본 발명은 1) 파지-펩타이드 라이브러리를 형성시키는 단계; 2) 파지-펩타이드 라이브러리를 래트에 경구 주입하는 단계; 3) 상기 래트를 혈액관주시키는 단계; 4) 관주종료 후 래트로부터 장기를 적출하여 조직 샘플을 채취하여 세척하고 균질화시키고 중화시킨 후 적정하는 단계; 5) 상기 샘플로부터 파지를 정량하는 단계; 및 상기에서 분리한 파지를 적정하여 파지 DNA를 분리해내고, DNA의 염기서열을 분석하여 펩타이드 작용기를 동정하는 단계로 구성되는 파지 디스플레이 방법에 있어서, 상기 2) 내지 3)의 단계를 3회 이상 반복하여 바이오패닝을 실시하고, 바이오패닝 후 소장 점막층을 통과하여 들어오는 파지를 간, 폐, 콩팥, 지라와 같은 다수의 조직 및 기관에서 동정하며, 상기 단계 4)의 균질화과정 후 산성 용리과정을 추가하여 소장 점막층 통과 후 특정 조직에 특이적으로 결합하는 기관 표적형 펩타이드를 동정할 수 있도록 한 것을 특징으로 하는 경구 파지 디스플레이 방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기의 경구 파지 디스플레이 방법을 이용하여 동정한 소장 상피세포 흡수촉진 유도 펩타이드에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기의 소장 상피세포 흡수촉진 펩타이드를 단백질계 약물에 도입시킨 경구 투약 시스템에 관한 것이다.
이하, 바람직한 실시형태에 따라 본 발명을 상세하게 설명한다. 하지만 이로부터 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다.
1. 파지 디스플레이
펩타이드
라이브러리(
Phage
display
peptide
library
)
본 발명에서 사용된 파지 디스플레이 펩타이드 라이브러리는 “ph.D.-C7CTM (New England BioLab.)”으로, 이는 M13 박테리오파지의 게놈중에서 코트 단백질(coat protein)의 일종인 pIII를 생산하는 유전자 말단에 7개의 무작위 아미노산 서열의 펩타이드가 발현되도록 인위적으로 유전자 서열을 삽입한 후, 대장균(E.coli)에 감염시켜 얻은 수억 종 이상의 서로 다른 펩타이드를 발현한 재조합 박테리오파지로 구성되어 있다.
한편, M13 파지에 도입되어 있는 7개의 무작위 아미노산 서열은 양쪽에 시스테인(cysteine) 잔기를 보유하도록 설계되어, 펩타이드 발현시 자연적으로 이황화 결합(disulfide bond)을 형성함으로써 고리모양(loop shape)을 이루도록 하여 목적 단백질과 더욱 강한 결합을 유도할 수 있게 고안되어 있다[도 4(a)].
2. 경구 파지 디스플레이(
Peroral
phage
display
) 기법의 확립
기존의 in vitro 파지 디스플레이와 in vivo 파지 디스플레이 연구기법을 응용하여 소장 점막층에서 트랜스사이토시스 된 후 각 장기조직으로 분포되는 펩타이드 작용기를 효과적으로 탐색하는 “경구 파지 디스플레이 기법”의 공정을 확립하고 이를 이용해 실제 파지-펩타이드 라이브러리를 래트에 경구주입 한 후 각 장기조직에 분포하는 재조합 파지를 동정함으로써 확립된 실험기법의 효용성을 검정하였다.
경구 파지 디스플레이 기법은 1.2× 1012 pfu의 파지-펩타이드 라이브러리 (개별 재조합 파지 클론 약 1,000 카피) 또는 말단에 펩타이드를 가지고 있지 않는 인서트리스 파지(insertless phage) (야생형: 음성 대조구)를 절식(overnight)시킨 래트에 경구주입 한 후, 1시간 뒤에 대표적인 내부 장기 조직(간, 폐, 콩팥, 지라)을 적출하여 소장 점막층을 통과한 뒤 혈류를 따라 각 장기로 분포한 파지를 회수하여 정량하는 순서로 이루어져 있다. 이러한 과정을 수차례 반복 수행(round of biopanning)한 다음 높은 효율로 체내로 유입되는 파지 개체군이 어떠한 펩타이드 서열을 가지고 있는지에 대해 파지 게놈에 대한 염기서열을 분석함으로써 소장 점막층에서 트랜스사이토시스를 효과적으로 유도하는 펩타이드 작용기를 동정하였다.
