CN116983268A - 一种用于药物靶向递送的多肽修饰的脂质体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于药物靶向递送的多肽修饰的脂质体及其应用，涉及生物医药技术领域。所述脂质体的制备原料包括一种多肽修饰脂质材料。所述多肽修饰脂质材料通过将多肽偶联在含有聚乙二醇链的脂质材料上得到；所述多肽为Cys‑(Arg)n、Cys‑(Asp)n或Cys‑(His)n，其中n为在大于1且小于11范围内的整数；所述多肽通过其半胱氨酸残基上的硫醇基与所述聚乙二醇链偶联。本发明提供的多肽修饰的脂质体，可以实现对体内器官、组织以及细胞的药物进行靶向递送。本发明提供的多肽修饰脂质材料具有一定程度的普适性，可以与目前商用的多种脂质体辅料联用，离子化脂质材料与磷脂的种类可以任意调整。

Description

一种用于药物靶向递送的多肽修饰的脂质体及其应用
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，特别是涉及一种用于药物靶向递送的多肽修饰的脂质体及其应用。
背景技术
目前mRNA疫苗已经得到了广泛的应用，mRNA疫苗的成功应用不仅在疫苗领域是一项里程碑事件，这项技术的成功应用也极大推动核酸药物在多种领域的发展，如在肿瘤的免疫治疗、组织的再生与修复、细胞命运的调控以及基因编辑等众多生命健康领域。从原理上讲，核酸药物由于其具有模块化制备特征，可以根据目标蛋白快速生产制备出其mRNA或者DNA序列，然后再借助特定的核酸递送载体递送至体内靶向器官或者组织，因此核酸药物具有个性化、标准化以及模块化的优势，这一特性使其具备快速以及广泛应用的巨大潜力。
但由于裸露的核酸药物(mRNA、siRNA以及DNA等)稳定性与靶向性受体内诸多因素的影响，其很难主动输运至特定的目标部位发挥功效。因此核酸药物必须借助特定的递送载体，递送载体不仅可以保护包裹的核酸药物免受核酸酶降解，同时可以借助载体的靶向作用将核酸药物递送至特定的组织器官甚至是特定的细胞类型，进而实现核酸药物的靶向递送，因此安全、高效、靶向的递送载体是核酸药物在体内真正发挥功能的关键。由于体内存在多种生化与物理屏障，核酸药物一旦进入体内，血流剪切作用、蛋白冠包覆作用、单核巨噬系统以及核酸降解酶等多种作用使核酸药物在进入特定靶向细胞前极可能失效，核酸药物被细胞内吞后，需要进一步逃脱内涵体，这在一定程度上进一步限制了核酸药物的递送效率，因此成功将核酸药物体内递送至特定部位极具挑战。当前，无机纳米材料、多肽、聚合物、脂质体(LNP)等都被发展成为核酸药物递送载体，在众多载体之中，脂质体作为核酸、蛋白、以及化学药物的递送载体已经被广泛应用在新冠疫苗、癌症免疫治疗、组织修复与再生等众多领域。例如，在肝脏疾病治疗领域，2018年8月得到FDA批准Onpattro产品已在临床广泛应用，该产品是一款载siRNA的LNP剂型药物，用于治疗遗传性疾病转甲状腺素蛋白介导的淀粉样变性(hATTR)引起的多发性神经病变，通过抑制肝脏甲状腺素转运蛋白(TTR)的合成来发挥作用。当前，广泛使用的脂质体为载体的药物主要靶向器官为肝脏，如何使以脂质体为载体的药物实现肝外器官或组织的靶向，突破肝脏的阻碍作用是所递送药物发挥作用的关键。
为实现肝外器官的靶向递送，目前主要有以下三种方式：(1)：改变递送方式，通过局部注射的方式进行特定部位的药物递送，从而避免系统静脉注射方式核酸药物在体内路径所遭受的多重屏障作用，进而可以实现针对性特定组织部位的药物递送；(2)脂质体化学文库构建与筛选：研究人员目前主要通过离子化脂质体的化学结构改造实现纳米文库构建，然后通过高通量筛选，从而筛选出器官靶向载体。(3)额外组分添加：研究人员在脂质体原有的四组分的基础上添加第五种成分，通过添加的组分电荷性质调控，可以实现肝外器官的靶向递送。综上所述，通过静脉给药的器官靶向载体，无论是通过化学文库设计筛选以及电荷调控，都只是从化学结构以及成分的角度去优化脂质体化学结构或属性，进而改变其体内靶向递送行为，但该方法设计的载体显然不具备模块化控制特性，而具有可编码属性的多肽纳米载体具有优异的生物相容性、结构丰富、功能多样等优势，因此结合多肽修饰纳米脂质体对于筛选、优化、设计出对体内的器官、组织、细胞等多尺度靶向纳米载体具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于药物靶向递送的多肽修饰的脂质体及其应用，以解决上述现有技术存在的问题，本发明提供的多肽修饰的脂质体，可以实现对体内器官、组织以及细胞的药物进行靶向递送。
