DE10157799A1 - Herstellung und Anwendung von DNA-Polyelektrolyt-Nanopartikeln für den Gentransfer - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein nichtvirales Verfahren zur Transfektion von Zellkulturen, Gewebe- bzw. Organkulturen und ist unter EInhaltung bestimmter Rahmenbedingungen auch für den Gentransfer in vivo einsetzbar. Sie ist für die medizinische und biologische Grundlagenforschung, besonders im Hinblick auf Vorstudien zur Gentherapie und in der pharmazeutischen Industrie geeignet. DOLLAR A Das Verfahren zum Gentransfer in tierische Zellen ist dadurch gekennzeichnet, daß Vektor-DNA in wäßriger Lösung durch eine aufeinander folgende Addition entgegengesetzt geladener Polyelektrolyte in kompakte Nanopartikel verpackt und nachfolgende die Transfektion der Zellen durchgeführt wird. DOLLAR A Es ist ferner gekennzeichnet, daß die Vektor-DNA DOLLAR A - im ersten Schritt mit Polykationen in Wechselwirkung gebracht und kondensiert wird, DOLLAR A - im zweiten Schritt mit Polyanionen gemischt und eine Schicht aufgetragen wird DOLLAR A - und diese Schritte ggf. wiederholt werden.

Description

Die Erfindung betrifft ein nichtvirales Verfahren zur Transfektion von Zellkulturen, Gewebe- bzw. Organkulturen und ist unter Einhaltung bestimmter Rahmenbedingungen auch für den Gentransfer in vivo einsetzbar. Sie ist für die medizinische und biologische Grundlagenforschung, besonders im Hinblick auf Vorstudien zur Gentherapie und in der pharmazeutischen Industrie geeignet.

Alle Verfahren des nichtviralen Gentransfers beruhen auf der Wechselwirkung der Transgen-DNA mit geeigneten Trägermolekülen, die im Transfektionsprozess mehrfache Funktionen übernehmen: Überführung der DNA in einen kondensierten Konformationsszustand, der die Aufnahme durch die Rezipientenzelle ermöglicht und die DNA vor einem nucleolytischem Abbau schützt. Es ist weiterhin erforderlich, lysosomolytische bzw. membranolytische Wirkungen zu integrieren, um ein Verlassen der Endosomen/Lysosomen zu ermöglichen und ein den Zellkern lokalisierendes Signal einzubauen. In der Literatur beschriebene bzw. kommerzielle Transfektantien erfüllen diese Forderungen nur teilweise. Es sind 3 Gruppen derartiger Transfektantien bekannt, zu denen z. B. die kationischen Liposomen, Peptid-bzw. Protein-vermittelte Systeme und die Polymer­ vermittelten Systeme gehören. Diese Methoden sind weitgehend in einer aktuellen Übersicht (R. I. Mahato, L. C. Smith, A. Rolland (1999) Advances in Genet. 41, 95-156) dokumentiert und können hier nicht weiter beschrieben werden.

Ein Hauptproblem bei der Herstellung transfektionsaktiver DNA-Komplexe auf der Basis dieser Systeme ist ihre schlechte Löslichkeit in physiologischen Salzlösungen. Hierbei handelt es sich um eine von der DNA geprägte Eigenschaft, die bei ladungsneutralisierter DNA auftritt (z. B. Chromatin). Die resultierenden Aggregate schließen wegen Emboliegefahr und ungenügender Bioverteilung ihre Anwendung in der Gentherapie aus. Andererseits wurde eine direkte Korrelation zwischen Aggregatgröße und in vitro Transfektionseffizienz an praktisch allen Systemen nachgewiesen. Allerdings erwiesen sich die großen Aggregate oft als toxisch für die Zellen. Lösliche Komplexe, die neben den Aggregaten beobachtet werden, sind transfektionsinaktiv. Eine einfache Zentrifugation der Komplexe bei 4000 × g und 2 min belegt diese Befunde. Eine Ausnahme bilden Polyethylenamin- und Dendrimerkomplexe, die bei hohem positiven Ladungsüberschuß weniger zur Aggregation neigen und transfektionsaktiv sind.

