ES2317953T3 - Anticuerpos humanizados que reconocen el peptido beta amiloide. - Google Patents

Abstract

Una inmunoglobulina humanizada que se une específicamente al péptido beta amiloide (Aa), o fragmento de unión a antígeno de la misma, comprendiendo la inmunoglobulina humanizada o fragmento de unión a antígeno: (i) una región variable de cadena ligera que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR) y los restos flanqueantes de cadena ligera variable L2, L36 y L46 (convención de numeración de Kabat) de la secuencia de la región variable de cadena ligera de la inmunoglobulina 3D6 expuesta como SEC ID Nº 2, en la que el resto de la región variable de cadena ligera es de una cadena ligera de inmunoglobulina aceptora humana seleccionada entre el grupo constituido por Kabat ID 019230, Kabat ID 005131, Kabat ID 005058, Kabat ID 005057, Kabat ID 005059, Kabat ID U21040 y Kabat ID U41645; y (ii) una región variable de cadena pesada que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR) y los restos flanqueantes de cadena pesada de la región variable H49, H93 y H94 (convención de numeración de Kabat) de la secuencia de la región variable de cadena pesada de la inmunoglobulina 3D6 expuesta como SEC ID Nº 4 y los restos flanqueantes de cadena pesada de la región variable H74, H77 y H89 de la secuencia de la línea germinal humana VH3-23, en la que el resto de la región variable de cadena pesada es de una cadena pesada de inmunoglobulina aceptora humana seleccionada entre el grupo constituido por Kabat ID 045919, Kabat ID 000459, Kabat ID 000553, Kabat ID 000386 y Kabat ID M23691.

Description

Anticuerpos humanizados que reconocen el péptido beta amiloide.

Antecedentes de la invención

La enfermedad de Alzheimer (AD) es una enfermedad progresiva que provoca demencia senil. Véase en líneas generales Selkoe, TINS 16:403 (1993); Hardy y col., documento WO 92/13069; Selkoe; J. Neuropathol. Exp. Neurol. 53:438 (1994); Duff y col., Nature 373: 476 (1995); Games y col., Nature 373:523 (1995). Hablando en términos generales, la enfermedad se clasifica en dos categorías: de aparición tardía, que sucede a edad avanzada (más de 65 años) y de aparición temprana, que se desarrolla antes del periodo senil, es decir, entre los 35 y 60 años. En ambos tipos de enfermedad, la patología es la misma pero las anormalidades tienden a ser más graves y extendidas en casos que comienzan a una edad más temprana. La enfermedad se caracteriza por al menos dos tipos de lesiones en el cerebro, ovillos neurofibrilares y placas seniles. Los ovillos neurofibrilares son depósitos intracelulares de microtúbulos asociados a proteína tau constituida por dos filamentos enrollados entre sí en pares. Las placas seniles (es decir, placas amiloides) son áreas de neurópilo desorganizado de hasta 150 mm de ancho con depósitos amiloides extracelulares en el centro que son visibles por análisis microscópico de secciones de tejido cerebral. La acumulación de placas amiloides dentro del cerebro también está asociada con el síndrome de Down y otros trastornos cognitivos.

El constituyente principal de las placas es un péptido llamado péptido A\beta o \beta-amiloide. El péptido A\beta es un fragmento interno de 4-kDa de 39-43 aminoácidos de una glicoproteína transmembrana más grandes llamada proteína precursora de amiloide (APP). Como resultado del procesamiento proteolítico de APP por diferentes enzimas secretasa, A\beta se encuentra principalmente tanto en una forma corta, de 40 aminoácidos de longitud, como una forma larga, que varía de 42-43 aminoácidos de longitud. Parte del dominio transmembrana hidrófobo de APP se encuentra en el extremo carboxi de A\beta, y puede representar la capacidad de A\beta de agregarse en placas, particularmente en el caso de la forma larga. La acumulación de placas amiloides en el cerebro finalmente conduce a muerte de las células neuronales. Los síntomas físicos asociados con este tipo de deterioro neural caracterizan la enfermedad de Alzheimer.

Se han correlacionado varias mutaciones dentro de la proteína APP con la presente de enfermedad de Alzheimer. Véase, por ejemplo, Goate y col., Nature 349:704 (1991) (valina^{717} en isoleucina); Chartier Harlan y col. Nature 353:844 (1991) (valina^{717} en glicina); Murrell y col., Science 254:97 (1991) (valina^{717} en fenilalanina); Mullan y col. Nature Genet. 1:345 (1992) (una doble mutación que cambia lisina^{595}-metionine^{596} en asparagina^{595}-leucina^{595}). Se cree que dichas mutaciones causan la enfermedad de Alzheimer por un procesamiento aumentado o alterado de APP en A\beta, particularmente el procesamiento de APP en cantidades aumentadas de la forma larga de A\beta (es decir, A\beta1-42 y A\beta1-43). Se cree que mutaciones en otros genes, tales como los genes de presenilina, PS1 y PS2, que afectan indirectamente al procesamiento de APP para generar cantidades aumentadas de la forma larga de A\beta (véase Hardy, TINS 20: 154 (1997)).

Se han usado con éxito modelos de ratón para determinar el significado de las placas amiloides en enfermedad de Alzheimer (Games y col., supra, Johnson-Wood y col., Proc. Natl. Acad Sci. USA 94:1550 (1997)). En particular, cuando a ratones PDAPP transgénicos (que expresan una forma mutante de APP humana y desarrollan enfermedad de Alzheimer a una edad joven), se les inyecta la forma larga de A\beta, presentan tanto una disminución en el progreso de la enfermedad de Alzheimer como un aumento en los títulos de anticuerpos al péptido Ap (Schenk y col., Nature 400, 173 (1999)). Las observaciones analizadas anteriormente indican que A\beta, particularmente en su forma larga, es un elemento causante en la enfermedad de Alzheimer.

McMichael, documento EP 526.511, propone la administración de dosificaciones homeopáticas (menos de o igual a 10^{-2} mg/día) de A\beta a pacientes con AD preestablecida. En un ser humano típico con aproximadamente 5 litros de plasma, se esperaría que incluso el límite superior de esta dosificación generara una concentración de no más de 2 pg/ml. La concentración normal de A\beta en plasma humano está típicamente en el intervalo de 50-200 pg/ml (Seubert y col., Nature 359:325 (1992)). Como la dosificación propuesta del documento EP 526.511 apenas alteraría el nivel de A\beta en circulación endógeno y como el documento EP 526.511 no recomienda el uso de un adyuvante, como un inmunoestimulante, parece inverosímil que se produjera algún beneficio terapéutico.

Bord y col., Nature Medicine, 2000, 6(8): 916-919 analizan anticuerpos monoclonales que se unen a A\beta pero contiene muy poca información respecto a estos anticuerpos.

Por consiguiente, existe la necesidad de nuevas terapias y reactivos para el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer, en particular, terapias y reactivos capaces de producir un beneficio terapéutico a dosis fisiológicas (por ejemplo, no tóxicas).

Sumario de la invención

La presente invención ofrece nuevos reactivos inmunológicos, en particular, reactivos de anticuerpo terapéuticos para la prevención y tratamiento de una enfermedad amiloidogénica (por ejemplo, la enfermedad de Alzheimer). La invención se basa, al menos en parte, en la identificación y caracterización de un anticuerpo monoclonal 306 que se une específicamente al péptido A\beta y es eficaz para reducir la carga de placas y/o reducir la distrofia neurítica asociada con los trastornos amiloidogénicos. El análisis estructural y funcional de este anticuerpo conduce a un diseño de diversos anticuerpos humanizados para uso profiláctico y/o terapéutico. En particular, la invención ofrece la humanización de las regiones variables de este anticuerpo y, por consiguiente proporciona cadenas de inmunoglobulina o anticuerpo humanizadas, inmunoglobulinas o anticuerpos humanizados intactos, y fragmentos de inmunoglobulina o anticuerpo funcionales, en particular, fragmentos de unión a antígeno, del anticuerpo caracterizado.

También se describen reactivos polinucleotídicos, y vectores adecuados para codificar los anticuerpos humanizados.

Se describe el uso de anticuerpos humanizados en la preparación de un medicamento para el tratamiento de enfermedades o trastornos amiloidogénicos (por ejemplo, la enfermedad de Alzheimer), que son composiciones farmacéuticas para su uso en dichas aplicaciones.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 representa un alineamiento de las secuencias de aminoácidos de la cadena ligera de anticuerpos 3D6 de ratón, 3D6 humanizado, Kabat ID 109230 y A19 de la línea germinal. Las regiones CDR están indicadas por flechas. La cursiva en negrita indica restos murinos raros. La negrita indica restos de empaquetado (VH+VL). El relleno continuo indica restos de interacción canónicos/CDR. Los asteriscos indican restos seleccionados para mutación de reversión en 3D6 humanizado, versión 1.

La Figura 2 representa un alineamiento de las secuencias de aminoácidos de la cadena pesada de los anticuerpos 3D6 de ratón, 3D6 humanizado, Kabat ID 045919 y VH3-23 de la línea germinal. La anotación es la misma que para la Figura 1.

La Figura 3 representa gráficamente las propiedades de unión a A\beta de 3D6, 3D6 quimérica y 10D5. La Figura 3A es un gráfico que representa la unión de A\beta a 3D6 quimérica (PK1614) en comparación con 3D6 murina. La Figura 3B es un gráfico que representa la competición de 3D6 biotinilidada frente a 3D6 no marcada, PK1614 y 10D5 por la unión a A\beta.

La Figura 4 representa un modelo de homología de VH y VL de 3D6, que muestra el trazo de la estructura de carbonos \alpha. VH se muestra en forma de una línea punteada, y VL se muestra en forma de una línea continua. Las regiones CDR se indican en forma de cintas.

La Figura 5 representa gráficamente las propiedades de unión a A\beta de 3D6 quimérica y 3D6 humanizada. La Figura 5A representa los resultados de ELISA que mide la unión de 3D6v1 humanizada y 3D6 quimérica a A\beta agregado. La Figura 5B representa los resultados de ELISA que mide la unión de 3D6v1 humanizada y 3D6v2 humanizada a A\beta agregado.

La Figura 6 es un gráfico que cuantifica la unión de 3D6 humanizada y 3D6 quimérica a placas A\beta a partir de secciones cerebrales de ratones PDAPP.

La Figura 7 es un gráfico que muestra los resultados de un ensayo de unión competitiva que ensaya la capacidad de 3D6 humanizada versiones 1 y 2, 3D6 quimérica, 3D6 murina, y 10D5 de competir con 3D6 murina por la unión a A\beta.

La Figura 8 representa gráficamente un ensayo de fagocitosis ex vivo que ensaya la capacidad de 3D6v2 humanizada, 3D6 quimérica, e IgG humana de mediar la captación de A\beta por células microgliales.

La Figura 9 representa un alineamiento de las secuencias de aminoácidos de VL de 10D5 y VL de 3D6. La negrita indica restos que coinciden exactamente con 10D5.

La Figura 10 representa un alineamiento de las secuencias de aminoácidos de VH de 10D5 y VH de 3D6. La negrita indica restos que coinciden exactamente con 10D5.

Descripción detallada de la invención

La presente invención ofrece nuevos reactivos inmunológicos y procedimientos para prevenir o tratar la enfermedad de Alzheimer u otras enfermedades amiloidogénicas. La invención se basa, al menos en parte, en la caracterización de la inmunoglobulina monoclonal, 3D6, eficaz en la unión de proteína beta amiloide (A\beta) (por ejemplo, la unión de A\beta soluble y/o agregado), la mediación de la fagocitosis (por ejemplo, de A\beta agregado), la reducción de la carga de placas y/o la reducción de la distrofia neurítica (por ejemplo, en un paciente). La invención se basa adicionalmente en la determinación y caracterización estructural de la estructura primaria y secundaria de las cadenas ligera y pesada variables de esta inmunoglobulina y la identificación de restos importantes para la actividad y la inmunogenicidad.

Las inmunoglobulinas, por ejemplo, las inmunoglobulinas terapéuticas de la invención incluyen una cadena ligera variable humanizada y/o pesada variable humanizada que se enumeran en la reivindicación 1. Estas cadenas ligera variable y pesada variable incluyen una región determinante de complementariedad (CDR) de la inmunoglobulina monoclonal (por ejemplo, inmunoglobulina donante) y regiones flanqueantes variables sustancialmente de una inmunoglobulina aceptora humana. La expresión "sustancialmente de una inmunoglobulina aceptora humana" significa que la mayoría o los restos flanqueantes clave son de una secuencia aceptora humana, lo que permite, sin embargo, la sustitución de restos en ciertas posiciones con restos seleccionados para mejorar la actividad de la inmunoglobulina humanizada (por ejemplo, alterar la actividad de modo que imite más estrechamente la actividad de la inmunoglobulina donante) o seleccionados para disminuir la inmunogenicidad de la inmunoglobulina humanizada.

La cadena ligera de inmunoglobulina humanizada incluye las CDR de la región variable de 3D6 (por ejemplo, de la secuencia de la región variable de la cadena ligera de 3D6 expuesta como la SEC ID Nº 2), e incluye una región flanqueante variable de inmunoglobulina aceptora humana, con la condición de que los restos flanqueantes L2, L36 y L46 (convención de numeración de Kabat) estén sustituidos con el resto aminoacídico correspondiente de la secuencia de la región variable de cadena ligera de 3D6 de ratón. La cadena pesada de inmunoglobulina humanizada incluye las CDR de la región variable de 3D6 (por ejemplo, de la secuencia de la región variable de la cadena pesada de 3D6 expuesta como la SEC ID Nº 4), e incluye una región flanqueante variable de inmunoglobulina aceptora humana, con la condición de que los restos flanqueantes H49, H93 y H94 (convención de numeración de Kabat) estén sustituidos con el resto aminoacídico correspondiente de la secuencia de la región variable de la cadena pesada de 3D6 de ratón.

Las regiones flanqueantes de la cadena ligera se seleccionan entre la inmunoglobulina aceptora Kabat ID 019230, Kabat ID 0051331, Kabat ID 005058, Kabat ID 005057, Kabat ID 005059, Kabat ID U21040 y Kabat ID U41645. Las regiones flanqueantes de la cadena pesada se seleccionan entre la inmunoglobulina aceptora Kabat ID 045919, Kabat ID 000459, Kabat ID 000553, Kabat ID 000386 y Kabat ID M23691.

Los restos flanqueantes de cadena pesada raros H74, H77 y H89 se sustituyente con un resto de la línea germinal correspondiente de una secuencia de inmunoglobulina de la línea germinal VH3-23.

La invención ofrece una inmunoglobulina humanizada que incluye una cadena ligera y una cadena pesada, como se ha descrito anteriormente, o un fragmento de unión a antígeno de dicha inmunoglobulina. En una realización ejemplar, la inmunoglobulina humanizada se une (por ejemplo, se une específicamente) al péptido beta amiloide (A\beta) con una afinidad de unión de al menos 10^{7} M^{-1}, 10^{8} M^{-1}, o 10^{9} M^{-1}. En otra realización, la inmunoglobulina o fragmento de unión a antígeno incluye una cadena pesada que tiene isotipo \gamma1. En otra realización, la inmunoglobulina o fragmento de unión a antígeno se une (por ejemplo, se une específicamente) tanto a péptido beta amiloide soluble (A\beta) como a A\beta agregado. En otra realización, la inmunoglobulina o fragmento de unión a antígeno media la fagocitosis (por ejemplo, induce la fagocitosis) de péptido beta amiloide (A\beta). En otra realización más, la inmunoglobulina o fragmento de unión a antígeno cruza la barrera hemato-encefálica en un sujeto. En otra realización más, la inmunoglobulina o fragmento de unión a antígeno reduce tanto la carga de péptido beta amiloide (A\beta) como la distrofia neurítica en un sujeto.

Las inmunoglobulinas descritas en este documento son particularmente adecuadas para su uso en la prevención o tratamiento de enfermedades amiloidogénicas. En una realización, la invención ofrece el uso en la prevención o tratamiento de una enfermedad amiloidogénica (por ejemplo, enfermedad de Alzheimer) administrando al paciente una dosificación eficaz de una inmunoglobulina humanizada como se describe en este documento. En otra realización, la invención ofrece composiciones farmacéuticas que incluyen una inmunoglobulina humanizada como se describe en este documento y un vehículo farmacéutico. También se ofrecen moléculas de ácido nucleico aisladas y vectores para producir las inmunoglobulinas o fragmentos cadenas de inmunoglobulina descritos en este documento.

Antes de describir la invención, puede ser de ayuda para entender la misma, exponer las definiciones de ciertos términos a usar a partir de ahora en este documento.

El término "inmunoglobulina" o "anticuerpo" (usado de forma intercambiable en este documento) se refiere a una proteína de unión a antígeno que tiene una estructura de cuatro cadenas polipeptídicas básica constituida por dos cadenas pesadas y dos ligeras, estando estabilizadas dichas cadenas, por ejemplo, por enlaces disulfuro intercatenarios, que tiene la capacidad de unirse específicamente a antígeno. Tanto las cadenas pesadas como las ligeras se pliegan en dominios. El término "dominio" se refiere a una región globular de un polipéptido de cadena pesada o ligera que comprende bucles peptídicos (por ejemplo, que comprende de 3 a 4 bucles peptídicos) estabilizados, por ejemplo, por láminas \beta plegadas y/o enlaces disulfuro intracatenarios. Los dominios se mencionan adicionalmente en este documento como "constante" o "variable", en base a la ausencia relativa de variación de secuencia dentro de los dominios de diversos miembros de la clase en el caso de un dominio "constante", o la variación significativa dentro de los dominios de diversos miembros de la clase en el caso de un dominio "variable". Los dominios "constantes" en la cadena ligera se mencionan de forma intercambiable como "regiones constantes de cadena ligera", "dominios constantes de cadena ligera", regiones "CL" o dominios "CL"). Los dominios "constantes" en la cadena pesada se mencionan de forma intercambiable como "regiones constantes de cadena pesada", "dominios constantes de cadena pesada", regiones "CH" o dominios "CH"). Los dominios "variables" en la cadena ligera se mencionan de forma intercambiable como "regiones variables de cadena ligera", "dominios variables de cadena ligera", regiones "VL" o dominios "VL"). Los dominios "variables" en la cadena pesada se mencionan de forma intercambiable como "regiones constantes de cadena pesada", "dominios constantes de cadena pesada", regiones "CH" o dominios "CH").

El término "región" se refiere a una parte o porción de una cadena de anticuerpo e incluye dominios constantes o variables como se define en este documento, así como partes o porciones más discretas de dichos dominios. Por ejemplo, los dominios o regiones variables de cadena ligera incluyen "regiones determinantes de complementariedad" o "CDR" intercaladas entre las "regiones flanqueantes" o "FR", como se define en este documento.

Las inmunoglobulinas o anticuerpos pueden existir en forma monomérica o polimérica. El término "fragmento de unión a antígeno" se refiere a un fragmento polipeptídico de una inmunoglobulina o anticuerpo que se une a antígeno o compite con el anticuerpo intacto (es decir, con el anticuerpo intacto del que derivan) por la unión de antígeno (es decir, unión específica). El término "conformación" se refiere a la estructura terciaria de una proteína o polipéptido (por ejemplo, un anticuerpo, cadena de anticuerpo, dominio o región del mismo). Por ejemplo, la expresión "conformación de cadena ligera (o pesada)" se refiere a la estructura terciaria de una región variable de cadena ligera (o pesada), y la expresión "conformación de anticuerpo" o "conformación de fragmento de anticuerpo" se refiere a la estructura terciaria de un anticuerpo o fragmento del mismo.

"Unión específica" de un anticuerpo significa que el anticuerpo muestra afinidad apreciable por el antígeno o un epítope preferido y, preferiblemente, no muestra reactividad cruzada significativa. La unión "apreciable" o preferida incluye la unión con una afinidad de al menos 10^{6}, 10^{7}, 10^{8}, 10^{9} M^{-1}, o 10^{10} M^{-1}. Son más preferidas afinidades mayores de 10^{7} M^{-1}, preferiblemente mayores de 10^{8} M^{-1}. Se pretende que valores intermedios de los expuestos en este documento también estén dentro del alcance de la presente invención y puede indicarse una afinidad de unión preferida como un intervalo de afinidades, por ejemplo, de 10^{6} a 10^{10} M^{-1}, preferiblemente de 10^{7} a 10^{10} M^{-1}, más preferiblemente de 10^{8} a 10^{10} M^{-1}. Un anticuerpo que "no muestra reactividad cruzada significativa" es uno que no se unirá de forma apreciable a una entidad indeseable (por ejemplo, una entidad proteica indeseable). Por ejemplo, un anticuerpo que se une específicamente a A\beta se unirá apreciable a A\beta pero no reaccionará significativamente con proteínas o péptidos no A\beta (por ejemplo, proteínas o péptidos no A\beta incluidos en placas). Un anticuerpo específico por un epítope preferido, por ejemplo, no reaccionará de forma cruzada significativamente con epítopes remotos sobre la misma proteína o péptido. La unión específica puede determinarse de acuerdo con cualquier medio reconocido en la técnica para determinar dicha unión. Preferiblemente, la unión específica se determina de acuerdo con análisis de Scatchard y/o ensayos de unión competitiva.

Los fragmentos de unión se producen por técnicas de ADN recombinante, o por escisión enzimática o química de inmunoglobulinas intactas. Los fragmentos de unión incluyen Fab, Fab', F(ab')_{2}, Fabc, Fv, cadenas sencillas, y anticuerpos de una cadena. Diferente a las inmunoglobulinas o anticuerpos "biespecíficos" o "bifuncionales", se entiende que una inmunoglobulina o anticuerpo tiene que tener sus sitios de unión idénticos. Un anticuerpo "biespecífico" o "bifuncional" es un anticuerpo híbrido artificial que tiene dos pares de cadena pesada/ligera diferentes y dos sitios de unión diferentes. Los anticuerpos biespecíficos pueden producirse por una diversidad de procedimientos que incluyen fusión de hibridomas o unión de fragmentos Fab'. Véase, por ejemplo, Songsivilai & Lachmann, Clin. Exp. Immunol. 79:315-321 (1990); Kostelny y col., J. Immunol. 148, 1547-1553 (1992).

El término "inmunoglobulina humanizada" o "anticuerpo humanizado" se refiere a una inmunoglobulina o anticuerpo que incluye al menos una cadena de inmunoglobulina o anticuerpo humanizada (es decir, al menos una cadena ligera o pesada humanizada). El término "cadena de inmunoglobulina humanizada" o "cadena de anticuerpo humanizada" (es decir, una "cadena ligera de inmunoglobulina humanizada" o "cadena pesada de inmunoglobulina humanizada") se refiere a una cadena de inmunoglobulina o anticuerpo (es decir, una cadena ligera o pesada, respectivamente) que tiene una región variable que incluye una región flanqueante variable sustancialmente de una inmunoglobulina o anticuerpo humano y regiones determinantes de complementariedad (CDR) (por ejemplo, al menos una CDR, preferiblemente dos CDR, más preferiblemente tres CDR) sustancialmente de una inmunoglobulina o anticuerpo no humano, y adicionalmente incluye regiones constantes (por ejemplo, al menos una región constante o parte de la misma, en el caso de una cadena ligera, y preferiblemente tres regiones constantes en el caso de una cadena pesada). El término "región variable humanizada" (por ejemplo, "región variable de cadena ligera humanizada" o "región variable de cadena pesada humanizada") se refiere a una región variable que incluye una región flanqueante variable sustancialmente de una inmunoglobulina o anticuerpo humano y regiones determinantes de complementariedad (CDR) sustancialmente de una inmunoglobulina o anticuerpo humano.

La expresión "sustancialmente de una inmunoglobulina o anticuerpo humano" o "sustancialmente humano" significa que, cuando se alinean con una secuencia de aminoácidos de inmunoglobulina o anticuerpo humano para propósitos de comparación, la región comparte al menos el 80-90%, preferiblemente el 90-95%, más preferiblemente el 95-99% de identidad (es decir, identidad de secuencia local) con la región flanqueante o constante humana, lo que permite, por ejemplo, para sustituciones conservativas, sustituciones de secuencia consenso, sustituciones de la línea germinal, mutaciones de reversión, y similares. La introducción de sustituciones conservativas, sustituciones de secuencia consenso, sustituciones de la línea germinal, mutaciones de reversión, y similares, a menudo se menciona como "optimización" de un anticuerpo o cadena humanizada. La expresión "sustancialmente de una inmunoglobulina o anticuerpo no humano" o "sustancialmente no humano" significa que tiene una secuencia de inmunoglobulina o anticuerpo al menos el 80-95%, preferiblemente el 90-95%, más preferiblemente el 96%, 97%, 98%, o 99% idéntica a la de un organismo no humano, por ejemplo, un mamífero no humano.

Por consiguiente, todas las regiones o restos de una inmunoglobulina o anticuerpo humanizado, o de una cadena de inmunoglobulina o anticuerpo humanizada, excepto posiblemente las CDR, son sustancialmente idénticas a las regiones o restos correspondientes de una o más secuencias de inmunoglobulina humana nativa. El término "región correspondiente" o "resto correspondiente" se refiere a una región o resto en una segunda secuencia de aminoácidos o nucleótidos que ocupa la misma (es decir, equivalente) posición que una región o resto en una primera secuencia de aminoácidos o nucleótidos, cuando la primera o segunda secuencias se alinean de forma óptima para propósitos de comparación.

No se pretende que las expresiones "inmunoglobulina humanizada" o "anticuerpo humanizado" abarquen inmunoglobulinas o anticuerpos quiméricos, como se define infra. Aunque las inmunoglobulinas o anticuerpos humanizados son quiméricos en su construcción (es decir, comprenden regiones de más de una especie de proteína), incluyen características adicionales (es decir, regiones variables que comprenden restos de CDR donantes y restos flanqueantes aceptores) no encontrados en inmunoglobulinas o anticuerpos quiméricos, como se define en este documento.

