도 펩타이드.
2. CTADQQRQC의 아미노산 서열을 갖는 것인 소장 점막 점착성 펩타이드.
3. 삭제

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