Esplora GmbH
Wirkstofftransportsystem
Die Erfindung betrifft ein Wirkstofftransportsystem, in Wirkstoff enthaltender oder wirkstofffreier Form, welches zur Überwindung einer Stoffbarriere oder zum Transport von Wirkstoff über eine Stoffbarriere hinweg geeignet ist und wenigstens einen Transportvermittler und gegebenenfalls ei- nen mit dem Transportvermittler verbundenen und von diesem verschiedenen Träger umfasst, wobei der Transportvermittler und/oder der Träger geeignet sind, einen oder mehrere Wirkstoffe aufzunehmen, einzuschließen, zu binden, zu adsorbieren und/oder anderweitig direkt oder indirekt über den Träger an den Transportvermittler zu koppeln, oder der Transportvermittler und/oder der Träger einen oder mehrere Wirkstoffe aufgenommen, eingeschlossen, gebunden, adsorbiert und/oder an- derweitig direkt oder indirekt über den Träger an den Transportvermittler gekoppelt aufweisen.
Der Transport von Therapeutika ist der limitierende Faktor in der Umsetzung der Erkenntnisse neurologischer Forschung in effektive klinische Neuro-Therapeutika für Erkrankungen des zentralen Nervensystems (ZNS). Die Schwierigkeiten bei der Applikation von Medikamenten werden durch das Vorhandensein der Blut-Him-Schranke (BHS) verursacht. Sowohl die Versorgung als auch der Schutz des Gehirnes wird bei allen Wirbeltieren durch eine die Blutgefässe auskleidende einlagige Endothelzellschicht aufrechterhalten. Das kapillare Netz ist dabei so dicht, das kein Neuron oder keine Gliazelle weiter als 20 μm von einem versorgenden Gefäß entfernt ist.
Zusätzlich zur BHS existieren im Gehirn zwei weitere Barrieresysteme, die Spinnenhaut, welche die Oberfläche des Hirngewebes bedeckt, und der Plexus chorioideus, der eine Schranke zwischen Blut und Gehirnflüssigkeit bildet. Beim Menschen ergibt sich daraus eine Kapillarlänge von ungefähr 650 km und eine Austauschfläche des Gehimendothels von schätzungsweise 20 m2. Diese Fläche übersteigt die der beiden anderen Systeme um das Tausendfache, wodurch die Überwindung der BHS als für den quantitativen Transport relevant angesehen werden muss.
Die Endothelzellschicht ist mit 200-300 nm sehr dünn, woraus sich im Vergleich zur großen Fläche ein nur geringes Volumen von 5 ml für das gesamte menschliche Gehirn ergibt. Aber diese dünne Zellschicht stellt eine der striktesten Barrieren im Körper dar.
Der Transport von Medikamenten vom Blut ins Gehirn ist durch das Vorhandensein verschiedener Mechanismen limitiert. Dazu gehören eine physikalische Grenze, die durch die Endothelzellen selbst gebildet wird, eine enzymatisch vermittelte und eine Efflux-Transportbarriere. Diese Multifunktionali- tät der BHS begründet sich im Zusammenspiel verschiedener Zellen in den mikrovaskulären Gefä- ßen. Die Endothelzellen stehen hier in engem Kontakt mit kapillaren Perizyten und Astrozyten. Das
Endothel und die Perizyten teilen sich dabei eine gemeinsame Basalmembran, und 99 % der kapillaren Oberfläche ist in Kontakt mit den Endfüßchen der Astrozyten.
Kapillaren, die andere Organe versorgen, haben poröse Zellwände und Zwischenräume zwischen den Zellen. Zusammen mit einer aktiven Pinozytose wird sowohl eine freie para- und als auch transzelluläre Diffusion im Blut gelöster Substanzen ermöglicht. Im Gegensatz dazu zeigen Hirnkapilla- rendothelzellen epithel-ähnliche undurchlässige Zell-Zell-Kontakte (tight junctions), so dass der parazelluläre Austausch bzw. Transport verhindert wird. Dazu kommt eine stark verringerte pinozytotj- sche Aktivität, die einem unspezifischen transzellulären Transport entgegenwirkt. Diese Kombination des sehr hohen Widerstandes der endothelialen Tight Junctions und der geringen pinozytotjschen Aktivität bildet die physikalische Schrankenfunktion.
In der Literatur ist auch das Vorhandensein einer sogenannten enzymatischen Blut-Hirn-Schranke zusätzlich zur physikalischen beschrieben. Die Hirnkapillarendothelzellen, ebenso wie Perizyten und Astrozytenendfüsschen, exprimieren eine Reihe von auf der Oberfläche lokalisierten Enzymen, die eine Vielzahl von aktiven Substanzen durch Modifikation in ihrer Wirkung blockieren können. Dazu gehören unter anderem Aminopeptidasen, Carboxypeptidasen und Endopeptidasen. Zirkulierendes Adenosin gelangt z.B. über den Nukleosidtransporter Typ2 (CNT2) ins Gehirn, kann aber keine pharmakologische Wirkung entfalten, da es sehr schnell an der BHS durch Enzyme metabolisiert wird. Im Gegensatz dazu wird aus der inaktiven Vorstufe L-DOPA, die in das Gehirn über den Transporter für große neutrale Aminosäuren (LAT1) transportiert wird, an der BHS das aktive Do- pamin freigesetzt.
Eine weitere Schwierigkeit besteht darin, dass verschiedene Medikamente die Blut-Hirn-Schranke zwar mittels freier Diffusion überqueren können, dann aber aus dem Himkompartiment sofort wieder aktiv ins Blut zurück transportiert werden. Daher besteht eine Strategie zur besseren Aufnahme der Medikamente ins Gehirn in der zeitgleichen Gabe von Inhibitoren dieser sogenannten Efflux- Transporter, um einen Rücktransport zu verhindern.
Aufgrund dieser obengenannten Besonderheiten der BHS ergeben sich für die Abgabe von Substanzen ins Hirn nur zwei generelle Wege: a) Lipid-vermittelte freie Diffusion von kleinen hydrophoben Molekülen und b) der aktive und passive Transport von kleinen und großen Substanzen.
Der freie Übertritt von Substanzen ist dabei von ihrer Größe (<500 Da) und ihre Lipophilie abhängig. Alle bisherigen Medikamente, die bei der Behandlung von ZNS-Erkrankungen zur Zeit eingesetzt werden, weisen die obengenannten Charakteristika auf. Daraus ergeben sich die von Lipinski et al. (Lipinski CA., Lombardo F., Dominy B.W. and Feeney P.J. (1997) Adv. Drug Deliv. Rev., 23:3-25)
aufgestellten Regeln für einen verminderten Transport und damit eine verringerte pharmakologische Aktivität für folgende Stoffeigenschaften: a) ein Molekulargewicht >500 Da, b) die Summe von Hydrogenbindungen Donoren/Akzeptoren >10, c) Substrat eines metabolisierenden Enzymsystems, d) Substrat eines aktiven Efflux-Transporters und e) Plasmaproteine binden das Molekül.
