PL211761B1

PL211761B1 - Humanizowana immunoglobulina, która specyficznie wiąże się z peptydem ß-amyloidu (A ß), oraz jej fragment wiążący antygen, zawierająca je kompozycja farmaceutyczna i ich zastosowanie oraz kodująca je wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego i wektor zawierający tę cząsteczkę

Info

Publication number: PL211761B1
Application number: PL366341A
Authority: PL
Inventors: Guriq Basi; Jose Saldanha
Original assignee: Elan Pharma Int Ltd; Wyeth Corp
Priority date: 2000-12-06
Filing date: 2001-12-06
Publication date: 2012-06-29
Also published as: JP4944149B2; DE60136651D1; EA011450B1; CN101081869A; EA010469B1; TWI255272B; PL366341A1; BG107850A; KR20030066695A; EA200300637A1; NO339290B1; EP1358213B1; UA87093C2; HK1070904A1; KR100996936B1; CA2430772C; WO2002046237A3; ECSP034685A; BR0115978A; CN101081868A

Description

Przedmiotem wynalazku jest humanizowana immunoglobulina, która specyficznie wiąże się z peptydem β-amyloidu (Αβ), oraz jej fragment wiążący antygen, zawierająca je kompozycja farmaceutyczna i ich zastosowanie. Przedmiotem wynalazku jest również wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego kodująca tę immunoglobulinę lub jej fragment oraz wektor zawierający tę cząsteczkę.

Tło wynalazku

Choroba Alzheimera (AD) jest postępującą chorobą prowadzącą do otępienia starczego. Patrz ogólnie Selkoe, TINS 16: 403 (1993); Hardy i inni, WO 92/13069; Selkoe, R Neuropathol. Exp. Neurol. 53: 438 (1994); Duff i inni. Nature 373: 476 (1995); Games i inni. Nature 373: 523 (1995). Ogólnie choroba dzieli się na dwie kategorie: z późnym początkiem, występującym w starszym wieku (ponad 65 lat) i z wczesnym początkiem, rozwijającym się znacznie przed okresem starczym, czyli w wieku 35-60 lat. W obydwu typach choroby patologia jest taka sama, ale nieprawidłowości wydają się być ostrzejsze i bardziej rozprzestrzenione w przypadku wystąpienia choroby w młodszym wieku. Choroba charakteryzuje się najmniej dwoma typami uszkodzeń w mózgu, neurofibylarnymi splotami i płytkami starczymi. Sploty neurofibylarne stanowią wewnątrzkomórkowe złogi związanego z mikrotubulami białka tau, składającego się z dwóch włókien skręconych wokół siebie w pary. Płytki starcze (czyli płytki amyloidowe) stanowią obszary zdezorganizowanego neutropilu o szerokości do 150 gm, z pozakomórkowymi złogami amyloidowymi w środku, widoczne podczas mikroskopowej analizy skrawków tkanki mózgowej. Nagromadzanie się płytek amyloidowych w mózgu jest również związane z zespołem Downa i innymi zaburzeniami funkcji poznawczych.

Podstawowym składnikiem płytek jest peptyd określany jako Aβ lub peptyd β-amyloidu. Peptyd Αβ jest wewnętrznym fragmentem 39-43 aminokwasowym o 4 kDa większego przezbłonowego białka nazywanego glikoproteiną, określanego jako białko prekursorowe amyloidu (APP). W wyniku obróbki proteolitycznej APP przez różne enzymy sekretazowe, Aβ występuje przede wszystkim w krótkiej formie o długości 40 aminokwasów oraz w długiej formie, o długości w zakresie 42-43 aminokwasów. Część hydrofobowej domeny przezbłonowej APP znajduje się na końcu karboksylowym Aβ i może odpowiadać za zdolność Aβ do agregacji w płytki, zwłaszcza w przypadku długiej formy. Nagromadzanie się płytek amyloidowych w mózgu prowadzi ostatecznie do śmierci komórek neuronalnych. Fizyczne objawy związane z tego typu degradacją nerwów charakteryzują chorobę Alzheimera.

Szereg mutacji w białku APP powiązano z występowaniem choroby Alzheimera. Patrz np. Go717 ate i inni, Nature 349: 704) (1991) (walina⁷¹⁷ na izoleucynę); Chartier Harlan i inni Nature 353: 844 717 717 (1991)) (walina⁷¹⁷ na glicynę); Murrell i inni, Science 254: 97 (1991) (walina⁷¹⁷ na fenyloalaninę); Mul595 596 lan i inni, Nature Genet. 1: 345 (1992) (podwójna mutacja zmieniająca lizynę⁵⁹⁵-metioninę⁵⁹⁶ na aspa595 596 raginę⁵⁹⁵-leucynę⁵⁹⁶). Sądzi się, że takie mutacje powodują chorobę Alzheimera przez zwiększenie lub zmianę obróbki APP do Λβ, zwłaszcza obróbki APP do zwiększonej ilości długiej formy Aβ (czyli Aβ 1-42 i Αβ 1-43). Sądzi się, że mutacje w innych genach, takich jak geny preseniliny, PS1 i PS2, pośrednio wpływają na obróbkę APP z wytworzeniem zwiększonej ilości długiej formy Λβ (patrz Hardy,

TINS 20: 154 (1997)),

Mysie modele z powodzeniem zastosowano do ustalenia znaczenia płytek amyloidowych w chorobie Alzheimera (Games i inni, supra, Johnson-Wood i inni. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 1550 (1997)). W szczególności, gdy transgenicznym myszom PDAPP (które eksprymują zmutowaną postać ludzkiego APP i u których choroba Alzheimera rozwija się w młodym wieku), wstrzyknie się długą formę Aβ, występuje u nich zarówno spadek postępu choroby Alzheimera, jak i wzrosty mian przeciwciała wobec peptydu Aβ (Schenk i inni, Nature 400, 173 (1999)). Przedyskutowane powyżej obserwacje wskazują, że Aβ, zwłaszcza w swej długiej formie, jest czynnikiem sprawczym w chorobie Alzheimera.

McMichael, EP 526511, zaproponował podawanie homeopatycznych dawek (w ilości mniejszej lub równej 10^- mg/dzień) Aβ pacjentom, u których wcześniej wystąpiła AD. W przypadku typowych ludzi z około 5 litrami osocza, należy oczekiwać, że nawet górna granica tej dawki powinna zapewniać stężenie nie przekraczające 2 pg/ml. Normalne stężenie Aβ w ludzkim osoczu wynosi zazwyczaj 50-200 pg/ml (Seubert i inni, Nature 359: 325 (1992)). Z uwagi na to, że jest mało prawdopodobne, aby proponowane w EP 526511 dawki mogły wpływać na poziom endogennego Aβ w krążeniu, a także ze względu na to, że w EP 526511 nie zaleca się stosowania adiuwanta jako immunostymulatora, wydaje się nieprawdopodobne, aby można było osiągnąć korzyści terapeutyczne.

PL 211 761 B1

W związku z tym istnieje zapotrzebowanie na terapie i reagenty do leczenia choroby Alzheimera, zwłaszcza terapie i reagenty mogące przynieść korzyści terapeutyczne w dawkach fizjologicznych (czyli nietoksycznych).

Streszczenie wynalazku

Wynalazek dotyczy humanizowanej immunoglobuliny, która specyficznie wiąże się z peptydem β-amyloidu (Αβ), lub jej fragmentu wiążącego antygen, przy czym humanizowana immunoglobulina lub fragment wiążący antygen obejmuje:

(i) zmienny region lekkiego łańcucha zawierający regiony determinujące komplementarność (CDR) i reszty zrębowe zmiennego lekkiego łańcucha L2, L36 i L46 (konwencja numeracji Kabata) z sekwencji zmiennego regionu lekkiego łańcucha immunoglobuliny 3D6, podanej jako SEQ ID NO:2, przy czym reszta zmiennego regionu lekkiego łańcucha pochodzi z lekkiego łańcucha ludzkiej akceptorowej immunoglobuliny wybranego z grupy obejmującej Kabat ID 019230, Kabat ID 005131, Kabat ID 005058, Kabat ID 005057, Kabat ID 005059, Kabat ID U21040 i Kabat ID U41645, oraz (ii) zmienny region ciężkiego łańcucha zawierający regiony determinujące komplementarność (CDR) i reszty zrębowe zmiennego regionu ciężkiego łańcucha H49, H93 i H94 (konwencja numeracji Kabata) z sekwencji zmiennego regionu ciężkiego łańcucha immunoglobuliny 3D6, podanej jako SEQ ID NO:4, oraz reszty zrębowe zmiennego regionu ciężkiego łańcucha H74, H77 i H89 z germinalnej ludzkiej sekwencji VH3-23, przy czym reszta zmiennego regionu ciężkiego łańcucha pochodzi z ciężkiego łańcucha ludzkiej akceptorowej immunoglobuliny wybranego z grupy obejmującej Kabat ID 045919, Kabat ID 000459, Kabat ID 000553, Kabat ID 000386 i Kabat ID M23691.

Korzystnie CDR lekkiego łańcucha są jak następuje:

CDR1 lekkiego łańcucha: Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn, czyli reszty 24-39 SEQ ID NO: 2;

CDR2 lekkiego łańcucha: Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser, czyli reszty 55-61 SEQ ID NO:2; oraz

CDR3 lekkiego łańcucha: Trp Gln Gly Thr His Phe Pro Arg Thr, czyli reszty 94-102 SEQ ID NO:2.

Korzystnie CDR ciężkiego łańcucha są jak następuje:

CDR1 ciężkiego łańcucha: Asn Tyr Gly Met Ser, czyli reszty 31-35 SEQ ID NO:4;

CDR2 ciężkiego łańcucha: Ser Ile Arg Ser Gly Gly Gly Arg Thr Tyr Tyr Ser Asp Asn Val Lys Gly, czyli reszty 50-66 SEQ ID NO:4; oraz

CDR3 ciężkiego łańcucha: Tyr Asp His Tyr Ser Gly Ser Ser Asp Tyr, czyli reszty 99-108 SEQ ID NO:4.

Korzystnie ludzki akceptorowy lekki łańcuch stanowi Kabat ID 019230.

Korzystnie ludzki akceptorowy ciężki łańcuch stanowi Kabat ID 045919.

Korzystnie humanizowana immunoglobulina lub fragment wiążący antygen (i) wiążą się zarówno z rozpuszczalnym peptydem β-amyloidu (Αβ) i zagregowanym Αβ; (ii) pośredniczą w fagocytozie peptydu β-amyloidu ^β); (iii) przekraczają barierę krew-mózg u leczonego osobnika; lub (iv) zmniejszają obciążenie peptydem β-amyloidu ^β) u leczonego osobnika.

Korzystnie sekwencja zmiennego regionu ciężkiego łańcucha jest taka jak reszty 1-119 SEQ ID NO:12.

Korzystnie sekwencja zmiennego regionu lekkiego łańcucha jest taka jak reszty 1-112 SEQ ID

NO:11.

Korzystnie sekwencja zmiennego regionu lekkiego łańcucha jest taka jak reszty 1-112 SEQ ID NO:11, a sekwencja zmiennego regionu ciężkiego łańcucha jest taka jak reszty 1-119 SEQ ID NO:12.

Korzystnie humanizowana immunoglobulina lub fragment wiążący antygen ma stały region pochodzący z ludzkiej IgG1 lub ludzkiej IgG4.

Korzystnie fragment wiążący antygen stanowi fragment Fab, Fab', Fabc, Fv, F(ab')2, lub jednołańcuchowe przeciwciało.

Wynalazek dotyczy także kompozycji farmaceutycznej zawierającej składnik czynny oraz farmaceutyczny nośnik, charakteryzującej się tym, że jako składnik czynny zawiera humanizowaną immunoglobulinę lub fragment wiążący antygen zdefiniowane powyżej.

Wynalazek dotyczy ponadto humanizowanej immunoglobuliny lub fragmentu wiążącego antygen zdefiniowanych powyżej do stosowania jako lek.

Wynalazek dotyczy również zastosowania skutecznej dawki humanizowanej immunoglobuliny lub fragmentu wiążącego antygen zdefiniowanych powyżej do wytwarzania leku do profilaktyki lub leczenia choroby amyloidogennej u pacjenta, w szczególności choroby Alzheimera.

Korzystnie skuteczna dawka wynosi (i) 0,01 - 5 mg/kg masy ciała; (ii) około 1 mg/kg masy ciała;

(iii) 1-10 mg/kg masy ciała; albo (iv) około 10 mg/kg masy ciała.

PL 211 761 B1

Korzystnie humanizowaną immunoglobulinę stosuje się do podawania w wielu dawkach w odstępach dawkowania wynoszących około 2 tygodnie, około jednego miesiąca, 3-6 miesięcy lub około roku.

Wynalazek dotyczy także wyizolowanej cząsteczki kwasu nukleinowego kodującej humanizowaną immunoglobulinę lub fragment wiążący antygen, zdefiniowane powyżej.

Korzystnie ta cząsteczka kwasu nukleinowego zawiera sekwencję nukleotydową podaną jako SEQ ID NO:35 oraz SEQ ID NO:37.

Wynalazek dotyczy również wektora, zawierającego cząsteczkę kwasu nukleinowego zdefiniowaną powyżej.

Wynalazek dotyczy nowych immunologicznych reagentów, w szczególności terapeutycznych reagentów w postaci przeciwciał, do profilaktyki i leczenia choroby amyloidogennej (np. choroby Alzheimera). Wynalazek jest oparty, co najmniej w części, na zidentyfikowaniu i scharakteryzowaniu monoklonalnego przeciwciała 3D6, które specyficznie wiąże się z peptydem Αβ i skutecznie zmniejsza obciążenie płytkami i/lub zmniejszają dystrofię neurytyczną związaną z zaburzeniami amyloidogennymi. Strukturalna i funkcjonalna analiza tego przeciwciała doprowadziła do zaprojektowania różnych humanizowanych przeciwciał do zastosowania profilaktycznego i/lub terapeutycznego. W szczególności, wynalazek dotyczy humanizacji zmiennych regionów tego przeciwciała i w związku z tym dostarcza humanizowanej immunoglobuliny lub łańcuchów przeciwciał, nienaruszonych humanizowanych immunoglobulin lub przeciwciał oraz funkcjonalnych fragmentów immunoglobuliny lub przeciwciała, w szczególności wiążących antygen fragmentów przeciwciała według wynalazku.

Ujawniono również reagenty polinukleotydowe oraz wektory odpowiednie do kodowania humanizowanych przeciwciał.

Ujawniono zastosowanie humanizowanych przeciwciał do wytwarzania leku do leczenia chorób lub zaburzeń amyloidogennych (np. choroby Alzheimera), jak również kompozycje farmaceutyczne do takich zastosowań.

Krótki opis figur

Fig. 1 przedstawia dopasowanie sekwencji aminokwasowych lekkiego łańcucha przeciwciała mysiego 3D6, humanizowanego 3D6, Kabat ID 109230 i germinalnego A19. Regiony CDR zaznaczono strzałkami. Pogrubioną kursywą zaznaczono rzadkie mysie reszty. Pogrubienia oznaczają reszty wypełniające (VH + VL). Wypełniony fragment oznacza oddziałujące reszty kanoniczne/CDR. Gwiazdkami zaznaczono reszty wybrane do mutacji wstecznej w humanizowanym 3D6, wersja 1.

Fig. 2 przedstawia dopasowanie sekwencji aminokwasowych ciężkiego łańcucha przeciwciała mysiego 3D6, humanizowanego 3D6, Kabat ID 045919 i germinalnego VH3-23 przeciwciała. Oznaczenia mają to samo znaczenie, jak na fig. 1.

Fig. 3 przedstawia graficznie właściwości wiążące 3D6, chimerycznego 3D6 i 10D5 z Αβ. Fig. 3A graficznie przedstawia wiązanie Aβ z chimerycznym 3D6 (PK1614) w porównaniu z mysim 3D6. Fig. 3B przedstawia graficznie konkurowanie biotynylowanego 3D6 z nieznakowanym 3D6, PK1614 i 10D5, w wiązaniu z Λβ.

Fig. 4 przedstawia model homologii 3D6 VH i VL, pokazując ślad głównego łańcucha a-węglowego. VH pokazano jako linię cieniowaną, a VL pokazano jako linię pełną. Regiony CDR zaznaczono w postaci wstążki.

Fig. 5 przedstawia graficznie właściwości wiążące chimerycznego 3D6 i humanizowanego 3D6 z Aβ. Fig. 5A przedstawia wyniki pomiarów wiązania humanizowanego 3D6v1 i chimerycznego 3D6 z zagregowanym Aβ w teście ELISA. Fig. 5B przedstawia wyniki pomiarów wiązania humanizowanego 3D6v1 i humanizowanego 3D6v2 z zagregowanym Aβ w teście ELISA.

Fig. 6 stanowi wykres przedstawiający ilościowo wiązanie humanizowanego 3D6 i chimerycznego 3D6 z płytkami Aβ w skrawkach mózgu myszy PDAPP.

Fig. 7 stanowi wykres przedstawiający wyniki próby konkurencyjnego wiązania w badaniu zdolności humanizowanego 3D6, wersje 1 i 2, chimerycznego 3D6, mysiego 3D6 i 10D5, w konkurowaniu z mysim 3D6 w wiązaniu z Λβ.

Fig. 8 przedstawia graficznie wyniki próby fagocytozy ex vivo w badaniu zdolności humanizowanego 3D6v2, chimerycznego 3D6 i ludzkiej IgG w pośredniczeniu w wychwycie Λβ przez komórki mikrogleju.

Fig. 9 przedstawia dopasowanie sekwencji aminokwasowych 10D5 VL i 3D6 VL. Pogrubiono reszty, które dokładnie pasują do 10D5.

Fig. 10 przedstawia dopasowanie sekwencji aminokwasowych 10D5 VH i 3D6 VH. Pogrubiono reszty, które dokładnie pasują do 10D5.

PL 211 761 B1

Szczegółowy opis wynalazku

Wynalazek dotyczy nowych reagentów immunologicznych i sposobów profilaktyki lub leczenia choroby Alzheimera lub innych chorób amyloidogennych. Wynalazek oparty jest, co najmniej częściowo, na scharakteryzowaniu monoklonalnej immunoglobuliny 3D6, skutecznej w wiązaniu białka beta amyloidowego (Αβ) (np. w wiązaniu rozpuszczalnego i/lub zagregowanego Αβ), pośredniczeniu fagocytozy (np. zagregowanego Αβ), zmniejszeniu obciążenia płytkami i/lub zmniejszenia dystrofii neurytycznej (np. u pacjenta). Wynalazek oparty jest ponadto na ustaleniu i strukturalnym scharakteryzowaniu pierwszorzędowej i drugorzędowej struktury zmiennego lekkiego i ciężkiego łańcucha tej immunoglobuliny, oraz identyfikacji reszt decydujących o aktywności i immunogenności.

Immunoglobulinami, np. terapeutycznymi immunoglobulinami według wynalazku, są te, które zawierają humanizowany zmienny lekki i/lub humanizowany zmienny ciężki łańcuch opisany powyżej. Ten zmienny lekki i ten zmienny ciężki łańcuch zawierają regiony determinujące komplementarność (CDR) z monoklonalnej immunoglobuliny (czyli immunoglobuliny donorowej) oraz zmienne regiony zrębowe zasadniczo z akceptorowej ludzkiej immunoglobuliny. Określenie „zasadniczo z akceptorowej ludzkiej immunoglobuliny oznacza, że większość lub kluczowe reszty zrębowe pochodzą z ludzkiej sekwencji akceptorowej, jednakże z dopuszczalnym podstawieniem reszt w pewnych pozycjach wybranymi resztami, tak aby poprawić aktywność humanizowanej immunoglobuliny (np. zmienić aktywność tak, aby dokładniej naśladowała aktywność donorowej immunoglobuliny) lub wybranymi w celu zmniejszenia immunogenności humanizowanej immunoglobuliny.

Lekki łańcuch humanizowanej immunoglobuliny zawiera CDR zmiennego regionu 3D6 (np. z sekwencji zmiennego regionu lekkiego łańcucha 3D6, podanej jako SEQ ID NO: 2 i obejmuje zmienny region zrębowy akceptorowej ludzkiej immunoglobuliny, z tym, że reszty zrębowe L2, L36 i L46 (konwencja numeracji Kabata) są podstawione odpowiednimi resztami aminokwasowymi z sekwencji zmiennego regionu lekkiego łańcucha mysiego 3D6. Ciężki łańcuch humanizowanej immunoglobuliny zawiera CDR zmiennego regionu 3D6 (np. z sekwencji zmiennego regionu ciężkiego łańcucha 3D6, podanej jako SEQ ID NO: 4) i obejmuje zmienny region zrębowy akceptorowej ludzkiej immunoglobuliny, z tym, że reszty zrębowe H49, H93 i H94 (konwencja numeracji Kabata) są podstawione odpowiednimi resztami aminokwasowymi z sekwencji zmiennego obszaru lekkiego łańcucha mysiego 3D6.

Regiony zrębowe łańcucha lekkiego są wybrane spośród akceptorowej immunoglobuliny Kabat ID 019230, Kabat ID 005131, Kabat ID 005058, Kabat ID 005057, Kabat ID 005059, Kabat ID U21040 i Kabat ID U41645. Regiony zrębowe łańcucha ciężkiego są wybrane spośród akceptorowej immunoglobuliny Kabat ID 045919, Kabat ID 000459, Kabat ID 000553, Kabat ID 000386 i Kabat ID M23691.

Rzadkie reszty zrębowe ciężkiego łańcucha H74, H77 i H89 są podstawione odpowiednimi resztami germinalnymi z sekwencji germinalnej VH3-23 immunoglobuliny.

Wynalazek dotyczy humanizowanej immunoglobuliny, która zawiera lekki łańcuch i ciężki łańcuch, opisane powyżej, lub wiążącego antygen fragmentu tej immunoglobuliny. W przykładowej postaci humanizowana immunoglobulina wiąże się (np. specyficznie wiąże się) z peptydem β-amyloidu (Αβ) z powinowactwem wiązania co najmniej 10⁷ M^-1, 10⁸ M^-1 lub 10⁹ M^-1. W innej postaci immunoglobulina lub fragment wiążący antygen zawierają ciężki łańcuch o izotypie γ1. W innej postaci immunoglobulina lub fragment wiążący antygen wiążą się (np. specyficznie wiążą się) zarówno z rozpuszczalnym peptydem β-amyloidu ^β), jak i z zagregowanym Aβ. W innej postaci immunoglobulina lub fragment wiążąc antygen pośredniczą w fagocytozie (np. wywołują fagocytozę) peptydu β-amyloidu (A|i). W jeszcze innej postaci immunoglobulina lub fragment wiążący antygen przekraczają barierę krew-mózg u pacjenta. W jeszcze innej postaci immunoglobulina lub fragment wiążący antygen zmniejszają zarówno obciążenie peptydem β-amyloidu ^β), jak i dystrofię neurytyczną u pacjenta.

Opisane immunoglobuliny są szczególnie przydatne do stosowania w profilaktyce lub leczeniu chorób amyloidogennych. W jednej postaci wynalazek dotyczy zastosowania do profilaktyki lub leczenia choroby amyloidogennej (np. choroby Alzheimera), polegającego na podawaniu pacjentowi skutecznej dawki opisanej humanizowanej immunoglobuliny. W innej postaci wynalazek dotyczy kompozycji farmaceutycznych, zawierających opisaną humanizowaną immunoglobulinę i farmaceutyczny nośnik. Wynalazek dotyczy także izolowanych cząsteczek kwasu nukleinowego i wektorów do wytwarzania immunoglobulin lub fragmentów albo łańcuchów opisanych immunoglobulin.

Przed opisaniem wynalazku, pomocne w jego zrozumieniu może być przedstawienie definicji pewnych określeń tutaj stosowanych.

PL 211 761 B1

Określenia „immunoglobulina lub „przeciwciało (stosowane tutaj zamiennie) dotyczą białka wiążącego antygen, posiadającego podstawową strukturę czterech łańcuchów polipeptydowych, składającą się z dwóch łańcuchów ciężkich i dwóch łańcuchów lekkich, które to łańcuchy są stabilizowane, np. przez międzyłańcuchowe mostki disulfidowe, które mają zdolność specyficznego wiązania antygenu. Zarówno łańcuch ciężki, jak i lekki są pofałdowane w domeny. Określenie „domena oznacza globularny region polipeptydu łańcucha ciężkiego lub lekkiego zawierający pętle peptydowe (np. zawierający 3-4 pętle peptydowe), stabilizowany np. przez β-pofałdowaną kartkę i/lub międzyłańcuchowe wiązanie disulfidowe. Domeny są ponadto określane jako „stałe lub „zmienne w oparciu o względny brak zmienności sekwencji w domenach różnych członków klasy w przypadku domeny „stałej lub istotną zmienność w domenach różnych członków klasy w przypadku domeny „zmiennej. Domeny „stałe na łańcuchu lekkim są zamiennie nazywane „regionami stałymi łańcucha lekkiego, „domenami stałymi łańcucha lekkiego, regionami „CL lub domenami „CL. Domeny „stałe na łańcuchu ciężkim są zamiennie nazywane „regionami stałymi łańcucha ciężkiego, „domenami stałymi łańcucha ciężkiego, regionami „CH lub domenami „CH. Domeny „zmienne na łańcuchu lekkim są zamiennie nazywane „regionami zmiennymi łańcucha lekkiego, „domenami zmiennymi łańcucha lekkiego, regionami „VL lub domenami „VL. Domeny „zmienne na łańcuchu ciężkim są zamiennie nazywane „regionami zmiennymi łańcucha ciężkiego, „domenami zmiennymi łańcucha ciężkiego, regionami „CH lub domenami „CH.

Określenie „region oznacza część lub fragment łańcucha przeciwciała i obejmuje domeny stałe lub zmienne, jak tutaj zdefiniowano, a także mniejsze części wspomnianych domen. Tak też np. domeny lub regiony zmienne łańcucha lekkiego obejmują „regiony determinujące komplementarność lub „CDR rozmieszczone pomiędzy „regionami zrębowymi lub „FR, jak tutaj zdefiniowano.

Immunoglobuliny lub przeciwciała mogą występować w postaci monomerycznej lub polimerycznej. Określenie „fragment wiążący antygen oznacza fragment polipeptydowy immunoglobuliny lub przeciwciała, który wiąże antygen lub konkuruje z nienaruszonym przeciwciałem (czyli z nienaruszonym przeciwciałem, z którego pochodzi) w wiązaniu antygenu (tj. specyficzne wiązanie). Określenie „konformacja dotyczy trzeciorzędowej struktury białka lub polipeptydu (np. przeciwciała, łańcucha przeciwciała, jego domeny lub regionu). Przykładowo wyrażenie „konformacja lekkiego (lub ciężkiego) łańcucha oznacza strukturę trzeciorzędową regionu zmiennego lekkiego (lub ciężkiego) łańcucha, a wyrażenie „konformacja przeciwciała lub „konformacja fragmentu przeciwciała oznacza strukturę trzeciorzędową przeciwciała lub jego fragmentu.

„Specyficzne wiązanie przeciwciała oznacza, że przeciwciało wykazuje znaczące powinowactwo do antygenu lub korzystnego epitopu oraz, korzystnie, nie wykazuje istotnej reaktywności krzyżowej. „Znaczące lub korzystne wiązanie obejmuje wiązanie z powinowactwem co najmniej 10⁶, 10⁷, 10⁸,

Qmi 7 1 ft 1

10⁹ lub 10¹⁰ M^-1. Korzystniejsze są powinowactwa powyżej 10⁷ M^-1, korzystnie wyższe niż 10⁸ M^-1. Wartości pośrednie pomiędzy przedstawionymi tutaj powyżej są także objęte zakresem wynalazku, a korzystne powinowactwo wiązania można przedstawić jako zakres powinowactwa, np. 10⁶ do 10¹⁰ M^-1,

1 n 1 ft 1 n 1 korzystnie 10⁷ do 10¹⁰ M^-1 korzystniej 10⁸ do 10¹⁰ M^-1. Przeciwciałem, które „nie wykazuje istotnej reaktywności krzyżowej, jest takie, które nie wiąże się znacząco z niepożądanym składnikiem (np. z niepożądanym składnikiem białkowym). Przykładowo przeciwciało, które specyficznie wiąże się z Αβ, będzie znacząco wiązać Aβ, ale nie będzie istotnie reagować z białkami lub peptydami innymi niż Aβ (np. białkami lub peptydami innymi niż Aβ, zawartymi w płytkach). Przeciwciało specyficzne względem korzystnego epitopu nie będzie np. istotnie reagować krzyżowo z odległymi epitopami na tym samym białku lub peptydzie. Specyficzne wiązanie można określić znanymi sposobami określania takiego wiązania. Korzystnie, specyficzne wiązanie określa się na podstawie analizy Scatcharda i/lub testów konkurencji w wiązaniu.