Ein Genvektor für die Gentherapie sollte klein (< 100 nm) sein, um durch Endozytose aufgenommen werden zu können. Rezeptorspezifische Liganden sollten anwesend sein, um ein Zell-bzw. Organtargeting zu ermöglichen. Weiterhin sollten Genvektoren stabil sein, d. h. nicht zur Aggregation tendieren und nicht mit Serumproteinen wechselwirken. Eine hohe Transfektionsaktivität wird erwartet. Von der Realisierung dieser Eigenschaften ist die Fachwelt momentan noch weit entfernt. Bereits die Forderung nach hoher in vitro Effizienz bei geringer Größe der transfizierenden Komplexe konnte bisher noch nicht befriedigend erfüllt werden.

Ein Weg, der in der Literatur beschritten wird, um die Aggregationsneigung zu umgehen, ist die Umhüllung der transfizierenden Komplexe mit einem neutralen Polymer, als das u. a. Polyethylenglycol (PEG) herangezogen wird, und das kovalent an den DNA-Träger angekoppelt wird (M. Ogris, S. Brunner, S. Schüller, R. Kircheis, E. Wagner (1999) Gene Ther. 6, 595-605). Trubetskoy et al. haben Nanopartikel auf der Basis von Plasmid-DNA und Polylysin hergestellt und diese Partikel mit einer Hülle aus sukzinylierten Polylysin umgeben (V. S. Trubetskoy, A. Loomis, J. E. Hagstrom, V. G. Budker, J. A. Wolff (1999) Nucleic Acids Res. 27, 3090-3095). In hypotonen Lösungen waren diese Partikel < 100 nm und zeigten nur dann eine Aggregationstendenz, wenn Polykation und Polyanion (hier Polylysin und sukzinyliertes Polylysin) im Verhältnis 1 : 1 anwesend waren. Trubetskoy et al. konnten auch zeigen, daß sich nicht alle negativen Polyelektrolyte eignen, die Energie für die zur Shell- Bildung erforderlichen Ladungsumverteilungen bereitzustellen, ohne die DNA freizusetzen. Die Carboxyl/Backbone-Distanz bzw die Ladungsdichte des Polyanions ist hierfür ein wichtiger Parameter. Kurze Distanz bzw. große Ladungsdichte führt zur Dissoziation des binären Komplexes zwischen DNA und Polylysin, große Distanz zu stabilen ternären Komplexen. Bei eigenen Versuchen wurde eine starke Aggregation dieser Nanopartikel (Shells) in physiologischer Salzlösung festgestellt. Es zeigte sich nach Zentrifugation bei 4000 × g für 2 min weiter, daß nur die aggregierten Partikel transfektionsaktiv waren, Transfektionsdaten wurden nicht publiziert.

Der Erfindung lag die Aufgabe zugrunde, erste Schritte bei der Erfüllung der o. a. Forderungen durch die Anwendung eines neuen Prinzips zur Partikelassemblierung zu gehen. Insbesondere sollten kleine, stabile Partikel entwickelt werden, die eine hohe Transfektionseffizienz besitzen.

Der Grundgedanke der Erfindung liegt darin, die DNA/DNA-Träger (Transfektantien)- Komplexe mit einer weiteren, stabilisierenden Polyelektrolytschicht zu umhüllen, so daß eine Aggregation in physiologischen Medien unterbunden wird, d. h. die Partikel stabilisiert werden. Die Erfindung stützt sich auf eigene Ergebnisse eines Teils der Erfinder bei der Herstellung von Nanopartikeln und beruht auf der schrittweisen Adsorption von Schichten entgegengesetzt geladener Polyelektrolyte an die Oberfläche von Kolloidpartikeln, bzw. hier an die durch Transfektantien kondensierte DNA. Nach Aufbringen jeder Schicht ändert sich die Oberflächenladung der Partikel. Durch geeignete Polyelektrolyte können gewünschte Hülleneigenschaften, wie selektive Permeabilität, kontrollierte Freigabe, Stabilität und Biokompatibilität erreicht werden.

Ein erfindungsgemäßes Ziel ist es, anionische Polyelektrolyte zu finden, die kationische DNA-Komplexe gegen Aggregationstendenzen unter physiologischen Bedingungen stabilisieren und zu tranfektionsaktiven Komplexen mit negativer Oberflächenladung führen. Die letztere Bedingung ist erforderlich, um eine Wechselwirkung mit den negativen Serumproteinen auszuschließen, die zum schnellen Verlust der Komplexe in vivo führen würde. Die Bindung an die negative Zelloberfläche soll andererseits über Liganden-Rezeptorwechselwirkung realisiert werden.

