JP4383855B2 - パイエル板および／またはｍ細胞を標的とするリガンド - Google Patents

Description

本発明は、腸上皮を介した、すなわち腸管関連リンパ組織および／または腸上皮のパイエル板組織にあるＭ細胞を介した、薬物、高分子、もしくは粒子（生分解性ナノ粒子および微粒子など）、または細菌担体もしくはウイルス担体の輸送を可能にする、または容易にする新規ターゲティングリガンドに関する。

胃腸管（ＧＩＴ）の管腔側内面の上皮細胞は、経口投与後の薬物送達にとって主要な障壁である。しかし、薬物の送達および輸送を容易にするために利用可能であることが確認された４つの輸送経路、すなわち経細胞（ｔｒａｎｓｃｅｌｌｕｌａｒ）輸送経路、傍細胞輸送経路、担体介在輸送経路および経細胞膜（ｔｒａｎｓｃｙｔｏｔｉｃ）輸送経路がある。従来の薬物、ペプチド、タンパク質、高分子、ナノ粒子系または微粒子系がこれらの輸送経路の１つと相互作用する能力があれば、ＧＩＴからその下にある循環への該薬物または粒子の送達が増加しうる。

Ｍ細胞は、腸管関連リンパ組織の上皮またはパイエル板で見いだされる抗原取り込み細胞である。Ｍ細胞が経細胞輸送能を有し、取り込まれた抗原が下流でプロセシングされることから、Ｍ細胞を標的とするワクチンは経口免疫を増強することが示唆される（たとえば、非特許文献１参照）。しかし、今までのところ、Ｍ細胞経路によってワクチンおよび／またはその他の薬物を送達するための標的となるＭ細胞マーカーは確認されていない。

オマホーニー（Ｏ’Ｍａｈｏｎｙ）の特許（特許文献１）において、本発明者の１人は、ヒトまたは動物の上皮組織を介した活性物質の輸送を可能にする、または容易にするペプチドの同定方法を開示した。この方法では、リガンドを同定するために、ｉｎ ｖｉｖｏにおけるファージディスプレイスクリーニングを使用する。

チェンら（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．）の特許（特許文献２）は、経口／経粘膜の薬物送達のため、リポソームが特定の部位または細胞のタイプを標的とするようにその表面に分子またはリガンドを含有する修飾された重合リポソームを開示している。マウスのＭ細胞またはパイエル板を特定の標的とする炭化水素部分またはレクチンによってリポソームを修飾する実施形態も開示されている。しかし、この文献はリポソームの輸送を教示しているにすぎない。

他の取り組みには、活性物質および輸送促進物質と結合したトランスフェリン受容体リガンドから選択された担体分子による経上皮薬物送達（たとえば、シェンら（Ｓｈｅｎ ｅｔ ａｌ．）の特許文献３）および抗原とＦｃＲｎ受容体に結合するリガンドとの結合による経上皮薬物送達（たとえば、ブルンベルグら（Ｂｌｕｍｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．）の特許文献４）がある。

本明細書で引用した文献は全て、参照によりその全体を本明細書に援用する。
米国特許第６，１１７，６３２号明細書 米国特許第６，０６０，０８２号明細書 米国特許第５，２５４，３４２号明細書 米国特許第６，０３０，６１３号明細書 フォスターら（Ｆｏｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．）、Ｖａｃｃｉｎｅ、第１５巻、５４６〜７１ページ、１９９８ 技術公示（Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ）＃８１０１（４／１／００） ワーナー（Ｗｅｒｎｅｒ）、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｖ、第２巻、１５３〜６５ページ、１９９８ バジャジ‐エリオット エム．ら（Ｂａｊａｊ‐Ｅｌｌｉｏｔｔ Ｍ．ｅｔ ａｌ．）、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ、第１０２巻、１４７３〜８０ページ、１９９８ ギブソン ピー．ら（Ｇｉｂｓｏｎ Ｐ．ｅｔ ａｌ．）、Ｇｕｔ、第７巻、９６９〜７５ページ、１９９４ ドラプキン ピー．ティー．ら（Ｄｒａｐｋｉｎ Ｐ．Ｔ．ｅｔ ａｌ．）、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ、第１０５巻、５８９〜９６ページ、２０００ ジャワリ エー．ら（Ｊａｗｈａｒｉ Ａ．ｅｔ ａｌ．）、Ｇｕｔ、第５巻、５８１〜４ページ、１９９７ ターナー エイチ．およびキネット ジェー．ピー．（Ｔｕｒｎｅｒ Ｈ．ａｎｄ Ｋｉｎｅｔ Ｊ．Ｐ．）、Ｎａｔｕｒｅ、第４０２巻、Ｂ２４〜３０ページ、１９９９ ヴァン ダム イー．ジェー．ら（Ｖａｎ Ｄａｍｍｅ Ｅ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．）、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ、第３巻、５７９〜９８ページ、１９９５ ハーディー ディー．エム．ら（Ｈａｒｄｙ Ｄ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．）、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．、第４４巻、２６０２５〜８ページ、１９９５ ウィルソン シー．エル．およびマトリシアン エル．エム．（Ｗｉｌｓｏｎ Ｃ．Ｌ．ａｎｄ Ｍａｔｒｉｓｉａｎ Ｌ．Ｍ．）、Ｉｎｔ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ、第２巻、１２３〜３６ページ、１９９６ ウグー エフ．ら（Ｕｇｗｕ Ｆ．ｅｔ ａｌ．）、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第２巻、７２３１〜６ページ、１９９８ ペンダー エス．エル．ら（Ｐｅｎｄｅｒ Ｓ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．）、Ａｎｎ ＮＹ Ａｃａｄ Ｓｃｉ、第８７８巻、５８１〜２ページ、１９９９ トレーバー ピー．ジー．（Ｔｒａｂｅｒ Ｐ．Ｇ．）、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ、第１７３巻、７６５〜７３ページ、１９９０ ケルナイス エス．ら（Ｋｅｒｎｅｉｓ Ｓ．ｅｔ ａｌ．）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２７７巻、９４９〜５２ページ、１９９７ ボルテ ジー．ら（Ｂｏｌｔｅ Ｇ．ｅｔ ａｌ．）、Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｍｅｔｈｏｄｓ、第３４巻、１８９〜２０３ページ、１９９７ イトウ エム．ら（Ｉｔｏｈ Ｍ．ｅｔ ａｌ．）、Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ、第３巻、４９１〜５０２ページ、１９９３ ウォルパート エス．アイ．ら（Ｗｏｌｐｅｒｔ Ｓ．Ｉ．ｅｔ ａｌ．）、Ｊ Ｓｕｒｇ Ｒｅｓ、第６３巻、３４５〜８ページ、１９９６

したがって、薬物を搭載したナノ粒子および微粒子、またはワクチンをコードする細菌もしくはウイルス担体を含めた薬物を、ヒトもしくは動物の腸上皮内へ、もしくは腸上皮を横断して輸送するのに特に効果的なＭ細胞および／またはパイエル板に特異的なリガンドが依然として必要とされている。

１２アミノ酸長の特異的Ｌ‐ペプチドに直接関係する態様では、本発明は配列番号１〜３４、配列番号３８〜３９および配列番号４２からなる群から選択される１２アミノ酸長Ｌ‐ペプチドまたはその相同体を有する精製合成ポリペプチドリガンドであって、前記相同体は前記群から選択された１２アミノ酸長ペプチドに対して少なくとも９／１２の相同性を有し、前記１２アミノ酸長Ｌ‐ペプチドまたはその相同体はＭ１３ファージのＮ末端ＰＩＩＩ融合ペプチドとして組み込まれると、該ファージにＣａｃｏ‐２細胞、ＩＥＣ‐６細胞、ラット、マウス、ブタまたはイヌのいずれかのホモジネート膜画分に結合する能力を与え、前記能力は、同様に組み込まれた配列番号６７の翻訳である１２アミノ酸長ペ
プチドによって与えられる能力と少なくとも同じであることを特徴とする、精製合成ポリペプチドリガンドである。

前述した機能試験は、「前記１２アミノ酸長Ｌ‐ペプチド、その断片または相同体は、Ｍ１３ファージのＮ末端ＰＩＩＩ融合ペプチドとして組み込まれると、該ファージにＣａｃｏ‐２細胞、ＩＥＣ‐６細胞、ラット、マウス、ブタまたはイヌのいずれかのホモジネート膜画分に結合する能力を与え、前記能力は、同様に組み込まれた配列番号６７の１２アミノ酸長ペプチドによって与えられる能力と少なくとも同じであり」、本発明のその他の態様および実施形態のためにまた以下に詳細を述べる。全ての作用物質および実施形態について、好ましいリガンドはＣａｃｏ‐２細胞ホモジネート膜画分を使用したとき該機能試験に合格するものである。

「１２アミノ酸長ペプチドと９／１２の相同性がある」とは、相同体を１２アミノ酸長ペプチドと配列比較したとき、連続していても、いなくても、１２個のアミノ酸のうち９個が１２アミノ酸長ペプチドと同一であることを意味する。たとえば、ペプチドが配列ＬＴＰＰＰＷＬＶＲＴＲＰを含有する場合、該ペプチドは配列番号１（ＡＴＰＰＰＷＬＬＲＴＡＰ）の１２アミノ酸長ペプチドと９／１２の相同性がある。

従って本発明の前述の態様では、ペプチドは特定の１２アミノ酸長ペプチドに対して９／１２の相同性があるが、その１２アミノ酸長ペプチドの少なくとも５個連続したアミノ酸断片ではないペプチドでありうるということになる。逆に、ペプチドは少なくとも５個連続したアミノ酸（たとえば、５〜８個のアミノ酸）の断片であるが、１２アミノ酸長ペプチドに対する少なくとも９／１２の相同性はないペプチドでありうる。しかし、ペプチドはまたその両方、すなわち１２アミノ酸長ペプチドの少なくとも５個のアミノ酸断片であり１２アミノ酸長ペプチドに対し少なくとも９／１２の相同性を有することが可能である。１２アミノ酸長ペプチドに対し９／１２の相同性を有するペプチドは、そのペプチドに対し７５％相同である。

特定の１２アミノ酸長Ｌ‐ペプチドのＤ型に関する態様では、本発明は配列番号１〜３４、配列番号３８〜３９および配列番号４２の１２アミノ酸長Ｌ‐ペプチドのＤ型からな
る群から選択される１２アミノ酸長Ｌ‐ペプチドのＤ型である１２アミノ酸長Ｄ‐ペプチドまたはその相同体を有する精製合成ポリペプチドリガンドであって、前記相同体は前記群から選択された１２アミノ酸長Ｄ‐ペプチドに対して少なくとも９／１２の相同性を有し、前記１２アミノ酸長Ｄ‐ペプチドまたはその相同体はＭ１３ファージのＮ末端ＰＩＩＩ融合ペプチドとして組み込まれると、該ファージにＣａｃｏ‐２細胞、ＩＥＣ‐６細胞、ラット、マウス、ブタまたはイヌのいずれかのホモジネート膜画分に結合する能力を与え、前記能力は、同様に組み込まれた配列番号６７の翻訳である１２アミノ酸長ペプチドによって与えられる能力と少なくとも同じであることを特徴とする、精製合成ポリペプチドリガンドである。