本发明提出了一种多肽修饰的脂质体，可以实现器官靶向的药物递送。首先通过不同种类与数目的氨基酸进行脱水缩合形成多肽，然后将制备而成的多肽偶联至Mal-PEG2k-DSPE，将脂质体五种组分溶于醇相，核酸溶于水相，二者通过微流控共混形成包裹核酸的纳米脂质体。最后将包裹核酸药物的纳米脂质体通过尾静脉注射进入小鼠体内，通过活体成像可以对递送的核酸药物的靶向器官进行观测。具体进行了以下操作和研究：
S1、多肽制备
按照实验需求选取特定种类与数目的氨基酸或者氨基酸衍生物，利用多肽合成(例如Fmoc固相肽合成方法)制备出特定编码的多肽，多肽的种类以及其长度取决于投入氨基酸或者氨基酸衍生物的种类与数目(计算机辅助设计)，通过制备多肽的性质调控(电荷、疏水作用、氢键作用等)，可以实现载体对体内特定器官、组织、细胞的药物靶向递送。
S2、多肽表征
首先将合成的多肽通过液相色谱(HPLC)确定主峰，然后通过质谱(MS)确定其分子量，与合成的目标多肽的分子量进行比对，确认合成多肽符合预期目标。
S3、多肽修饰的脂质体制备
在多肽的末端(C端或者N端)引入半胱氨酸参与反应，利用半胱氨酸的硫醇基与Mal-PEG2k-DSPE发生反应，可以将步骤S1中合成制备的多肽偶联至PEG2k-DSPE表面，最后通过核磁氢谱对其化学结构进行分析，确认成功将多肽偶联至PEG2k-DSPE表面。然后将将一定比例的离子化脂质(如SM102)、胆固醇、磷脂(如DSPC)、多肽偶联的PEG溶于乙醇，将特定量的核酸(如mRNA)溶于柠檬酸盐缓冲液中，然后将水相与醇相通过微流控装置按照特定流速进行共混，在微流体共混过程中核酸与脂质成分进行自组装，实现多肽修饰的脂质体的制备。
S4、多肽修饰的脂质体实现体内器官靶向递送mRNA
将一定含量步骤S3中合成的脂质体静脉注射至小鼠体内，为确定多肽修饰的脂质体的体内的器官分布，包裹核酸使用编码萤火虫荧光素酶的mRNA(Firefly LuciferasemRNA)。静脉注射小鼠脂质体几个小时后，在底物作用下通过活体成像对于小鼠各个器官进行成像，进而确定递送mRNA的靶向器官。为确定多肽修饰脂质体这种方法实现器官靶向是否具有一定的普适性与迁移性，通过改变离子化脂质种类，如商用最为广泛的MC3、SM102、ALC0315、LP01等，所形成的多肽修饰脂质体进行体内递送，通过活体成像确定其富集器官。此外，通过改变磷脂组分，如DSPC、DOPC、DOPE、HSPC等，然后表征所制备形成的脂质体的体内所富集的器官。最后，通过改变脂质体中修饰多肽的含量，分析不同浓度多肽修饰的脂质体对其体内器官靶向性的影响。
基于上述研究，本发明提供了如下方案：
本发明提供一种多肽修饰脂质材料，所述多肽修饰脂质材料通过将多肽偶联在含有聚乙二醇链的脂质材料上得到；
所述多肽为Cys-(Arg)n、Cys-(Asp)n或Cys-(His)n，其中n为在大于1且小于11范围内的整数；
所述多肽通过其半胱氨酸残基上的硫醇基与所述聚乙二醇链偶联。
进一步地，当所述多肽为Cys-(Arg)n时，n＝3、4、5、6、7或8；当所述多肽为Cys-(His)n时，n＝2、3、4、5、6、7、8或10。
进一步地，含有聚乙二醇链的脂质材料为Mal-PEG2k-DSPE。
本发明还提供上述的多肽修饰脂质材料在制备用于药物靶向递送的多肽修饰的脂质体中的应用。
本发明还提供一种用于药物靶向递送的多肽修饰的脂质体，制备原料包括上述的多肽修饰脂质材料。