El término "identidad significativa" significa que dos secuencias polipeptídicas, cuando se alinean de forma óptima, tal como por los programas GAP o BESTFIT usando pesos de hueco por defecto, comparten al menos el 50-60% de identidad de secuencia, preferiblemente el 60-70% de identidad de secuencia, más preferiblemente el 70-80% de identidad de secuencia, más preferiblemente al menos el 80-90% de identidad, incluso más preferiblemente al menos el 90-95% de identidad, e incluso más preferiblemente al menos el 95% de identidad de secuencia o más (por ejemplo, el 99% de identidad de secuencia o más). El término "identidad sustancial" significa que dos secuencias polipeptídicas, cuando se alinean de forma óptima, tal como pos los programas GAP o BESTFIT usando pesos de hueco por defecto, comparten al menos el 80-90% de identidad de secuencia, preferiblemente el 90-95% de identidad de secuencia, y más preferiblemente al menos el 95% de identidad de secuencia o más (por ejemplo, el 99% de identidad de secuencia o más). Para comparación de secuencia, típicamente una secuencia funciona como una secuencia de referencia, con la que se compran las secuencias de ensayo. Cuando se usa un algoritmo de comparación se secuencia, las secuencias de ensayo y de referencia se introducen en un ordenador, se designan coordenadas de subsecuencia, si es necesario, y se designan parámetros del programa de algoritmo de secuencia. El algoritmo de comparación de secuencia después calcula el porcentaje de identidad de secuencia para la(s) secuencia(s) de ensayo relativa a la secuencia de referencia, en base a los parámetros del programa designados. Las expresiones "identidad de secuencia" e "identidad de secuencia" se usan de forma intercambiable en este documento.

La alineación óptima de secuencias para la comparación puede realizarse, por ejemplo, por el algoritmo de homología local de Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981), por el algoritmo de alineación de homología de Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970), por el procedimiento de búsqueda de similitud de Pearson & Lipman, Proc. Nat'l. Acad Sci. USA 85:2444 (1988), por aplicaciones informáticas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA, y TFASTA del Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI), o por inspección visual (véase en líneas generales Ausubel y col., Current Protocols in Molecular Biology). Un ejemplo de algoritmo que es adecuado para determinar el porcentaje de identidad de secuencia y la similitud de secuencia es el algoritmo BLAST, que se describe en Altschul y col., J. Mol. Biol. 215:403 (1990). El software para realizar análisis BLAST está disponible al público a través del National Center for Biotechnology Information (accesible al público a través de del servidor de Internet de National Institutes of Health NCBI). Típicamente, pueden usarse los parámetros del programa por defecto para realizar la comparación de secuencia, aunque también pueden usarse parámetros personalizados. Para secuencias de aminoácidos, el programa BLASTP usa como valores por defecto una longitud de palabra (W) de 3, una expectativa (E) de 10, y la matriz de valores BLOSUM62 (véase Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad Sci. USA 89:10915 (1989)).

Preferiblemente, las posiciones de los restos que no son idénticas difieren en sustituciones de aminoácidos conservativas. Para propósitos de clasificación de sustituciones de aminoácidos como conservativas o no conservativas, los aminoácidos se agrupan del siguiente modo: Grupo I (cadenas laterales hidrófobas): leu, met, ala, val, leu, ile; Grupo II (cadenas laterales hidrófilas neutras): cys, ser, thr; Grupo III (cadenas laterales ácidas): asp, glu; Grupo IV (cadenas laterales básicas): asn, gln, his, lys, arg; Grupo V (restos que incluyen en la orientación de la cadena): gly, pro; y Grupo VI (cadenas laterales aromáticas): trp, tyr, phe. Las sustituciones conservativas implican sustituciones entre aminoácidos de la misma clase. Las sustituciones no conservativas constituyen intercambiar un miembro de una de estas clases por un miembro de otra.

Preferiblemente, las inmunoglobulinas o anticuerpos humanizados se unen al antígeno con una afinidad que está dentro de un factor de tres, cuatro, o cinco del de un anticuerpo no humano correspondiente. Por ejemplo, si el anticuerpo no humano tiene una afinidad de unión de 10^{9} M^{-1}, los anticuerpos humanizados tendrán una afinidad de unión de al menos 3 x 10^{9} M^{-1}, 4 x 10^{9} M^{-1} o 10^{9} M^{-1}. Cuando se describen las propiedades de unión de una inmunoglobulina o cadena de anticuerpo, la cadena puede describirse en base a su capacidad de "dirigir la unión del antígeno (por ejemplo, A\beta)". Se dice que una cadena "dirige la unión del antígeno" cuando confiere sobre una inmunoglobulina o anticuerpo intacto (o fragmento de unión a antígeno del mismo) una propiedad de unión o afinidad de unión específica. Se dice que una mutación (por ejemplo, una mutación de reversión) afecta sustancialmente a la capacidad de una cadena pesada o ligera de dirigir la unión del antígeno si afecta (por ejemplo, disminuye) la afinidad de unión de una inmunoglobulina o anticuerpo intacto (o fragmento de unión a antígeno del mismo) que comprende dicha cadena en al menos un orden de magnitud en comparación con la del anticuerpo (o fragmento de unión a antígeno del mismo) que comprende una cadena equivalente que carece de dicha mutación. Una mutación "no afecta sustancialmente (por ejemplo, disminuye) la capacidad de una cadena de dirigir la unión del antígeno" si afecta (por ejemplo, disminuye) la afinidad de unión de una inmunoglobulina o anticuerpo intacto (o fragmento de unión a antígeno del mismo) que comprende en solamente un factor de dos, tres, o cuatro el del anticuerpo (o fragmento de unión a antígeno del mismo) que comprende una cadena equivalente que carece de dicha mutación.

El término "inmunoglobulina o anticuerpo quimérico" se refiere a una inmunoglobulina o anticuerpo cuyas cadenas ligera y pesada derivan de diferentes especies. Las inmunoglobulinas o anticuerpos quiméricos pueden construirse, por ejemplo por ingeniería genética, a partir de segmentos del gen de inmunoglobulina que pertenecen a diferentes especies.

Un "antígeno" es una entidad (por ejemplo, una entidad proteica o peptídica) a la que se une específicamente un anticuerpo.

El término "epítope" o "determinante antigénico" se refiere a un sitio sobre un antígeno al que se une específicamente una inmunoglobulina o anticuerpo (o fragmento de unión a antígeno del mismo). Los epítopes pueden formarse a partir de aminoácidos contiguos o aminoácidos no contiguos yuxtapuestos por el plegamiento terciario de una proteína. Los epítopes formados a partir de aminoácidos contiguos típicamente se retienen con exposición a disolventes desnaturalizantes mientras que los epítopes formados por el plegamiento terciario típicamente se pierden por el tratamiento con disolventes desnaturalizantes. Un epítope típicamente incluye al menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ó 15 aminoácidos en una conformación espacial única. Los procedimientos para determinar la conformación espacial de epítopes incluyen, por ejemplo, cristalografía de rayos x y resonancia magnética nuclear 2-dimensional. Véase, por ejemplo, Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, G. E. Morris, Ed. (1996).

Los anticuerpos que reconocen el mismo epítope pueden identificarse en un inmunoensayo simple que muestra la capacidad de un anticuerpo de bloquear la unión de otro anticuerpo a un antígeno diana, es decir, un ensayo de unión competitiva. La unión competitiva se determina en un ensayo en que la inmunoglobulina ensayo inhibe la unión específica de un anticuerpo de referencia a un antígeno común, tal como A\beta. Se conocen numerosos tipos de ensayos de unión competitiva, por ejemplo: radioinmunoensayo directo o indirecto en fase sólida (RIA), inmunoensayo directo o indirecto en fase sólida (EIA), ensayo de competición tipo sándwich (véase Stahli y col., Methods in Enzymology 9:242 (1983)); EIA de biotina-avidina directa en fase sólida (véase Kirkland y col., J. Immunol. 137:3614 (1986)); ensayo marcado directo en fase sólida, ensayo tipo sándwich marcado directo en fase sólida (véase Harlow y Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (1988)); RIA de marcaje directo en fase sólida usando marcador I-125 (véase Morel y col., Mol. Immunol. 25(1):7 (1988)); EIA de biotina-avidina directo en fase sólida (Cheung y col., Virology 176:546 (1990)); y RIA marcado directo (Moldenhauer y col., Scand. J. Immunol. 32:77 (1990)). Típicamente, dicho ensayo implica el uso de antígeno purificado unido a una superficie sólida o células que llevan cada uno de estos, una inmunoglobulina de ensayo sin marcar y una inmunoglobulina de referencia marcada. La inhibición competitiva se mide determinando la cantidad de marcador unido a la superficie sólida o las células en presencia de la inmunoglobulina de ensayo. Habitualmente la inmunoglobulina de ensayo está presente en exceso. Habitualmente, cuando está presente un anticuerpo competidor en exceso, inhibirá la unión específica de un anticuerpo de referencia a un antígeno común en al menos el 50-55%, 55-60%, 60-65%, 65-70% 70-75% o más.

Un epítope también se reconoce por células inmunológicas, por ejemplo, células B y/o células T. el reconocimiento celular de un epítope puede determinarse por ensayos in vitro que miden la proliferación dependiente de antígeno, determinada por incorporación de ^{3}H-timidina, por secreción de citoquinas, por secreción de anticuerpos, o por eliminación dependiente de antígeno (ensayo de linfocitos T citotóxicos).

Pueden encontrarse epítopes o determinantes antigénicos ejemplares dentro de la proteína precursora amiloide humana (APP), pero se encuentra preferiblemente dentro del péptido A\beta de APP. Existe múltiples isoformas de APP, por ejemplo APP^{695} APP^{751} y APP^{770}. Los aminoácidos dentro de APP tienen números asignados de acuerdo con la secuencia de la isoforma APP^{770} (véase por ejemplo, GenBank Nº de Acceso P05067, también expuesto como la SEC ID Nº 38). El péptido A\beta (también mencionado en este documento como péptido beta amiloide y A-beta) es un fragmento interno de \sim4-kDa de 39-43 aminoácidos de APP (A\beta39, A\beta40, A\beta41, A\beta42 y A\beta43). A\beta40, por ejemplo, consta de los restos 672-711 de APP y A\beta42 consta de los restos 673-713 de APP. Como resultado del procesamiento proteolítico de APP por diferentes enzimas secretasa in vivo o in situ, A\beta se encuentra tanto en la "forma corta", de 40 aminoácidos de longitud, como en una "forma larga", que varía de 42-43 aminoácidos de longitud. Los epítopes o determinantes antigénicos preferidos, como se describe en este documento, se localizan dentro del extremo N-terminal del péptido A\beta e incluyen restos dentro de los aminoácidos 1-10 de A\beta, preferiblemente de los restos 1-3, 1-4, 1-5, 1-6, 1-7 o 3-7 de A\beta42. Los epítopes o determinantes antigénicos referidos adicionales incluyen los restos 2-4, 5, 6, 7 u 8 de A\beta, los restos 3-5, 6, 7, 8 ó 9 de A\beta, o los restos 4-7, 8, 9 ó 10 de A\beta42.

El término "enfermedad amiloidogénica" incluye cualquier enfermedad asociada con (o causada por) la formación o deposición de fibrillas amiloides insolubles. Las enfermedades amiloidogénicas ejemplares incluyen, aunque sin limitación amiloidosis sistémica, enfermedad de Alzheimer, diabetes de aparición en la madurez, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Huntington, demencia fronto-temporal, y las encefalopatías espongiformes transmisibles relacionadas con priones (kuru y enfermedad de Creutzfeldt-Jacob en seres humanos y scrapie y BSE en ovejas y vacas, respectivamente). Las diferentes enfermedades amiloidogénicas se definen o caracterizan por la naturaleza del componente polipeptídico de las fibrillas depositadas. Por ejemplo, en sujetos o pacientes que tienen enfermedad de Alzheimer, la proteína \beta-amiloide (por ejemplo, proteína \beta-amiloide de tipo silvestre, variante, o truncada) es el componente polipeptídico característico del depósito amiloide. Por consiguiente, la enfermedad de Alzheimer es un ejemplo de una "enfermedad caracterizada por depósitos de A\beta" o una "enfermedad asociadas con depósitos de A\beta", por ejemplo, en el cerebro de un sujeto o paciente. Las expresiones "proteína \beta-amiloide", "péptido \beta-amiloide", "\beta-amiloide", "A\beta" y "péptido A\beta" se usan de forma intercambiable en este documento.

El término "dosis eficaz" o "dosificación eficaz" se define como una cantidad suficiente para conseguir o al menos conseguir parcialmente el efecto deseado. El término "dosis terapéuticamente eficaz" se define como una cantidad suficiente para curar o al menos detener parcialmente la enfermedad y sus complicaciones en un paciente que ya padece la enfermedad. Las cantidades eficaces para este uso dependerán de la gravedad de la infección y el estado general del propio sistema inmune del paciente.

El término "paciente" incluye sujetos humanos y otros mamíferos que reciben tratamiento profiláctico o terapéutico.

A\beta "soluble" o "disociado" se refiere a polipéptido A\beta no agregante o disgregado. A\beta "insoluble" se refiere a polipéptido A\beta agregante, por ejemplo, A\beta mantenido junto por enlaces no covalentes. Se cree que el A\beta (por ejemplo, A\beta42) se agrega, al menos en parte, debido a la presencia de restos hidrófobos en el extremo C-terminal del péptido (parte de los dominios transmembrana de APP). Un procedimiento para preparar A\beta soluble es disolver péptido liofilizado en DMSO solo con sonicación. La solución resultante se centrifuga para retirar cualquier particulado insoluble.

I. Reactivos Inmunológicos y Terapéuticos

Los reactivos inmunológicos y terapéuticos de la invención comprenden o constan de anticuerpos humanizados, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, como se define en este documento. Se sabe que la unidad estructural del anticuerpo básica comprende un tetrámero de subunidades. Cada tetrámero está compuesto de dos pares idénticos de cadenas polipeptídicas, teniendo cada par una cadena "ligera" (aproximadamente 25 kDa) y una "pesada" (aproximadamente 50-70 kDa). La parte amino-terminal de cada cadena incluye una región variable de aproximadamente 100 a 110 o más aminoácidos principalmente responsable del reconocimiento de antígeno. La parte carboxi-terminal de cada cadena define una región constante principalmente responsable de la función efectora.

Las cadenas ligeras se clasifican como kappa o lambda y son de aproximadamente 230 restos de longitud. Las cadenas pesadas se clasifican como gamma (\gamma), mu (\mu), alfa (\alpha), delta (\delta), o épsilon (\varepsilon), son de aproximadamente 450-600 restos de longitud, y definen el isotipo del anticuerpo como IgG, IgM, IgA, IgD y IgE, respectivamente. Tanto la cadena pesada como la ligera se pliegan en dominios. El término "dominio" se refiere a una región globular de una proteína, por ejemplo, una inmunoglobulina o anticuerpo. Los dominios de inmunoglobulina o anticuerpo incluyen, por ejemplo, 3 o cuatro bucles peptídicos estabilizados por una lámina \beta plegada y un enlace disulfuro intercatenario. Las cadenas ligeras intactas tienen, por ejemplo, dos dominios (V_{L} y C_{L}) y las cadenas pesadas intactas tienen, por ejemplo, cuatro o cinco dominios (V_{H}, C_{H}1, C_{H}2, y C_{H}3).

Dentro de las cadenas ligera y pesada, las regiones variable y constante están unidas por una región "J" de aproximadamente 12 o más aminoácidos, incluyendo también la cadena pesada una región "D" de aproximadamente 10 o más aminoácidos. (Véase en líneas generales, Fundamental Immunology (Paul, W., ed., 2a ed. Raven Press, N.Y. (1989), Cap. 7), incorporado por referencia en su totalizada para todos los propósitos).

Las regiones variables de cada par de cadena ligera/pesada forman el sitio de unión del anticuerpo. Por tanto, un anticuerpo intacto tiene dos sitios de unión. Excepto en anticuerpos bifuncionales o biespecíficos, los dos sitios de unión son iguales. Las cadenas todas muestran la misma estructura general de regiones flanqueantes (FR) relativamente conservadas unidas por tres regiones hipervariables, también llamadas regiones determinantes de complementariedad o CDR. Las cadenas de origen natural o las cadenas producidas de forma recombinante pueden expresarse con una secuencia líder que se retira durante el procesamiento celular para producir una cadena madura. Las cadenas maduras también pueden producirse de forma recombinante teniendo una secuencia líder de origen no natural, por ejemplo, para potenciar la secreción o alterar el procesamiento de una cadena particular de
interés.

Las CDR de las dos cadenas maduras de cada par se alinean por las regiones flanqueantes, posibilitando la unión a un epítope específico. Desde el extremo N-terminal al extremo C-terminal, tanto la cadena ligera como la pesada comprenden los dominio FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 y FR4, "FR4" también se menciona en la técnica como la región D/J de la cadena pesada variable y la región J de la cadena ligera variable. La asignación de aminoácidos a cada dominio es de acuerdo con las definiciones de Kabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1987 y 1991). Se ha propuesto una definición estructural alternativa por Chotia y col., J. Mol. Biol. 196:901 (1987); Nature 342: 878 (1989); y J. Mol. Biol. 186:651 (1989) (a partir de ahora mencionado colectivamente como "Chotia y col." e incorporado por referencia en su totalidad para todos los propósitos).

2. Anticuerpos Humanizados

La presente invención se refiere a anticuerpos humanizados (inmunoglobulinas humanizadas) específicos para el péptido beta amiloide. Los anticuerpos humanizados tienen la misma o similar especificidad y afinidad de unión que un anticuerpo de ratón u otro no humano que proporciona el material de partida para la construcción de un anticuerpo humanizado.

A. Producción de Anticuerpos Humanizados

El término "anticuerpo humanizado" se refiere a un anticuerpo que comprende al menos una cadena que comprende restos flanqueantes de la región variable sustancialmente de una cadena de anticuerpo humano (mencionado como la inmunoglobulina o anticuerpo aceptor) y al menos una región determinante de complementariedad sustancialmente de un anticuerpo de ratón (mencionado como la inmunoglobulina o anticuerpo donante). Véase, Queen y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:10029-10033 (1989), documentos US 5.530.101, US 5.585.089, US 5.693.761, US 5.693.762, Selick y col., documento WO 90/07861, y Winter, documento US 5.225.539 (incorporados por referencia en su totalidad para todos los propósitos). Las(s) región(es) constante(s), si están presentes, también son sustancial o completamente de una inmunoglobulina humana.

La sustitución de CDR de ratón en una región flanqueante variable humana muy probablemente provoca la retención de su orientación espacial correcta si la región flanqueante del dominio variable humano adopta la misma o similar conformación que la región flanqueante variable de ratón de la de las CDR originadas. Esto se consigue obteniendo los dominios variables humanos de anticuerpos humanos cuyas secuencias flanqueantes muestran un elevado grado de identidad de secuencia con los dominios flanqueantes variables murinos de los que derivan las CDR. Las regiones flanqueantes variables de cadena pesada y ligera pueden obtenerse de las mismas o diferentes secuencias de anticuerpo humano. Las secuencias de anticuerpo humano pueden ser las secuencias de anticuerpos humanos de origen natural o pueden ser secuencias consenso de varios anticuerpos humanos. Véase Kettleborough y col., Protein Engineering 4:773 (1991); Kolbinger y col., Protein Engineering 6:971 (1993) y Carter y col., documento WO 92/22653.

Habiendo identificado las regiones determinantes de complementariedad de la inmunoglobulina donante murina y las inmunoglobulinas aceptoras humanas apropiadas, la siguiente etapa es determinar cuales, si los hay, de los restos de estos componentes deben sustituirse para optimizar las propiedades del anticuerpo humanizado resultante. En general, la sustitución de restos aminoacídicos humanos con murinos debe minimizarse, porque la introducción de restos murinos aumenta el riesgo de que el anticuerpo provoque una respuesta humana anti-anticuerpo de ratón (HAMA) en seres humanos. Los procedimientos reconocidos en la técnica para determinar la respuesta inmune pueden realizarse para controlar una respuesta HAMA en un paciente particular o durante ensayos clínicos. A los pacientes a los que se ha administrado anticuerpos humanizados puede hacérseles una evaluación de inmunogenicidad al inicio y durante toda la administración de dicha terapia. La respuesta HAMA se mide, por ejemplo, detectando anticuerpos contra el reactivo terapéutico humanizado, en muestras séricas del paciente usando un procedimiento conocido para los especialistas en la técnica, incluyendo tecnología de resonancia de plasmón superficial (BIACORE) y/o análisis ELISA en fase sólida.

Ciertos aminoácidos de los restos flanqueantes de la región variable humana se seleccionan para la sustitución en base a su posible influencia sobre la conformación de la CDR y/o la unión al antígeno. La yuxtaposición no natural de las regiones CDR murinas con una región flanqueante variable humana puede provocar restricciones conformaciones no naturales que, salvo que se corrijan por sustitución de ciertos restos aminoacídicos, conducen a la pérdida de afinidad de unión.

La selección de restos aminoacídicos para la sustitución se determina, en parte, por modelado informático. En este documento se describen hardware y software informáticos para producir imágenes tridimensionales de moléculas de inmunoglobulina. En general, los modelos moleculares se producen partiendo de estructuras resueltas para cadenas de inmunoglobulina o dominios de las mismas. Las cadenas a modelar se comparan para la similitud de secuencia de aminoácidos con cadenas o dominios de estructuras tridimensionales resueltas, y las cadenas o dominios que muestran la mayor similitud de secuencia se selecciona(n) como puntos de partida para la construcción del modelo molecular. Las cadenas o dominios que comparte al menos un 50% de identidad de secuencia se seleccionan para el modelado, y preferiblemente aquellos que comparten al menos el 60%, 70%, 80%, 90% de identidad de secuencia o más se seleccionan para el modelado. Las estructuras de partida resueltas se modifican para permitir las diferencias entre los aminoácidos reales en las cadenas o dominios de inmunoglobulina que se están modelando, y los de la estructura de partida. Las estructuras modificadas después se ensamblan en una inmunoglobulina compuesta. Finalmente, el modelo se refina por minimización de energía y verificando que todos los átomos están dentro de las distancias apropiadas entre ellos y que las longitudes de enlace y ángulos están dentro de los límites químicamente aceptables.

La selección de restos aminoacídicos para sustitución también puede determinarse, en parte, por el examen de las características de los aminoácidos en localizaciones particulares, o la observación empírica de los efectos de la sustitución o mutagénesis de aminoácidos particulares. Por ejemplo, cuando un aminoácido difiere entre un resto flanqueante de la región variable murina y un resto flanqueante de la región variable humana, el aminoácido flanqueante humano habitualmente debe sustituirse por el aminoácido flanqueante equivalente del anticuerpo de ratón cuando se espera razonablemente que el aminoácido:

(1) se una no covalentemente al antígeno directamente,

(2) esté adyacente a una región CDR,

(3) interaccione de otro modo con una región CDR (por ejemplo, esté dentro de aproximadamente 3-6 \ring{A} de una región CDR determinado por modelado informático), o

(4) participe en la superficie de contacto VL-VH.

Los restos que "se unen no covalentemente al antígeno directamente" incluyen aminoácidos en posiciones en regiones flanqueantes que tienen una buena probabilidad de interaccionar directamente con aminoácidos en el antígeno de acuerdo con las fuerzas químicas establecidas, por ejemplo, por enlaces de hidrógeno, fuerzas de Van der Waals, interacciones hidrófobas, y similares.

Las CDR y regiones flanqueantes son como se define por Kabat y col. o Chotia y col., supra. Cuando los restos flanqueantes, como se define por Kabat y col., supra, constituyen restos de bucle estructural como se define por Chotia y col., supra, los aminoácidos presentes en el anticuerpo de ratón pueden seleccionarse para sustitución en el anticuerpo humanizado. Los restos que están "adyacentes a una región CDR" incluyen restos aminoacídicos en posiciones inmediatamente adyacentes a una o más de las CDR en la secuencia primaria de la cadena de inmunoglobulina humanizada, por ejemplo, en posiciones inmediatamente adyacentes a una CDR como se define por Kabat, o una CDR como se define por Chotia (Véase, por ejemplo, Chotia y Lesk JMB 196:901 (1987)). Estos aminoácidos son particularmente propensos a interaccionar con los aminoácidos en las CDR y, si se eligen del aceptor, a distorsionar las CDR donantes y reducir la afinidad. Además, los aminoácidos adyacentes pueden interaccionar directamente con el antígeno (Amit y col., Science, 233:747 (1986), que se incorpora en este documento por referencia) y seleccionar estos aminoácidos del donante puede ser deseable para mantener todos los contactos del antígeno que proporcionan afinidad en el anticuerpo original.

Los restos que "interaccionan de otro modo con una región CDR" incluyen aquellos que se determina por análisis estructural secundario que están en una orientación espacial suficiente para lograr una región CDR. En una realización, los restos que "interaccionan de otro modo con una región CDR" se identifican analizando un modelo tridimensional de la inmunoglobulina donante (por ejemplo, un modelo generado por ordenador). Un modelo tridimensional, típicamente del anticuerpo donante original, muestra que ciertos aminoácidos fuera de las CDR están cerca de las CDR y tienen buena probabilidad de interaccionar con aminoácidos en las CDR por enlaces de hidrógeno, fuerzas de Van der Waals, interacciones hidrófobas, etc. En esas posiciones de aminoácidos, puede seleccionarse el aminoácido de la inmunoglobulina donante en lugar del aminoácido de la inmunoglobulina aceptora. Los aminoácidos de acuerdo con este criterio generalmente tendrán un átomo de la cadena lateral dentro de aproximadamente 3 unidades angstrom (A) de algún átomo en las CDR y deben contener un átomo que podría interaccionar con los átomos de la CDR de acuerdo con fuerzas químicas establecidas, tales como las enumeradas anteriormente.

En el caso de átomos que pueden formar un enlace de hidrógeno, los 3 \ring{A} se miden entre sus núcleos, pero para átomos que no forman un enlace, los 3 \ring{A} se miden entre sus superficies de Van der Waals. Por tanto, en el último caso, los núcleos deben estar dentro de aproximadamente 6 \ring{A} (3 \ring{A} más la suma de los radios de Van) para los átomos considerados capaces de interaccionar. En muchos casos los núcleos estarán 4 ó 5 a 6 \ring{A} separados. Para determinar si un aminoácido puede interaccionar con las CDR, se prefiere no considerar los últimos 8 aminoácidos de la CDR 2 de cadena pesada como parte de las CDR, porque desde el punto de vista estructural, estos 8 aminoácidos se comportan más como parte de la región flanqueante.