特定の１２アミノ酸長Ｌ‐ペプチドの反転（ｒｅｔｒｏ‐ｉｎｖｅｒｔｅｄ）型に関する態様では、本発明は配列番号１〜３４、配列番号３８〜３９および配列番号４２の１２アミノ酸長Ｌ‐ペプチドの反転型からなる群から選択される１２アミノ酸長Ｌ‐ペプチドの反転型である１２アミノ酸長反転ペプチドまたはその相同体を有する精製合成ポリペプチドリガンドであって、前記相同体は前記群から選択された１２アミノ酸長反転ペプチドに対して少なくとも９／１２の相同性を有し、前記１２アミノ酸長反転ペプチドまたはその相同体はＭ１３ファージのＮ末端ＰＩＩＩ融合ペプチドとして組み込まれると、該ファージにＣａｃｏ‐２細胞、ＩＥＣ‐６細胞、ラット、マウス、ブタまたはイヌのいずれかのホモジネート膜画分に結合する能力を与え、前記能力は、同様に組み込まれた配列番号６７の翻訳である１２アミノ酸長ペプチドによって与えられる能力と少なくとも同じであることを特徴とする、精製合成ポリペプチドリガンドである。

特定のＬ‐ペプチドの天然に生じる相同体に関する態様では、本発明はＬ‐ペプチドまたはその相同体を有する長さが２００アミノ酸以下の精製合成ポリペプチドリガンドであって、前記Ｌ‐ペプチドは長さが６〜１２アミノ酸であり、かつ前記Ｌ‐ペプチドは配列番号７４〜配列番号９６からなる群から選択され、前記相同体は前記群から選択されたＬ‐ペプチドに対して少なくとも８３％の相同性を有し、前記Ｌ‐ペプチドまたはその相同体はＭ１３ファージのＮ末端ＰＩＩＩ融合ペプチドとして組み込まれると、該ファージにＣａｃｏ‐２細胞、ＩＥＣ‐６細胞、ラット、マウス、ブタまたはイヌのいずれかのホモジネート膜画分に結合する能力を与え、前記能力は、同様に組み込まれた配列番号６７の翻訳である１２アミノ酸長ペプチドによって与えられる能力と少なくとも同じであることを特徴とする、精製合成ポリペプチドリガンドである。

特定のＬ‐ペプチドの天然に生じる相同体のＤ型に関する態様では、本発明は、Ｄ‐ペプチドまたはその相同体を有する長さ２００アミノ酸以下の精製合成ポリペプチドリガンドであって、前記Ｄ‐ペプチドは長さが６〜１２アミノ酸であり、かつ前記Ｄ‐ペプチドは配列番号７４〜配列番号９６からなる群から選択されたＬ‐ペプチドのＤ型であり、前記相同体は前記群から選択されたＤ‐ペプチドに対して少なくとも８３％の相同性を有し、前記Ｄ‐ペプチドまたはその相同体はＭ１３ファージのＮ末端ＰＩＩＩ融合ペプチドとして組み込まれると、該ファージにＣａｃｏ‐２細胞、ＩＥＣ‐６細胞、ラット、マウス、ブタまたはイヌのいずれかのホモジネート膜画分に結合する能力を与え、前記能力は、同様に組み込まれた配列番号６７の翻訳である１２アミノ酸長ペプチドによって与えられる能力と少なくとも同じであることを特徴とする、精製合成ポリペプチドリガンドである。

特定のＬ‐ペプチドの天然に生じる相同体の反転型に関する態様では、本発明は、反転ペプチドまたはその相同体を有する長さ２００アミノ酸以下の精製合成ポリペプチドリガンドであって、前記反転ペプチドは長さが６〜１２アミノ酸であり、かつ前記反転ペプチドは配列番号７４〜配列番号９６からなる群から選択されたＬ‐ペプチドの反転型であり、前記相同体は反転ペプチドに対して少なくとも８３％の相同性を有し、前記反転ペプチドまたはその相同体はＭ１３ファージのＮ末端ＰＩＩＩ融合ペプチドとして組み込まれると、該ファージにＣａｃｏ‐２細胞、ＩＥＣ‐６細胞、ラット、マウス、ブタまたはイヌのいずれかのホモジネート膜画分に結合する能力を与え、前記能力は、同様に組み込まれた配列番号６７の翻訳である１２アミノ酸長ペプチドによって与えられる能力と少なくとも同じであることを特徴とする、精製合成ポリペプチドリガンドである。

精製合成ポリペプチドリガンドに関する前記発明では、好ましい、およびよりいっそう好ましい実施形態がある。
特定の１２アミノ酸長Ｌ‐ペプチドもしくは天然に生じる１２アミノ酸長相同体、それらのＤ型およびそれらの反転型に関する本発明に関して、相同体は少なくとも１０／１２の相同性を有することが好ましく、１１／１２の相同性を有することがより好ましい。同様に、１２アミノ酸長の断片は長さが少なくとも８アミノ酸であることが好ましい。相同体または断片よりも、完全な特定のＬ‐ペプチド、Ｄ型、または反転型の存在が最も好ましい。

前述の精製合成ポリペプチドリガンド全てに関して、長さは２００アミノ酸以下が好ましく、１００アミノ酸以下がより好ましく、５０アミノ酸以下が最も好ましい。反対に、長さは少なくとも１２アミノ酸が好ましく、少なくとも２０アミノ酸がより好ましく、少なくとも３０アミノ酸が最も好ましい。

前述の精製合成ポリペプチドリガンド全ての具体的な実施形態では、ポリペプチドは亜鉛結合ドメインを含む。
前述の精製合成ポリペプチドリガンドをコードする核酸分子もまた本発明の態様である。長さが６００ヌクレオチド以下であるものが好ましい。特定の１２アミノ酸長ペプチド、モチーフ、または天然に生じる相同体のうち１つからなる精製合成ポリペプチドをコードするものが非常に好ましい。

本発明の特定の実施形態では、前述の精製合成ポリペプチドリガンドのうち１つがファージのタンパク質に組み込まれる。
本発明の特定の実施形態では、前述の精製合成ポリペプチドリガンドのうち１つが薬剤を含む担体実体に共有結合または非共有結合している。たとえば、該担体実体はナノ粒子、微粒子、リポソーム、細菌、ファージ（バクテリオファージ）およびウイルス（好ましくは哺乳類ウイルス、最も好ましくはヒトウイルス、特に組換えまたはその他の技術によって作製された非病原性型）からなる群から選択される。本明細書の他所で詳細に述べるように、ナノ粒子、微粒子またはリポソームの大きさは最大の寸法が１０ｎｍ〜５００μｍの範囲にあることが好ましい。本発明の特定の実施形態では、薬剤は薬物または治療薬である。その他の特定の実施形態では、薬剤は病原体抗原である。

本発明のある態様は、薬剤の送達を目的とする精製合成ポリペプチドリガンドの使用を含む。
一態様では、本発明は腸上皮を有する生物に薬剤を投与する方法であって、前記方法は担体実体に共有結合、または非共有結合した前述の精製合成ポリペプチドリガンドの１つと前記腸上皮とを接触させることからなる方法である。好ましい実施形態では、この生物は哺乳類である。最も好ましくは、この哺乳類はヒトである。

この方法の特定の実施形態では、担体実体はナノ粒子、微粒子、リポソーム、細菌、ファージおよびウイルスからなる群から選択される。好ましい実施形態では、ポリペプチドリガンドはファージまたは細菌の表面上に発現され、該ファージまたは細菌は同様に表面上に発現される抗原または同抗原をコードする遺伝子をさらに含む。

微粒子、ナノ粒子またはリポソームは主要な寸法が１０ｎｍ〜５００μｍの範囲にあることが好ましい。好ましい実施形態では、担体実体に薬剤を搭載する。リガンド‐担体実体の送達のための好ましい投与経路は経口経路である。その他の可能な経路は、直腸、皮下、筋肉内、鼻腔および静脈内経路である。特定の実施形態では、精製合成ポリペプチドリガンドはファージの被覆タンパク質に取り込まれた１２アミノ酸長である。その他の特定の実施形態では、精製合成ポリペプチドリガンドは亜鉛結合モチーフを含み、前記リガンドを亜鉛存在下で前記上皮と接触させる。

本発明は、腸上皮を通じて薬剤を粘膜送達するために標的設定された（ｔａｒｇｅｔｅｄ）ポリペプチドリガンドに関する。本発明の一実施形態では、このポリペプチドリガンドは腸上皮のＭ細胞またはパイエル板組織を標的とする。

本明細書では、「精製合成ポリペプチドリガンド」という用語は、（１）天然に生じるアミノ酸配列のみからなるポリペプチド、および（２）天然に生じるが精製されていないポリペプチドから本発明のポリペプチドを区別するものである。

天然に生じるが精製されていないポリペプチドの例は、断片を伸長して完全なポリペプチドにする翻訳過程中に中間体として、また時に生じるタンパク質分解産物として存在するポリペプチド断片である。

以下のＢｌａｓｔ相同性検索で確認されたマウスケラチノサイト成長因子などのタンパク質のポリペプチド成分は、天然に生じるポリペプチドの例であろう。
溶液中のポリペプチドのほとんどまたは全てが特定の合成ポリペプチドリガンドである溶液中の合成ポリペプチドリガンド集団は、精製合成ポリペプチドリガンドの一例である。

真核細胞で天然に生じ得るポリペプチドリガンドが、ファージ表面もしくは細菌表面で生じる（天然には生じない）ならば、またはナノ粒子、微粒子もしくはリポソーム、または細菌もしくはウイルス担体の表面上で生じるならば、または該リガンドを天然には生じない細胞、ウイルスもしくはファージにおいて遺伝子組換え技術の結果として生じるならば、そのリガンドは精製合成ポリペプチドリガンドである。

本明細書では、「ポリペプチド」および「ペプチド」という用語には、生化学的意味に関して本質的な違いはない。本明細書で示したように、１２アミノ酸長ペプチドはポリペプチドとして適格であり得る。１種または複数のアミノ酸が誘導体化（たとえば、グリコシル化、アセチル化、アミド化、ビオチン化、ダンシル化）された精製合成ポリペプチドリガンドでは、精製合成ポリペプチドリガンドという用語は、リガンドのポリペプチド成分に適用するものである。ダンシル化にダンシル‐リジン基の付加が含まれる場合、ダンシル‐リジン基のリジンを欠いたポリペプチドが精製合成ポリペプチドリガンドである。

１２アミノ酸長、断片または相同体の機能試験は、「前記１２アミノ酸長Ｌ‐ペプチド、その断片または相同体は、Ｍ１３ファージのＮ末端ＰＩＩＩ融合ペプチドとして取り込まれると、該ファージにＣａｃｏ‐２細胞ホモジネート膜画分に結合する能力を与え、前記能力は同様に取り込まれた配列番号６７の１２アミノ酸長ペプチドによって与えられる能力と少なくとも同じである」ことによって例示される。結合試験を実施するために有用なクローニングベクターはニューイングランドラボ社（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｌａｂｓ Ｉｎｃ．）から入手可能なＭ１３ＫＥであり、ペプチドの取り込みに関する詳述（本明細書にその全体を援用した非特許文献２を参照のこと）のとおりである。２０〜３０アミノ酸より大きいペプチドは、そのように取り込まれたならば、Ｍ１３ウイルスの感染性に有害な影響を及ぼす。ファージ結合試験で試験するには大きすぎるペプチドの結合機能を試験する必要がある場合には、その大きなペプチドが検出可能な結合活性を保持しているかどうかを調べるために、その大きなペプチドのビオチン化体を本明細書に記載のＣａｃｏ‐２膜結合アッセイで試験することが可能である。