进一步地，所述多肽修饰的脂质体还包括离子化脂质、磷脂、胆固醇和磷脂-聚乙二醇。
进一步地，所述离子化脂质、所述磷脂、所述胆固醇、所述多肽修饰脂质材料和所述磷脂-聚乙二醇的摩尔比为50∶10∶38.5∶6∶0.75。
进一步地，所述磷脂为二硬脂酰磷脂酰胆碱、1,2-二油酰基-SN-甘油-3-磷酸胆碱、1,2二油酰基丙三基3-磷脂酰乙醇胺或氢化大豆磷脂酰胆碱。
进一步地，所述离子化脂质为MC3、SM102、ALC0315或LP01。
本发明还提供上述的多肽修饰的脂质体在提高药物靶向性中的应用。
本发明公开了以下技术效果：
1.本发明提供的多肽修饰的脂质体，可以实现对体内器官、组织以及细胞的药物进行靶向递送。
2.本发明提供的可编码多肽脂质体可以构建一种模块化多肽修饰的纳米脂质体的递送平台，通过调整编码多肽的氨基酸或者氨基酸衍生物的种类与数目，可以实现可编程式纳米载体文库构建。
3.本发明具有一定程度的普适性，可以与目前商用的多种脂质体辅料联用，离子化脂质材料与磷脂的种类可以任意调整，多肽修饰的脂质体均可以优先富集至肝外特定器官。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为实施例1所制备合成的3R(A)、6D(B)和6R(C)的化学结构图；
图2为实施例1所制备合成的3R的液相色谱(HPLC)检测结果；
图3为实施例1所制备合成的3R的质谱(MS)检测结果；
图4为实施例1所制备合成的6D的液相色谱(HPLC)检测结果；
图5为实施例1所制备合成的6D的质谱(MS)检测结果；
图6为实施例1所制备合成的6R的液相色谱(HPLC)检测结果；
图7为实施例1所制备合成的6R的质谱(MS)检测结果；
图8为表征DSPE-PEG2k-3R/6D/6R的核磁氢谱结果；其中A-C分别为DSPE-PEG2k-3R、DSPE-PEG2k-6D和DSPE-PEG2k-6R；
图9为制备包裹mRNA多肽修饰脂质体的微流控装置示意图；
图10为3R、6R和6D多肽修饰脂质体(分别以MC3、SM102、ALC0315、LP01为离子化脂质，DSPC为磷脂)递送Firefly Luciferase mRNA体内各个器官靶向结果；其中A为3R、6R和6D的活体成像图；B为肝、肺、脾递送mRNA表达蛋白占比；C-E分别为3R、6R和6D的荧光统计结果；
图11为3R、6R和6D多肽修饰脂质体(以MC3为离子化脂质，DOPC、DOPE、HSPC为磷脂)递送Firefly Luciferase mRNA体内各个器官靶向结果；；其中A为3R、6R和6D的活体成像图；B为肝、肺、脾递送mRNA表达蛋白占比；C-E分别为3R、6R和6D的荧光统计结果；
图12为改变编码精氨酸(R)、组氨酸(H)数目以及编码组合的多肽，经过此多肽修饰后的脂质体递送Firefly Luciferase mRNA的活体荧光结果；其中，A为2R-10R；B为2H-10H；C为不同尺寸多肽对三种器官靶向的归一化比较结果；
图13为多肽修饰LNPs共递送两种信使核糖核酸(Luciferase mRNA与EGFP绿色荧光蛋白)的结果；
图14为实现递送EGFP-ASO到靶向器官结果；A为靶向递送EGFP-ASO器官至肝、肺和脾脏活体图像；B为靶向器官中EGFP流式分析结果，灰色曲线代表阴性组(PBS注射)；C为靶向递送EGFP-ASO至肝、肺和脾脏的荧光切片图像；比例尺：50μm；
图15为递送Cre mRNA递送到mT-mG工具鼠体内实现器官特异性编辑；A为将Cre递送到mT-mG工具鼠中诱导EGFP表达的示意图；B为递送Cre mRNA后靶向器官中的EGFP荧光图像；C为靶向器官的共聚焦图像(证实了EGFP蛋白的表达)；比例尺：50μm；
图16为递送Cas9mRNA和sgSTOP到mT-mG小鼠体内实现器官特异性的基因编辑(CRISPR)；A为将Cas9mRNA和sgSTOP共同递送到Ai14工具鼠中诱导tdTomato表达的示意图；B为CRSPR-Cas基因编辑后靶向器官的离体tdTomato活体成像结果；C为靶向器官的共聚焦图像(证实了tdTomato蛋白的表达)；比例尺：50μm；