Fragmenty wiążące wytwarza się technikami rekombinacji DNA lub przez chemiczne albo enzymatyczne rozszczepienie nienaruszonych immunoglobulin. Fragmenty wiążące obejmują Fab, Fab', F(ab')2, Fabc, Fv, pojedyncze łańcuchy oraz jednołańcuchowe przeciwciała. Za immunoglobuliny lub przeciwciała inne niż „bispecyficzne lub „dwufunkcyjne uważa się taką immunoglobulinę lub przeciwciało, które ma identyczne każde ze swoich miejsc wiążących. „Bispecyficzne lub „dwufunkcyjne przeciwciało jest sztucznym przeciwciałem hybrydowym zawierającym dwie różne pary łańcuchów lekkich/ciężkich i dwa różne miejsca wiążące. Bispecyficzne przeciwciała można wytwarzać różnymi metodami, włącznie z fuzją hybrydom lub połączeniem fragmentów Fab'. Patrz np. Songsivilai i Lachmann, Clin. Exp. Immunol. 79:315-321 (1990); Kostelny i inni, J. Immunol. 148, 1547-1553 (1992).

PL 211 761 B1

Określenie „humanizowana immunoglobulina lub „humanizowane przeciwciało dotyczy immunoglobuliny lub przeciwciała, które zawierają co najmniej jeden humanizowany łańcuch immunoglobuliny lub przeciwciała (czyli co najmniej jeden humanizowany łańcuch lekki lub ciężki). Określenia „humanizowany łańcuch immunoglobuliny lub „humanizowany łańcuch przeciwciała (czyli „humanizowany łańcuch lekki immunoglobuliny lub „humanizowany łańcuch ciężki immunoglobuliny) dotyczą łańcucha immunoglobuliny lub przeciwciała (czyli odpowiednio łańcucha lekkiego lub ciężkiego) posiadającego zmienny region zawierający zmienny region zrębowy zasadniczo pochodzący z ludzkiej immunoglobuliny lub przeciwciała oraz regiony determinujące komplementarność (CDR) (np. co najmniej jeden CDR, korzystnie dwa CDR, korzystniej trzy CDR) zasadniczo pochodzące z immunoglobuliny lub przeciwciała nie pochodzącego od człowieka oraz ponadto regiony stałe (np. co najmniej jeden region stały lub jego część, w przypadku łańcucha lekkiego oraz korzystnie trzy regiony stałe w przypadku łańcucha ciężkiego). Określenie „humanizowany region zmienny (np. „humanizowany region zmienny łańcucha lekkiego lub „humanizowany region zmienny łańcucha ciężkiego) dotyczy regionu zmiennego zawierającego zmienny region zrębowy zasadniczo pochodzący z ludzkiej immunoglobuliny lub przeciwciała oraz regiony determinujące komplementarność (CDR) zasadniczo pochodzące z immunoglobuliny lub przeciwciała nie pochodzącego od człowieka.

Określenie „zasadniczo pochodzący z ludzkiej immunoglobuliny lub przeciwciała lub „zasadniczo ludzki oznacza, że przy dopasowywaniu z sekwencją aminokwasową ludzkiej immunoglobuliny lub przeciwciała w celu porównania, region wykazuje co najmniej 80-90%, korzystnie 90-95%, korzystniej 95-99% identyczności (np. lokalnej identyczności sekwencji) z sekwencją ludzkiego regionu zrębowego lub regionu stałego, co pozwala np. na konserwatywne podstawienia, konsensusowe podstawienia sekwencji, podstawienia germinalne, wsteczne mutacje itp. Wprowadzenie konserwatywnych podstawień, konsensusowych podstawień sekwencji, podstawień germinalnych, wstecznych mutacji itp. jest często określane „optymalizacją humanizowanego przeciwciała lub łańcucha. Wyrażenie „zasadniczo niepochodzący z ludzkiej immunoglobuliny lub przeciwciała lub „zasadniczo niepochodzący od człowieka oznacza immunoglobulinę lub przeciwciało o sekwencji zasadniczo w 80-95%, korzystnie 90-95%, korzystniej 96%, 97%, 98% lub 99% identyczną z sekwencją organizmu innego niż człowiek, np. ssaka innego niż człowiek.

Zgodnie z tym, wszystkie regiony lub reszty humanizowanej immunoglobuliny lub przeciwciała lub humanizowanego łańcucha immunoglobuliny lub przeciwciała, ewentualnie z wyjątkiem CDR, są zasadniczo identyczne z odpowiadającymi im regionami lub resztami jednej lub większej liczby sekwencji natywnych immunoglobuliny ludzkiej. Określenia „region odpowiadający lub „reszta odpowiadająca dotyczą regionu lub reszty na drugiej sekwencji aminokwasowej lub nukleotydowej, które zajmują tą samą (tj. równoważną) pozycję jak region lub reszta w pierwszej sekwencji aminokwasowej lub nukleotydowej, gdy pierwszą i drugą sekwencję optymalnie dopasuje się w celu porównania.

Określenia „humanizowana immunoglobulina lub „humanizowane przeciwciało nie uważa się za obejmujące chimeryczne immunoglobuliny lub przeciwciała, jak zdefiniowano poniżej. Jakkolwiek humanizowane immunoglobuliny lub przeciwciała są chimeryczne pod względem konstrukcji (np. zawierają regiony z jednego lub większej ilości rodzajów białka), wykazują dodatkowe cechy, (np. regiony zmienne zawierające donorowe reszty CDR i akceptorowe reszty zrębowe) nie znajdywane w chimerycznych immunoglobulinach lub przeciwciałach, jak tutaj zdefiniowano.

Określenie „istotna identyczność oznacza, że dwie sekwencje polipeptydowe, przy optymalnym dopasowaniu, np. przy pomocy programów GAP lub BESTFIT z domyślnym obciążeniem za przerwę, wykazują 50-60% identyczności sekwencji, korzystnie 60-70% identyczności sekwencji, korzystniej 70-80% identyczności sekwencji, korzystniej co najmniej 80-90% identyczności, jeszcze korzystniej co najmniej 90-95% identyczności, jeszcze korzystniej co najmniej 95% identyczności sekwencji lub powyżej (np. 99% identyczności sekwencji lub powyżej). Określenie „zasadnicza identyczność oznacza, ze dwie sekwencje polipeptydowe, gdy są optymalnie dopasowane, np. przy pomocy programów GAP lub BESTFIT z domyślnym obciążeniem za przerwę, wykazują co najmniej 80-90% identyczności sekwencji, korzystnie 90-95% identyczności sekwencji, a najkorzystniej 95% identyczności sekwencji lub powyżej (np, 99% identyczności sekwencji lub powyżej). Przy porównywaniu sekwencji zazwyczaj jedną sekwencję stosuje się jako sekwencję odniesienia, z którą porównuje się badane sekwencje. Przy stosowaniu algorytmu porównującego sekwencje, sekwencję badaną i odniesienia wprowadza się do komputera, w razie potrzeby wyznacza się współrzędne podsekwencji i wyznacza się parametry programu algorytmu sekwencji. Następnie algorytm porównujący sekwencje oblicza procent identyczności sekwencji dla sekwencji badanych względem sekwencji odniesienia, w oparciu o wyznaczo8

PL 211 761 B1 ne parametry programu. Określenia „identyczność sekwencji i „tożsamość sekwencji stosuje się tutaj zamiennie.

Optymalne dopasowanie sekwencji do porównania można przeprowadzić przy pomocy algorytmu lokalnej homologii Smitha i Watermana, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981), przy pomocy algorytmu dopasowania homologi Needlemana i Wunscha, J. Mol. Biol. 48:443 (1970), przez poszukiwanie podobieństw metodą Pearsona i Lipmana, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988), przez komputerową realizację tych algorytmów (GAP, BESTFIT, FASTA i TFASTA z Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI) lub ocenę wzrokową (patrz ogólnie, Ausubel i inni, Current Protocols in Molecular Biology). Jednym przykładem algorytmu, który jest odpowiedni do wyznaczania procentu identyczności sekwencji jest algorytm BLAST, który opisano w Altschul i inni, J. Mol. Biol. 215:403 (1990). Oprogramowanie do przeprowadzenia analiz BLAST jest publicznie dostępne z National Center for Biotechnology Information (publicznie dostępne przez serwer internetowy National Institutes of Health NCBI). Zazwyczaj domyślne parametry programu można stosować do przeprowadzenia porównania sekwencji, jednak można także stosować dostosowane parametry. Dla sekwencji aminokwasowych program BLASTP używa domyślną długość słowa (W) równą 3, oczekiwanie (E) równe 10 i macierz punktującą BLOSUM62 (patrz, Henikoff i Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915 (1989)).

Korzystnie pozycje reszt, które nie są identyczne, różnią się konserwatywnymi podstawieniami aminokwasowymi. W celu sklasyfikowania podstawień aminokwasowych jako konserwatywne i niekonserwatywne, aminokwasy pogrupowano następująco: grupa I (hydrofobowe łańcuchy boczne): leu, met, ala, val, leu, ile; grupa II (obojętne hydrofilowe łańcuchy boczne): cys, ser, thr; grupa III (kwasowe łańcuchy boczne): asp, glu; grupa IV (zasadowe łańcuchy boczne): asn, gln, his, lys, arg; grupa V (reszty wpływające na orientację łańcucha): gly, pro oraz grupa VI (aromatyczne łańcuchy boczne): trp, tyr, phe. Konserwatywne podstawienia obejmują podstawienia pomiędzy aminokwasami w tej samej klasie. Niekonserwatywne podstawienia obejmują wymianę składnika jednej z tych klas na składnik innej klasy.

Korzystnie humanizowane immunoglobuliny lub przeciwciała wiążą antygen z powinowactwem w zakresie trzy-, cztero- lub pięciokrotnie wyższym niż odpowiednie przeciwciało niepochodzące od człowieka. Przykładowo, gdy przeciwciało niepochodzące od człowieka ma powinowactwo wiązania

-1 9 -1 9 -1 9 -1

10⁹ M^-1, humanizowane przeciwciała mają powinowactwo wiązania 3 x 10⁹ M^-1, 4 x 10⁹ M^-1 lub 10⁹ M^-1.

Przy opisywaniu właściwości wiążących łańcucha immunoglobuliny lub przeciwciała, łańcuch można opisać pod względem jego zdolności do „kierowaniem wiązaniem antygenu (np. Αβ). Łańcuch uważa się za „kierujący wiązaniem przeciwciała gdy nadaje on nienaruszonej immunoglobulinie lub przeciwciału (albo jego fragmentowi wiążącemu antygen) właściwości specyficznego wiązania lub powinowactwo wiązania. Mutację (np. mutację wsteczną) uważa się za zasadniczo wpływającą na zdolność łańcucha ciężkiego lub lekkiego do kierowania wiązaniem antygenu, gdy wpływa ona (np. zmniejsza) na powinowactwo wiązania nienaruszonej immunoglobuliny lub przeciwciała (lub jego fragmentu wiążącego antygen), zawierających wspomniany łańcuch co najmniej o rząd wielkości w porównaniu z przeciwciałem (lub jego fragmentem wiążącym antygen) zwierającym odpowiedni łańcuch niezawierający wspomnianej mutacji. Mutacja „nie wpływa zasadniczo (np. nie zmniejsza) na zdolność łańcucha do kierowania wiązaniem antygenu gdy wpływa ona (np. zmniejsza) na powinowactwo wiązania nienaruszonej immunoglobuliny lub przeciwciała (lub jego fragmentu wiążącego antygen) zawierającego wspomniany łańcuch tylko dwu-, trój- lub czterokrotnie w porównaniu z przeciwciałem (lub jego fragmentem wiążącym antygen) zawierającym odpowiedni łańcuch niezawierający takiej mutacji.

Określenie „chimeryczna immunoglobulina lub przeciwciało dotyczy immunoglobuliny lub przeciwciała, którego łańcuchy lekkie i ciężkie pochodzą z różnych gatunków. Chimeryczne immunoglobuliny lub przeciwciała można skonstruować, np. technikami inżynierii genetycznej, z segmentów genu immunoglobuliny należących do różnych gatunków.

„Antygen jest cząsteczką (np. cząsteczką białka lub peptydu), z którym specyficznie wiąże się przeciwciało.

Określenie „epitop lub „determinanta antygenowa dotyczy miejsca na antygenie, z którym immunoglobulina lub przeciwciało (lub jego fragment wiążący antygen) wiążą się specyficznie. Epitopy mogą być utworzone zarówno przez sąsiadujące, jak i nie sąsiadujące aminokwasy umieszczone obok siebie w wyniku trzeciorzędowego fałdowania białka. Epitopy utworzone przez sąsiadujące aminokwasy są zazwyczaj utrzymywane po wystawieniu na działanie rozpuszczalników denaturujących, podczas gdy epitopy utworzone w wyniku trzeciorzędowego pofałdowania są zazwyczaj tracone przy

PL 211 761 B1 podziałaniu rozpuszczalnikami denaturującymi. Epitop zazwyczaj zawiera co najmniej 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 lub 15 aminokwasów w unikatowej konformacji przestrzennej. Metody określania konformacji przestrzennej epitopów obejmują np. krystalografię rentgenowską i dwuwymiarowy magnetyczny rezonans jądrowy. Patrz, np., Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, tom 66, G. E. Morris, red. (1996).

Przeciwciała rozpoznające ten sam epitop można zidentyfikować w prostym teście immunologicznym wykazującym zdolność przeciwciała do blokowania wiązania innego przeciwciała z docelowym antygenem, tj. w teście konkurencji w wiązaniu. Konkurencję w wiązaniu określa się w teście, w którym immunoglobulina podczas testu hamuje specyficzne wiązanie przeciwciała odniesienia ze wspólnym antygenem, takim jak Λβ. Znanych jest wiele typów testów konkurencji w wiązaniu, np.: bezpośredni lub pośredni test radioimmunologiczny (RIA) na fazie stałej, bezpośredni lub pośredni test enzymatyczny (EIA) na fazie stałej, sandwiczowy test konkurencji (patrz Stahli i inni, Methods in Enzymology 9:242 (1983)); bezpośredni EIA na fazie stałej z biotyną-awidyną (patrz, Kirkland i inni, J. Immunol. 137:3614 (1986)); test z bezpośrednim znakowaniem na fazie stałej, test sandwiczowy z bezpośrednim znakowaniem na fazie stałej (patrz Harlow i Lane, Antibodies; A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (1988)); bezpośredni RIA na fazie stałej ze znakowaniem I-125 (patrz. Morel i inni. Mol. Immunol. 25(1):7 (1988)); bezpośredni EIA na fazie stałej z biotyną-awidyną (Cheung i inni, Virology 176:546 (1990)) oraz RIA z bezpośrednim znakowaniem. (Moldenhauer i inni, Scand. J. Immunol. 32:77 (1990)). Zazwyczaj taki test obejmuje zastosowanie oczyszczonego antygenu związanego ze stałą powierzchnią lub zawierających go komórek, nieznakowanej immunoglobuliny badanej i znakowanej immunoglobuliny odniesienia. Konkurencyjne hamowanie mierzy się przez ustalenie ilości znacznika związanego ze stałą powierzchnią lub komórkami w obecności badanej immunoglobuliny. Zazwyczaj badana immunoglobulina jest obecna w nadmiarze. Zazwyczaj przy konkurencji przeciwciało obecne w nadmiarze hamuje specyficzne wiązanie przeciwciała odniesienia ze wspólnym antygenem co najmniej o 50-55%, 55-60%, 60-65%, 65-70%, 70-75% lub powyżej.

Epitop jest także rozpoznawany przez immunologiczne komórki, np. komórki B i/lub komórki T. Komórkowe rozpoznawanie epitopu można określić w testach in vitro mierzących zależną od antygenu proliferację, co wyznacza się przez włączanie 3H-tymidyny, na podstawie wydzielania cytokin, wydzielania przeciwciał lub przez zależne od antygenu uśmiercanie (test cytotoksyczności limfocytów T).

Przykładowe epitopy lub determinanty antygenowe można znaleźć w ludzkim białku prekursorowym amyloidu (APP), ale korzystnie w peptydzie Aβ w APP. Istnieje wiele izoform APP, np. APP⁶⁹⁵APP⁷⁵¹ i APP⁷⁷⁰. Aminokwasom APP przypisuje się numery według sekwencji izoformy APP⁷⁷⁰ (patrz np. nr dostępu GenBank P05067, przedstawiona także jako SEQ ID NO: 38). Peptyd Λβ (nazywany tutaj także peptydem beta-amyloidu i A-beta) jest wewnętrznym fragmentem 39-43 aminokwasowym APP o ~4 kDa (Λβ39, Aβ40, Aβ41, Aβ42 i Aβ43). Przykładowo Λβ40 składa się z reszt 672-711 APP, a Aβ42 składa się z reszt 673-713 APP. W wyniku proteolitycznej obróbki APP przez różne enzymy sekretazowe iv vivo i in situ, Aβ występuje zarówno w „formie krótkiej, jak i „formie długiej, o długości 42-43 aminokwasów. Korzystne epitopy lub determinanty antygenowe, jak tutaj opisano, są umiejscowione w N-końcu peptydu Aβ i zawierają reszty aminokwasów 1-10 Λβ, korzystnie reszty 1-3, 1-4, 1-5,

1- 6, 1-7 lub 3-7 Λβ42. Dodatkowe stosowane epitopy lub determinanty antygenowe obejmują reszty

2- 4, 5, 6, 7 lub 8 Λβ, reszty 3-5, 6, 7, 8 lub 9 Λβ lub reszty 4-7, 8, 9 lub 10 Λβ42.

Określenie „choroba amyloidogenna obejmuje dowolną chorobę związaną z (lub wywołaną przez) tworzenie lub odkładanie nierozpuszczalnych włókien amyloidowych. Przykładowe choroby amyloidogenne obejmują, ale nie tylko, skrobiawicę ogólnoustrojową, chorobę Alzheimera, cukrzycę dorosłych, chorobę Parkinsona, chorobę Huntingtona, otępienie czołowo-skroniowe oraz związane z i przenoszone przez priony encefalopatię gąbczaste (choroby kuru i Creutzfeldta-Jacoba u ludzi i scrapie oraz BSE odpowiednio u owiec i bydła). Różne choroby amyloidogenne definiuje się lub charakteryzuje się na podstawie charakteru składnika polipeptydowego odłożonych włókien. Tak też np. u osób lub pacjentów cierpiących na chorobę Alzheimera, białko β-amyloidu (np. typu dzikiego, wariant lub skrócone białko β-amyloidu) jest charakteryzującym składnikiem polipeptydowym złogu amyloidowego. Zgodnie z tym, choroba Alzheimera jest przykładem „choroby charakteryzującej się złogami Aβ lub „choroby związanej ze złogami Ap, np. w mózgu osoby lub pacjenta. Określenia „białko β-amyloidu, „peptyd β-amyloidu, „β-amyloid, „Ap i „peptyd Ap są tutaj stosowane zamiennie.

Określenie „skuteczna dawka lub „skuteczne dawkowanie definiuje się jako ilość wystarczaj ącą do osiągnięcia lub co najmniej częściowego osiągnięcia pożądanego efektu. Określenie „terapeutycznie skuteczna dawka definiuje się jako ilość wystarczającą do wyleczenia lub co najmniej czę10

PL 211 761 B1 ściowego zahamowania choroby i jej powikłań u pacjenta już cierpiącego na tę chorobę. Ilości skuteczne do tego zastosowania zależą od ostrości zakażenia i ogólnego stanu układu immunologicznego pacjenta.

Określenie „pacjent obejmuje człowieka i inne osobniki będące ssakami, poddawane leczeniu profilaktycznemu lub terapeutycznemu.

„Rozpuszczalny lub „rozłączony Αβ oznacza niezagregowany lub zdezagregowany polipeptyd Αβ. „Nierozpuszczalny Αβ oznacza agregujący polipeptyd Αβ, np. Αβ utrzymywany razem przez wiązania niekowalencyjne. Uważa się, że Aβ (np. Αβ42) ulega agregacji, co najmniej częściowo, ze względu na obecność reszt hydrofobowych na C-końcu peptydu (części transbłonowej domeny APP). Jedną metodą wytwarzania rozpuszczalnego Αβ jest rozpuszczanie liofilizowanego peptydu w czystym DMSO z obróbką ultradźwiękami. Powstały roztwór odwirowuje się w celu usunięcia jakichkolwiek nierozpuszczalnych cząstek.

I. Reagenty immunologiczne i terapeutyczne

Immunologiczne i terapeutyczne reagenty według wynalazku obejmują lub zawierają humanizowane przeciwciała albo ich fragmenty wiążące antygen, tutaj zdefiniowane. Wiadomo, że podstawowa jednostka strukturalna przeciwciał zawiera tetramer podjednostek. Każdy tetramer składa się z dwóch identycznych par łańcuchów polipeptydowych, przy czym każda para zawiera jeden „lekki (o około 25 kDa) i jeden „ciężki łańcuch (o około 50-70 kDa). Aminowa część końcowa każdego łańcucha zawiera zmienny region z około 100 - 110 lub większej liczby aminokwasów, odpowiedzialny przede wszystkim za rozpoznawanie antygenu. Karboksylowa część końcowa każdego łańcucha określa stały region odpowiedzialny przede wszystkim za funkcję efektorową.

Lekkie łańcuchy klasyfikuje się jako kappa lub lambda zawierają one około 230 reszt. Ciężkie łańcuchy klasyfikuje się jako gamma (γ), mi (μ), alfa (a), delta (δ) lub epsilon (ε), zawierają około 450-600 reszt i definiują izotyp przeciwciała odpowiednio jako IgG, IgM, IgA, IgD i IgE. Zarówno ciężkie jak i lekkie łańcuchy są pofałdowane w domeny. Określenie „domena oznacza globularny region białka, np. immunoglobuliny lub przeciwciała. Domeny immunoglobuliny lub przeciwciała zawierają np. 3 lub 4 pętle peptydowe, stabilizowane np. przez β-pofałdowaną kartkę i międzyłańcuchowe wiązanie disulfidowe. Nienaruszone lekkie łańcuchy zawierają np. 2 domeny (VL i CL), a nienaruszone ciężkie łańcuchy zawierają np. 4 lub 5 domen (VH, CH1, CH2 i CH3).

W lekkich i ciężkich łańcuchach zmienne i stałe regiony są połączone regionem „J z około 12 lub większej liczby aminokwasów, przy czym ciężki łańcuch zawiera również region „D z jeszcze około 10 aminokwasami (patrz ogólnie Fundamental Inmunology (Paul W., red., 2 wydanie. Raven Press, N. Y. (1989), rozdz. 7, który wprowadza się w całości we wszelkich celach jako źródło literaturowe).

Zmienne regiony każdej pary łańcuchów lekki/ciężki tworzą miejsce wiązania przeciwciała. W związku z tym nienaruszone przeciwciało ma 2 miejsca wiązania. Z wyjątkiem dwufunkcyjnych lub bispecyficznych przeciwciał, dwa miejsca wiązania są takie same. Wszystkie łańcuchy mają taką samą ogólną strukturę ze stosunkowo zachowanymi regionami zrębowymi (FR) połączonymi trzema hiperzmiennymi regionami, określanymi również jako regiony determinujące komplementarność lub CDR. Naturalnie występujące łańcuchy lub rekombinacyjnie wytworzone łańcuchy mogą być eksprymowane z sekwencją liderową, która jest usuwana podczas obróbki w komórce, z wytworzeniem dojrzałego łańcucha. Można również wytworzyć rekombinacyjnie dojrzałe łańcuchy zawierające niewystępującą naturalnie sekwencję liderową, np. w celu wzmocnienia wydalania lub zmiany obróbki konkretnego interesującego łańcucha.

CDR dwóch dojrzałych łańcuchów w każdej parze są dopasowane regionami zrębowymi, co umożliwia wiązanie z określonym epitopem. Od N-końca do C-końca łańcuchy, lekki i ciężki, zawierają domeny FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 i FR4. „FR4 określa się również jako region D/J zmiennego ciężkiego łańcucha oraz region J zmiennego lekkiego łańcucha. Przypisanie aminokwasów do każdej z domen jest zgodne z definicją Kabata, Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1987 i 1991). Alternatywne definicje strukturalne zostały zaproponowane przez Chothia i inni, J. Mol. Biol. 196: 901 (1987); Nature 342: 878 (1989); i J. Mol. Biol. 186: 651 (1989) (poniżej określane łącznie jako „Chothia i inni, który wprowadza się w całości we wszelkich celach jako źródło literaturowe).

PL 211 761 B1

A. Przeciwciała Aβ

1. Humanizowane przeciwciała

Wynalazek dotyczy humanizowanych przeciwciał (humanizowanych immunoglobulin), specyficznych względem peptydu β-amyloidu. Humanizowane przeciwciała wykazują taką samą lub podobną specyficzność i powinowactwo wiązania, jak mysie lub inne przeciwciało niepochodzące od człowieka, które stanowi wyjściowy materiał do konstruowania humanizowanego przeciwciała.

Α. Wytwarzanie humanizowanych przeciwciał

Określenie „humanizowane przeciwciało odnosi się do przeciwciała zawierającego co najmniej jeden łańcuch zawierający reszty zrębowe zmiennego regionu, pochodzące zasadniczo z łańcucha ludzkiego przeciwciała (określanego jako akceptorowa immunoglobulina lub przeciwciało) i co najmniej jeden region determinujący komplementarność, pochodzące zasadniczo z mysiego przeciwciała, (określanego jako donorowa immunoglobulina lub przeciwciało). Patrz, Queen i inni. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 10029-10033 (1989), US 5530101, US 5585089, US 5693761, US 5693762, Selick i inni, WO 90/07861 oraz Winter, US 5225539 (które wprowadza się w całości jako źródła literaturowe we wszelkich celach). Jeśli obecny jest stały region (stałe regiony), to pochodzą one również zasadniczo lub wyłącznie z ludzkiej immunoglobuliny.

Podstawienie mysimi CDR zrębu ludzkiej zmiennej domeny najprawdopodobniej doprowadzi do zachowania ich prawidłowej orientacji przestrzennej, jeśli zrąb ludzkiej zmiennej domeny przyjmuje taką samą lub podobną konformację, jak mysi zmienny zrąb, z którego pochodzą CDR. Osiąga się to przez zastosowanie ludzkich zmiennych domen z ludzkich przeciwciał, których sekwencje zrębowe wykazują wysoki stopień identyczności sekwencji z mysimi zmiennymi domenami zrębowymi, z których pochodzą CDR. Zmienne regiony zrębowe ciężkiego i lekkiego łańcucha mogą pochodzić z tych samych lub różnych sekwencji ludzkiego przeciwciała. Sekwencje ludzkiego przeciwciała mogą być sekwencjami naturalnie występującego ludzkiego przeciwciała, albo mogą być sekwencjami konsensusowymi dla szeregu ludzkich przeciwciał. Patrz Kettleborough i inni, Protein Engineering 4: 773 (1991); Kolbinger i inni. Protein Engineering 6: 971 (1993) oraz Carter i inni, WO 92/22653.

Po zidentyfikowaniu regionów determinujących komplementarność mysiej donorowej immunoglobuliny i odpowiednich akceptorowych ludzkich immunoglobulin, następnym etapem jest ustalenie, które reszty z tych składników powinny być ewentualnie podstawione w celu zoptymalizowania właściwości otrzymanego humanizowanego przeciwciała. Ogólnie podstawienie ludzkich reszt aminokwasowych mysimi powinno być ograniczone do minimum, gdyż wprowadzenie mysich reszt zwiększa ryzyko otrzymania przeciwciała wywołującego u ludzi odpowiedź ludzkiego przeciwciała przeciw-mysiego (HAMA). Znane sposoby ustalania odpowiedzi odpornościowej można zastosować do monitorowania odpowiedzi HAMA u konkretnego pacjenta lub podczas prób klinicznych. U pacjentów, którym podano humanizowane przeciwciała, można dokonać oceny immunogenności na początku i w trakcie stosowania takiej terapii. Odpowiedź HAMA mierzy się, np. przez wykrywanie przeciwciał względem humanizowanego odczynnika terapeutycznego, w próbkach surowicy od pacjenta, znanymi sposobami, w tym techniką powierzchniowego rezonansu plazmonowego (BIACORE) i/lub w analizie ELISA na fazie stałej.