Die Auswahl an Substanzen bzw. Wirkstoffen, die in der Lage sind, die Blut-Hirn-Schranke über- haupt oder zumindest in ausreichender Menge zu überwinden, um eine pharmakologische Wirkung zu entfalten, ist damit äußerst begrenzt. Es besteht daher ein dringender Bedarf nach Verfahren oder Systemen, mit denen Wirkstoffe effektiv, zielgerichtet und in ausreichender Menge an ihren Wirkort im ZNS gebracht werden können, auch wenn die Wirkstoffe eine, mehrere oder alle der vorgenannten, von Lipinski aufgestellten Stoffeigenschaften a) bis e) besitzen.
Die DE-OS 19745 950 schlägt für den Transport von Arzneimitteln über die Blut-Him-Schranke hinweg Arzneistoffträgerpartikel vor, bei denen an der Partikeloberfläche ein Erkennungsprotein oder zumindest ein Molekülteil davon, welcher einen Rezeptor erkennt, gebunden ist. Das Erkennungsprotein, welches den Transport über die BHS vermittelt, ist Apolipoprotein, speziell Apolipoprotein E. Das Trägeφartikel kann der Arzneistoff selbst sein. In der Regel wird der Arzneistoff jedoch in ein Trägermaterial eingearbeitet oder daran gebunden. Die Beispiele der DE-OS 197 45 950 beschreiben Polybutylcyanoacrylat (PBCA)-Nanopartikel als Träger, an denen Apolipoprotein E gebunden ist und die mit Wirkstoff beladen sind.
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung bestand darin, ein neues, verbessertes Wirkstofftransportsystem bereitzustellen, welches zur Überwindung einer Stoffbarriere, insbesondere der Blut-Him- Schranke in Wirbeltieren, und zum Transport von Wirkstoff über eine solche Stoffbarriere hinweg geeignet ist.
Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe gelöst durch ein Wirkstofftransportsystem, in Wirkstoff enthaltender oder wirkstofffreier Form, welches zur Überwindung einer Stoffbarriere oder zum Transport von Wirkstoff über eine Stoffbarriere hinweg geeignet ist und wenigstens einen Transportvermittler und gegebenenfalls einen mit dem Transportvermittler verbundenen und von diesem verschiedenen Träger umfasst, wobei der Transportvermittler und/oder der Träger geeignet sind, einen oder mehre- re Wirkstoffe aufzunehmen, einzuschließen, zu binden, zu adsorbieren und/oder anderweitig direkt oder indirekt über den Träger an den Transportvermittler zu koppeln, oder der Transportvermittler und/oder der Träger einen oder mehrere Wirkstoffe aufgenommen, eingeschlossen, gebunden, adsorbiert und/oder anderweitig direkt oder indirekt über den Träger an den Transportvermittler gekop-
pelt aufweisen, wobei der Transportvermittler einen oder mehrere Stoffe umfasst, die aus der folgenden Gruppe ausgewählt sind: filamentose Phagen; Teile, Bruchstücke, Partikel und Fragmente von Partikeln von filamentosen Phagen; Proteine, Teile oder Bereiche von Proteinen und Peptide von filamentosen Phagen; Kombi- nationen, Fusionen, Derivate und Homologe der vorgenannten Stoffe, wobei filamentose Phagen intakte natürliche filamentose Phagen und genetisch manipulierte Formen oder Analoge davon umfassen.
Bei der Stoffbarriere, die mittels des erfindungsgemäßen Wirkstofftransportsystem überwunden werden kann, handelt es sich vorzugsweise um eine biologische Membran oder eine Zellmembran und ganz besonders bevorzugt um die Blut-Him-Schranke (BHS) eines Wirbeltiers, insbesondere die Blut-Hirn-Schranke des Menschen.
In einer ganz besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung umfasst der Transportvermitt- Ier einen oder mehrere Stoffe, die aus der folgenden Gruppe ausgewählt sind:
M13-Bakteriophagen; Teile, Bruchstücke, Partikel und Fragmente von Partikeln von M13- Bakteriophagen; Proteine, Teile oder Bereiche von Proteinen und Peptide von M13-Bakteriophagen; Kombinationen, Fusionen, Derivate und Homologe der vorgenannten Stoffe, wobei M13- Bakteriophagen intakte natürliche M13-Bakteriophagen und genetisch manipulierte Formen oder Analoge davon umfassen.
In zahlreichen Versuchen der Anmelderin konnte gezeigt werden, dass M13-Bakteriophagen sowie vorgenannten Teile, Proteine usw. davon die Fähigkeit besitzen, die Stoffbarriere in einem etablierten Modellsystem für die Blut-Him-Schranke von Wirbeltieren sehr effektiv zu überwinden und den Durchtritt von anderen Substanzen durch diese Barriere zu vermitteln bzw. solche Substanzen durch die Barriere hindurch zu transportieren. Die Verwendung von filamentosen Bakteriophagen, insbesondere M13-Bakteriophagen als Transportvermittler eröffnet damit ein weites Anwendungsgebiet für die medikamentöse Behandlung von Störungen und Erkrankungen im zentralen Nervensystem, das bislang aufgrund der begrenzten Auswahl an Stoffen, welche selbst die BHS überwinden kön- nen, sehr eng war.
Bevorzugt ist der erfindungsgemäß eingesetzte Transportvermittler unter Oberflächenproteinen, Teilen oder Bereichen von Oberflächenproteinen und/oder Peptiden mit Aminosäuresequenzen von Oberflächenproteinen des M13-Bakteriophagen oder Kombinationen, Fusionen, Derivaten und/oder Homologen davon ausgewählt.
Ganz besonders bevorzugt ist der erfϊndungsgemäße Transportvermittler unter den Oberflächenproteinen P3, P6, P7, P9 des M13-Bakteriophagen, Teilen oder Bereichen davon und/oder Peptiden mit
Aminosäuresequenzen von diesen Oberflächenproteinen oder Kombinationen, Fusionen, Derivaten und/oder Homologen davon ausgewählt.
Versuche haben gezeigt, dass das Oberflächenprotein P3 des M13-Bakteriophagen eine wichtige Rolle bei der Überwindung der Stoffbarriere spielt. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Wirkstofftransportsystems ist daher der Transportvermittler unter dem O- berflächenprotein P3, Teilen oder Bereichen davon und/oder Peptiden mit Aminosäuresequenzen dieses Oberflächenproteins des M13-Bakteriophagen oder Kombinationen, Fusionen, Derivaten und/oder Homologen davon ausgewählt.
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung weist der Transportvermittler eine Anzahl von unmittelbar aufeinanderfolgenden Histidinresten, vorzugsweise 3 bis 10 Histidinre- ste, besonders bevorzugt 6 Histidinreste (His6; 6-His-Tag) auf. Besonders bevorzugt sind die Histi- dinreste am aminoterminalen Ende des Transportvermittlers gebunden. Es hat sich überraschend gezeigt, dass mit Histidinresten versehene Proteine bzw. Peptide eine erhöhte Transportrate durch die BHS zeigen.
Das erfindungsgemäße Wirkstofftransportsystem umfasst verschiedene Ausführungsvarianten bezüglich der Kombination von Wirkstoff bzw. Wirkstoffen, Transportvermittler und, soweit vorhanden, Träger. In einer unter verschiedenen möglichen Ausführungsformen ist der Wirkstoff oder sind mehrere gleiche oder verschiedene Wirkstoffe direkt mit dem Transportvermittler verbunden: [Wirkstoff]- [Transportvermittler].