图17为对C57/BL6野生型小鼠器官特异性的PTEN基因编辑；A器官特异性的PTEN基因编辑示意图；B为Cas9mRNA或Cas9蛋白和sgPTEN共同递送靶向器官的免疫组化(IHC)图像；比例尺：100μm；C为每个组织切片(n＝10个组织切片)中阳性PTEN蛋白的归一化统计结果；
图18为对C57/BL6野生型小鼠肝脏PCSK9基因编辑；A为PCSK9敲除的蛋白免疫印迹(WB)分析；B为PCSK9蛋白的Elisa定量分析；C为胆固醇的定量分析；
以上所有数据均来自n＝3只生物学上独立的小鼠，所有数据均绘制为平均值±标准差，使用不成对的双侧Student t检验计算P值，*P<0.05，**P＜0.001，****P＜0.0001。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
术语说明：
Fmoc-Arg(Pbf)-OH是指Fmoc-保护基精氨酸，CAS号154445-77-9。
HOBT是指1-羟基苯并三唑，CAS号2592-95-2。
DIC是指N,N'-二异丙基碳二亚胺，CAS号693-13-0。
Fmoc-Cys(Trt)-OH是指N-芴甲氧羰基-S-三苯甲基-L-半胱氨酸，CAS号103213-32-7
Fmoc-Asp(OtBu)-OH是指芴甲氧羰基-天冬氨酸-4-叔丁脂，CAS号71989-14-5。
DSPC是指二硬脂酰磷脂酰胆碱，CAS号816-94-4。
DOPC指1,2-二油酰基-SN-甘油-3-磷酸胆碱，CAS号4235-95-4
DOPE指1,2二油酰基丙三基3-磷脂酰乙醇胺，CAS号4004-05-1。
HSPC指氢化大豆磷脂酰胆碱，CAS号：92128-87-5。
Mal-PEG2k-DSPE是指马来酰亚胺-聚乙二醇-磷脂，购自广州碳水有限公司。
DSPE-PEG是指磷脂-聚乙二醇，购自广州碳水有限公司
用于制备脂质体的辅料如离子化脂质SM102、MC3、ALC0315和LP01，购自厦门赛诺邦格生物科技股份有限公司。
为了阐述方便，下面列举一个多肽修饰的脂质体的制备案例，并且体内实现肝、脾、肺三种器官的mRNA靶向递送。本发明主要聚焦于多肽(包括其他的多肽衍生物等)修饰的脂质体的器官靶向递送技术，通过模块化的多肽修饰纳米载体有望实现特定器官、组织、细胞类型的载体的筛选、优化以及设计，最终实现靶向药物递送，但实际情况完全不局限于此。
对于模块化多肽，选用3R、6D、6R，分别将此三种多肽偶联至Mal-PEG2k-DSPE，然后将五种脂质成分离子化脂质：磷脂：胆固醇：多肽偶联物：DSPE-PEG按照摩尔比为50∶10∶38.5∶6∶0.75溶于醇相，Firefly Luciferase mRNA溶于水相，离子化脂质与核酸的N/P比为5.67，二者通过微流控装置按照1∶3流速进行共混，制备包裹Firefly Luciferase mRNA的纳米脂质体。值得说明的是这里采用的特定多肽修饰方法以及包裹Firefly LuciferasemRNA的脂质体制备技术只是其中一种案例，本发明所涉及的器官与组织靶向脂质体修饰并不局限于天然氨基酸所编码的多肽，对于非天然氨基酸以及其他氨基酸衍生物等编码所形成的多肽类物质也同样适用。
以下实施例中使用的Cas9mRNA购自Trilink,Cas9蛋白、修饰的sgSTOP、sgPTEN、sgPCSK9和EGFP-ASO(EGFP反义寡核苷酸)购自GeneScript。
实施例1
S1、多肽的合成
本实例中设计了3R、6D、6R三种多肽，其化学结构分别如图1中A-C所示，具体合成方式如下：
(1)3R的合成制备：
a)选wang树脂1克，装载量为1mmol/g，加第一个氨基酸Fmoc-Arg(Pbf)-OH 1.3g，HOBT 1g，DIC为1毫升，吹氮气保护，反应6小时。