본 발명에서 확립한 경구 파지 디스플레이 기법의 구체적인 과정과 실험 조건은 도 8 및 표 2에 나타내었다.
본 발명에서 확립한 경구 파지 디스플레이 기법 최적 조건
대상 |
Spargue-Dawley 래트(12주, 350g, 수컷) |
파지 펩타이드 라이브러리 유형 |
PhD-C7CTM 파지 디스플레이 펩타이드 라이브러리(NEB) |
라이브러리 변위 |
1.2×109 |
라이브러리 투여량 |
1.2× 1012 pfu/PBS 500ul(각 서열의 약 1,000 카피) |
유지시간 |
1 시간 |
혈액 관주 조건 |
헤파린-첨가 DMEM(12mh/h)를 좌측 용기에 첨가, 우심방 조각 배양 헤파린 첨가 DMEM을 12ml/h의 속도로 좌심실에 주입한 후 우심방을 절개하여 방혈 |
조직 세척 조건 |
조직 절단 후 PBS 완충용액으로 냉각(30ml 3회) 조직 세절 후 냉각된 PBS 완충용액으로 조직 세척 (30ml, 3회) |
파지 용리 조건 |
조직-균질화 후 산성 용리 (1.0M 글리신 2ml, 8분 간 원심분리, 2M 트리스-염기 55-60 ul를 이용하여 중화) |
적용 기관 및 조직 |
간, 폐, 심장, 콩팥, 지라 및 혈액 |
1) 목 적
파지 펩타이드 라이브러리를 경구주입 하여 장 상피세포를 통과하여 혈류 중 또는 각 장기로 유입된 파지로부터 엔테로사이트-트랜스사이토틱 펩타이드(enterocyte-transcytotic peptide)와 기관-귀소 펩타이드(organ-homing peptide)를 동정한다.
2) 기구 및 시약
1. 래트 : 스프라귀-다우리(Sprague-Dawley), 수컷, 12주령, 350g
2. 마취제: 럼푼, 케이란 (케타라) & 헤파린
3. 주사기 (1ml, 3ml, 5ml, 50ml 등), 경구주입기(Oral Zonde, 플라스틱류)
4. 그래비티 퍼퓨젼 시스템(Gravity Perfusion system) - 50ml 주사기, 3웨이 코크(3way cock), 링거용 튜브관
5. 수술도구 (각 조직당 메스, 핀셋, 가위, 고정핀, 수술대 등)
6. 균화기(Homogenizer)
7. 관주 용액(Perfusion sol.) (DMEM 500ml + 헤파린 5ml)
8. 조직 현탁 용액(Tissue suspension sol) 40ml
[BSA 0.4g + 10X PIC 4ml + DMEM +heparin up to 40ml]
프로테아제 억제제 칵테일 분말(protease inhibitor cocktail powder) +(DMEM +헤파린 ; 10ml) ⇒ 10X
9. 0.1M 글리신 용액 (pH2.0)- 파지 용리용
10. 2M 트리스 염기- 9번 중화제
11. 락스 (10% 수용액)- 파지 살균용
12. PBS 용액 - 각 조직 당 3회 반복 세척
3) 사용된 동물
SD[스프라귀-다우리(Sprague-Dawley)] 래트 (12주령, 350g)(Samtako, Korea). 공시동물은 표준 조건하 하에서 자유급식 하고, 실험 하루 전 오후 6시에 절식시켰다.
4) 파지 라이브러리의 주입
1. 밤새도록 절식시킨 SD 래트를 케타민 하이드로클로라이드(Ketamine hydrochloride) (40mg/kg bw)와 자일라진(xylazine) (5mg/kg bw)을 래트의 복강에 혼합투여 하여 약하게 마취 시켰다.
2. 1.2×1012 pfu의 파지-펩타이드 라이브러리 [개개 재조합형 파지 클론(individual recombinant phage clone) 약 1,000 카피]를 500ul의 PBS(phosphate buffered-saline)에 희석한 후 1ml 주사기에 장입하였다.
3. 래트가 마취에서 깨어나기 직전 2번의 파지-펩타이드 라이브러리를 경구주입기(oral zonde)를 이용해 경구 투여하였다.
4. 래트를 우리로 옮겨 파지-펩타이드 라이브러리가 소장 점막층을 통해 체내로 흡수될 수 있도록 1시간 동안 정치시켰다.
5) 혈액
관주
1. 헤파린이 첨가된 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Media)을 37℃ 인큐베이터에 넣어 미리 가온하였다.