Das erfindungsgemäße Verfahren zum Gentransfer in tierische Zellen ist dadurch gekennzeichnet, daß a) Vektor-DNA zur Herstellung von transfizierenden Komplexen mit polykationischen Substanzen, wie Peptiden, bestehend vorwiegend aus Lysinen und Argininen, Kernproteinen wie H1 oder HMG1 und Polyaminosäuren, wie beispielsweise Polylysin (hier exemplarisch untersucht), in Wechselwirkung gebracht wird. Dies erfolgt in wäßrigem Medium, um eine Aggregation der entstehenden Komplexe zu verhindern. In einem 2. Schritt b) wird auf diese Komplexe, die i. a. eine positive Oberflächenladung aufweisen, durch Mischung mit einem Polyanion eine negative Schicht aufgetragen. Diese Schicht, die bevorzugt aus Transfer-RNA besteht, verhindert bei Übertragung der Komplexe in physiologische Salzbedingungen deren Aggregation. Erfindungsgemäß können als Polyanionen auch biologisch relevante Oligoribonukleotide (z. B. Antisenseoligos) eingesetzt werden. Es sei erwähnt, daß eine Reihe anderer untersuchter Polyanionen das Auftreten von Aggregaten nicht verhindert (siehe oben). Um zu belegen, daß die erhaltenen Komplexe die Kriterien der Schichtassemblierung (geringe Größe, geringe Polydispersität, negatives Zeta- Potential) tatsächlich erfüllen, werden sie in physiologischer Salzlösung bezüglich ihrer Größenverteilung durch dynamische Lichtstreuung, AFM oder Elektronenmikroskopie sowie ihres Zeta-Potentials untersucht. Die erhaltenen Partikel erfüllen diese Kriterien und erwiesen sich im Transfektionsexperiment als aktiv. Wegen ihrer negativen Oberflächenladung, die eine starke Wechselwirkung mit der Zelloberfläche behindert, ist die Transfektionseffizienz geringer, als von DNA/Polylysin-Komplexen allein, die weitgehend aggregiert sind. Dies erhöht jedoch die Erwartung, durch Einführung von Liganden für Zelloberflächenrezeptoren, die Effizienz des targetierten Gentransfers verbessern zu können. Eine einfache Methode zur Herstellung ligandierter Nanopartikel ist die Addition kationischer Peptide mit Ligandensequenzen (z. B. K₁₆-cRGD), die als dritte äußere Schicht der Nanopartikel fungiert. Ein Problem hierbei ist jedoch die Gefahr von Aggregation, der durch sorgfältige Titration der zugefügten Peptidkomponente in definierten Konzentrationsschritten vorgebeugt werden muß.

Durch die Anwesenheit von lysosomolytischen Substanzen wie z. B. Chloroquin und CaCl₂ kann die Transfektionsleistung erfindungsgemäß weiter gesteigert werden. Eine lysosomolytische Komponente ist bisher nicht in die Partikel integriert. Mit dieser Zielstellung kann das Polylysin jedoch durch Polyethylenimin (PEI) ersetzt werden. PEI/DNA-Komplexe sind befähigt, Endosomen oder Lysosomen zu verlassen. Ein großer Vorteil der Erfindung ist die Möglichkeit, eine homogene, transfektionsaktive Partikelpopulation geringer Größe zu schaffen (im vorliegenden Beispiel unter Verwendung von Polylysin von ca. 100 nm), die als ein Modell für Untersuchungen zum in vivo Gentransfer genutzt werden kann.

Erfindungsgemäß kann das dargestellte Verfahren zur Zelltransfektion von verschiedenen kultivierten Zellinien angewandt werden. Auch ein Gentransfer in Gewebe- bzw. Organkulturen ist möglich. Ein in vivo Gentransfer ist bei ausreichender Stabilität der Partikel erreichbar. Während auf das hier dargestellte Verfahren zur Partikelassemblierung kein Erfindungsanspruch erhoben wird, soll die Verwendung von RNA als Polyanion zum Aufbau der Nanopartikel geschützt werden. Ähnliches gilt für andere biokompatible Polyanionen, die dem erfindungsgemäßen Anspruch der Aggregationsfreiheit in Salzlösungen gerecht werden.

In Gegenwart von RNA erhält man erstmalig unter physiologischen Salzbedingungen aggregationsfreie Partikel geringer Größe, die transfektionsaktiv sind.