Los aminoácidos que son capaces de interaccionar con aminoácidos en las CDR, pueden identificarse de otro modo más. El área superficial accesible al disolvente de cada aminoácido flanqueante se calcula de dos modos: (1) en el anticuerpo intacto, y (2) en una molécula hipotética constituida por el anticuerpo con sus CDR retiradas. Una diferencia significativa entre estas cifras de aproximadamente 10 angstrom cuadrados o más muestra que el acceso del aminoácido flanqueante al disolvente está al menos parcialmente bloqueado por las CDR, y por lo tanto que el aminoácido está haciendo contacto con las CDR. El área superficial accesible al disolvente de un aminoácido puede calcularse en base a un modelo tridimensional de un anticuerpo, usando algoritmos conocidos en la técnica (por ejemplo, Connolly, J. Appl. Cryst. 16:548 (1983) y Lee y Richards, J. Mol. Biol. 55:379 (1971), que se incorporan ambos en este documento por referencia). Los aminoácidos flanqueantes también pueden interaccionar ocasionalmente con las CDR indirectamente, afectando a la conformación de otro aminoácido flanqueante que a su vez contacta con las CDR.

Se sabe que los aminoácidos en varias posiciones en la región flanqueante son capaces de interaccionar con las CDR en muchos anticuerpos (Chotia y Lesk, supra, Chotia y col., supra y Tramontano y col., J. Mol. Biol. 215:175 (1990), todos los cuales se incorporan en este documento por referencia). Notablemente, se sabe que los aminoácidos en las posiciones 2, 48, 64 y 71 de la cadena ligera y 26-30, 71 y 94 de la cadena pesada (numeración acuerdo con Kabat) son capaces de interaccionar con las CDR en muchos anticuerpos. Los aminoácidos en las posiciones 35 en la cadena ligera y 93 y 103 en la cadena pesada también son propensos a interaccionar con las CDR. En todas estas posiciones numeradas, se prefiere la elección del aminoácido donante en lugar del aminoácido aceptor (cuando diferente) a estar en la inmunoglobulina humanizada. Por otro lado, a veces pueden elegirse ciertos restos capaces de interaccionar con la región CDR, tales como los primeros 5 aminoácidos de la cadena ligera, entre la inmunoglobulina aceptora sin pérdida de afinidad en la inmunoglobulina humanizada.

Los restos que "participan en la superficie de contacto VL-VH" o "restos de empaquetado" incluyen aquellos restos en la superficie de contacto entre VL y VH como se define, por ejemplo, por Novotny y Haber, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:4592-66 (1985) o Chotia y col., supra. Generalmente, deben retenerse los restos de empaquetado inusuales en el anticuerpo humanizado si difieren de los de las regiones flanqueantes humanas.

En general, se sustituye uno o más de los aminoácidos que cumplen los criterios anteriores. En algunas realizaciones, se sustituyen todos o la mayoría de los aminoácidos que cumplen los criterios anteriores. Ocasionalmente, hay alguna ambigüedad acerca de su un aminoácido particular cumple los criterios anteriores, y se producen inmunoglobulinas variantes alternativas, una de las cuales tiene esa sustitución particular, la otra no. Las inmunoglobulinas variantes alternativas producidas de este modo pueden ensayarse en cualquiera de los ensayos descritos en este documento para la actividad deseada, y la inmunoglobulina preferida seleccionada.

Habitualmente las regiones CDR en anticuerpos humanizados son sustancialmente idénticas, y más habitualmente, idénticas a las regiones CDR correspondientes del anticuerpo donante. Aunque no es habitualmente deseable, a veces es posible hacer una o más sustituciones de aminoácidos conservativas de restos de CDR sin afectar de forma apreciable a la afinidad de unión de la inmunoglobulina humanizada resultante. Por sustituciones conservativas se entiende combinaciones tales como gly, ala; val, ile, leu; asp, glu; asn, gln; ser, thr; lys, arg; y phe, tyr.

Son candidatos adicionales para sustitución aminoácidos flanqueantes humanos aceptores que son inusuales o "raros" para una inmunoglobulina humana en esa posición. Estos aminoácidos pueden sustituirse con aminoácidos de la posición equivalente del anticuerpo donante de ratón o de las posiciones equivalentes de inmunoglobulinas humanas más típicas. Por ejemplo, la sustitución puede se deseable cuando el aminoácido en una región flanqueante humana de la inmunoglobulina aceptora es raro para esa posición y el aminoácido correspondiente en la inmunoglobulina donante es común para esa posición en secuencias de inmunoglobulina humana; o cuando el aminoácido en la inmunoglobulina aceptora es raro para esa posición y el aminoácido correspondiente en la inmunoglobulina donante también es raro, relativo a otras secuencias humanas. Este criterio ayuda a asegurar que un aminoácido atípico en la región flanqueante humana no altera la estructura del anticuerpo. Además, remplazando un aminoácido aceptor humano inusual con un aminoácido del anticuerpo donante que resulta ser típico para anticuerpos humanos, el anticuerpo humanizado puede hacerse menor inmunogénico.

El término "raro", como se usa en este documento, indica un aminoácido que existe en esa posición en menos de aproximadamente el 20% pero habitualmente menos de aproximadamente el 10% de las secuencias en una muestra representativa de secuencias, y el término "común", como se usa en este documento, indica un aminoácido que existe en más de aproximadamente el 25% pero habitualmente más de aproximadamente el 50% de las secuencias en una muestra representativa. Por ejemplo, todas las secuencias de la región variable de cadena ligera y pesada humana están respectivamente agrupadas en "subgrupos" de secuencias que son especialmente homólogas entre sí y tienen los mismos aminoácidos en ciertas posiciones críticas (Kabat y col., supra). Cuando se decide si un aminoácido en una secuencia aceptora humana es "raro" o "común" entre secuencias humanas, a menudo será preferible considerar solamente aquellas secuencias humanas en el mismo subgrupo que la secuencia aceptora.

Son candidatos adicionales para sustitución aminoácidos flanqueantes humanos aceptores que se identificarían como parte de una región CDR según la definición alternativa propuesta por Chotia y col., supra. Son candidatos adicionales para sustitución aminoácidos flanqueantes humanos aceptores que se identificarían como parte de una región CDR según las definiciones del AbM y/o de contacto. Notablemente, la CDR1 en la cadena pesada variable se define incluyendo los restos 26-32.

Son candidatos adicionales para sustitución restos flanqueantes aceptores que corresponden a un resto flanqueante donante raro o inusual. Los restos flanqueantes donantes raros o inusuales son aquellos que son raros o inusuales (como se define en este documento) para anticuerpos murinos en esa posición. Para anticuerpos murinos, el subgrupo puede determinarse de acuerdo con Kabat y las posiciones de los restos identificadas que difieren de los consenso. Estas diferencias específicas del donante pueden apuntar a mutaciones somáticas en la secuencia murina que potencian la actividad. Los restos inusuales que se predice que afectan a la unión se retienen, mientras que los restos que se predice que son no importantes para la unión pueden sustituirse.

Son candidatos adicionales para sustitución restos no de la línea germinal que existen en una región flanqueante aceptora. Por ejemplo, cuando una cadena de anticuerpo aceptora (es decir, una cadena de anticuerpo humana que comparte identidad de secuencia significativa con la cadena de anticuerpo donante) se alinea con una cadena de anticuerpo de la línea germinal (que comparte asimismo identidad de secuencia significativa con la cadena donante), pueden sustituirse los restos que no coinciden entre la región flanqueante de la cadena aceptora y la región flanqueante de la cadena la línea germinal con restos correspondientes de la secuencia de la línea germinal.

Diferente a las sustituciones de aminoácidos específicas analizadas anteriormente, las regiones flanqueantes de inmunoglobulinas humanizadas habitualmente son sustancialmente idénticas, y más habitualmente, idénticas a las regiones flanqueantes de los anticuerpos humanos de los que derivan. Por supuesto, muchos de los aminoácidos en la región flanqueante hacen poca o ninguna contribución directa a la especificidad o afinidad de un anticuerpo. Por tanto, muchas sustituciones conservativas individuales de restos flanqueantes pueden tolerarse sin cambio apreciable de la especificidad o afinidad de la inmunoglobulina humanizada resultante. Por tanto, en una realización la región flanqueante variable de la inmunoglobulina humanizada comparte al menos el 85% de identidad de secuencia con una secuencia de la región flanqueante variable humana o consenso de dichas secuencias. En otra realización, la región flanqueante variable de la inmunoglobulina humanizada comparte al menos el 90%, preferiblemente el 95%, más preferiblemente el 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia con una secuencia de la región flanqueante variable humana o consenso de dichas secuencias. En general, sin embargo, dichas sustituciones son indeseables.

Los anticuerpos humanizados preferiblemente muestran una afinidad de unión específica por el antígeno de al menos 10^{7}, 10^{8}, 10^{9} o 10^{10} M^{-1}. Habitualmente el límite superior de afinidad de unión de los anticuerpos humanizados por el antígeno está dentro de un factor de tres, cuatro o cinco el de la inmunoglobulina donante. A menudo el límite inferior de afinidad de unión también está dentro de un factor de tres, cuatro o cinco el de la inmunoglobulina donante. Como alternativa, la afinidad de unión puede compararse con la de un anticuerpo humanizado que no tiene sustituciones (por ejemplo, un anticuerpo que tiene CDR donantes y FR aceptoras, pero no sustituciones de FR). En dichos casos, la unión del anticuerpo optimizado (con sustituciones) es preferiblemente al menos dos a tres veces mayor, o tres a cuatro veces mayor, que la del anticuerpo sin sustituir. Para hacer comparaciones, puede determinarse la actividad de los diversos anticuerpos, por ejemplo, por BIACORE (es decir, resonancia de plasmón superficial usando reactivos no marcados) o ensayos de unión competitiva.

B. Producción de Anticuerpos 3D6 Humanizados

La presente invención ofrece un anticuerpo humanizado contra el extremo N-terminal de A\beta para su uso en las metodologías terapéuticas y/o de diagnóstico descritas en este documento. El material de partida para la producción de anticuerpos humanizados es 3D6. 3D6 es específico para el extremo N-terminal de A\beta y ha demostrado mediar la fagocitosis (por ejemplo, induce la fagocitosis) de placas amiloides (véanse los Ejemplos I-V). La clonación y secuenciación del ADNc que codicia las regiones variables de cadena pesada y ligera del anticuerpo 3D6 se describe en el Ejemplo VI.

Las secuencias de anticuerpo aceptoras humanas adecuadas se identifican por comparaciones informáticas de las secuencias de aminoácidos de las regiones variables de ratón con las secuencias de anticuerpos humanos conocidos. La comparación se realiza por separado para las cadenas pesada y ligera pero los principios son similares para cada una. En particular, se identificaron dominios variables de anticuerpos humanos cuyas secuencias flanqueantes muestran un elevado grado de identidad de secuencia con las regiones flanqueantes VL y VH murinas por consulta de la Base de Datos Kabat usando NCBI BLAST (accesible al público a través del servido de Internet de National Institutes of Health NCBI) con las secuencias flanqueantes murinas respectivas. En una realización, se seleccionan las secuencias aceptoras que comparten más del 50% de identidad de secuencia con secuencias donantes murinas. Preferiblemente, se seleccionan las secuencias de anticuerpo aceptoras que comparten el 60%, 70%, 80%, 90% o más.

Una comparación informática de 3D6 reveló que la cadena ligera de 3D6 muestra la mayor identidad de secuencia con cadenas ligeras humanas del subtipo kappa II, y que la cadena pesada de 3D6 muestra la mayor identidad de secuencia con cadenas pesadas humanas del subtipo III, como se define por Kabat y col., supra. Por tanto, las regiones flanqueantes humanas ligera y pesada se obtienen de anticuerpos humanos de estos subtipos, o de secuencias consenso de dichos subtipos. Las regiones variables humanas de cadena ligera que muestran la mayor identidad de secuencia con la región correspondiente de 3D6 son de anticuerpos que tienen los Números de ID de Kabat 019230, 005131, 005058, 005057, 005059, U21040 y U41645, siendo 019230 más preferida. Las regiones variables humanas de cadena pesada preferidas que muestran la mayor identidad de secuencia con la región correspondiente de 3D6 son de anticuerpos que tienen los Números de ID de Kabat 045919, 000459, 000553, 000386 y M23691, siendo 045919 más preferida.

A continuación se seleccionan los restos para sustitución, del siguiente modo. Cuando un aminoácido difiere entre una región flanqueante variable de 3D6 y una región flanqueante variable humana equivalente, el aminoácido flanqueante humano debe habitualmente sustituirse por el aminoácido de ratón equivalente si se espera razonablemente que el aminoácido:

(1) se una no covalentemente al antígeno directamente,

(2) esté adyacente a una región CDR, se parte de una región CDR según la definición alternativa propuesta por Chotia y col., supra, o interaccione de otro modo con una región CDR (por ejemplo, esté dentro de aproximadamente 3A de una región CDR) (por ejemplo, los aminoácidos en las posiciones L2, H49 y H94 de 3D6), o

(3) participe en la superficie de contacto VL-VH (por ejemplo, los aminoácidos en las posiciones L36, L46 y H93 de 3D6).

El modelado informático de las regiones variables de cadena pesada y ligera del anticuerpo 3D6, y la humanización del anticuerpo 3D6 se describe en el Ejemplo VII. En resumen, se generó un modelo tridimensional en base a las estructuras de anticuerpo murino resueltas más cercanas para las cadenas pesada y ligera. Para este propósito, se eligió un anticuerpo denominado 1CR9 (Banco de Datos de Proteínas (PDH) ID: 1CR9, Kanyo y col., J Mol. Biol. 293; 855 (1999)) como molde para modelar la cadena ligera de 3D6, y se eligió un anticuerpo denominado 1OPG (PDB ID: 1OPG, Kodandapani y col., J. Biol. Chem. 270:2268 (1995)) como molde para modelar la cadena pesada. El modelo se refinó adicionalmente por una serie de etapas de minimización de energía para aliviar los contactos atómicos desfavorables y optimizar las interacciones electrostáticas y de van der Waals. Se eligió la estructura resuelta de Iqkz (PDB ID: 1QKZ, Derrick y col., J. Mol. Biol. 293:81 (1999)) como molde para modelar la CDR3 de la cadena pesada como 3D6 y 1OPG no mostró homología de secuencia significativa en esta región cuando se alineaba para propósitos de comparación.

La información estructural tridimensional para los anticuerpos descritos en este documento están disponibles al público, por ejemplo, del Banco de Datos de Proteínas de Research Collaboratory for Structural Bioinformatics (PDB). El PDB es de acceso libre mediante la Red Mundial Internet y se describe por Berman y col. (2000) Nucleic Acids Research, 28:235. El modelado informático permite la identificación de restos de interacción en CDR. El modelo informático de la estructura de 3D6 puede a su vez servir como punto de partida para predecir la estructura tridimensional de un anticuerpo que contiene las regiones determinantes de complementariedad de 3D6 sustituidas en estructuras flanqueantes humanas. Pueden construirse modelos adicionales que representan la estructura según se introducen sustituciones de aminoácidos adicionales.

En general, es deseable la sustitución de uno, la mayoría o todos los aminoácidos que cumplen los criterios anteriores. Por consiguiente, los anticuerpos humanizados de la presente invención contienen una sustitución de un resto flanqueante de cadena ligera humana con un resto de 3D6 correspondiente en las posiciones: L2, L36 y L46. Los anticuerpos humanizados también contienen una sustitución de un resto flanqueante de cadena pesada humana con un resto de 3D6 correspondiente en las siguientes posiciones: H49, H93 y H94. Los anticuerpos humanizados también contienen una sustitución de un resto flanqueante de cadena pesada con un resto de la línea germinal correspondiente en las siguiente posiciones: H74, H77 y H89.

Ocasionalmente, sin embargo, existe alguna ambigüedad acerca de si un aminoácido particular cumple los criterios anteriores, y se producen inmunoglobulinas variantes alternativas, una de las cuales tiene esa sustitución particular, la otra no. En casos en los que la sustitución con un resto murino introduciría un resto que es raro en las inmunoglobulinas humanas en una posición particular, puede ser deseable ensayar el anticuerpo para la actividad con o sin la sustitución particular. Si la actividad (por ejemplo, la afinidad de unión y/o especificidad de unión) es aproximadamente igual con o sin la sustitución, el anticuerpo sin sustitución puede preferirse, ya que se esperaría que provocara una respuesta HAHA, como se describe en este documento.

Son otros candidatos para sustitución aminoácidos flanqueantes humanos aceptores que son inusuales para una inmunoglobulina humana en esa posición. Estos aminoácidos pueden sustituirse con aminoácidos de la posición equivalente de inmunoglobulinas humanas más típicas. Como alternativa, pueden introducirse aminoácidos de posiciones equivalentes en la 3D6 de ratón en las regiones flanqueantes humanas cuando dichos aminoácidos son típicos de inmunoglobulina humana en las posiciones equivalentes. Se muestran ejemplos de aminoácidos apropiados para sustituir en las Figuras 1 y 2.

Son otros candidatos para sustitución restos no de la línea germinal que existen en una región flanqueante. Una comparación informática de 3D6 con secuencias de la línea germinal conocidas reveló que las cadenas pesadas que muestran el mayor grado de identidad de secuencia incluyen secuencias de la región variable de la línea germinal VH3-48, VH3-23, VH3-7, VH3-21 y VH3-11, siendo VH3-23 más preferida. La alineación de Kabat ID 045919 con VH3-23 revela que los restos H74, H77 y/o H89 pueden seleccionarse para sustitución con restos de la línea germinal correspondiente (por ejemplo, los restos H74, H77 y/o H89 cuando se comparan Kabat ID 045919 y VH3-23). Asimismo, las secuencias de la línea germinal que tienen el mayor grado de identidad con la cadena ligera de 3D6 incluyen A1, A17, A18, A2 y A19, siendo A19 la más preferida. Los restos que no coinciden entre una región flanqueante de cadena aceptora ligera seleccionada y una de estas secuencias de la línea germinal podrían seleccionarse para sustitución con el resto de la línea germinal correspondiente.

La Tabla 1 resume el análisis de secuencia de las regiones VH y VL de 3D6. Se exponen estructuras de ratón y humanas adicionales que pueden usarse para modelado informático del anticuerpo 3D6 y anticuerpos humanos adicionales así como secuencias de la línea germinal que pueden usarse para seleccionar sustituciones de aminoácidos. También se exponen restos de ratón raros en la Tabla 1. Los restos de ratón raros se identifican comparando las secuencias VL y/o VH donantes con las secuencias de otros miembros del subgrupo al que pertenecen las secuencias VL y/o VH donantes (de acuerdo con Kabat) e identificando las posiciones de los restos que difieren de las consenso. Estas diferencias específicas del donante pueden apuntar a mutaciones somáticas que potencian la actividad. Los restos inusuales o raros cercanos al sitio de unión posiblemente pueden contactar con el antígeno, haciendo deseable retener el resto de ratón. Sin embargo, si el resto de ratón inusual no es importante para la unión, se prefiere el uso del resto aceptor correspondiente ya que el resto de ratón puede crear neoepítopes inmunogénicos en el anticuerpo humanizado. En la situación en la que un resto inusual en la secuencia donante es realmente un resto común en la secuencia aceptora correspondiente, el resto preferido es claramente el resto aceptor.

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TABLA 1 Resumen de la secuencia de la región V de 3D6

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Las ID de secuencias Kabat mencionadas en este documento están disponibles al público, por ejemplo, de la Base de Datos Kabat de Secuencias de Proteínas de Interés Inmunológico de Northwestern University Biomedical Engineering Department. La información estructural tridimensional para anticuerpos descritos en este documento está disponible al público, por ejemplo, del Banco de Datos de Proteínas de Research Collaboratory for Structural Bioinformatics (PDB). La PDB es de libre acceso mediante la red mundial Internet y se describe por Berman y col. (2000) Nucleic Acids Research, p235-242. Las secuencias génicas de la línea germinal mencionadas en este documento están disponibles al público, por ejemplo, de la base de datos del National Center for Biotechnology Information (NCBI) de secuencias en colecciones de genes V de la línea germinal de Igh, Ig kappa e Ig lambda (como una división del National Library of Medicine (NLM) at the National Institutes of Health (NIH)). La búsqueda de homología de la base de datos de "Genes de la línea germinal de Ig" de NCBI se proporciona por IgG BLAST^{TM}.

El anticuerpo humanizado de la presente invención contiene (i) una cadena ligera que comprende un dominio variable que comprende las CDR de VL de 3D6 murina y una región flanqueante aceptora humana, teniendo la región flanqueante los restos L2, L36, y L46 sustituidos con el resto de 3D6 correspondiente y (ii) una cadena pesada que comprende las CDR de VH de 3D6 y una región flanqueante aceptora humana, teniendo la región flanqueante los restos H49, H93 y H94 sustituidos con el resto de 3D6 correspondiente, y los restos H74, H77 y H89 están sustituidos con un resto de la línea germinal human correspondiente.

El anticuerpo humanizado de la presente invención contiene (i) una cadena ligera que comprende un dominio variable que comprende las CDR de VL de 3D6 murina y una región flanqueante aceptora humana, teniendo la región flanqueante el resto 2 sustituido con una val (V), el resto 36 sustituido con una leu (L) y el resto 46 sustituido con una arg (R), y (ii) una cadena pesada que comprende las CDR de VH de 3D6 y una región flanqueante aceptora humana, teniendo la región flanqueante el resto 49 sustituido con una ala (A), el resto 93 sustituido con una val (V) y el resto 94 sustituido con una arg (R) y, teniendo el resto 74 sustituido con una ser (S), el resto 77 sustituido con una thr (T) y/o el resto 89 sustituido con una val (V).

En una realización particularmente preferida, un anticuerpo humanizado de la presente invención tiene características estructurales, descritas en este documento, y adicionalmente tiene al menos una (preferiblemente dos, tres, cuatro o todas) de las siguientes actividades: (1) se une a A\beta1-42 agregado (por ejemplo, como se determina por ELISA); (2) se une a A\beta en placas (por ejemplo, tinción de placas de AD y/o PDAPP); (3) se une a A\beta con dos a tres veces más afinidad de unión en comparación con 3D6 quimérica (por ejemplo, 3D6 que tiene CDR murinas y FR aceptoras humanas); (4) media la fagocitosis de A\beta (por ejemplo, en un ensayo de fagocitosis ex vivo, como se describe en este documento); y (5) cruza la barrera hemato-encefálica (por ejemplo, muestra localización cerebral a corto plazo, por ejemplo, en un modelo animal de PDAPP, como se describe en este documento).

En otra realización, un anticuerpo humanizado de la presente invención tiene características estructurales, como se describe en este documento, se une a A\beta de un modo o con una afinidad suficiente para provocar al menos uno de los siguientes efectos in vivo: (1) reducir la carga de placas de A\beta; (2) evitar la formación de placas; (3) reducir los niveles de A\beta soluble; (4) reducir la patología neurítica asociada con un trastorno amiloidogénico; (5) aliviar o mejorar al menos un síntoma fisiológico asociado con un trastorno amiloidogénico; y/o (6) mejorar la función cognitiva.

En otra realización, un anticuerpo humanizado de la presente invención tiene características estructurales, como se describe en este documento, y se une específicamente a un epítope que comprende los restos 1-5 ó 3-7 de A\beta.

3. Producción de Regiones Variables

Habiendo seleccionado conceptualmente los componentes de CDR y la región flanqueante de inmunoglobulinas humanizadas, están disponibles una diversidad de procedimientos para producir dichas inmunoglobulinas. A causa de la degeneración del código, una diversidad de secuencias de ácido nucleico codificará cada secuencia de aminoácidos de inmunoglobulina. Las secuencias de ácido nucleico deseadas pueden producirse por síntesis de ADN en fase sólida de novo o por mutagénesis por PCR de una variante preparada previamente del polinucleótido deseado. La mutagénesis mediada por oligonucleótido es un procedimiento preferido para preparar variantes de sustitución, deleción e inserción del polipéptido diana (ADN. Véase Adelman y col., DNA 2:183 (1983). En resumen, el ADN del polipéptido diana se altera hibridando un oligonucleótido que codifica la mutación deseada con un molde de ADN monocatenario. Después de la hibridación, se usa una ADN polimerasa para sintetizar una segunda cadena complementaria completa del molde que incorpora el cebador oligonucleotídico, y codifica la alteración seleccionada en el ADN del polipéptido diana.

4. Selección de Regiones Constantes

Los segmentos variables de los anticuerpos producidos como se ha descrito supra (las regiones variables de cadena pesada y ligera de los humanizados) típicamente se unen a al menos una parte de una región constante de inmunoglobulina (Fc), típicamente la de una inmunoglobulina humana. Las secuencias de ADN de la región constante humana pueden aislarse de acuerdo con procedimientos bien conocidos a partir de una diversidad de células humanas, pero preferiblemente células B inmortalizadas (véase Kabat y col., supra, y Liu y col., documento WO87/02671) (cada uno de los cuales se incorpora por referencia en su totalidad para todos los propósitos). Habitualmente, el anticuerpo contendrá regiones constantes tanto de cadena ligera como de cadena pesada. La región constante de cadena pesada habitualmente incluye las regiones CH1, bisagra, CH2, CH3, y CH4. Los anticuerpos descritos en este documento incluyen anticuerpos que tienen todos los tipos de regiones constantes, incluyendo IgM, IgG, IgD, IgA e IgE, y cualquier isotipo, incluyendo IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4. La elección de la región constante depende, en parte, de si se desea el complemento dependiente de anticuerpo y/o la toxicidad mediada por células. Por ejemplo, los isotipos IgG1 e IgG3 tienen actividad del complemento y los isotipos IgG2 e IgG4 no. Cuando se desea que el anticuerpo (por ejemplo, el anticuerpo humanizado) muestre actividad citotóxica, el dominio constante habitualmente es una región constante de fijación de complemento y la clase es típicamente IgG1. Cuando dicha actividad citotóxica no es deseable, el dominio constante puede ser de la clase IgG2. La elección de isotipo también puede afectar al peso del anticuerpo al cerebro. Se prefiere el isotipo humano IgG1. Las regiones constantes de cadena ligera pueden ser lambda o kappa. El anticuerpo humanizado puede comprender secuencias de más de una clase o isotipo. Los anticuerpos pueden expresarse en forma de tetrámeros que contienen dos cadenas ligeras y dos pesadas, en forma de cadenas pesadas y cadenas ligeras separadas, como Fab, Fab' F(ab')2, y Fv, o en forma de anticuerpos de cadena sencilla en que los dominios variables de cadena pesada y ligera están unidos a través de un espaciador.