2. 케타민 하이드로클로라이드(80mg/kg bw)와 자일라진(10mg/kg bw)을 래트의 복강에 혼합투여 하여 마취시켰다.
3. 마취된 래트를 수술대 위에 고정한 후 출혈을 최대한 억제한 상태에서 개복하였다.
4. 횡격막 절제 후 흉곽을 종방향으로 절개하여 심장을 노출시켰다.
5. 우심방을 통해 혈액을 2ml 채취하여 헤파린 처리된 튜브에 옮긴 후 얼음에 정치시켰다.
6. 1번의 37℃ 인큐베이터에 넣어둔 용액(DMEM+헤파린)을 중력 관주 시스템(gravity perfusion system)에 60ml 장입한 후 좌심실의 첨단 부분에 바늘로 주입하였다.
7. DMEM이 좌심실로 유입되는 것을 확인한 후 우심방을 절개하여 방혈하였다.
8. 간, 폐, 콩팥 등 주요장기의 혈액이 모두 제거될 때까지 DMEM 장입을 반복한다 (총 120ml/1h).
6) 파지
용리
및 적정
1. 혈액 샘플의 처리
- 혈액 1.5ml을 50ml 날겐(Nalgene) 튜브에 분주한 후 조직 현탁액 용액 1ml을 첨가한 후 균질화시켰다.
- 2ml 글리신 (pH2.0) 용액 1ml을 첨가한 후 볼텍싱(voltexing), 14,000g에서 8분간 원심분리 한 후 상층액을 새로운 튜브에 옮겼다.
- 55ul의 2M 트리스 염기로 중화 시켰다.
- 적정 (위 상층액 부피의 전체 파지 역가가 혈액 1ml 내의 파지 역가).
2. 조직 샘플의 처리
- 50ml 튜브의 무게를 측정하여 기록하였다.
- 관주 종료 후 각 장기조직(간, 폐, 콩팥, 지라)에서 적출하여 페트리 접시(petri dish)에 옮겼다.
- 각 장기조직을 페트리 접시위에서 잘게 잘랐다.
- 자른 각 장기조직을 50ml 튜브로 옮겨 20ml의 빙냉된 PBS 완충제를 이용하여 각각 3회 세척하였다.
- 무게를 단 50ml 튜브에 조직 샘플을 넣은 후 다시 무게를 측정하여 기록하였다 (표준화 데이터로 활용).
- 각 조직 샘플에 2ml의 '조직 현탁 용액(DMEM, 1% BSA, 10% 프로테아제 억제제 칵테일, 1% 헤파린)'을 첨가한 후 얼음에 정치한 상태에서 균질화시켰다(각 조직의 균질화시에는 교차 오염을 방지하기 위해 조직이 바뀔 때마다 10% 락스와 DW로 균질화기 날을 각각 3회씩 세척하였다).
- 균질화 완료 후 각각의 조직 샘플에 2ml의 0.1M 글리신 (pH 2.0)을 첨가한 후 강하게 볼텍싱한 다음 14,000g에서 8분간 원심분리 한다 (acidic elution). 원심분리한 상층액을 새로운 50ml 튜브에 옮긴 후 55-60ul의 2M 트리스 염기를 첨가하여 중화시켜 파지를 용리시킨다.
- 이를 적정하였다(위 상층액 부피의 전체 파지 역가를 조직의 g수로 나눈 것이 조직 1g 내의 파지 역가이다).
7) 파지 적정(
Phage
titration
)
1. 이. 콜라이(E. coli)ER2738 글리세롤 스톡(15%)을 LB/tet 플레이트에 스트리킹하여 37℃에서 밤새도록 배양하였다.
2. 플레이트상에서 이. 콜라이(E. coli) ER2738 1 콜로니를 취해서 LB/tet 브러쓰 5ml에 접종하여 37℃ 진탕기에서 OD600 0.45-0.5 까지 배양하였다.
4. 아가로스 탑(Agarose top)을 끓는 물에 중탕하여 녹인 뒤 45℃ 수조에 정치하여 응고를 방지하였다.
5. LB/tet/X-gal/IPTG 플레이트를 37℃ 배양기에서 가온하였다.
6. 정량하고자 하는 파지 용액을 LB/tet 브러쓰를 이용하여 10배로 연속 희석하였다(희석 범이는 임의대로 조정).
7. 얼음에 정치해 두었던 2번 배양액을 튜브에 190ul씩 분주하였다.