Pewne aminokwasy z ludzkich reszt zrębowych zmiennego regionu są wybrane do podstawienia w oparciu o ich możliwy wpływ na konformację CDR i/lub wiązanie z antygenem. Nienaturalne nakładanie się mysich regionów CDR z ludzkimi zmiennymi regionami zrębowymi może doprowadzić do nienaturalnych napięć konformacyjnych, co, o ile nie zostanie skorygowane przez podstawienie pewnych reszt aminokwasowych, prowadzi do utraty powinowactwa wiązania.

Dobór reszt aminokwasów do podstawienia ustala się częściowo w oparciu o modelowanie komputerowe. Opisano tutaj sprzęt i oprogramowanie komputerowe do wytwarzania trójwymiarowych obrazów cząsteczek immunoglobuliny. Ogólnie modele cząsteczek otrzymuje się wychodząc z rozwiązanych struktur łańcuchów immunoglobuliny lub ich domen. Łańcuchy do modelowania porównuje się pod względem podobieństwa sekwencji aminokwasowych z łańcuchami lub domenami rozwiązanych trójwymiarowych struktur i łańcuchy lub domeny wykazujące najwyższe podobieństwo sekwencji wybiera się jako punkty wyjściowe do konstrukcji modelu cząsteczkowego. Do modelowania wybiera się łańcuchy lub domeny wykazujące co najmniej 50% identyczności sekwencji, korzystnie te, które wykazują co najmniej 60%, 70%, 80%, 90% identyczności sekwencji lub powyżej. Rozwiązane wyjściowe struktury modyfikuje się, aby wprowadzić różnice pomiędzy konkretnymi aminokwasami w modelowanych łańcuchach lub domenach immunoglobuliny i w wyjściowej strukturze. Zmodyfikowane struktury składa się następnie w złożoną immunoglobulinę. Na koniec model optymalizuje się

PL 211 761 B1 pod względem minimum energetycznego i sprawdza się, czy wszystkie atomy znajdują się w odpowiedniej odległości od innych oraz czy długości wiązań i kąty pomiędzy nimi znajdują się w granicach dopuszczalnych chemicznie.

Doboru reszt aminokwasowych do podstawienia można również częściowo dokonać przez badanie charakterystyki aminokwasów w konkretnych miejscach lub empiryczną obserwację wpływu podstawienia lub mutagenezy konkretnych aminokwasów. Przykładowo, gdy aminokwas różni się pomiędzy mysią resztą zrębową zmiennego regionu i wybraną ludzką resztą zrębową zmiennego regionu, aminokwas ludzkiego zrębu powinien być zazwyczaj podstawiony równoważnym aminokwasem zrębowym z mysiego przeciwciała, gdy z pewną dozą prawdopodobieństwa oczekuje się, że aminokwas:

(1) niekowalencyjnie wiąże się bezpośrednio z antygenem, (2) sąsiaduje z regionem CDR, (3) w inny sposób oddziałuje z regionem CDR (np. znajduje się w obszarze około 3-6 A od regionu CDR, zgodnie z ustaleniem na podstawie modelowania komputerowego) lub (4) uczestniczy w połączeniu VL-VH.

Do reszt, które „niekowalencyjnie wiążą się bezpośrednio z antygenem należą aminokwasy w pozycjach w regionach zrębowych, w których występuje dobre prawdopodobieństwo bezpośredniego oddziaływania z aminokwasami na antygenie poprzez określone siły chemiczne, np. poprzez wiązania wodorowe, siły Van der Waalsa, oddziaływania hydrofobowe itp.

Regiony CDR i zrębowe określone są według definicji Kabata i innych lub Chothia i innych, supra. Gdy reszty zrębowe, według definicji Kabata i innych, supra, stanowią reszty strukturalnej pętli, zdefiniowanej według Chothia i inni, supra, aminokwasy obecne w mysim przeciwciele można wybrać do podstawienia w humanizowanym przeciwciele. Reszty „sąsiadujące z regionem CDR stanowią reszty aminokwasów w pozycjach bezpośrednio sąsiadujących z jednym lub większą liczbą CDR w podstawowej sekwencji łańcucha humanizowanej immunoglobuliny, np. w pozycjach bezpośrednio sąsiadujących z CDR zgodnie z definicją Kabata lub CDR zgodnie z definicją Chothia (Patrz np., Chothia i Lesk, JMB 196: 901 (1987)). Takie aminokwasy szczególnie prawdopodobnie będą oddziaływać z aminokwasami w CDR oraz, jeśli wybrane są z akceptora, będą zniekształcać donorowe CDR i zmniejszać powinowactwo. Ponadto sąsiadujące aminokwasy mogą oddziaływać bezpośrednio z antygenem (Amit i inni. Science, 233: 747 (1986), publikacja, którą wprowadza się jako źródło literaturowe) i wybranie tych aminokwasów z donora może być pożądane, aby utrzymać kontakty z antygenem, zapewniające powinowactwo w oryginalnym przeciwciele.

Do reszt „w inny sposób oddziałujących z regionem CDR należą te, w przypadku których na podstawie drugorzędowej strukturalnej analizy ustalono, że są w przestrzennej orientacji wystarczającej do wpływania na region CDR. W jednej postaci reszty „w inny sposób oddziałujące z regionem CDR identyfikuje się na podstawie analizy trójwymiarowego modelu donorowej immunoglobuliny (np. modelu wygenerowanego komputerowo). Trójwymiarowy model, zazwyczaj wyjściowego donorowego przeciwciała, wykazuje, że pewne aminokwasy poza CDR znajdują się blisko CDR i istnieje duże prawdopodobieństwo ich oddziaływania z aminokwasami w CDR poprzez wiązania wodorowe, siły Van der Waalsa, oddziaływania hydrofobowe itp. W tych pozycjach aminokwasów może być wybrany raczej aminokwas donorowej immunoglobuliny niż aminokwas akceptorowej immunoglobuliny. Aminokwasy według tego kryterium będą zazwyczaj miały atom bocznego łańcucha w odległości do około 3 angstremów (A) od pewnego atomu w CDR i muszą zawierać atom, który może oddziaływać z atomami CDR z wykorzystaniem określonych sił chemicznych, takich jak wymienione powyżej.

W przypadku atomów, które mogą tworzyć wiązanie wodorowe, odległość 3 A mierzy się pomiędzy ich jądrami, ale w przypadku atomów, które nie tworzą wiązania, odległość 3 A mierzy się pomiędzy ich powierzchniami Van der Waalsa. Dlatego też w tym ostatnim przypadku, jądra muszą znajdować się w granicach około 6 A (3 A plus suma promieni Van der Waalsa) w przypadku atomów, które uważa się za zdolne do oddziaływania. W wielu przypadkach jądra będą w odległości 4 lub 5 - 6 A. Przy ustalaniu, czy aminokwas może oddziaływać z CDR, korzystnie nie uwzględnia się ostatnich 8 aminokwasów CDR2 ciężkiego łańcucha jako części CDR, gdyż z punktu widzenia struktury tych 8 aminokwasów zachowuje się bardziej jako część zrębu.

Aminokwasy, które są zdolne do oddziaływania z aminokwasami w CDR, można zidentyfikować w jeszcze inny sposób. Dostępną dla rozpuszczalnika powierzchnię każdego aminokwasu zrębowego oblicza się dwoma sposobami: (1) dla nienaruszonego przeciwciała oraz (2) dla hipotetycznej cząsteczki stanowiącej przeciwciało, z którego usunięto jego CDR. Istotna różnica pomiędzy tymi liczbaPL 211 761 B1 mi, około 10 A² lub powyżej, wskazuje, że dostęp aminokwasu zrębowego do rozpuszczalnika jest co najmniej częściowo zablokowany przez CDR, a zatem ten aminokwas kontaktuje się z CDR. Dostępną dla rozpuszczalnika powierzchnię aminokwasu można obliczyć w oparciu o trójwymiarowy model przeciwciała, z użyciem znanych algorytmów (np. Connolly, J. Appl. Cryst. 16: 548 (1983) oraz Lee i Richards, J. Mol. Biol. 55: 379 (1971), publikacje, które wprowadza się jako źródła literaturowe). Aminokwasy zrębowe mogą także czasami oddziaływać z CDR pośrednio, przez wpływanie na konformację innego aminokwasu zrębowego, który z kolei styka się z CDR.

Wiadomo, że aminokwasy w kilku pozycjach w zrębie są zdolne do oddziaływania z CDR w wielu przeciwciałach (Chothia i Lesk, supra, Chothia i inni, supra oraz Tramontano i inni, J. Mol. Biol. 215: 175 (1990), przy czym wszystkie publikacje wprowadza się jako źródła literaturowe). Należy podkreślić, że wiadomo, iż aminokwasy w pozycjach 2, 48, 64 i 71 lekkiego łańcucha oraz 26-30, 71 i 94 ciężkiego łańcucha (numerowanie według Kabata) są zdolne do oddziaływania z CDR w wielu przeciwciałach. Jest również prawdopodobne, że aminokwasy w pozycji 35 w lekkim łańcuchu oraz 93 i 103 w ciężkim łańcuchu mogą oddziaływać z CDR. W pozycjach o wszystkich tych numerach korzystnie dobiera się raczej aminokwas donorowy niż aminokwas akceptorowy (gdy różnią się one) w humanizowanej immunoglobulinie. Z drugiej strony pewne reszty zdolne do oddziaływania z regionem CDR, takie jak pierwszych 5 aminokwasów lekkiego łańcucha, można czasami wybrać z akceptorowej immunoglobuliny bez utraty powinowactwa w humanizowanej immunoglobulinie.

Do reszt, które „uczestniczą w połączeniu VL-VH lub do „reszt upakowania międzyłańcuchowego należą reszty z połączenia pomiędzy VL i VH, zdefiniowane np. w publikacjach Novotny i Haber, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 4592-66 (1985) lub Chothia i inni, supra. Zazwyczaj nietypowe reszty upakowania powinny być zachowane w humanizowanym przeciwciele, jeśli różnią się one od odpowiednich reszt w ludzkich zrębach.

Zazwyczaj jeden lub większa liczba aminokwasów spełniających powyższe kryteria, jest podstawiona. W pewnych postaciach wszystkie lub większość aminokwasów spełniających powyższe kryteria jest podstawiona. Czasami istnieją pewne wątpliwości odnośnie tego, czy konkretny aminokwas spełnia powyższe kryteria, tak że wytwarza się wariantowe immunoglobuliny, z których jedna zawiera określone podstawienie, a druga nie zawiera go. Otrzymane w ten sposób wariantowe immunoglobuliny można zbadać w dowolnej z opisanych tutaj prób w celu ustalenia żądanej aktywności i wybrania korzystnej immunoglobuliny.

Zwykle regiony CDR w humanizowanych przeciwciałach są zasadniczo identyczne, a częściej identyczne z odpowiednimi regionami CDR donorowego przeciwciała. Choć nie jest to zazwyczaj pożądane, czasami można wykonać jedno lub większą liczbę konserwatywnych podstawień aminokwasów w resztach CDR bez znaczącego wpływania na powinowactwo wiązania otrzymanej humanizowanej immunoglobuliny. Konserwatywne podstawienia obejmują połączenia, takie jak gly, ala; val, ile, leu; asp, glu; asn, gln; ser, thr; lys, arg; oraz phe, tyr.

Dodatkowymi kandydatami do podstawienia są aminokwasy akceptorowego ludzkiego zrębu, które są nietypowe lub „rzadkie w ludzkiej immunoglobulinie w tej pozycji. Te aminokwasy można podstawić aminokwasami z odpowiednich pozycji mysiego donorowego przeciwciała lub z odpowiednich pozycji bardziej typowych ludzkich immunoglobulin. Przykładowo, podstawienie może być pożądane, gdy aminokwas w ludzkim regionie zrębowym akceptorowej immunoglobuliny jest rzadki w tej pozycji, a odpowiedni aminokwas w donorowej immunoglobulinie jest powszechny w tej pozycji w sekwencjach ludzkiej immunoglobuliny; albo gdy aminokwas w akceptorowej immunoglobulinie jest rzadki w tej pozycji, a odpowiedni aminokwas w donorowej immunoglobulinie jest również rzadki, w stosunku do innych ludzkich sekwencji. To kryterium ułatwia zapewnienie, że inny niż typowy aminokwas w ludzkim zrębie nie zniszczy struktury przeciwciała. Ponadto przez zastąpienie nietypowego ludzkiego aminokwasu akceptorowego aminokwasem z donorowego przeciwciała, które jest bardziej typowe dla ludzkiego przeciwciała, humanizowanemu przeciwciału można nadać mniejszą immunogenność.

W opisie określenie „rzadki oznacza aminokwas występujący w danej pozycji w mniej niż około 20%, a zazwyczaj w mniej niż około 10% sekwencji w reprezentatywnej próbce sekwencji, a użyte w opisie określenie „powszechny oznacza aminokwas występujący w powyżej około 25%, a zazwyczaj w powyżej około 50% sekwencji w reprezentatywnej próbce. Przykładowo, wszystkie sekwencje ludzkiego zmiennego regionu lekkiego i ciężkiego łańcucha są odpowiednio pogrupowane w „podgrupy sekwencji, które wykazują szczególną homologię pomiędzy sobą i zawierają takie same aminokwasy w pewnych krytycznych pozycjach (Kabat i inni, supra). Przy decydowaniu o tym, czy amino14

PL 211 761 B1 kwas w ludzkiej sekwencji akceptorowej jest „rzadki, czy też „powszechny wśród ludzkich sekwencji, często korzystnie uwzględnia się tylko ludzkie sekwencje z tej samej podgrupy, co sekwencja akceptorowa.

Dodatkowymi kandydatami do podstawienia są aminokwasy akceptorowego ludzkiego zrębu, które mogłyby być zidentyfikowane jako część regionu CDR zgodnie z wariantową definicją, którą zaproponowali Chothia i inni, supra. Dodatkowymi kandydatami do podstawienia są aminokwasy akceptorowego ludzkiego zrębu, które mogłyby być zidentyfikowane jako część regionu CDR zgodnie z definicją AbM i/lub kontaktową. Należy podkreślić, że CDR1 w zmiennym ciężkim łańcuchu jest zdefiniowany jako zawierający reszty 26-32.

Dodatkowymi kandydatami do podstawienia są akceptorowe reszty zrębowe, które odpowiadają rzadkiej lub nietypowej donorowej reszcie zrębowej. Rzadkimi lub nietypowymi donorowymi resztami zrębowymi są te, które są rzadkie lub nietypowe (w zdefiniowanym znaczeniu) dla mysiego przeciwciała w tej pozycji. W przypadku mysich przeciwciał, podgrupę można ustalić według Kabata, oraz zidentyfikować pozycje reszt, które różnią się od konsensusu. Te donorowe specyficzne różnice mogą wskazywać na somatyczne mutacje w mysiej sekwencji, zwiększające aktywność. Zachowuje się te nietypowe reszty, w przypadku których przewiduje się wpływ na wiązanie, a reszty, w przypadku których przewiduje się, że nie mają znaczenia dla wiązania, można podstawić.

Dodatkowymi kandydatami do podstawienia są niegerminalne reszty występujące w akceptorowym regionie zrębowym. Przykładowo, gdy łańcuch akceptorowego przeciwciała (np. łańcuch ludzkiego przeciwciała wykazujący istotną identyczność sekwencji z łańcuchem donorowego przeciwciała) dopasowuje się do germinalnego łańcucha przeciwciała (również wykazującego istotną identyczność sekwencji z łańcuchem donorowym), reszty niedopasowane pomiędzy akceptorowym zrębem łańcucha i germinalnym zrębem łańcucha można podstawić odpowiednimi resztami z sekwencji germinalnej.

Poza specyficznymi podstawieniami aminokwasowymi, przedyskutowanymi powyżej, regiony zrębowe humanizowanych immunoglobulin są zwykle zasadniczo identyczne, a częściej identyczne z regionami zrębowymi ludzkiego przeciwciała, z którego pochodzą. Oczywiście bezpośredni udział w specyficzności lub powinowactwie przeciwciała wielu spośród aminokwasów w zrębowym regionie jest niewielki lub żaden. W związku z tym można zaakceptować wiele konserwatywnych podstawień reszt zrębowych bez znaczącej zmiany specyficzności lub powinowactwa otrzymanej humanizowanej immunoglobuliny. W związku z tym w jednej postaci zmienny region zrębowy humanizowanej immunoglobuliny wykazuje co najmniej 85% identyczności sekwencji z sekwencją ludzkiego zmiennego regionu zrębowego lub konsensusem takich sekwencji. W innej postaci zmienny region zrębowy humanizowanej immunoglobuliny wykazuje co najmniej 90%, korzystnie 95%, korzystniej 96%, 97%, 98% lub 99% identyczności sekwencji z sekwencją ludzkiego zmiennego regionu zrębowego lub konsensusem takich sekwencji. Zazwyczaj jednak takie podstawienia są niepożądane.

Humanizowane przeciwciała korzystnie wykazują specyficzne powinowactwo wiązania z anty7 ft Q 1Π 1 genem co najmniej 10⁷, 10⁸, 10⁹ lub 10¹⁰ M^-1. Zwykle górna granica powinowactwa wiązania humanizowanego przeciwciała z antygenem jest trzy-, cztero- lub pięciokrotnie większa niż w przypadku donorowej immunoglobuliny. Często dolna granica powinowactwa wiązania jest również trzy-, cztero- lub pięciokrotnie większa niż w przypadku donorowej immunoglobuliny. Alternatywnie powinowactwo wiązania można porównać z powinowactwem humanizowanego przeciwciała niezawierającego podstawień (czyli przeciwciała zawierającego donorowe CDR i akceptorowe FR, ale bez podstawień w FR). W takich przypadkach wiązanie zoptymalizowanego przeciwciała (z podstawieniami) jest korzystnie co najmniej 2-3-krotnie lub 3-4-krotnie wyższe, niż niepodstawionego przeciwciała. W celu dokonania porównań aktywność różnych przeciwciał można oznaczyć techniką BIACORE (czyli techniką powierzchniowego rezonansu plazmonowego z użyciem nieznakowanych reagentów) lub w próbach konkurencyjnego wiązania.

B. Wytwarzanie humanizowanych przeciwciał 3D6

Wynalazek dotyczy humanizowanego przeciwciała względem N-końca w Αβ, w szczególności do stosowania w opisanych tutaj sposobach terapeutycznych i/lub diagnostycznych. Materiałem wyjściowym do wytwarzania humanizowanych przeciwciał jest 3D6. 3D6 jest specyficzny względem N-końca w Aβ i, jak wykazano, pośredniczy w fagocytozie (np. wywołuje fagocytozę) płytek amyloidowych (patrz przykłady I-V). Klonowanie i sekwencjonowanie cDNA kodującego zmienne regiony ciężkiego i lekkiego łańcucha przeciwciała 3D6 opisano w przykładzie VI.

Odpowiednie sekwencje ludzkiego akceptorowego przeciwciała identyfikuje się przez komputerowe porównywanie sekwencji aminokwasowych mysich zmiennych regionów z sekwencjami znanych

PL 211 761 B1 ludzkich przeciwciał. Porównanie przeprowadza się osobno dla ciężkiego i lekkiego łańcucha, z tym, że zasady w każdym przypadku są podobne. W szczególności, zmienne domeny ludzkiego przeciwciała, którego sekwencje zrębowe wykazują wysoki stopień identyczności sekwencji z mysimi regionami zrębowymi VL i VH zidentyfikowano przez zapytanie do bazy danych Kabat Database z wykorzystaniem NCBI BLAST (dostępnego publicznie przez serwer internetowy National Institutes of Health NCBI) odnośnie odpowiednich mysich sekwencji zrębowych. W jednej postaci wybiera się sekwencje akceptorowe wykazujące ponad 50% identyczności sekwencji z mysimi sekwencjami donorowymi. Korzystnie, wybiera się sekwencje przeciwciała akceptorowego wykazujące 60%, 70%, 80%, 90% identyczności lub powyżej.

Komputerowe porównywanie 3D6 potwierdziło, że lekki łańcuch 3D6 wykazuje najwyższą identyczność sekwencji z ludzkimi lekkimi łańcuchami podtypu kappa II, a ciężki łańcuch 3D6 wykazuje najwyższą identyczność sekwencji z ludzkimi ciężkimi łańcuchami podtypu III, według definicji Kabata i innych, supra. W związku z tym ludzkie regiony zrębowe, lekki i ciężki, pochodzą od ludzkiego przeciwciała tych podtypów lub z sekwencji konsensusowych tych podtypów. Korzystne zmienne regiony ludzkiego lekkiego łańcucha wykazujące najwyższą identyczność sekwencji z odpowiednim regionem z 3D6 pochodzą od przeciwciał o numerach Kabat ID 019230, 005131, 005058, 005057, 005059, U21040 i U41645, przy czym 019230 jest korzystniejszy. Korzystne zmienne regiony ludzkiego ciężkiego łańcucha wykazujące najwyższą identyczność sekwencji z odpowiednim regionem z 3D6 pochodzą od przeciwciał o numerach Kabat ID 045919, 000459, 000553, 000386 i M23691, przy czym 045919 jest korzystniejszy.

Reszty następnie wybiera się do podstawienia w sposób następujący. Gdy występuje różnica aminokwasu pomiędzy zmiennym regionem zrębowym 3D6 i równoważnym ludzkim zmiennym regionem zrębowym, aminokwas ludzkiego zrębu należy zazwyczaj podstawić odpowiednim mysim aminokwasem, jeśli z pewną dozą prawdopodobieństwa oczekuje się, że aminokwas:

(1) niekowalencyjnie wiąże się bezpośrednio z antygenem, (2) sąsiaduje z regionem CDR, stanowi część regionu CDR zgodnie z alternatywną definicją, którą zaproponowali Chothia i inni, supra lub w inny sposób oddziaływuje z regionem CDR (czyli znajduje się w obszarze około 3 A od regionu CDR) (co dotyczy aminokwasów w pozycjach L2, H49 i H94 w 3D6) lub (3) uczestniczy w połączeniu VL-VH (co dotyczy aminokwasów w pozycjach L36, L46 i H93 w 3D6).

Komputerowe modelowanie zmiennego regionu ciężkiego i lekkiego łańcucha przeciwciała 3D6 i humanizację przeciwciała 3D6 opisano w przykładzie VII. W skrócie, wygenerowano trójwymiarowy model w oparciu o najbliższe rozwiązanie struktury mysiego przeciwciała dla ciężkiego i lekkiego łańcucha. W tym celu wybrano przeciwciało oznaczone jako 1CR9 (Protein Data Bank (PDB) ID: 1CR9, Kanyo i inni, J. Mol. Biol. 293: 855 (1999)) jako matrycę do modelowania lekkiego łańcucha 3D6, a przeciwciało oznaczone jako 10PG (PDB ID: 10PG, Kodandapani i inni, J. Biol. Chem. 270: 2268 (1995)) jako matrycę do modelowania ciężkiego łańcucha. Model dokładniej zoptymalizowano w szeregu etapów minimalizacji energii w celu złagodzenia niekorzystnych kontaktów atomowych oraz zoptymalizowania oddziaływań elektrostatycznych i oddziaływań van der Waalsa. Rozwiązaną strukturę 1qkz (PDB ID: 1QKZ, Derrick i inni, J. Mol. Biol. 293: 81 (1999)) wybrano jako matrycę do modelowania CDR3 ciężkiego łańcucha, gdyż 3D6 i 10PG nie wykazywały istotnej homologii sekwencji w tym regionie po dopasowaniu w celach porównawczych.

Informacje o trójwymiarowej strukturze opisanych przeciwciał są publicznie dostępne, np. z Research Collaboratory for Structural Bioinformatics' Protein Data Bank (PDB). PDB jest swobodnie dostępny poprzez World Wide Web internet i jest opisany przez Bermana i innych (2000) Nucleic Acids Research, 28: 235. Modelowanie komputerowe umożliwia identyfikację reszt oddziaływujących z CDR. Komputerowy model struktury 3D6 może z kolei służyć jako punkt wyjścia do przewidywania trójwymiarowej struktury przeciwciała zawierającego regiony determinujące komplementarność z 3D6, podstawione w ludzkich strukturach zrębowych. Można konstruować dodatkowe modele reprezentujące strukturę w miarę wprowadzania kolejnych podstawień aminokwasowych.

Ogólnie, pożądane jest podstawienie jednego, większości lub wszystkich aminokwasów spełniających powyższe kryteria. W związku z tym humanizowane przeciwciała według wynalazku zawierają podstawienie ludzkiej reszty zrębowej lekkiego łańcucha odpowiednią resztą 3D6 w pozycjach: L2, L36 i L46. Humanizowane przeciwciała zawierają ponadto podstawienie ludzkiej reszty zrębowej ciężkiego łańcucha odpowiednią resztą 3D6 w następujących pozycjach: H49, H93 i H94. Humanizowane przeciwciała zawierają również podstawienie reszty zrębowej ciężkiego łańcucha odpowiednią resztą germinalną w następujących pozycjach: H74, H77 i H89.

PL 211 761 B1

Jednakże czasami występują pewne wątpliwości odnośnie tego, czy konkretny aminokwas spełnia powyższe kryteria, tak że wytwarza się warianty immunoglobuliny, spośród których jeden zawiera to konkretne podstawienie, a inne nie zawierają go. W tych przypadkach, gdy podstawienie mysią resztą mogłoby doprowadzić do wprowadzenia reszty, która jest rzadka w ludzkich immunoglobulinach w konkretnej pozycji, celowe może być zbadanie przeciwciał pod względem aktywności, z tym konkretnym podstawieniem i bez niego. Jeśli aktywność (np. powinowactwo wiązania i/lub specyficzność wiązania) jest w przybliżeniu taka sama w przypadku z podstawieniem i bez niego, korzystne może być przeciwciało bez podstawienia, gdyż należałoby oczekiwać, że wywoła ono słabszą odpowiedź HAHA, jak to opisano.

Innymi kandydatami do podstawienia są aminokwasy akceptorowego ludzkiego zrębu, które są nietypowe dla ludzkiej immunoglobuliny w tej pozycji. Te aminokwasy można podstawić aminokwasami z równoważnych pozycji bardziej typowych ludzkich immunoglobulin. Alternatywnie, aminokwasy z równoważnych pozycji w mysim 3D6 można wprowadzić do ludzkich regionów zrębowych, gdy takie aminokwasy są typowe dla ludzkiej immunoglobuliny w równoważnych pozycjach.

Przykłady odpowiednich aminokwasów do podstawienia przedstawiono na fig. 1 i 2.

Innymi kandydatami do podstawienia są niegerminalne reszty występujące w regionie zrębowym. Komputerowe porównywanie 3D6 ze znanymi germinalnymi sekwencjami potwierdziło, że ciężkie łańcuchy wykazujące najwyższy stopień identyczności sekwencji zawierają germinalne sekwencje zmiennego regionu VH3-48, VH3-23, VH3-7, VH3-21 i VH3-11, przy czym VH3-23 jest korzystniejszy. Dopasowywanie Kabat ID 045919 z VH3-23 potwierdza, że reszty H74, H77 i/lub H89 można wybrać do podstawienia odpowiednimi resztami germinalnymi (np. resztami H74, H77 i/lub H89 przy porównywaniu Kabat ID 045919 i VH3-23). Podobnie germinalne sekwencje o najwyższym stopniu identyczności z lekkim łańcuchem 3D6 obejmują A1, A17, A18, A2 i A19, przy czym A19 jest najkorzystniejsza. Reszty nie dopasowane pomiędzy zrębem wybranego akceptorowego lekkiego łańcucha i jedną z tych germinalnych sekwencji można wybrać do podstawienia odpowiednimi resztami germinalnymi.

W tabeli 1 zestawiono analizę sekwencji regionów VH i VL w 3D6. Podano dodatkowe mysie i ludzkie struktury, które można zastosować do komputerowego modelowania przeciwciała 3D6 i dodatkowych ludzkich przeciwciał, jak również germinalne sekwencje, które można zastosować w wybranych podstawieniach aminokwasów. W tabeli 1 podano również rzadkie mysie reszty. Rzadkie mysie reszty identyfikuje się przez porównywanie donorowych sekwencji VL i/lub VH z sekwencjami innych składników podgrupy, do której należą donorowe sekwencje VL i/lub VH (według Kabata) i identyfikację pozycji reszt różniących się od konsensusu. Te specyficzne różnice donorowych sekwencji mogą wskazywać na somatyczne mutacje wzmacniające aktywność. Nietypowe lub rzadkie reszty w pobliżu miejsca wiązania mogą ewentualnie stykać się z antygenem, tak że zachowanie mysiej reszty może okazać się pożądane. Jednakże, jeśli niezwykła mysia reszta nie jest istotna z punktu widzenia wiązania, zastosowanie odpowiedniej reszty akceptorowej jest korzystne, gdyż mysia reszta może tworzyć immunogenne neoepitopy w humanizowanym przeciwciele. W sytuacji gdy resztę nietypową w sekwencji donorowej w rzeczywistości stanowi reszta powszechna w odpowiedniej sekwencji akceptorowej, korzystną resztę stanowi wyraźnie reszta akceptorowa.