5. Expresión de Anticuerpos Recombinantes

Los anticuerpos humanizados típicamente se producen por expresión recombinante. Los ácidos nucleicos que codifican las regiones variables de cadena ligera y pesada humanizadas, opcionalmente unidas a regiones constantes, se insertan en vectores de expresión. Las cadenas ligera y pesada pueden clonarse en los mismos o diferentes vectores de expresión. Los segmentos de ADN que codifican cadenas de inmunoglobulina se unen de forma funcional a secuencias de control en el(los) vector(es) de expresión lo que asegura la expresión de los polipéptidos de inmunoglobulina. Las secuencias de control de la expresión incluyen, aunque sin limitación, promotores (por ejemplo, promotores asociados de forma natural o heterólogos), secuencias señal, elementos potenciadores, y secuencias terminadoras de la transcripción. Preferiblemente, las secuencias de control de la expresión son un sistema promotor eucariota en vectores capaces de transformar o transfectar células huésped eucariotas. Una vez que el vector se ha incorporado en el huésped apropiado, el huésped se mantiene en condiciones adecuadas para la expresión a elevado nivel de las secuencias nucleotídicas, y la recogida y purificación de los anticuerpos de reacción cruzada.

Estos vectores de expresión típicamente son replicables en los organismos huésped en forma de episomas o como parte integral del ADN cromosómico del huésped. Habitualmente, los vectores de expresión contienen marcadores de selección (por ejemplo, resistencia a ampicilina, resistencia a higromicina, resistencia a tetraciclina o resistencia a neomicina) para permitir la detección de aquellas células transformadas con las secuencias de ADN deseadas (véase, por ejemplo, Itakura y col., Patente de Estados Unidos 4.704.362).

E. coli es un huésped procariota particularmente útil para clonar los polinucleótidos (por ejemplo, secuencias de ADN) de la presente invención. Otros huéspedes microbianos adecuados para su uso incluyen bacilos, tales como Bacillus subtilus, y otras enterobacteriaceae, tales como Salmonella, Serratia, y diversas especies de Pseudomonas. En estos huéspedes procariotas, uno también puede crear vectores de expresión, que típicamente contendrán secuencias de control de la expresión compatibles con la célula huésped (por ejemplo, un origen de replicación). Además, estará presente cualquier cantidad de una diversidad de promotores bien conocidos, tales como el sistema promotor de lactosa, un sistema promotor de triptófano (trp), un sistema promotor de beta-lactamasa, o un sistema promotor del fago lambda. Los promotores típicamente controlarán la expresión, opcionalmente con una secuencia operadora, y tendrán secuencias del sitio de unión al ribosoma y similares, para iniciar y completar la transcripción y traducción.

Otros microbios, tales como levaduras, también son útiles para la expresión. Saccharomyces es un huésped de levaduras preferido, con vectores adecuados que tienen secuencias de control de la expresión (por ejemplo, promotores), un origen de replicación, secuencias de terminación y similares según se desee. Los promotores típicos incluyen el de la 3-fosfoglicerato quinasa y otras enzimas glucolíticas. Los promotores de levaduras inducibles incluyen, entre otros, promotores de la alcohol deshidrogenasa, isocitocromo C, y enzimas responsables de la utilización de maltosa y galactosa.

Además de microorganismos, también puede usarse cultivo de células tisulares de mamífero para expresar y producir los polipéptidos de la presente invención (por ejemplo, polinucleótidos que codifican inmunoglobulinas o fragmentos de las mismas). Véase Winnacker, From Genes to Clones, VCH Publishers, N.Y., N.Y. (1987). Las células eucariotas son realmente preferidas, porque se han desarrollado varias líneas celulares huésped adecuadas capaces de secretar proteínas heterólogas (por ejemplo, inmunoglobulinas intactas) en la técnica, e incluyen líneas de células CHO, diversas líneas de células Cos, células HeLa, preferiblemente, líneas celulares de mieloma, o células B transformadas o hibridomas. Preferiblemente, las células son no humanas. Los vectores de expresión para estas células pueden incluir secuencias de control de la expresión, tales como un origen de replicación, un promotor, y un potenciador (Queen y col., Immunol. Rev. 89:49 (1986)), y sitios de procesamiento de la información necesarios, tales como sitios de unión al ribosoma, sitios de corte y empalme del ARN, sitios de poliadenilación, y secuencias terminadoras de la transcripción. Las secuencias de control de la expresión preferidas son promotores derivados de genes de inmunoglobulina, SV40, adenovirus, virus de papiloma bovino, citomegalovirus y similares. Véase Co y col., J. Immunol. 148:1149 (1992).

Como alternativa, las secuencias que codifican el anticuerpo pueden incorporarse en transgenes para la introducción en el genoma de un animal transgénico y la expresión posterior en la leche del animal transgénico (véase, por ejemplo, Deboer y col., documento US 5.741.957, Rosen, documento US 5.304.489, y Meade y col., documento US 5.849.992). Los transgenes adecuados incluyen secuencias codificantes de las cadenas ligera y/o pesada en unión funcional con un promotor y potenciador de un gen específico de la glándula mamaria, tal como caseína o beta lactoglobulina.

Los vectores que contienen las secuencias polinucleotídicas de interés (por ejemplo, las secuencias que codifican la cadena pesada y ligera y secuencias de control de la expresión) pueden transferirse a la célula huésped por procedimientos bien conocidos, que varían dependiendo del tipo de huésped celular. Por ejemplo, la transfección con cloruro cálcico se utiliza habitualmente para células procariotas, mientras que puede usarse tratamiento con fosfato cálcico, electroporación, lipofección, biolística o transfección basada en virus para otros huéspedes celulares. (Véase en líneas generales Sambrook y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Press, 2a ed., 1989) (incorporado por referencia en su totalizada para todos los propósitos). Otros procedimientos usados para transformar células de mamífero incluyen el uso de polibreno, fusión de protoplastos, liposomas, electroporación, y microinyección (véase en líneas generales, Sambrook y col., supra). Para la producción de animales transgénicos, los transgenes pueden microinyectarse en ovocitos fertilizados, o pueden incorporarse en el genoma de células madre embrionarias, y los núcleos de dichas células pueden transferirse a ovocitos no nucleados.

Cuando se clonan las cadenas pesada y ligera en vectores de expresión diferentes, los vectores se introducen por co-transfección para obtener la expresión y ensamblaje de inmunoglobulinas intactas. Una vez expresadas, los anticuerpos completos, sus dímeros, las cadenas ligera y pesada individuales, u otras formas de inmunoglobulina de la presente invención puede purificarse de acuerdo con procedimientos convencionales de la técnica, incluyendo precipitación con sulfato amónico, columnas de afinidad, cromatografía en columna, purificación por HPLC, electroforesis en gel y similares (véase en líneas generales Scopes, Protein Purification (Springer-Verlag, N.Y., (1982)). Se prefieren inmunoglobulinas sustancialmente puras de al menos aproximadamente el 90 al 95% de homogeneidad, y más preferidas del 98 al 99% o más de homogeneidad, para usos farmacéuticos.

6. Fragmentos de Anticuerpo

También se contemplan dentro del alcance de la presente invención fragmentos de anticuerpo.

Se proporcionan fragmentos de anticuerpos humanizados. Típicamente, estos fragmentos muestran unión específica a antígeno con una afinidad de al menos 10^{7}, y más típicamente 10^{8} o 10^{9} M^{-1}. Los fragmentos de anticuerpos humanizados incluyen cadenas pesadas y cadenas ligeras separadas, Fab, Fab' F(ab')2, Fabc, y Fv. Los fragmentos se producen por técnicas de ADN recombinante, o por separación enzimática o química de inmunoglobulinas intactas.

7. Anticuerpos de Ensayo para la Eficacia Terapéutica en Modelos Animales

Se inyectó a grupos de ratones PDAPP de 7-9 meses de edad cada uno 0,5 mg en PBS de anticuerpo policlonal anti-A\beta o anticuerpo monoclonal anti-A\beta específico. Todas las preparaciones de anticuerpo se purifican para que tengan bajos niveles de endotoxina. Los monoclonales pueden prepararse frente a un fragmento inyectando el fragmento o la forma más larga de A\beta en un ratón, preparando hibridomas y secretando de los hibridomas un anticuerpo que se une específicamente a un fragmento deseado de A\beta sin unión a otros fragmentos no solapantes de A\beta.

A los ratones se les inyecta por vía intraperitoneal según sea necesario durante un periodo de 4 meses para mantener una concentración de anticuerpo en circulación medido por titulación ELISA de más de 1/1000 definido por ELISA contra A\beta42 u otro inmunógeno. Los títulos se controlan y los ratones se sacrifican al final de los 6 meses de inyecciones. Se realizan histoquímica, niveles de A\beta y toxicología post mortem. Se usan diez ratones por grupo.

8. Exploración de Anticuerpos de Actividad Eliminadora

Para explorar la actividad contra un depósito amiloide, se pone en contacto una muestra tisular de un cerebro de un paciente con enfermedad de Alzheimer o un modelo animal que tienen patología de Alzheimer característica con células fagocíticas que llevan un receptor Fc, tales como células microgliales, y el anticuerpo en ensayo en a medio in vitro. Las células fagocíticas pueden ser un cultivo primario o una línea celular, tal como BV-2, C8-B4, o THP-1. En algunos procedimientos, los componentes se combinan sobre un portaobjetos de microscopio para facilitar el control microscópico. En algunos procedimientos, se realizan múltiples reacciones en paralelo en los pocillos de una placa de microtitulación. En dicho formato, puede montarse un portaobjetos de microscopio en miniatura diferente en los diferentes pocillos, o puede usarse un formato de detección no microscópico, tal como detección por ELISA de A\beta. Preferiblemente, se hace una serie de mediciones de las cantidades de depósito amiloide en la mezcla de reacción in vitro, partiendo de un valor basal antes de que haya procedido la reacción, y uno o más valores de ensayo durante la reacción. El antígeno puede detectarse por tinción, por ejemplo, con un anticuerpo marcado con fluorescencia contra A\beta u otro componente de placas amiloides. El anticuerpo usado para la tinción puede ser o no igual que el anticuerpo que se está ensayando para la actividad de eliminación. Una reducción relativa al basal durante la reacción de los depósitos amiloides indica que el anticuerpo en ensayo tiene actividad de eliminación. Dichos anticuerpos probablemente son útiles para prevenir o tratar la enfermedad de Alzheimer y otras enfermedades amiloidogénicas.

Pueden usarse procedimientos análogos para explorar anticuerpos para la actividad de eliminar otros tipos de entidades biológicas. El ensayo puede usarse para detectar la actividad de eliminación contra casi cualquier tipo de entidad biológica. Típicamente, la entidad biológica tiene alguna función en la enfermedad humana o animal. La entidad biológica puede proporcionarse en forma de una muestra tisular o en forma aislada. Si se proporciona en forma de una muestra tisular, la muestra tisular está preferiblemente no fijada para permitir el fácil acceso a componentes de la muestra tisular y para evitar alterar la conformación de los componentes secundarios para la fijación. Los ejemplos de muestras tisulares que pueden ensayarse en este ensayo incluyen tejido canceroso, tejido precanceroso, tejido que contiene crecimientos benignos tales como verrugas o lunares, tejido infectado con microorganismos patogénicos, tejido infiltrado con células inflamatorias, tejido que lleva matrices patológicas entre células (por ejemplo, pericarditis fibrinosa), tejido que lleva antígenos aberrantes, y tejido cicatrizal. Los ejemplos de entidades biológicas aisladas que pueden usarse incluyen A\beta, antígenos virales o virus, proteoglicanos, antígenos de otros microorganismos patogénicos, antígenos tumorales, y moléculas de adhesión. Dichos antígenos pueden obtenerse de fuentes naturales, expresión recombinante o síntesis química, entre otros medios. La muestra tisular o la entidad biológica aislada se pone en contacto con células fagocíticas que llevan receptores Fc, tales como monocitos o células microgliales, y un anticuerpo a ensayar en un medio. El anticuerpo puede estar dirigido a la entidad biológica en ensayo o a un antígeno asociado con la entidad. En la última situación, el objetivo es ensayar si la entidad biológica se fagocita indirectamente con el antígeno. Habitualmente, aunque no necesariamente, el anticuerpo y la entidad biológica (a veces con un antígeno asociado), se ponen en contacto entre sí antes de añadir las células fagocíticas. Después se controla la concentración de la entidad biológica y/o el antígeno asociado que queda en el medio. Una reducción en la cantidad o concentración de antígeno o la entidad biológica asociada en el medio indica que el anticuerpo tiene una respuesta de eliminación contra el antígeno y/o la entidad biológica asociada junto con las células fagocíticas (véase, por ejemplo, el Ejemplo IV).

B. Ácido Nucleico que Codifica Agente Inmunológicos y Terapéuticos

También pueden inducirse respuestas inmunes contra depósitos amiloides por administración de ácidos nucleicos que codifican anticuerpos y sus cadenas componentes usadas para la inmunización pasiva. Dichos ácidos nucleicos pueden ser ADN o ARN. Un segmento de ácido nucleico que codifica un inmunógeno típicamente se une a elementos reguladores, tales como un promotor y un potenciador, que permiten la expresión del segmento de ADN en las células diana pretendidas de un paciente. Para la expresión en células sanguíneas, que es deseable para la inducción de una respuesta inmune, son adecuados elementos promotores y potenciadores de los genes de inmunoglobulina de cadena ligera o pesada o el promotor temprano intermedio principal de CMV y el potenciador para dirigir la expresión. Los elementos reguladores unidos y las secuencias codificantes a menudo se clonan en un vector. Para la administración de anticuerpos de doble cadena, pueden clonarse las dos cadenas en el mismo o diferentes vectores.

Están disponibles varios sistemas de vector viral incluyendo sistemas retrovirales (véase, por ejemplo Lawrie y Tumin, Cur. Opin. Genet. Develop. 3:102-109 (1993)); vectores adenovirales (véase, por ejemplo, Bett y col., J. Virol. 67:5911 (1993)); vectores de virus adeno-asociados (véase, por ejemplo, Zhou y col., J. Exp. Med 179:1867 (1994)), vectores virales de la familia poxvirus incluyendo el virus vaccinia y los poxvirus aviares, vectores virales del género alfa virus tales como los derivados de los virus Sindbis y Semliki Forest (véase, por ejemplo, Dubensky y col., J. Virol. 70:508 (1996)), virus de la encefalitis equina venezolana (véase Johnston y col., documento US 5.643.576) y rabdovirus, tales como el virus de la estomatitis vesicular (véase Rose, documento WO 96/34625) y papilomavirus (Ohe y col., Human Gene Therapy 6:325 (1995); Woo y col., documento WO 94/12629 y Xiao & Brandsma, Nucleic Acids. Res. 24, 2630-2622 (1996)).

El ADN que codifica un inmunógeno, o un vector que contiene el mismo, puede empaquetarse en liposomas. Se describen lípidos adecuados y análogos relacionados por Eppstein y col., documento US 5.208.036, Felgner y col., documento US 5.264.618, Rose, documento US 5.279.833, y Epand y col., documento US 5.283.185. Los vectores y el ADN que codifica un inmunógeno también pueden adsorberse a o asociarse con vehículos particulados, ejemplos de los cuales incluyen polímeros de polimetil metacrilato y polilactidas y poli(lactida-co-glicolidas), véase, por ejemplo, McGee y col., J. Micro Encap. (1996).

Pueden suministrarse vectores de terapia génica o polipéptidos desnudos (por ejemplo, ADN) in vivo por administración a un paciente individual, típicamente por administración sistémica (por ejemplo, intravenosa, intraperitoneal, nasal, gástrica, intradérmica, intramuscular, subdérmica, o infusión intracraneal) o aplicación tópica (véase, por ejemplo, Anderson y col., documento US 5.399.346). El término "polinucleótido desnudo" se refiere a un polinucleótido no complejado con materiales coloidales. Los polinucleótidos desnudos a veces se clonan en un vector plasmídico. Dichos vectores pueden incluir adicionalmente agentes facilitadores tales como bupivacina (Attardo y col., documento US 5.593.970). El ADN también puede administrarse usando una pistola génica. Véase Xiao & Brandsma, supra. El ADN que codifica un inmunógeno se precipita sobre la superficie de perlas metálicas microscópicas. Los microproyectiles se aceleran con una onda de choque o gas helio en expansión, y penetran los tejidos a una profundidad de varias capas celulares. Por ejemplo, el Dispositivo de Suministro Génico Accel^{TM} fabricado por Agacetus, Inc. Middleton WI es adecuado. Como alternativa, el ADN desnudo puede pasar a través de la piel en el torrente sanguíneo aplicando puntualmente el ADN sobre la piel con irritación química o mecánica (véase Howell y col., documento WO 95/05853).

En una variación adicional, los vectores que codifican inmunógenos pueden suministrarse a células ex vivo, tales como células explantadas de un paciente individual (por ejemplo, linfocitos, aspirados de médula ósea, biopsia tisular) o células madre hematopoyéticas donantes universales, seguido de reimplante de las células en el paciente, habitualmente después de la selección de las células que han incorporado el vector.

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II. Usos Profilácticos y Terapéuticos

La presente invención se refiere inter alia al tratamiento de la enfermedad de Alzheimer y otras enfermedades amiloidogénicas por administración de las inmunoglobulinas humanizadas contra epítopes específicos dentro de A\beta a un pacientes en condiciones que generan una respuesta terapéutica beneficiosa en un paciente (por ejemplo, inducción de fagocitosis de A\beta, reducción de la carga de placas, inhibición de la formación de placas, reducción de la distrofia neurítica, mejora de la función cognitiva, y/o reversión, tratamiento o prevención del deterioro cognitivo) en el paciente, por ejemplo, para la prevención o tratamiento de una enfermedad amiloidogénica. La invención también se refiere al uso de las inmunoglobulinas humanizadas en la preparación de un medicamento para el tratamiento o prevención de una enfermedad amiloidogénica.

El término "tratamiento" como se usa en este documento, se define como la aplicación o administración de una agente terapéutico a un paciente, o la aplicación o administración de un agente terapéutico a un tejido aislado o línea celular de un paciente, que tiene una enfermedad, un síntoma de enfermedad o una predisposición a una enfermedad, con el propósito de curar, sanar, aliviar, mitigar, alterar, remediar, aminorar, mejorar o afectar la enfermedad, los síntomas de enfermedad o la predisposición a una enfermedad.

En un aspecto, la invención proporciona el uso de las inmunoglobulinas humanizadas en la preparación de un medicamento para la prevenir o tratar una enfermedad asociada con depósitos amiloides de A\beta en el cerebro de un paciente. Dichas enfermedades incluyen enfermedad de Alzheimer, síndrome de Down y alteración cognitiva. La última puede suceder con o sin otras características de una enfermedad amiloidogénica. Algunos usos de la invención implican administrar una dosificación eficaz de un anticuerpo que se une específicamente a un componente de un depósito amiloide al paciente. Dichos usos son particularmente útiles para prevenir o tratar la enfermedad de Alzheimer en pacientes humanos. Los usos ejemplares implican administrar una dosificación eficaz de un anticuerpo que se une a A\beta. Los usos preferidos implican administrar una dosificación eficaz de un anticuerpo que se une específicamente a un epítope dentro de los restos 1-10 de A\beta, por ejemplo, anticuerpos que se unen específicamente a un epítope dentro de los restos 1-5 de A\beta, anticuerpos que se unen específicamente a un epítope dentro de los restos 1-6 de A\beta, anticuerpos que se unen específicamente a un epítope dentro de los restos 1-7 de A\beta, o anticuerpos que se unen específicamente a un epítope dentro de los restos 3-7 de A\beta. En otro aspecto más, la invención ofrece administrar anticuerpos que se unen a un epítope que comprenden un resto N-terminal libre de A\beta. En otro aspecto más, la invención ofrece administrar anticuerpos que se unen a un epítope dentro de los restos 1-10 de A\beta donde el resto 1 y/o el resto 7 de A\beta es ácido aspártico. En otro aspecto más, la invención ofrece administrar anticuerpos que se unen específicamente al péptido A\beta sin unirse a la proteína precursora amiloide (APP) de longitud completa. En otro aspecto más, el isotipo del anticuerpo es IgG1 humana.

En otro aspecto más, la invención ofrece administrar anticuerpos que se unen a un depósito amiloide en el paciente e inducen una respuesta de eliminación contra el depósito amiloide. Por ejemplo, dicha respuesta de eliminación puede realizarse por fagocitosis mediada por el receptor Fc.

Los agentes terapéuticos de la invención típicamente son sustancialmente puros de contaminantes indeseados. Esto significa que un agente tiene típicamente al menos aproximadamente un 50% p/p (peso/peso) de pureza, y también está sustancialmente libre de proteínas interferentes y contaminantes. A veces los agentes tienen al menos aproximadamente un 80% p/p y, más preferiblemente al menos un 90 o aproximadamente un 95% p/p de pureza. Sin embargo, usando técnicas de purificación de proteínas convencionales, pueden obtenerse péptidos homogéneos de al menos un 99% p/p.

Las inmunoglobulinas humanizadas pueden usarse tanto en pacientes sintomáticos como en aquello que actualmente no muestran síntomas de enfermedad. Los anticuerpos pueden ser humanizados, anticuerpos, o fragmentos de los mismos (por ejemplo, fragmentos de unión a antígeno) como se describe en este documento.

En otro aspecto, la invención ofrece administrar un anticuerpo con un vehículo farmacéutico en forma de una composición farmacéutica. Como alternativa, el anticuerpo puede administrarse a un paciente administrando un polinucleótido que codifica al menos una cadena de anticuerpo. El polinucleótido se expresa para producir la cadena de anticuerpo en el paciente. Opcionalmente, el polinucleótido codifica las cadenas pesada y ligera del anticuerpo. El polinucleótido se expresa para producir las cadenas pesada y ligera en el paciente. En realizaciones ejemplares, el paciente se controla para el nivel de anticuerpo administrado en la sangre del paciente.

La invención por tanto cumple una antigua necesidad de regímenes terapéuticos para prevenir o mejorar la neuropatología y, en algunos pacientes, la alteración cognitiva asociada con la enfermedad de Alzheimer.

A. Pacientes Susceptibles a Tratamiento

Los pacientes susceptibles a tratamiento incluyen individuos en riesgo de enfermedad pero que no muestran síntomas, así como pacientes que actualmente están mostrando síntomas. En el caso de la enfermedad de Alzheimer, casi cualquier está en riesgo de padecer la enfermedad de Alzheimer si vive mucho tiempo. Por lo tanto, las presentes inmunoglobulinas pueden administrarse profilácticamente a la población general sin necesidad de ninguna evaluación del riesgo del paciente. Las presentes inmunoglobulinas son especialmente útiles para individuos que tienen un riesgo genético conocido de enfermedad de Alzheimer. Dichos individuos incluyen aquellos que tienen parientes que han experimentado la enfermedad, y aquellos cuyo riesgo está determinado por análisis de marcadores genéticos o bioquímicos. Los marcadores genéticos de riesgo a la enfermedad de Alzheimer incluyen mutaciones en el gen APP, particularmente mutaciones en la posición 717 y las posiciones 670 y 671 conocidas como las mutaciones de Hardy y Sueca respectivamente (véase Hardy, supra). Otros marcadores re riesgo son mutaciones en los genes de la presenilina, PS1 y PS2, y ApoE4, la historia familiar de AD, hipercolesterolemia o aterosclerosis. Los individuos que ya están padeciendo la enfermedad de Alzheimer pueden reconocerse por la demencia característica, así como por la presencia de factores de riesgo descritos anteriormente. Además, están disponibles varios ensayos de diagnóstico para identificar individuos que tienen AD. Estos incluyen la medición de los niveles de CSF tau y A\beta42. Los elevados niveles de tau y los niveles disminuidos de A\beta42 indican la presencia de AD. Los individuos que padecen enfermedad de Alzheimer también pueden diagnosticarse por los criterios ADRDA analizados en la sección de Ejemplos.

En pacientes asintomáticos, el tratamiento puede comenzar a cualquier edad (por ejemplo, 10, 20, 30). Habitualmente, sin embargo, no en necesario comenzar el tratamiento hasta que el paciente alcance los 40, 50, 60 ó 70. El tratamiento típicamente implica dosificaciones durante un periodo de tiempo. El tratamiento puede controlarse ensayando los niveles de anticuerpo en el tiempo. Si la respuesta disminuye, se indica una dosificación de refuerzo. En el caso de pacientes con síndrome de Down potenciales, el tratamiento puede comenzar de forma antenatal administrando agente terapéutico a la madre o poco después del nacimiento.

B. Regímenes y Dosificaciones de Tratamiento

En aplicaciones profilácticas, las composiciones farmacéuticas o medicamentos se administran a un paciente susceptible a, o en riesgo de otro modo de, enfermedad de Alzheimer en una cantidad suficiente para eliminar o reducir el riesgo, disminuir la gravedad, o retardar la aparición de la enfermedad, incluyendo síntomas bioquímicos, históricos y/o del comportamiento de la enfermedad, sus complicaciones y genotipos patológicos intermedios que se presentan durante el desarrollo de la enfermedad. En aplicaciones terapéuticas, las composiciones o medicamentos se administran a un paciente del que se sospecha de, o que ya padece dicha enfermedad en una cantidad suficiente para curar, o al menos detener parcialmente, los síntomas de la enfermedad (bioquímicos, histológicos y/o del comportamiento), incluyendo sus complicaciones y fenotipos patológicos intermedios en el desarrollo de la enfermedad.

En algunos usos, la administración de agente reduce o elimina la mioalteración cognitiva en pacientes que aún no han desarrollado la patología de Alzheimer característica. Una cantidad adecuada para conseguir el tratamiento terapéutico o profiláctico se define como una dosis terapéutica o profilácticamente eficaz. En regímenes tanto profilácticos como terapéuticos, los agentes habitualmente se administran en varias dosificaciones hasta que se ha conseguido una respuesta inmune suficiente. El término "respuesta inmune" o "respuesta inmunológica" incluye el desarrollo de una respuesta humoral (mediada por anticuerpo) y/o celular (mediada por células T específicas de antígeno o sus productos de secreción) dirigida contra un antígeno en un sujeto receptor. Dicha respuesta puede ser una respuesta activa, es decir, inducida por la administración de inmunógeno, o una respuesta pasiva, es decir, inducida por la administración de inmunoglobulina o anticuerpo o células T sensibilizadas.

Un "agente inmunogénico" o "inmunógeno" es capaz de inducir una respuesta inmunológica contra sí mismo después de administración a un mamífero, opcionalmente junto con un adyuvante. Típicamente, la respuesta inmune se controla y se dan dosificaciones repetidas si la respuesta inmune empieza a disminuir.