b)抽调反应液体，茚三酮检测，树脂为无色后，用DMF和DCM交替洗四遍，加入哌啶配比液20毫升，反应15分钟，脱Fmoc保护。
c)用DMF和DCM交替洗四遍，茚三酮检测，树脂显示棕色，表示Fmoc已经脱掉可以进行下一步氨基酸反应。
d)加入第二个氨基酸Fmoc-Arg(Pbf)-OH 1.3克，HOBT 0.5克，DIC 0.5毫升，反应2个小时，茚三酮监控，树脂无色则进行哌啶配比液脱除Fmoc保护，然后进行下一步。
e)依次完成多肽序列最后一个氨基酸Fmoc-Cys(Trt)-OH合成并脱去Fmoc保护。
f)树脂洗干净，抽干，用TFA裂解；冰乙醚沉降，离心，得到3R固体。
(2)6D的合成制备：
a)选wang树脂1克，装载量为1mmol/g，加第一个氨基酸Fmoc-Asp(OtBu)-OH 1g，HOBT 1g，DIC为1毫升，吹氮气保护，反应6小时。
b)抽调反应液体，茚三酮检测，树脂为无色后，用DMF和DCM交替洗四遍，加入哌啶配比液20毫升，反应15分钟，脱Fmoc保护。
c)用DMF和DCM交替洗四遍，茚三酮检测，树脂显示棕色，表示Fmoc已经脱掉可以进行下一步氨基酸反应。
d)加入第二个氨基酸Fmoc-Asp(OtBu)-OH 1克，HOBT 0.5克，DIC 0.5毫升，反应2个小时，茚三酮监控，树脂无色则进行哌啶配比液脱除Fmoc保护，然后进行下一步。
e)依次完成多肽序列最后一个氨基酸Fmoc-Cys(Trt)-OH合成并脱去Fmoc保护。
f)树脂洗干净，抽干，用TFA裂解；冰乙醚沉降，离心，得到6D固体。
(3)6R的合成制备：
a)选wang树脂1克，Loading为1mmol/g，加第一个氨基酸Fmoc-Arg(Pbf)-OH 1.3g，HOBT 1g，DIC为1毫升，吹氮气保护，反应6小时。
b)抽调反应液体，茚三酮检测，树脂为无色后，用DMF和DCM交替洗四遍，加入哌啶配比液20毫升，反应15分钟，脱Fmoc保护。
c)用DMF和DCM交替洗四遍，茚三酮检测，树脂显示棕色，表示Fmoc已经脱掉可以进行下一步氨基酸反应。
d)加入第二个氨基酸Fmoc-Arg(Pbf)-OH 1.3克，HOBT 0.5克，DIC 0.5毫升，反应二个小时，茚三酮监控，树脂无色则进行哌啶配比液脱除Fmoc保护，然后进行下一步。
e)依次完成多肽序列最后一个氨基酸Fmoc-Cys(Trt)-OH合成并脱去Fmoc保护。
f)树脂洗干净，抽干，用TFA裂解；冰乙醚沉降，离心，得到6R固体。
S2、多肽的表征。
对步骤S1中制备得到的三种多肽固体通过MS确认分子量，通过HPLC确定主峰，结果如图2-7所示，然后液相制备纯化收取产物，冻干。
S3、多肽修饰的脂质体(LNP)制备
取1mmol 3R、1mmol 6D和1mmol 6R，分别和1mmol Mal-PEG2k-DSPE加入到反应瓶中，之后分别进行如下操作：在氩气保护下分别加入10mL超干溶剂(四氢呋喃)溶解，再加入10μL新蒸缚酸剂，密封后室温搅拌反应24小时。将上述反应液分别置于透析袋中，使用超纯水透析3天，冻干得到最终产物DSPE-PEG2k-3R/6D/6R，利用核磁氢谱对产物进行化学结构表征，验证多肽是否成功偶联至PEG2k-DSPE，其结果如图8中A-C所示。将五种脂质成分(离子化脂质MC3、磷脂DSPC、胆固醇、DSPE-PEG2k-3R/6D/6R、DSPE-PEG)按照摩尔比为50∶10∶38.5∶6∶0.75溶于乙醇(醇相)，Firefly Luciferase mRNA溶于柠檬酸盐缓冲液(水相)中，离子化脂质与mRNA按照N/P比为5.67进行配置，醇相与水相体积比为1∶3，醇相与水相按照流速比为1∶3(醇相与水相分别为0.3mL/min与0.9mL/min)通过如图9所示的微流控通道，收取经过多肽修饰的脂质体，最后将收取的液体经过1×PBS透析过夜，最后得到三种包裹了Luciferase mRNA的脂质体。
S4、多肽修饰的脂质体实现器官靶向体内递送mRNA