In einer alternativen Ausführungsform, die einen Träger umfasst, ist der Wirkstoff einerseits und der Transportvermittler andererseits mit dem Träger verbunden, ohne dass Wirkstoff und Transportvermittler direkt miteinander verbunden sind: [WirkstoffJ-[Träger]-[Transportvermittler].
Weiterhin umfasst das erfindungsgemäße Wirkstofftransportsystem auch Kombinationen der vorgenannten Ausführungsvarianten, die z. B. verschiedene Wirkstoffe am Träger und/oder am Trans- portvermittler, mehrere gleiche oder verschiedene Trägersubstanzen, mehrere gleiche oder verschiedene Transportvermittler etc. miteinander verbunden enthalten: ([Wirkstoff 1][Wirkstoff2])- [Träger]-[Transportvermittler]; [Wirkstoff1]-[Träger]-[Transportvermittler]-[Wirkstoff2], [WirkstoffJ- [Träger]-([Transportvermittler1 ][Transportvermittler2]) usw.
Als Träger eignen sich alle auf dem Gebiet bekannten Trägersubstanzen und Trägersysteme, insoweit sie sich mit dem erfindungsgemäßen Wirkstofftransportsystem kombinieren lassen und eine Bindung von Wirkstoff und/oder Transportvermittler erlauben. Insbesondere eignen sich die in der DE 197 45 950 A1 beschriebenen Trägersubstanzen, die durch die Bezugnahme zum Gegenstand
der vorliegenden Anmeldung gehören sollen. Ganz besonders bevorzugt werden als Träger Polymere, feste Lipide, flüssige Lipide, Phospholipidvesikel, Nanopartikel oder Mikropartikel eingesetzt.
Darüber hinaus kann das erfindungsgemäße Wirkstofftransportsystem weiterhin pharmazeutisch verträgliche Zusatz- und/oder Hilfsstoffe enthalten. Die Auswahl der geeigneten Zusatz- und/oder Hilfsstoffe liegt im Ermessen des Fachmanns auf dem Gebiet.
Neben dem Wirkstofftransportsystem als solches umfasst die vorliegende Erfindung auch die Verwendung wenigstens eines Transportvermittlers und gegebenenfalls eines mit dem Transportver- mittler verbundenen und von diesem verschiedenen Trägers zur Herstellung eines Arzneimittels bzw. Wirkstofftransportsystems, in Wirkstoff enthaltender oder wirkstofffreier Form, welches zur Überwindung einer Stoffbarriere oder zum Transport von Wirkstoff über eine Stoffbarriere hinweg geeignet ist, wobei der Transportvermittler und/oder der Träger geeignet sind, einen oder mehrere Wirkstoffe aufzunehmen, einzuschließen, zu binden, zu adsorbieren und/oder anderweitig direkt oder indirekt über den Träger an den Transportvermittler zu koppeln, oder der Transportvermittler und/oder der Träger einen oder mehrere Wirkstoffe aufgenommen, eingeschlossen, gebunden, adsorbiert und/oder anderweitig direkt oder indirekt über den Träger an den Traπsportvermittler gekoppelt aufweisen, wobei der Transportvermittler einen oder mehrere Stoffe umfasst, die aus der folgenden Gruppe ausgewählt sind: filamentose Phagen; Teile, Bruchstücke, Partikel und Fragmente von Partikeln von filamentosen Phagen; Proteine, Teile oder Bereiche von Proteinen und Peptide von filamentosen Phagen; Kombinationen, Fusionen, Derivate und Homologe der vorgenannten Stoffe, wobei filamentose Phagen intakte natürliche filamentose Phagen und genetisch manipulierte Formen oder Analoge davon umfassen.
Begriffsdefinitionen:
"Filamentöser Phage" bezeichnet alle Bakteriophagen mit fadenförmig gestreckter Form bzw. Stäbchenform des Viruspartikels, einschließlich M13-Bakieriophagen, fd-Bakteriophagen, f1- Bakteriophagen, in der Wildtyp-Form sowie in natürlich vorkommenden oder gentechnisch veränder- ten mutanten Formen.
"M13-Bakteriophage" bezeichnet die Wildtyp-Form des M13-Bakteriophagen sowie natürlich vorkommende oder gentechnisch veränderte mutante Formen davon.
"Apikal" oder "apikale Seite" bedeutet im Kontext dieser Erfindung die Seite (Ausgangsseite) einer Stoffbarriere, wie der Blut-Him-Schranke von Wirbeltieren, oder eines Labormodells für eine solche Stoffbarriere, von welcher aus ein Stoff über die Barriere hinweg bzw. durch diese hindurch zur gegenüberliegenden Seite (Zielseite) transportiert werden soll.
"Basolateral" oder "basolaterale Seite" bedeutet im Kontext dieser Erfindung die Seite (Zielseite) einer Stoffbarriere, wie der Blut-Him-Schranke von Wirbeltieren, oder eines Labormodells für eine solche Stoffbarriere, zu welcher ein Stoff von der Ausgangsseite bzw. apikalen Seite über die Barrie- re hinweg bzw. durch diese hindurch transportiert werden soll.
"P3-Protein" bezeichnet das 42 kDa Genprodukt des Gens 3 des M13-Bakteriophagen.
Figuren:
Figur 1 zeigt eine schematische Darstellung des filamentosen M13-Bakteriophagen.
Figur 2 zeigt eine schematische Darstellung des P3-Proteins aus einem filamentosen Ff- Phagen (wie M13-Bakteriophage), die Domänenstruktur des P3-Proteins, die unter- schiedlichen Funktionen der Domänen bei der Infektion eines Wirtsbakteriums und den Infektionsvorgang (modifiziert nach Holliger P. and Riechmann L. (1997) Current Biology 5:265 - 275).
Figur 3 ist eine schematische Darstellung des P3-Proteins mit den Domänen D1, D2 und D3 und der hergestellten Expressionskonstrukte His6-D2 und His6-D1-2.
Figur 4 zeigt eine schematische Darstellung des als Modell für die Blut-Hirn-Schranke oder anderer Stoffbarrieren verwendeten Transwellsystems.
Figur 5 zeigt die Ergebnisse eines Vergleichs des Transportes von Wildtyp-M13- Phagenpartikel über eine Himkapillarendothelzellbarriere bei apikaler und basolateraler Phagenzugabe.
Figur 6 zeigt die Ergebnisse eines Vergleichs des Transportes von Wildtyp-M13- Phagenpartikel über eine Zellbarriere von Hirnkapillarendothelzellen einerseits und Darmepithelzellen (CaCo-2-Zelllinie) andererseits im Transwellsystem.
Figur 7 zeigt die Ergebnisse der Bestimmung der maximalen Transportgeschwindigkeiten im Transwellsystem mit Hirnkapillarendothelzellen gemäß Beispiel 3 in den Richtungen apikal-basolateral und basolateral-apikal.
Figur 8 zeigt die Ergebnisse der Km-Wert-Bestimmung für den Transport von Wildtyp-M13- Phagenpartikel über eine Hirnkapillarendothelzellbarriere im Transwellsystem.
Figur9 zeigt eine schematische Darstellung von verschiedenen eingesetzten M13- Phagenpartikeln mit unterschiedlichen Modifikationen, die im Transwelltest eingesetzt wurden.
Figur 10 zeigt eine schematische Darstellung des Transports von Wildtyp-M13-Phagenpartikel und M13-Phagenpartikel mit modifiziertem P3-Protein auf der Oberfläche.