8. 6번의 각 파지 희석액을 10ul 취해서 7번의 튜브에 첨가하고, 볼텍싱한 후 상온에서 3분 정치시켰다.
9. 8번의 샘플 100ul를 4번의 아가로스 탑에 첨가하여 볼텍싱한 후 37℃에서 가온한 5번의 플레이트 위에 부어서 완전히 퍼지게 하였다(모든 파지 희석액을 동일한 요령으로 퍼지게 하였다).
10. 5분간 청정 벤치에 플레이트를 정치하여 아가로스 탑을 응고 시킨 후 37℃에서 밤새도록 배양하였다.
11. 배양된 플레이트 중에서 청색 혈소판이 100개 미만으로 형성된 것을 골라 희석 인자를 고려하여 파지 용액의 pfu(혈소판 형성 단위:plaque forming unit)를 결정하였다 (단위: pfu/10ul).
* pfu 결정 예: 1/106 플레이트에서 90개의 혈소판이 형성된 경우 200ul의 감염 용액을 100ul 취해서 적정했으므로 희석 인자는 ×2이다. 따라서 180×106, 1.8×108 (pfu/10ul)이다.
8) 혈소판 증폭 및 시퀀싱
템플릿
정제(
Plaque
amplification
and
sequencing
template
purification
)
1. 1.5ml 튜브에 LB/tet 브러쓰(broth)를 990ul씩 분주하고, 이. 콜라이(E.coli) 밤새도록 배양하여 각 튜브에 10ul씩 접종하였다.
2. 이쑤시게(Tooth pick)를 이용하여 혈소판이 100 미만인 플레이트에서 청색 혈소판 1개씩을 취해서 각 튜브에 접종하였다.
3. 볼텍싱을 통해 청색 혈소판을 완전히 현탁시킨 다음 5ml 유리 튜브에 접종액을 완전히 옮긴 후 37℃ 진탕기에서 4.5시간 동안 배양하였다.
4. 배양액을 1.5ml 튜브에 옮긴 후, 14,000g에서 1분 동안 원심분리 하고 상층액을 새 튜브로 옮겨 레스핀, 펩타이드를 이용해 80%의 상층액만 취해 새 튜브에 담았다[개별 파지 클론 스톡(individual phage clone stock)].
5. 상기의 개별 파지 클론 스톡를 각각 1.5ml 튜브에 분주하였다.
6. 200ul의 PEG/NaCl을 첨가하여 혼합한 후에 상온에서 10분간 정치시켰다.
7. 14,000g에서 10분간 원심분리하여 상층액을 제거한 후, 파지 펠렛에 100ul의 아오다이드 완충제를 첨가하여 파지의 표면 단백질(coated protein)을 제거하였다.
8. PCR 정제 키트를 적용하여 파지의 단일 가닥 DNA를 정제하였다 (Figure 3).
9. 아가로즈 겔 전기영동을 통해 파지 DNA를 확인하였다.
10. -96 gIII 프라이머를 이용한 시퀀싱을 통해 파지가 코딩하고 있는 펩타이드 서열을 확인하였다.
이와 같이 본 발명의 경구 파지 디스플레이 기법은, 1차 바이오패닝 후 소장 점막층을 통과하여 들어오는 파지를 체내 기관을 대표하여 지라에서 동정하는 방법을 취한 종래의 파지 디스플레이 기법과는 다르게, 3차 바이오패닝을 거친 후 소장 점막층을 통과하여 들어오는 파지를 간, 폐, 콩팥, 지라와 같은 다수의 조직 및 기관에서 동정하는 방법을 취하고 있다. 1차 바이오패닝 후 파지를 동정하는 종래의 방법에 비해, 3차 바이오패닝을 거친 후 파지를 동정할 경우에는 보다 효율적으로 소장 점막층을 통과하는 수렴된 펩타이드 서열을 얻을 수 있는 장점이 있으며, 지라를 대표기관으로 선정할 경우 부속 면역기관인 지라의 특성상 면역세포에 특이적으로 결합하는 펩타이드 서열만 편향적으로 동정될 가능성이 있는 반면 다수의 기관 및 조직을 통해 펩타이드 서열을 동정할 경우에는 그러한 결과의 편향을 저감시킬 수 있다.
한편, 본 발명의 경구 파지 디스플레이 방법에서는 파지의 산성 용리과정을 추가하여 만일 소장 점막층 통과 후 특정 조직에 특이적으로 결합하는 기관 표적형 펩타이드가 존재할 경우 이를 동정할 수 있도록 고안하였다.