「Ｃａｃｏ‐２細胞ホモジネート膜画分」および簡単に「Ｃａｃｏ‐２細胞ホモジネート」という用語は、他に指示がなければ本明細書では互換的に使用される。ｉｎ ｖｉｖｏにおけるファージディスプレイライブラリスクリーニングを使用して、様々な種の腸パイエル板および非パイエル板組織ホモジネートに結合するポリペプチドリガンドを決定した。１００個のファージクローンから最も高い結合親和性（Ｏ．Ｄ．＞０．７５）を有するＤＮＡを配列決定して、ペプチドインサート（挿入ペプチド）の配列を同定した。３０個の固有配列を同定したところ、その中にいくつかの共通するトリペプチドモチーフがあった。いくつかのクローンについては複数のコピーが単離され、いくつかのクローンが別々のラットから単離された（以下の表１参照）。

全部で４３個の１２アミノ酸長ペプチドおよび関連ペプチド（表１および２参照）を合成し、結合実験におけるリガンドとして使用した。関連ペプチドには、選択した相同体、１２アミノ酸長のＤ型および反転型、並びに亜鉛結合キメラペプチド（配列番号４３）が含まれた。

前述の技法を使用することによって、発明者等はラット、イヌ、マウス、ブタおよび／またはヒト腸上皮組織を含めたいくつかの種の腸上皮への結合を媒介するいくつかのポリペプチドリガンドを同定した。したがって、本発明には以下のリガンドが含まれる（表１および２）。

１２アミノ酸長ペプチド配列の分析によって、いくつかのペプチドは共通モチーフを含有することが明らかになった。したがって、本発明は、これらのモチーフおよびこれらのモチーフを有するポリペプチドリガンドをも含んでおり、このポリペプチドリガンドによって薬剤を腸上皮、Ｍ細胞またはパイエル板組織に侵入または横断して輸送することが容易になる。

モチーフＰＰＹ、ＰＶＴ、ＬＧＴおよびＮＶＹには、すでに明確にされている受容体はない。モチーフＴＰＰＰは親和性の低いω‐オピオイドペプチドアンタゴニストとされてきた。ある種のオピオイド受容体は腸上皮上に認められている。本発明の他のモチーフはＮＶＹＴＸＸＸＸＳＰＸＰ（配列番号９８）で、式中Ｘは任意のアミノ酸である。

本発明の好ましい合成ポリペプチドリガンドは数群あり、各群の構成要素は関連したアミノ酸配列を含有する。第１のこのような群には、ＬＥＴＴＣＡＳＬＣＹＰＳ（配列番号８）、ＬＥＴＴＡＡＳＬＣＹＰＳ（配列番号３１）、ＬＥＴＴＣＡＳＬＡＹＰＳ（配列番号３２）、ＬＥＴＴＡＡＳＬＡＹＰＳ（配列番号３３）、ＬＥＴＴＳＡＳＬＳＹＰＳ（配列番号３４）、ｓｐｙｃｌｓａｃｔｔｅｌ（配列番号３５）およびｌｅｔｔｓａｓｌｓｙｐｓ（配列番号３６）からなる群から選択されたアミノ酸配列からなるリガンドが含まれる。第２のこのような群には、ＶＰＰＨＰＭＴＹＳＣＱＹ（配列番号２５）、ｙｑｃｓｙｔｍｐｈｐｐｖ（配列番号４０）、ＶＰＰＨＰＭＴＹＳＳＱＹ（配列番号３９）およびＶＰＰＨＰＭＴＹＳＡＱＹ（配列番号３８）からなる群から選択されたリガンドが含まれる。第３のこのような群には、ＶＣＳＮＭＹＦＳＣＲＬＳ（配列番号２４）、ｖｃｓｎｍｙｆｓｃｒｌｓ（配列番号４１）およびＶＳＳＮＭＹＦＳＳＲＬＳ（配列番号４２）からなる群から選択されたアミノ酸配列からなるリガンドが含まれる。

本発明のリガンドは、担体実体または薬剤を腸上皮、Ｍ細胞またはパイエル板組織の中へ、またはそれらを通過して輸送するために有用である。したがって、本発明は新規リガンドを提供するだけでなく、担体実体または薬剤を腸上皮、Ｍ細胞またはパイエル板組織内に進入またはそれらを横断して輸送する方法、並びに新規リガンド‐担体実体複合体を提供する。

本明細書では、「担体実体」という用語を、薬剤を運搬することが可能な粒子、小滴、細菌、ファージまたはウイルスとして定義する。本明細書では、「担体実体」という用語はまた、薬剤をコードし得る細菌、ファージまたはウイルスとして定義する。微粒子は、その「主要な寸法」が１〜５μｍの範囲、最も好ましくは１〜３μｍである粒子として定義する。ナノ粒子は、その主要な寸法が１μｍ未満、好ましくは１ｎｍ〜５００ｎｍ、最も好ましくは１０ｎｍ〜５００ｎｍの範囲である粒子として定義する。

本明細書では、球状粒子の主要な寸法はその直径で、円柱状の粒子ではその長さである。その他の粒子では、主要な寸法とはその粒子で可能な最長の寸法である。
薬剤を搭載した、またはカプセル化したナノ粒子および微粒子を、腸上皮組織、たとえばＭ細胞またはパイエル板組織を標的とするポリペプチドリガンド、たとえば本発明のポリペプチドリガンドで被覆することが可能である。被覆は共有結合または非共有結合によって実施することが可能である。共有結合は、吸着または任意のその他の被覆工程によって実施することが可能である。いずれの場合においても、この結合の形成により完成した粒子とするか、またはその後粒子の一部を形成する粒子成分とすることが可能である。

生物分解可能な粒子は好ましい。
あるいは、薬剤を直接ポリペプチドリガンドに結合することが可能である。薬剤自身がポリペプチドまたはペプチドの場合、生成物は薬剤とターゲティング（標的を目標とする）部分の両方からなるキメラポリペプチドである。細菌ベクターはその表面上にターゲティングリガンドを発現することが可能であり、同時に表面上に抗原を発現するか、または抗原をコードする遺伝子を有することも可能である。ウイルスベクターはその表面上にタ
ーゲティングリガンドを発現することが可能であり、表面上に抗原を発現するか、または抗原をコードする遺伝子を有することもまた可能である。

「薬剤」は、治療薬または診断薬である。治療薬は、現存する疾患を治療するため、または将来可能性のある疾患に対して防御するために予防的に投与するものである。診断薬は、診断方法の一部として投与される任意の薬剤である。

治療薬の例は、薬物、遺伝子、遺伝子送達ベクター、ＤＮＡワクチン、抗原および組換えウイルスである。
薬物には、たとえば、鎮痛剤、抗偏頭痛薬、抗血液凝固剤、制吐薬、心臓血管薬、抗高血圧症薬、麻薬拮抗薬、キレート剤、抗狭心症薬、化学療法剤、鎮静剤、抗新生物薬、プロスタグランジンおよび抗利尿薬、アンチセンスオリゴヌクレオチド、遺伝子修正（ｇｅｎｅ‐ｃｏｒｒｅｃｔｉｎｇ）ハイブリッドオリゴヌクレオチド、リボザイム、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）オリゴヌクレオチド、サイレンシングＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）オリゴヌクレオチド、アプタマー・オリゴヌクレオチドおよび三重鎖形成オリゴヌクレオチドが含まれる。

遺伝子送達ベクターの例は、ＤＮＡ分子、ウイルスベクター（たとえば、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、レトロウイルス、単純ヘルペスウイルス、およびシンドビスウイルス）ならびに陽イオン性脂質被覆ＤＮＡおよびＤＮＡデンドリマーである。

薬物の例は、インスリン、カルシトニン、カルシトニン遺伝子制御タンパク質、心房性ナトリウム利尿タンパク質、コロニー刺激因子、ベータセロン（商品名）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、インターフェロン（たとえば、α、βまたはγインターフェロン）、ソマトロピン、ソマトトロピン、ソマトスタチン、インスリン様成長因子（ソマトメジン）、黄体化ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ）、組織プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ）、成長ホルモン放出ホルモン（ＧＨＲＨ）、オキシトシン、エストラジオール、成長ホルモン、酢酸ロイプロリド、第ＶＩＩＩ因子およびインターロイキン（たとえば、インターロイキン‐２）である。代表的な薬物にはまた、鎮痛剤（たとえば、フェンタニール、スフェンタニール、ブトルファノール、ブプレノルフィン、レボルファノール、モルヒネ、ヒドロモルフォン、ヒドロコドン、オキシモルフォン、メタドン、リドカイン、ブピバカイン、ジクロフェナク、ナプロキセンおよびパベリン（ｐａｖｅｒｉｎ））、抗偏頭痛薬（たとえば、スマトリプタンおよび麦角アルカロイド）、抗血液凝固剤（たとえば、ヘパリンおよびヒルジン）、制吐薬（たとえば、スコポラミン、オンダンセトロン、ドンペリドンおよびメトクロプラミド）、心臓血管薬、抗高血圧症薬および血管拡張剤（たとえば、ジルチアゼム、クロニジン、ニフェジピン、ベラパミル、イソソルビド‐５‐一硝酸エステル、有機硝酸エステルおよび心臓障害の治療で使用する薬剤）、鎮静剤（たとえば、ベンゾジアゼピンおよびフェノチアジン）、麻薬拮抗薬（たとえば、ナルトレキソンおよびナロキソン）、キレート剤（たとえば、デフェロキサミン）、抗利尿薬（たとえば、デスモプレシンおよびバソプレシン）、抗狭心症薬（たとえば、ニトログリセリン）、抗新生物薬（たとえば、５‐フルオロウラシルおよびブレオマイシン）、プロスタグランジンならびに化学療法剤（たとえば、ビンクリスチン）が含まれる。

治療薬である抗原の例は、腫瘍抗原、病原体抗原およびアレルゲン抗原である。ワクチン調製物には、少なくとも１種の抗原が含まれる。「病原体抗原」とは、ウイルス、細菌、寄生生物または菌類から得られた抗原などの病原体に特有の抗原である。

重要な病原体の例には、コレラ菌、毒素原性大腸菌、ロタウイルス、クロストリジウム・ディフィシレ、赤痢菌、サルモネラ・チフィ、パラインフルエンザウイルス、インフルエンザウイルス、ストレプトコッカス・ミュータンス、熱帯熱マラリア原虫、黄色ブドウ
球菌、狂犬病ウイルスおよびエプスタイン‐バーウイルスが含まれる。

一般的なウイルスには、以下の科、ピコナウイルス科、カリチウイルス科、トガウイルス科、フラビウイルス科、コロナウイルス科、ラブドウイルス科、フィロウイルス科、パラミクソウイルス科、オルソミクソウイルス科、ブンヤウイルス科、アレナウイルス科、レオウイルス科、レトロウイルス科、ヘパドナウイルス科、パルボウイルス科、パポバウイルス科、アデノウイルス科、ヘルペスウイルス科およびポックスウイルス科が含まれる。