Las dosis eficaces de las composiciones de la presente invención, para el tratamiento de las afecciones descritas anteriormente varían dependiendo de muchos factores diferentes, incluyendo el medio de administración, el sitio diana, el estado fisiológico del paciente, si el paciente es un ser humano o un animal, otras medicaciones administradas, y si el tratamiento es profiláctico o terapéutico. Habitualmente, el paciente es un ser humano pero también pueden tratarse mamíferos no humanos incluyendo mamíferos transgénicos. Las dosificaciones de tratamiento tienen que titularse para optimizar la seguridad y la eficacia.

Para la inmunización pasiva con un anticuerpo, la dosificación varía de aproximadamente 0,0001 a 100 mg/kg, y más habitualmente de 0,01 a 5 mg/kg, del peso corporal del huésped. Por ejemplo las dosificaciones pueden ser de 1 mg/kg de peso corporal o 10 mg/kg de peso corporal o dentro del intervalo de 1-10 mg/kg, preferiblemente al menos 1 mg/kg. A los sujetos se les puede administrar dichas dosis diariamente, en días alternos, semanalmente o de acuerdo con cualquier otro programa determinado por análisis empírico. Un tratamiento ejemplar implica la administración en múltiples dosificaciones durante un periodo prolongado, por ejemplo, de al menos seis meses. Los regímenes de tratamiento ejemplares adicionales implican la administración una vez cada dos semanas o una vez al mes o una vez cada 3 a 6 meses. Los programas de dosificación ejemplares incluyen 1-10 mg/kg o 15 mg/kg en días consecutivos, 30 mg/kg en días alternos o 60 mg/kg semanalmente. En algunos procedimientos, se administran simultáneamente dos o más anticuerpos monoclonales con diferentes especificidades de unión, en cuyo case la dosificación de cada anticuerpo administrado está dentro de los intervalos indicados.

El anticuerpo habitualmente se administra en múltiples ocasiones. Los intervalos entre dosificaciones sencillas pueden ser semanalmente, mensualmente o anualmente. Los intervalos también pueden ser irregulares como se indique midiendo los niveles sanguíneos de anticuerpo contra A\beta en el paciente. En algunos procedimientos, la dosificación se ajusta para conseguir una concentración plasmática de anticuerpo de 1-1000 \mug/ml y en algunos procedimientos 25-300 \mug/ml. Como alternativa, el anticuerpo puede administrarse en forma de una formulación de liberación sostenida, en cuyo caso se requiere una administración menos frecuente. La dosificación y la frecuencia varían dependiendo de la semi-vida del anticuerpo en el paciente. En general, los anticuerpos humanos muestran la semi-vida más larga, seguidos de los anticuerpos humanizados, los anticuerpos quiméricos, y los anticuerpos no humanos.

La dosificación y la frecuencia de administración pueden variar dependiendo de si el tratamiento es profiláctico o terapéutico. En aplicaciones profilácticas, las composiciones que contienen los presentes anticuerpos o un cóctel de los mismos se administran a un paciente que ya no está enfermo para potenciar la resistencia del paciente. Dicha cantidad se define como una "dosis profiláctica eficaz". En este uso, las cantidades precisas de nuevo dependen del estado de salud y la inmunidad general del paciente, pero generalmente varían de 0,1 a 25 mg por dosis, especialmente de 0,5 a 2,5 mg por dosis. Se administra una dosificación relativamente baja a intervalos relativamente infrecuentes durante un largo periodo de tiempo. Algunos pacientes continúan recibiendo tratamiento durante el resto de sus vidas.

En aplicaciones terapéuticas, a veces se requiere una dosificación relativamente elevada (por ejemplo, de aproximadamente 1 a 200 mg de anticuerpo por dosis, siendo más habitualmente usadas dosificaciones de 5 a 25 mg) a intervalos relativamente cortos hasta que se reduce o termina el progreso de la enfermedad, y preferiblemente hasta que el paciente muestra mejora parcial o completa de los síntomas de la enfermedad. Después de ello, al paciente puede administrársele un régimen profiláctico.

Las dosis de ácidos nucleicos que codifican anticuerpos varían de aproximadamente 10 ng a 1 g, de 100 ng a 100 mg, de 1 mg a 10 mg, o de 30-300 mg de ADN por paciente. Las dosis para vectores virales infecciosos varían de 10-100, o más viriones por dosis.

Los agentes terapéuticos pueden administrarse por un medio parenteral, tópico, intravenoso, oral, subcutáneo, intraarterial, intracraneal, intraperitoneal, intranasal o intramuscular para tratamiento profiláctico y/o terapéutico. La vía más típica de administración de un agente inmunogénico es subcutánea aunque otras vías pueden ser igual de eficaces. La siguiente vía más común es inyección intramuscular. Este tipo de inyección se realiza más típicamente en los músculos del brazo o la pierna. En algunos procedimientos, los agentes se inyectan directamente en un tejido particular donde se han acumulado depósitos, por ejemplo inyección intracraneal. Se prefiere la inyección intramuscular o infusión intravenosa para la administración de anticuerpos. En algunos procedimientos, se inyectan anticuerpos terapéuticos particulares directamente en el cráneo. En algunos procedimientos, los anticuerpos se administran en forma de una composición de liberación sostenida o dispositivo, tal como un dispositivo Medipad^{TM}.

Los agentes de la invención puede administrarse opcionalmente en combinación con otros agentes que son al menos parcialmente eficaces en el tratamiento de una enfermedad amiloidogénica. En el caso de la enfermedad de Alzheimer y el síndrome de Down, en que existen depósitos amiloides en el cerebro, los agentes de la invención también pueden administrarse junto con otros agentes que aumentan el paso de los agentes de la invención a través de la barrera hemato-encefálica.

C. Composiciones Farmacéuticas

Los agentes de la invención a menudo se administran en forma de composiciones farmacéuticas que comprenden un agente terapéutico activo, es decir, y una diversidad de otros componentes farmacéuticamente aceptables. Véase Remington's Pharmaceutical Science (15a ed., Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania (1980)). La forma preferida depende del modo pretendido de administración y la aplicación terapéutica. Las composiciones también pueden incluir, dependiendo de la formulación deseada, vehículos o diluyentes farmacéuticamente aceptables, no tóxicos, que se definen como vehículos habitualmente usados para formular composiciones farmacéuticas para administración a animales o seres humanos. El diluyente se selecciona de modo que no afecte a la actividad biológica de la combinación. Ejemplos de dichos diluyentes son agua destilada, solución salina tamponada con fosfato fisiológica, solución de Ringer, solución de dextrosa, y solución de Hank. Además, la composición o formulación farmacéutica también puede incluir otros vehículos, adyuvantes, o estabilizadores no tóxicos, no terapéuticos, no inmunogénicos y similares.

Las composiciones farmacéuticas también pueden incluir macromoléculas grandes, metabolizadas lentamente tales como proteínas, polisacáridos tales como quitosana, ácidos polilácticos, ácidos poliglicólicos y copolímeros (tal como sepharose(TM) funcionalizado con látex, agarosa, celulosa, y similares), aminoácidos poliméricos, copolímeros de aminoácidos, y agregados lipídicos (tales como gotas de aceite o liposomas). Además, estos vehículos pueden funcionar como agentes inmunoestimuladores (es decir, adyuvantes).

Para administración parenteral, los agentes de la invención pueden administrarse en forma de dosificaciones inyectables de una solución o suspensión de la sustancia en un diluyente fisiológicamente aceptable con un vehículo farmacéutico que puede ser un líquido estéril tal como aceites acuosos, solución salina, glicerol, o etanol. Además, pueden estar presentes sustancias auxiliares, tales como agentes humectantes o emulsionantes, tensioactivos, sustancias tamponantes del pH y similares en las composiciones. Otros componentes de composiciones farmacéuticas son aquellos de origen petrolífero, animal, vegetal, o sintético, por ejemplo, aceite de cacahuete, aceite de soja, y aceite mineral. En general, los glicoles tales como propilenglicol o polietilenglicol son vehículos líquidos preferidos, particularmente para soluciones inyectables. Los anticuerpos pueden administrarse en forma de una inyección de depósito o preparación de implante, que puede formularse de tal modo que permita una liberación sostenida del ingrediente activo. Una composición ejemplar comprende anticuerpo monoclonal a 5 mg/ml, formulado en tampón acuoso constituido por L-histidina 50 mM, NaCl 150 mM, ajustado a pH 6,0 con HCl.

Típicamente, las composiciones se preparan en forma de inyectables, como soluciones o suspensiones líquidas; también pueden prepararse formas sólidas adecuadas para solución en, o suspensión en, vehículos líquidos antes de la inyección. La preparación también puede emulsionarse o encapsularse en liposomas o micropartículas tales como polilactida, poliglicolida, o copolímero para un efecto adyuvante potenciado, como se ha analizado anteriormente (véase Langer, Science 249: 1527 (1990) y Hanes, Advanced Drug Delivery Reviews 28:97 (1997)). Los agentes de esta invención pueden administrarse en forma de una inyección de depósito o preparación de implante, que puede formularse de tal modo que permita una liberación sostenida o por pulsos del ingrediente activo.

Las formulaciones adicionales adecuadas para otros modos de administración incluyen formulaciones orales, intranasales, y pulmonares, supositorios, y aplicaciones transdérmicas. Para supositorios, los aglutinantes y vehículos incluyen, por ejemplo, polialquilenglicoles o triglicéridos; dichos supositorios pueden formarse a partir de mezclas que contienen el ingrediente activo en el intervalo del 0,5% al 10%, preferiblemente del 1%-2%. Las formulaciones orales incluyen excipientes, tales como grados farmacéuticos de manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina sódica, celulosa, y carbonato de magnesio. Estas composiciones tienen forma de soluciones, suspensiones, comprimidos, píldoras, cápsulas, formulaciones de liberación sostenida o polvos y contienen el 10%-95% de ingrediente activo, preferiblemente el 25%-70%.

La aplicación tópica puede producir el suministro transdérmico o intradérmico. La administración tópica puede facilitarse por co-administración del agente con toxina colérica o derivados destoxificados o subunidades de la misma u otras toxinas bacterianas similares (Véase Glenn y col., Nature 391, 851 (1998)). La co-administración puede conseguirse usando los componentes en forma de una mezcla o en forma de moléculas unidas obtenidas por reticulación química o expresión en forma de una proteína de fusión.

Como alternativa, el suministro transdérmico puede conseguirse usando un parche cutáneo o usando transferosomas (Paul y col., Eur. J. Immunol. 25:3521 (1995); Cevc y col., Biochem. Biophys. Acta 1368:201-15 (1998)).

III. Control del Transcurso de Tratamiento

Los anticuerpos humanizados de la invención pueden usarse en procedimientos para controlar el tratamiento en un paciente que padece o es susceptible a enfermedad de Alzheimer, es decir, para controlar el transcurso del tratamiento que se está administrando a un paciente. Los procedimientos pueden usarse para controlar tanto el tratamiento terapéutico en pacientes sintomáticos como el tratamiento profiláctico en pacientes asintomáticos. En particular, los procedimientos son útiles para controlar la inmunización pasiva (por ejemplo, midiendo el nivel de anticuerpo administrado).

Algunos procedimientos implican determinar un valor basal, por ejemplo, de un nivel o perfil de anticuerpo en un paciente, antes de administrar una dosificación de agente, y comparar este con un valor para el perfil o nivel después del tratamiento. Un aumento significativo (es decir, mayor que el margen típico de error experimental en mediciones repetidas de la misma muestra, expresado como una desviación típica de la media de dichas mediciones) en el valor del nivel o perfil indica un resultado de tratamiento positivo (es decir, que la administración del agente ha conseguido una respuesta deseada). Si el valor para la respuesta inmune no cambia significativamente, o disminuye, se indica un resultado de tratamiento negativo.

En otros procedimientos, se determina un valor de control (es decir, una media y desviación típica) del nivel o perfil para una población de control. Típicamente los individuos en la población de control no han recibido tratamiento previo. Los valores medidos del nivel o perfil en un paciente después de administrarle un agente terapéutico después se comparan con el valor de control. Un aumento significativo relativo al valor de control (por ejemplo, mayor que una desviación típica de la media) indica un resultado de tratamiento positivo o suficiente. La ausencia de aumento significativo o una disminución indica un resultado de tratamiento negativo o insuficiente. La administración de agente se continúa generalmente mientras el nivel esté aumentando relativo al valor de control. Como anteriormente, la obtención de un nivel constante relativo a valores de control es un indicador de que la administración de tratamiento puede interrumpirse o reducirse en la dosificación y/o frecuencia.

En otros procedimientos, se determina un valor de control del nivel o perfil (por ejemplo, una media y desviación típica) a partir de una población de control de individuos que han experimentado tratamiento con un agente terapéutico y cuyos niveles o perfiles han alcanzado un nivel constante en respuestas al tratamiento. Los valores medidos de niveles o perfiles en un paciente se comparan con el valor de control. Si el nivel medido en un paciente no es significativamente diferente (por ejemplo, más de una desviación típica) del valor de control, el tratamiento puede interrumpirse. Si el nivel en un paciente está significativamente por debajo del valor de control, está justificada la administración continuada de agente. Si el nivel en el paciente persiste por debajo del valor de control, entonces puede indicarse un cambio en el tratamiento.

En otros procedimientos, se controla a un paciente que actualmente no está recibiendo tratamiento pero ha experimentado un transcurso previo de tratamiento para los niveles o perfiles de anticuerpo para determinar si se requiere una reanudación del tratamiento. El nivel o perfil medido en el paciente puede compararse con un valor previamente conseguido en el paciente después de un transcurso previo de tratamiento. Una disminución significativa relativa a la medición previa (es decir, mayor que un margen de error típico en mediciones repetidas de la misma muestra) es una indicación de que el tratamiento puede reanudarse. Como alternativa, el valor medido en un paciente puede compararse con un valor de control (media más desviación típica) determinado en una población de pacientes después de experimentar un transcurso de tratamiento. Como alternativa, el valor medido en un paciente puede compararse con un valor de control en poblaciones de pacientes tratados profilácticamente que siguen estando libres de síntomas de enfermedad, o poblaciones de pacientes tratados terapéuticamente que muestran mejora de las características de la enfermedad. En todos estos casos, una disminución significativa relativa al nivel de control (es decir, más de una desviación típica) es un indicador de que el tratamiento debe reanudarse en un paciente.

La muestra tisular para el análisis típicamente es sangre, plasma, suero, fluido mucoso o fluido cefalorraquídeo del paciente. La muestra se analiza, por ejemplo, para los niveles o perfiles de anticuerpos contra el péptido A\beta, por ejemplo, los niveles o perfiles de anticuerpos humanizados. Se describe procedimientos ELISA para detectar anticuerpos específicos contra A\beta en la sección de Ejemplos. En algunos procedimientos, el nivel o perfil de un anticuerpo administrado se determina usando un ensayo de eliminación, por ejemplo, en un ensayo de fagocitosis in vitro, como se describe en este documento. En dichos procedimientos, se pone en contacto una muestra tisular de un paciente que se está ensayando con depósitos amiloides (por ejemplo, de un ratón PDAPP) y células fagocíticas que llevan receptores Fc. La eliminación posterior del depósito amiloide se controla después. La existencia y grado de respuesta de eliminación proporciona una indicación de la existencia y nivel de anticuerpos eficaces para eliminar A\beta en la muestra tisular del paciente en ensayo.

El perfil de anticuerpo después de la inmunización pasiva típicamente muestra un pico inmediato en la concentración de anticuerpo seguido de una caída exponencial. Sin una dosificación adicional, la caída se aproxima a los niveles pretratamiento dentro de un periodo de días a meses dependiendo de la semi-vida del anticuerpo administrado. Por ejemplo la semi-vida de algunos anticuerpos humanos es del orden de 20 días.

En algunos procedimientos, se hace una medición basal de anticuerpo contra A\beta en el paciente antes de la administración, se hace una segunda medición poco después de ello para determinar el nivel de anticuerpo máximo, y se hace una o más mediciones adicionales a intervalos para controlar la caída de los niveles de anticuerpo. Cuando el nivel de anticuerpo ha caído a la medida basal o un porcentaje predeterminado del pico menos la medida basal (por ejemplo, el 50%, 25% o 10%), se administra la administración de una dosificación adicional de anticuerpo. En algunos procedimientos, el pico o los niveles medidos posteriores menos el fondo se comparan con niveles de referencia determinados previamente para constituir un régimen de tratamiento profiláctico o terapéutico beneficioso en otros pacientes. Si el nivel de anticuerpo medido es significativamente menor que el nivel de referencia (por ejemplo, menor que la media menos una desviación típica del valor de referencia en la población de pacientes que se beneficia del tratamiento) se indica la administración de una dosificación adicional de anticuerpo.

Los procedimientos adicionales incluyen el control, durante el transcurso del tratamiento, de cualquier síntoma fisiológico reconocido en la técnica (por ejemplo, síntoma físico o mental) que depende rutinariamente de los investigadores o médicos para diagnosticar o controlar enfermedades amiloidogénicas (por ejemplo, enfermedad de Alzheimer). Por ejemplo, puede controlarse la alteración cognitiva. El último es un síntoma de la enfermedad de Alzheimer y el síndrome de Down pero también puede suceder sin otras características de cualquiera de estas enfermedades. Por ejemplo, la alteración cognitiva puede controlarse determinando el la valoración de un paciente en el Mini-examen de Estado Mental de acuerdo con las convenciones en todo el transcurso de tratamiento.

C. Kits

La invención proporciona adicionalmente kits para realizar los procedimientos de control descritos anteriormente. Típicamente, dichos kits contienen un agente que se une específicamente a anticuerpos contra A\beta. El kit también puede incluir un marcador. Para la detección de anticuerpos contra A\beta, el marcador está típicamente en forma de anticuerpos anti-idiotipo marcados. Para la detección de anticuerpos, el agente puede suministrarse preunido a una fase sólida, tal como a pocillos de una placa de microtitulación. Los kits también contienen típicamente directrices que proporcionan el marcaje para el uso del kit. El marcaje también puede incluir un diagrama u otro régimen de correspondencia que correlaciona lo niveles de marcador medido con niveles de anticuerpos contra A\beta. El término marcaje se refiere a cualquier material escrito o registrado que está unido a, o que acompaña de otro modo a un kit en cualquier momento durante su fabricación, transporte, venta o uso. Por ejemplo, el término marcaje abarca panfletos o folletos publicitarios, materiales de empaquetado, instrucciones, audio o videocasetes, discos informáticos, así como escritura impresa directamente en los kits.

La invención también proporciona kits de diagnóstico, por ejemplo, kits de investigación, detección y/o diagnóstico (por ejemplo, para realizar imágenes in vivo). Dichos kits típicamente contienen un anticuerpo para la unión a un epítope de A\beta, preferiblemente dentro de los restos 1-10, Preferiblemente, el anticuerpo está marcado o está incluido un reactivo de marcaje secundario en el kit. Preferiblemente, el kit está etiquetado con instrucciones para realizar la aplicación pretendida, por ejemplo, para realizar un ensayo de imágenes in vivo. Los anticuerpos ejemplares son los descritos en este documento.

D. Imágenes In vivo

La invención proporciona imágenes in vivo de depósitos amiloides en un paciente usando las inmunoglobulinas de la invención. Dichos procedimientos son útiles para diagnosticar o confirmar el diagnóstico de la enfermedad de Alzheimer, o la susceptibilidad a la misma. Por ejemplo, los procedimientos pueden usarse en un paciente que presenta síntomas de demencia. Si el paciente tiene depósitos amiloides anormales, entonces el paciente es susceptible de padecer la enfermedad de Alzheimer. Los procedimientos también pueden usarse en pacientes asintomáticos. La presencia de depósitos amiloides anormales indica susceptibilidad a enfermedad sintomática futura. Los procedimientos también son útiles para controlar el progreso de la enfermedad y/o la respuesta al tratamiento en pacientes que se han diagnosticado previamente con enfermedad de Alzheimer.

Los procedimientos funcionan administrado un reactivo, tal como un anticuerpo que se une a A\beta, al paciente y después detectando el agente después de que se haya unido. Los anticuerpos preferidos se unen a depósitos de A\beta en un paciente sin unirse al polipéptido APP de longitud completa. Los anticuerpos que se unen a un epítope de A\beta dentro de los aminoácidos 1-10 son particularmente preferidos. En algunos procedimientos, el anticuerpo se une a un epítope dentro de los aminoácidos 7-10 de A\beta. Dichos anticuerpos típicamente se unen sin inducir una respuesta de eliminación sustancial. En otros procedimientos, el anticuerpo se une a un epítope dentro de los aminoácidos 1-7 de A\beta. Dichos anticuerpos típicamente se unen e inducen una respuesta de eliminación contra A\beta. Sin embargo, la respuesta de eliminación puede evitarse usando fragmentos de anticuerpo que carecen de una región constante de longitud completa, tal como Fab. En algunos procedimientos, el mismo anticuerpo puede servir como reactivo tanto de tratamiento como de diagnóstico. En general, los anticuerpos que se unen a epítopes C-terminales al resto 10 de A\beta no muestran una señal tan fuerte como anticuerpos que se unen a epítopes dentro de los restos 1-10, supuestamente porque los epítopes C-terminales son inaccesibles en depósitos amiloides. Por consiguiente, dichos anticuerpos son menos preferidos.

Los reactivos de diagnóstico pueden administrarse por inyección intravenosa en el cuerpo del paciente, o directamente en el cerebro por inyección intracraneal o taladrando un orificio a través del cráneo. La dosificación de reactivo debe estar dentro de los mismos intervalos que para los procedimientos de tratamiento. Típicamente, el reactivo está marcado, aunque en algunos procedimientos, el reactivo primario con afinidad por A\beta está sin marcar y se usa un agente de marcaje secundario para unirlo al reactivo primario. La elección del marcador depende del medio de detección. Por ejemplo, un marcador fluorescente es adecuado para la detección óptica. El uso de marcadores paramagnéticos es adecuado para la detección topográfica sin intervención quirúrgica. Los marcadores radiactivos también pueden detectarse usando PET o SPECT.

El diagnóstico se realiza comparando la cantidad, tamaño, y/o intensidad de sitios marcador, con valores basales correspondientes. Los valores basales pueden representar los niveles medios en una población de individuos no enfermos. Los valores basales también pueden representar niveles previos determinados en el mismo paciente. Por ejemplo, los valores basales pueden determinarse en un paciente antes del inicio del tratamiento, y los valores medidos compararse después de ello con los valores basales. Una disminución en los valores relativa a la medida basal indica una respuesta positiva al tratamiento.

La presente invención se describirá más completamente por los siguientes ejemplos no limitantes.

Ejemplos

Los Ejemplos I a VI y X a XI se proporcionan solamente para propósitos de información.

Ejemplo I Eficacia Terapéutica de Anticuerpo Anti-A\beta: mAb 2H3, mAb 10D5, mAb 266, mAb 21F12 y pAb A\beta1-42

Este ejemplo ensaya la capacidad de diversos anticuerpos monoclonales y policlonales contra A\beta de inhibir la acumulación de A\beta en el cerebro de ratones transgénicos heterocigóticos.

A. Diseño del Estudio

Se obtuvieron sesenta ratones transgénicos PDAPP heterocigóticos macho y hembra, de 8,5 a 10,5 meses de edad de Charles River Laboratory. Los ratones se clasificaron en seis grupos a tratar con diversos anticuerpos dirigidos contra A\beta. Los animales se distribuyeron para que coincidieran en género, edad, origen y fuente de los animales dentro de los grupos lo más cercanamente posible. La Tabla 2 representa el diseño experimental.

TABLA 2 Diseño Experimental

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Como se muestra en la Tabla 2, los anticuerpos incluían cuatro anticuerpos monoclonales murinos específicos de A\beta, 2H3 (dirigido contra los restos 1-12 de A\beta), 10D5 (dirigido contra los restos 3-7 de A\beta), 266 (dirigido contra los restos 13-28 de A\beta y se une a AN1792 soluble pero no a AN1792 agregado), 21F12 (dirigido contra los restos 33-42 de A\beta). Un quinto grupo se trató con una fracción de anticuerpo policlonal específico de A\beta (provocado por inmunización con AN1792 agregado). El grupo de control negativo recibió el diluyente, PBS, solo sin anticuerpo.

B. Control del Transcurso de Tratamiento

Los anticuerpos monoclonales se inyectaron a una dosis de aproximadamente 10 mg/kg (suponiendo que los ratones pesaban 50 g). Los títulos de anticuerpo se controlaron durante las 28 semanas de tratamiento. Las inyecciones se administraron por vía intraperitoneal cada siete días de promedio para mantener los títulos anti-A\beta por encima de 1000. Aunque se midieron títulos inferiores para mAb 266 ya que no se une bien al AN1792 agregado usado como antígeno de captura en el ensayo, se mantuvo el mismo programa de dosis para este grupo. El grupo que recibió anticuerpo monoclonal 2H3 se interrumpió en las primeras tres semanas ya que el anticuerpo se eliminaba demasiado rápidamente in vivo.

Para la determinación de los títulos de anticuerpo, se extrajo sangre de u subconjunto de tres ratones elegidos aleatoriamente de cada grupo justo antes de la inoculación intraperitoneal, para un total de 30 extracciones. Los títulos de anticuerpo se midieron como anticuerpo que se une a A\beta1-42 usando un ELISA tipo sándwich con placas multipocillo de plástico revestidas con A\beta1-42 como se describe en detalle en los Materiales y Procedimientos Generales. Los títulos medios para cada extracción se exponen en la Tabla 3 para el anticuerpo policlonal y los monoclonales 10D5 y 21F12.

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TABLA 3

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Los títulos promediaban aproximadamente 1000 durante este periodo de tiempo para la preparación de anticuerpo policlonal y estaban ligeramente por encima de este nivel para los animales tratados con 10D5 y 21F12.

El tratamiento se continuó durante un periodo de seis meses para un total de 196 días. Los animales se sacrificaron una semana después de la dosis final.

C. Niveles de A\beta y APP en el Cerebro

Después de aproximadamente seis meses de tratamiento con las diversas preparaciones de anticuerpo anti-A\beta, se retiraron los cerebros de los animales después de perfusión salina. Se preparó un hemisferio para análisis inmunohistoquímico y el segundo se usó para la cuantificación de los niveles de A\beta y APP. Para medir las concentraciones de diversas formas del péptido beta amiloide y proteína precursora amiloide (APP), el hemisferio se diseccionó y se prepararon homogeneizados de las regiones del hipocampo, la corteza, y el cerebelo en guanidina 5 M. Éstas se diluyeron en serie y se cuantificó el nivel de péptido amiloide o APP por comparación con una serie de diluciones de patrones de péptido A\beta o APP de concentraciones conocidas en un formato ELISA.