Figur 11 zeigt eine schematische Darstellung des Transports von Proteinfragmenten des P3- Proteins D1-2 und D2 und des Transports der Kontrollproteine Rinderserumalbumin (BSA) und Meerrettich-Peroxidase (HRP).
Figur 12 zeigt die Ergebnisse des Transports von mit Lucifer-Yellow beladenen Wildtyp-M13- Phagenpartikeln über eine Himkapillarendothelzellbarriere im Transwellsystem.
Figur 13 zeigt die Nukleinsäure- und Aminosäuresequenz des Fragmentes D2.
Figur 14 zeigt die Nukleinsäure- und Aminosäuresequenz des Fragmentes D1-2.
Figur 15 zeigt die Nukleinsäuresequenz des P3-Gens.
Figuren, üaterial und Methoden
Filamentose Bakteriophagen Filamentose Bakteriophagen sind eine große Familie von einzelsträngigen DNA-Viren, die in der Lage sind gram-negative Bakterien zu infizieren. Die Infektion mit einem filamentosen Phagen verläuft dabei in zwei Abschnitten. Zunächst bindet der Phage an seinen primären Rezeptor, im allgemeinen die Spitze des bakteriellen F-Pilus, die sich zum Teil in größerer Entfernung zur Bakterium selbst befindet. Durch Einzug des Pilus zusammen mit dem gebundenen Phagen kommt dieser in die räumliche Nähe zu einem weiteren Rezeptor (TolA), welcher die Penetration der bakteriellen Zellwand und -membran vermittelt. Der Infektionsprozess ist vor allem bei der Infektion von Esche- richia coli mit filamentosen Phagen, insbesondere Ff-Phagen (M13, fd, f1) sehr gut verstanden. In diesen Ff-Phagen wird die Infektion durch das Minor Capsid Protein 3 (P3, P-lll, g3p) vermittelt. Dieses Protein ist an einem Ende des länglichen Phagenpartikels lokalisiert, wo es eng mit einem weite- ren Oberflächenprotein, dem Minor Capsid Protein 6 (P6, P-Vl, g6p), assoziiert ist. Der größte Teil der Hülle wird durch eine Vielzahl von Kopien des Major Capsid Proteins 8 (P8, P-Vlll, gδp) gebildet. Am gegenüberliegenden Ende befinden sich mehrere Moleküle der Minor Capsid Proteine 7 und 9,
die für die Freisetzung des Phagen aus der Wirtszelle essentiell sind. Figur 1 zeigt eine schematische Darstellung des M13-Bakteriophagen.
Das 42 kDa Protein P3 besitzt eine Struktur mit drei Domänen. Dabei ist jede Domäne von der nächsten durch glycinreiche Tetra- und Pentapeptidwiederholungen getrennt. Durch Deletionsanaly- sen konnten den einzelnen Domänen verschiedene Funktionen zugewiesen werden. So wird das Protein durch den C-terminalen Membrananker der dritten Domäne (D3) mit der Phagenhülle verbunden. Die beiden N-terminalen Domänen sind dagegen direkt an der Infektion des Bakteriums beteiligt. Die Domäne 2 (D2) bindet an den primären Rezeptor, den F-Pilus des Bakteriums, aber die Adsoφtion alleine ist nicht ausreichend für eine erfolgreiche Penetration. Experimente weisen dabei auf eine Beteiligung der Domäne 1 (D1) hin. Diese soll über eine Wechselwirkung mit dem TolA- Rezeptor des Wirtsorganismus die Abgabe der viralen DNA an das Bakterium vermitteln. Figur 2 zeigt eine schematische Darstellung des P3-Proteins aus einem filamentosen Ff-Phagen (wie M13- Bakteriophage), die Domänenstruktur des P3-Proteins, die unterschiedlichen Funktionen der Domä- nen bei der Infektion eines Wirtsbakteriums und den Infektionsvorgang (Holliger P. and Riechmann L. (1997) Current biology 5:265 - 275).
Präparation von Hirnkapillarendothelzellen
Zur Präparation von Hirnkapillarendothelzellen wurde das Gehirn eines Schweins entnommen, in einem geeigneten Puffer gelagert und schnellstmöglich auf Eis ins Labor transportiert. Die zu isolierenden Hirnkapillarendothelzellen befinden sich im Wesentlichen in der grauen Himsubstanz. Nach Entfernen der Hirnhäute und der äußeren Blutgefäße wurde die graue Substanz abgeschabt, mechanisch zerkleinert und in ein geeignetes Medium überführt. Ein geeignetes Medium war z.B. M199-Medium (Gibco/BRL, Grand Island, NY) oder Earle's Puffer. In einem ersten enzymatischen Schritt wurde die Himsubstanz mit dem Enzym Dipase verdaut. Der Dipaseverdau bewirkt eine Auflösung des Bindegewebes (5 mg Dipase/g graue Substanz). Der Verdau erfolgte für 3 h bei 37°C in M199-Medium unter Rühren. Nach dem Dipaseverdau wurden die Hirnkapillaren mit dem gleichen Volumen 15 %ige (w/v) Dextranlösung unter Schütteln gemischt und bei 8.650xg in einem Festwinkelrotor zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und das Sediment für den zweiten enzymati- sehen Verdauungsschritt in Collagenase D-haltigem M199-Medium resuspendiert. Bei der anschließenden Hydrolyse für 1 h bei 37°C wurde auch Na-p-Tosyl-L-Lysin-Chloromethylketon (TLCK) als Proteaseinhibitor zugesetzt.
Nach dem zweiten enzymatischen Schritt wurde eine Isolierung der freigesetzten Endothelzellen über eine Percoll-Dichtegradientenzentrifugation durchgeführt. Für den Dichtegradienten wurden 9,91 ml Percoll, 0,72 ml 10-fach konzentriertes M199-Medium und 19,37 ml Earle's Puffer (117,2 mM Natriumchlorid, 5,3 mM Kaliumchlorid, 1,0 mM Natriumdihydrogenphosphat, 0,1 mM Magnesiumsulfat, 1 ,8 mM Calciumchlorid und 5,6 mM Glukose, pH 7,3) gemischt und in der Ultrazentrifuge
bei 37.200xg und 4°C im Festwinkelrotor für eine Stunde zentrifugiert. Die Zellsuspension aus dem zweiten enzymatischen Schritt wurde durch mehrfaches Zentrifugieren bei geringer Geschwindigkeit, Abziehen des Überstandes und Resuspendieren des Zentrifugationssedimentes gewaschen. Nach dem letzten Zentrifugationsschritt wurde das Sediment in einer geringen Menge M199-Medium aufgenommen, auf den vorbereiteten Percoll-Dichtegradienten aufgetragen und in der Ultrazentrifuge bei 1,400xg bei 4°C für 10 Minuten zentrifugiert. Nach der Zentrifugation wurde die Hirnkapillarendothelzellen enthaltende Bande abpipettiert und erneut wie oben beschrieben gewaschen.