これらのウイルス、特に弱毒化体または、そうでなければ病原性のない修飾体を、修飾してその表面上にターゲティングリガンドを発現させ、それによりワクチン接種を促進することが可能である。

一般的な細菌には、Ｐ．アエルギノーサ、大腸菌、クレブシエラ属の細菌、セラチア属の細菌、シュードモナス属の細菌、Ｐ．セパシア、アシネトバクター属の細菌、表皮ブドウ球菌、Ｅ．フェカリス、Ｓ．ニューモニア、Ｓ．アウレウス、ヘモフィルス属の細菌、ナイセリア属の細菌、Ｎ．メニンジティディス、バクテロイド属の細菌、シトロバクター属の細菌、ブランハメラ属の細菌、サルモネラ属の細菌、シゲラ属の細菌、Ｓ．レステリア（Ｌｅｓｔｅｒｉａ）属の細菌、パスツレラ・ムルトシダ、ストレプトバシラス属の細菌、Ｓ．ピオゲネス、プロテウス属の細菌、クロストリジウム属の細菌、エリジペロスリックス属の細菌、スピリルム属の細菌、フソスピロヘータ（Ｆｕｓｏｓｐｉｒｏｃｈｅｔａ）属の細菌、トレポネーマ・パリダム、ボレリア属の細菌、アクチノミセス属、マイコプラズマ属の細菌、クラミジア属の細菌、リケッチア属の細菌、スピロヘータ属、レジオネラ属の細菌、ミコバクテリア属の細菌、ウレアプラズマ属の細菌、ストレプトマイセス属の細菌、トリコモナス属の細菌およびＰ．ミラビリスが含まれるが、これらだけに限定されない。

寄生生物には、熱帯熱マラリア原虫、三日熱マラリア原虫、卵形マラリア原虫、四日熱マラリア原虫、トキソプラズマ・ゴンディ、メキシコリーシュマニア、熱帯リーシュマニア、森林型熱帯リーシュマニア、エチオピアリーシュマニア、ドノバンリーシュマニア、クルーズトリパノソーマ、ブルーストリパノソーマ 、マンソン住血吸虫、ビルハルツ住血吸虫、日本住血吸虫、旋毛虫、バンクロフト糸状虫、マレー糸状虫、赤痢アメーバ、蟯虫（Ｅｎｔｅｒｏｂｕｓ ｖｅｒｍｉｃｕｌｏａｒｕｓ）、有鉤条虫、無鉤条虫、膣トリコモナス、腸トリコモナス、口腔トリコモナス、ランブル鞭毛虫、クリプトスポリジウム・パルバム、ニューモシスチス・カリニ、バベシア・ボビス、Ｂ．ディバージエンス、ネズミバベシア（Ｂ．ｍｉｃｒｏｔｉ）、イソスポラ（Ｉｓｏｓｐｏｒｅ ｂｅｌｌｉ）、Ｌ．ホミニス、二核アメーバ、回旋糸状虫、回虫、アメリカ鉤虫、ズビニ鉤虫、糞線虫、フィリピン毛頭虫、広東住血線虫、小形条虫、広節裂頭条虫、単包条虫、多包条虫、ウェステルマン肺吸虫、Ｐ．カリエンシス（ｃａｌｉｅｎｓｉｓ）、シナ肝吸虫、ネコ肝吸虫、タイ肝吸虫（Ｇ．Ｖｉｖｅｒｉｎｉ）、肝蛭、疥癬虫、ヒトジラミ、ケジラミ（Ｐｈｔｉｒｉｕｓ ｐｕｂｉｓ）、およびヒトヒフバエが含まれるが、これらだけに限定されない。

一般的な菌類には、クリプトコックス・ネオフォルマンス、ブラストマイセス・デマティティジス（Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ ｄｅｍａｔｉｔｉｄｉｓ）、アイェロミセス・デルマティティジス（Ａｉｅｌｌｏｍｙｃｅｓ ｄｅｒｍａｔｉｔｉｄｉｓ）、ヒストプラスマ・カプスラーツム（Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｆｒａｉ ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ、コクシジオイデス・イミチス、カンジダ属の菌（Ｃ．アルビカンス、Ｃ．トロピカリス、Ｃ．パラプシローシス、Ｃ．ギリエルモンディおよびＣ．クルセイなど）、アスペルギルス属の菌（Ａ．フミガーツス、Ａ．フラバスおよびＡ．ニガーなど）、リゾプス属菌、リゾムコー
ル属の菌、クンニングアメラ属の菌、アポフィソミセス（Ａｐｏｐｈｙｓｏｍｙｃｅｓ）属の菌（Ａ．サクセナエ（ｓａｋｓｅｎａｅａ）、Ａ．ムコールおよびＡ．アブシジアなど）、スポロトリクス・シェンキィ、パラコクシジオイデス・ブラジリエンシス、シューダレシェリア・ボイディ（Ｐｓｅｕｄａｌｌｅｓｃｈｅｒｉａ ｂｏｙｄｉｉ）、トルロプシス・グラブラタおよび皮膚糸状菌（Ｄｅｒｍａｔｏｐｈｙｒｅｓ）が含まれるが、これらだけに限定されない。

アレルゲンである抗原は、ハプテン、または花粉、ほこり、カビ、胞子、鱗屑、昆虫および食品由来の抗原であり得る。具体例には、トキシコデンドロン属植物のウルシオールおよびセスキテルペノイドラクトンが含まれる。

アジュバントを、所望であれば、担体実体によって、または担体実体と共に輸送することが可能である。アジュバントの例は、フロイント完全アジュバント、フロイント不完全アジュバント、ハンター（Ｈｕｎｔｅｒ）のＴｉｔｅｒｍａｘ（登録商標）、Ｇｅｒｂｕ（登録商標）アジュバント、リビ（Ｒｉｂｉ）のアジュバント、モンタニド（Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ）ＩＳＡアジュバント、アルミニウム塩アジュバントおよびニトロセルロース吸着タンパク質である。

診断薬には、抗体、核酸およびイメージング剤、並びにこのような抗体、核酸またはイメージング剤を検出可能にするために必要な分子が含まれる。
腸上皮を有する生物に担体実体を投与するための本発明の好ましい方法には、担体実体が腸上皮に進入もしくは横断して、またはＭ細胞もしくはパイエル板などの腸の好ましい領域を進入もしくは横断して輸送されるように、担体実体の存在下で腸上皮を本発明のポリペプチドリガンドと接触させることが含まれる。

この担体実体およびポリペプチドリガンドを一緒に（たとえば、担体‐リガンド複合体の一部として、または分離した状態で）、または別々に投与することが可能である。経口投与が最も好ましいが、標的組織に到達するための経上皮輸送を必要とするその他の投与様式もまた許容される（たとえば、直腸投与）。

当然のことであるが、本発明のリガンドは、腸上皮のある種の細胞を標的とする能力を有するので、該リガンドは治療または予防のために該細胞自体を薬剤の標的とするのにも好適である。

前述のリガンドおよび方法に加えて、本発明にはまた本発明のリガンドをコードする核酸配列が含まれる。本明細書に記載したように、「コードする」という用語には、実際のコーディング配列または相補鎖が含まれる。好ましい本発明の核酸配列を以下の表に示す。

さらに、遺伝子コードの縮合に起因し同一のアミノ酸配列を生じる、これらＤＮＡ配列の全ての変異配列が本発明に含まれる。

以下の実施例を参照して本発明をさらに詳細に例示するが、本発明はそれらに限定されるものではないことを理解されたい。

（スクリーニング方法：ｉｎ ｖｉｖｏでのバイオパニング）
ファージディスプレイペプチドライブラリ（１．５×１０１１ｐｆｕの１２アミノ酸長）をラットループモデル（ｎ＝５）に十二指腸内接種した。血液試料を０、３０、６０、９０および１２０分の時点でラットループから採取した。次に動物を殺処分して、ループを切除した。これらのループから、パイエル板および非パイエル板組織を単離して、洗浄してホモジナイズした。これらの組織試料に存在するバクテリオファージを大腸菌内で増幅して、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）沈殿によって単離した。パイエル板特異的ファージの力価を測定して、その後のスクリーニングサイクルで使用するために選択した。

４回のスクリーニングサイクルを完了し、４回目にファージ力価（ｐｆｕ／ｍｌ）を求めた。

（ファージ結合試験）
実施例１で得られたファージプールをトップアガーとともにＬＢ寒天プレート上に広げ、Ｃａｃｏ‐２およびＩＥＣ‐６細胞モデルのほか様々な種から得られたパイエル板組織に対する結合をＥＬＩＳＡ分析で評価するために、ファージクローンを選択した。

ＥＬＩＳＡは、５μｇ／ｍｌのファージホモジネート、ブロッキング緩衝液すなわち１％ＢＳＡ‐ＴＢＳ、洗浄緩衝液すなわちＴＢＳ‐Ｔｗｅｅｎ（０．０５％）、１：５０００に希釈した抗Ｍ１３ビオチン複合体（リサーチダイアグノスティックス（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）ＲＤＩ‐ＰＲＯ６１５９７）、１：５０００に希釈したＥｘｔｒＡｖｉｄｉｎ（登録商標）アルカリホスファターゼ（シグマ（Ｓｉｇｍａ）Ｅ‐２６３６）およびｐＮＰＰ基質を用いて実施した。

続いて５００個のクローン（サイクル４のラット１〜５）を前述の方法を使用してアッセイした（結合特性については図１Ａ〜５を参照のこと）。これらのクローンは広範囲の活性を示し、全ての高結合クローンについては明らかに検出可能な濃度依存性結合を伴っていた。

１．特異性の測定：ラット小腸および／またはパイエル板に対するファージ結合の分析
ファージクローンのハイスループットスクリーニングのために、ビオチン‐ＥｘｔｒＡｖｉｄｉｎ（登録商標）アルカリホスファターゼアッセイを確立した。最初のスクリーニングで、高結合クローンとして５００個のクローンから５５個を同定した（吸光度の読取り値＞０．７５）。

ラット組織ホモジネートは、ラットＧＩおよびパイエル板を採取し、必要になるまで、または１〜２時間氷上で保存することによって用意した。次に、プロテアーゼ阻害剤カクテルを含むホモジナイズ用緩衝液（２５０ｍＭスクロース、１２ｍＭ Ｔｒｉｓ、１６ｍＭ ＥＤＴＡ）にこの組織を入れた。手持ち式のホモジナイザーを使用して組織を３〜４分間破砕した。次にホモジナイザーの内容物を微量遠心管に移して、１５００ｒｐｍで１分間遠心した。上清を取り出し、バイオラッド（Ｂｉｏ‐Ｒａｄ）のアッセイを使用してタンパク質含量を測定した。次にパイエル板特異的結合特性および非特異的結合特性の間の区別を可能にするために特異性試験を実施した。５５個の高結合クローンについて、パイエル板組織（すなわち、組織ホモジネート膜画分）存在下で、および非存在下でラット小腸ホモジネート（すなわち、ホモジネート膜画分）への結合をアッセイした（図６および７参照）。陰性対照はペプチドインサートを持たないＭ１３ｍｐ１８とした。この陰性対照は、一貫して０．２００未満の吸光度の読取り値を示した。クローンは全て、いずれの組織のタイプに対しても対照と比較して著しく高い結合性を示した。しかし、パイエル板組織および非パイエル板組織への結合の差は無視できるものであり、これらのクローンが両方の組織のタイプに共通の要素に結合することが示唆された。
さらに吸光度が０．５〜０．７５のクローンを５０個使用したとき、これらの結果には再現性があった。