Im einzelnen läuft das erfindungsgemäße Verfahren wie folgt ab:

• 1. Das Peptid K₁₆ (Oligolysin), K₁₆-cRGD (integrinspezifisches K₁₆), H1-Histon, Polylysin oder PEI wird mit Vektor-DNA in waßrigem Medium in Wechselwirkung gebracht. Für einen Transfektionsansatz mit 2.10⁵ Zellen werden 2 µg DNA eingesetzt.
• 2. Anschließend wird Transfer-RNA (hier Typ V aus wheat germ von Sigma) zu den Komplexen im Überschuß (hier DNA : Polylysin : RNA = 1 : 1.5 : 6) addiert und durch Addition von 5 M NaCl-Lösung in physiologische Ionenstärke überführt. Die Konzentrationsverhältnisse der einzelnen Komponenten müssen mit der Anzahl Schichten zunehmen, sind aber wegen der Aggregationsgefahr zu optimieren. Die Teilchen werden bei Zimmertemperatur für ca. 2 Stunden konditioniert (in dieser Zeit unterliegen sie bei ungeänderter Polydispersität einer Schwellung auf ca. 250 nm, siehe dynamische Lichtstreuung).
• 3. Die Transfektion erfolgt durch Addition der Komplexe zum Zellkulturmedium und weiter durch die Addition dieser Transfektionsmischung zu den Zellen. Das Transfektionsmedium verbleibt für einige Stunden auf den Zellen, wird dann entfernt und die Zellen gewaschen. Nach Wechsel zum Posttransfektionsmedium, das zusätzlich 0,1 mM Chloroquin enthalten kann, wird bis zum Fremdgen-Assay bzw. zum Beginn der Selektion inkubiert. In ähnlicher Weise werden die Komplexe zur in vitro Gewebe- oder Organtransfektion angewandt.

Anschließend wird die Erfindung an Beispielen erläutert, auf die sie aber nicht beschränkt sein soll.

Ausführungsbeispiele 1. Herstellung und Charakterisierung von DNA-Polyelektrolyt-Nanopartikeln für die in vitro Transfektion von Zellkulturen

Vektor-DNA und kationisches Polymer werden wie oben beschrieben bei Zimmertemperatur und im Überschuß des Polykation in Wasser gemischt. Hier verwenden wir pCMV Luc und Polylysin des M_w 58000 im Verhältnis 1 : 1,5 (w/w) auf der Basis von 2 µg DNA. Zu diesen Komplexen wird im Überschuß Transfer-RNA (Typ V von Sigma) zugegeben, so daß ein Mischungsverhältnis DNA : Polylysin : RNA von 1 : 1,5 : 6 entsteht. Es ist wichtig, daß immer die n + 1. Komponente im Überschuß zur n. Komponente zugefügt wird. Durch Zugabe von 3 M NaCl wird die Lösung auf physiologische Salzkonzentration gebracht. Dieser Ansatz wird für Transfektionszwecke direkt verwendet. Zur physikochemischen Analyse werden bis zu 10 derartige Ansätze vereinigt.

Die entstandenen Nanopartikel werden durch dynamische Lichtstreuung im Zetasizer 3000 HS (Malvern Instr. Ltd, Malvern, England) auf ihre Größe und Aggregationsneigung untersucht. Fig. 1 zeigt die Komplexentstehung ausgehend vom Polylysin/DNA-Komplex in Wasser. Die schrittweise Veränderung dieser Komplexe nach Addition der DNA, Überführung in NaCl und die Konditionierung der Komplexe in Abhängigkeit von der Zeit werden dargestellt. Es findet auf der Basis von Ladungsumverteilungen eine Uniformierung der Komplexgrößen zu einer homogenen Partikelpopulation statt (Polydispersitätsindex in diesem Versuch 0,0025). Eine stabile Größe der Partikel von 150 nm wird nach einer Konditionierungszeit von ca. 2 Stunden bei gleichem Polydispersitätindex erreicht.

Fig. 2 zeigt das Zeta-Potential der Nanopartikel, das im gleichen Gerät gemessen wurde, im Vergleich zum Polylysin/DNA-Komplex, der dem Nanopartikel zugrunde liegt (DNA : Polylysin : RNA, 1 : 1,5 : 6 w/w/w). Man sieht, daß der positive Polylysin/DNA- Komplex (+ 21.2 mV) wie erwartet in das negativ geladene Nanopartikel (-37.1 mV) übergeht.