Transwellsystem Das hierin verwendete Transwellsystem dient als Labormodell für die Blut-Hi -Schranke (Verwendung von Hirnkapillarendothelzellen) und andere Zellbarrieren eines Organismus. Zellen, wie die zuvor präparierten Hirnkapillarendothelzellen, wurden gewaschen, in Medium resuspendiert und in mit Kollagen beschichtete Zellkulturflaschen ausgesät, wie es bei Franke et al. (Franke H., Galla H- J. and Beuckmann CT. (2000) Brain Research Protocols 5:248 - 256) beschrieben ist. Die Kultivie- rung der Hirnkapillarendothelzellen erfolgte bei 37°C in Cθ2-lnkubatoren mit einem konstanten C02- Gehalt von 5 %. Andere Zelltypen wurden ggf. in der für den jeweiligen Zelltyp geeigneten Weise kultiviert. Nachdem die Zellen Konfluenz erreicht hatten, wurden sie durch eine Behandlung mit Trypsinlösung abgelöst und in dafür vorbereitete Transwellschalen (1 ,1 cm2, Corning) aufgeteilt. Danach erfolgte eine Weiterkultivierung der Zellen für mindestens 5 Tage unter den zuvor beschrie- benen Bedingungen. Figur 4 zeigt eine schematische Darstellung des verwendeten Transwellsystems, wie es für nachfolgend beschriebene Untersuchungen verwendet wurde.
Präparation der Phagen
2xYT/Kan-Medium (5 g/l Natriumchlorid, 16 g/l Trypton, 10 g/l Hefeextrakt, 25 mg/l Kanamycin, pH 7.0) werden mit 1/1000 Volumen des Mediums VCS-M13-Phagen angeimpft und 16 h - 24 h bei 30°C unter Schütteln inkubiert. Die Bakterien werden dann bei 10.800xg für 15 min sedimentiert und der Überstand dekantiert. Das Volumen des Überstandes wird bestimmt und es erfolgt die Zugabe von PEG/NaCI-Lösung (200 g/l Polyethylenglykol 6000, 2,5 M Natriumchlorid) im Volumenverhältnis Überstand zu PEG/NaCI-Lösung von 4:1. Die Reaktionslösung wird gemischt und mindestens 2 h bei 4°C inkubiert. Danach werden die Phagen durch Zentrifugation bei 10.800xg für 15 min sedimentiert. Das erhaltene Pellet wird in 40 ml H 0 resuspendiert und erneut mit 8 ml PEG/NaCI-Lösung versetzt. Nach dem Mischen wird nun mindestens für 20 min bei 4°C inkubiert, und anschließend werden die Phagen bei 10.800xg sedimentiert. Das Pellet wird nach dem gründlichen Entfernen des Überstandes getrocknet, und dann werden die Phagen in 2 ml SM-Puffer (35 mM Tris-Base, 100 mM Natriumchlorid, 10 mM Magnesiumsulfat, 100 mg/l Glukose, pH 7.5) resuspendiert und bei 4°C gelagert.
Bestimmung des Phagentiters
Von der erhaltenen Phagenlösung werden Verdünnungen von 10"6, 10~7, 10"8, 10"9 und 10"10 in SM- Puffer hergestellt. Parallel dazu werden E.coli Bakterien, bevorzugt solche, die einen F-Pilus ausbilden, besonders bevorzugt TG1, bis zu einer OD6oo (600 nm) von 0,2 in 2xYT-Medium angezogen. Jeweils 100 μl dieser Bakterien werden mit 10 μl der oben beschriebenen Phagenverdünnungen versetzt. Die Ansätze werden dann 30 min bei 37°C ohne Schütteln inkubiert und anschließend auf 2xYT/Kan-Platten (5 g/l Natriumchlorid, 16 g/l Trypton, 10 g/l Hefeextrakt, 15 g/l Agar, 25 mg/l Ka- namycin, pH 7.0) ausplattiert. Die Platten werden anschließend für 16 h bei 37°C inkubiert. Die Phagen enthaltenden Bakterienkolonien werden gezählt und der Phagentiter durch die nachfolgende Formel bestimmt: Gezählte Kolonien x 100 x eingesetzte Verdünnung = Phagen pro ml Phagenstammlösung.
Transportstudien im Transwellsvstem
Zur Untersuchung des Transportes von Phagen oder Proteinen, Peptiden oder Fragmenten von Phagen oder anderer Stoffe durch eine Zellbarriere (Stoffbarriere) hindurch wurde das oben beschriebene Transwellsystem eingesetzt. Im Model der Blut-Him-Schranke unter Verwendung von Hirnkapillarendothelzellen entspricht ein Durchtritt in der Richtung "apikal-basolateral" einem Transport vom Blut in das Gehirn, und ein Durchtritt in der Richtung "basolateral-apikal" entspricht einem Transport in umgekehrter Richtung vom Gehirn ins Blut.
Die Transwelleinsätze wurden vorbereitet, wie es oben beschrieben ist. Am Versuchstag wurde der endotheliale Widerstand (TEER) der Transwelleinsätze gemessen und die geeigneten Transwelleinsätze in frische Schalen überführt. Als geeignet wurde ein Widerstand von mindestens 600 Ω x cm2 bestimmt. Ein Medienwechsel erfolgte durch Zugabe von 400 μl (apikal) und 1,5 ml (basolaterale) frischem, auf 37°C vorgewärmtem Medium (DMEM/Ham's F12-Medium im Falle von Hirnkapillarendothelzellen).
Das bezüglich des Durchtritts durch die Stoffbarriere zu untersuchende Material (Phagen oder Proteine, Peptide oder Fragmente von Phagen oder andere Stoffe) wurde in definierter Menge in das apikale oder basolaterale Kompartiment des Transwellsystems eingebracht. Zum Startzeitpunkt T0 des Experimentes wurden den apikalen und basolateralen Kompartimenten Proben entnommen.
Das Transwellsystem wurde für den Verlauf des Experimentes bei 37°C inkubiert, und weitere Proben zu definierten Zeitpunkten entnommen. Nach der Probennahme wurden die jeweiligen Mengen bzw. Konzentrationen des bezüglich des Transports zu untersuchenden Materials in den apikalen und basolateralen Proben mit geeigneten Mitteln untersucht und die Effizienz bzw. der zeitliche Verlauf des Durchtritts durch die Stoffbarriere festgestellt.
Zur Bestimmung von in den Zellen des Zellrasens verbliebenem Material (in den Figuren mit INT- Zell oder internalisiert bezeichnet) wurde der Zellrasen sechsmal mit PBS-Puffer und anschließend dreimal mit Stripping-Puffer (50 mM Glycin, 0,5 M Natriumchlorid, 2 M Harnstoff, 20 g/l PVP 40, pH 2.8) gewaschen. Die Zellen wurden durch Zugabe von 500 μl Triethanolamin (100 mM) lysiert. Nach Inkubation für 10 min bei RT wurde der Ansatz durch Zugabe von Tris-Puffer (1 M Tris-Base, pH 7.5) neutralisiert. Die jeweiligen Mengen bzw. Konzentrationen des bezüglich des Transports zu untersuchenden Materials in den Proben wurden mit geeigneten Mitteln untersucht.
Die Konzentrationen von Phagen in den Proben wurden durch Infektion von E.coli Bakterien und Titerbestimmung in der oben beschriebenen Art und Weise festgestellt. Konzentrationen von Fluoreszenzfarbstoff in den Proben wurden durch Messung im ELISA-Reader bei geeigneter Wellenlänge bestimmt.