２．種特異性：ブタ、イヌおよびマウスの小腸および／またはパイエル板へのファージの結合分析
１００個の高結合クローンについて、パイエル板組織ホモジネートを含む、および含まない、ブタ、イヌおよびマウスの小腸ホモジネートへの結合特性をアッセイした（図８、９、１０参照）。これらのホモジネートは、前述のラットホモジネートを得る方法と同様の方法で調製した。ラット組織で認められたように、クローン全てについてパイエル板組織および非パイエル板組織への結合の差は無視できるものであり、これらのクローンが両方の組織のタイプに特異的な部位に結合していることが示唆された。ラットモデルにおいて最も高い結合を示した数個のクローンは、イヌおよびブタのモデル系においても高結合クローンとして分類された。１．００２、１．００９、１．０１６、１．０３８、１．０８３、２．０７８、２．０８０、３．０８４、３．０８７および５．０７４と番号づけられたこれらのクローンを、高、中程度および低結合性を示す１００個のクローンと一緒に、結合機能に関連し得るペプチドインサートの性質を決定するための配列決定用に選択した。

３．ＩＥＣ‐６およびＣａｃｏ‐２ホモジネートに対するファージ結合アッセイ
７０個のクローンについて、細胞ホモジネート（ＩＥＣ‐６およびＣａｃｏ‐２ホモジネート）への結合をアッセイした。ＩＥＣ‐６細胞はラット正常小腸上皮細胞株、Ｃａｃｏ‐２細胞はヒトの小腸上皮細胞の特性を示すと考えられるヒト結腸上皮腺癌細胞株である。

Ｃａｃｏ‐２の細胞膜および細胞基質画分を調製するために、（７５ｃｍ^２フラスコで１週間まで３７℃でＣＯ_２５％で増殖させた）コンフルエントなＣａｃｏ‐２細胞単層をダルベッコＰＢＳ（ＤＰＢＳ）で２回洗浄した。次にこの細胞単層を１０ｍＭ ＥＤＴＡ‐ＤＰＢＳで５〜１０分間３７℃で処理して、１０００ｒｐｍで５分間遠心分離することによって細胞をハーベストした。次に、細胞をＤＰＢＳで３回洗浄した。細胞ペレットを３倍体積の氷冷ＨＥＤ緩衝液（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．６７）、１ｍＭ ＥＧＴＡ、０．５ｍＭジチオスレイトール、１ｍＭフェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ））に再懸濁し、同細胞を氷上で５分間膨張させた。次にこの細胞を３０秒間ホモジネートした。次にこの細胞ホモジネートを堅壁管（ｈａｒｄ ｗａｌｌｅｄ ｔｕｂｅ）で４００００ｒｐｍで４５分間４℃で遠心分離した（超遠心Ｔｉ９０ロータ）。上清を取り出し、ペレットをＨＥＤＧ緩衝液（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．６７）、１ｍＭ ＥＧＴＡ、０．５ｍＭジチオスレイトール、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１０％グリセロール、１ｍＭ ＰＭＳＦ）に再懸濁した。次に３倍体積の緩衝液を添加し、ペレットを再懸濁して１０００ｒｐｍで２分間再度遠心した。上清を取り出して、氷上で保存した。第２の上清を第１の上清に添加してこの手順を繰り返し、次にこの手順をさらに２〜３回繰り返した。バイオラッド（Ｂｉｏ‐Ｒａｄ）のタンパク質アッセイを使用してタンパク質濃度を測定した。画分は全て−８０℃で保存した。

ＩＥ‐６細胞ホモジネートを前述のＣａｃｏ‐２ホモジネートと同様の方法で調製した。
ＥＬＩＳＡによるファージクローンのＣａｃｏ‐２細胞膜画分への結合分析を以下の通り実施した。９６ウェルＥＬＩＳＡプレートを一晩４℃でＣａｃｏ‐２細胞膜画分（０．０５Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）中に１０μｇ／ｍｌ、１００μｌ／ウェル）で被覆した。次に、このプレートを１．５％ＢＳＡ‐ＴＢＳ（１００μｌ／ウェル）で室温で１時間ブロッキングしてからＴＢＳ／Ｔｗｅｅｎ２０（０．０５％）で３回洗浄した。ファージクローン（１．５％ＢＳＡ‐ＴＢＳで１：２に希釈）を連続希釈してプレートに入れ、室温で１〜２時間インキュベートした。ＴＢＳ／Ｔｗｅｅｎ２０で３回洗浄後、ファージをビオチン化マウス抗Ｍ１３ＭＡｂ（１．５％ ＢＳＡ‐ＴＢＳで１：５０００に希釈、ＲＤＩ社、１００μｌ／ウェル）とともに室温で１時間インキュベートした。該プレートを３回洗浄してからＥｘｔｒＡｖｉｄｉｎ（登録商標）ＡＰ（１．５％ ＢＳＡ‐ＴＢＳで１：５０００に希釈、シグマ（Ｓｉｇｍａ）、１００μｌ／ウェル）とともに室温で１時間インキュベートした。このプレートを再度ＴＢＳ／Ｔｗｅｅｎ２０で３回洗浄した。アルカリホスファターゼ活性を基質ｐ‐ＮＰＰ（ｐ‐ニトロフェニルホスフェート）を使用して検出した。３０分後、酵素反応の進行を３Ｍ ＮａＯＨ（１００μｌ／ウェル）の添加により停止させた。ＥＬＩＳＡプレートリーダーを使用して、プレートを４０５ｎｍで読み取った。

クローンは、濃度依存性結合を示す広範囲の高結合活性を示した。結合特性は、未分化および分化Ｃａｃｏ‐２細胞画分が同様の結果を与えることを示した。異なる組織および細胞種の間で吸光度は変化したが、全体の結合特性は変化しないままであった（図１１および１２参照）。

（選択したファージクローンのインサートの配列決定）
高結合クローン全てと、選択した中程度および低結合クローンを含む実施例３のファージクローン１００個の配列を決定して、ペプチドインサートの性質を測定した。

キアゲン社（Ｑｉａｇｅｎ）のＱｉａｐｒｅｐ（登録商標）Ｍ１３スピンキットを使用してファージＤＮＡを単離した。単離したＤＮＡを沈殿させ、その後ペプチドインサートの３’側１１７塩基対に位置する９６ ｇＩＩＩ配列決定プライマーを用いて配列決定した。

配列決定した１００個のインサートのうち、５３％は遺伝子ＩＩＩに検出可能なインサートを含有しておらず、これらのクローンは全て吸光度＜０．４の低結合クローンであることが示された。これはライブラリのファージ（ＭＰ１３ＫＥ）と一致するようであり、選択したクローンの最終増幅中にインサートが脱落したことを示すものかもしれず、またパイエル板Ｍ細胞または腸細胞のいずれかに粒子状物質として摂取される能力により選択されたのかもしれず、あるいはこれらのクローンが遺伝子ＩＩＩ、遺伝子ＶＩＩまたはＭ１３の他の遺伝子のどこかに変異を有し、該変異がｉｎ ｖｉｖｏでの腸上皮またはパイエル板組織への結合／取り込みに関するスクリーニングプログラムにおいて選択されたのかもしれない。

予測ペプチド配列とタンパク質／ペプチド配列データベースとを比較するために、Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔデータベースを使用したＢＬＡＳＴ検索を特有の配列のうち３０個について実施した。ＢＬＡＳＴ配列比較の概要は以下の通りである。

配列番号４の相同体は、腸並びにその他の上皮細胞によって発現されるケラチノサイト成長因子受容体（ＫＧＦＲ）であることが発見された。これは、間質細胞で産生され上皮
細胞の増殖をもたらす、マイトジェンである繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）ファミリーの一種、ＫＧＦと相互作用する。ＫＧＦ‐ＫＧＦＲ相互作用は、上皮修復過程において役割を担っているものと考えられる。非特許文献３、４を参照のこと。

配列番号５の相同体は、組織型プラスミノーゲン活性化因子（ｔ‐ＰＡ）およびプラスミノーゲン活性化抑制因子１型（ＰＡＩ‐１）もまた含まれるプラスミノーゲン活性化システムのメディエータの１つである、ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子（ｕ‐ＰＡ）である。ｕ‐ＰＡは、プラスミノーゲンを切断して活性化プラスミンとするが、活性化プラスミンは細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の成分を分解することが可能である。ｕ‐ＰＡ受容体（ｕ‐ＰＡＲ）は腸上皮を含めた様々な種類の上皮細胞で発現することが示されている。非特許文献５を参照のこと。ｕ‐ＰＡＲを標的とすることによって、遺伝子送達が促進されることも示されている。非特許文献６を参照のこと。

配列番号６は、カドヘリン前駆体と相同であることが発見された。カドヘリンは、完全な、選択的透過性の、上皮層の形成を可能にする上皮接着分子である。カドヘリンは、カドヘリンをアクチン細胞骨格に結合させるのでカテニンと称される細胞質タンパク質と複合体を形成する膜貫通糖タンパク質である。Ｅ‐カドヘリン／カテニン相互作用は、腸上皮細胞およびタイトジャンクションの完全性にとって重要である。非特許文献７を参照のこと。

配列番号７の相同体は、ＩｇＥのＦｃ領域に結合するＩ型膜貫通タンパク質である、高親和性ＦｃεＲＩのαサブユニットである。ヒトでは、ＦＣεＲＩは、マスト細胞および好塩基球の活性化において役割を担っており、ＩｇＥ媒介性の抗原提示に関与する。したがって、ＦＣεＲＩはアレルギー応答の誘導および維持の中心で、寄生虫感染において生理学的防御をもたらし得る。非特許文献８を参照のこと。このタンパク質は、マスト細胞、好酸球、ランゲルハンス細胞、樹状細胞および単球で発現する。

配列番号８は、レクチン関連タンパク質と強い相同性を示すが、腸細胞の糖衣に結合することが既に示されている本当のレクチンとは異なり、このタンパク質は炭水化物結合活性を有していない。非特許文献９を参照のこと。

配列番号９の相同体は、精子の卵子細胞外マトリックスへの接着を促進するゾナデシン前駆体である、非特許文献１０を参照のこと。これは、腸ムチン、ｍｕｃ２との類似性を有する接着性糖タンパク質フォン・ビルブランド因子ドメインを含有する。これらのドメインのうちの１つに、選択したペプチドとの相同性が認められる。

配列番号１０の相同体は、細胞外マトリックスの主要な構造タンパク質、エラスチンである。マウスでは、エラスチンを基質とするマトリックスメタロプロテアーゼであるマトリライシンは、子宮、小腸および精管外の上皮細胞に認められる。非特許文献１１を参照のこと。興味深いことに、マウスエラスチンとの相同性を備えた６残基ペプチドモチーフがこのタンパク質内で５回繰り返され、一方この配列内の４残基モチーフは１３回繰り返される。