Los niveles de A\beta total y de A\beta1-42 medidos por ELISA en homogeneizados de la corteza, y el hipocampo y el nivel de A\beta total en el cerebelo se muestran en las Tablas 4, 5, y 6, respectivamente. La concentración media de A\beta total para el grupo de control, inoculado con PBS, fue 3,6 veces mayor en el hipocampo que en la corteza (media de 63.389 ng/g de tejido del hipocampo en comparación con 17.818 ng/g para la corteza). El nivel medio en el cerebelo del grupo de control (30,6 ng/g de tejido) fue más de 2.000 veces inferior que en el hipocampo. Estos niveles son similares a los presentados previamente para ratones transgénicos PDAPP heterocigóticos de esta edad (Johnson-Wood y col., supra).

Para la corteza, un grupo de tratamiento tenía un nivel de A\beta medio, medido como A\beta1-42, que difería significativamente del grupo de control (p < 0,05), aquellos animales que recibieron el anticuerpo policlonal anti-A\beta como se muestra en la Tabla 4. El nivel medio de A\beta1-42 se redujo en un 65%, en comparación con el control para este grupo de tratamiento. Los niveles medios de A\beta1-42 también se redujeron significativamente en un 55% en comparación con el control en un grupo de tratamiento adicional, aquellos animales a los que se dosificó el mAb 10D5 (p = 0,0433).

TABLA 4

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En el hipocampo, la reducción porcentual media de A\beta total asociada con el tratamiento con anticuerpo policlonal anti-A\beta (50%, p = 0,0055) no fue tan grande como la observada en la corteza (65%) (Tabla 5). Sin embargo, la magnitud absoluta de la reducción era casi 3 veces mayor en el hipocampo que en la corteza, una reducción neta de 31.683 ng/g de tejido en el hipocampo frente a 11.658 ng/g de tejido en la corteza. Cuando se midió como el nivel de la forma más amiloidogénica de A\beta, A\beta1-42, en lugar de cómo A\beta total, la reducción conseguida con el anticuerpo policlonal fue significativa (p = 0,0025). Los niveles medios en los grupos tratados con los mAb 10D5 y 266 se redujeron en un 33% y un 21%, respectivamente.

TABLA 5

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También se midió A\beta total en el cerebelo (Tabla 6). Aquellos grupos a los que se dosificó el anticuerpo policlonal anti-A\beta y el anticuerpo 266 mostraron reducciones significativas de los niveles de A\beta total (43% y 46%, p = 0,0033 y p = 0,0184, respectivamente) y el grupo tratado con 10D5 tuvo una reducción casi significativa (29%, p = 0,0675).

TABLA 6

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También se determinó la concentración de APP por ELISA en la corteza y el cerebelo de ratones tratados con anticuerpo y control, tratados con PBS. Se utilizaron dos ensayos diferentes de APP. El primero, denominado APP-\alpha/FL, reconoce tanto APP-alfa (\alpha, la forma secretada de APP que ha sido escindida en la secuencia de A\beta), como las formas de longitud completa (FL) de APP, mientras que el segundo reconoce solamente APP-\alpha. En contraste con la disminución asociada al tratamiento de A\beta en un subconjunto de grupos de tratamiento, los niveles de APP estaban prácticamente inalterados en todos los animales tratados en comparación con los de control. Estos resultados indican que las inmunizaciones con anticuerpos contra A\beta eliminan A\beta sin eliminar APP.

En resumen, los niveles de A\beta se redujeron significativamente en la corteza, el hipocampo y el cerebelo en animales tratados con el anticuerpo policlonal producido contra AN1792. A un menor grado los anticuerpos monoclonales contra la región amino terminal de A\beta1-42, específicamente los aminoácidos 1-16 y 13-28 también mostraron efectos de tratamiento significativos.

D. Análisis Histoquímicos

Se comparó cualitativamente la morfología de placas inmunorreactivas A\beta en subconjuntos de cerebros de ratones en los grupos de tratamiento PBS, policlonal A\beta42, 21F12, 266 y 10D5 con la de los estudios previos en que se siguieron procedimientos de inmunización convencionales con A\beta42:

La mayor alteración tanto en la extensión como en el aspecto de las placas amiloides sucedía en los animales inmunizados con el anticuerpo policlonal contra A\beta42. La reducción de la carga amiloide, la morfología de placa erosionada y la inmunorreactividad de A\beta asociada a células se parecían muy estrechamente a los efectos producidos por el procedimiento de inmunización. Estas observaciones apoyan los resultados de ELISA en que se conseguían reducciones significativas tanto en A\beta total como A\beta42 por administración del anticuerpo policlonal contra A\beta42.

En evaluaciones cualitativas similares, también se reducían las placas amiloides en el grupo 10D5 en cantidad y aspecto, con algunas evidencias de inmunorreactividad de A\beta asociada a células. Con relación a los animales tratados de control, la fracción de Ig policlonal contra A\beta y uno de los anticuerpos monoclonales (10D5) reducía la carga de placas en un 93% y 81%, respectivamente (p < 0,005). Parecía que 21F12 tenía un efecto relativamente moderado sobre la carga de placas. Las micrografías del cerebro después del tratamiento con pAbA\beta_{1-42} muestran depósitos difusos y ausencia de muchas de las placas compactadas más grandes en el grupo tratado con pAbA\beta_{1-42} relativo a los animales tratados de control.

E. Respuesta Linfoproliferativa

Se midió la linfoproliferación dependiente de A\beta usando células esplénicas recogidas ocho días después de la infusión final de anticuerpo. Las células recién recogidas, 10^{5} por pocillo, se cultivaron durante 5 días en presencia de A\beta1-40 a una concentración de 5 mM para la estimulación. Como control positivo, se cultivaron células adicionales con el mitógeno de células T, PHA, y, como control negativo, las células se cultivaron sin péptido añadido.

Los esplenocitos de ratones PDAPP envejecidos inmunizados pasivamente con diversos anticuerpos anti-A\beta es estimularon in vitro con AN1792 y se midieron las respuestas proliferativas y de citoquinas. El propósito de estos ensayos era determinar si la inmunización pasiva facilitaba la presentación de antígeno, y de este modo la sensibilización a respuestas de células T específicas para AN1792. No se observaron respuestas proliferativas o de citoquinas específicas de AN1792 en ratones inmunizados pasivamente con los anticuerpos anti-A\beta.

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Ejemplo II Eficacia Terapéutica de Anticuerpos Anti-A\beta: mAb 2H3, mAb 10D5, mAb 266, mAb 21F12, mAb 3D6, mAb 16C11 y pAb A\beta1-42

En un segundo estudio, se repitió el tratamiento con 10D5 y se ensayaron dos anticuerpos anti-A\beta adicionales, los monoclonales 3D6 (A\beta1-5) y 16C11 (A\beta33-42). Los grupos de control recibieron PBS o un anticuerpo irrelevante de isotipo coincidente (TM2a). Los ratones eran más viejos (heterocigotos de 11,5-12 meses de edad) que en el estudio previo, por lo demás el diseño experimental era el mismo. Otra vez, después de seis meses de tratamiento, 10D5 redujo la carga de placas en más del 80% relativa a los controles de PBS o anticuerpo de isotipo coincidente (p=0,003). Uno de los otros anticuerpos contra A\beta, 3D6, era igual de eficaz, produciendo una reducción del 86% (p=0,003). En contraste, el tercer anticuerpo contra el péptido, 16C11, no lograba tener ningún efecto sobre la carga de placas. Se obtuvieron hallazgos similares con mediciones ELISA de A\beta42.

Estos resultados demuestran que una respuesta de anticuerpo contra el péptido A\beta, en ausencia de inmunidad de células T, es suficiente para disminuir la deposición amiloide en ratones PDAPP, pero que no todos los anticuerpos anti-A\beta son igual de eficaces. Los anticuerpos dirigidos contra epítopes que comprenden los aminoácidos 1-5 ó 3-7 de A\beta son particularmente eficaces. En resumen, puede demostrarse que anticuerpos administrados pasivamente contra A\beta (es decir, inmunización pasiva) reducen el grado de posición de placas en un modelo de ratón de enfermedad de Alzheimer.

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Ejemplo III Control de la Unión de Anticuerpo en el SNC

Este Ejemplo demuestra que cuando se mantienen a concentraciones séricas moderadas (25-70 mg/ml), los anticuerpos conseguían acceder al SNC a niveles suficientes para cubrir las placas \beta-amiloides.

Para determinar si los anticuerpos contra A\beta podrían estar actuando directamente dentro del SNC, los cerebros tomados de ratones prefundidos con solución salina al final del Ejemplo II, se examinaron para la presencia de los anticuerpos administrados periféricamente. Se expusieron secciones cerebrales de criostato sin fijar a un reactivo fluorescente contra la inmunoglobulina de ratón (anticuerpo de cabra anti-IgG de ratón-Cy3). Las placas dentro de cerebros de los grupos 10D5 y 3D6 se cubrían fuertemente con anticuerpo, mientras que no hubo tinción en el grupo 16C11. Para revelar la extensión completa de la deposición de placas, se hicieron inmunorreaccionar primero secciones seriadas de cada cerebro con un anticuerpo anti-A\beta, y después con el reactivo secundario. 10D5 y 3D6, después de administración periférica, consiguieron acceder a la mayoría de las placas dentro del SNC. La carga de placas se redujo enormemente en estos grupos de tratamiento en comparación el grupo 16C11. La entrada de anticuerpos en el SNC no se debía a una filtración anormal de la barrera hemato-encefálica ya que no había aumento en la permeabilidad vascular medida por Azul de Evans en ratones PDAPP. Además, la concentración de anticuerpo en el parénquima cerebral de ratones PDAPP envejecidos era igual que en ratones no transgénicos, que representa el 0,1% de la concentración de anticuerpos en suero (independientemente del isotipo).

Estos datos indican que anticuerpos administrados periféricamente pueden entrar en el SNC donde pueden desencadenar directamente la eliminación amiloide. Es probable que 16C11 también tuviera acceso a las placas pero era incapaz de unirse.

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Ejemplo IV Ensayo de Exploración Ex vivo para la Actividad de un Anticuerpo Contra Depósitos Amiloides

Para examinar el efecto de los anticuerpos sobre la eliminación de placas, se estableció un ensayo ex vivo en el que se cultivaron células microgliales primarias con secciones de criostato no fijadas de cerebros AD de ratones PDAPP o seres humanos. Las células microgliales se obtuvieron de las cortezas cerebrales de ratones DBA/2N neonatos (1-3 días). Las cortezas se disociaron mecánicamente en HBSS^{-} (Solución Salina Equilibrada de Hank, Sigma) con 50 mg/ml de DNasa I (Sigma). Las células disociadas se filtraron con un tamiz celular de 100 mm (Falcon), y se centrifugaron a 1000 rpm durante 5 minutos. El sedimento se resuspendió en medio de cultivo (DMEM de elevado contenido de glucosa, FBS al 10%, 25ng/ml de rmGM-CSF), y las células se sembraron a una densidad de 2 cerebros por matraz de cultivo de plástico T-75. Después de 7-9 días, los matraces se rotaron en un agitador orbital a 200 rpm durante 2 h a 37ºC. La suspensión celular se centrifugó a 1000 rpm y se resuspendió en el medio de ensayo.

Se montaron secciones de criostato descongeladas de 10 mm de cerebros AD de ratón PDAPP o ser humano (intervalo post-mortem < 3 h) en cubreobjetos de vidrio redondeados revestidos con poli-lisina y se colocaron en pocillos de placas de cultivo tisular de 24 pocillos. Los cubreobjetos se lavaron dos veces con medio de ensayo constituido por H-SFM (medio libre de suero de hibridoma, Gibco BRL) con FBS al 1%, glutamina, penicilina/estreptomicina, y 5 ng/ml de rmGM-CSF (R&D). Se añadieron anticuerpos de control o anti-A\beta a una concentración 2x (5 mg/ml final) durante 1 hora. Las células microgliales después se sembraron a una densidad de 0,8 x 10^{6} células/ml de medio de ensayo. Los cultivos se mantuvieron en un incubador humidificado (37ºC, CO_{2} al 5%) durante 24 h o más. Al final de la incubación, los cultivos se fijaron con paraformaldehído al 4% y se permeabilizaron con Triton-X100 al 0,1%. Las secciones se tiñeron con 3D6 biotinilado seguido de un conjugado estreptavidina/Cy3 (Jackson ImmunoResearch). Las células microgliales exógenas se visualizaron por un tinte nuclear (DAPI). Los cultivos se observaron con un microscopio fluorescente invertido (Nikon, TE300) y se tomaron fotomicrografías con una cámara digital SPOT usando el software SPOT (Diagnostic instruments). Para el análisis de transferencia de Western, los cultivos se extrajeron en urea 8 M, se diluyeron 1:1 en tampón de muestra de tricina reductor y se cargaron en un gel de tricina al 16% (Novex). Después de transferirlos a immobilon, las manchas de transferencia se expusieron a 5 mg/ml del pabAp42 seguido de un anticuerpo anti-ratón conjugado con HRP, y se revelaron con ECL (Amersham).

Cuando el ensayo se realizó con secciones de cerebro PDAPP en presencia de 16C 11 (uno de los anticuerpos contra A\beta que no era eficaz in vivo), las placas \beta-amiloides permanecían intactas y se observaba fagocitosis. En contraste, cuando se cultivaban secciones adyacentes en presencia de 10D5, los depósitos amiloides desaparecían en gran medida y las células microgliales mostraban numerosas vesículas fagocíticas que contenían A\beta. Se obtuvieron resultados idénticos con secciones cerebrales AD; 10D5 inducía fagocitosis de placas AD, mientras que 16C11 era ineficaz. Además, el ensayo proporcionaba resultados comparables cuando se realizaba con células microgliales de ratón o humanas, y con anticuerpos de ratón, conejo, o primate contra A\beta.

La Tabla 7 compara la unión de A\beta frente a la fagocitosis para varias especificidades de unión a anticuerpo diferentes. Puede observarse que los anticuerpos que se unen a epítopes en los aa 1-7 se unen y eliminan los depósitos amiloides, mientras que anticuerpos que se unen a epítopes en los aminoácidos 4-10 se unen sin eliminar los depósitos amiloides. Los anticuerpos que se unen a epítopes C-terminales al resto 10 ni se unen ni eliminan los depósitos amiloides.

TABLA 7 Análisis de Especificidad de Epítope

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La Tabla 8 muestra los resultados obtenidos con varios anticuerpos contra A\beta, comparando sus capacidades de inducir la fagocitosis en el ensayo ex vivo y de reducir la carga de placas in vivo en estudios de transferencia pasiva. Aunque 16C11 y 21F12 se unían al péptido A\beta sintético agregado con elevada avidez, estos anticuerpos eran incapaces de reaccionar con placas \beta-amiloides en secciones cerebrales sin fijar, no podían desencadenar fagocitosis en el ensayo ex vivo, y no eran eficaces in vivo. 10D5, 3D6, y el anticuerpo policlonal contra A\beta eran activos por las tres mediciones. Estos resultados muestran que la eficacia in vivo se debe a la eliminación medida por anticuerpo directa de las placas dentro del SNC, y que el ensayo ex vivo era predictivo de eficacia in vivo.

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TABLA 8 El ensayo ex vivo como procedimiento predictivo de eficacia in vivo

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Se ha usado el mismo ensayo para ensayar la actividad de eliminación de un anticuerpo contra un fragmento de sinucleína mencionada como NAC. La sinucleína ha demostrado ser una proteína asociada a placas amiloides. Se puso en contacto un anticuerpo contra NAC con una muestra de tejido cerebral que contenía placas amiloides, y células microgliales, como anteriormente. Se usó suero de conejo como control. El control posterior mostró una marcada reducción en la cantidad y tamaño de placas indicativo de actividad de eliminación del anticuerpo.

Se usó microscopía confocal para confirmar que se internalizaba A\beta durante el transcurso del ensayo ex vivo. En presencia de anticuerpos de control, las células microgliales exógenas permanecían en un plano confocal por encima del tejido, no había vesículas fagocíticas que contenían A\beta, y las placas permanecían intactas dentro de la sección. En presencia de 10D5, casi todo el material de placa estaba contenido en vesículas dentro de las células microgliales exógenas. Para determinar el destino del péptido internalizado, se extrajeron cultivos tratados con 10D5 con urea 8 M en diversos momentos puntuales, y se examinaron por análisis de transferencia de Western. En el momento puntual de una hora, cuando aún no había sucedido fagocitosis, la reacción con un anticuerpo policlonal contra A\beta reveló una fuerte banda de 4 kD (correspondiente al péptido A\beta). La inmunorreactividad de A\beta disminuyó en el día 1 y estuvo ausente en el día 3. Por tanto, la fagocitosis mediada por anticuerpo de A\beta conduce a su degradación.

Para determinar si la fagocitosis en el ensayo ex vivo estaba mediada por Fc, se prepararon fragmentos F(ab')2 del anticuerpo anti-A\beta 3D6. Aunque los fragmentos F(ab')2 retenían su capacidad completa de reaccionar con las placas, eran incapaces de desencadenar la fagocitosis por células microgliales. Además, la fagocitosis con el anticuerpo completo podía bloquearse por un reactivo contra receptores Fc murinos (anti-CD16/32). Estos datos indican que la eliminación in vivo de A\beta sucede a través de la fagocitosis mediada por el receptor Fc.

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Ejemplo V Paso de Anticuerpos a Través de la Barrera Hemato-Encefálica

Este ejemplo determina la concentración de anticuerpo suministrado al cerebro después de inyección intravenosa en un tejido periférico de ratones normales o PDAPP. Después del tratamiento, los ratones PDAPP o de control normales se prefundieron con NaCl al 0,9%. Las regiones cerebrales (hipocampo o corteza) se diseccionaron y se congelaron rápidamente. El cerebro se homogeneizó en triton al 0,1% + inhibidores de proteasa. La inmunoglobulina se detectó en los extractos por ELISA. Se revistieron F(ab)'2 de cabra anti-IgG de ratón sobre una placa RIA como reactivo de captura. El suero o los extractor cerebrales se incubaron durante 1 h. Los isotipos se detectaron con anticuerpo anti-IgG1 de ratón-HRP o IgG2a-HRP o IgG2b-HRP (Caltag). Los anticuerpos, independientemente del isotipo, estaban presentes en el SNC a una concentración que es 1:1000 la encontrada en la sangre. Por ejemplo, cuando la concentración de IgG1 era tres veces la de IgG2a en la sangre, IgG2a era también tres veces en el cerebro, estando ambas presentes al 0,1% de sus niveles respectivos en la sangre. Este resultado se observó en ratones tanto transgénicos como no transgénicos lo que indica que los PDAPP no tienen una barrera hemato-encefálica filtrante única.

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Ejemplo VI Clonación y Secuenciación de las Regiones Variables de 3D6 de Ratón

Clonación y Análisis de Secuencia de VH de 3D6. Se clonó la región VH variable de cadena pesada de 3D6 por RT-PCR usando ARNm preparado a partir de células de hibridoma por dos procedimientos independientes. En el primero, se emplearon cebadores consenso para el péptido líder de la región VH que abarca el codón de inicio de la traducción como cebador 5' (ADN nº 3818-3829), y un cebador 3' específico de las regiones constantes g2b (ADN nº 3832). Las secuencias del producto amplificado por PCR, así como de múltiples clones obtenidos independientemente, estaban en completo acuerdo entre sí. Como comprobación adicional sobre la secuencia de la región VH de 3D6, el resultado se confirmó secuenciando un fragmento VH obtenido por metodología de 5' RACE RT-PCR y el cebador específico g2b 3' (ADN nº 3832). De nuevo, la secuencia se obtuvo del producto de PCR, así como múltiples clones independientemente aislados. Ambas secuencias están en completo acuerdo entre sí (con la excepción de la sustitución V8I en la región líder del producto 5' RACE), lo que indica que las secuencias se obtienen del ARNm que codifica la región VH de 3D6. La secuencia de nucleótidos (SEC ID Nº 3) y aminoácidos (SEC ID Nº 4) de la región VH de 3D6 se exponen en la Tabla 9A y en la Figura 2, respectivamente.

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TABLA 9A Secuencia de Nucleótidos de VH de 3D6 de Ratón

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Clonación y Análisis de Secuencia de VL de 3D6. Se clonó la región VL variable de cadena ligera de 3D6 de un modo análogo que la región VH. En el primer ensayo, se diseñó una serie de cebadores consenso para la amplificación de regiones VL murinas del siguiente modo: se diseñaron cebadores 5' (ADN nº 3806-3816) para que hibridaran con la región VL que abarca el codón de inicio de la traducción, y un cebador 3' (ADN nº 3817) era específico de la región Ck murina cadena debajo de la región de unión V-J. El análisis de secuencia de ADN del fragmento de PCR, así como clones independientemente obtenidos aislados usando esta serie de cebadores de cadena ligera consenso, reveló que el ADNc obtenido derivaba de un mensaje no funcionalmente reordenado ya que la secuencia contenía una mutación de cambio de fase entre la unión de la región V-J.

En un segundo ensayo, se empleó 5' RACE para clonar un segundo ADNc que codifica VL. El análisis de la secuencia de ADN de este producto (consenso 11) mostró que codificaba un ARNm funcional. Por tanto, puede concluirse que la secuencia codifica el ARNm de cadena ligera de 3D6 correcto. La secuencia de nucleótidos (SEC ID Nº 1) y aminoácidos (SEC ID Nº 2) de la región VL de 3D6 se exponen en la Tabla 9B y en la Figura 1, respectivamente.

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TABLA 9B Secuencia de Nucleótidos de VL de 3D6 de Ratón

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(Tabla pasa a página siguiente)

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Los cebadores usados para la clonación del ADNc de VL de 3D6 se exponen en la Tabla 10.

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Desde el extremo N-terminal al extremo C-terminal, la cadena ligera y pesada contienen los dominios FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 y FR4. La asignación de aminoácidos a cada dominio es de acuerdo con la convención numérica de Kabat y col., supra.

Expresión del Anticuerpo 3D6 Quimérico: Las regiones de cadena pesada y ligera variables se re-diseñaron para que codificara secuencias donantes de corte y empalme cadena debajo de las uniones VDJ o VJ respectivas, y se clonaron en el vector de expresión de mamíferos pCMV-h\gamma1 para la cadena pesada, y pCMV-h\kappa1 para la cadena ligera. Estos vectores codifican las regiones constantes yI y Ck humanas como fragmentos exónicos cadena abajo del casete de región variable insertado. Después de la verificación de secuencia, los vectores de expresión de cadena pesada y cadena ligera se introdujeron por co-transfección en células COS. Se introdujeron por co-trasfección dos clones de cadena pesada diferentes (H2.2 y H3.2) independientemente con 3 clones de cadena ligera diferentes (L3, L4, y L10) para confirmar la reproducibilidad del resultado. Se realizó una transfección de anticuerpo 21.6 quimérico como control positivo para los vectores. El medio condicionado se recogió 48 h después de la transfección y se ensayó por análisis de transferencia de western para la producción de anticuerpo o ELISA para la unión
a A\beta.

Los múltiples transfectantes expresaban todos combinaciones cadena pesada + cadena ligera que se reconocen por un anticuerpo de cabra anti-IgG humana (H+L) en transferencia de western.

Se ensayó la unión directa de los anticuerpos 3D6 y 3D6 quimérico (PK1614) a A\beta por análisis ELISA. Se descubrió que 3D6 quimérico se unía a A\beta con elevada avidez, similar a la demostrada por 3D6 (Figura 3A). Además, un ensayo de inhibición competitiva basado en ELISA reveló que el anticuerpo 3D6 quimérico y 3D6 murino competían igualmente por con 3D6 biotinilado por la unión a A\beta (Figura 3B). El anticuerpo quimérico presentaba propiedades de unión indistinguibles de la muestra de referencia de 3D6.

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TABLA 11

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Además, tanto 3D6 como PK1614 eran eficaces en eliminar placas A\beta. El ensayo ex vivo demuestra que según aumenta la concentración de anticuerpo, la cantidad de A\beta disminuye de una manera similar para los anticuerpos 3D6 tanto murino como quimérico. Por tanto, puede concluirse que las secuencias codifican cadenas pesadas y cadenas ligeras de 3D6 funcionales respectivamente.

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Ejemplo VII Humanización de 3D6

Homología/Modelado Molecular. Para identificar restos flanqueantes estructurales clave en el anticuerpo 3D6 murino, se generó un modelo tridimensional basado en los anticuerpos murinos más cercanos para las cadenas pesada y ligera. Para este propósito, se eligió un anticuerpo denominado 1CR9 como molde para modelar la cadena ligera de 3D6 (PDB ID: 1CR9, Kanyo y col., supra), y se eligió un anticuerpo denominado 1OPG como molde para modelar la cadena pesada. (PDB ID: 1OPG Kodandapani y col., supra). (Véase también la Tabla 1_{1}) La alineación de secuencias de aminoácidos de 3D6 con la cadena ligera y la cadena pesada de estos anticuerpos reveló que, con la excepción de CDR3 de la cadena pesada, los anticuerpos 1CR9 y 1OPG comparten homología de secuencia significativa con 3D6. Además, los bucles CDR de los anticuerpos seleccionados están en las mismas clases estructuras de Chotia canónicas como los bucles CDR de 3D6, de nuevo exceptuando CDR3 de la cadena pesada. Por lo tanto, 1CR9 y 1OPG se seleccionaron inicialmente como anticuerpos de estructura resuelta para el modelado de homología de 3D6.

Se construyó un modelo de homología de primer paso de la región variable de 3D6 basado en los anticuerpos indicados anteriormente usando el paquete de software Look & SegMod Modules GeneMine (v3.5). Este software se adquirió bajo una licencia perpetua de Molecular Applications Group (Palo Alto, CA). Este paquete de software, elaborado por los Drs. Michael Levitt y Chris Lee, facilita el procedimiento de modelado molecular automatizando las etapas implicadas en el modelado estructural de una secuencia primaria sobre un molde de estructura conocida en base a la homología de secuencia. Trabajando en una terminal de trabajo Silicon Graphics IRIS en un ambiente UNIX, se refina automáticamente la estructura modelada por una serie de etapas de minimización de energía para aliviar los contactos atómicos desfavorables y optimizar las interacciones electrostáticas y de van der Waals.