T a b e l a 1

Zestawienie sekwencji regionu V 3D6

Łańcuch	Ciężki	Lekki
1	2	3
Mysia podgrupa (Kabat SEQ ID NO)	IIID (002688)	II (005840-005844,005851005853,005857,005863)
Mysie homologi	002727/163.1'CL	005840/1210.7
(Kabat/Genbank)	002711/H35-C6'CL 002733/8-1 -12-5-3-1 (A2-1 )'CL 002715/ASWA2'CL 020669/#14'CL	005843/42.4b.12.2'CL 005842/BXW-14'CL 005841/42.7B3.2'CL 005851/36-60CRI-
Rzadkie aminokwasy (% czę-	N40 (0,233%)	Y1(,035%)
stości występowania w klasie)	D42 (0,699%)	I15(3,3%) D27 (0,867%)-CDR1 I78 (0,677%) L85 (0,625%) W89(0,815%)-CDR3 K106A (0,295%)

PL 211 761 B1 cd. tabeli 1

1	2	3
Ludzka podgrupa	III (000488-000491,000503, 000624)	II (005046)
Kanoniczne ugrupowa-	H1: klasa 1 [2fbj]	L1: klasa 4 [1 rmfl
nia CDR wg Chothia [przykład pdb]	H2: klasa 3 [1igc]	L2: klasa 1 [1lmk] L3: klasa 1 [1tet]
Najbliższe rozwiązane	PDB ID: 10PG Kodandapani i inni,	PDB ID: 1CR9; Kanyo i in., supra; (94%, 2A)
mysie struktury	supra; (72% 2A)	PDB ID: 1NLD; Davies i in., Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallog. 53:186 (1997); (98%, 2,8A)
Najbliższe rozwiązane	1VH (68%, nmr)	1LVE(57%,LEN)
ludzkie struktury	443560 (65%, IgG, szpiczak λ, 1,8 A) KOL/2FB4H (60%, szpiczak, 3A)	1B6DA (54%, dimer B-J, 2,8 A); 1VGEL (54%, autoAb)
Wynik zapytania o ger-	VH3-48 (4512283/BAA75032.1)	A1(x63402)
minalne (Hu) (górne 4)	VH3-23 (4512287/BAA75046.1) VH3-7 (4512300/BAA75056.1) VH3-21 (4512287/BAA75047.1) VH3-11 (4152300/BAA75053.1)	Α17 (x63403) A18(X63396) A2(m31952) A19(x63397)

* Ciężki łańcuch i lekki łańcuch z tego samego przeciwciała (O-81, Hirabayashi inni, NAR 20: 2601).

Przywoływane tutaj sekwencje Kabat ID są publicznie dostępne np. z Northwestern University Biomedical Engineering Department's Kabat Database of Sequences of Proteins of Immunological Interest. Informacje odnośnie trójwymiarowej struktury opisanych tutaj przeciwciał są publicznie dostępne np. z Research Collaboratory for Structural Bioinformatics' Protein Data Bank (PDB). PDB jest swobodnie dostępny poprzez World Wide Web internet i jest opisany przez Bermana i innych (2000) Nucleic Acids Research, str. 235-242. Przywoływane tutaj sekwencje germinalnych genów są publicznie dostępne np. z bazy danych National Center for Biotechnology Information (NCBI) dla sekwencji w zbiorach germinalnych genów V, Igh, Ig kappa i Ig lambda (jako część National Library of Medicine (NLM) w National Institutes of Health (NIH)). Poszukiwanie homologii bazy danych NCBI „Ig Germline Genes jest możliwe dzięki IgG BLAST™.

Humanizowane przeciwciało według wynalazku zawiera (i) lekki łańcuch zawierający zmienną domenę zawierającą mysie CDR VL z 3D6 i ludzki zrąb akceptorowy, przy czym zrąb zawiera L2, L36 i L46 podstawione odpowiednimi resztami 3D6 i (ii) ciężki łańcuch, zawierający CDR VH z 3D6 i ludzki zrąb akceptorowy, przy czym zrąb zawiera reszty H49, H93 i H94, podstawione odpowiednimi resztami 3D6, a reszty H74, H77 i H89 są podstawione odpowiednimi ludzkimi resztami germinalnymi.

Humanizowane przeciwciało według wynalazku zawiera (i) lekki łańcuch zawierający zmienną domenę zawierającą mysie CDR VL z 3D6 i ludzki zrąb akceptorowy, przy czym zrąb zawiera resztę 2 podstawioną val (V), resztę 36 podstawioną leu (L) i resztę 46 podstawioną arg (R) oraz (ii) ciężki łańcuch, zawierający CDR VH z 3D6 i ludzki zrąb akceptorowy, przy czym zrąb zawiera resztę 49 podstawioną ala (A), resztę 93 podstawioną val (V) i resztę 94 podstawioną arg (R), oraz zawiera resztę 74 podstawioną ser (S), resztę 77 podstawioną thr (T) i/lub resztę 89 podstawioną val (V).

W szczególnie korzystnej postaci, humanizowane przeciwciało według wynalazku wykazuje opisane powyżej cechy strukturalne, a ponadto wykazuje co najmniej jedną (korzystnie dwie, trzy, cztery lub wszystkie) z następujących aktywności: (1) wiąże zagregowany Aβ 1-42 (np. na podstawie oznaczenia metodą ELISA); (2) wiąże Aβ w płytkach (np. na podstawie zabarwiania płytek AD i/lub PDAPP); (3) wiąże Aβ z 2-3-krotnie wyższym powinowactwem wiązania w porównaniu z chimerycznym 3D6 (np. 3D6 zawierającym mysie CDR i ludzkie akceptorowe FR); (4) pośredniczy w fagocytozie Aβ (np. w próbie fagocytozy ex vivo, tutaj opisanej); i (5) przekracza barierę krew-mózg (np. wykazuje krótkoterminową lokalizacje w mózgu, np. w zwierzęcym modelu PDAPP, tutaj opisanym).

W innej postaci humanizowane przeciwciało według wynalazku wykazuje cechy strukturalne, tutaj opisane, wiąże Aβ w sposób lub z powinowactwem wystarczającym do wywołania co najmniej jednego z następujących efektów in vivo: (1) zmniejsza obciążenie płytkami Aβ; (2) zapobiega tworzeniu się płytek; (3) zmniejsza poziomy rozpuszczalnego Aβ; (4) zmniejsza patologię neurytyczną związaną z zaburzeniem amyloidogennym; (5) zmniejsza lub osłabia co najmniej jeden objaw fizjologiczny związany z zaburzeniem amyloidogennym; i/lub (6) usprawnia funkcje poznawcze.

PL 211 761 B1

W innej postaci humanizowane przeciwciało według wynalazku wykazuje opisane tutaj cechy strukturalne i specyficznie wiąże się z epitopem zawierającym reszty 1-5 lub 3-7 Αβ.

2. Wytwarzanie zmiennych regionów

Po koncepcyjnym wybraniu składników CDR i zrębu humanizowanych immunoglobulin, dostępne są różne sposoby wytwarzania takich immunoglobulin. Z uwagi na degenerację kodu, szereg sekwencji kwasów nukleinowych będzie kodować każdą sekwencję aminokwasową immunoglobuliny. Żądane sekwencje kwasów nukleinowych można otrzymać drogą syntezy de novo DNA na fazie stałej lub na drodze mutagenezy PCR wcześniej otrzymanego wariantu żądanego polinukleotydu. Pośredniczona przez oligonukleotyd mutageneza jest korzystnym sposobem wytwarzania wariantów DNA docelowego polipeptydu z podstawieniem, delecją i insercją. Patrz Adelman i inni, DNA 2: 183 (1983). W skrócie, DNA docelowego polipeptydu zmienia się drogą hybrydyzacji oligonukleotydu kodującego żądaną mutację z jednoniciową matrycą DNA. Po hybrydyzacji polimerazę DNA stosuje się do syntezy całej drugiej komplementarnej nici matrycy, która wprowadza starter oligonukleotydowy i koduje wybraną zmianę w docelowym DNA polipeptydu.

3. Selekcja stałych regionów

Zmienne segmenty przeciwciał, wytworzone w sposób opisany powyżej (zmienne regiony ciężkiego i lekkiego łańcucha humanizowanych przeciwciał) zazwyczaj łączy się z co najmniej częścią stałego regionu (Fc) immunoglobuliny, zwykle ludzkiej immunoglobuliny. Sekwencje ludzkiego DNA stałego regionu można wydzielić znanymi sposobami z różnych ludzkich komórek, ale korzystnie z unieśmiertelnionych komórek B (patrz Kabat i inni, supra oraz Liu i inni, WO 87/02671) (przy czym każdą z tych publikacji wprowadza się w całości jako źródła literaturowe we wszelkich celach). Zazwyczaj przeciwciało będzie zawierać stałe regiony zarówno lekkiego łańcucha, jak i ciężkiego łańcucha. Stały region ciężkiego łańcucha zazwyczaj zawiera regiony CH1, zawiasę, CH2, CH3 i CH4. Opisane przeciwciała obejmują przeciwciała zawierające wszystkie typy stałych regionów, w tym IgM, IgG, IgD, IgA i IgE i dowolny izotyp, w tym IgG1, IgG2, IgG3 i IgG4. Wybór stałego regionu zależy częściowo od tego, czy pożądany jest zależna do przeciwciała pośredniczona przez dopełniacz i/lub komórki toksyczność. Przykładowo, izotopy IgG1 i IgG3 wykazują aktywność związaną z dopełniaczem, a izotypy IgG2 i IgG4 nie wykazują jej. Gdy pożądane jest, aby przeciwciało (np. humanizowane przeciwciało) wykazywało aktywność cytotoksyczną, stałą domenę stanowi zazwyczaj stała domena wiążąca dopełniacz, a klasę stanowi zazwyczaj IgG1. Gdy taka aktywność cytotoksyczna nie jest pożądana, stała domena może należeć do klasy IgG2. Dobór izotypu może również wpływać na przechodzenie przeciwciała do mózgu. Korzystny jest ludzki izotyp IgG1. Stałe regiony lekkiego łańcucha mogą być lambda lub kappa. Humanizowane przeciwciało może zawierać sekwencje więcej niż jednej klasy lub izotypu. Przeciwciała mogą być eksprymowane jako tetramery zawierające dwa lekkie i dwa ciężkie łańcuchy, jako odrębne ciężkie łańcuchy, lekkie łańcuchy, jako Fab, Fab'F(ab')2 i Fv, albo jako przeciwciała o pojedynczym łańcuchu, w którym zmienne domeny ciężkiego i lekkiego łańcucha są połączone poprzez łącznik.

4. Ekspresja rekombinowanych przeciwciał

Humanizowane przeciwciała wytwarza się zazwyczaj drogą rekombinacyjnej ekspresji. Kwasy nukleinowe kodujące zmienne regiony humanizowanego lekkiego i ciężkiego łańcucha, ewentualnie połączone ze stałymi regionami, wstawia się do wektorów ekspresyjnych. Lekkie i ciężkie łańcuchy można klonować w tych samych lub różnych wektorach ekspresyjnych. Segmenty DNA kodujące łańcuchy immunoglobuliny funkcjonalnie łączy się z sekwencjami kontrolnymi w wektorze (wektorach) ekspresyjnym (ekspresyjnych), które zapewniają ekspresję polipeptydów immunoglobuliny. Sekwencje kontrolujące ekspresję zawierają, ale nie wyłącznie, promotory (np. naturalnie połączone lub heterologiczne promotory), sekwencje sygnałowe, elementy wzmacniające i sekwencje zakończenia transkrypcji. Korzystnie, sekwencje kontrolujące ekspresję są eukariotycznymi układami promotorowymi w wektorach zdolnych do transformacji lub transfekcji eukariotycznych komórek gospodarzy. Po wprowadzeniu wektora do odpowiedniego gospodarza, gospodarza utrzymuje się w warunkach odpowiednich do osiągnięcia wysokiego poziomu ekspresji sekwencji nukleotydowych oraz zbierania i oczyszczania reagującego krzyżowo przeciwciała.

Takie wektory ekspresyjne zazwyczaj ulegają replikacji w organizmach gospodarzach jako episomy lub jako integralna część chromosomowego DNA gospodarza. Wektory ekspresyjne zwykle zawierają markery selekcyjne (np. oporności na ampicylinę, oporności na higromycynę, oporności na tetracyklinę lub oporności na neomycynę), aby umożliwić wykrycie komórek transformowanych żądaPL 211 761 B1 nymi sekwencjami DNA (patrz np. Itakura i inni, opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4704362).

E. coli jest jednym z prokariotycznych gospodarzy szczególnie odpowiednich do klonowania polinukleotydów (np. sekwencji DNA) według wynalazku. Do innych gospodarzy drobnoustrojowych, które można zastosować, należą laseczki, taki jak Bacillus subtilus i inne pałeczki jelitowe, takie jak Salmonella, Serratia i różne gatunki Pseudomonas. W tych gospodarzach prokariotycznych można również wytworzyć wektory ekspresyjne, które będą zazwyczaj zawierać sekwencje kontrolujące ekspresję, zgodne z komórką gospodarzem (np. miejsce inicjacji procesu replikacji). Dodatkowo obecna może być dowolna liczba różnych dobrze znanych promotorów, takich jak układ promotora laktozowego, układ promotora tryptofanowego (trp), układ promotora β-laktamazowego lub układ promotora z faga lambda. Promotory będą zazwyczaj kontrolować ekspresję, ewentualnie wraz z sekwencją operatorową, oraz zawierają sekwencje miejsca wiązania rybosomu itp., do inicjowania i dopełnienia transkrypcji i translacji.

Do ekspresji można również wykorzystać inne drobnoustroje, takie jak drożdże. Korzystnym gospodarzem drożdżowym jest Saccharomyces, z odpowiednimi wektorami zawierającymi sekwencje kontrolujące ekspresję (np. promotory), miejsce inicjacji procesu replikacji, sekwencje terminacji itp., zależnie od potrzeb. Typowe promotory obejmują kinazę 3-fosfoglicerynianu i inne enzymy glikolityczne. Do indukowanych promotorów drożdżowych należą między innymi promotory z dehydrogenazy alkoholowej, izocytochromu C i enzymów odpowiedzialnych za wykorzystanie maltozy i galaktozy.

Oprócz drobnoustrojów, hodowlę komórek ssaczych tkanek można zastosować do ekspresji i wytwarzania polipeptydów według wynalazku (np. polinukleotydów kodujących immunoglobuliny lub ich fragmenty). Patrz Winnacker, From Genes to Clons, VCH Publishers, N.Y., N.Y. (1987). Obecnie korzystne są komórki eukariotyczne, gdyż rozwinięto wiele odpowiednich linii komórek gospodarzy, zdolnych do wydzielania heterologicznych białek (np. nienaruszonych immunoglobulin), takich jak linie komórek CHO, różne linie komórek Cos, komórki HeLa, korzystnie, linie komórek szpiczaka lub transformowane komórki B albo hybrydomy. Korzystnie, komórki nie pochodzą od ludzi. Wektory ekspresyjne dla takich komórek mogą zawierać sekwencje kontrolujące ekspresję, takie jak miejsce inicjacji procesu replikacji, promotor i wzmacniacz (Queen i inni, Immunol. Rev. 89: 49 (1986)) oraz miejsca dostarczające niezbędnych informacji do obróbki, takie jak miejsca wiązania rybosomu, miejsca składania RNA, miejsca poliadenylacji i sekwencje terminatorów transkrypcji. Korzystnymi sekwencjami kontrolującymi ekspresję są promotory pochodzące z genów immunoglobuliny, SV40, adenowirusa, bydlęcego wirusa brodawczaka, wirusa cytomegalii itp. Patrz Co i inni, J. Immunol. 148: 1149 (1992).

Alternatywnie, sekwencje kodujące przeciwciała można wprowadzić w transgenach do wprowadzania do genomu transgenicznego zwierzęcia, a następnie ekspresję w mleku transgenicznego zwierzęcia (patrz np. Deboer i inni, US 5741957, Rosen, US 5304489 oraz Meade i inni, US 5849992). Do odpowiednich transgenów należą sekwencje kodujące lekkie i/lub ciężkie łańcuchy w funkcjonalnym połączeniu z promotorem i wzmacniaczem ze specyficznego genu gruczołu sutkowego, takie jak kazeina lub β-laktoglobulina.

Wektory zawierające interesujące sekwencje polinukleotydowe (np. sekwencje kodujące ciężki i lekki łańcuch oraz sekwencje kontrolujące ekspresję) można przenosić do komórek gospodarza dobrze znanymi sposobami, różniącymi się w zależności od typu komórki gospodarza. Przykładowo, transfekcję z użyciem chlorku wapnia powszechnie stosuje się w przypadku komórek prokariotycznych, podczas gdy obróbkę fosforanem wapnia, elektroporację, lipofekcję, biolistykę lub transfekcję na bazie wirusów można stosować w przypadku innych komórek gospodarzy. (Patrz ogólnie Sambrook i inni, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Press, 2 wyd., 1989) (publikacja, którą wprowadza się w całości jako źródło literaturowe we wszelkich celach). Do innych sposobów stosowanych do transformowania ssaczych komórek należy zastosowanie polibrenu, fuzji protoplastów, liposomów, elektroporacji i mikroiniekcji (patrz ogólnie Sambrook i inni, supra). Przy wytwarzaniu transgenicznych zwierząt można dokonać mikroiniekcji transgenów do zapłodnionych komórek jajowych, albo można je wprowadzić do genomu embrionalnych komórek macierzystych i jądra takich komórek przenieść do wyłuszczonych komórek jajowych.

Gdy ciężkie i lekkie łańcuchy klonuje się w odrębnych wektorach ekspresyjnych, wektory kotransfekuje się w celu osiągnięcia ekspresji i złożenia nienaruszonych immunoglobulin. Po ekspresji pełne przeciwciała, ich dimery, poszczególne lekkie i ciężkie łańcuchy lub inne postacie immunoglobuliny według wynalazku można oczyścić znanymi sposobami, takimi jak wytrącanie siarczanem amonu, kolumny powinowactwa, chromatografia kolumnowa, oczyszczanie metodą HPLC, elektroforeza

PL 211 761 B1 w żelu itp. (patrz ogólnie Scopes, Protein Purification (Springer-Verlag, N.Y., (1982)). Do zastosowań farmaceutycznych korzystne są zasadniczo czyste immunoglobuliny o co najmniej około 90 - 95% jednorodności, najkorzystniej o jednorodności 98 - 99% lub powyżej.

5. Fragmenty przeciwciał

Zakresem wynalazku objęte są również fragmenty przeciwciał. Dostarcza się fragmenty humanizowanych przeciwciał. Zazwyczaj takie fragmenty wykazują specyficzne wiązanie z antygenem z powinowactwem co najmniej 10⁷, częściej 10⁸ lub 10⁹ M^-1. Fragmenty humanizowanych przeciwciał obejmują odrębne ciężkie łańcuchy, lekkie łańcuchy Fab, Fab'F(ab')2, Fabc i Fv. Fragmenty wytwarza się technikami rekombinacji DNA lub drogą enzymatycznego lub chemicznego rozdzielania nienaruszonych immunoglobulin.

6. Badanie przeciwciał pod względem skuteczności terapeutycznej na modelach zwierzęcych

Każdej z grupy 7-9 miesięcznych myszy PDAPP wstrzyknięto 0,5 mg przeciwciał poliklonalnych przeciw-Αβ lub specyficznych przeciwciał monoklonalnych przeciw-Αβ, w postaci roztworu w PBS. Wszystkie preparaty przeciwciał oczyszczono do osiągnięcia niskich poziomów endotoksyny. Można wytworzyć monoklonalne przeciwciała przeciw fragmentowi przez wstrzyknięcie myszy fragmentu lub dłuższej formy Λβ, wytworzenie hybrydom i selekcję hybrydom pod względem przeciwciała, które specyficznie wiąże się z żądanym fragmentem Aβ bez wiązania się z innymi nie nakładającymi się fragmentami Αβ.

Myszom wykonuje się iniekcje śródotrzewnowe zależnie od potrzeb w ciągu 4 miesięcy, aby utrzymać w krążeniu stężenie przeciwciała, mierzone jako miano w ELISA, powyżej 1/1000 wartości zmierzonej metodą ELISA dla Aβ42 lub innego immunogenu. Miana monitoruje się i myszy uśmierca się pod koniec 6 miesięcznego okresu iniekcji. Pośmiertnie wykonuje się badania histochemiczne, oznaczanie poziomów Aβ i badania toksykologiczne. Stosuje się grupy liczące po 10 myszy.

7. Selekcja przeciwciał pod względem aktywności klirensowej

W celu wykonania selekcji pod względem aktywności przeciw złogom amyloidowym, próbkę tkanki z mózgu pacjenta z chorobą Alzheimera lub modelowego zwierzęcia z charakterystyczną patologią Alzheimera łączy się z fagocytowymi komórkami przenoszącymi receptor Fc, takimi jak komórki mikrogleju i badanymi przeciwciałami w pożywce in vitro. Komórki fagocytowe może stanowić pierwotna hodowla lub linia komórkowa, taka jak BV-2, C8-B4 lub THP-1. W pewnych sposobach składniki łączy się na szkiełku mikroskopowym dla ułatwienia monitorowania mikroskopowego. W pewnych sposobach przeprowadza się równolegle wielokrotne reakcje w studzienkach płytki do mikromianowania. W takim formacie odrębne miniaturowe szkiełka mikroskopowe można zamontować w odrębnych studzienkach, albo też można zastosować niemikroskopowy format wykrywania, taki jak wykrywanie Αβ metodą ELISA. Korzystnie wykonuje się serie pomiarów ilości złogu amyloidowego w mieszaninach reakcyjnych in vitro, wychodząc od wartości podstawowej przed zajściem reakcji oraz jednej lub większej liczby wartości zmierzonych w czasie reakcji. Antygen można wykryć przez wybarwianie, np. fluorescencyjnie znakowanym przeciwciałem przeciw Aβ lub innemu składnikowi płytek amyloidowych. Przeciwciało zastosowane do wybarwiania może, ale nie musi być takie samo, jak przeciwciało, którego aktywność klirensową bada się. Obniżenie w stosunku do wartości podstawowej podczas reakcji złogów amyloidowych oznacza, że badane przeciwciało wykazuje aktywność klirensową. Takie przeciwciała będą prawdopodobnie przydatne w profilaktyce lub leczeniu choroby Alzheimera i innych chorób amyloidogennych.

Analogiczne sposoby można zastosować do selekcji przeciwciał pod względem aktywności w klirensie innych typów składników biologicznych. Taką próbę można zastosować do wykrywania aktywności klirensowej w stosunku do praktycznie dowolnego rodzaju składnika biologicznego. Zazwyczaj składnik biologiczny spełnia taką samą rolę w chorobie ludzi i zwierząt. Składnik biologiczny można dostarczyć jako próbkę tkanki lub w postaci wyizolowanej. Jeśli stosuje się próbkę tkanki, to taka próbka tkanki korzystnie nie jest utrwalona, aby umożliwić łatwy dostęp do składników próbki tkanki i aby uniknąć zakłócenia konformacji składników w wyniku utrwalania. Do przykładowych próbek tkanek, które można badać w tej próbie, należy tkanka rakowa, tkanka przedrakowa, tkanka zawierająca łagodne przerosty, takie jak brodawki lub znamiona, tkanka zakażona zakaźnym drobnoustrojem, tkanka nacieczona komórkami zapalnymi, tkanka przenosząca patologiczne macierze pomiędzy komórkami (np. włókniste zapalenie osierdzia), tkanka przenosząca nieprawidłowe antygeny i tkanka bliznowata. Do przykładowych wyizolowanych składników biologicznych, które można zastosować, należy Λβ, antygeny wirusowe lub wirusy, proteoglikany, antygeny innych zakaźnych drobnoustrojów, antygeny nowotworów i cząsteczki adhezyjne. Takie antygeny można otrzymać między inPL 211 761 B1 nymi ze źródeł naturalnych, drogą rekombinacyjnej ekspresji lub syntezy chemicznej. Próbkę tkanki lub wyizolowany składnik biologiczny kontaktuje się w pożywce z fagocytowymi komórkami przenoszącymi receptory Fc, takimi jak monocyty lub komórki mikrogleju, oraz z badanym przeciwciałem. Przeciwciało może być skierowane przeciw badanemu składnikowi biologicznemu lub przeciw antygenowi związanemu z tym składnikiem. W tym ostatnim przypadku celem jest zbadanie, czy składnik biologiczny ulega zastępczo fagocytozie z antygenem. Zazwyczaj, choć nie zawsze, przeciwciało i składnik biologiczny (czasami z połączonym antygenem), kontaktuje się ze sobą przed dodaniem komórek fagocytowych. Następnie monitoruje się stężenie składnika biologicznego i/lub zasocjowanego antygenu pozostającego w pożywce, jeśli jest obecny. Zmniejszenie ilości lub stężenia antygenu lub zasocjowanego składnika biologicznego w pożywce wskazuje, że przeciwciało wykazuje odpowiedź klirensową przeciw antygenowi i/lub zasocjowanemu składnikowi biologicznemu w połączeniu z komórkami fagocytowymi (patrz np. przykład IV).

B. Kwas nukleinowy kodujący środki immunologiczne i terapeutyczne

Odpowiedzi odpornościowe przeciw złogom amyloidowym można również wywołać przez podawanie kwasów nukleinowych kodujących przeciwciała i ich łańcuchy składowe stosowane w pasywnej immunizacji. Takim kwasem nukleinowym może być DNA lub RNA. Segment kwasu nukleinowego kodujący immunogen jest zazwyczaj połączony z elementami regulacyjnymi, takimi jak promotor i wzmacniacz, co umożliwia ekspresję segmentu DNA w przewidzianych docelowych komórkach pacjenta. W przypadku ekspresji w krwinkach, co jest pożądane w celu wywołania odpowiedzi odpornościowej, elementy promotora i wzmacniacza z lekkich lub ciężkich łańcuchów genów immunoglobuliny albo główny pośredni wczesny promotor i wzmacniacz CMV są odpowiednie do kierowania ekspresją. Połączone elementy regulacyjne i sekwencje kodujące często klonuje się w wektorze. Przy podawaniu dwułańcuchowego przeciwciała, dwa łańcuchy można sklonować w tym samym wektorze lub w różnych wektorach.

Dostępnych jest szereg wirusowych układów wektorowych, obejmujących układy retrowirusowe (patrz np. Lawrie i Tumin, Cur. Opin. Genet. Develop. 3: 102-109 (1993)); wektory adenowirusowe (patrz np. Bett i inni, J. Virol. 67: 5911 (1993)); wektory oparte na wirusach związanych z adenowirusami (patrz np. Zhou i inni, J. Exp. Med. 179: 1867 (1994)), wektory wirusowe z rodziny ospy, obejmujące wirusa krowianki i wirusy ospy ptasiej, wektory wirusowe z rodzaju alfawirusów, takie jak pochodzące z wirusów Sindbis i Semliki Forest (patrz np. Dubensky i inni, J. Virol. 70: 508 (1996)), wirus wenezuelskiego zapalenia mózgu koni (patrz Johnston i inni, US 5643576) i rabdowirusy, takie jak wirus pęcherzykowego zapalenia błony śluzowej jamy ustnej (patrz Rose, WO 96/34625) i papilomawirusy (Ohe i inni, Human Gene Therapy 6: 325 (1995); Woo i inni, WO 94/12629 oraz Xiao i Brandsma, Nucleic Acids. Res. 24, 2620-2622 (1996)).

DNA kodujący immunogen lub zawierający go wektor można umieścić w liposomach. Odpowiednie lipidy i zbliżone analogi opisali Eppstein i inni, US 5208036, Felgner i inni, US 5264618, Rose, US 5279833 oraz Epand i inni, US 5283185. Wektory i DNA kodujący immunogen można również zaadsorbować lub zasocjować z nośnikami w postaci cząstek, których przykłady obejmują polimetakrylany metylu oraz polilaktydy i poli(laktyd-co-glikolid), patrz np. McGee i inni, J. Micro. Encap. (1996).