配列番号１２は、ＥＣＭコラーゲンの分解並びにｕ‐ＰＡの切断に関与するストロメライシン、またはＭＭＰ‐３に相同性を示す。非特許文献１２を参照のこと。ストロメライシンは、腸組織のリモデリングおよび修復において他のＭＭＰファミリーのメンバーとともに重要な役割を果たす。非特許文献１３を参照のこと。ペプチド配列番号２５は、ＴＩＭＰ‐１（ＭＭＰの組織インヒビター）と相同性を示した。このタンパク質はＭＭＰと不可逆な複合体を形成し、したがってそれらを不活性化する。このタンパク質は腸に存在するが、腸においてこのタンパク質は、ＭＭＰとともに、腸内で行われる修復および再生の
進行に重要である。

配列番号１５の相同体は、絨毛に位置する上皮細胞で発現する刷子縁加水分解酵素である腸スクラーゼ‐イソマルターゼであった。最大量の加水分解酵素が腺窩‐柔突起接合部および柔突起下部から中間部領域に位置する。非特許文献１４を参照のこと。ｉｎ ｖｉｔｒｏ共培養モデルではＭ細胞上で下方制御されることが示されている。非特許文献１５を参照のこと。

２種類の異なるペプチド、配列番号８および配列番号１９はそれぞれカゼインＡおよびカゼインＢとの相同性を示す。カゼインは乳タンパク質であり、小腸の刷子縁膜に結合することが示されている。非特許文献１６を参照のこと。

選択したペプチドの１つ、配列番号２０は、マウス密着結合タンパク質、ＺＯ‐１との相同性を有する。非特許文献１７を参照のこと。Ｎ末端は、密着結合の構築に必要なシグナルの変換に関与する可能性があり、Ｃ末端は密着結合の特異的特性を備え得る。ＺＯ‐１は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでカドヘリンと相互作用することが示されている。

いくつかのペプチド、配列番号２３、２６および２７は、バーシカンおよびコラーゲンを含むＥＣＭタンパク質と相同な領域を示す。これらのタンパク質およびプロテオグリカンは、細胞を互いに連結する接着剤として作用するだけでなく、細胞の運動性、増殖および分化においても作用し、組織の完全性にとって重要である。

配列番号２９は、いくつかの生物種由来の高親和性インシュリン様成長因子Ｉ受容体（ＩＧＦ ＩＲ）と相同性を示す。ＩＧＦ ＩＲは、腸の上皮細胞を含めた組織に広く発現し、そこで上皮細胞増殖因子として作用する。非特許文献１８を参照のこと。ＩＧＦは完全静脈栄養の候補品である。

ペプチド配列（配列番号３、４、５、７、８、９、１０、１１、１４、１５、１６、１７、１９、２０、２６、２８、２９、３０）を、全ペプチドのアミノ末端と、さらに配列番号８および１４についてはカルボキシル末端にもビオチンタグをつけて合成した。これらのペプチドのＣａｃｏ‐２ホモジネートおよび／またはラット腸組織ホモジネートへの結合を、ＥＬＩＳＡをベースとしてストレプトアビジン‐ペルオキシダーゼで検出するアッセイで試験した。ペプチド配列番号３、８、２５および２４では、両タイプの組織に対して強い結合が認められた（図１３Ａ〜１３Ｎ参照）。

ペプチド配列（配列番号３、７、８、９、および１４）を、全ペプチドのアミノ末端と、さらに配列番号８および１４についてはカルボキシル末端にもビオチンタグをつけて合成した。これらのペプチドの、様々な種、すなわちイヌ、マウス、ブタ、およびラットの腸組織に対する結合を実施した。異なる種の組織に対する結合特性には大きな差は認められなかった（図１４Ａ〜１４Ｈ参照）。ラットの様々な器官、すなわち肝臓、肺、腸間膜リンパ節、脾臓および腎臓の組織に対するペプチド（配列番号８および１４）の結合を実施した。これらの組織に対する結合特性には大きな差は認められなかった（図１５Ａ〜１５Ｅ参照）。

単離クローン由来の３種類の合成ペプチド（配列番号８、２５および１４）をビオチン化して、ヒトパイエル板組織切片に対する結合を試験した。さらに、既知の陰性結合ペプチドを陰性対照として含めた。ヒトパイエル板のパラフィン切片を脱パラフィンして、脱
水した。この切片をＰＢＳで洗浄した。組織上の抗原決定基を、２．１ｇ／Ｌの酢酸中で５分間マイクロ波を当てて露出させ、プラスティックラップで覆って室温で２０分間冷却させた。２０分後、この切片をＰＢＳで洗浄して、次にメタノールに溶かした１％過酸化水素中において内在性ペルオキシダーゼで１０分間ブロッキングした。すすぎを繰り返し、この切片をＰＢＳに溶かした２％ＢＳＡで室温で２０分間ブロッキングした。この切片をＰＢＳ中の２％ＢＳＡに溶かしたペプチド５０μｇ／ｍｌとともに室温で１時間インキュベートした。対照組織はＢＳＡ単独で処理した。切片をＰＢＳに溶かした０．０５％Ｔｗｅｅｎですすいだ。２％ＢＳＡで１／５００にしたストレプトアビジン‐ＨＲＰを添加し室温で３０〜６０分間とした。再度、この切片をＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎですすいだ。ＤＡＢ基質を添加して最大５分とし、スライドを水に浸漬することによって反応を停止させた。この切片をヘマトキシリンで５０秒間対比染色して、次に水ですすいだ。このスライドを１％酸アルコール中で５〜１０秒間識別化（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅ）して、次に水ですすいだ。このスライドを、水性の封入剤およびカバーガラスを使用して封入した。陰性対照ペプチドは結合を示さなかった。配列番号１４（ＥＬＩＳＡで測定したところ低から中程度の結合であった）も、この実験では結合は陰性であった。ヒトパイエル板に対する結合は、配列番号８および２５で陽性であった。いずれのペプチドもヒト腸細胞の先端側に陽性染色をもたらした。

（システイン結合実験）
濃度６．２５μｇ／ｍｌ、１２．５μｇ／ｍｌおよび２５μｇ／ｍｌのペプチド配列番号８を濃度範囲１００ｍＭから０．００３ｍＭにわたるＬ‐システインと一緒にインキュベートした。濃度６．２５μｇ／ｍｌの配列番号２５を濃度範囲１００ｍＭから０．００３ｍＭにわたるＬ‐システインと一緒にインキュベートした。遊離Ｌ‐システインの存在により結合が妨害され、したがってこれらのペプチドの結合にはシステイン基も関与することが示された（図１６Ａから１６Ｄ）。

（実験例の考察）
配列番号８の腸上皮組織に対する結合は中程度である。２個のシステイン残基のうちいずれかをアラニン残基で置換した場合（配列番号３１および３２）、結合は依然として維持される。両方のシステインをアラニン残基で置換すると（配列番号３３）、上皮への結合が消失する。ビオチンタグをアミノ末端またはカルボキシル末端のいずれかに添加しても、結合親和性の差は認められなかった（図１７Ａ参照）。

配列番号２５は最も高い結合性を示すファージ由来ペプチドである。システイン残基をアラニン残基で置換すると（配列番号３８）、上皮への結合は消失する。安定化したＤ型（配列番号３７）および反転Ｄ型（配列番号４０）では、高い結合が維持された（図１７Ｂ参照）。

配列番号２４の結合は中程度である。システイン残基をアラニン残基で置換すると、上皮への結合は消失する。

カルボキシル末端に亜鉛結合モチーフ（ＨＥＳＳＨ）を添加した配列番号３の誘導体（配列番号４３）のＣａｃｏ‐２ホモジネートへの結合を試験した。このモチーフの添加によって結合の促進が認められた（図１８参照）。

いくつかのファージ由来ペプチド（配列番号２５、３１、３２、３３、および４０）をストレプトアビジン粒子に吸着させた（０．２８９μｍ）。ペプチドで被覆された粒子の
Ｃａｃｏ‐２ホモジネートへの結合を、ＥＬＩＳＡをベースとしたアッセイで試験した。試験した全例において結合が維持されていた。さらに、２重変異ペプチドリガンド（配列番号３３）をポリスチレン粒子に吸着させると、元のペプチドの約６０％の結合が認められる（図１９Ａ〜１９Ｂ参照）。

ビオチン化した配列番号４０を室温で通常の方法を使用して蛍光ポリスチレン粒子（０．２８９μｍ）の表面に吸着させた。１種または複数のポリスチレン懸濁液（通常１ｍｌ当たり５．０×１０^１０個の粒子を含有するものを３００μｌ）を含めたマウス腸ループを３０分間インキュベートした。パイエル板を切除して、メタノールで固定して、続く共焦点顕微鏡による分析のためにＭ細胞をＵＥＡ１‐ローダミンで対比染色した。染色した組織をバイオラッド（ＢｉｏＲａｄ）ＭＲＣ ６００共焦点レーザー走査顕微鏡で調べた。

ペプチド配列番号４０で被覆した蛍光粒子はＭ細胞に結合し、取り込まれた。対照のストレプトアビジン粒子を使用すると、結合も取り込みも見られなかった。

（消化管から血液へのファージの移動を調べるための血液試料の力価測定）
高結合ファージクローン番号１．００９、５．０７４、２．０７８および４．００９を前述のようにラット腸ループに注射した。１群当たりマウスは３匹とした。０、３０、６０、９０および１２０分に血液試料を採取した。次に、動物を殺処分してループを切除した。各血液試料１００μｌをＬＢで連続希釈して、ＩＰＴＧ／Ｘｇａｌを含有するトップアガープレートに広げた。３７℃で一晩インキュベートした後、青いプラークを計数した。ＰＢＳ対照およびｍ１３ｍｐ１９対照を置いた。

配列番号８は好ましいファージ由来ペプチドの１つである。このペプチドは、中程度の結合性を有する。２個のシステイン残基のうちいずれかを置換すると、結合が消失する。しかし、この２重変異ペプチドリガンドをポリスチレン粒子に吸着させると、元のペプチドの約６０％の結合が認められる。このことは、ペプチドの立体構造が重要であることを示している可能性がある。この１２アミノ酸長はアミノ末端またはカルボキシ末端にビオチンタグを伴って合成した。ビオチンタグの添加によって、結合親和性の差は認められなかった。安定化されたＤ型および反転Ｄ型は、強い結合性を維持していた。

配列番号２５は、ファージ由来ペプチドのうち最も強い結合性を有する。システイン残
基をアラニン残基で置換すると、結合が消失する。配列番号２５の安定化されたＤ型および反転Ｄ型は強い結合性を維持していた。

詳細に、かつその具体的な実施例を参照して本発明を説明してきたが、当業者には本発明の思想および範囲を逸脱することなく様々な変更形態および修正形態を作製し得ることが明らかであろう。