Se construyó un modelo refinado adicional usando la capacidad de modelado de Quanta®. Una consulta de la base de datos PDB con CDR3 de la cadena pesada de 3D6 identificó 1qkz como el más homólogo y que tiene la cantidad idéntica de restos que 3D6. Por tanto, la CDR3 de la cadena pesada de 3D6 se modeló usando la estructura cristalina de 1qkz como molde. El trazo de la estructura de carbonos \alpha del modelo 3D6 se muestran en la Figura 4. El dominio VH se muestra en forma de una línea punteada, y el dominio VL se muestra en forma de una línea continua, y lo bucles CDR se indican en forma de cintas.

Selección de Secuencias de Anticuerpo Aceptoras Humanas. Se identificaron secuencias de anticuerpo aceptoras humanas adecuadas por comparaciones informáticas de las secuencias de aminoácidos de las regiones variables de ratón con las secuencias de anticuerpos humanos conocidas. La comparación se realizó por separado para las cadenas pesada y ligera de 3D6. En particular, los dominios variables de anticuerpos humanos cuyas secuencias flanqueantes mostraban un elevado grado de identidad de secuencia con las regiones flanqueantes VL y VH se identificaron por consulta de la Base de Datos Kabat usando NCBI BLAST (accesible al público a través del servidor de Internet de National Institutes of Health NCBI) con las secuencias flanqueantes murinas respectivas.

Se eligieron dos secuencias candidatas como secuencias aceptoras en base a los siguientes criterios: (1) homología con la secuencia sometida; (2) el hecho de compartir estructuras de CDR canónicas con la secuencia donante; y (3) el hecho de no contener ningún resto aminoacídico raro en las regiones flanqueantes. La secuencia aceptora seleccionada para VL es el Nº ID Kabat (KABID) 019230 (Genbank Nº de Acceso S40342), y para VH es KABID 045919 (Genbank Nº de Acceso AF115110). Las primeras versiones del anticuerpo 3D6 humanizado utilizan estas secuencias de anticuerpo aceptoras seleccionadas.

Sustitución de Restos Aminoacídicos. Como se ha indicado supra, los anticuerpo humanizados de la invención comprenden regiones flanqueantes variables sustancialmente de una inmunoglobulina humana (inmunoglobulina aceptora) y regiones determinantes de complementariedad sustancialmente de una inmunoglobulina de ratón (inmunoglobulina donante) llamada 3D6. Habiendo identificado las regiones determinantes de complementariedad de 3D6 y las inmunoglobulinas aceptoras humanas apropiadas, la siguiente etapa fue determinar qué restos, si los hay, de estos componentes sustituir para optimizar las propiedades del anticuerpo humanizado resultante. Los criterios descritos supra se usaron para seleccionar restos para sustitución.

Las Figuras 1 y 2 representan alineamientos de la VL y VH de 3D6 murina original, respectivamente, con la versión 1 respectiva de la secuencia humanizada, la secuencia aceptora flanqueante humana correspondiente y, finalmente, la secuencia de la región V de la línea germinal humana que muestra la mayor homología con la secuencia aceptora flanqueante humana. Los restos sombreados indican los aminoácidos canónicos (relleno continuo), vernier (contorno discontinuo), de empaquetado (negrita), y raros (cursiva negrita), y se indican en la figura. Los asteriscos indican restos con mutación de reversión a restos murinos en la secuencia flanqueante aceptora humana, y las regiones CDR se muestran super-rayados. Se presenta un resumen de los cambios incorporados en la versión 1 de VH y VL de 3D6 humanizado en la Tabla 12.

TABLA 12 Resumen de los cambios en 3D.v1 humanizado

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Las Tablas 13 y 14 exponen las claves de numeración de Kabat para las diversas cadenas ligera y pesada, respectivamente.

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TABLA 13 Clave a la Numeración de Kabat para la Cadena Ligera

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TABLA 14 Clave a la Numeración de Kabat para la Cadena Pesada

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Los anticuerpos humanizados preferiblemente muestran una afinidad de unión específica por A\beta de al menos 10^{7}, 10^{8}, 10^{9} o 10^{10} M^{-1}. Habitualmente el límite superior de la afinidad de unión de los anticuerpos humanizados por A\beta está dentro de un factor de tres, cuatro o cinco el de 3D6 (es decir, \sim10^{9} M^{-1}). A menudo el límite inferior de la afinidad de unión también está dentro de un factor de tres, cuatro o cinco el de 3D6.

Ensamblaje y Expresión de VH y VL de 3D6 Humanizado, Versión 1. En resumen, para cada región V, se sintetizaron 4 oligonucleótidos solapantes monocatenarios grandes. Además, se sintetizaron 4 cortos cebadores de PCR para cada región V para facilitar adicionalmente el ensamblaje de la región V particular. Las secuencias de ADN de los oligonucleótidos empleados para este propósito se muestran en la Tabla 15.

TABLA 15 Oligonucleótidos de ADN

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La cadena ligera humanizada se ensambló usando PCR. El análisis de secuencia de ADN de más de dos docenas de clones reveló mutaciones puntuales dispersas y deleciones en toda la región VL con respecto a la secuencia esperada. El análisis de las secuencias indicó que el clon 2.3 era susceptible de reparar 2 deleciones de un único nucleótido poco espaciadas en la región amino-terminal. Por tanto, se realizó mutagénesis dirigida al sitio en el clon pCRShum3D6v12.3 usando oligonucleótidos para introducir los 2 nucleótidos delecionados, y la reparación de las mutaciones puntuales se confirmó por análisis de secuencia de ADN, y el inserto VL se clonó en el vector de expresión de cadena ligera pCMV-cK.

El ensamblaje de VH humanizada usando procedimientos basados en PCR produjo clones con deleciones burdas en la mitad 5' de la secuencia. Los esfuerzos adicionales por optimizar las condiciones de PCR tuvieron éxito parcial. Los clones ensamblados mediante condiciones de PCR optimizadas aún tenían deleciones de 10-20 nt en la región de mapeo que solapa los fragmentos A+B. Por consiguiente, se empleó una estrategia alternativa para el ensamblaje de VH utilizando extensión de solapamiento mediado por ADN polimerasa (T4, Klenow, y Secuenasa), seguido de ADN ligasa T4 para unir covalentemente los extremos solapantes. El análisis de secuencia de ADN de un subconjunto de los clones provocado por el ensamblaje de VH usando el último enfoque reveló mutaciones puntuales dispersadas y deleciones entre los clones. El análisis de unas dos docenas de clones reveló esencialmente el mismo patrón ilustrado para los clones. Los resultados similares observados después del ensamblaje de primer paso de los clones VH y VL sugieren que los errores en la secuencia de ADN observados estaban provocados por los errores del sintetizador automatizado durante la síntesis de los ADN largos empleados para el ensamblaje.

El clon de VH humanizada 2.7 se seleccionó para la reparación por mutagénesis dirigida al sitio de las 3 deleciones de nucleótidos que se observó que contenía.

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Ejemplo XIII Caracterización del Anticuerpo 3D6v2 Humanizado

Se creó una segunda versión de 3D6 humanizado que tiene cada una de las sustituciones indicadas para la versión 1, excepto para la sustitución D \rightarrow Y en el resto 1. La sustitución en este resto se realizó en la versión 1 porque el resto se identificó como un resto de interacción de CDR. Sin embargo, la sustitución delecionaba un resto que era raro para inmunoglobulinas humanas en esa posición. Por tanto, se creó una versión sin la sustitución. Además, se sustituyeron restos no de la línea germinal en las regiones flanqueantes de cadena pesada con restos de la línea germinal, concretamente, H74 = S, H77 = T y H89 = V. La numeración de Kabat para las cadenas ligera y pesada de la versión 2, es la misma que la representada en las Tablas 13 y 14, respectivamente, excepto que el resto 1 de la cadena ligera versión 2 es asp (D), el resto 74 de la cadena pesada es ser (S), el resto 77 de la cadena pesada es thr (T) y el resto 89 de la cadena pesada es val (V). La secuencia de nucleótidos de las cadenas ligera y pesada de 3D6 humanizado versión 1 se expone como las SEC ID Nº 34 y 36, respectivamente. La secuencia de nucleótidos de las cadenas ligera y pesada de 3D6 humanizado versión 2 se expone como las SEC ID Nº 35 y 37, respectivamente.

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Ejemplo IX Ensayo Funcional de Anticuerpos 3D6 Humanizados

Unión de 3D6v1 humanizado a A\beta agregado. Se realizó ensayo funcional de 3D6v1 humanizado usando medios condicionados de células COS trasnfectadas de forma transitoria. Las células se transfectaron con anticuerpo completamente quimérico, una mezcla de cadena pesada quimérica + cadena ligera humanizada, o cadena ligera quimérica + cadena pesada humanizada, y finalmente, anticuerpo completamente humanizado. El medio condicionado se ensayó para la unión a A\beta1-42 agregado por ensayo ELISA. El anticuerpo humanizado mostró buena actividad dentro del error experimental, y presentó propiedades de unión indistinguibles de la muestra de referencia de 3D6 quimérico. Los resultados se muestran en la Tabla 16.

TABLA 16

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Para comparar las afinidades de unión de los anticuerpos 3D6v1 y 3D6v2 humanizados, se realizó análisis ELISA usando A\beta agregado como antígeno. Los resultados muestran que tanto 3D6v1 (H1L1) como 3D6v2 (H2L2) tienen propiedades de unión a A\beta casi idénticas (Figura 5).

Análisis de NET de reemplazo (rNET) de h3D6v2. El ensayo de mapa de epítope rNET proporciona información acerca de la contribución de restos individuales dentro del epítope a la actividad de unión global del anticuerpo. El análisis de rNET usa análogos con una única sustitución sintetizados sistemáticamente. La unión de un anticuerpo que se está ensayando se determina frente al péptido nativo (antígeno nativo) y frente a 19 péptidos con una "única sustitución" alternativos, estando sustituido cada péptido en una primera posición con uno de los 19 aminoácidos no nativos para esa posición. Se genera un perfil que refleja el efecto de la sustitución en esa posición con los diversos restos no nativos. Así mismo se general perfiles en posiciones sucesivas a lo largo del péptido antigénico. El perfil combinado, o mapa de epítopes (que refleja la sustitución en cada posición con los 19 restos no nativos) después puede compararse con un mapa generado de forma similar para un segundo anticuerpo. Mapas sustancialmente similares o idénticos indican que los anticuerpos que se están comparando tienen la misma o similar especificidad de
epítope.

Este análisis se realizó para 3D6 y 3D6 humanizado, versión 2. Los anticuerpos se ensayaron para la unión frente al péptido A\beta nativo DAEFRHDSGY (SEC ID Nº 33). Los restos 1-8 se sustituyeron sistemáticamente con cada uno de los 19 restos no nativos para esa posición. Se generaron mapas de acuerdo a ello para 3D6 y h3D6v2. Los resultados se presentan en forma de tabla en la Tabla 17.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 17 A\beta: mapeo de Epítope Net de reemplazo (rNET) de wt3D6 y 3D6 humanizado

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Notablemente, los perfiles son casi idénticos para 3D6 y h3D6v2 cuando una mira las sustituciones en cada posición (es decir, los valores fluctúan de un modo idéntico cuando se comparan los datos de la columna 1 (3D6) frente a la columna 2 (h3D6v2). Estos datos demuestran que se conserva la especificidad de h3D6v2, ya que el mapa de epítope rNET de h3D6v2 es casi idéntico a m3D6 usando ambos restos de A\beta 1-4 y 5-8.

La inmunohistoquímica en secciones de cerebro PDAPP demuestra especificidad de anticuerpo h3D6v1. El anticuerpo 3D6v1 humanizado reconocía A\beta en secciones cerebrales preparadas en criostato de ratones PDAPP. 3D6v1 humanizado y PK1614 ambos se unieron a placas PDAPP en el mismo modo de respuesta a dosis, medido por la cantidad de fluorescencia (cuantificado en píxeles) por portaobjetos frente a la cantidad de anticuerpo usado APRA teñir el tejido (Figura 6). Se usaron anticuerpos secundarios anti-humano idénticos en el experimento. Los procedimientos de seccionamiento, tinción, y formación de imágenes se describieron previamente. En experimentos idénticos, el análisis de imágenes de tinción de h3D6v2 en secciones cerebrales PDAPP y AD reveló que h3D6v2 reconocen placas A\beta de una manera similar a 3D6v1 (por ejemplo, placas altamente cubiertas).

Análisis de unión competitiva de h3D6. Se midió la capacidad de anticuerpos h3D6 v1 y v2 de competir con 3D6 murino por ELISA usando un anticuerpo 3D6 biotinilado. El análisis de unión competitiva reveló que h3D6v1, h3D6v2, y PK1614 quimérico pueden todos competir con m3D6 por la unión a A\beta (Figura 7). h3D6v1 y h3D6v2 eran idénticos en su capacidad de competir con 3D6 por A\beta. Se usó el anticuerpo 10D5 como control negativo, ya que tienen un epítope de unión diferente a 3D6. El análisis BIAcore también reveló una elevada afinidad de h3D6v1 y h3D6v2 por A\beta (Tabla 18).

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TABLA 18 Medición de Afinidad de Anticuerpos contra A\beta Usando Tecnología BIAcore

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En comparación con 3D6, que tiene una Kd de 0,88 nM, tanto h3D6v1 como h3D6v2 tenían aproximadamente 2 a 3 veces menos afinidad de unión, medida a 2,06 nM y 2,24 nM para h3D6v1 y h3D6v2, respectivamente. El ensayo de unión competitiva por ELISA reveló aproximadamente 6 veces menos afinidad de unión para h3D6v1 y h3D6v2. Típicamente los anticuerpos humanizados pierden aproximadamente 3-4 veces de afinidad de unión en comparación con sus equivalentes murinos. Por lo tanto, una pérdida de aproximadamente 3 veces (promedio de resultados de ELISA BIAcore) para h3D6v1 y h3D6v2 está dentro del intervalo aceptado.

Ensayo ex vivo usando anticuerpo h3D6v2. La capacidad de h3D6v2 de estimular células microgliales se ensayó a través de un ensayo de fagocitosis ex vivo (Figura 8). h3D6v2 era tan eficaz como 3D6 quimérico en la inducción de fagocitosis de agregados de A\beta de tejido cerebral de ratón PDAPP. Se usó IgG como control negativo en este experimento porque es incapaz de unirse a A\beta y por lo tanto no puede inducir fagocitosis.

Localización cerebral in vivo de h3D6. Se inyectaron IV h3D6v2, m3D6, y anticuerpo DAE13 marcados con ^{125}I en 14 ratones PDAPP individuales en experimentos diferentes. Los ratones se sacrificaron después del Día 7 y se prefundieron para análisis adicional. Se diseccionaron sus regiones cerebrales y se midieron para la actividad ^{125}I en regiones cerebrales específicas. La actividad del radiomarcador en el cerebro se comparó con la actividad en muestras séricas. Los resultados se exponen en las Tablas 19 y 20, para suero y regiones cerebrales, respectivamente.

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TABLA 19

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TABLA 20

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Los datos muestran que h3D6v2 se localizaba en el cerebro, y estaba particularmente concentrado en la región del hipocampo donde se sabe que A\beta se agrega. Los recuentos cerebrales para m3D6 y DAE13 eran comparables con h3D6v2. Los tres anticuerpos eran capaces de cruzar la barrera hemato-encefálica como se demuestra por la unión a placas A\beta in vivo.

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Ejemplo X Clonación y Secuenciación de las Regiones Variables de 10D5 de Ratón

Clonación y Análisis de Secuencia de VH de 10D5. Se clonaron las regiones VH y VL de 10D5 de células de hibridoma por RT-PCR usando procedimientos 5' RACE. La secuencia de nucleótidos (SEC ID Nº 13) y la secuencia de aminoácidos deducida (SEC ID Nº 14) derivada de dos clones de ADNc independientes que codifican el supuesto dominio VL de 10D5, se exponen en la Tabla 21 y Figura 9. La secuencia de nucleótidos (SEC ID Nº 15) y la secuencia de aminoácidos deducida (SEC ID Nº 16) derivada de dos clones de ADNc independientes que codifican el supuesto dominio VH de 10D5, se exponen en la Tabla 22 y la Figura 10. Las secuencias de VL y VH de 10D5 cumplen los criterios para regiones V funcionales en cuanto a que no contienen un ORF contiguo desde la metionina iniciadora hasta la región C, y comparten restos conservados característicos de genes de la región V de inmunoglobulina.

TABLA 21 Secuencia de ADN de VL de 10D5 de ratón

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TABLA 22 Secuencia de ADN de VH de 10D5 de ratón

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Ejemplo XI Prevención y Tratamiento de Sujetos Humanos

Se realizó un ensayo en fase I de dosis única para determinar la seguridad en seres humanos. Se administra un agente terapéutico en dosificaciones crecientes a diferentes pacientes empezando a partir aproximadamente del nivel 0,01 de supuesta eficacia, y aumentándolas en un factor de tres hasta un nivel que alcance aproximadamente 10 veces la dosificación eficaz para ratones.

Se realiza un ensayo en fase II para determinar la eficacia terapéutica. Se seleccionan pacientes con enfermedad de Alzheimer de temprana a media definida usando los criterios de la Alzheimer's Disease and Related Disorders Association (ADRDA) para probable AD. Los pacientes adecuados puntúan en el intervalo de 12-26 en el Mini-Examen de Estado Mental (MMSE). Otros criterios de selección son que los pacientes tengan posibilidades de sobrevivir a la duración del estudio y carezcan de cuestiones complicadas tales como el uso de medicaciones concomitantes que puedan interferir. Se hacen evaluaciones iniciales de la función del paciente usando mediciones psicométricas clásicas, tales como el MMSE, y la ADAS, que es una escala comprehensiva para evaluar pacientes con estado y función de enfermedad de Alzheimer. Estas escales psicométricas proporcionan una medida del progreso de la enfermedad de Alzheimer. También pueden usarse escales de vida cualitativas adecuadas para controlar el tratamiento. El progreso de la enfermedad también puede controlarse por MRI. También pueden controlarse los perfiles sanguíneos de los pacientes incluyendo ensayos de respuestas de anticuerpos y células T específicas de inmunógeno.

Después de las mediciones iniciales, los pacientes comienzan a recibir el tratamiento. Se distribuyen aleatoriamente y se tratan con agente terapéutico o placebo de un modo ciego. Se controla a los pacientes al menos cada seis meses. La eficacia se determina por una reducción significativa en el progreso de un grupo de tratamiento con relación a un grupo de placebo.

Se realiza un segundo ensayo en fase II para evaluar la conversión de pacientes con pérdida de memoria temprana sin enfermedad de Alzheimer, a veces mencionada alteración de la memoria asociada a la edad (AAMI) o alteración cognitiva leve (MCI), en pacientes con enfermedad de Alzheimer probable definida según los criterios de la ADRDA. Los pacientes con elevado riesgo de conversión a enfermedad de Alzheimer se seleccionan entre una población no clínica explorando poblaciones de referencia para signos tempranos de pérdida de memoria u otras dificultades asociadas con la sintomatología pre-Alzheimer, una historia familiar de enfermedad de Alzheimer, factores de riesgo genéticos, edad, sexo, y otras características que se ha descubierto que predicen un elevado riesgo de enfermedad de Alzheimer. Se recogen lo valores iniciales en la métrica adecuada incluyendo el MMSE y la ADAS junto con otras métricas diseñadas para evaluar una población más normal. Estas poblaciones de pacientes se dividen en grupos adecuados con comparación de placebo frente a alternativas de dosificación con el agente. Se sigue a estas poblaciones de pacientes a intervalos de aproximadamente seis meses, y el criterio de valoración para cada paciente es si se convierte o no en paciente con probable enfermedad de Alzheimer definida por los criterios de la ADRDA al final de la observación.

Materiales Generales y Procedimientos A. Preparación de Anticuerpos Policlonales y Monoclonales contra A\beta

El anticuerpo policlonal anti-A\beta se preparó a partir de sangre recogida de dos grupos de animales. El primer grupo constaba de 100 ratones Swiss Webster hembra, de 6 a 8 semanas de edad. Se inmunizaron en los días 0, 15, y 29 con 100 mg de AN1792 combinado con CFA/IFA. Se les dio una cuarta inyección en el día 36 con la mitad de la dosis de AN 1792. Se extrajo la sangre de los animales después de su sacrificio en el día 42, se preparó el suero y se combinaron los sueros para crear un total de 64 ml. El segundo grupo constaba de 24 ratones hembra isogénicos con los ratones PDAPP pero no transgénicos para el gen APP humano, de 6 a 9 semanas de edad. Se inmunizaron en los días 0, 14, 28 y 56 con 100 mg de AN1792 combinado con CFA/IFA. También se extrajo la sangre de estos animales después de su sacrificio en el día 63, se preparó el suero y se combinaron para un total de 14 ml. Se combinaron los dos lotes de suero. La fracción de anticuerpo se purificó usando dos rondas secuenciales de precipitación con sulfato amónico saturado al 50%. El precipitado final se dializó frente a PBS y se ensayó para endotoxinas. El nivel de endotoxinas era menor de 1 EU/mg.

Los anticuerpos monoclonales anti-A\beta se prepararon a partir de fluido ascítico. Primero se deslipidó el fluido por la adición de dextrano sulfato sódico concentrado a fluido ascítico enfriado en hielo agitando en hielo hasta alcanzar una concentración final del 0,238%. Después se añadió CaCl_{2} concentrado con agitación hasta alcanzar una concentración final de 64 mM. Esta solución se centrifugó a 10.000 x g y se desechó el sedimento. El sobrenadante se agitó en hielo con un volumen igual de sulfato amónico saturado añadido gota a gota. La solución se centrifugó de nuevo a 10.000 x g y se desechó el sobrenadante. El sedimento se resuspendió y se dializó frente a Tris-HCl 20 mM, NaCl 0,4 M, pH 7,5. Esta fracción se aplicó a una columna de FPLC de Sepharose Q de Pharmacia y se eluyó con un gradiente inverso de NaCl de 0,4 M a 0,275 M en Tris-HCl 20 mM, pH 7,5.

Se identificó el pico de anticuerpo por absorbancia a 280 nm y se combinaron las fracciones apropiadas. La preparación de anticuerpo purificada se caracterizó midiendo la concentración de proteínas usando el procedimiento BCA y la pureza usando SDS-PAGE. La combinación también se ensayó para endotoxinas. El nivel de endotoxina era menor de 1 EU/mg. Títulos, a títulos menores de 100 se les asignó arbitrariamente un valor de titulación de 25.

B. Medición de Títulos de Anticuerpos

Se extrajo sangre de los ratones haciendo un pequeño corte en la vena de la cola y recogiendo aproximadamente 200 ml de sangre en un tubo de microfuga. Se extrajo sangre de cobayas afeitando primero el área del codillo trasero y después usando una aguja de calibre 18 para cortar la vena metatarsiana y recogiendo la sangre en tubos de microfuga. Se dejó que la sangre coagulara durante una h a temperatura ambiente (TA), se agitó con vórtice, después se centrifugó a 14.000 x g durante 10 min para separar el coágulo del suero. Después se transfirió el suero a un tubo de microfuga limpio y se almacenó a 4ºC hasta que se tituló.

Los títulos de anticuerpo se midieron por ELISA. Se revistieron placas de microtitulación de 96 pocillos (placas de EIA Costar) con 100 ml de una solución que contenía 10 mg/ml de A\beta42 o SAPP u otros antígenos indicados en cada uno de los informes individuales en Tampón de Revestimiento de Pocillos (fosfato sódico 0,1 M, pH 8,5, azida sódica al 0,1%) y se mantuvieron durante una noche a TA. Los pocillos se aspiraron y se añadieron los sueros a los pocillos comenzando a una dilución 1/100 en Diluyente de Muestra (fosfato sódico 0,014 M, pH 7,4, NaCl 0,15 M, albúmina de suero bovino al 0,6%, timerosal al 0,05%). Se hicieron siete diluciones seriadas de las muestras directamente en las placas en etapas de factor tres hasta alcanzar una dilución final de 1/218.700. Las diluciones se incubaron en los pocillos de la placa revestida durante una h a TA. Las placas después se lavaron cuatro veces con PBS que contenía Tween 20 al 0,05%. El segundo anticuerpo, uno de cabra anti-Ig de ratón conjugado con peroxidasa de rábano rusticano (obtenido de Boehringer Mannheim), se añadió a los pocillos como 100 \mul de una dilución 1/3000 en Diluyente de Muestra y se incubó durante una h a TA. Las placas se lavaron de nuevo cuatro veces en PBS, Tween 20. Para revelar el cromogen, se añadieron 100 \mul de Slow TMB (3,3',5,5'-tetrametil benzidina obtenida de Pierce Chemicals) a cada pocillo y se incubaron durante 15 min a TA. La reacción se detuvo por la adición de 25 \mul de H_{2}SO_{4} 2 M. Después se leyó la intensidad del color en un Molecular Devices Vmax a (450 nm-650 nm).

Los títulos se definieron como el recíproco de la dilución de suero que da la mitad de la DO máxima. La DO máxima generalmente se tomó a partir de una dilución inicial 1/100, excepto en casos con títulos muy elevados, en cuyo caso era necesaria una dilución inicial más elevada para establecer la DO máxima. Si el punto del 50% estaba entre dos diluciones, se hacía una extrapolación lineal para calcular el título final. Para calcular la media geométrica de los títulos de anticuerpo, a los títulos menores de 100 se les asignaba arbitrariamente un valor de título de 25.

C. Preparación de Tejido Cerebral

Después de la eutanasia, se retiraron los cerebros y se preparó un hemisferio para el análisis inmunohistoquímico, mientras que se diseccionaron tres regiones cerebrales (hipocampo, corteza y cerebelo) del otro hemisferio y se usaron para medir la concentración de diversas proteínas A\beta y formas de APP usando ensayos ELISA específicos (Johnson-Wood y col., supra).

Los tejidos destinados para los ensayos ELISA se homogeneizaron en 10 volúmenes de tampón guanidina enfriado en hielo (guanidina-HCl 5,0 M, Tris-HCl 50 mM, pH 8,0). Los homogeneizados se mezclaron por agitación suave usando un Adams Nutator (Fisher) durante tres a cuatro h a TA, después se almacenaron a -20ºC antes de la cuantificación de A\beta y APP. Experimentos previos han demostrado que los analitos eran estables en estas condiciones de almacenamiento, y que la proteína A\beta sintética (Bachem) podía recuperarse cuantitativamente cuando estaba en adiciones en homogeneizados de tejido cerebral de control de crías de ratón de la misma camada (Johnson-Wood y col., supra).