Im Gegensatz zu den Polylysin/DNA-Komplexen können diese Nanopartikel nicht bei 4000 × g für 2 min abzentrifugiert werden. Dieser einfache Test kann zu einer ersten Identifizierung der Partikel herangezogen werden.

Fig. 3 zeigt derartige Nanopartikel, die durch Rasterkraftmikroskopie abgebildet wurden.

2. In vitro Transfektion von ECV 304-Zellen mit DNA-Polyelektrolyt-Nanopartikeln

Die fertigen Nanopartikel auf der Basis von 2 µg DNA (wie oben) in 100 µl Arbeitspuffer (0,15 M NaCl, 10 mM Tris-HCl, pH 7.6) werden mit 0,9 ml Zellkulturmedium aufgefüllt und zu den gewaschenen Zellen gegeben, hier 2.10⁵ Zellen. RPMI wird als Zellkulturmedium eingesetzt.

Die Transfektionsmischung bleibt 2-4 Std. auf den Zellen, die Zellen werden mit RPMI gewaschen, frisches Kulturmedium (RPMI, 10% FKS), gegebenenfalls mit 0,1 mM Chloroquin versetzt, als Posttransfektionsmedium hinzugefügt und ca. 24 Std in einer 5% CO₂-Atmosphäre inkubiert. Anschließend wird mit dem Assay bzw. bei stabiler Expression mit der Selektion begonnen. Beim Posttransfektionsansatz verbleibt das Chloroquin für 24 Std. auf den Zellen. In diesem Fall ist die Toxizität des Ansatzes erheblich geringer, als wenn die DNA für die ganze Zeit anwesend wäre. Die Ergebnisse sind in Abb. 4 dargestellt. Nach Abzentrifugieren der Nanopartikel bei 4000 × g und 2 min wird eine Transfektionseffizienz von 10-25% der unzentrifugierten Probe gemessen. Dies bedeutet, daß ein Teil der Partikel nicht abzentrifugiert werden kann. Gegenüber reinen Polylysin-Komplexen wird eine Abnahme in der Transfektionseffizienz demonstriert, die auf die schlechte Zellbindung der negativen Nanopartikel zurückgeführt werden kann.

Abbildungslegenden

Abb. 1 Herstellungskontrolle von DNA-Polyelektrolyt-Nanopartikeln anhand der Größenbestimmung mittels quasielastischer Lichtstreuung. Es sind die Streuintensitäten als Funktion der Partikelgröße (Größenverteilung) dargestellt.
A: DNA/-Polylysin-Komplexe (1 : 1,5 w/w) in Wasser.
B: DNA/Polylysin-Komplexe (1 : 1,5 w/w) in 0,15 M NaCl. Das Inset zeigt Aggregate mit < 1000 nm.
C: DNA/Polylysin/RNA-Nanopartikel (1 : 1,5 : 6 w/w/w) in Wasser, zentrifugiert mit 4000 × g für 2 min. D: DNA/Polylysin/RNA-Nanopartikel (1 : 1,5 : 6 w/w/w) in Wasser, zentrifugiert mit 4000 × g für 2 min. danach Überführung in 0,15 M NaCl. E: Wie D, nach Stehenlassen bei Zimmertemperatur für 1 Std. Die vermessenen Ansätze beziehen sich auf 10 µg DNA (pCMV Luc).

Abb. 2 Zeta-Potential von DNA/Polylysin-Komplexen (1 : 1,5 w/w) in Wasser (A) und DNA/Polylysin/RNA-Nanopartikeln (1 : 1,5 : 6 w/w/w) in Wasser (B).

Abb. 3 Rasterkraftmikrokopie von DNA/Polylysin/RNA (1 : 1,5 : 6).

Abb. 4 Transfektion von ECV304-Zellen mit DNA/Polylysin/RNA-Nanopartikeln (1 : 1,5 : 6 w/w). Die Lösung der Nanopartikel (200 µl) enthielt 0,15 NaCl und wurde vor der Transfektion 2 Std. stehengelassen. Danach wurde sie in zentrifugierter Form als Überstand (schraffiert) oder ohne Zentrifugation (weiß) zu 0,8 ml Transfektionsmedium (RPMI) addiert und zu den Zellen gegeben, Transfektionszeit 2 Std. 2 µg pCMV Luc, 2 × 10⁵ Zellen. Zentrifugation bei 4000 × g, 2 min.