Wektory do terapii genowej lub nagie polipeptydy (np. DNA) można dostarczać in vivo przez podawanie konkretnemu pacjentowi, zazwyczaj drogą podawania ogólnoustrojowego (np. dożylnie, śródotrzewnowo, donosowo, do przewodu pokarmowego, śródskórnie, domięśniowo, podskórnie lub drogą infuzji doczaszkowej), albo podawania miejscowego (patrz np. Anderson i inni, US 5399346). Określenie „nagi polinukleotyd dotyczy polinukleotydu nieskompleksowanego z materiałami koloidalnymi. Nagie polinukleotydy czasami klonuje się w wektorze plazmidowym. Takie wektory mogą ponadto zawierać środki ułatwiające, takie jak bupiwacyna (Attardo i inni, US 5593970). DNA można także podawać z użyciem działa genowego. Patrz Xiao i Brandsma, supra. DNA kodujący immunogen wytrąca się na powierzchni mikroskopijnych perełek metalowych. Mikropociski przyspiesza się za pomocą fali szokowej lub z użyciem rozprężającego się gazowego helu, tak że wnikają one do tkanki na głębokość szeregu warstw komórek. Przydatne jest przykładowo urządzenie The Accel Gene Delivery Device, produkowane przez Agacetus, Inc. Middleton WI. Alternatywnie, nagie DNA może przejść przez skórę do krwioobiegu po prostu przez nakroplenie DNA na skórę wraz z chemicznym lub mechanicznym podrażnieniem (patrz Howell i inni, WO 95/05853).

PL 211 761 B1

W kolejnej odmianie wektory kodujące immunogeny można dostarczać do komórek ex vivo, np. do komórek wypreparowanych od konkretnego pacjenta (np. z limfocytów, aspiratów szpiku kostnego, z biopsji tkankowych) lub do uniwersalnych donorowych hematopoetycznych komórek macierzystych, a następnie ponowne wszczepienie komórek pacjentowi, zazwyczaj po wyborze komórek zawierających wprowadzony wektor.

II. Zastosowania profilaktyczne i terapeutyczne

Wynalazek dotyczy między innymi leczenia choroby Alzheimera i innych chorób amyloidogennych, przez podawanie humanizowanych immunoglobulin przeciw specyficznym epitopom w Αβ pacjentowi, w warunkach wywołujących korzystną odpowiedź terapeutyczną u pacjenta (np. wywołanie fagocytozy Αβ, zmniejszenie obciążenia płytkami, hamowanie powstawania płytek, zmniejszenie dystrofii neurytycznej, poprawę funkcji poznawczych i/lub odwracanie, leczenie lub profilaktykę osłabienia zdolności poznawczych), np. do profilaktyki lub leczenia choroby amyloidogennej. Wynalazek dotyczy także zastosowania humanizowych immunoglobulin do wytwarzania leku do leczenia lub profilaktyki choroby amyloidogennej.

W opisie określenie „leczenie oznacza stosowanie lub podawanie środka terapeutycznego pacjentowi, albo stosowanie lub podawanie środka terapeutycznego do wyizolowanej tkanki lub linii komórek pacjenta, u którego występuje choroba, objaw choroby lub predyspozycja do choroby, w celu wyleczenia, zagojenia, złagodzenia, ulżenia, zmiany, wykurowania, polepszenia, poprawy lub wpłynięcia na chorobę, objawy choroby lub predyspozycję do choroby.

W jednej postaci wynalazek dostarcza zastosowanie humanizowanego przeciwciała do wytwarzania leku do profilaktyki lub leczenia choroby związanej ze złogami amyloidowymi Aβ w mózgu pacjenta. Do takich chorób należy choroba Alzheimera, zespół Downa i osłabienie funkcji poznawczych. To ostatnie może wystąpić z innymi cechami choroby amyloidogennej lub bez nich. Pewne zastosowania według wynalazku obejmują podawanie skutecznej dawki przeciwciała, które specyficznie wiąże się ze składnikiem złogu amyloidowego u pacjenta. Takie zastosowania są szczególnie przydatne w profilaktyce lub leczeniu choroby Alzheimera u ludzi.

Przykładowe zastosowania obejmują podawanie skutecznej dawki przeciwciała, które wiąże się z Αβ. Korzystne zastosowania obejmują podawanie skutecznej dawki przeciwciała, które specyficznie wiąże się z epitopem pomiędzy resztami 1-10 Αβ, przykładowo przeciwciała, które specyficznie wiąże się z epitopem pomiędzy resztami 1-5 Αβ, przeciwciała, które specyficznie wiąże się z epitopem pomiędzy resztami 1-6 Ap, przeciwciała, które specyficznie wiąże się z epitopem pomiędzy resztami 1-7 Ap lub przeciwciała, które specyficznie wiąże się z epitopem pomiędzy resztami 3-7 Αβ. W jeszcze innej postaci wynalazek dotyczy podawania przeciwciała, które wiąże się z epitopem zawierającym wolną N-końcową resztę Ap. W jeszcze inne postaci wynalazek dotyczy podawania przeciwciała, które wiąże się z epitopem pomiędzy resztami 1-10 Αβ, przy czym resztę 1 i/lub resztę 7 w Ap stanowi kwas asparaginowy, w jeszcze innej postaci wynalazek dotyczy podawania przeciwciała, które wiąże się z peptydem Αβ bez wiązania się z pełnej długości białkiem prekursorowym amyloidu (APP). W jeszcze innej postaci izotypem przeciwciała jest ludzka IgG1.

W jeszcze innej postaci wynalazek dotyczy podawania przeciwciała, które wiąże się ze złogiem amyloidowym u pacjenta i wywołuje odpowiedź klirensową przeciw złogowi amyloidowemu. Przykładowo taka odpowiedź klirensowa może być wywołana przez fagocytozę pośredniczoną przez receptor Fc.

Terapeutyczne środki według wynalazku są zazwyczaj zasadniczo czyste i wolne od niepożądanego zanieczyszczenia. Oznacza to, że czystość środka wynosi zazwyczaj co najmniej około 50% w/w (wag./wag.), a także że środek jest zasadniczo wolny od zakłócających białek i zanieczyszczeń. Czasami czystość środków wynosi co najmniej około 80% w/w, a korzystniej co najmniej 90 lub około 95% w/w. Jednakże przy zastosowaniu zwykłych technik oczyszczania białka można otrzymać homogenne peptydy o czystości co najmniej 99% w/w.

Humanizowane immunoglobuliny można stosować w przypadku pacjentów zarówno bez objawów, jak i tych, u których już występują objawy choroby. Przeciwciała mogą stanowić humanizowane przeciwciała lub ich fragmenty (np. fragmenty wiążące antygen), jak to tutaj opisano.

W innej postaci wynalazek dotyczy podawania przeciwciała z farmaceutycznym nośnikiem, w postaci kompozycji farmaceutycznej. Alternatywnie, przeciwciało można podawać pacjentowi poprzez podawanie polinukleotydu kodującego co najmniej jeden łańcuch przeciwciała. Polinukleotyd ulega ekspresji z wytworzeniem łańcucha przeciwciała u pacjenta. Polinukleotyd ewentualnie koduje ciężki i lekki łańcuch przeciwciała. Polinukleotyd ulega ekspresji z wytworzeniem ciężkiego i lekkiego

PL 211 761 B1 łańcucha u pacjenta. W przykładowych postaciach u pacjenta monitoruje się poziom podawanego przeciwciała we krwi pacjenta.

W związku z tym wynalazek zaspokaja od dawna istniejące zapotrzebowanie na tryby terapeutyczne w profilaktyce lub łagodzeniu stanów neuropatologicznych, a u pewnych pacjentów, pogorszenia funkcji poznawczych związanych z chorobą Alzheimera.

A. Pacjenci podatni na leczenie

Do pacjentów podatnych na leczenie należą osobnicy z ryzykiem choroby, ale bez jej objawów, a także pacjenci, u których objawy już występują. W przypadku choroby Alzheimera może to być praktycznie dowolna osoba z ryzykiem wystąpienia choroby Alzheimera, jeśli żyje wystarczająco długo. Z tego względu immunoglobuliny według wynalazku można podawać profilaktycznie w przypadku ogólnej populacji pacjentów bez potrzeby jakiejkolwiek oceny ryzyka u pacjenta. Immunoglobuliny według wynalazku są szczególnie przydatne w przypadku osób ze znanym genetycznym ryzykiem choroby Alzheimera. Należą do nich osoby mające krewnych, u których wystąpiła ta choroba oraz te, u których ryzyko zostało ustalone na podstawie analizy genetycznych lub biochemicznych markerów. Do genetycznych markerów ryzyka wystąpienia choroby Alzheimera należą mutacje w genie APP, zwłaszcza mutacje w pozycji 717 i pozycjach 670 i 671, określane odpowiednio jako mutacje Hardy'ego i szwedzka (patrz Hardy, supra). Do innych markerów ryzyka należą mutacje w genach preseniliny, PS1 i PS2 oraz w ApoE4, historia AD w rodzinie, hipercholesterolemia lub miażdżyca tętnic. Osoby aktualnie cierpiące na chorobę Alzheimera można rozpoznać na podstawie charakterystycznego otępienia, a także obecności opisanych powyżej czynników ryzyka. Dostępnych jest ponadto szereg testów diagnostycznych do identyfikacji osób z AD. Należą do nich pomiary poziomów CSF tau i Αβ42. Podwyższone poziomy tau i zmniejszone poziomy Αβ42 świadczą o obecności AD. Osoby cierpiące na chorobę Alzheimera można również zdiagnozować na podstawie kryteriów ADRDA, opisanych w części przykładów.

W przypadku pacjentów bez objawów leczenie można rozpocząć w dowolnym wieku (np. w wieku 10, 20, 30 lat). Jednakże zazwyczaj nie ma potrzeby rozpoczynania leczenia przed osiągnięciem przez pacjenta 40, 50, 60 lub 70 lat. Leczenie obejmuje zazwyczaj stosowanie wielu dawek w pewnym okresie czasu. Leczenie można monitorować oceniając poziomy przeciwciał w czasie. Gdy odpowiedź nie następuje, wskazana jest dawka przypominająca. W przypadku potencjalnych pacjentów z zespołem Downa, leczenie można rozpocząć przed narodzeniem, przez podawanie środka terapeutycznego matce, albo wkrótce po urodzeniu.

B. Tryby leczenia i dawki

W zastosowaniach profilaktycznych kompozycje farmaceutyczne lub leki podaje się pacjentowi podatnemu lub takiemu, u którego występuje innego rodzaju ryzyko choroby Alzheimera, w ilości wystarczającej do wyeliminowania lub zmniejszenia ryzyka, złagodzenia ostrości lub opóźnienia pojawienia się choroby, w tym biochemicznych, histologicznych i/lub związanych z zachowaniem objawów choroby, jej powikłań i pośrednich fenotypów patologicznych obecnych podczas rozwoju choroby. W zastosowaniach terapeutycznych kompozycje lub leki podaje się pacjentowi podejrzewanemu o wystąpienie choroby lub takiemu, u którego już ona występuje, w ilości wystarczającej do wyleczenia lub co najmniej częściowego zatrzymania objawów choroby (biochemicznych, histologicznych i/lub związanych z zachowaniem), w tym jej powikłań i pośrednich fenotypów patologicznych obecnych podczas rozwoju choroby.

W pewnych zastosowaniach podawanie środka zmniejsza lub eliminuje pogorszenia zdolności miopoznawczych u pacjentów, u których nie rozwinęła się jeszcze charakterystyczna patologia choroby Alzheimera. Ilość odpowiednią do osiągnięcia działania terapeutycznego lub profilaktycznego określa się jako terapeutycznie lub profilaktycznie skuteczną dawkę. Zarówno w trybie terapeutycznym, jak i profilaktycznym, środki zazwyczaj podaje się w szeregu dawkach aż do osiągnięcia wystarczającej odpowiedzi odpornościowej. Określenie „odpowiedź odpornościowa lub „odpowiedź immunologiczna obejmuje pojawienie się u biorcy humoralnej (pośredniczonej przez przeciwciała) i/lub komórkowej (pośredniczonej przez specyficzne względem antygenu komórki T lub wydzielane przez nie produkty) odpowiedzi skierowanej przeciw antygenowi. Taka odpowiedź może być odpowiedzią aktywną, czyli wywołaną przez podanie immunogenu, albo odpowiedzią pasywną, czyli wywołaną przez podanie immunoglobuliny albo przeciwciała lub prowokowanych komórek T.

PL 211 761 B1 „Środek immunogenny lub „immunogen jest zdolny do wywoływania odpowiedzi immunologicznej przeciw sobie w wyniku podania ssakowi, ewentualnie w połączeniu z adiuwantem. Zazwyczaj monitoruje się odpowiedź odpornościową i podaje się powtarzane dawki, gdy odpowiedź immunologiczna zaczyna słabnąć.

Skuteczne dawki kompozycji według wynalazku w leczeniu wyżej opisanych stanów zmieniają się w zależności od wielu różnych czynników, obejmujących sposób podawania, docelowe miejsce, stan fizjologiczny pacjenta, to, czy pacjentem jest człowiek czy też zwierzę, inne podawane leki oraz to, czy cel podawania stanowi profilaktyka, czy też leczenie. Zazwyczaj pacjentem jest człowiek, ale leczyć można również ssaki inne niż ludzie, w tym ssaki transgeniczne. Podawaną dawkę trzeba oznaczyć w celu zoptymalizowania bezpieczeństwa i skuteczności.

W przypadku pasywnej immunizacji przeciwciałem, dawka wynosi około 0,0001 - 100 mg/kg, częściej 0,01 - 5 mg/kg masy ciała pacjenta. Przykładowa dawka może wynosić 1 mg/kg masy ciała lub 10 mg/kg masy ciała albo 1-10 mg/kg, korzystnie co najmniej 1 mg/kg. Pacjentom można podawać takie dawki codziennie, co drugi dzień, raz w tygodniu lub według dowolnego innego trybu ustalonego na podstawie analizy empirycznej. Przykładowe leczenie obejmuje podawanie wielu dawek w przedłużonym okresie czasu, np. w ciągu co najmniej 6 miesięcy. Dodatkowe przykładowe tryby leczenia obejmują podawanie raz na 2 tygodnie lub raz w miesiącu lub raz na 3 - 6 miesięcy. Przykładowe tryby dawkowania obejmują podawanie 1-10 mg/kg lub 15 mg/kg w kolejnych dniach, 30 mg/kg co drugi dzień lub 60 mg/kg raz w tygodniu. W pewnych sposobach równocześnie podaje się dwa lub większą liczbę monoklonalnych przeciwciał o różnej specyficzności wiązania, i w takim przypadku dawka każdego podawanego przeciwciała mieści się w podanych zakresach.

Przeciwciało zazwyczaj podaje się wielokrotnie. Przerwy pomiędzy poszczególnymi dawkami mogą być tygodniowe, miesięczne lub roczne. Przerwy mogą być również nieregularne, zależnie od wskazań pomiarów poziomów we krwi przeciwciał względem Aβ u pacjenta. W pewnych sposobach dawkę dopasowuje się, aby osiągnąć w osoczu stężenie przeciwciał 1-1000 gg/ml, a w pewnych sposobach 25-300 gg/ml. Alternatywnie, przeciwciało można podawać jak preparat o przedłużonym uwalnianiu, przy czym w takim przypadku wymagane jest podawanie rzadziej. Dawka i częstość podawania zmieniają się w zależności od okresu półtrwania przeciwciała w organizmie pacjenta. Zazwyczaj ludzkie przeciwciała wykazują najdłuższy okres półtrwania, a następnie humanizowane przeciwciała, chimeryczne przeciwciała i przeciwciała pochodzące od człowieka.

Dawka i częstość podawania mogą zmieniać się w zależności od tego, czy leczenie jest profilaktyczne, czy też terapeutyczne. W zastosowaniach profilaktycznych kompozycje zawierające przeciwciała według wynalazku lub ich mieszaninę podaje się pacjentowi, u którego jeszcze nie wystąpił stan chorobowy, w celu wzmocnienia odporności pacjenta. Taką ilość określa się jako „profilaktycznie skuteczną dawkę. W takim zastosowaniu dokładne ilości również zależą od stanu zdrowia i ogólnej odporności pacjenta, ale zazwyczaj wynoszą 0,1 - 25 mg/dawkę, zwłaszcza 0,5 - 2,5 mg/dawkę. Stosunkowo niską dawkę podaje się stosunkowo rzadko przez długi okres czasu. Pewni pacjenci kontynuują leczenie przez resztę swojego życia.

W zastosowaniach terapeutycznych stosunkowo wysoka dawka (np. około 1 - 200 mg przeciwciała/dawkę, przy czym częściej stosowana dawka wynosi 5-25 mg) w stosunkowo krótkich odstępach czasu jest czasami niezbędna aż do zmniejszenia postępu choroby lub jej zakończenia, a korzystnie do momentu, gdy u pacjenta zaobserwuje się częściowe lub całkowite złagodzenie objawów choroby. Następnie w przypadku pacjenta może być stosowany tryb profilaktyczny.

Dawki kwasów nukleinowych kodujących przeciwciała wynoszą od około 10 ng do 1 g, od 100 ng do 100 mg, od 1 gg do 10 mg lub 30-300 gg DNA/pacjenta. Dawki dla zakaźnych wektorów wirusowych zawierają 10-100 lub więcej wirionów/dawkę.

Środki terapeutyczne można podawać pozajelitowo, miejscowo, dożylnie, doustnie, podskórnie, dotętniczo, doczaszkowo, śródotrzewnowo, do nosa lub domięśniowo, w celach profilaktycznych i/lub terapeutycznych. Najbardziej typową drogą podawania środka immunogennego jest droga podskórna, choć inne drogi mogą być równie skuteczne. Kolejną najbardziej rozpowszechnioną drogą jest iniekcja domięśniowa. Ten typ iniekcji najczęściej wykonuje się do mięśni ramienia lub nogi. W pewnych sposobach środki wstrzykuje się bezpośrednio do określonej tkanki, w której nagromadziły się złogi, np. drogą iniekcji doczaszkowej. Iniekcja domięśniowa lub infuzja dożylna są korzystne przy podawaniu przeciwciał. W pewnych sposobach określone terapeutyczne przeciwciała wstrzykuje się bezpośrednio do czaszki. W pewnych sposobach przeciwciała podaje się w postaci kompozycji lub urządzenia o przedłużonym uwalnianiu, takiego jak urządzenie Medipad™.

PL 211 761 B1

Środki według wynalazku można ewentualnie podawać w połączeniu z innymi środkami, które są co najmniej częściowo skuteczne w leczeniu choroby amyloidogennej.

W przypadku choroby Alzheimera i zespołu Downa, gdy złogi amyloidowe występują w mózgu, środki według wynalazku można również podawać w połączeniu z innymi środkami, które ułatwiają przechodzenie środków według wynalazku przez barierę krew-mózg.

C. Kompozycje farmaceutyczne

Środki według wynalazku często podaje się jako kompozycje farmaceutyczne, zawierające środek terapeutycznie czynny, oraz szereg innych farmaceutycznie dopuszczalnych składników. Patrz Remington's Pharmaceutical Science (15 wyd., Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania (1980)). Korzystna postać zależy od przewidzianego trybu podawania i zastosowania terapeutycznego. Kompozycje te mogą również zawierać, w zależności od wymaganego preparatu, farmaceutyczn ie dopuszczalne, nietoksyczne nośniki lub rozcieńczalniki, określane jako zaróbki powszechnie stosowane w formułowaniu kompozycji farmaceutycznych do podawania zwierzętom lub ludziom. Rozcieńczalnik dobiera się tak, aby nie wpływał na aktywność biologiczną połączenia. Do takich rozcieńczalników przykładowo należy woda destylowana, fizjologiczny roztwór soli buforowany fosforanem, roztwory Ringera, roztwór dekstrozy i roztwór Hanka. Dodatkowo kompozycja lub preparat farmaceutyczny mogą również zawierać inne nośniki, adiuwanty lub nietoksyczne, nieterapeutyczne, nieimmunogenne stabilizatory itp.

Kompozycje farmaceutyczne mogą również zawierać duże, powoli metabolizowane makrocząsteczki, takie jak białka, polisacharydy, takie jak chitozan, poli(kwasy mlekowe), poli(kwasy glikolowe) i kopolimery (takie jak funkcjonalizowana lateksem sepharose(TM), agaroza, celuloza itp.), polimeryczne aminokwasy, kopolimery aminokwasów i agregaty lipidowe (takie jak kropelki oleju lub liposomy). Dodatkowo takie nośniki mogą działać jako środki immunostymulujące (czyli adiuwanty).

W przypadku podawania pozajelitowego środki według wynalazku można stosować jako dawki iniekcyjne roztworu lub zawiesiny substancji w fizjologicznie dopuszczalnym rozcieńczalniku z farmaceutycznym nośnikiem, którym może być jałowa ciecz, taka jak woda, oleje, fizjologiczny roztwór soli, gliceryna lub etanol. Dodatkowo kompozycja może zawierać substancje pomocnicze, takie jak środki zwilżające lub emulgujące, środki powierzchniowo czynne, substancje buforujące pH itp. Innymi składnikami kompozycji farmaceutycznych są składniki pochodzenia naftowego, zwierzęcego, roślinnego lub syntetyczne, przykładowo olej arachidowy, olej sojowy i olej mineralny. Zazwyczaj glikole, takie jak glikol propylenowy lub glikol polietylenowy, są korzystnymi ciekłymi nośnikami, zwłaszcza w przypadku roztworów do iniekcji. Przeciwciała można podawać w postaci iniekcji typu depot lub wszczepianego preparatu, który można formułować w taki sposób, aby umożliwić przedłużone uwalnianie substancji czynnej. Przykładowa kompozycja zawiera monoklonalne przeciwciało w ilości 5 mg/ml, formułowane w wodnym buforze zawierającym 50 mM L-histydynę, 150 mM NaCl, doprowadzonym do pH 6,0 za pomocą HCl.

Zazwyczaj kompozycje wytwarza się jako preparaty do iniekcji, w postaci ciekłych roztworów lub zawiesin; można także wytwarzać stałe postacie przydatne do przygotowywania roztworów lub zawiesin w ciekłych nośnikach przed iniekcją. Preparat może być również emulgowany lub kapsułkowany w liposomach albo w mikrocząstkach, np. z polilaktydu, poliglikolidu lub ich kopolimeru, w celu wzmocnienia efektu adiuwantowego, jak to przedstawiono powyżej (patrz Langer, Science 249: 1527 (1990) i Hanes, Advanced Drug Delivery Reviews 28: 97 (1997)). Środki według wynalazku można podawać w postaci iniekcji typu depot lub wszczepianego preparatu, który można formułować w taki sposób, aby umożliwić przedłużone lub pulsacyjne uwalnianie substancji czynnej.

Do dodatkowych preparatów, odpowiednich do innych trybów podawania, należą preparaty doustne, donosowe i dopłucne, czopki i preparaty do podawania przezskórnego. W przypadku czopków do środków wiążących i nośników należą przykładowo glikole polialkilenowe lub triglicerydy; takie czopki można wytwarzać z mieszanin zawierających substancję czynną w ilości 0,5 - 10%, korzystnie 1-2%. Preparaty doustne zawierają zaróbki, takie jak farmaceutyczne gatunki mannitolu, laktozy, skrobi, stearynianu magnezu, sacharyny sodowej, celulozy i węglanu magnezu. Kompozycje te przyjmują postać roztworów, zawiesin, tabletek, pigułek, kapsułek, preparatów o przedłużonym uwalnianiu lub proszków i zawierają 10-95% substancji czynnej, korzystnie 25-70%.

Podawanie miejscowe może prowadzić do dostarczania przezskórnego lub śródskórnego. Podawanie miejscowe można ułatwić przez współpodawanie środka z toksyną cholery lub jej odtoksycznionymi pochodnymi lub jej podjednostkami, albo z innymi podobnymi toksynami bakteryjnymi (patrz Glenn i inni, Nature 391, 851 (1998)). Współpodawanie można osiągnąć przez zastosowanie

PL 211 761 B1 składników w postaci mieszaniny lub w postaci połączonych cząsteczek otrzymanych przez chemiczne sieciowanie lub ekspresję jako białko fuzyjne.

Alternatywnie, dostarczanie przezskórne można osiągnąć przez zastosowanie plastrów na skórę lub z użyciem transferosomów (Paul i inni, Eur. J. Immunol. 25: 3521 (1995); Cevc i inni, Biochem. Biophys. Acta 1368: 201-15 (1998)).

III. Monitorowanie przebiegu leczenia

Humanizowane przeciwciała według wynalazku można stosować w sposobach monitorowania leczenia pacjenta cierpiącego lub podatnego na chorobę Alzheimera, np. monitorowania przebiegu leczenia zastosowanego u pacjenta. Sposób ten można zastosować do monitorowania zarówno leczenia terapeutycznego pacjentów z objawami, jak i profilaktycznego leczenia pacjentów bez objawów. W szczególności sposoby są przydatne do monitorowania pasywnej immunizacji (np. do pomiaru poziomu podanego przeciwciała).

Pewne sposoby obejmują wyznaczanie wartości wyjściowej, np. poziomu lub profilu przeciwciał u pacjenta, przed podaniem dawki środka, oraz porównanie jej z wartością profilu lub poziomu po leczeniu. Istotny wzrost (czyli wyższy niż typowy margines błędu doświadczalnego w powtórzonych pomiarach tej samej próbki, wyrażony jako jedno odchylenie standardowe od wartości średniej takich pomiarów) wartości poziomu lub profilu jest sygnałem dodatniego wyniku leczenia (czyli, że podanie środka wywołało pożądaną odpowiedź). Jeśli wartość odpowiedzi odpornościowej nie zmienia się istotnie lub spada, jest to oznaką ujemnego wyniku leczenia.

W innych sposobach wartość kontrolną (czyli wartość średnią z odchyleniem standardowym) poziomu lub profilu ustala się dla kontrolnej populacji. Zazwyczaj osobnicy w kontrolnej populacji nie byli wcześniej poddawani leczeniu. Zmierzone wartości poziomu lub profilu u pacjenta po podaniu środka terapeutycznego porównuje się następnie z wartością kontrolną. Istotny wzrost w stosunku do wartości kontrolnej (np. powyżej jednego odchylenia standardowego od średniej) oznacza dodatni lub wystarczający wynik leczenia. Brak istotnego wzrostu lub spadek oznacza ujemny lub niewystarczający wynik leczenia. Podawanie środka zazwyczaj kontynuuje się aż do osiągnięcia poziomu powyżej wartości kontrolnej. Jak poprzednio, osiągnięcie plateau w stosunku do wartości kontrolnych jest wskazówką, że podawanie środka można przerwać lub zmniejszyć dawkę i/lub częstość podawania.

W innych sposobach wartość kontrolną poziomu lub profilu (np. wartość średnią i odchylenie standardowe) ustala się dla kontrolnej populacji osób poddawanych leczeniu środkiem terapeutycznym i u których poziomy lub profile osiągnęły plateau w odpowiedzi na leczenie. Zmierzone wartości poziomów lub profili u pacjenta porównuje się z wartością kontrolną. Gdy zmierzony poziom u pacjenta nie różni się istotnie (np. więcej niż o jedno odchylenie standardowe) od wartości kontrolnej, leczenie można przerwać. Gdy poziom u pacjenta jest istotnie niższy od wartości kontrolnej, kontynuowanie podawania środka jest konieczne. Gdy poziom u pacjenta utrzymuje się poniżej wartości kontrolnej, wskazana może być zmiana leczenia.

W innych sposobach u pacjenta, który aktualnie nie jest leczony, ale który przebył leczenie, monitoruje się poziomy lub profile przeciwciała w celu ustalenia, czy konieczne jest wznowienie leczenia. Zmierzony poziom lub profil u pacjenta można porównać z wartością uprzednio osiągniętą u pacjenta, po poprzednim okresie leczenia. Istotny spadek w stosunku do wcześniejszego pomiaru (czyli większy niż typowy margines błędu w powtarzanych pomiarach tej samej próbki) stanowi wskazanie, że leczenie należy wznowić. Alternatywnie, wartość zmierzoną u pacjenta można porównać z wartością kontrolną (wartością średnią plus odchylenie standardowe) oznaczoną dla populacji pacjentów po przebytym leczeniu. Alternatywnie, wartość zmierzoną u pacjenta można porównać z wartością kontrolną u populacji profilaktycznie leczonych pacjentów bez objawów choroby lub populacji terapeutycznie leczonych pacjentów, u których nastąpiła poprawa wskaźników choroby. We wszystkich tych przypadkach znaczące zmniejszenie w porównaniu z poziomem kontrolnym (czyli przekraczającym odchylenie standardowe) stanowi wskazanie, że należy wznowić leczenie pacjenta.