S4-A、将上述步骤S3中得到的三种包裹了Firefly Luciferase mRNA的脂质体，分别按照每只小鼠5μg mRNA的含量尾静脉注入小鼠体内，三个小时后每只小鼠腹腔注射200μLFirefly Luciferase底物(浓度为20mg/mL)，底物注射3min后，取出小鼠体内的五种主要器官(心、肝、脾、肺、肾)进行活体成像，利用活体成像软件对五种器官进行荧光强度的定量统计。
S4-B、离子化脂质种类对器官靶向性影响探究
为确定多肽修饰的脂质体器官靶向性是否依赖于特定的离子化脂质成分，因此探究改变离子化脂质种类对器官特异性的影响。分别选取MC3、SM102、ALC0315和LP01这三种商用最为广泛的离子化脂质成分作为脂质体，其他四种脂质体成分依然选取DSPC、胆固醇、DSPE-PEG2k-3R/6D/6R、DSPE-PEG，所形成的包裹Firefly Luciferase mRNA的脂质体经过S4-A同样步骤进行器官的荧光强度统计比较，其结果如图10所示。将制备脂质体的离子化脂质成分进行更改，但是其主要富集的器官仍然保持不变，只是Firefly Luciferase蛋白的荧光强度有所差异，这是由于不同离子化脂质所形成的脂质体的理化性质差异，而造成在体内成功递送Firefly Luciferase mRNA效率的差异。
S4-C、磷脂种类对器官靶向性影响探究
将形成脂质体组分中的磷脂成分分别调整为DOPC、DOPE或HSPC，其他四种脂质体成分选取MC3、胆固醇、DSPE-PEG2k-3R/6D/6R、DSPE-PEG，然后按照S4-A同样步骤进行器官的荧光强度统计比较，其统计结果如图11所示。结果显示，三种不同磷脂成分分别形成的多肽修饰脂质体在小鼠体内仍可以实现器官特异性递送mRNA。说明经过3R、6D、6R三种多肽修饰的脂质的器官富集特性不依赖于脂质体的离子化脂质以及磷脂种类，该方法所形成的多肽修饰脂质体对器官的富集特性具有一定程度的迁移性与普适性。
本发明所设计的药物递送载体具有模块化特征，通过将编码多肽的氨基酸数目进行调整，即可改变修饰在脂质体的多肽尺寸。按照步骤S1的合成流程，针对精氨酸，本发明依次合成制备了2R、3R、4R、5R、6R、7R、8R、9R、10R九种不同尺寸的多肽，其中nR表示Cys-(Arg)n，n＝2、3、4、5、6、7、8、9或10。针对组氨酸，本发明依次合成制备了2H、3H、4H、5H、6H、7H、8H、9H、10H九种不同尺寸的多肽(方法参考步骤S1)，其中nH表示Cys-(His)n，n＝2、3、4、5、6、7、8、9或10。然后再按照步骤S2进行表征以及步骤S3进行多肽修饰的脂质体的制备(其他四种组分别选取离子化脂质MC3、磷脂DSPC、胆固醇、DSPE-PEG)。然后按照S4-A同样步骤将合成制备的脂质体进行体内静脉注射并进行器官的荧光强度统计比较，其统计结果如图12所示。结果表明脂质体对于器官的靶向性严重依赖于修饰多肽的尺寸，如3H的主要靶向器官为肝脏，而8H的靶向器官则为脾脏；3R修饰载体的靶向器官为肝脏，5R的靶向器官则变为肝脏与肺，而当精氨酸数目编码数目变为6时，其主要靶向器官则变为肺，这说明基于编码尺寸的模块化微调则可以使递送载体的靶向器官改变。此外，改变6R多肽氨基酸的序列，替换为赖氨酸(K)，使原本靶向器官由肺变为肝脏与脾脏，进一步说明编码多肽修饰脂质体的器官靶向性对多肽的分子敏感性。
以上结果说明通过将编码多肽进行模块化调整，既可实现纳米载体在体内器官的选择性递送，也可以实现递送效率的调控，并且靶向性与效率是具有单分子敏感特性。同时，本发明中选取精氨酸与组氨酸数目编码只是示例之一，可以对氨基酸以及氨基酸衍生物的种类与数目进行多种排列组合，这种模块化的组合可以与机器学习等人工智能算法相结合，实现纳米载体的智能化设计。
S6、体内多种信使核糖核酸递送