Expression von einzelnen Domänen des P3-Proteins Für die Expression von einzelnen Domänen (D1-2 und D2) wurden Konstrukte zur Herstellung des Proteins in E.coli Bakterien hergestellt. Dazu wurde Phagen-DNA nach Standard-DNA- Präparationsmethoden gewonnen und das entsprechende DNA-Fragment mit den dazu passenden Primern mittels PCR (Polymerase-Kettenreaktion) vervielfältigt. Jeweils zwei 50 μl PCR-Ansätze wurden für die Herstellung jedes Fragmentes hergestellt (IxPuffer, 1,5 mM MgCI2, 200 nM dNTPs, 600 nM Primer, 2,5 Einheiten Proof-reading Taq-Polymerase). Nach der PCR-Reaktion wurden die Proben gelelektrophoretisch getrennt und die DNA-Banden aus dem Gel ausgeschnitten. Nach Elu- tion der DNA-Fragmente aus dem Agarosegel wurde der DNA-Gehalt bestimmt und jeweils 100 pmol Fragment in eine BP-Clonase-Reaktion (Gateway™-System, Invitrogen) eingesetzt und ü. N. bei 25°C inkubiert. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 2 μl Proteinase K-Lösung und Inkubation bei 37°C für 10 min gestoppt. E.co//-Zellen wurden dann mit der DNA transformiert und auf Agaφlat- ten ausgesät. Die DNA positiver Klone wurde sequenziert und dann zur Herstellung eines mit sechs Histidinen (His6) N-terminal markierten Konstruktes mittels einer LR-Clonase-Reaktion (Gateway™- System, Invitrogen) in einen entsprechenden Expressionsvektor überführt. Nach 16 h Inkubation bei 25°C und 10 min Inkubation mit Proteinase K-Lösung bei 37°C, wurden erneut £co//-Zellen mit der erhaltenen DNA in den Reaktionsansätzen transformiert und auf Agarplatten ausgesät.
Die erhaltenen fertigen Plasmide wurden in E.co//-Expressionsstämme, z.B. BI21(DE3)LysS, Tu- ner(DE3)LysS oder JM109(DE3) transformiert, und durch Zugabe von IPTG wurde die Expression des entsprechenden Proteins bzw. Proteinfragmentes induziert. Die Induktion erfolgte jeweils für 4 h bei 37°C unter Schütteln.
Reinigung der Domäne D2 des P3-Proteins
Die Bakterienzellen, in welchen die Expression durchgeführt worden war, wurden sedimentiert, in IB- Puffer (50 mM Tris-Base, 1 mM EDTA, 25 % (w/v) Saccharose, 0,1 mg/ml Lysozym pH 8,0) resuspendiert und für 30 min auf Eis inkubiert. Danach wurden die Zellen im Ultraschallbad behandelt und zum vollständigen Aufschluss zunächst 1 h bei -20°C eingefroren und anschließend bei Raumtemperatur wieder aufgetaut.
Zu der viskosen Suspension wurden nun Magnesiumchlorid, Manganchlorid und 1 μl Benzonase zugegeben. Anschließend wurde im Verhältnis 1:1 mit Detergenz-Puffer (0,2 M Natriumchlorid, 1 % (w/v) Desoxycholat, 1 % (v/v) Nonidet P40) gemischt und der Ansatz zentrifugiert. Der Überstand wurde abpipettiert und das Sediment mit TriED-Lösung gewaschen (1 % (v/v) Triton X-100, 1 mM EDTA). Die Probe wurde erneut zentrifugiert, der Überstand entfernt und das Sediment in Solubili- sierungspuffer (100 mM Tris-Base, 6 M Guanidiumhydrochlorid, 2 mM EDTA) resuspendiert. Die erhaltene Lösung wurde 1:100 in Renaturierungspuffer (50 mM Tris-Base, 1 mM EDTA, M Arginin, pH 8,0) verdünnt und über Nacht bei 10°C inkubiert. Danach erfolgte jeweils täglich eine weitere Zugabe eines Anteils der Probe zum Renaturierungspuffer bis zu einem Verdünnungsverhältnis von 1:25. Der komplette Ansatz wurde anschließend zentrifugiert und im Überstand die Fraktion mit dem Protein D2 erhalten.
Reinigung der Domänen D1-2 des P3-Proteins
Die Bakterienzellen, in welchen die Expression durchgeführt worden war, wurden sedimentiert, in IB- Puffer (50 mM Tris-Base, 1 mM EDTA, 25 % (w/v) Saccharose, 0,1 mg/ml Lysozym pH 8,0) resuspendiert und für 30 min auf Eis inkubiert. Danach wurden die Zellen im Ultraschallbad behandelt und zum vollständigen Aufschluss zunächst 1 h bei -20°C eingefroren und anschließend bei Raum- temperatur wieder aufgetaut.
Zu der viskosen Suspension wurden nun Magnesiumchlorid, Manganchlorid und 1 μl Benzonase zugegeben. Anschließend wurde im Verhältnis 1:1 mit Detergenz-Puffer (0,2 M Natriumchlorid, 1 % (w/v) Desoxycholat, 1 % (v/v) Nonidet P40) gemischt und der Ansatz zentrifugiert. Der Überstand wurde abpipettiert und das Sediment mit TriED-Lösung gewaschen (1 % (v/v) Triton X-100, 1 mM EDTA). Die Probe wurde erneut zentrifugiert, der Überstand entfernt und das Sediment in Solubili- sierungspuffer (100 mM Tris-Base, 6 M Guanidiumhydrochlorid, 2 mM EDTA) resuspendiert. Die erhaltene Lösung wurde 1:100 in Renaturierungspuffer (50 mM Tris-Base, 1 mM EDTA, 1M Arginin, pH 8,0) verdünnt und über Nacht bei 4°C inkubiert. Danach erfolgte jeweils täglich eine weitere Zu- gäbe eines Anteils der Probe zum Renaturierungspuffer bis zu einem Verdünnungsverhältnis von 1:25. Der komplette Ansatz wurde anschließend zentrifugiert und im Überstand die Fraktion mit dem Protein D1-2 erhalten.
Beispiele
Beispiel 1 : Phagen-Transport-Studien
Zur Untersuchung des Transportes von Wildtyp-M13-Bakteriophagen in den Richtungen apikal- basolateral und basolateral-apikal wurden zwei unabhängige Dreifach-Bestimmungen im oben beschriebenen Transwellsystem mit Hirnkapillarendothelzellen durchgeführt. Hierfür wurden jeweils drei Transwelleinsätze mit einem Mindestwiderstand von 600 Ohmxcm2 vorbereitet, wie es oben beschrieben ist.
Am Versuchstag wurde der endotheliale Widerstand (TEER) der Transwelleinsätze gemessen und die geeigneten Transwelleinsätze in frische Schalen überführt. Ein Medienwechsel erfolgte durch Zugabe von 400 μl (apikai) und 1,5 ml (basolateral) frischem, auf 37°C vorgewärmtem DMEM/Ham's F12-Medium. Danach wurden jeweils apikai 6 μl FITC-Inulin-Lösung (1 mM FITC- Inulin) und apikai (Untersuchung des Transports in Richtung apikal-basolateral) bzw. basolateral (Untersuchung des Transports in Richtung basolateral-apikal) 100 μl Phagensuspension (1013 pfu/ml) zugegeben.