Claims (19)

1. Verfahren zum Gentransfer in tierische Zellen, gekennzeichnet dadurch, daß Vektor-DNA in wäßriger Lösung durch eine aufeinanderfolgende Addition entgegengesetzt geladener Polyelektrolyte in kompakte Nanopartikel verpackt und nachfolgend die Transfektion der Zellen durchgeführt wird.

2. Verfahren zum Gentransfer in tierische Zellen nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß die Vektor-DNA

• - im ersten Schritt mit Polykationen in Wechselwirkung gebracht und kondensiert wird,
• - im zweiten Schritt mit Polyanionen gemischt und eine Schicht aufgetragen wird
• - und diese Schritte ggf. wiederholt werden.

3. Verfahren zum Gentransfer in tierische Zellen nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß als Polykationen Peptide, Kernproteine oder Polyaminosäuren eingesetzt werden.

4. Verfahren zum Gentransfer in tierische Zellen nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß als Polykationen Peptide aus vorwiegend Lysinen und/oder Arginin eingesetzt werden.

5. Verfahren zum Gentransfer in tierische Zellen nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß als Polykationen die Kernproteine H1-Histon oder HMG1 eingesetzt werden.

6. Verfahren zum Gentransfer in tierische Zellen nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß als Polykation Polylysin oder Oligolysin K₁₆ eingesetzt wird.

7. Verfahren zum Gentransfer in tierische Zellen nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß als Polyanionen Transfer-RNA, DNA oder Oligonukleotide eingesetzt werden.

8. Verfahren zum Gentransfer in tierische Zellen nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß als Polyanionen Antisenseribonukleotide oder Mischungen aus Antisenseribonukleotiden und Transfer-RNA oder anderen Polyanionen eingesetzt werden.

9. Verfahren zum Gentransfer in tierische Zellen nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß als Polyanionen biokompatible anionische Polymere eingesetzt werden, die eine Aggregation der Komplexe unter physiologischen Salzbedingungen verhindern.

10. Verfahren zum Gentransfer in tierische Zellen nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß als Polyanion Polyvinylsulfat eingesetzt wird.

11. Verfahren zum Gentransfer in tierische Zellen nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß als Polykation Polylysin und als Polyanion Transfer-RNA eingesetzt wird.

12. Verfahren zum Gentransfer in tierische Zellen nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß die Vektor-DNA mit mehr als 2 Polyelektrolytschichten umhüllt wird.

13. Verfahren zum Gentransfer in tierische Zellen nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß folgende Parameter unabhängig voneinander gewählt werden:

• - die Partikeloberflächenladung durch Wahl geeigneter Polyanionen/Polykationen an der Oberfläche,
• - Ligandierung für die Aufnahme durch rezeptorspezifische Endozytose durch elektrostatische Anbindung der Liganden vermittels kurzer polarer Aminosäuresegmente,
• - lysosomolytische Aktivität der Nanopartikel durch Einbau von lysosomolytischen Polykationen.

14. Verfahren zum Gentransfer in tierische Zellen nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß die Polykationen/Polyanionen zusätzliche Liganden aufweisen.

15. Verfahren zum Gentransfer in tierische Zellen nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß Integrinliganden wie K₁₆-GGCRGDMFGCA oder ähnliche Ligandenals äußere Polyelektrolytschicht verwendet wird.

16. Verfahren zum Gentransfer in tierische Zellen nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß zur Vermittlung der lysosomolytischen Aktivität als Polykationen Polyethylenimin (PEI) oder Dendrimere verwendet werden.

17. Verfahren zum Gentransfer in tierische Zellen nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß die Transfektion in Gegenwart von Chloroquin oder CaCl₂ als lysosomolytische Agentien durchgeführt wird.

18. Verfahren zum Gentransfer in tierische Zellen nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß die fertigen Komplexe in wäßriger Lösung hergestellt werden und die Transfektion unter physiologischen Salzbedingungen durchgeführt wird.

19. Verfahren zum Gentransfer in tierische Zellen nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß die fertigen Komplexe in physiologische Salzkonzentrationen überführt werden und die Transfektion unter physiologischen Bedingungen durchgeführt wird.