在免疫疗法、组织修复和细胞编程等诸多领域，基于mRNA疗法往往可能需要多种蛋白质共同发挥作用，因此同时递送多种mRNA至靶向器官至关重要。为了实现这一目标，多肽修饰LNP封装了可以编码Luc和EGFP蛋白的mRNA，然后C57BL/6小鼠接受以0.4mg/kg的总剂量(0.1mg/kg的Luc mRNA和0.3mg/kg的EGFP)尾静脉注射。6小时后，分离器官，并通过IVIS Lumina系统对Luc和EGFP荧光进行成像。如图13所示，在LNP系统的靶器官中观察到显著的Luc发光和EGFP荧光。说明经过多肽修饰的器官靶向纳米粒子可以共递送多种核酸分子至靶器官。
S7、ASO体内递送
为了拓宽LNPs的应用范围，本发明用LNPs封装了GFP-ASO，并试图将EGFP-ASO递送到特定器官。ASO可以降解mRNA，并已被美国食品药品监督管理局批准用作临床治疗，但ASOs的器官靶向递送仍然具有挑战性。对于ASO的包封，脂质和ASO的比例固定为15/1(wt/wt)。将包裹EGFP-ASO的多肽修饰LNPs尾静脉静脉注射到EGFP工具鼠中三次(第0天、第1天和第2天)，并在第3天分离靶器官进行荧光成像。并对主要器官(肝、肺和脾)切片进行染色，并使用共聚焦显微镜(Zeiss LSM710)检测EGFP降低效果。此外，为了定量分析EGFP的抑制效率，根据Miltenyi试剂盒的方案将靶器官解离成单细胞悬浮液，并进一步进行流式细胞术(SONY ID7000)定量分析。
靶器官的活体成像结果证实了ASO的功能性靶向递送(图14中A)，并与流式分析结果的趋势保持一致(图14中B)。由于EGFP通道中器官的显著自发荧光，本发明同时选择共焦成像作为检测方法来验证器官特异性ASO的功能递送。在特定靶器官的切片中发现EGFP阳性细胞明显减少(图14中C)，再次确认了多肽修饰LNP递送系统可以实现器官靶向递送ASO分子。
S8、将Cre mRNA递送到mT-mG小鼠模型中
为了验证多肽修饰LNP对器官特异性基因编辑的能力，本发明首先将Cre重组酶(Cre)mRNA递送到mT-mG工具鼠体内。该基因工程小鼠能够在所有组织中表达tdTomato蛋白。在Cre介导的重组后，CMVb-肌动蛋白增强子启动子(pCA)促进增强的绿色荧光蛋白的表达，如图15中A所示。本发明将包裹Cre mRNA的多肽修饰LNP注射到mT-mG小鼠中，并在两天后分离器官进行活体成像。活体成像结果如图15中B所示，在靶器官肝、肺和脾观察到了显著的EGFP荧光。此外，与活体成像结果一致，在靶器官的组织切片中也检测到明显的EGFP绿色荧光(图15中C)，进一步提供了多肽修饰LNP递送系统可以实现器官特异性基因编辑。
S9、Ai14小鼠模型中的基因编辑(Cas9mRNA/sgSTOP)
Cas9mRNA和sgTom(2/1，wt/wt)用POST LNPs包封，并以2mg/kg的总RNA剂量共递送到Ai14小鼠(每组n＝3)中三次(第0天、第1天和第2天)。第一次注射后7天，通过IVISLumina系统和共聚焦显微镜检测主要器官的tdTomato荧光。
通过将Cas9mRNA和sgRNA共同递送到选定的器官中，将LNP系统用于CRISPR-Cas基因编辑。本发明在所有器官中使用了具有Loxp-STOP-Loxp-tdTomato的Ai14模型小鼠，并且Cas 9mRNA和sgSTOP可以删除停止并激活tdTomoto蛋白的表达(图16中A)。Cas 9mRNA和sgSTOP以2:1的比例同时封装在多肽修饰LNP中，并静脉注射到Ai14小鼠中。如图16中B所示，7天后，在相应的LNP的特定器官中可以检测到明亮的tdTomato荧光，这意味着LNP系统的有效器官特异性CRISPR-Cas基因编辑。同样，共聚焦荧光图像显示tdTomato阳性细胞(图16中C)。
S10、C57BL/6小鼠中Cas9mRNA/sgPTEN和RNPs的共递送