D. Medición de los Niveles de A\beta

Los homogeneizados cerebrales se diluyeron 1:10 con Diluyente de Caseína (caseína al 0,25%, PBS, azida sódica al 0,05%, 20 \mug/ml de aprotinina, EDTA 5 mM pH 8,0, 10 \mug/ml leupeptina) enfriado en hielo y después se centrifugaron a 16.000 x g durante 20 min a 4ºC. Los patrones de proteína A\beta sintética (1-42 aminoácidos) y los patrones de APP se prepararon para que incluyeran guanidina 0,5 M, y albúmina de suero bovino (BSA) al 0,1% en la composición final. El ensayo ELISA tipo sándwich de A\beta "total" utiliza el anticuerpo monoclonal 266, específico para los aminoácidos 13-28 de A\beta (Seubert y col., supra), como anticuerpo de captura, y anticuerpo monoclonal 3D6 biotinilado, específico para los aminoácidos 1-5 de A\beta (Johnson-Wood y col., supra), como anticuerpo informador. El anticuerpo monoclonal 3D6 no reconoce APP secretada o APP de longitud completa, sino que detecta solamente las especies de A\beta con un ácido aspártico amino-terminal. Este ensayo tiene un límite inferior de sensibilidad de \sim50 ng/ml (11 nM) y no muestra reactividad cruzada con la proteína A\beta murina endógena a concentraciones de hasta 1 ng/ml (Johnson-Wood y col., supra).

El ensayo ELISA tipo sándwich específico de A\beta1-42 emplea mAb 21F12, específico para los aminoácidos 33-42 de A\beta (Johnson-Wood, y col., supra), como anticuerpo de captura. El mAb 3D6 biotinilado también es el anticuerpo informador en este ensayo que tiene un límite inferior de sensibilidad de aproximadamente 125 \mug/ml (28 \muM, Johnson-Wood y col., supra). Para los ensayos ELISA de A\beta, se revistieron 100 \mul de mAb 266 (a 10 \mug/ml) o mAb 21F12 (a 5 \mug/ml) en los pocillos de placas de inmunoensayo de 96 pocillos (Costar) por incubación durante una noche a TA. La solución se retiró por aspiración y los pocillos se bloquearon por la adición de 200 \mul de albúmina de suero humano al 0,25% en tampón PBS durante al menos 1 h a TA. Se retiró la solución de bloqueo y las placas se almacenaron desecadas a 4ºC hasta que se usaron. Las placas se rehidrataron con Tampón de Lavado [solución salina tamponada con Tris (NaCl 0,15 M, Tris-HCl 0,01 M, pH 7,5), más Tween 20 al 0,05%] antes de su uso. Las muestras y los patrones se añadieron en alícuotas triplicadas de 100 \mul por pocillo y después se incubaron durante una noche a 4ºC. Las placas se lavaron al menos tres veces con Tampón de Lavado entre cada etapa del ensayo. El mAb 3D6 biotinilado, diluido a 0,5 \mug/ml en Tampón de Ensayo de Caseína (caseína al 0,25%, PBS, Tween 20 al 0,05%, pH 7,4), se añadió y se incubó en los pocillos durante 1 h a TA. Se añadió un conjugado de avidina-peroxidasa de rábano rusticano (Avidina-HRP obtenido de Vector, Burlingame, CA), diluido 1:4000 en Tampón de Ensayo de Caseína, a los pocillos durante 1 h a TA. Se añadió el sustrato colorimétrico, Slow TMB-ELISA (Pierce), y se dejó reaccionar durante 15 minutos a TA, después de lo cual se detuvo la reacción enzimática por la adición de 25 \mul de H2SO4 2 N. El producto de reacción se cuantificó usando un Molecular Devices Vmax que mide la diferencia en la absorbancia a 450 nm y 650 nm.

E. Medición de los Niveles de APP

Se utilizaron dos ensayos de APP diferentes. El primero, llamado APP-\alpha/FL, reconoce las formas tanto APP-alfa (a) como de longitud completa (FL) de APP. El segundo ensayo es específico para APP-\alpha. El ensayo APP-\alpha/FL reconoce APP secretada incluyendo los primeros 12 aminoácidos de A\beta. Como el anticuerpo informador (2H3) no es específico del sitio gancho-\alpha, que existe entre los aminoácidos 612-613 de APP^{695} (Esch y col., Science 248:1122-1124 (1990)); este ensayo solo reconoce APP de longitud completa (APP-FL). Experimentos preliminares usando anticuerpos contra APP inmovilizados a la cola citoplasmática de APP-FL para eliminar los homogeneizados cerebrales de APP-FL sugieren que aproximadamente el 30-40% de APP-\alpha/FL APP es FL (datos no mostrados). El anticuerpo de captura para los ensayos tanto APP-\alpha/FL como APP-\alpha es mAb 8E5, producido contra los aminoácidos 444 a 592 de la forma APP^{695} (Games y col., supra). El mAb informador para el ensayo APP-\alpha/FL es mAb 2H3, específico para los aminoácidos 597-608 DE APP^{695} (Johnson-Wood y col., supra) y el anticuerpo informador para el ensayo APP-\alpha es un derivado biotinilado de mAb 16H9, producido contra los aminoácidos 605 a 611 de APP. El límite inferior de sensibilidad del ensayo APP-\alpha/FL es aproximadamente 11 ng/ml (150 pM) (Johnson-Wood y col.) y el del ensayo específico de APP-\alpha es 22 ng/ml (0,3 nM). Para ambos ensayos de APP, se revistió mAb 8E5 sobre los pocillos de placas EIA de 96 pocillos como se ha descrito anteriormente para mAb 266. Se usó APP-\alpha secretada recombinante, purificada como patrón de referencia para el ensayo APP-\alpha y el ensayo APP-\alpha/FL (Esch y col., supra). Las muestras de homogeneizado cerebral en guanidina 5 M se diluyeron 1:10 en Diluyente de Muestra ELISA (tampón fosfato 0,014 M, pH 7,4, albúmina de suero bovino al 0,6%, timerosal al 0,05%, NaCl 0,5 M, NP40 al 0,1%). Después se diluyeron 1:4 en Diluyente de Muestra que contenía guanidina 0,5 M. Los homogeneizados diluidos después se centrifugaron a 16.000 x g durante 15 segundos a TA. Los patrones de APP y las muestras se añadieron a la placa en alícuotas duplicadas y se incubaron durante 1,5 h a TA. El anticuerpo informador 2H3 o 16H9 biotinilado se incubó con las muestras durante 1 h a TA. Se incubó estreptavidina-fosfatasa alcalina (Boehringer Mannheim), diluida 1:1000 en diluyente de muestra, en los pocillos durante 1 h a TA. Se añadió el sustrato fluorescente 4-metil-umbeliferil-fosfato para una incubación a TA de 30 min y las placas se leyeron en un fluorímetro Cytofluor tm 2350 (Millipore) a 365 nm de excitación y 450 nm de emisión.

F. Inmunohistoquímica

Los cerebros se fijaron durante tres días a 40ºC en paraformaldehído al 4% en PBS y después se almacenaron de uno a siete días a 4ºC en paraformaldehído al 1%, PBS hasta que se seccionaron. Se cortaron secciones en forma de corona de cuarenta micrómetros de grosor en un vibratome a TA y se almacenaron en crioconservante (glicerol al 30%, etilenglicol al 30% en tampón fosfato) a -20ºC antes del procesamiento inmunohistoquímico. Para cada cerebro, se incubaron seis secciones al nivel del hipocampo dorsal, cada una separada por intervalos consecutivos de 240 mm, durante una noche con uno de los siguientes anticuerpos: (1) uno anti-A\beta biotinilado (mAb, 3D6, específico para A\beta humana) diluido a una concentración de 2 mg/ml en PBS y suero de caballo al 1%; o (2) un mAb biotinilado específico para APP humana, 8E5, diluido a una concentración de 3 mg/ml en PBS y suero de caballo al 1,0%; o (3) un mAb específico para la proteína ácida fibrilar glial (GFAP; Sigma Chemical Co.) diluido 1:500 con Triton X-100 al 0,25% y suero de caballo al 1%, en solución salina tamponada con Tris, pH 7,4 (TBS); o (4) un mAb específico para CD11b, el antígeno MAC-1, (Chemicon International) diluido 1:100 con Triton X-100 al 0,25% y suero de conejo al 1% en TBS; o (5) un mAb específico para el antígeno MHC II, (Pharmingen) diluido 1:100 con Triton X-100 al 0,25% y suero de conejo al 1% en TBS; o (6) un mAb de rata específico para CD 43 (Pharmingen) diluido 1:100 con suero de conejo al 1% en PBS o (7) un mAb de rata específico para CD 45RA (Pharmingen) diluido 1:100 con suero de conejo al 1% en PBS; o (8) un Ab monoclonal de rata específico para CD 45RB (Pharmingen) diluido 1:100 con suero de conejo al 1% en PBS; o (9) un Ab monoclonal de rata específico para CD 45 (Pharmingen) diluido 1:100 con suero de conejo al 1% en PBS; o (10) un Ab policlonal de hámster biotinilado específico para CD3e (Pharmingen) diluido 1:100 con suero de conejo al 1% en PBS o (11) un mAb de rata específico para CD3 (Serotec) diluido 1:200 con suero de conejo al 1% en PBS; o con (12) una solución de PBS que carece de anticuerpo primario que contiene suero de caballo normal al 1%.

Las secciones que reaccionaron con las soluciones de anticuerpo enumeradas en 1,2 y 6-12 anteriores se pretrataron con Triton X-100 al 1,0%, peróxido de hidrógeno al 0,4% en PBS durante 20 min a TA para bloquear la peroxidasa endógena. A continuación se incubaron durante una noche a 4ºC con anticuerpo primario. Las secciones que reaccionaron con los mAb 3D6 o 8E5 o CD3e después se hicieron reaccionar durante una h a TA con un complejo de peroxidasa de rábano rusticano-avidina-biotina con los componentes del kit "A" y "B" diluidos 1:75 en PBS (Vector Elite Standard Kit, Vector Labs, Burlingame, CA.). Las secciones que reaccionaron con anticuerpos específicos para CD 45RA, CD 45RB, CD45, CD3 y la solución de PBS desprovista de anticuerpo primario se incubaron durante 1 hora a TA con anticuerpo anti-IgG de rata biotinilado (Vector) diluido 1:75 en PBS o anticuerpo anti-IgG de ratón biotinilado (Vector) diluido 1:75 en PBS, respectivamente. Las secciones después se hicieron reaccionar durante una h a TA con un complejo de peroxidasa de rábano rusticano-avidina-biotina con los componentes del kit "A" y "B" diluidos 1:75 en PBS (Vector Elite Standard Kit, Vector Labs, Burlingame, CA.).

Las secciones se revelaron en peróxido de hidrógeno al 0,01%, 3,3'-diaminobenzidina (DAB) al 0,05% a TA. Las secciones destinadas para incubación con los anticuerpos específicos para GFAP, MAC-1 y MHC II se pretrataron con peróxido de hidrógeno al 0,6% a TA para bloquear la peroxidasa endógena, después se incubaron durante una noche con el anticuerpo primario a 4ºC. Las secciones que reaccionaron con el anticuerpo contra GFAP se incubaron durante 1 h a TA con anticuerpo anti-IgG de ratón biotinilado creado en caballo (Vector Laboratories; Vectastain Elite ABC Kit) diluido 1:200 con TBS. Las secciones a continuación se hicieron reaccionar durante una h con un complejo de avidina-biotina-peroxidasa (Vector Laboratories; Vectastain Elite ABC Kit) diluido 1:1000 con TBS. Las secciones incubadas con el monoclonal anticuerpo específico para MAC-1 o MHC II como anticuerpo primario se hicieron reaccionar posteriormente durante 1 h a TA con anticuerpo anti-IgG de rata biotinilado creado en conejo diluido 1:200 con TBS, seguido de incubación durante una h con complejo de avidina-biotina-peroxidasa diluido 1:1000 con TBS. Las secciones incubadas con anticuerpos específicos para GFAP, MAC-1 y MHC II después se visualizaron por tratamiento a TA con DAB al 0,05%, peróxido de hidrógeno al 0,01%, cloruro de níquel al 0,04%, TBS durante 4 y 11 min, respectivamente.

Las secciones inmunomarcadas se montaron en portaobjetos de vidrio (VWR, portaobjetos Superfrost), se secaron al aire durante una noche, se sumergieron en Propar (Anatech) y se recubrieron con cubreobjetos usando Permount (Fisher) como medio de montaje.

Para teñir con contraste las placas A\beta, se montó un subconjunto de las secciones GFAP-positivas en portaobjetos Superfrost y se incubaron en Tioflavina S al 1% acuosa (Sigma) durante 7 min siguiendo el procesamiento inmunohistoquímico. Las secciones después se deshidrataron y aclararon en Propar, después se recubrieron con cubreobjetos montados con Permount.

G. Análisis de Imágenes

Se usó un Sistema de Análisis de Imágenes Videometric 150 (Oncor, Inc., Gaithersburg, MD) conectado a un microscopio Nikon Microphot-FX a través de una videocámara CCD y un monitor Sony Trinitron para la cuantificación de los portaobjetos inmunorreactivos. La imagen de la sección se almacenó en una memoria de video y se determinó el umbral basado en el color y la saturación para seleccionar y calcular al área de píxeles total ocupada por las estructuras inmunomarcadas. Para cada sección, se contorneó manualmente el hipocampo y se calculó el área de píxeles total ocupada por el hipocampo. El porcentaje de carga amiloide se midió como: (la fracción del área del hipocampo que contiene depósitos A\beta inmunorreactivos con mAb 3D6) x 100. Asimismo, el porcentaje de carga neurítica se midió como: (la fracción del área del hipocampo que contiene neuritas distróficas reactivas con anticuerpo monoclonal 8E5) x 100. El C-Imaging System (Compix, Inc., Cranberry Township, PA) que hace funcionar el programa Simple 32 Software Application estaba conectado a un microscopio Nikon Microphot-FX a través de un cámara Optronics y se usó para cuantificar el porcentaje de la corteza retrosplenial ocupada por astrocitos GFAP-positivos y microglía MAC-1 y MHC II-positiva. La imagen de la sección que ha inmunorreaccionado se almacenó en una memoria de video y se determinó el umbral basado en monocromía para seleccionar y calcular el área de píxeles total ocupada por las células inmunomarcadas. Para cada sección, se contorneó manualmente la corteza retrosplenial (RSC) y se calculó el área de píxeles total ocupada por la RSC. El porcentaje de astrocitosis se definió como: (la fracción de la RSC ocupada por astrocitos GFAP-reactivos) x 100. Asimismo, el porcentaje de microgliosis se definió como: (la fracción de la RSC ocupada por microglía MAC-1 o MHC II-reactiva) x 100. Para todos los análisis de imágenes, se cuantificaron seis secciones al nivel del hipocampo dorsal cada una separada por intervalos consecutivos de 240 mm, para cada animal. En todos los casos, el estado de tratamiento de los animales era desconocido para el observador.

Aunque la anterior invención se ha descrito para todos los propósitos de claridad de entendimiento, será obvio que pueden practicarse ciertas modificaciones.

A partir de lo anterior será evidente que la invención proporciona varios usos. Por ejemplo, la invención proporciona el uso de cualquiera de los anticuerpos contra A\beta descritos anteriormente en el tratamiento, profilaxis o diagnóstico de enfermedad amiloidogénica, o en la fabricación de un medicamento o composición de diagnóstico para su uso en la misma.

<110> Neuralab Limited

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<120> Anticuerpos Humanizados que Reconocen el Péptido Beta-Amiloide

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<130> ELN-002PC

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<150> 60/251.892

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<151> 06-12-2000

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<160> 63

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<170> FastSEQ para Windows Versión 4.0

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<210> 1

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<211> 396

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<212> ADN

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<213> Mus musculus

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<220>

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<221> CDS

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<222> (1)...(396)

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<221> péptido_señal

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<222> (1)...(60)

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<400> 1

49

490

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<210> 2

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<211> 132

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<212> PRT

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<213> Mus musculus

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<220>

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<221> SEÑAL

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<221> (1)...(20)

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<400> 2

50

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<210> 3

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<211> 414

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<212> ADN

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<213> Mus musculus

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<220>

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<221> CDS

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<222> (1)...(414)

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<221> péptido_señal

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<222> (1)...(57)

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<400> 3

51

52

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<210> 4

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<211> 138

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<212> PRT

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<213> Mus musculus

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<220>

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<221> SEÑAL

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<222> (1)...(19)

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<400> 4

53

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<210> 5

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<211> 132

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<221> SEÑAL

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<222> (1)...(20)

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<223> región variable de cadena ligera de 3D6 humanizada

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<400> 5

54

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<210> 6

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<211> 125

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<220>

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<221> SEÑAL

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<222> (1)...(19)

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<400> 6

55

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<210> 7

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<211> 100

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 7

56

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<210> 8

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<211> 138

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> región variable de cadena pesada de 3D6 humanizada

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<221> SEÑAL

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<222> (1)...(19)

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<400> 8

57

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<210> 9

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<211> 121

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 9

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58

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<210> 10

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<211> 98

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 10

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59

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<210> 11

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<211> 132

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> SEÑAL

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)...(20)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<223> región variable de cadena ligera de 3D6 humanizada

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

\vskip1.000000\baselineskip

60

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 138

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> región variable de cadena pesada de 3D6 humanizada

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<221> SEÑAL

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)...(19)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

\vskip1.000000\baselineskip

61

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 393

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)...(393)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<221> péptido_señal

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)...(57)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

\vskip1.000000\baselineskip

62

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 131

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> SEÑAL

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)...(19)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

\vskip1.000000\baselineskip

63

630

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 426

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)...(426)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<221> péptido_señal

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)...(57)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 15

\vskip1.000000\baselineskip

64

640

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 142

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> SEÑAL

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)...(19)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 16

\vskip1.000000\baselineskip

65

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 136

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 17

\vskip1.000000\baselineskip

66

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 131

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 18

\vskip1.000000\baselineskip

67

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 146

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 19

\vskip1.000000\baselineskip

68

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 142

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 20

\vskip1.000000\baselineskip

69

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 21

\hskip1cm

70

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 22

\hskip1cm

71

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 138

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 23

\vskip1.000000\baselineskip

72

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 135

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 24

\vskip1.000000\baselineskip

73

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 142

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 25

\vskip1.000000\baselineskip

74

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 144

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 26

\vskip1.000000\baselineskip

75

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 27

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

76

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 28

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

77

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 29

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

78

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 30

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

79

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 31

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

80

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 32

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

81

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> péptido interno

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 33

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

82

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 402

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> VL versión 1 de h3D6

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 34

83

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 402

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> VL versión 2 de h3D6

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 35

84

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 414

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> VH versión 1 de h3D6

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 36

85

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 414

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> VH versión 2 de h3D6

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 37

86

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 38

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 770

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 38

87

88

89

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 39

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebadores

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 39

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

90

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 40

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebadores

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 40

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

91

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 41

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebadores

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 41

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

92

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebadores

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 42

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

93

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebadores

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 43

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

94

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 44

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebadores

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 44

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

95

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 45

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebadores

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 45

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

96

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 46

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

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<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebadores

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 46

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

97

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 47

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebadores

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 47

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

98

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 48

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebadores

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 48

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

99

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 49

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebadores

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 49

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

100

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 50

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebadores

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 50

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

101

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 51

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebadores

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 51

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

102

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 52

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebadores

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 52

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

103

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 53

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebadores

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 53

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

104

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 54

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebadores

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 54

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

105

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 55

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebadores

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 55

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

106

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 56

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebadores

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 56

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

107

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 57

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebadores

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 57

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

108

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 58

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebadores

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 58

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

109

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 59

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebadores

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 59

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

110

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 60

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebadores

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 60

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

111

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 61

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebadores

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 61

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

112

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 62

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebadores

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 62

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

113

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 63

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebadores

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 63

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

114

Claims (20)

1. Una inmunoglobulina humanizada que se une específicamente al péptido beta amiloide (A\beta), o fragmento de unión a antígeno de la misma, comprendiendo la inmunoglobulina humanizada o fragmento de unión a antígeno:

(i) una región variable de cadena ligera que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR) y los restos flanqueantes de cadena ligera variable L2, L36 y L46 (convención de numeración de Kabat) de la secuencia de la región variable de cadena ligera de la inmunoglobulina 3D6 expuesta como SEC ID Nº 2, en la que el resto de la región variable de cadena ligera es de una cadena ligera de inmunoglobulina aceptora humana seleccionada entre el grupo constituido por Kabat ID 019230, Kabat ID 005131, Kabat ID 005058, Kabat ID 005057, Kabat ID 005059, Kabat ID U21040 y Kabat ID U41645; y

(ii) una región variable de cadena pesada que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR) y los restos flanqueantes de cadena pesada de la región variable H49, H93 y H94 (convención de numeración de Kabat) de la secuencia de la región variable de cadena pesada de la inmunoglobulina 3D6 expuesta como SEC ID Nº 4 y los restos flanqueantes de cadena pesada de la región variable H74, H77 y H89 de la secuencia de la línea germinal humana VH3-23, en la que el resto de la región variable de cadena pesada es de una cadena pesada de inmunoglobulina aceptora humana seleccionada entre el grupo constituido por Kabat ID 045919, Kabat ID 000459, Kabat ID 000553, Kabat ID 000386 y Kabat ID M23691.

2. La inmunoglobulina humanizada o fragmento de unión a antígeno de la reivindicación 1, en la que las CDR de cadena ligera se exponen de la siguiente manera:

CDR1 de cadena ligera:

Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn (restos 24-39 de la SEC ID Nº 2);

\vskip1.000000\baselineskip

CDR2 de cadena ligera:

Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser (restos 55-61 de la SEC ID Nº 2); y

\vskip1.000000\baselineskip

CDR3 de cadena ligera:

Trp Gln Gly Thr His Phe Pro Arg Thr (restos 94-102 de la SEC ID Nº 2).

\vskip1.000000\baselineskip

3. La inmunoglobulina humanizada o fragmento de unión a antígeno de la reivindicación 1 ó 2, en la que las CDR de cadena pesada se exponen de la siguiente manera:

CDR1 de cadena pesada:

Asn Tyr Gly Met Ser (restos 31-35 de la SEC ID Nº 4);

\vskip1.000000\baselineskip

CDR2 de cadena pesada:

Ser Ile Arg Ser Gly Gly Gly Arg Thr Tyr Tyr Ser Asp Asn Val Lys Gly (restos 50-66 de la SEC ID Nº 4); y

\vskip1.000000\baselineskip

CDR3 de cadena pesada:

Tyr Asp His Tyr Ser Gly Ser Ser Asp Tyr (restos 99-108 de la SEC ID Nº 4).

\vskip1.000000\baselineskip

4. La inmunoglobulina humanizada o fragmento de unión a antígeno de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que la cadena ligera aceptora humana es Kabat ID 019230.

5. La inmunoglobulina humanizada o fragmento de unión a antígeno de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que la cadena pesada aceptora humana es Kabat ID 045919.

6. La inmunoglobulina humanizada o fragmento de unión a antígeno de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que (i) se une tanto al péptido beta amiloide (A\beta) soluble como a A\beta agregado; (ii) media la fagocitosis del péptido beta amiloide (A\beta); (iii) cruza la barrera hemato-encefálica en un sujeto; o (iv) reduce la carga de péptido beta amiloide (A\beta) en un sujeto.

7. La inmunoglobulina humanizada o fragmento de unión a antígeno de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que la secuencia de la región variable de cadena pesada es como se expone en los restos 1-119 de la SEC ID Nº 12.

8. La inmunoglobulina humanizada o fragmento de unión a antígeno de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que la secuencia de la región variable de cadena ligera es como se expone en los restos 1-112 de la SEC ID Nº 11.

9. La inmunoglobulina humanizada o fragmento de unión a antígeno de la reivindicación 1, en la que la secuencia de la región variable de cadena ligera es como se expone en los restos 1-112 de la SEC ID Nº 11 y la secuencia de la región variable de cadena pesada es como se expone en los restos 1-119 de la SEC ID Nº 12.

10. La inmunoglobulina humanizada o fragmento de unión a antígeno de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que la inmunoglobulina humanizada o fragmento de unión a antígeno tiene una región constante derivada de IgG1 humana o IgG4 humana.

11. El fragmento de unión a antígeno de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dicho fragmento de unión a antígeno es un fragmento Fab, Fab', Fabc, Fv, F(ab')2, o un anticuerpo de cadena sencilla.

12. Una composición farmacéutica que comprende la inmunoglobulina o fragmento de unión a antígeno de las reivindicaciones 1-11 y un vehículo farmacéutico.

13. La inmunoglobulina humanizada de las reivindicaciones 1-11 para su uso como un medicamento.

14. El uso de una dosificación eficaz de inmunoglobulina humanizada o fragmento de unión a antígeno de las reivindicaciones 1-11 en la fabricación de un medicamento para la prevención o tratamiento de una enfermedad amiloidogénica en un paciente.

15. El uso de la reivindicación 14, en el que la enfermedad amiloidogénica es la enfermedad de Alzheimer.

16. El uso de la reivindicación 14 o reivindicación 15, en el que la dosificación eficaz es (i) de 0,01 mg/kg de peso corporal a 5 mg/kg de peso corporal; (ii) aproximadamente 1 mg/kg de peso corporal; (iii) de 1 mg/kg a 10 mg/kg de peso corporal; o (iv) aproximadamente 10 mg/kg de peso corporal.

17. El uso de las reivindicaciones 14-16, en el que la inmunoglobulina es para su administración en múltiples dosificaciones a un intervalo de dosificación de aproximadamente dos semanas, aproximadamente un mes, de 3 a 6 meses, o aproximadamente 1 año.

18. Una molécula de ácido nucleico aislada que codifica la inmunoglobulina o fragmento de unión a antígeno de las reivindicaciones 1-11.

19. Una molécula de ácido nucleico aislada de la reivindicación 18, en la que dicha molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos expuesta en la SEC ID Nº 35 y la SEC ID Nº 37.

20. Un vector que comprende la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 18 o reivindicación 19.