Zur Überprüfung, ob eine Beschädigung im Zellrasen vorlag, die einen unspezifischen Durchtritt ermöglichte, wurde ein möglicher Durchtritt von FITC-Inulin-Lösung gemessen. Hierfür wurden zum Zeitpunkt T0 50 μl apikai entnommen und die Fluoreszenzintensität bei 520 nm im ELISA-Reader bestimmt. Nach 30 min (T30) Inkubation bei 37°C wurden apikai und basolateral jeweils 50 μl Proben entnommen und die Fluoreszenzintensität erneut gemessen. Die Endothelzellen in den eingesetzten Transwellschalen blieben für FITC-Inulin undurchlässig, so dass eine Beschädigung des Zellrasens und ein unspezifischer Sloffdurchtritt ausgeschlossen werden konnten.
In den zu den Zeitpunkten T0 und T30 apikai und basolateral entnommenen Proben wurden die Phagentiter in der oben beschriebenen Weise bestimmt. Überraschenderweise zeigte sich dabei ein Durchtritt von ca. 10 % der eingesetzten Wildtyp-M13-Bakteriophagen in der Richtung apikal- basolateral. Demgegenüber war der Durchtritt in umgekehrter Richtung basolateral-apikal um den Faktor 50 geringer. Da ein unspezifischer Stofftransport ausgeschlossen werden konnte, konnten die Ergebnisse zeigen, dass M13-Bakteriophagen, zumindest im etablierten Modellsystem, spezifisch die Blut-Him-Schranke überwinden konnten. Darüber hinaus erwies sich der Transport überraschenderweise als polar, d. h. dass 10 % der eingesetzten Phagen im Modell vom Blut ins Gehirn transportiert werden, aber nur 0,2 % aus dem Gehirn in der gleichen Zeit wieder zurücktransportiert werden. Die Ergebnisse sind in Figur 5 graphisch dargestellt.
Beispiel 2: Vergleich zweier verschiedenen Zellbarrieresvsteme In einem weiteren Experiment wurden als Zellbarriere Hirnkapillarendothelzellen einerseits und Ca- Co-2-Zellen andererseits wie in Beispiel 1 vorbereitet. Die CaCo-2-Zellen wurden bei einem Widerstand größer 400 Ohm x cm2 im Test verwendet. Wiederum wurde der Durchtritt von Wildtyp-M13- Bakteriophagen durch die zwei verschiedenen Zellbarrieren untersucht. Während die Phagen die Barriere aus Hirnkapillarendothelzellen wie in Beispiel 1 spezifisch in der Richtung apikal-basolateral überwinden konnten, wurde bei den CaCo-2-Zellen nur ein geringer Durchtritt der Phagen (nur 0,05 %) beobachtet. Figur 6 zeigt den Vergleich der prozentualen Anteile der durchgetretenen Phagen. Die Ergebnisse, die in Tabelle 1 zusammengefasst sind, lassen auf einen selektiven Transport der Phagen über Hirnkapillarendothelzellen schließen.
Tabelle 1: Zusammenfassung der Ergebnisse des Transportvergleiches über die Zellbarrieren in den zwei verschiedenen untersuchten Zellkulturmodellen. Verwendet wurden ein BHS-Modell (BHS) und ein Modell für Darmepithelbarrieren (CaCo-2). In Spalte 2 ist die Richtung des Transpor- tes dargestellt. Bei der Simulation des Transportes vom Blut ins Gehirn wurden die M13-Phagen apikai zugegeben und der Durchtritt durch basolaterale Entnahme des Mediums nach 30 min bestimmt. Beim Transport vom Gehirn ins Blut wurden die Phagen basolateral zugegeben und der Durchtritt nach 30 min durch Entnahme des apikalen Mediums bestimmt. Die dritte Spalte gibt den Durchtritt als jeweiligen prozentualen Anteil der eingesetzten Phagen an, und der in Spalte 4 darge- stellte Faktor zeigt einen Vergleich zwischen den einzelnen Transportraten mit dem Durchtritt im BHS-Modell vom Blut ins Gehirn.
Beispiel 3: Bestimmung von kinetischen Daten des Transports von M13-Phagen im BHS-Modell Zur Bestimmung der maximalen Transportgeschwindigkeit im Transwellsystem mit Hirnkapillarendothelzellen gemäß Beispiel 1 in der Richtung apikal-basolateral wurden in vorbereitete Transwellschalen zum Zeitpunkt T0 apikai 100 μl M13-Bateriophagensuspension zugegeben (10
13 pfu/ml) und bei 37°C inkubiert. Dem basolateralen Kompartiment wurden nach verschiedenen Zeiten Proben entnommen und der Phagentiter in den Proben bestimmt. Der gleiche Versuch wurde auch bei basolateraler Zugabe der Phagensuspension und apikaler Entnahme nach verschiedenen Zeiten durchgeführt. Es zeigte sich eine maximale Transportrate von 750 Phagenpartikeln pro Minute für den Transport in der Richtung apikal-basolateral und von 150 Phagenpartikeln pro Minute für den retrograden Transport, d. h. in umgekehrter Richtung basolateral-apikal. Die Ergebnisse sind in Figur 7 dargestellt.
Der Km-Wert des Transportes in der Richtung apikal-basolateral, entsprechend der Richtung vom Blut ins Gehirn, wurde ebenfalls im Transwellsystem ermittelt. Dazu wurden Transwells wie beschrieben vorbereitet und apikai unterschiedliche molare Mengen M13-Phage zugegeben. Nach 20 min wurde basolateral das Medium entnommen und der Titer bestimmt. In Figur 8 ist die erhaltene Michaelis-Menten-Kinetik dargestellt. Der daraus ermittelte Km-Wert beträgt 2,0 x10
"13 M.
Beispiel 4: Transporttests Weitere Untersuchungen lieferten deutliche Anzeichen dafür, dass eine Blockierung oder Modifizierung des P3-Proteins des M13-Bakteriophagen die Transportrate gegenüber dem Wildtyp-Phagen herabsetzen kann.
Bei diesen Versuchen wurden 2 verschiedene Phagenpopulationen im Vergleich zum Wildtyp eingesetzt. Zunächst wurde der in Figur 9, mittlere Darstellung gezeigte genetisch manipulierte Phage verwendet. Dieser präsentiert statistisch ein oder kein modifiziertes P3-Protein, d.h. dann nur unmo- difizierte P3-Moleküle auf seiner Oberfläche. Diese Phagen wurden, wie in den vorangegangenen Beispielen beschrieben, apikai in dem Transwellsystem mit Hirnkapillarendothelzellen eingestetzt. Nach 30 min wurden Proben entnommen und die Phagentiter bestimmt. Überraschenderweise hatte keiner der durchgetretenen Phagen ein funktionelles modifiziertes P3-Protein auf seiner Oberfläche präsentiert, da die selektierten Phagen entweder keinen funktionellen Leserahmen enthielten (ORF, open reading frame) oder gar keine genetische Manipulation enthielten (Insert). Dies erwies sich als statistisch relevant, da in der eingesetzten Ausgangspopulation 80 % der untersuchten Phagen ein funktionelles, modifiziertes P3-Protein auf der Oberfläche präsentieren. Tabelle 2 fasst die Ergebnisse dieser Tests zusammen.