为了证实多肽修饰LNP递送系统的应用潜力，本发明试图实现内源性靶标的CRISPR-Cas基因编辑。在这里，之所以选择PTEN，是因为它在细胞增殖、DNA修复和肿瘤抑制中起着关键作用，已经是广泛关注的重要靶点。本发明专注于将Cas9mRNA和sgPTEN共同递送到野生型C57BL/6小鼠中，以缺失PTEN靶标，为了验证多肽修饰的LNP在野生型C57BL/6小鼠中的基因编辑能力，本发明选择磷酸酶和紧张素同源物(PTEN)基因作为内源性靶标。Cas9mRNA和sgPTEN(4/1，wt/wt)用多肽修饰LNP包封，并以4mg/kg的剂量共递送到C57BL/6小鼠中，连续注射三天。10天后，处死小鼠，收集肺和肝进行进一步的IHC染色评估。对于Cas9/sgPTEN RNPs递送，Cas9蛋白和sgPTEN的摩尔比固定为1/3。值得注意的是，RNP混合物首先溶解在1×PBS中并孵育15分钟，然后与乙醇相快速混合。如图17中A所示，连续三次注射后，肝和肺的IHC结果显示PTEN蛋白显著降低。类似地，多肽修饰的LNP也实现了Cas9蛋白/sgPTEN复合物的共递送(图17中B)，实现了PTEN基因的敲除。阳性PTEN蛋白表达归一化结果定量分析表明了多肽修饰LNP系统的靶向性(图17中C)。
S11、体内递送Cas9mRNA/sgPCSK9用于肝脏中的PCSK9基因敲除
为了证实多肽修饰LNP系统是否可以对临床相关PCSK9靶点实现器官特异性基因敲除，将Cas9mRNA和sgPCSK9(1/1，wt/wt)用多肽修饰LNP包封，以2mg/kg的剂量共递送到野生型C57BL/6小鼠，连续尾静脉注射三次(第0天、第2天、第4天)。在第七天，收集肝脏用于进一步的蛋白质印迹评估。分别采集小鼠的血液用于ELISA分析(第10天)和胆固醇检测(第15天)。结果显示肝脏和血清中的PCSK9蛋白均明显降低(图18中A和B)。血清中胆固醇的降低也证实了PCSK9基因的成功敲除(图18中C)。因此，多肽修饰LNP系统设计可以为治疗相关遗传性疾病的提供一个潜在的平台。
基于以上递送载体平台的设计，通过模块化多肽修饰，可以构造可编程式的模块化纳米载体文库，结合高通量筛选工具可以从中筛选出相应的靶向载体。模块化多肽修饰是纳米载体的关键元件，也是结合人工智能以及大数据技术对靶向载体实现智能化设计与构造的重要基础。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (10)

1.一种多肽修饰脂质材料，其特征在于，所述多肽修饰脂质材料通过将多肽偶联在含有聚乙二醇链的脂质材料上得到；
所述多肽为Cys-(Arg)n、Cys-(Asp)n或Cys-(His)n，其中n为在大于1且小于11范围内的整数；
所述多肽通过其半胱氨酸残基上的硫醇基与所述聚乙二醇链偶联。
2.根据权利要求1所述的多肽修饰脂质材料，其特征在于，
当所述多肽为Cys-(Arg)n时，n＝3、4、5、6、7或8；
当所述多肽为Cys-(His)n时，n＝2、3、4、5、6、7、8或10。
3.根据权利要求1所述的多肽修饰脂质材料，其特征在于，含有聚乙二醇链的脂质材料为Mal-PEG2k-DSPE。
4.一种如权利要求1-3任一项所述的多肽修饰脂质材料在制备用于药物靶向递送的多肽修饰的脂质体中的应用。
5.一种用于药物靶向递送的多肽修饰的脂质体，其特征在于，制备原料包括权利要求1-3任一项所述的多肽修饰脂质材料。
6.根据权利要求5所述的多肽修饰的脂质体，其特征在于，所述多肽修饰的脂质体还包括离子化脂质、磷脂、胆固醇和磷脂-聚乙二醇。
7.根据权利要求6所述的多肽修饰的脂质体，其特征在于，所述离子化脂质、所述磷脂、所述胆固醇、所述多肽修饰脂质材料和所述磷脂-聚乙二醇的摩尔比为50∶10∶38.5∶6∶0.75。
8.根据权利要求6所述的多肽修饰的脂质体，其特征在于，所述磷脂为二硬脂酰磷脂酰胆碱、1,2-二油酰基-SN-甘油-3-磷酸胆碱、1,2二油酰基丙三基3-磷脂酰乙醇胺或氢化大豆磷脂酰胆碱。
9.根据权利要求6所述的多肽修饰的脂质体，其特征在于，所述离子化脂质为MC3、SM102、ALC0315或LP01。
10.一种如权利要求5-9所述的多肽修饰的脂质体在提高药物靶向性中的应用。
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