4. 확립된 경구 파지 디스플레이 기법에 의한
바이오패닝
확립된 경구 파지 디스플레이 기법을 이용하여 총 4 회에 걸쳐 순차적인 바이오패닝을 실시하여 각각의 회에서 소장 점막층을 통과 한 후 4개의 대표적 내부 기관(간, 폐, 콩팥, 지라)에 분포한 파지를 정량하였다. 각 회는 총 4 마리의 서로 다른 래트를 이용한 독립적인 실험으로 구성되어 있으므로 각 회의 파지 역가는 4번의 반복실험을 통해 얻어진 결과의 평균 값을 나타낸다.
일반적으로 파지 디스플레이 기법을 통한 바이오패닝을 실시할 경우 목적하는 타깃과 강한 결합능력(binding affinity)을 가지는 파지 개체수가 횟수를 거듭할수록 증가하기 때문에 횟수에 따른 파지 역가의 증가 현상은 파지 디스플레이 실험에 있어서 실험이 의도한 방향으로 진행되고 있는지를 판가름하는 가장 기본적인 파라미터라고 할 수 있다.
도 9에 나타난 바와 같이, 그러한 현상은 본 발명을 통해서도 확인 할 수 있었는데, 확립된 경구 파지 디스플레이 기법에 의해 바이오패닝을 실시한 결과, 횟수를 거듭할수록 각 내부 장기에서 회수한 파지의 적정농도(titer)가 3회 차까지 급격히 증가하는 양상을 보였다. 1회 차에 비해 3회 차의 파지 적정농도는 기관에 따라 약 100배에서 1,000배 증가하였으며, 말단에 펩타이드 서열을 포함하지 않는 인서트리스 파지의 경우에는 1회 차에 비해서도 낮은 적정농도를 보였다.
바이오패닝의 횟수를 거듭함에 따라 각 기관에 분포하는 파지의 수가 증가하는 이유는 소장 점막층을 효율적으로 통과할 수 있는 펩타이드 서열을 가진 파지의 비율이 회차의 진행에 따라 점차 증가하기 때문인 것으로 추정할 수 있었다.
5.
펩타이드
서열의 동정
경구 파지 디스플레이 바이오패닝 과정을 통해 소장 점막층을 통과하여 각 내부 장기로 분포되는 파지의 적정농도가 3회 차에서 가장 높은 수준을 보였기 때문에 3회 차 바이오패닝 과정에서 회수한 파지 개체군을 아가 플레이트(agar plate)에 도말한 후 각각의 개별적인 파지 플라크를 취해 게놈 DNA(genomic DNA)를 추출하고 염기서열을 분석함으로써 각각 어떠한 펩타이드 서열을 보유하고 있는지를 동정하였다(도 10 및 11).
간, 폐, 콩팥 및 지라에서 각각 회수한 파지 개체군에서 총 850개(각 기관 당 200여개)의 펩타이드 서열을 동정한 결과,“CSKSSDYQC ”의 아미노산 서열을 가진 펩타이드가 간에서 3번, 폐, 콩팥 및 지라에서 각각 2번, 도합 9번의 출현 빈도수를 보이는 것을 확인할 수 있었다. 3회 차에서 각 내부 기관에 분포한 파지의 역가가 106~107(pfu/조직g) 수준인 것을 감안할 때 이러한 거대 모집단에서 850개의 표본추출을 통해 9번의 출현 빈도수를 보였다는 것은 모집단 내에 이러한 펩타이드 서열을 가진 파지의 비율이 매우 높다는 것으로 해석할 수 있으며 이러한 펩타이드 서열은 소장 점막층에서의 흡수를 효과적으로 유도할 수 있는 잠재력이 매우 높을 것으로 추정할 수 있었다.
6.
CSKSSDYQC
서열에 대한 소장
점막층
흡수효율 검정
경구 파지 디스플레이 기법을 이용하여 파지 디스플레이 펩타이드 라이브러리를 래트에 경구주입 한 후 소장 점막층을 통과하는 파지로부터 동정한‘CSKSSDYQC' 펩타이드 서열에 대해 실제 소장 점막층에서의 효과적인 흡수 여부, 흡수될 경우 특정 흡수경로의 존재 가능성을 검정하기 위하여 다음과 같은 실험을 수행하였다.