Tabelle 2: Analyse der modifizierten Phagen. Getestet wurde dabei, ob ein Phagenklon von A) der Ausgangspopulation und B) der selektierten Population eine Insertion enthielt (Spalte 1 ) und ob diese Insertion einen durchgängigen und vollständigen Leserahmen besaß (Spalte 2) (ORF open reading frame)
Aufgrund dieser Ergebnisse, wurde das Experiment mit den in Figur 9, untere Darstellung gezeigten Phagen wiederholt. Diese unterschieden sich von den bisher verwendeten dadurch, dass alle auf der Oberfläche präsentierten P3-Proteine modifiziert waren. Diese Phagen wurden, wie in den vo-
rangegangenen Beispielen beschrieben, apikai in dem Transwellsystem mit Hirnkapillarendothelzellen eingesetzt. Nach 30 min wurden Proben entnommen und die Phagentiter bestimmt. Es konnten überraschenderweise keine Phagenklone detektiert werden, d.h. es fand kein Transport der Phagen über die Hirnkapillarendothelzellen statt. Figur 10 fasst die Ergebnisse aus Beispiel 4 nochmals zu- sammen.
Beispiel 5: Transportstudien Proteinfraqmente
Die Ergebnisse aus Beispiel 4 lassen den Schluss zu, dass es sich bei dem Molekül, das den Transport bedingt, um das Protein P3 handelt oder zumindest handeln könnte. Daher wurden 2 Fragmente davon (D1-2 und D2), denen auch bei der Infektion und Penetration von E. coli die ent- scheidene Rolle zukommt, rekombinant als N-terminal mit 6 Histidinresten und einer Enterokina- seschnittstelle (DDDDK) markierte Proteine in E coli hergestellt, wie es oben beschrieben ist (siehe auch Figur 3, Figur 13 und Figur 14).
Eingesetzt wurden D1-2 und D2, sowie Meerrettich-Peroxidase (HRP) und Rinderserumalbumin (Fraktion V, BSA, beide Sigma). Verwendet wurden gleiche molare Mengen der eingesetzten Proteine (Tab. 3). Die Widerstände der wie oben beschriebenen Transwellschalen wurden gemessen und Schalen mit einem Widerstand größer 900 Ohmxcrn2 wurden verwendet.
Die Proteine wurden zusammen mit Na-Fluorescein apikai in das Transwellsystem eingebracht und 30 min bei 37°C inkubiert. Danach wurden apikai und basolateral die Proben entnommen. Für D1-2, D2 und BSA wurden entsprechende Mengen der apikalen und basolateralen Proben auf Nitrocellu- losemembran übertragen und mit einer entsprechenden Antikörperkombination wurden die Proteine nachgewiesen. Die quantitative Bestimmung erfolgte durch Vergleich mit einer jeweils entsprechen- den mitgeführten Standardeichreihe. Die Auswertung erfolgte nach Scannen der gefärbten Membranen Über die 2D-Auswerte-Software AIDA (Raytest). Das Protein HRP wurde in entsprechenden Verdünnungen in einer ELISA-Platte mit dem Substrat ABTS (Fluka) versetzt und die Farbreaktion durch Absorptionsmessung im ELISA-Reader bei 450 nm quantifiziert. Der Durchtritt des Na- Fluoresceins wurde durch eine Quantifizierung im ELISA-Reader (Anregung 480 nm, Emission 520 nm) bestimmt.
Überraschenderweise zeigte sich bei diesen Versuchen, dass die Proteinfragmente D1-2 (50 %) und D2 (20 %) sehr gut über das Transwellsystem transportiert werden. Im Vergleich dazu werden vergleichbar große Proteine BSA (66 kDa) und HRP (40 kDa) nur zu 0,2 % bzw. 1 % über die BMECs in den Transwellschalen transportiert. Der als Kontrolle mitgeführte Permeabilitätsmarker Na- Fluorescein zeigte keinerlei signifikante Unterschiede in den einzelnen Transwells und der Kontrolle ohne Protein.
Dass die Proteinfragmente besser transportiert wurden als der Phage selbst, könnte auf eine höheren maximalen Geschwindigkeit, aber auch zusätzlich auf den verwendeten N-terminalen 6-Histidin- Tag, der eine positive Ladung am N-Terminus einführt, zurückzuführen sein. Die Verwendung eines Hisβ-Tags hat sich daher als positiv für die Transportrate erwiesen.
Tabelle 3 und Figur 11 fassen die erhaltenen Ergebnisse zusammen.
Tabelle 3: Die Tests wurden als Doppelbestimmung (je 2 Transwells) durchgeführt. Spalte 1 zeigt das jeweilige Protein, die Spalten 2 und 3 die eingesetzte Menge in μg und nmol. Der Widerstand des entsprechenden Transwelleinsatzes ist in Spalte 4 gezeigt. Die Transportraten für das Protein bzw. das als Permeabilitätsmarker mitgeführte Na-Fluorescein sind in den Spalten 5 und 6 aufgeführt.
Beispiel 7: Phaαen-Transport-Studie von mit Fluoreszenzfarbstoff beladenen Phagen Wildtyp-M13-Bakteriophagen wurden wie oben beschrieben präpariert. Das erhaltene Phagenpellet wurde in 1 ml Lucifer-Yellow-Lösung (10 mM) resuspendiert. Anschließend wurden 100 μl dieser Suspension in eine Elektroporationsküvette (auf Eis vorgekühlt) überführt und bei einer Transformationsspannung von 0,2-1 ,3 kV mit dem Farbstoff beladen bzw. gefüllt. Der Ansatz wurde mit 900 μl SM-Puffer aufgenommen und in ein Eppendorffgefäß (1,5 ml) überführt. Durch Zugabe von 200 μl PEG/NaCI-Lösung und Inkubation für 16 h auf Eis wurden die Phagen gefällt. Durch Zentrifugation bei 7.400xg und 4°C wurden die Phagen sedimentiert. Das Sediment wurde anschließend in SM- Puffer/PEG/NaCI (4:1) resuspendiert. Nach einer Inkubationszeit auf Eis von mindestens 20 min wurde erneut sedimentiert und das Pellet dann in 100 μl SM-Puffer aufgenommen.
Von diesen 100 μl wurden der Phagentiter und die Fluoreszenzintensität bestimmt. Jeweils 1012 Phagen wurden apikai in ein mit Hanks-Puffer gewaschenes Transwell zu 400 μl Hanks-Puffer pipet-
tiert und sofort 50 μl apikai und basolateral zum Zeitpunkt TO entnommen. Nach Inkubation für 30 min (T30) bei 37°C wurden apikai und basolateral Proben entnommen. Die Fluoreszenzintensitäten der Proben wurden im ELISA-Reader gemessen und die Titer der Phagen bestimmt, wie es oben beschrieben ist.
Die Phagenpartikel waren mit Fluoreszenzfarbstoff beladbar bzw. befüllbar. Diese beladenen Pha- genpartikel waren in der Lage, den Farbstoff über die Endothelzellbarriere in Richtung apikal- basolateral zu transportieren. Die Transportrate wurde durch die Beladung mit Farbstoff nicht beein- flusst und lag etwas höher bei 20%, wie bei unbeladenen Phagen.
Auch die Fluoreszenzintensität, die basolateral nachgewiesen werden konnte, bestätigte dieses Ergebnis. 20 % der gesamten Fluoreszenz wurden basolateral gefunden (Figur 12).