Próbkę tkanki do analizy stanowi zazwyczaj krew, osocze, surowica, płyn śluzowy lub płyn mózgowo-rdzeniowy pacjenta. Próbkę analizuje się przykładowo w celu określenia poziomów lub profili przeciwciał przeciw peptydowi Αβ, np. poziomów lub profili humanizowanych przeciwciał. Metody ELISA wykrywania przeciwciał specyficznych względem Aβ opisano w sekcji przykładów. W pewnych metodach poziom lub profil podawanego przeciwciała oznacza się w próbie klirensowej, np. w próbie fagocytozy in vitro, tutaj opisanej. W takich metodach badaną próbkę tkanki od pacjenta kontaktuje się ze złogami amyloidowymi (np. od myszy PDAPP) i fagocytowymi komórkami przenoszącymi receptory Fc. Następnie monitoruje się klirens złogów amyloidowych. Obecność i zakres odpowiedzi

PL 211 761 B1 klirensowej dostarcza wskazania odnośnie obecności i poziomu przeciwciał skutecznie powodujących klirens Aβ w badanej próbce tkanki pacjenta.

Profil przeciwciała po pasywnej immunizacji zazwyczaj wykazuje natychmiastowy pik stężenia przeciwciała, po którym następuje wykładniczy spadek. Bez kolejnej dawki spadek prowadzi do poziomów przed leczeniem w okresie od dni do miesięcy, w zależności od okresu półtrwania podanego przeciwciała. Przykładowo okres półtrwania pewnych ludzkich przeciwciał jest rzędu 20 dni.

W pewnych metodach pomiar wartości wyjściowej przeciwciał przeciw Aβ u pacjenta wykonuje się przed podaniem, drugi pomiar wykonuje się wkrótce potem, w celu oznaczenia szczytowego poziomu przeciwciała, oraz jeden lub większą liczbę pomiarów wykonuje się w pewnych odstępach czasu, aby monitorować spadek poziomu przeciwciała. Gdy poziom przeciwciała obniży się do wartości wyjściowej lub o ustalony procent różnicy pomiędzy pikiem i wartością wyjściową (np. 50%, 25% lub 10%), podaje się kolejną dawkę przeciwciała. W pewnych metodach wartość szczytową lub następnie zmierzone poziomy, pomniejszone o wartość tła, porównuje się z uprzednio ustalonymi poziomami odniesienia, odpowiadającymi korzystnemu trybowi leczenia profilaktycznego lub terapeutycznego u innych pacjentów. Gdy zmierzony poziom przeciwciała jest istotnie niższy od poziomu odniesienia (np. niższy od wartości średniej pomniejszonej o odchylenie standardowe wartości odniesienia u populacji pacjentów, u których leczenie przyniosło korzyści), wskazane jest podanie dodatkowej dawki przeciwciała.

Dodatkowe sposoby obejmują monitorowanie w trakcie leczenia dowolnego znanego objawu fizjologicznego (np. objawu fizycznego lub umysłowego) rutynowo wykorzystywanego przez badaczy lub lekarzy do diagnozowania lub monitorowania chorób amyloidogennych (np. choroby Alzheimera). Przykładowo, można monitorować pogorszenie funkcji poznawczych. Są one objawem choroby Alzheimera i zespołu Downa, ale mogą również wystąpić bez innych cech charakterystycznych dla obydwu tych chorób. Przykładowo, pogorszenie funkcji poznawczych w trakcie leczenia można monitorować przez ustalenie oceny pacjenta w krótkiej skali oceny stanu psychicznego, zgodnie z powszechnie przyjętą konwencją.

C. Zestawy

Humanizowane przeciwciała według wynalazku można stosować także w zestawach do przeprowadzania opisanych powyżej metod monitorowania. Zazwyczaj takie zestawy zawierają środek, który specyficznie wiąże się z przeciwciałami przeciw Aβ. Zestaw może również zawierać znacznik. Do wykrywania przeciwciał względem Aβ znacznik jest zazwyczaj w postaci znaczonych przeciwciał przeciwidiotypowych. Do wykrywania przeciwciał można stosować środek wstępnie związany z fazą stałą, taką jak studzienki płytki do mikromianowania. Zestawy zazwyczaj zawierają również oznakowanie ze wskazówkami odnośnie stosowania zestawu. Oznakowanie może również obejmować wykres lub inne wskazówki umożliwiające skorelowanie poziomów mierzonego znacznika z poziomami przeciwciał przeciw Λβ. Określenie oznakowanie odnosi się do pisanego lub zarejestrowanego materiału dołączonego lub w inny sposób towarzysząceg o zestawowi w dowolnym momencie podczas wytwarzania, transportu, sprzedaży lub stosowania. Przykładowo, określenie oznakowanie obejmuje ulotki reklamowe i broszury, materiały opakowaniowe, instrukcje, kasety audio lub video, dyski komputerowe, opis nadrukowany bezpośrednio na zestawach.

Można wytworzyć także zestawy diagnostyczne, przykładowo zestawy do badania, wykrywania i/lub diagnozowania (np. do wykonywania obrazowania in vivo). Takie zestawy zazwyczaj zawierają przeciwciała do wiązania z epitopem Λβ, korzystnie w obszarze reszt 1-10. Korzystnie, przeciwciało jest znakowane lub do zestawu dołączony jest drugorzędowy odczynnik znakujący. Korzystnie, zestaw jest oznakowany instrukcjami dotyczącymi przewidywanego zastosowania, np. do wykonywania obrazowania in vivo. Przykłady przeciwciał zostały tutaj opisane.

D. Obrazowanie in vivo

Wynalazek umożliwia obrazowanie in vivo złogów amyloidowych u pacjenta z zastosowaniem immunoglobulin według wynalazku. Takie sposoby są przydatne w diagnozowaniu lub potwierdzaniu diagnozy choroby Alzheimera lub podatności na nią. Przykładowo, sposoby można stosować w przypadku pacjenta z objawami otępienia. Gdy u pacjenta występują nienormalne złogi amyloidowe, to wówczas pacjent prawdopodobnie cierpi na chorobę Alzheimera. Sposoby takie można również stosować w przypadku pacjentów bezobjawowych. Obecność nienormalnych złogów amyloidu wskazuje na podatność na wystąpienie w przyszłości choroby z objawami. Sposoby są także przydatne w monitorowaniu postępu choroby i/lub odpowiedzi na leczenie w przypadku pacjentów, u których uprzednio zdiagnozowano chorobę Alzheimera.

PL 211 761 B1

Sposoby obejmują podawanie pacjentowi odczynnika, takiego jak przeciwciało wiążące się z Λβ, a następnie wykrywanie środka po jego związaniu. Korzystne przeciwciała wiążą się ze złogami Λβ u pacjenta bez wiązania się z polipeptydem APP o pełnej długości. Szczególnie korzystne są przeciwciała wiążące się z epitopem Ap pomiędzy aminokwasami 1-10. W pewnych sposobach przeciwciało wiąże się z epitopem pomiędzy aminokwasami 7-10 w Λβ. Takie przeciwciała zazwyczaj wiążą się bez wywoływania znaczącej odpowiedzi klirensowej. W innych sposobach przeciwciało wiąże się z epitopem pomiędzy aminokwasami 1-7 w Λβ. Takie przeciwciała zazwyczaj wiążą się i wywołują odpowiedź klirensową w Ap. Jednakże odpowiedzi klirensowej można uniknąć przez zastosowanie fragmentów przeciwciała nie zawierających stałego regionu o pełnej długości, takich jak Fab. W pewnych sposobach to samo przeciwciało może służyć zarówno do leczenia, jak i jako odczynnik diagnostyczny. Ogólnie przeciwciała wiążące się z epitopami od końca C do reszty 10 w Ap nie wykazują tak silnego sygnału, jak przeciwciała wiążące się z epitopami pomiędzy resztami 1-10, prawdopodobnie z uwagi na to, że C-końcowe epitopy są niedostępne w złogach amyloidowych. W związku z tym takie przeciwciała są mniej korzystne.

Odczynniki diagnostyczne można podawać drogą iniekcji dożylnej do organizmu pacjenta, albo bezpośrednio do mózgu drogą iniekcji wewnątrzczaszkowej albo przez wywiercenie otworu przez czaszkę. Dawka odczynnika powinna mieścić się w takich samych granicach jak w sposobach leczenia. Zazwyczaj odczynnik jest znakowany, choć w pewnych sposobach pierwszorzędowy odczynnik z powinowactwem do Λβ jest nieznakowany, przy czym stosuje się drugi środek znakujący do wiązania się z pierwszorzędowym odczynnikiem. Dobór znacznika zależy od środków wykrywających. Przykładowo, znacznik fluorescencyjny jest przydatny przy wykrywaniu technikami optycznymi. Zastosowanie znaczników paramagnetycznych jest przydatne przy wykrywaniu tomograficznym bez interwencji chirurgicznej. Radioaktywne znaczniki można także wykrywać technikami PET lub SPECT.

Diagnozę wykonuje się przez porównanie liczby, wielkości i/lub natężenia znakowanych miejsc z odpowiednimi wartościami wyjściowymi. Wartości wyjściowe mogą reprezentować średnie poziomy w populacji osób, które nie są chore. Wartości wyjściowe mogą również stanowić poprzednie poziomy oznaczone u tego samego pacjenta. Przykładowo, wartości wyjściowe można oznaczyć u pacjenta przed rozpoczęciem leczenia i wartości oznaczone później porównywać z wartościami wyjściowymi. Spadek wartości w stosunku do wartości wyjściowych oznacza dodatnią odpowiedź na leczenie.

Wynalazek zostanie dokładniej opisany w poniższych przykładach, nie ograniczających jego zakresu. Przykłady I - VI oraz X - XI opisano wyłącznie w celach informacyjnych.

P r z y k ł ad I. Skuteczność terapeutyczna przeciwciał przeciw-Λβ : mΛb 2H3, mΛb 10D5, τΛ 266, mΛb 21F12 i pΛb Λβ1-42

W przykładzie tym zbadano zdolność różnych monoklonalnych i poliklonalnych przeciwciał względem Λβ do hamowania nagromadzania się Ap w mózgu heterozygotycznych transgenicznych myszy.

A. Projekt badań samców i samic heterozygotycznych transgenicznych myszy PDAPP, 8,5 - 10,5 miesiąca otrzymano z Charles River Laboratory. Myszy podzielono na 6 grup do leczenia różnymi przeciwciałami skierowanymi przeciw Ap. Zwierzęta rozdzielono tak, aby dopasować płeć, wiek, rodzicielstwo i źródło zwierząt w grupach możliwie jak najdokładniej. W tabeli 2 przedstawiono projekt doświadczenia.

T a b e l a 2 Projekt doświadczenia

Leczona grupa	N^a	Podawane przeciwciało	Specyficzność przeciwciała	Izotyp przeciwciała
1	9	(sam PBS)	ΝΛ⁰	ΝΛ
2	10	Poliklonalne	Λβ1-42	mieszany
3	0	τιΛΕ 2H3	Λβ1-12	IgG1
4	8	ιτιΛϋ 10D5	Λβ3-7	IgG1
5	6	ιτιΛϋ 266	Λβ 13-28	IgG1
6	8	ιτιΛϋ 21F12	Λβ33-42	IgG2a

a. Liczba myszy w grupie pod koniec doświadczenia. Na początku w każdej grupie znajdowało się 10 zwierząt.

b. ΝΛ: nie dotyczy

c. mysie poliklonalne: przeciw-zagregowane Λβ42

d. mAb: monoklonalne przeciwciało

PL 211 761 B1

Jak to pokazano w tabeli 2, jako przeciwciała zastosowano 4 mysie, specyficzne względem Ap, monoklonalne przeciwciała, 2H3 (skierowane na reszty 1-12 Αβ), 10D5 (skierowane na reszty 3-7 Αβ), 266 (skierowane na reszty 13-28 Αβ i wiąże się z rozpuszczalnym, ale nie z zagregowanym AN1792), 21F12 (skierowane na reszty 33-42 Αβ). Piątej grupie podawano frakcję specyficznego względem Ap poliklonalnego przeciwciała (wytworzonego przez immunizację zagregowanym AN1792). Ujemna grupa kontrolna otrzymywała sam rozcieńczalnik, PBS, bez przeciwciał.

B. Monitorowanie przebiegu leczenia

Monoklonalne przeciwciała wstrzyknięto w dawce około 10 mg/kg (przy założeniu, że myszy ważyły 50 g). Miano przeciwciał monitorowano przez 28 tygodni leczenia. Iniekcje wykonywano śródotrzewnowo średnio co 7 dni, aby utrzymać miana przeciw-Αβ powyżej 1000. Choć niższe miana zmierzono dla mAb 266, gdyż nie wiązało się ono dobrze z zagregowanym AN1792 stosowanym jako antygen wychwytujący w próbie, taki sam schemat podawania utrzymywano w przypadku tej grupy. Doświadczenia z grupą otrzymującą monoklonalne przeciwciało 2H3 przerwano w ciągu pierwszych 3 tygodni z uwagi na zbyt szybki klirens przeciwciała in vivo.

Do oznaczania mian przeciwciał, tuż przed szczepieniem śródotrzewnowym podgrupie 3 losowo wybranych myszy z każdej grupy pobierano krew, łącznie 30 próbek. Miana przeciwciał mierzono jako przeciwciała wiążące Ap 1-42 w teście ELISA typu sandwicz na wielostudzienkowych płytkach z tworzywa sztucznego, powleczonych Αβ 1-42, jako to opisano szczegółowo w części „Ogólne materiały i metody. Średnie miana dla każdej próbki krwi podano w tabeli 3, dla poliklonalnego przeciwciała i monoklonalnych przeciwciał 10D5 i 21F12.

T a b e l a 3

tygodnie 21F12	21F12	tygodnie 10D5	10D5	tygodnie poli	poli
1	2	3	4	5	6
0,15	500	0,15	3000	0,15	1600
0,5	800	0,5	14000	0,5	4000
1	2500	1	5000	1	4500
1,5	1800	1,1	5000	1,5	3000
2	1400	1,2	1300	2	1300
3	6000	2	3000	3	1600
3,5	550	3	4000	3,5	650
4	1600	3,5	500	4	1300
5	925	4	2400	5	450
6	3300	5	925	6	2100
7	4000	6	1700	7	1300
8	1400	7	1600	8	2300
9	1900	8	4000	9	700
10	1700	9	1800	10	600
11	1600	10	1800	11	600
12	1000	11	2300	12	1000
13	1500	12	2100	13	900
14	1300	13	2800	14	1900
15	1000	14	1900	15	1200
16	1700	15	2700	16	700
17	1700	16	1300	17	2100
18	5000	17	2200	18	1800

PL 211 761 B1 cd. tabeli 3

1	2	3	4	5	6
19	900	18	2200	19	1800
20	300	19	2500	20	1200
22	1750	20	980	22	1000
23	1600	22	2000	23	1200
24	1000	23	1000	24	675
25	1100	24	850	25	850
26	2250	25	600	26	1600
27	1400	26	1100	27	1900
28		27	1450	28
		28

Średnie miana około 1000 w tym okresie czasu w przypadku preparatu poliklonalnych przeciwciał były nieznacznie wyższe od poziomów u zwierząt, którym podawano 10D5 i 21F12.

Podawanie kontynuowano przez ponad 6 miesięcy, łącznie przez 196 dni. Zwierzęta uśmiercono w tydzień po ostatniej dawce.

C. Poziomy Aβ i APP w mózgu:

Po około 6 miesięcznym podawaniu różnych preparatów przeciwciał przeciw-Aji usunięto mózgi zwierząt po perfuzji fizjologicznym roztworem soli. Jedną półkulę wypreparowano do analizy immunohistochemicznej, a drugą zastosowano do ilościowego oznaczania poziomów Aβ i APP. W celu zmierzenia stężenia różnych postaci peptydu β-amyloidu i amyloidowego białka prekursorowego (APP), półkulę rozcięto i przygotowano preparaty hipokampu oraz obszaru korowego i podwzgórzowego w 5M guanidynie. Rozcieńczono je seryjnie i poziom peptydu amyloidowego lub APP oznaczono ilościowo przez porównanie z seryjnymi rozcieńczeniami wzorców peptydu Aβ lub APP o znanych stężeniach, w formacie ELISA.

Poziomy całkowitego Aβ i Aβ1-42 zmierzone metodą ELISA w homogenatach kory i hipokampu oraz poziom całkowitego Aβ w móżdżku podano odpowiednio w tabelach 4, 5 i 6. Mediana stężenia całkowitego Aβ dla grupy kontrolnej, zaszczepionej PBS, była 3,6-krotnie wyższa w hipokampie niż w korze (mediana 63,389 ng/g tkanki hipokampu w porównaniu z 17,818 ng/g dla kory). Mediana poziomu w móżdżku dla grupy kontrolnej (30,6 ng/g tkanki) była ponad 2000 razy niższa niż w hipokampie. Są to poziomy podobne do podanych uprzednio dla heterozygotycznych transgenicznych myszy PDAPP w tym wieku (Johnson-Wood i inni, supra).

W przypadku kory u jednej z leczonych grup mediana poziomu Aβ, mierzonego jako Aβ 1-42, istotnie różniła się od poziomu dla grupy kontrolnej (p < 0,05), przy czym zwierzętom tym podawano poliklonalne przeciwciało przeciw-Aji, co pokazano w tabeli 4. Mediana poziomu Aβ 1-42 była zmniejszona o 65% w porównaniu z kontrolą dla tej grupy leczonej. Mediany poziomów Aβ 1-42 były również istotnie zmniejszone, o 55%, w porównaniu z kontrolą w jednej dodatkowej leczonej grupie, przy czym zwierzętom tym podawano mAb 10D5 (p = 0,0433).

PL 211 761 B1

W hipokampie procentowe zmniejszenie mediany całkowitego Λβ, związane z leczeniem poliklonalnym przeciwciałem przeciw-Aji (50%, p = 0,0055) nie było tak duże, jak zaobserwowane w korze (65%) (tabela 5). Jednakże bezwzględna wartość zmniejszenia była prawie 3 razy wyższa w hipokampie niż w korze, gdyż zmniejszenie netto wyniosło 31,683 ng/g tkanki w hipokampie w porównaniu z 11,658 ng/g

PL 211 761 B1 tkanki w korze. Przy pomiarach poziomu bardziej amyloidogennej postaci Αβ, Αβ 1-42, a nie całkowitego Αβ, zmniejszenie zapewniane przez poliklonalne przeciwciało było istotne (p = 0,0025). Średnie poziomy w grupach, którym podawano mAbs 10D5 i 266, były zmniejszone odpowiednio o 33% i 21%.

PL 211 761 B1

Zmierzono również całkowity Λβ w móżdżku (tabela 6). W grupach, którym podawano poliklonalne przeciwciało przeciw-Aji i przeciwciało 266, stwierdzono istotne zmniejszenie poziomów całkowitego Aβ (odpowiednio 43% i 46%, p = 0,0033 i p = 0,0184), a w przypadku grupy, której podawano 10D5, zmniejszenie było prawie istotne (29%, p = 0,0675).

T a b e l a 6

Móżdżek
Grupa leczona	N^a	Mediany	Średnie
	Całkowity Aβ	Całkowity Aβ
Wartość ELISA^b	Wartość PC	% zmiany	Wartość ELISA^b
PBS	9	30,64	NA^d	NA	40,00±31,89^e
Poliklonalne przeciw-A\|^Ji42	10	17,61	0,0033	-43	18,15±4,36
mAb10D5	8	21,68	0,0675	-29	27,29±19,43
mAb 266	6	16,59	0,0184	-46	19,59±6,59
mAb 21F12	8	29,80	>0,9999	-3	32,88±9,90

a. Liczba zwierząt w grupie na końcu doświadczenia

b. ng/g tkanki

c. Analiza Manna-Whitney'a

d. NA: nie dotyczy

e. Odchylenie standardowe

Oznaczono również metodą ELISA stężenie APP w korze i móżdżku myszy leczonych przeciwciałem i kontrolnych, którym podawano PBS. Zastosowano dwie różne próby APP. W pierwszej, oznaczonej jako APP-a/FL, rozpoznaje się zarówno APP-α (a, wydzielona postać APP, która została rozszczepiona, bez sekwencji Aβ) oraz postacie o pełnej długości (FL) APP, a w drugiej rozpoznaje się tylko APP -a. W przeciwieństwie do związanych z leczeniem spadkiem Aβ w podzestawie grup leczonych, poziomy APP u zwierząt we wszystkich leczonych grupach praktycznie nie różniły się od poziomów u zwierząt kontrolnych. Wyniki te wskazują, że immunizacje przeciwciałami Aβ powodują wyczerpanie Aβ bez wyczerpania APP.

W podsumowaniu, poziomy Aβ były istotne zmniejszone w korze, hipokampie i móżdżku zwierząt leczonych poliklonalnym przeciwciałem wyhodowanym przeciw AN1792. W mniejszym stopniu monoklonalne przeciwciała względem regionu Aβ 1-42 na końcu aminowym, zwłaszcza aminokwasy 1-16 i 13-28, również wykazywały istotne działanie w leczeniu.

D. Analizy histochemiczne:

Morfologię Aβ-immunoreaktywnych płytek w podzestawach mózgów myszy z grup, którym podawano PBS, poliklonalne Aβ42, 21F12, 266 i 10D5, porównano ilościowo z wcześniejszymi badaniami, w których przeprowadzono zwykłe procedury immunizacji z użyciem Aβ42.

Największe zmiany, zarówno w zakresie, jak i wyglądzie płytek amyloidowych wystąpiły u zwierząt immunizowanych poliklonalnym przeciwciałem Aβ42. Zmniejszenie obłożenia amyloidem, nadżarta morfologia płytek i związana z komórkami immunoreaktywność Aβ przypominała działanie osiągane przy zwykłej procedurze immunizacji. Obserwacje te potwierdziły wyniki otrzymane w teście ELISA, w którym osiągnięto istotne zmniejszenie Aβ i Aβ42 w wyniku podania poliklonalnego przeciwciała Aβ42.

W podobnych ocenach ilościowych płytki amyloidowe w grupie 10D5 były również zmniejszone w odniesieniu do liczby i wyglądu, z pewnymi dowodami immunoreaktywności Aβ związanej z komórkami. W stosunku do zwierząt kontrolnych okazało się, że frakcja poliklonalnej Ig przeciw Aβ i jedno z monoklonalnych przeciwciał (10D5) zmniejszają obciążenie płytkami odpowiednio 93% i 81%, (p < 0,005). Okazało się, że 21F12 wywiera stosunkowo umiarkowane działanie na obciążenie płytkami. Mikrofotografie mózgu po leczeniu pAbAβ_1-42 wykazały obecność rozproszonych złogów i brak znaczącej liczby większych zwartych płytek w grupie leczonej pAbAβ_1-42 w porównaniu ze zwierzętami kontrolnymi.

E. Odpowiedzi limfoproliferacyjne

Limfoproliferację zależną od Aβ zmierzono z użyciem komórek śledziony zebranych 8 dni po ₅ ostatniej infuzji przeciwciał. Świeżo zebrane komórki, w liczbie 10⁵ na studzienkę, hodowano przez dni w obecności Aβ 1-40 w stężeniu 5 μΜ, w celu stymulacji. Jako dodatnią kontrolę dodatkowe

PL 211 761 B1 komórki hodowano z mitogenem komórek T, PHA, jako kontrolę ujemną komórki hodowano bez dodanego peptydu.

Limfocyty śledzionowe od dojrzałych myszy PDAPP pasywnie immunizowanych różnymi przeciwciałami przeciw-Aji stymulowano in vitro za pomocą AN1792 i zmierzono odpowiedzi proliferacyjne i cytokinowe. Celem tej próby było ustalenie, czy pasywna immunizacja ułatwia prezentację antygenu i tym samym wywoływanie odpowiedzi komórek T, specyficznej dla AN1792. Nie zaobserwowano AN1792-specyficznej odpowiedzi proliferacyjnej i cytokinowej u myszy pasywnie immunizowanych przeciwciałami przeciw-Aji

P r z y k ł a d II. Terapeutyczna skuteczność przeciwciał przeciw^: mAb 2H3, mAb 10D5, mAb 266, mAb 21F12, mAb 3D6, mAb 16C11 i pAb Aβ1-42

W drugim badaniu powtórzono leczenie z użyciem 10D5 i zbadano dwa dodatkowe przeciwciała przeciw^, monoklonalne 3D6 ^β1-5) i 16C11 ^β33-42).

Grupom kontrolnym podawano PBS lub niezwiązane dopasowane izotypowo przeciwciała (TM2a). Myszy były starsze (heterozygotyczne, w wieku 11,5-12 miesięcy) niż w poprzednim badaniu. Pod innymi względami doświadczenie zaprojektowano tak samo. W tym przypadku również po 6 miesiącach leczenia 10D5 zmniejszyło obciążenie płytkami o ponad 80% w stosunku do grup kontrolnych z PBS lub dopasowanym izotypowo przeciwciałem (p=0,003). Jedno z innych przeciwciał przeciw Αβ, 3D6, było również skuteczne, wywołując zmniejszenie o 86% (p=0,003). Natomiast trzecie przeciwciało przeciw peptydowi, 16C11, nie wywarło żadnego wpływu na obciążenie płytkami. Podobne wyniki ustalono w pomiarach ELISA z Aβ42.

Wyniki te wykazują, że odpowiedź przeciwciał przeciw peptydowi Αβ, pod nieobecność odporności komórek T, jest wystarczająca do zmniejszenia złogów amyloidowych u myszy PDAPP, z tym, że nie wszystkie przeciwciała przeciw^ są równie skuteczne. Szczególnie skuteczne są przeciwciała skierowane przeciw epitopom Aβ zawierającym aminokwasy 1-5 lub 3-7. W podsumowaniu można wykazać, że pasywnie podawane przeciwciała przeciw Αβ (czyli pasywna immunizacja) zmniejsza stopień złogów płytkowych w mysim modelu choroby Alzheimera.

P r z y k ł a d III. Monitorowanie wiązania przeciwciał w OUN

W doświadczeniu tym wykazano, że przy utrzymaniu umiarkowanego stężenia w surowicy (25-70 pg/ml), przeciwciała dochodzą do OUN w poziomie wystarczającym do włączania się do płytek β-amyloidowych.

W celu ustalenia, czy przeciwciała przeciw Αβ mogą działać bezpośrednio w OUN, mózgi pobrane od myszy perfundowanych fizjologicznym roztworem soli pod koniec doświadczenia w przykładzie II, zbadano pod względem obecności obwodowo podawanych przeciwciał. Nieutrwalone, kriostatowe skrawki mózgu poddano działaniu odczynnika fluorescencyjnego przeciw mysiej immunoglobulinie (kozia przeciw-mysia IgG-Cy3). Płytki w mózgach grup z 10D5 i 3D6 były silnie „udekorowane przeciwciałami, natomiast nie stwierdzono zabarwienia w grupie z 16C11. W celu potwierdzenia pełnego zakresu złogów płytkowych, kolejne skrawki każdego mózgu najpierw poddawano reakcji immunochemicznej z przeciwciałami przeciw^, a następnie z drugorzędowym odczynnikiem. 10D5 i 3D6, po podaniu obwodowym, włączają się do większości płytek w OUN. Obciążenie płytkami w tych leczonych grupach było znacząco mniejsze w porównaniu z grupą 16C11. Wejście przeciwciała do OUN nie było spowodowane nienormalnym przeciekaniem bariery krew-mózg, gdyż nie nastąpił wzrost naczyniowej przepuszczalności, co ustalono w pomiarach z błękitem Evansa na myszach PDAPP. Na dodatek, stężenie przeciwciała w miąższu mózgu dojrzałych myszy PDAPP było takie samo jak u nietransgenicznych myszy i stanowiło 0,1% stężenia przeciwciał w surowicy (niezależnie od izotypu).

Wyniki te wskazują, że obwodowo podawane przeciwciała mogą przechodzić do OUN, gdzie mogą bezpośrednio wyzwalać klirens amyloidu. Prawdopodobnie również 16C11 ma dostęp do płytek, ale nie jest zdolny do wiązania się z nimi.

P r z y k ł a d IV. Próba przesiewowa ex vivo aktywności przeciwciał przeciw złogom amyloidowym

W celu zbadania wpływu przeciwciał na klirens płytek, przeprowadzono próbę ex vivo, w której pierwotne komórki mikrogleju hodowano z nieutrwalonymi kriostatowymi skrawkami mózgów myszy PDAPP lub ludzi z AD. Komórki mikrogleju otrzymano z rdzeni mózgowych nowonarodzonych myszy DBA/2N (1-3 dniowych). Kory mechanicznie rozdzielano w HBSS (zrównoważonym roztworze soli Hanksa, Sigma) z 50 pg/ml DNazy I (Sigma). Zdysocjowane komórki sączono przez 100 pm filtr komórkowy (Falcon) i wirowano z szybkością 1000 obrotów/minutę przez 5 minut. Osad przeprowadzano ponownie w zawiesinę w pożywce wzrostowej (DMEM o wysokiej zawartości glukozy, 10% FBS, 25 ng/ml rmGM-CSF) i komórki wysiewano w gęstości 2 mózgi/kolbę T-75 do hodowli, z tworzywa

PL 211 761 B1 sztucznego. Po 7-9 dniach kolby obracano na wytrząsarce orbitalnej z szybkością 200 obrotów/minutę przez 2 godziny w 37°C. Zawiesinę komórek odwirowano z szybkością 1000 obrotów/minutę i przeprowadzono w zawiesinę w pożywce testowej.