(1)
Ex
-
vivo
파지 결합 분석 및 유리 작용기 경합 분석
특정 물질이 경구적으로 투여된 후 소장 점막층에서 특정 수용체에 의한 ‘수용체 매개 물질 운송 기전 (receptor-mediated endocytosis or transcytois)’을 통하여 체내로 흡수되기 위해서는 우선 소장 점막층의 특정 수용체에 특이적으로 결합하여야 한다. 따라서 본 실험에서는 래트(Sprague-Dawley, male, 350g)의 소장 점막 조직을 추출하여 CSKSSDYQC 펩타이드 서열을 말단에 보유하고 있는 파지와 인서트리스 파지(야생형) 간의 소장 점막 조직에 대한 결합력 차이를 비교하였다. 아울러 합성된 CSKSSDYQC 펩타이드의 첨가 유무에 따른 결합력의 변화를 관찰하였다. 만약 이러한 결합이 실제 수용체의 매개에 의해 이루어지는 것이라면 유리 작용기 (free ligand: CSKSSDYQC)의 첨가량이 증가할수록 첨가된 합성 CSKSSDYQC 펩타이드와 CSKSSDYQC-파지 간의 수용체에 대한 경합(competition)으로 인해 소장 점막층과 결합하는 파지의 적정 농도가 감소하게 된다 (도 12). 따라서 이러한 경합 유무는 이러한 결합이 수용체 매개에 의한 것인지에 대한 간접적인 증거가 될 수 있다. 한편, 소장 점막층을 통과하여 체내로 유입된 각각의 파지가 특정 장기 조직과의 결합력이 있는지 여부를 살펴보기 위해 간, 폐, 콩팥 및 지라의 조직을 적출하여 이들 조직에 대한 결합력 차이도 비교하였다.
그 결과, CSKSSDYQC를 보유한 파지의 경우 래트의 소장 점막조직에 대한 결합능력이 인서트리스 파지에 비해 유의적으로 높은 수준을 보였고, 합성 CSKSSDYQC 펩타이드를 첨가하였을 때 CSKSSDYQC-파지는 소장 점막층에 결합한 파지의 적정 농도가 펩타이드의 첨가량이 증가 할수록 감소한 반면, 인서트리스 파지의 경우에는 적정 농도의 변화를 보이지 않았다. CSKSSDYQC-파지와 인서트리스 파지의 유일한 차이는 파지 말단의 펩타이드 서열(CSKSSDYQC)의 유무이므로 이러한 두 파지군 간의 차이는 바로 CSKSSDYQC 펩타이드 서열에서 비롯되는 것으로 추정할 수 있었다 [도 13(a)].
한편, 내부 장기(간, 폐, 콩팥, 지라)에 대한 결합력은 두 파지 군 (CSKSSDYQC-파지와 인서트리스 파지) 간에 유의적 차이를 보이지 않았다 [도 13 (b)].
이러한 결과로 미루어 볼 때 CSKSSDYQC-파지는 소장 점막층에 특이적으로 결합할 수 있는 수용체를 지닌 것으로 여겨지지만 체내의 특정 장기를 표적하는 특성을 가지고 있지는 않다는 사실을 확인할 수 있었다.
(2) 소장
점막층
-통과 파지의
In
-
vivo
트랙킹
특정 펩타이드 작용기(peptide ligand)가 소장 점막층에 효과적으로 결합한다고 해서 반드시 소장 점막층을 효율적으로 통과할 것으로 결론을 내리는 것은 지나친 논리적 비약이라고 할 수 있다. 따라서 본 실험에서는 절식시킨 래트(Sprague-Dawley, male, 350g)를 개복한 후, 소장(회장 부분)의 장관 내부(intestinal lumen)에 CSKSSDYQC-파지와 인서트리스 파지를 각각 2.0x1011 pfu/500㎕ 수준으로 주입한 다음 40분 뒤에 대표적인 내부 장기인 간과 지라를 적출하여 소장 점막층을 통과하여 혈류를 따라 내부 장기로 유입되는 파지를 정량 하였다. 그 결과 CSKSSDYQC 펩타이드 서열을 말단에 보유한 파지는 인서트리스 파지에 비해 간과 지라 모두에서 약 1,000배 높은 체내 유입 효율을 가지는 것으로 확인되었다 (도 14). 한편, 본 연구의 최종 목적은 효과적인‘경구 투약’시스템을 구축하는 것이므로 이번에는 전 실험과 동량의 CSKSSDYQC-파지와 인서트리스 파지를 절식시킨 래트에 경구적으로 주입한 후 1시간 뒤에 래트를 개복하여 소장 점막층을 통과한 뒤 간, 폐, 콩팥, 지라 등 대표적인 내부 장기로 분포된 파지를 정량 하였다. 전 실험의 결과와 유사하게 각각의 파지군을 경구 주입한 경우에도 CSKSSDYQC-파지가 인서트리스 파지에 비해 유의적으로 높은 체내 분포율을 보였다 (도 15).