ラット１由来のファージのラットパイエル板組織への結合を４０５ｎｍにおける吸光度の関数として示すグラフ。 ラット１由来のファージのラットパイエル板組織への結合を４０５ｎｍにおける吸光度の関数として示すグラフ。 ラット２由来のファージのラットパイエル板組織への結合を４０５ｎｍにおける吸光度の関数として示すグラフ。 ラット３由来のファージのラットパイエル板組織への結合を４０５ｎｍにおける吸光度の関数として示すグラフ。 ラット４由来のファージのラットパイエル板組織への結合を４０５ｎｍにおける吸光度の関数として示すグラフ。 ラット５由来のファージのラットパイエル板組織への結合を４０５ｎｍにおける吸光度の関数として示すグラフ。 パイエル板組織存在下および非存在下における５５個の高結合クローンのラット小腸ホモジネートへの結合を４０５ｎｍにおける吸光度の関数として示すグラフ。 パイエル板組織存在下および非存在下における残りの５５個の高結合クローンのラット小腸ホモジネートへの結合を４０５ｎｍにおける吸光度の関数として示すグラフ。 パイエル板組織存在下および非存在下におけるクローンのイヌ小腸ホモジネートへの結合を４０５ｎｍにおける吸光度の関数として示すグラフ。 パイエル板組織存在下および非存在下におけるクローンのブタ小腸ホモジネートへの結合を４０５ｎｍにおける吸光度の関数として示すグラフ。 パイエル板組織存在下および非存在下におけるクローンのマウス小腸ホモジネートへの結合を４０５ｎｍにおける吸光度の関数として示すグラフ。 ファージクローンのラットパイエル板、Ｃａｃｏ‐２細胞およびＩＥＣ‐６細胞への結合を４０５ｎｍにおける吸光度の関数として示すグラフ。 ファージクローンの分化および非分化Ｃａｃｏ‐２細胞への結合を４０５ｎｍにおける吸光度の関数として示すグラフ。 アミノ末端にビオチンタグを備えた配列番号３の、Ｃａｃｏ‐２ホモジネートおよびラットＧＩホモジネートへの結合を、６５０ｎｍにおける吸光度の関数として示すグラフ。結果はＥＬＩＳＡをベースとしたアッセイでストレプトアビジン‐ペルオキシダーゼ検出を使用して得られた。 アミノ末端にビオチンタグを備えた配列番号４の、Ｃａｃｏ‐２ホモジネートおよびラットＧＩホモジネートへの結合を、６５０ｎｍにおける吸光度の関数として示すグラフ。結果はＥＬＩＳＡをベースとしたアッセイでストレプトアビジン‐ペルオキシダーゼ検出を使用して得られた。 アミノ末端にビオチンタグを備えた配列番号７の、Ｃａｃｏ‐２ホモジネートおよびラットＧＩホモジネートへの結合を、６５０ｎｍにおける吸光度の関数として示すグラフ。結果はＥＬＩＳＡをベースとしたアッセイでストレプトアビジン‐ペルオキシダーゼ検出を使用して得られた。 アミノ末端およびカルボキシル末端にビオチンタグを備えた配列番号８の、Ｃａｃｏ‐２ホモジネートおよびラットＧＩホモジネートへの結合を、６５０ｎｍにおける吸光度の関数として示すグラフ。結果はＥＬＩＳＡをベースとしたアッセイでストレプトアビジン‐ペルオキシダーゼ検出を使用して得られた。 アミノ末端にビオチンタグを備えた配列番号５の、Ｃａｃｏ‐２ホモジネートおよびラットＧＩホモジネートへの結合を、６５０ｎｍにおける吸光度の関数として示すグラフ。結果はＥＬＩＳＡをベースとしたアッセイでストレプトアビジン‐ペルオキシダーゼ検出を使用して得られた。 アミノ末端およびカルボキシル末端にビオチンタグを備えた配列番号１４の、Ｃａｃｏ‐２ホモジネートおよびラットＧＩホモジネートへの結合を、６５０ｎｍにおける吸光度の関数として示すグラフ。結果はＥＬＩＳＡをベースとしたアッセイでストレプトアビジン‐ペルオキシダーゼ検出を使用して得られた。 アミノ末端にビオチンタグを備えた配列番号９の、Ｃａｃｏ‐２ホモジネートおよびラットＧＩホモジネートへの結合を、６５０ｎｍにおける吸光度の関数として示すグラフ。結果はＥＬＩＳＡをベースとしたアッセイでストレプトアビジン‐ペルオキシダーゼ検出を使用して得られた。 アミノ末端にビオチンタグを備えた配列番号２０の、Ｃａｃｏ‐２ホモジネートおよびラットＧＩホモジネートへの結合を、６５０ｎｍにおける吸光度の関数として示すグラフ。結果はＥＬＩＳＡをベースとしたアッセイでストレプトアビジン‐ペルオキシダーゼ検出を使用して得られた。 アミノ末端にビオチンタグを備えた配列番号１７の、Ｃａｃｏ‐２ホモジネートおよびラットＧＩホモジネートへの結合を、６５０ｎｍにおける吸光度の関数として示すグラフ。結果はＥＬＩＳＡをベースとしたアッセイでストレプトアビジン‐ペルオキシダーゼ検出を使用して得られた。 アミノ末端にビオチンタグを備えた配列番号２８の、Ｃａｃｏ‐２ホモジネートおよびラットＧＩホモジネートへの結合を、６５０ｎｍにおける吸光度の関数として示すグラフ。結果はＥＬＩＳＡをベースとしたアッセイでストレプトアビジン‐ペルオキシダーゼ検出を使用して得られた。 アミノ末端にビオチンタグを備えた配列番号２６の、Ｃａｃｏ‐２ホモジネートおよびラットＧＩホモジネートへの結合を、６５０ｎｍにおける吸光度の関数として示すグラフ。結果はＥＬＩＳＡをベースとしたアッセイでストレプトアビジン‐ペルオキシダーゼ検出を使用して得られた。 アミノ末端にビオチンタグを備えた配列番号１１の、Ｃａｃｏ‐２ホモジネートおよびラットＧＩホモジネートへの結合を、６５０ｎｍにおける吸光度の関数として示すグラフ。結果はＥＬＩＳＡをベースとしたアッセイでストレプトアビジン‐ペルオキシダーゼ検出を使用して得られた。 アミノ末端にビオチンタグを備えた配列番号１０の、Ｃａｃｏ‐２ホモジネートへの結合を、６５０ｎｍにおける吸光度の関数として示すグラフ。結果はＥＬＩＳＡをベースとしたアッセイでストレプトアビジン‐ペルオキシダーゼ検出を使用して得られた。 アミノ末端にビオチンタグを備えた配列番号１６の、Ｃａｃｏ‐２ホモジネートへの結合を、６５０ｎｍにおける吸光度の関数として示すグラフ。結果はＥＬＩＳＡをベースとしたアッセイでストレプトアビジン‐ペルオキシダーゼ検出を使用して得られた。 アミノ末端にビオチンタグを備えた配列番号１９の、Ｃａｃｏ‐２ホモジネートおよびラットＧＩホモジネートへの結合を、６５０ｎｍにおける吸光度の関数として示すグラフ。結果はＥＬＩＳＡをベースとしたアッセイでストレプトアビジン‐ペルオキシダーゼ検出を使用して得られた。 アミノ末端にビオチンタグを備えた配列番号２９の、Ｃａｃｏ‐２ホモジネートおよびラットＧＩホモジネートへの結合を、６５０ｎｍにおける吸光度の関数として示すグラフ。結果はＥＬＩＳＡをベースとしたアッセイでストレプトアビジン‐ペルオキシダーゼ検出を使用して得られた。 アミノ末端にビオチンタグを備えた配列番号３０の、Ｃａｃｏ‐２ホモジネートへの結合を、６５０ｎｍにおける吸光度の関数として示すグラフ。結果はＥＬＩＳＡをベースとしたアッセイでストレプトアビジン‐ペルオキシダーゼ検出を使用して得られた。 アミノ末端にビオチンタグを備えた配列番号１５の、Ｃａｃｏ‐２ホモジネートへの結合を、６５０ｎｍにおける吸光度の関数として示すグラフ。結果はＥＬＩＳＡをベースとしたアッセイでストレプトアビジン‐ペルオキシダーゼ検出を使用して得られた。 アミノ末端およびカルボキシル末端の両方にビオチンタグを備えた配列番号８および１４のブタＧＩホモジネートへの結合を６５０ｎｍにおける吸光度の関数として示すグラフ。 アミノ末端およびカルボキシル末端の両方にビオチンタグを備えた配列番号８および１４のブタパイエル板ホモジネートへの結合を６５０ｎｍにおける吸光度の関数として示すグラフ。 アミノ末端およびカルボキシル末端の両方にビオチンタグを備えた配列番号８および１４のラットＧＩホモジネートへの結合を６５０ｎｍにおける吸光度の関数として示すグラフ。 アミノ末端およびカルボキシル末端の両方にビオチンタグを備えた配列番号８および１４のラットパイエル板ホモジネートへの結合を６５０ｎｍにおける吸光度の関数として示すグラフ。 アミノ末端およびカルボキシル末端の両方にビオチンタグを備えた配列番号８および１４のイヌＧＩホモジネートへの結合を６５０ｎｍにおける吸光度の関数として示すグラフ。 アミノ末端およびカルボキシル末端の両方にビオチンタグを備えた配列番号８および１４のイヌパイエル板ホモジネートへの結合を６５０ｎｍにおける吸光度の関数として示すグラフ。 アミノ末端およびカルボキシル末端の両方にビオチンタグを備えた配列番号８および１４のマウスＧＩホモジネートへの結合を６５０ｎｍにおける吸光度の関数として示すグラフ。 アミノ末端およびカルボキシル末端の両方にビオチンタグを備えた配列番号８および１４のマウスパイエル板ホモジネートへの結合を６５０ｎｍにおける吸光度の関数として示すグラフ。 アミノ末端にビオチンタグを備えた配列番号３、７および９のイヌＧＩホモジネートへの結合を６５０ｎｍにおける吸光度の関数として示すグラフ。 アミノ末端にビオチンタグを備えた配列番号３、７および９のイヌパイエル板ホモジネートへの結合を６５０ｎｍにおける吸光度の関数として示すグラフ。 アミノ末端にビオチンタグを備えた配列番号３、７および９のマウスＧＩホモジネートへの結合を６５０ｎｍにおける吸光度の関数として示すグラフ。 アミノ末端にビオチンタグを備えた配列番号３、７および９のマウスパイエル板ホモジネートへの結合を６５０ｎｍにおける吸光度の関数として示すグラフ。 アミノ末端およびカルボキシル末端にビオチンタグを備えた配列番号８および１４のラット肝臓組織ホモジネートへの結合を６５０ｎｍにおける吸光度の関数として示すグラフ。 アミノ末端およびカルボキシル末端にビオチンタグを備えた配列番号８および１４のラット脾臓組織ホモジネートへの結合を６５０ｎｍにおける吸光度の関数として示すグラフ。 アミノ末端およびカルボキシル末端にビオチンタグを備えた配列番号８および１４のラット肺組織ホモジネートへの結合を６５０ｎｍにおける吸光度の関数として示すグラフ。 アミノ末端およびカルボキシル末端にビオチンタグを備えた配列番号８および１４のラット腎臓組織ホモジネートへの結合を６５０ｎｍにおける吸光度の関数として示すグラフ。 アミノ末端およびカルボキシル末端にビオチンタグを備えた配列番号８および１４のラット腸間膜リンパ節組織ホモジネートへの結合を６５０ｎｍにおける吸光度の関数として示すグラフ。 様々な濃度の遊離Ｌ‐システインの存在下における濃度２５μｇ／ｍｌの配列番号８の腸上皮組織への結合を、６５０ｎｍにおける吸光度の関数として示すグラフ。 様々な濃度の遊離Ｌ‐システインの存在下における濃度１２．５μｇ／ｍｌの配列番号８の腸上皮組織への結合を、６５０ｎｍにおける吸光度の関数として示すグラフ。 様々な濃度の遊離Ｌ‐システインの存在下における濃度６．２５μｇ／ｍｌの配列番号８の腸上皮組織への結合を、６５０ｎｍにおける吸光度の関数として示すグラフ。 様々な濃度の遊離Ｌ‐システインの存在下における濃度６．２５μｇ／ｍｌの配列番号２５の腸上皮組織への結合を、６５０ｎｍにおける吸光度の関数として示すグラフ。 配列番号３１、３２および３３を含めた配列番号８の誘導体のＣａｃｏ‐２ホモジネートへの結合を、６５０ｎｍにおける吸光度の関数として示すグラフ。 配列番号３７、３８および４０を含めた配列番号２５の誘導体のＣａｃｏ‐２ホモジネートへの結合を、６５０ｎｍにおける吸光度の関数として示すグラフ。 亜鉛結合モチーフを備えた配列番号３（配列番号４３）のＣａｃｏ‐２ホモジネートへの結合を、６５０ｎｍにおける吸光度の関数として示すグラフ。 ストレプトアビジン粒子に吸着させた配列番号２５、３１、３２および３３のＣａｃｏ‐２細胞への結合を、６５０ｎｍにおける吸光度の関数として示すグラフ。 ストレプトアビジン粒子に吸着させた配列番号２５および４０のＣａｃｏ‐２細胞への結合を、６５０ｎｍにおける吸光度の関数として示すグラフ。