10-gm kriostatowe skrawki mózgów myszy PDAPP lub ludzi z AD (okres od śmierci < 3 godzin) zainstalowano po rozmrożeniu na powleczonych polilizyną okrągłych szkiełkach nakrywkowych i umieszczono w studzienkach 24-studzienkowych płytek do hodowli tkankowej. Szkiełka nakrywkowe przemyto dwukrotnie pożywką testową zawierającą H-SFM (pożywka wolna od surowicy dla hybrydom, Gibco BRL) z 1% FBS, glutaminą, penicyliną/streptomycyną i 5 ng/ml rmGM-CSF (R&D). Dodano przeciwciała kontrolne lub przeciw-Aji w stężeniu 2x (stężenie końcowe 5 gg/ml) na 1 godzinę. Następnie wysiano komórki mikrogleju w gęstości 0,8 x 10⁶ komórek/ml pożywki testowej. Hodowle utrzymywano w nawilżanym inkubatorze (37°C, 5% CO2) przez 24 godziny lub dłużej. Pod koniec inkubacji hodowle utrwalono 4% paraformaldehydem i permeabilizowano 0,1% Tritonem-X100. Skrawki wybarwiono biotynylowanym 3D6, a następnie koniugatem streptawidyna/Cy3 (Jackson ImmunoResearch). Egzogenne komórki mikrogleju wizualizowano przez wybarwienie jąder (DAPI). Hodowle obserwowano pod inwersyjnym mikroskopem fluorescencyjnym (Nikon, TE300) i wykonano mikrofotografie aparatem cyfrowym SPOT z oprogramowaniem SPOT (Diagnostic instruments). Do analizy Western blotting hodowle wyekstrahowano 8M mocznikiem, rozcieńczono 1:1 redukującym buforem tricynowym do próbek i wprowadzono na 16% żel tricynowy (Novex). Po przeniesieniu na immobilon, bloty wystawiono na działanie 5 gg/ml pabAβ42, a następnie przeciwmysiego przeciwciała skoniugowanego z HRP i przeprowadzono wywoływanie z użyciem ECL (Amersham).

Gdy próbę wykonywano ze skrawkami mózgu PDAPP w obecności 16C11 (jednego z przeciwciał przeciw Aβ, które nie były skuteczne in vivo), płytki amyloidowe pozostały nienaruszone i nie zaobserwowano fagocytozy. Natomiast gdy sąsiednie skrawki hodowano w obecności 10D5, złogi amyloidowe w znacznym stopniu zanikły, a komórki mikrogleju zawierały liczne pęcherzyki fagocytowe z Aβ. Identyczne wyniki otrzymano w przypadku skrawków mózgów objętych AD; 10D5 wywoływało fagocytozę płytek AD, natomiast 16C11 było nieskuteczne. Na dodatek próba dostarczyła porównawczych wyników, gdy przeprowadzano ją z mysimi lub ludzkimi komórkami mikrogleju oraz z przeciwciałami przeciw Aβ z myszy, królika lub naczelnych.

W tabeli 7 porównano wiązanie Aβ z fagocytozą dla szeregu specyficzności wiązania różnych przeciwciał. Można stwierdzić, że przeciwciała wiążące się z epitopami w zakresie aminokwasów 1-7 wiążą się i powodują klirens złogów amyloidowych, natomiast przeciwciała wiążące się z epitopami w zakresie aminokwasów 4-10 wiążą się bez klirensu złogów amyloidowych. Przeciwciała wiążące się z epitopami C-końcowymi do reszty 10 ani nie wiążą się, ani nie wywołują klirensu złogów amyloidowych.

T a b e l a 7

Analiza specyficzności epitopów

Przeciwciało
	epitop	izotyp	Wybarwianie	Fagocytoza
1	2	3	4	5
N-Koniec
mab
3D6	1-5	IgG2b	+	+
10D5	3-7	IgG1	+	+
22C8	3-7	IgG2a	+	+
6E10	5-10	IgG1	+	-
14A8	4-10	szczurza IgG1	+	-
aminokwasy 13-28
18G11	10-18	szczurza IgG1	-	-
266	16-24	IgG1	-	-
22D12	18-21	IgG2b	-	-

PL 211 761 B1 cd. tabeli 7

1	2	3	4	5
C-Koniec
2G3	-40	IgG1	-	-
16C11	-40/-42	IgG1	-	-
21F12	-42	IgG2a	-	-
Surowica odpornościowa
królicza (CFA)	1-6		+	+
mysia (CFA)	3-7		+	+
mysia (QS-21)	3-7		+	+
małpia (QS-21)	1-5		+	+
mysia (MAPI-7)			+	+

W tabeli 8 przedstawiono wyniki otrzymane z użyciem szeregu przeciwciał przeciw Ap, porównujące ich zdolność do wywoływania fagocytozy w próbie ex vivo oraz zmniejszania obciążenia płytkami w badaniach pasywnego transferu. Choć 16C11 i 21F12 wiążą się z zagregowanym syntetycznym peptydem Αβ z wysoką awidnością, przeciwciała te były niezdolne do reagowania z płytkami β-amyloidowymi w nieutrwalonych skrawkach mózgu, nie mogły wyzwolić fagocytozy w próbie ex vivo i nie były skuteczne in vivo. 10D5, 3D6 i poliklonalne przeciwciało przeciw Ap były aktywne pod wszystkimi trzema względami. Wyniki te wskazują, że skuteczność in vivo jest wywołana bezpośrednio pośredniczonym przez przeciwciała klirensem płytek w OUN, oraz że próba ex vivo umożliwia przewidywanie skuteczności in vivo.

T a b e l a 8

Próba ex vivo jako prognoza skuteczności in vivo

Przeciwciało	Izotyp	Awidność wobec zagregowanych Αβ (pM)	Wiązanie z płytkami p-amyloidowymi	Skuteczność ex vivo	Skuteczność in vivo
monoklonalne
3D6	IgG2b	470	+	+	+
10D5	IgG1	43	+	+	+
16C11	IgG1	90	-	-	-
21F12	IgG2a	500	-	-	-
TM2a	IgG1	-	-	-	-
poliklonalne
1-42	mieszany	600	+	+	+

Taką samą próbę zastosowano do zbadania aktywności klirensowej przeciwciała przeciw fragmentowi synukleiny, określanemu jako NAC. Wykazano, że synukleina jest białkiem związanym z płytkami amyloidowymi. Przeciwciała przeciw NAC połączono z próbką tkanki mózgowej zawierającej płytki amyloidowe i komórkami mikrogleju, jak poprzednio. Jako kontrolę zastosowano surowicę królika. Prowadzone następnie monitorowanie wykazało znaczące zmniejszenie liczby i wielkości płytek, co wskazuje na aktywność klirensową przeciwciała.

Mikroskopię współogniskową zastosowano do potwierdzenia, że Ap ulegał internalizacji podczas próby ex vivo. W obecności kontrolnych przeciwciał, egzogenne komórki mikrogleju pozostały w płaszczyźnie współogniskowej nad tkanką, nie były obecne fagocytowe pęcherzyki zawierające Ap, a płytki w skrawku pozostały nienaruszone. W obecności 10D5, prawie cały materiał znajdował się w pęcherzykach w egzogennych komórkach mikrogleju. W celu ustalenia losu internalizowanego peptydu, hodowle poddane działaniu 10D5 wyekstrahowano 8M mocznikiem w różnych punktach czasowych i wykonano analizę Western blotting. Po 1 godzinie, gdy fagocytoza jeszcze nie wystąpiła, reakcja z poliklonalnymi przeciwciałami przeciw Ap ujawniła występowanie silnego pasma 4 kD (odpowiaPL 211 761 B1 dającego peptydowi Aβ). Immunoreaktywność Aβ zmniejszyła się w dniu 1 i zanikła do 3 dnia. W związku z tym fagocytoza Aβ pośredniczona przeciwciałami prowadzi do jego rozpadu.

W celu ustalenia, czy fagocytoza w próbie ex vivo była pośredniczona przez Fc, otrzymano fragmenty F(ab')2 przeciwciała 3D6 przeciw Ap. Choć fragmenty F(ab')2 zachowały pełną zdolność do reagowania z płytkami, nie były zdolne do wyzwalania fagocytozy przez komórki mikrogleju. Na dodatek, fagocytozę z pełnym przeciwciałem można było zablokować odczynnikiem przeciw mysim receptorom Fc (przeciw-CD16/32). Dane te wskazują, że klirens in vivo Ap następuje w wyniku fagocytozy pośredniczonej przez receptor Fc.

P r z y k ł a d V. Przejście przeciwciał przez barierę krew-mózg

W przykładzie tym oznaczono stężenie przeciwciał dostarczanych do mózgu po iniekcji dożylnej do tkanki obwodowej myszy normalnych lub PDAPP. Po podaniu myszy PDAPP lub kontrolne normalne myszy perfundowano 0,9% NaCl. Obszary mózgu (hipokamp lub korę) wycięto i szybko zamrożono. Mózg zhomogenizowano w 0,1% Tritonie + inhibitory proteazy. Immunoglobulinę wykrywano w ekstraktach techniką ELISA. F(ab)'2 z koziej przeciw-mysiej IgG powleczone na płytce RIA zastosowano jako reagent wychwytujący. Surowicę lub ekstrakty mózgowe inkubowano przez 1 godzinę. Izotypy wykrywano przeciwmysią IgG1-HRP lub IgG2a-HRP lub IgG2b-HRP (Caltag). Przeciwciała, niezależnie od izotypu, były obecne w OUN w stężeniu w stosunku 1:1000 do stężenia stwierdzonego w krwi. Przykładowo, gdy stężenie IgG1 było trzykrotnie wyższe od stężenia IgG2a we krwi, to było również trzykrotnie wyższe niż IgG2a w mózgu, przy czym poziomy obydwu wynosiły 0,1% odpowiednich poziomów we krwi. Wynik ten zaobserwowano zarówno w przypadku transgenicznych, jak i nietransgenicznych myszy, co wskazuje, że PDAPP nie mają unikatowo przeciekającej bariery krewmózg.

P r z y k ł a d VI. Klonowanie i sekwencjonowanie zmiennych regionów mysiego 3D6

Klonowanie i analiza sekwencji VH 3D6. Zmienny region VH ciężkiego łańcucha 3D6 sklonowano techniką RT-PCR z użyciem mRNA otrzymanego z komórek hybrydomy dwoma niezależnymi sposobami. W pierwszym zastosowano startery konsensusowe dla regionu VH peptydu liderowego, obejmującego kodon inicjacji translacji, jako 5'-starter (DNA nr 3818-3829) i g2b (DNA nr 3832) jako 3'-starter specyficzny dla stałych regionów. Sekwencje produktu amplifikacji PCR, a także z wielokrotnych, niezależnie otrzymanych klonów, były całkowicie zgodne pomiędzy sobą. Jako kolejne sprawdzenie sekwencji regionu VH 3D6, wynik potwierdzono przez sekwencjonowanie fragmentu VH otrzymanego techniką 5'RACE RT-PCR i z użyciem specyficznego startera 3'g2b (DNA nr 3832). Również w tym przypadku sekwencja pochodziła z produktu PCR, podobnie jak szereg niezależnie wyizolowanych klonów. Zgodność obu sekwencji była całkowita (z wyjątkiem podstawienia V8I w regionie liderowym z produktu 5'RACE), co wskazuje na to, że sekwencje pochodzą z mRNA kodującego region VH 3D6. Sekwencję nukleotydową (SEQ ID NO: 3) i sekwencję aminokwasową (SEQ ID NO: 4) regionu VH 3D6 podano odpowiednio w tabeli 9A i na fig. 2.

T a b e l a 9A

Sekwencja nukleotydowa VH mysiego 3D6

ATGAACTTCGGGCTCAGCTTGATTTTCCTTGTCCTTGTTTTAAAAGGTGTCCAGTGTGA

AGTGAAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTAGTGAAGCCTGGAGCGTCTCTGAAACTCT

CCTGTGCAGCCTCTGGATTCACTTTCAGTAACTATGGCATGTCTTGGGTTCGCCAGAAT

TCAGACAAGAGGCTGGAGTGGGTTGCATCCATTAGGAGTGGTGGTGGTAGAACCTACTA

TTCAGACAATGTAAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGAGAATGCCAAGAACACCCTGT

ACCTGCAAATGAGTAGTCTGAAGTCTGAGGACACGGCCTTGTATTATTGTGTCAGATAT GATCACTATAGTGGTAGCTCCGACTACTGGGGCCAGGGCACCACT (SEQ ID NO: 3) *Peptyd liderowy podkreślono.

PL 211 761 B1

Klonowanie i analiza sekwencji VL 3D6. Zmienny region VL lekkiego łańcucha 3D6 sklonowano w sposób analogiczny, jak region VH. W pierwszej próbie zaprojektowano zestaw starterów konsensusowych do amplifikacji mysich regionów VL w sposób następujący: startery 5' (DNA nr 3806-3816) zaprojektowano do hybrydyzacji z regionem VL, obejmującym kodon inicjacji translacji, a starter 3' (DNA nr 3817) był specyficzny dla mysiego regionu Ck w dół od regionu łączącego V-J. Analiza sekwencji DNA fragmentu PCR, jak również niezależnie otrzymanych wyizolowanych klonów z użyciem tego zestawu starterów konsensusowych dla lekkiego łańcucha ujawniła, że otrzymany cDNA pochodził z niefunkcjonalnie przegrupowanego sygnału jako sekwencji zawierającej mutację przesunięcia ramki odczytu pomiędzy regionem połączenia V-J.

W drugiej próbie 5'RACE zastosowano do klonowania DNA kodującego drugi VL. Analiza sekwencji DNA tego produktu (konsensus 11) wykazała, że kodował on funkcjonalny mRNA. W związku z tym można wywnioskować, że sekwencja koduje prawidłowy mRNA lekkiego łańcucha 3D6. Sekwencję nukleotydową (SEQ ID NO: 1) i sekwencję aminokwasową (SEQ ID NO: 2) regionu VL 3D6 podano odpowiednio w tabeli 9B i na fig. 1.

T a b e l a 9B

Sekwencja nukleotydowa VL mysiego 3D6

ATGATGAGTCCTGCCCAGTTCCTGTTTCTGTTAGTGCTCTGGATTCGGGAAACCAACGG

TTATGTTGTGATGACCCAGACTCCACTCACTTTGTCGGTTACCATTGGACAACCAGCCT

CCATCTCTTGCAAGTCAAGTCAGAGCCTCTTAGATAGTGATGGAAAGACATATTTGAAT

TGGTTGTTACAGAGGCCAGGCCAGTCTCCAAAGCGCCTAATCTATCTGGTGTCTAAACT

GGACTCTGGAGTCCCTGACAGGTTCACTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTTACACTGA

AAATCAGCAGAATAGAGGCTGAGGATTTGGGACTTTATTATTGCTGGCAAGGTACACAT _{TTTCCTCGGACGTTCGGTGGAggcACCAAGCTgGAAATCAAA (SEQ ID NO}.

*Peptyd liderowy podkreślono

Startery zastosowane do klonowania cDNA VL 3D6 podano w tabeli 10.

PL 211 761 B1

T a b e l a 10

DNA	Wiel- kość	Nić kodująca?	Sekwencja DNA	Uwagi
3806	40	Tak	ACT.AGT.CGA.CAT.GAA. GTT.GCC.TGT.TAG.GCT.GTT .GGT.GCT.G (SEQ ID NO: 39)	starter dla mysiego zmiennego łańcucha κ 1, Starter MKV 1, zestaw MRC; % A+T = 50,00 [20]; % C+G = 50,00 [20] Davis, Botstein, Roth. Temp, topn 72,90°C
3807	39	Tak	ACT.AGT.CGA.CAT.GGA.GW C.AGA.CAC.ACT.CCT.GYT.A TG.GGT (SEQ ID NO: 40)	starter dla mysiego zmiennego łańcucha κ 2, Starter MKV 2. zestaw MRC % A+T = 46,15 [18]; % C+G = 48,72 [19] Davis, Botstein, Roth. Temp, topn. 72,05°C
3808	40	Tak	ACT.AGT.CGA.CAT.GAG.TG T.GCT.CAC.TCA.GGT.CCT.G GS.GTT.G (SEQ ID NO: 41)	starter dla mysiego zmiennego łańcucha κ 3, Starter MKV 3. zestaw MRC; % A+T = 45,00 [18]; % C+G = 52,50 [21] Davis, Botstein. Roth. Temp, topn. 73,93°C
3809	43	Tak	act.agt.cga.cat.gag.gr C.CCC.TGC.TCA.GWT.TYT.T GG.MWT.CTT.G (SEQ ID NO: 42)	starter dla mysiego zmiennego łańcucha κ 4, Starter MKV 4. zestaw MRC; % A+T = 41,86 [18]; % C+G = 46,51 [20] Davis, Botstein, Roth. Temp, topn. 72,34°C
3810	40	Tak	ACT.AGT.CGA.CAT.GGA.TT T.WCA.GGT.GCA.GAT.TWT. CAG.CTT.C (SEQ ID NO: 43)	starter dla mysiego zmiennego łańcucha κ 5, Starter MKV 5. zestaw MRC; % A+T = 52,50 [21]; % C+G = 42,50 [17] Davis, Botstein, Roth. Temp, topn. 69,83°C
3811	37	Tak	ACT.AGT.CGA.CAT.GAG.GT K.CYY.TGY.TSA.GYT.YCT.G RG.G (SEQ ID NO: 44)	starter dla mysiego zmiennego łańcucha κ 6, Starter MKV 6. zestaw MRC; % A+T = 37,84 [14]; % C+G = 40,54 [15] Davis, Botstein, Roth. Temp, topn. 68,01 °C

PL 211 761 B1 cd. tabeli 10

DNA	Wiel- kość	Nić kodująca?	Sekwencja DNA	Uwagi
3812	41	Tak	ACT.AGT.CGA.CAT.GGG.CW T.CAA.GAT.GGA.GTC.ACA. KWY.YCW.GG (SEQ ID NO: 45)	starter dla mysiego zmiennego łańcucha κ 7, Starter MKV 7, zestaw MRC; % A+T = 39,02 [16]; % C+G = 46,34 [19] Davis, Botstein, Roth. Temp, topn. 71,70°C
3813	41	Tak	ACT.AGT.CGA.CAT.GTG.GG G.AYC.TKT.TTY.CMM.TTT.T TC.AAT.TG (SEQ ID NO: 46)	starter dla mysiego zmiennego łańcucha κ 8, Starter MKV 8. zestaw MRC; % A+T 53,66 [22]; % C+G = 34,15 [14] Davis, Botstein, Roth. Temp, topn. 66,70°C
3814	35	Tak	ACT.AGT.CGA.CAT.GGT.RT C.CWC.ASC.TCA.GTT.CCT.T G (SEQ ID NO: 47)	starter dla mysiego zmiennego łańcucha κ 9, Starter MKV 9. zestaw MRC; % A+T = 45,71 [16]; % C+G = 45,71 [16] Davis, Botstein, Roth. Temp, topn. 69,36°C
3815	37	Tak	ACT.AGT.CGA.CAT.GTA.TA T.ATG.TrT.GTLGTC.TAT.TT C.T (SEQ ID NO: 48)	starter dla mysiego zmiennego łańcucha κ 10, Starter MKV 10. zestaw MRC; % A+T = 70,27 [26]; % C+G = 29,73 [11] Davis, Botstein, Roth. Temp. topn. 63,58°C
3816	38	Tak	ACT.AGT.CGA.CAT.GGA.AG C CCC.AGC.TCA.GCT.TCT.C TT.CC (SEQ ID NO: 49)	starter dla mysiego zmiennego łańcucha κ 11, Starter MKV 11. zestaw MRC; % A+T = 44,74 [17]; % C+G - 55,26 [21] Davis, Botstein, Roth. Temp. topn. 74,40°C
3817	27	Nie	GGA.TCC.CGG.GTG.GAT.GG T.GGG.AAG.ATG (SEQ ID NO: 50)	starter w tył dla mysiego lekkiego łańcucha κ. aminokwasy 116-122; starter dla stałego regionu Ck. Zestaw MRC + miejsce Smal; % A+T = 47,06 [8]; % C+G = 52,94 [9] Davis, Bot-stein, Roth, Temp. topn. 57,19°C
3818	37	Tak	ACT.AGT.CGA.CAT.GAA.AT G.CAG.CTG.GGT.CAT.STT.C TT.C (SEQ ID NO: 51)	starter dla mysiego zmiennego ciężkiego łańcucha 1, starter ΜΗV ł. zestaw MRC;
3819	36	Tak	ACT.AGT.CGA.CAT.GGG.AT G.GAG.CTR.TAT.CAT.SYT.C TT (SEQ ID NO: 52)	starter dla mysiego zmiennego ciężkiego łańcucha 2, starter MHV 2. zestaw MRC;

PL 211 761 B1 cd. tabeli 10

DNA	Wiel- kość	Nić kodująca?	Sekwencja DNA	Uwagi
3820	37	Tak	ACT.AGT.CGA.CAT.GAA.GW T.GTG.GTT.AAA.CTG.GGT.T TT.T (SEQ ID NO: 53)	starter dla mysiego zmiennego ciężkiego łańcucha 3, starter MHV 3. zestaw MRC;
3821	35	Tak	ACT.AGT.CGA.CAT.GRA.CT T.TGG.GYT.CAG.CTT.GRT.T T (SEQ ID NO: 54)	starter dla mysiego zmiennego ciężkiego łańcucha 4, starter MHV 4. zestaw MRC;
3822	40	Tak	ACT.AGT.CGA.CAT.GGA.CT C.CAG.GCT.CAA.TTT.AGT.T TT.CCT.T (SEQ ID NO: 55)	starter dla mysiego zmiennego ciężkiego łańcucha 5, starter MHV 5. zestaw MRC;
3823	37	Tak	ACT.AGT.CGA.CAT.GGC.TG T.CYT.RGS.GCT.RCT.CTT.CT G.C (SEQ ID NO: 56)	starter dla mysiego zmiennego ciężkiego łańcucha 6, starter MHV 6. zestaw MRC;
3824	36	Tak	ACT.AGT.CGA.CAT.GGR.AT G.GAG.CKG.GRT.CTT.TMT.C TT (SEQ ID NO: 57)	starter dla mysiego zmiennego ciężkiego łańcucha 7, starter MHV 7. zestaw MRC;
3825	33	Tak	ACT.AGT.CGA.CAT.GAG.AG T.GCT.GAT.TCT.TTT.GTG (SEQ ID NO: 58)	starter dla mysiego zmiennego ciężkiego łańcucha 8, starter MHV 8. zestaw MRC;
3826	40	Tak	ACT.AGT.CGA.CAT.GGM.TT G.GGT.GTG.GAM.CTT.GCT. ATT.CCT.G (SEQ ID NO: 59)	starter dla mysiego zmiennego ciężkiego łańcucha 9, starter MHV 9. zestaw MRC;
3827	37	Tak	ACT.AGT.CGA.CAT.GGG.CA G.ACT.TAC.ATT.CTC.ATT.C CT.G (SEQ ID NO: 60)	starter dla mysiego zmiennego ciężkiego łańcucha 10, starter MHV 10. zestaw MRC;
3828	38	.. Tak	ACT.AGT.CGA.CAT.GGA.TT T.TGG.GCT.GAT.TTT.TTT.TA T.TG (SEQ1DNO: 61)	starter dla mysiego zmiennego ciężkiego łańcucha 11, starter MHV 11. zestaw MRC;
3829	37	Tak	ACT.AGT.CGA.CAT.GAT.GG T.GTT.AAG.TCT.TCT.GTA.C CT.G (SEQ ID NO: 62)	starter dla mysiego zmiennego ciężkiego łańcucha 12, starter MHV 12. zestaw MRC;
3832	27	Nie	GGA.TCC.CGG.GAG.TGG.AT A.GAC.tGA.TGG (SEQ ID NO: 63)	starter w tył dla mysiego ciężkiego łańcucha IgG2b. Pozycje aminokwasów 119-124. zestaw MRC;

Od N-końca do C-końca łańcuchy lekki i ciężki zawierają domeny FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 i FR4. Przyporządkowanie aminokwasów do każdej domeny jest zgodne z konwencją numeracji Kabata i innych, supra.

Ekspresja chimerycznego przeciwciała 3D6: Zmienne regiony ciężkiego i lekkiego łańcucha przekonstruowano tak, aby kodowały sekwencje donorowe do składania w dół od odpowiednich połączeń VDJ lub VJ i wklonowano do ssaczego wektora ekspresyjnego pCMV-hy1 w przypadku ciężkiego łańcucha i pCMV-hk1 w przypadku lekkiego łańcucha. Wektory te kodują ludzkie stałe regiony γ1 i Ck jako egzonowe fragmenty w dół od wstawionej kasety zmiennego regionu. Po weryfikacji sekwencji wektorami do ekspresji ciężkiego łańcucha i lekkiego łańcucha kotransfekowano komórki COS. Dwa różne klony ciężkiego łańcucha (H2.2 i H3.2) niezależnie kontransfekowano z 3 różnymi chimerycz42

PL 211 761 B1 nymi klonami lekkiego łańcucha (L3, L4 i L10) w celu potwierdzenia powtarzalności wyniku. Transfekcję chimerycznego przeciwciała 21.6 przeprowadzono jako dodatnią kontrolę dla wektorów.

Kondycjonowane pożywki zebrano w 48 godzin po transfekcji i wykonano analizę Western blotting w celu ustalenia wytwarzania przeciwciał lub ELISA do ustalenia wiązania Ap.

Spośród wielu transfektantów wszystkie eksprymowały kombinacje ciężki łańcuch + lekki łańcuch, rozpoznawane przez kozie przeciwciało przeciw-ludzka IgG (H+L) w metodzie Western blotting.

Bezpośrednie wiązanie przeciwciał 3D6 i chimerycznego 3D6 (PK1614) z Ap zbadano techniką ELISA. Stwierdzono, że chimeryczne 3D6 wiąże się z Ap z wysoką awidnością, podobną do wykazywanej przez 3D6 (fig. 3A). Ponadto oparta na ELISA próba konkurencyjnego hamowania ujawniła, że chimeryczne 3D6 i mysie przeciwciała 3D6 jednakowo konkurowały z biotynylowanym 3D6 w wiązaniu z Λβ (fig. 3B). Chimeryczne przeciwciało pod względem właściwości wiązania było nieodróżnialne od wzorcowej próbki 3D6.

T a b e l a 11

Stężenie (gg/ml)	3D6	PK1614	IgG1
0,037		919,3
0,11	118,6	118,9
0,33	99,7	71,25
1	98,63	84,53	134,4

Ponadto, zarówno 3D6, jak i PK1614 skutecznie zapewniały klirens płytek Ap. Próba ex vivo wykazuje, że w miarę, jak stężenie przeciwciała wzrasta, ilość Ap zmniejsza się w podobny sposób przypadku zarówno mysiego, jak i chimerycznego przeciwciała 3D6. W związku z tym można wywnioskować, że sekwencje kodują odpowiednio funkcjonalny ciężki łańcuch i lekkie łańcuchy 3D6.

P r z y k ł a d VII. Humanizacja 3D6

Homologia/Modelowanie cząsteczkowe. W celu zidentyfikowania kluczowych strukturalnych reszt zrębowych w mysim przeciwciele 3D6, wygenerowano trójwymiarowy model na bazie najbardziej zbliżonych mysich przeciwciał dla ciężkiego i lekkiego łańcucha. W tym celu przeciwciało oznaczone jako 1CR9 wybrano jako matrycę do modelowania lekkiego łańcucha 3D6 (PDB ID: 1CR9, Kanyo i inni, supra), a przeciwciało oznaczone jako 1OPG wybrano jako matrycę do modelowania ciężkiego łańcucha. (PDB ID: 1OPG Kodandapani i inni, supra). (Patrz także tabela 1) Dopasowanie sekwencji aminokwasowych 3D6 z lekkim łańcuchem i ciężkim łańcuchem tych przeciwciał wykazało, że z wyjątkiem CDR3 ciężkiego łańcucha, przeciwciała 1CR9 i 1OPG przeciwciała wykazują istotną homologię sekwencji z 3D6. Na dodatek pętle CDR wybranego przeciwciała wypadają w tych samych kanonicznych klasach strukturalnych Chothia jak pętle CDR w 3D6, także w tym przypadku z wyjątkiem CDR3 ciężkiego łańcucha. Z tego względu 1CR9 i 1OPG wybrano wstępnie jako przeciwciała o rozwiązanej strukturze do modelowania homologii 3D6.