이상과 같이 경구 파지 디스플레이 기법을 이용하여 선발한 CSKSSDYQC 펩타이드는 소장 점막층에서 고분자 물질(M13 파지의 경우 16MDa의 고분자)의 체내 흡수효율을 크게 증진 시킬 수 있음을 검증할 수 있었다.
(3) 면역조직학 분석(
Immunohistochemical
assay
)
전술한 일련의 실험을 통해 특정 펩타이드 서열을 말단에 발현하지 않은 야생형 파지 (인서트리스 파지)에 비해 CSKSSDYQC 서열을 말단에 발현하는 재조합 파지의 경우 소장 점막층에서의 흡수 효율이 크게 증진하는 것을 확인하였다. 본 실험에서는 여기에서 한 단계 더 나아가 면역조직학 분석(immunohistochemical assay)을 통해 소장 점막층에 CSKSSDYQC-파지가 통과 할 수 있는 특정 경로가 실제로 존재하는 지 여부에 대해 검사하였다. 그 과정을 간략히 기술하면 절식한 래트에 CSKSSDYQC-파지와 인서트리스 파지를 각각 2.0x1011 pfu/500㎕ 수준으로 경구 주입한 다음 30분 후에 개복하여 소장(회장 부분: ileum) 일부를 적출한 뒤 4% 파라포름알데하이드로 고정한 다음 동결 박편기를 이용해 소장 융모 조직을 준비하고, 그 위에 M13 파지 항체(1차 항체)와 녹색형광을 나타내는 FITC가 도입된 2차 항체를 첨가한 다음 형광 현미경을 통해 파지의 위치를 확인하는 방법이다(도 16).
그 결과 CSKSSDYQC-파지를 경구 주입한 rat의 소장의 융모 조직에서는 상피세포 층을 따라 체 내로 유입되는 특이적인 녹색 형광 신호를 확인 할 수 있었으나 [그림 17, (a)와 (b)], 인서트리스 파지를 경구 주입한 rat의 소장 융모 조직에서는 동일 위치에서 어떠한 특이적인 신호도 관찰되지 않았다 [그림 17, (c)와 (d)]. 소장 융모 조직 내부에서 녹색 형광 신호가 관찰된다는 것은 곧 파지가 소장 상피세포층을 통과했음을 의미하므로 이러한 관찰을 통해 소장 점막층에는 실제로 CSKSSDYQC-파지가 효과적으로 흡수될 수 있는 경로가 존재하는 것으로 추정할 수 있었다.
한 가지 특징적인 현상은 CSKSSDYQC-파지의 녹색 형광이 관찰되는 위치가 소장 상피세포 층에서 특히 배상 세포의 위치와 일치한다는 점이었다. 배상 세포은 소장 점막층에 존재하는 세포 종의 하나로 뮤신이라는 당단백질 분비하여 소장 점막층을 코팅함으로써 소장 점막층이 음식물에 의한 물리적인 손상을 입는 것과 소화효소에 의해 자가분해 되는 것을 방지하는 역할을 담당한다 (Molecular Biology of the Cell, 4th edition, 2002). 배상 세포의 점액 액적(mucus droplet)이 당단백질 결합물질의 하나인 UEA-1 렉틴과 결합하는 성질을 이용하여 적색 형광을 나타내는 로다민이 도입된 UEA-1 렉틴을 소장 융모 조직 박편에 첨가한 후 관찰하였을 때 CSKSSDYQC-파지의 녹색 형광 신호가 배상 세포의 적색 형광 신호 하부에 마치‘혜성의 꼬리’와 같은 형태로 나타나는 것을 확인 할 수 있었다 [도 17(b)]. 이러한 현상을 보이는 단일 배상 세포를 확대하여 관찰할 경우 배상 세포의 세포형상을 따라 점액 액적(적색 형광)외곽을 둘러싸고 있는 CSKSSDYQC-파지의 녹색 형광 신호를 더욱 확연히 확인할 수 있었다 [도 17(e)]. 또한 이는 전자현미경을 통해 관찰된 배상 세포의 모양과도 일치하였다 [도 17(f)].