Claims (46)

1. 配列番号１〜３４、配列番号３８〜３９および配列番号４２からなる群から選択される１２アミノ酸長ペプチドを有する精製合成ポリペプチドであって、前記１２アミノ酸長ペプチドはＭ１３ファージのＮ末端ＰＩＩＩ融合ペプチドとして組み込まれると、該ファージにＣａｃｏ‐２細胞、ＩＥＣ‐６細胞、ラット、マウス、ブタまたはイヌのいずれかのホモジネート膜画分に結合する能力を与え、前記能力は、同様に組み込まれた配列番号６７の翻訳である１２アミノ酸長ペプチドによって与えられる能力と少なくとも同じであることを特徴とする、精製合成ポリペプチド。
2. 前記１２アミノ酸長ペプチドは、１２アミノ酸Ｌ−ペプチド、該１２アミノ酸Ｌ−ペプチドのＤ型、および該１２アミノ酸Ｌ−ペプチドの反転型から選択される請求項１に記載の精製合成ポリペプチド。
3. 亜鉛結合ドメインを含む請求項１または２に記載の精製合成ポリペプチド。
4. 配列番号１〜３４、配列番号３８、３９、および配列番号４２からなる群から選択されたアミノ酸配列からなる請求項１に記載の精製合成ポリペプチド。
5. 配列番号１〜３４、配列番号３８、３９、および配列番号４２からなる群から選択された１２アミノ酸長ペプチドまたはその反転型からなる請求項１に記載の精製合成ポリペプチド。
6. 長さが多くとも２００アミノ酸である請求項１〜３のいずれかに記載の精製合成ポリペプチド。
7. 長さが少なくとも３０アミノ酸である請求項１〜３のいずれかに記載の精製合成ポリペプチド。
8. 前記１２アミノ酸長ペプチドがＬＥＴＴＣＡＳＬＣＹＰＳ（配列番号８）、ＬＥＴＴＡＡＳＬＣＹＰＳ（配列番号３１）、ＬＥＴＴＣＡＳＬＡＹＰＳ（配列番号３２）、ＬＥＴ
   ＴＡＡＳＬＡＹＰＳ（配列番号３４）からなる群から選択される請求項１〜７のいずれかに記載の精製合成ポリペプチド。
9. 前記１２アミノ酸長ペプチドがＬＥＴＴＣＡＳＬＣＹＰＳ（配列番号８）である請求項１〜７のいずれかに記載の精製合成ポリペプチド。
10. 前記１２アミノ酸長ペプチドがＶＰＰＨＰＭＴＹＳＣＱＹ（配列番号２５）、ＶＰＰＨＰＭＴＹＳＳＱＹ（配列番号３９）およびＶＰＰＨＰＭＴＹＳＡＱＹ（配列番号３８）からなる群から選択される１２アミノ酸長Ｌ‐ペプチドである請求項１〜７のいずれかに記載の精製合成ポリペプチド。
11. 前記１２アミノ酸長ペプチドがＶＰＰＨＰＭＴＹＳＣＱＹ（配列番号２５）である請求項１〜７のいずれかに記載の精製合成ポリペプチド。
12. 前記１２アミノ酸長ペプチドがＶＣＳＮＭＹＦＳＣＲＬＳ（配列番号２４）およびＶＳＳＮＭＹＦＳＳＲＬＳ（配列番号４２）からなる群から選択される請求項１〜７のいずれかに記載の精製合成ポリペプチド。
13. 前記１２アミノ酸長ペプチドがＶＣＳＮＭＹＦＳＣＲＬＳ（配列番号２４）である請求項１〜７のいずれかに記載の精製合成ポリペプチド。
14. 前記１２アミノ酸長ペプチドが配列番号８、配列番号２４、および配列番号２５の１２アミノ酸長Ｌ−ペプチドのＤ型から選択される請求項１〜７のいずれかに記載の精製合成ポリペプチド。
15. 前記１２アミノ酸長ペプチドが配列番号８および配列番号２５の１２アミノ酸長Ｌ−ペプチドの反転型から選択される請求項１〜７のいずれかに記載の精製合成ポリペプチド。
16. ＨＥＳＳＨ（配列番号９７）およびＮＶＹＴＸＸＸＸＳＰＸＰ（配列番号９８）からなる群から選択されるＬ‐ペプチド、そのＤ‐ペプチド型、またはその反転型からなる精製合成ポリペプチドであって、前記Ｌ‐ペプチド、そのＤ‐ペプチド型、またはその反転型はＭ１３ファージのＮ末端ＰＩＩＩ融合ペプチドとして組み込まれると、該ファージにＣａｃｏ‐２細胞、ＩＥＣ‐６細胞、ラット、マウス、ブタまたはイヌのいずれかのホモジネート膜画分に結合する能力を与え、前記能力は、同様に組み込まれた配列番号６７の１２アミノ酸長ペプチドによって与えられる能力と少なくとも同じであることを特徴とする、精製合成ポリペプチド。
17. 長さが２００アミノ酸以下である請求項１６に記載の精製合成ポリペプチド。
18. 長さが５０アミノ酸以下である請求項１６に記載の精製合成ポリペプチド。
19. 長さ２００アミノ酸以下の精製合成ポリペプチドであって、配列番号７４〜配列番号９６からなる群から選択されたペプチドを有し、前記ペプチドはＭ１３ファージのＮ末端ＰＩＩＩ融合ペプチドとして組み込まれると、該ファージにＣａｃｏ‐２細胞、ＩＥＣ‐６細胞、ラット、マウス、ブタまたはイヌのいずれかのホモジネート膜画分に結合する能力を与え、前記能力は、同様に組み込まれた配列番号６７の翻訳である１２アミノ酸長ペプチドによって与えられる能力と少なくとも同じであることを特徴とする、精製合成ポリペプチド。
20. 前記ペプチドは、配列番号７４〜配列番号９６からなる群から選択されたペプチドのＬ型、Ｄ型、または反転型である請求項１９に記載の精製合成ポリペプチド。
21. 長さが多くとも５０アミノ酸である請求項１９または２０に記載の精製合成ポリペプチド。
22. ファージのタンパク質に組み込まれることを特徴とする、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の精製合成ポリペプチド。
23. ファージの表面上で発現されるポリペプチドであって、該ファージが同様に表面上に発現される抗原および同抗原をコードする遺伝子のうち少なくとも一方をさらに含むことを特徴とする、請求項２２に記載のポリペプチド。
24. 細菌の表面上で発現されるポリペプチドであって、該細菌が同様に表面上に発現される抗原および同抗原をコードする遺伝子のうち少なくとも一方をさらに含むことを特徴とする、請求項２２に記載のポリペプチド。
25. 薬剤を含む担体実体に共有結合または非共有結合される請求項１〜２１のいずれか一項に記載の精製合成ポリペプチド。
26. 前記担体実体がナノ粒子、微粒子、リポソーム、細菌、ファージおよびウイルスからなる群から選択される請求項２５に記載の精製合成ポリペプチド。
27. 前記担体実体の最大の寸法が１０ｎｍ〜５００μｍの範囲にある請求項２６に記載の精製合成ポリペプチド。
28. 前記薬剤が薬物または治療薬である請求項２５に記載のポリペプチド。
29. 前記薬剤が病原体抗原である請求項２５に記載のポリペプチド。
30. 前記薬剤がアジュバントである請求項２５に記載のポリペプチド。
31. 前記担体実体がファージおよびウイルスからなる群から選択される請求項２５に記載の精製合成ポリペプチド。
32. 請求項１に記載の精製合成ポリペプチドをコードする、ヌクレオチド配列の長さが６００ヌクレオチド以下である精製核酸配列。
33. 腸上皮を有する生物に投与される薬剤の製造における、担体実体に共有結合または非共有結合された請求項１〜３１に記載の精製合成ポリペプチドの使用方法。
34. 前記生物が哺乳類である請求項３３に記載の使用方法。
35. 前記哺乳類がヒトである請求項３４に記載の使用方法。
36. 前記担体実体がナノ粒子、微粒子リポソーム、細菌、ファージ、およびウイルス担体からなる群から選択される請求項３４に記載の使用方法。
37. 前記担体実体がナノ粒子、微粒子およびリポソーム担体実体の主要な寸法が１０ｎｍ〜５００μｍの範囲にある請求項３６に記載の使用方法。
38. 前記ナノ粒子、微粒子、またはリポソームに薬剤を搭載するか、あるいは前記ナノ粒子、微粒子、またはリポソームを薬剤とともにカプセル化する請求項３６または３７に記載の使用方法。
39. 前記投与が経口経路によって実施される請求項３３〜３８のいずれかに記載の使用方法。
40. 前記投与が直腸、皮下、筋肉内、鼻腔内または静脈内のいずれかの経路によって実施される請求項３３〜３８のいずれかに記載の使用方法。
41. 前記薬剤がワクチンである請求項３３〜４０のいずれかに記載の使用方法。
42. 前記精製合成ポリペプチドが、ナノ粒子または微粒子のいずれかである担体の表面に被覆、吸着または共有結合される、ファージのタンパク質に組み込まれたペプチドである、請求項３３〜４１のいずれかに記載の使用方法。
43. 前記ファージが抗原をコードするＤＮＡを含有するように修飾される請求項４２に記載の使用方法。
44. 前記ナノ粒子または微粒子に薬剤を搭載するか、あるいは前記ナノ粒子または微粒子を薬剤とともにカプセル化する請求項４２に記載の使用方法。
45. 前記精製合成ポリペプチドが亜鉛結合モチーフを含み、該精製合成ポリペプチドを亜鉛の存在下で前記上皮に接触させることを特徴とする請求項４２に記載の使用方法。
46. 前記担体実体がファージおよびウイルス担体からなる群に由来する請求項４２に記載の使用方法。

Images