한편, 이러한 현상의 재현성을 확인하기 위해 이번에는 M13 파지 항체(1차 항체)와 HRP(horse radish peroxidase) 효소가 도입된 2차 항체를 이용하여 앞서 준비한 소장 점막조직 박편을 관찰하였다. 위와 같은 항체가 처리된 소장 점막조직에 DAB(diaminobenzidine)을 기질로 첨가할 경우 파지가 존재하는 부위는 특이적인 갈색 신호를 나타내게 된다.
그 결과 FITC를 이용한 형광 현미경 검사와 마찬가지로 CSKSSDYQC-파지를 경구 주입한 후 적출한 소장 융모 조직에서는 상피세포 층을 따라 배상 세포의 위치에서 특이적인 갈색 반점이 관찰된 반면 [도 18, (a)-(c)], 인서트리스 파지를 경구 주입한 rat의 소장 융모 조직에서는 동일 위치에서 어떠한 특이적인 신호도 관찰되지 않았다 [도 18, (d)- (f)]. 이러한 결과들을 종합해 볼 때, 경구 주입된 CSKSSDYQC-파지는 소장에 도달한 후 배상 세포와 같은 특정 세포를 경유하여 효과적으로 체 내로 유입되는 것으로 결론을 내릴 수 있었다. CSKSSDYQC-파지와 인서트리스 파지의 특징을 구분 짓는 유일한 변인은 바로 인위적으로 파지 말단에 도입된 CSKSSDYQC 펩타이드 서열의 유무인 점을 감안할 때, CSKSSDYQC-파지의 배상 세포을 통한 소장 점막층에서의 흡수는 바로 CSKSSDYQC 펩타이드 서열에 의한 효과인 것으로 사료된다.
7. 경구 투약 시스템
상기에서 경구 파지 디스플레이 기법에 의해 선발된 소장 점막층에서 효과적으로 트랜스사이토시스를 유도하는 펩타이드 서열을 단백질계 약물과 유전자 재조합 기법으로 하나의 유전자로 접합시켜 단백질 발현 숙주세포를 통해 단일사슬의 재조합 단백질 약물로 생산할 수 있다 (도 7).
이렇게 도입된 펩타이드 작용기의 길이는 아미노산 7-9개 정도의 극히 짧은 서열로 트랜스사이토시스 능력이 이미 알려진 고분자의 단백질을 약물에 도입한 기존 연구에서 약물의 기능저하가 문제점으로 지적되었던 것과는 달리 단백질 약물 고유의 입체구조나 기능에 대한 방해를 최소화 할 수 있다. 한편, 기존의 알려진 트랜스사이토시스 유도물질을 이용할 경우 소장 점막층에서의 흡수효율 측면에서 과연 최적의 선택이었는지 여부에 대한 추가검증이 필요한 반면, 본 발명의 경구 파지 디스플레이 기법을 이용한 경우에는 가장 높은 빈도수로 소장 점막층을 통과하는 최적의 흡수효율을 보인 펩타이드 서열을 선발하게 되므로 그러한 문제점을 해결 할 수 있다.
본 발명을 통해 선발된 펩타이드를 현재까지 주사에 의한 투여방법에 의존하고 있는 인슐린, GH, 등의 호르몬, 인터페론, 인터류킨 등의 사이토카인 및 생리활성을 조절하는 각종 효소 등, 기존의 단백질계 기능성 물질에 도입하여, 생체막에서의 흡수효율을 획기적으로 증진시킨 효율적인 경구 투약 시스템은 단백질 약물의 이용성 확대와 더불어 의학, 약학, 축산 및 수의 분야에 지대한 파급효과를 예상할 수 있다. 실용적으로는 의학 및 약학 분야에서 간편한 경구투여를 통해 주사제 사용 시 소요되었던 불필요한 인건비 및 부대비용을 감소시킬 수 있고 환자의 투약에 따른 고통경감 효과를 기대할 수 있으며, 축산 및 수의 분야에서는 성장호르몬이나 백신 등을 주사에 의해 투여할 경우 발생하는 개체마다 일일이 투여해야 하는 번거로움과 숙련된 노동력의 필요에 의한 불필요한 생산비 증가를 피할 수 있을 것이다. 아울러, 향 후 이러한 펩타이드가 경유하는 막 수용체에 대한 연구가 뒷받침 된다면 소장 상피세포에서의 물질운송 기전을 규명하여 학술적 지식을 심화하는 데에도 크게 기여할 수 있을 것으로 사료된다.