Model pierwszego przejścia homologii zmiennego regionu 3D6 na bazie przeciwciał wspomnianych powyżej skonstruowano z użyciem pakietu oprogramowania Look & SegMod Modules GeneMine (v3.5). Oprogramowanie to zakupiono ze stałą licencją z Molecular Applications Group (Palo Λ^, ^). Ten pakiet oprogramowania, którego autorami są dr Michael Levitt i dr Chris Lee, ułatwia proces modelowania cząsteczkowego przez zautomatyzowanie etapów podczas strukturalnego modelowania pierwotnej sekwencji na matrycy znanej struktury, w oparciu o homologię sekwencji. Dzięki pracy z wykorzystaniem stacji roboczej Silicon Graphics IRIS w środowisku UNIX modelowana struktura jest automatycznie uszczegółowiana w serii etapów minimalizowania energii w celu złagodzenia niekorzystnych kontaktów atomowych i zoptymalizowania oddziaływań elektrostatycznych i van der Wallsa.

Kolejny rozwinięty model skonstruowano z wykorzystaniem zdolności Quanta® w modelowaniu. Zapytanie bazy danych PDB odnośnie CDR3 ciężkiego łańcucha w 3D6 pozwoliło zidentyfikować 1qkz jako najbardziej homologiczny i mający taką samą liczbę reszt, jak 3D6. W związku z tym CDR3 ciężkiego łańcucha w 3D6 wymodelowano z wykorzystaniem struktury krystalicznej 1qkz jako matrycy. Ślad rdzenia a-węglowego modelu 3D6 pokazano na fig. 4. Domenę VH pokazano jako linię cieniowaną, domenę VL zaznaczono linią ciągłą, a pętle CDR wskazano jako wstążki.

Selekcja sekwencji ludzkiego przeciwciała akceptorowego. Odpowiednie sekwencje ludzkiego przeciwciała akceptorowego zidentyfikowano drogą komputerowego porównywania sekwencji aminokwasowych mysich zmiennych regionów z sekwencjami znanych ludzkich przeciwciał.

PL 211 761 B1

Porównanie przeprowadzono osobno dla ciężkiego i lekkiego łańcucha 3D6. W szczególności zmienne domeny ludzkich przeciwciał, których sekwencje zrębowe wykazywały wysoki stopień identyczności sekwencji z mysimi regionami zrębowymi VL i VH, zidentyfikowano przez zapytanie do bazy danych Kabat z wykorzystaniem programu NCBI BLAST (ogólnie dostępnego poprzez serwer internetowy National Institutes of Health NCBI) z odpowiednimi mysimi sekwencjami zrębowymi.

Dwie potencjalne sekwencje wybrano jako sekwencje akceptorowe, w oparciu o następujące kryteria: (1) homologia z przedmiotową sekwencją; (2) zawieranie wspólnych kanonicznych struktur CDR z sekwencją donorową; i (3) brak jakichkolwiek rzadkich reszt aminokwasowych w regionach zrębowych. Wybraną sekwencją akceptorową dla VL jest Kabat ID numer (KABID) 019230 (nr dostępu Genbank S40342), a dla VH jest KABID 045919 (nr dostępu Genbank AF115110). W pierwszych wersjach humanizowanego przeciwciała 3D6 wykorzystuje się te wybrane sekwencje akceptorowych przeciwciał.

Podstawienie reszt aminokwasowych. Jak to zaznaczono powyżej, humanizowane przeciwciała według wynalazku zawierają zmienne regiony zrębowe zasadniczo z ludzkiej immunoglobuliny (immunoglobuliny akceptorowej) i regiony determinujące komplementarność, zasadniczo z mysiej immunoglobuliny (immunoglobuliny donorowej) określanej jako 3D6. Po zidentyfikowaniu regionów determinujących komplementarność w 3D6 i odpowiednich akceptorowych ludzkich immunoglobulin, następnym etapem było ustalenie, czy ewentualnie jakieś reszty z tych składników nadają się do podstawienia w celu zoptymalizowania właściwości otrzymanego humanizowanego przeciwciała. Opisane powyżej kryteria zastosowano do wyselekcjonowania reszt do podstawienia.

Fig. 1 i 2 przedstawiają dopasowanie wyjściowego mysiego VL i VH w 3D6, z odpowiednią wersją 1 humanizowanej sekwencji, odpowiednią ludzką akceptorową sekwencją zrębową i na koniec z ludzką sekwencją germinalnego regionu V, wykazującą najwyższą homologię z ludzką akceptorową sekwencją zrębową. Zacienione reszty wskazują aminokwasy kanoniczne (zaczernione), Verniera (obrysowane linią kreskowaną), upakowania (pogrubione) i rzadkie (pogrubione, kursywa) i zostały zaznaczone na rysunku. Gwiazdki wskazują reszty stanowiące mutację wsteczną do reszt mysich w ludzkiej akceptorowej sekwencji zrębowej, a regiony CDR zaznaczono przez obrysowanie. Zestawienie zmian wprowadzonych do wersji 1 humanizowanych VH i VL w 3D6 przedstawiono w tabeli 12.

T a b e l a 12

Zestawienie zmian w humanizowanym 3D6.v1

Zmiany	VL (112 reszt)	VH (119 reszt)
Hu^Mu: Zrąb	4/112	3/119 (1 kanoniczna, 1 upakowania)
CDR1	6/16	3/5
CDR2	4/7	7/14
CDR3	5/8	4/10
Hu^Mu	19/112(17%)	17/119(14%)
Mu^Hu: Zrąb	13/112	14/119
Uwagi odnośnie mutacji wstecznej	1. I2V, jest w pozycji kanonicznej 2. Y36L, jest resztą upakowania oraz leży pod CDR 3. L46R, jest resztą upakowania oraz leży pod CDR	4. S49A Vernier/pod CDR 5. A93V, jest resztą w strefie upakowania i Verniera 6. K94R, jest resztą kanoniczną
Uwagi odnośnie akceptora	7. KABID 019230/nr dost. Genbank S40342 8. Hu κ LC, podgrupa II 9. CDR z tej samej kanonicznej grupy strukturalnej, co donor (m3D6) L1 = klasa 4 L2 = klasa 1 L3 = klasa 1 10. Nieznana specyficzność	11. KABID 045919/nr dost. Genbank AF115110 12. Hu HC, podgrupa III 13. CDR z tej samej kanonicznej grupy strukturalnej, co donor (m3D6) H1 = klasa 1 H2 = klasa 3 14. Rozpoznaje polisacharyd kapsularny z Neisseria meningitidis
Akceptorowa linia germinalna	15. VH3-23	16. A3 i A19

PL 211 761 B1

W tabelach 13 i 14 podano klucze numerowania Kabata odpowiednio dla różnych lekkich i ciężkich łańcuchów.

T a b e l a 13

Klucz do numeracji Kabata dla lekkiego łańcucha

nr KAB	nr	Typ	Mysi VL 3D6	HUM VL 3D6	KABID 019230	Linia germinalna A19	Uwagi
1	2	3	4	5	6	7	8
1	1	FR1	Y	Y	D	D	Rzadka mysia, możliwy kontakt z CDR
2	2		V	V	I	I	Kanoniczna/kontakt z CDR
3	3		V	V	V	V
4	4		M	M	M	M
5	5		T	T	T	T
6	6		Q	Q	Q	Q
7	7		T	S	S	S
8	8		P	P	P	P
9	9		L	L	L	L
10	10		T	S	S	S
11	11		L	L	L	L
12	12		S	P	P	P
13	13		V	V	V	V
14	14		T	T	T	T
15	15		I	P	P	P
16	16		G	G	G	G
17	17		Q	E	E	E
18	18		P	P	P	P
19	19		A	A	A	A
20	20		S	S	S	S
21	21		I	I	I	I
22	22		S	S	S	S
23	23		C	C	C	C
24	24	CDR1	K	K	R	R
25	25		S	S	S	S
26	26		S	S	S	S
27	27		Q	Q	Q	Q
27A	28		S	S	S	S
27B	29		L	L	L	L
27C	30		L	L	L	L
27D	31		D	D	H	H
27E	32		S	S	S	S
28	33		D	D	N	N

PL 211 761 B1 cd. tabeli 13

1	2	3	4	5	6	7	8
29	34		G	G	G	G
30	35		K	K	Y	Y
31	36		T	T	N	N
32	37		Y	Y	Y	Y
33	38		L	L	L	L
34	39		N	N	D	D
35	40	FR2	W	W	W	W
36	41		L	L	Y	Y	Reszta upakowania
37	42		L	L	L	L
38	43		Q	Q	Q	Q
39	44		R	K	K	K
40	45		P	P	P	P
41	46		G	G	G	G
42	47		Q	Q	Q	Q
43	48		S	S	S	S
44	49		P	P	P	P
45	50		K	Q	Q	Q
46	51		R	R	L	L	Reszta upakowania
47	52		L	L	L	L
48	53		I	I	I	I
49	54		Y	Y	Y	Y
50	55	CDR2	L	L	L	L
51	56		V	V	G	G
52	57		S	S	S	S
53	58		K	K	N	N
54	59		L	L	R	R
55	60		D	D	A	A
56	61		S	S	S	S
57	62	FR3	G	G	G	G
58	63		V	V	V	V
59	64		P	P	P	P
60	65		D	D	D	D
61	66		R	R	R	R
62	67		F	F	F	F
63	68		T	S	S	S
64	69		G	G	G	G
65	70		S	S	S	S
66	71		G	G	G	G

PL 211 761 B1 cd. tabeli 13

1	2	3	4	5	6	7	8
67	72		S	S	S	S
68	73		G	G	G	G
69	74		T	T	T	T
70	75		D	D	D	D
71	76		F	F	F	F
72	77		T	T	T	T
73	78		L	L	L	L
74	79		K	K	K	K
75	80		I	I	I	I
76	81		S	S	S	S
77	82		R	R	R	R
78	83		I	V	V	V
79	84		E	E	E	E
80	85		Λ	Λ	Λ	Λ
81	86		E	E	E	E
82	87		D	D	D	D
83	88		L	V	V	V
84	89		G	G	G	G
85	90		L	V	V	V
86	91		Y	Y	Y	Y
87	92		Y	Y	Y	Y
88	93		C	C	C	C
89	94	CDR3	W	W	M	M
90	95		Q	Q	Q	Q
91	96		G	G	Λ	Λ
92	97		T	T	L	L
93	98		H	H	Q	Q
94	99		F	F	T	T
95	100		P	P	P	P
96	101		R	R	R
97	102		T	T	T
98	103	FR4	F	F	F
99	104		G	G	G
100	105		G	Q	Q
101	106		G	G	G
102	107		T	T	T
103	108		K	K	K
104	109		L	V	V
105	110		E	E	E
106	111		I	I	I
106Λ	112		K	K	K

PL 211 761 B1

T a b e l a 14

Klucz do numeracji Kabata dla ciężkiego łańcucha

nr	nr	Typ	Mysi VH	HUM VH	KABID	Linia germinalna	Uwagi
KAB	3D6	3D6	045919	VH3-23
1	2	3	4	5	6	7	8
1	1	FR1	E	E	E	E
2	2		V	V	V	V
3	3		K	Q	Q	Q
4	4		L	L	L	L
5	5		V	L	L	L
6	6		E	E	E	E
7	7		S	S	S	S
8	8		G	G	G	G
9	9		G	G	G	G
10	10		G	G	G	G
11	11		L	L	L	L
12	12		V	V	V	V
13	13		K	Q	Q	Q
14	14		P	P	P	P
15	15		G	G	G	G
16	16		A	G	G	G
17	17		S	S	S	S
18	18		L	L	L	L
19	19		K	R	R	R
20	20		L	L	L	L
21	21		S	S	S	S
22	22		C	C	C	C
23	23		A	A	A	A
24	24		A	A	A	A
25	25		S	S	S	S
26	26		G	G	G	G
27	27		F	F	F	F
28	28		T	T	T	T
29	29		F	F	F	F
30	30		S	S	S	S
31	31	CDR1	N	N	S	S
32	32		Y	Y	Y	Y
33	33		G	G	A	A
34	34		M	M	V	M
35	35		S	S	S	S

PL 211 761 B1 cd. tabeli 14

1	2	3	4	5	6	7	8
36	36	FR2	W	W	W	W
37	37		V	V	V	V
38	38		R	R	R	R
39	39		Q	Q	Q	Q
40	40		N	A	A	A	Rzadka mysia, zastąpić Hum
41	41		S	P	P	P
42	42		D	G	G	G	Rzadka mysia, zastąpić Hum
43	43		K	K	K	K
44	44		R	G	G	G
45	45		L	L	L	L
46	46		E	E	E	E
47	47		W	W	W	W
48	48		V	V	V	V
49	49		A	A	S	S	kontakt z CDR/veneer
50	50	CDR2	S	S	A	A
51	51		I	I	I	I
52	52		R	R	S	S
52Α	53		S	S	G	G
53	54		G	G	S	S
54	55		G	G	G	G
55	56		G	G	G	G
56	57		R	R	S	S
57	58		T	T	T	T
58	59		Y	Y	Y	Y
59	60		Y	Y	Y	Y
60	61		S	S	A	A
61	62		D	D	D	D
62	63		N	N	S	S
63	64		V	V	V	V
64	65		K	K	K	K
65	66		G	G	G	G
66	67	FR3	R	R	R	R
67	68		F	F	F	F
68	69		T	T	T	T
69	70		I	I	I	I
70	71		S	S	S	S
71	72		R	R	R	R
72	73		E	D	D	D

PL 211 761 B1 cd. tabeli 14

1	2	3	4	5	6	7	8
73	74		N	N	N	N
74	75		A	A	A	S
75	76		K	K	K	K
76	77		N	N	N	N
77	78		T	S	S	T
78	79		L	L	L	L
79	80		Y	Y	Y	Y
80	81		L	L	L	L
81	82		Q	Q	Q	Q
82	83		M	M	M	M
82A	84		S	N	N	N
82B	85		S	S	S	S
82C	86		L	L	L	L
83	87		K	R	R	R
84	88		S	A	A	A
85	89		E	E	E	E
86	90		D	D	D	D
87	91		T	T	T	T
88	92		A	A	A	A
89	93		L	L	L	V
90	94		Y	Y	Y	Y
91	95		Y	Y	Y	Y
92	96		C	C	C	C
93	97		V	V	A	A	Reszta upakowania, wykorzystać mysi
94	98		R	R	K	K	Kanoniczna, wykorzystać mysi
95	99	CDR3	Y	Y	D
96	100		D	D	N
97	101		H	H	Y
98	102		Y	Y	D
99	103		S	S	F
100	104		G	G	W
100A	105		S	S	S
100B	106		S	S	G
100C	107		-	-	T
100D	108		-	-	F
101	109		D	D	D
102	110		Y	Y	Y
103	111	FR4	W	W	W
104	112		G	G	G
105	113		Q	Q	Q

PL 211 761 B1 cd. tabeli 14

1	2	3	4	5	6	7	8
106	114		G	G	G
107	115		T	T	T
108	116		T	L	L
109	117		V	V	V
110	118		T	T	T
111	119		V	V	V
112	120		S	S	S
113	121		S	S	S

Humanizowane przeciwciała korzystnie wykazują specyficzne powinowactwo wiązania względem Ap, wynoszące co najmniej 10 , 10 , 10 lub 10 M^- . Zazwyczaj górna granica powinowactwa wiązania humanizowanych przeciwciał względem Αβ mieści się w granicach trzy-, cztero- lub pięcio9 -1 krotnej wartości dla 3D6 (czyli ~10⁹ M^-1). Często dolna granica powinowactwa wiązania również mieści się w granicach trzy-, cztero- lub pięciokrotnej wartości dla 3D6.

Składanie i ekspresja VH i VL humanizowanego 3D6, wersja 1. W skrócie, dla każdego regionu V, zsyntetyzowano 4 duże jednoniciowe, zachodzące na siebie oligonukleotydy. Dodatkowo zsyntetyzowano 4 krótkie startery PCR dla każdego regionu V, aby jeszcze bardziej ułatwić składanie konkretnego regionu V. Sekwencje DNA zastosowanych w tym celu oligonukleotydów podano w tabeli 15.

T a b e l a 15 Oligonukleotydy DNA

nr DNA	Wiel- kość	Kodo- wanie?	Sekwencja	Uwagi
4060	136	Tak	tccgc aagct tgccg ccacc ATGGA CATGC GCGTG CCCGC CCAGC TGCTG GGCCT GCTGA TGCTG TGGGT GTCCG GCTCC TCCGG CTACG TGGTG ATGAC CCAGT CCCCC CTGTC CCTGC CCGTG ACCCC CGGCG A (SEQ ID NO: 17)	hum 3D6 VL-A
4061	131	Nie	CTGGG GGGAC TGGCC GGGCT TCTGC AGCAG CCAGT TCAGG TAGGT CTTGC CGTCG GAGTC CAGCA GGGAC TGGGA GGACT TGCAG GAGAT GGAGG CGGGC TCGCC GGGGG TCACG GGCAG GGACA GGGGG G (SEQ ID NO: 18)	hum 3D6 VL-B
4062	146	Tak	ACCTG AACTG GCTGC TGCAG AAGCC CGGCC AGTCC CCCCA GCGCC TGATC TACCT GGTGT CCAAG CTGGA CTCCG GCGTG CCCGA CCGCT TCTCC GGCTC CGGCT CCGGC ACCGA CTTCA CCCTG AAGAT CTCCC GCGTG GAGGC C (SEQIDNO: 19)	hum 3D6 VL-C

PL 211 761 B1 cd. tabeli 15

nr DNA	Wiel- kość	Kodo- wanie?	Sekwencja	Uwagi
4063	142	Nie	aattc tagga tccac tcacg CTTGA TCTCC ACCTT GGTGC CCTGG CCGAA GGTGC GGGGG AAGTG GGTGC CCTGC CAGCA GTAGT ACACG CCCAC GTCCT CGGCC TCCAC GCGGG AGATC TTCAG GGTGA AGTCG GTGCC GG (SEQ ID NO: 20)	hum 3D6 VL-D
4064	16	Nie	CTGGG GGGAC TGGCC G (SEQIDNO:21)	hum 3D6 VL AtB do tyłu %A+T = 18,75 [3]; % C+G = 81,2 [13] Davis, Botstein, Roth. Temp. topn. 66,96°C
4065	22	Tak	ACCTG AACTG GCTGC TGCAG AA (SEQ ID NO: 22)	hum 3D6 VL C+D do przodu % A+T = 45,45 [10]; % C+G = 54,55 [12] Davis, Botstein, Roth. Temp. topn. 64,54°C
4066	138	Tak	acaga aagct tgccg ccacc ATGGA GTTTG GGCTG AGCTG GCTTT TTCTT GTGGC TATTT TAAAA GGTGT CCAGT GTGAG GTGCA GCTGC TGGAG TCCGG CGGCG GCCTG GTGCA GCCCG GCGGC TCCCT GCGCC TGT (SEQ ID NO: 23)	hum 3D6 VH-A
4067	135	Nie	GCCGC CGGAG CGGAT GGAGG CCACC CACTC CAGGC CCTTG CCGGG GGCCT GGCGC ACCCA GGACA TGCCG TAGTT GGAGA AGGTG AAGCC GGAGG CGGCG CAGGA CAGGC GCAGG GAGCC GCCGG GCTGC ACCAG (SEQ ID NO: 24)	hum3D6VH-B
4068	142	Tak	CTGGA GTGGG TGGCC TCCAT CCGCT CCGGC GGCGG CCGCA CCTAC TACTC CGACA ACGTG AAGGG CCGCT TCACC ATCTC CCGCG ACAAC GCCAA GAACT CCCTG TACCT GCAGA TGAAC TCCCT GCGCG CCGAG GACAC CG (SEQ ID NO: 25)	hum 3D6 VH-C

PL 211 761 B1 cd. tabeli 15

nr DNA	Wiel- kość	Kodo- wanie?	Sekwencja	Uwagi
4069	144	Nie	ctgca aggat ccact caccG GAGGA CACGG TCACC AGGGT GCCCT GGCCC CAGTA GTCGG AGGAG CCGGA GTAGT GGTCG TAGCG CACGC AGTAG TACAG GGCGG TGTCC TCGGC GCGCA GGGAG TTCAT CTGCA GGT AC AGGG (SEQ ID NO: 26)	hum 3D6 VH-D
4070	16	Nie	GCCGC CGGAG CGGAT G (SEQ ID NO: 27)	hum 3D6 VH A+B do tyłu % A+T =18,75 [3]; % C+G = 81,25 [13] Davis, Botstein, Roth Temp. topn. 66,96°C
4071	20	Tak	CTGGA GTGGG TGGCC TCCAT (SEQ ID NO: 28)	hum 3D6 VH C+D do przodu % A+T 35,00 [7]; % C+G = 65,00 [13] Davis, Botstein, Roth Temp. topn. 66,55°C
4072	19	Tak	tcc gca agc ttg ccg cca c (SEQ ID NO: 29)	Hum 3D6 VL A+B do przodu % A+T = 31,58 [6]; % C+G = 68,42 [13] Davis, Botstein, Roth Temp. topn. 66,64°C
4073	29	Nie	aat tct agg atc cac tca cgC TTG ATC TC (SEQ ID NO: 30)	Hum 3D6VL C+D do tyłu % A+T = 55,17 [16]; % C+G = 44,83 [13] Davis, Botstein, Roth Temp. topn. 66,04^cC
4074	23	Tak	aca gaa agc ttg ccg cca ccATG(SEQID NO: 31)	Hum 3D6 VH A+B do przodu % A+T = 43,48 [10]; % C+G = 56,52 [13] Davis, Botstein, Roth Temp. topn. 66,33°C
4075	22	Nie	ctg caa gga tcc act cac cGG A (SEQ ID NO: 32)	Hum 3D6 VH C+D do tyłu % A+T = 40,91 [9]; % C+G = 59,09 [13] Davis, Botstein, Roth Temp. topn. 66,40°C

PL 211 761 B1

Humanizowany lekki łańcuch złożono z wykorzystaniem PCR. Analiza sekwencji DNA ponad dwóch tuzinów klonów ujawniła obecność rozproszonych punktowych mutacji i delecji w regionie VL w stosunku do oczekiwanej sekwencji. Analiza sekwencji wskazała, że klon 2.3 był podatny na naprawę 2 blisko rozmieszczonych pojedynczych delecji nukleotydów w regionie przy końcu aminowym. W związku z tym przeprowadzono ukierunkowaną mutagenezę klonu pCRShum3D6v12.3 z użyciem oligonukleotydów, w celu wprowadzenia 2 wydeletowanych nukleotydów, a naprawę mutacji punktowych potwierdzono na podstawie analizy sekwencji DNA, i insert VL wklonowano do wektora do ekspresji lekkiego łańcucha, pCMV-cK.

W wyniku złożenia humanizowanego VH sposobami opartymi na PCR otrzymano klony z dużymi delecjami w połowie 5' sekwencji. Dalsze próby optymalizacji warunków PCR zakończyły się częściowym powodzeniem. Klony złożone w zoptymalizowanych warunkach PCR w dalszym ciągu zawierały 10-20 nt delecje w regionie mapowania zakładki fragmentów A+B. W związku z tym inną strategię zastosowano do składania VH, z użyciem pośredniczonego przez polimerazę DNA (T4, Klenowa i Sequenase) wydłużenia zakładki, a następnie ligazy DNA T4 w celu połączenia kowalencyjnego zachodzących końców. Analiza sekwencji DNA podzestawu klonów otrzymanych przez składanie VH z zastosowaniem tego ostatniego sposobu, ujawniła występowanie rozproszonych mutacji i delecji w klonach. Analiza ponad dwóch tuzinów klonów potwierdziła zasadniczo taki sam wzór, jaki przedstawiono dla klonów. Podobne wyniki zaobserwowane po pierwszym składaniu klonów VH

VL sugerują, że zaobserwowane błędy w sekwencjach DNA wynikają z błędów automatycznego syntetyzatora podczas syntezy długich DNA, zastosowanych do składania.

Humanizowany klon VH 2.7 wybrano do przeprowadzanej z udziałem ukierunkowanej mutagenezy naprawy 3 delecji nukleotydowych, których obecność zaobserwowano.

P r z y k ł a d XIII. Charakteryzowanie humanizowanego przeciwciała 3D6v2

Wytworzono drugą wersję humanizowanego 3D6, zawierającego każde z podstawień zaznaczonych w wersji 1, z wyjątkiem podstawienia D > Y w reszcie 1. Podstawienie w tej reszcie wykonano w wersji 1, gdyż resztę tę zidentyfikowano jako resztę oddziaływującą z CDR. Jednakże podstawienie wydeletowało resztę rzadką w ludzkich immunoglobulinach w tej pozycji. W związku z tym wytworzono wersję bez tego podstawienia. Ponadto niegerminalne reszty w regionach zrębowych ciężkiego łańcucha zastąpiono resztami germinalnymi, w szczególności H74 = S, H77 = T i H89 = V. Numeracja Kabata dla lekkiego i ciężkiego łańcucha w wersji 2 jest taka sama, jak numeracja podana odpowiednio w tabelach 13 i 14, z tym że resztę 1 w wersji 2 lekkiego łańcucha stanowi asp (D), resztę 74 ciężkiego łańcucha stanowi ser (S), resztę 77 ciężkiego łańcucha stanowi thr (T), a resztę 89 ciężkiego łańcucha stanowi val (V). Sekwencje nukleotydowe wersji 1 lekkiego i ciężkiego łańcucha humanizowanego 3D6 podano odpowiednio jako SEQ ID NO: 34 i 36. Sekwencje nukleotydowe wersji lekkiego i ciężkiego łańcucha humanizowanego 3D6 podano odpowiednio jako SEQ ID NO: 35 i 37.

P r z y k ł a d IX. Funkcjonalne badanie humanizowanych przeciwciał 3D6

Wiązanie humanizowanego 3D6v1 z zagregowanym Aβ. Funkcjonalne badanie humanizowanego 3D6v1 przeprowadzono z użyciem kondycjonowanej pożywki z przejściowo transfekowanych komórek COS. Komórki transfekowano całkowicie chimerycznym przeciwciałem, mieszaniną chimerycznego ciężkiego łańcucha + humanizowanego lekkiego łańcucha lub chimerycznego lekkiego łańcucha + humanizowanego ciężkiego łańcucha i na koniec całkowicie humanizowanym przeciwciałem. Kondycjonowane pożywki zbadano pod względem wiązania z zagregowanym Aβ 1-42 w teście ELISA. Humanizowane przeciwciało wykazało dobrą aktywność w granicach błędu doświadczalnego i pod względem zdolności wiązania było nie do odróżnienia od chimerycznego 3D6 jako próbki odniesienia. Wyniki pokazano w tabeli 16.

T a b e l a 16

ng/ml	Chimeryczne	huVH/ChVL	ChVH/HuVL	HuVH/HuVL
1	2	3	4	5
690			0,867
600				0,895
260	0,83
230			0,774
200				0,81

PL 211 761 B1 cd. tabeli 16

1	2	3	4	5
190		0,811
87	0,675
77			0,594
67				0,689
63		0,648
29	0,45
25			0,381
22				0,496
21		0,438
9,6	0,251
8,5			0,198
7,4				0,278
7		0,232
3,2	0,129
2,3		0,124

W celu porównania powinowactwa wiązania humanizowanych przeciwciał 3D6v1 i 3D6v2, wykonano test ELISA z użyciem zagregowanego Aβ jako antygenu. Wyniki wskazują, że zarówno 3D6v1 (H1L1), jak i 3D6v2 (H2L2) wykazują prawie identyczną zdolność wiązania Aβ (fig. 5).

Analiza Replacement NET (rNET) h3D6v2. Próba z mapą epitopową rNET dostarcza informacji dotyczącej udziału poszczególnych reszt w epitopie w ogólnej aktywności wiązania przeciwciała. W analizie rNET wykorzystuje się zsyntetyzowane analogi peptydowe z jednym podstawieniem. Oznacza się wiązanie badanego przeciwciała przeciw natywnemu peptydowi (natywnemu antygenowi) i przeciw 19 wariantowym „pojedynczo podstawionym peptydom, przy czym każdy peptyd jest podstawiony w pozycji 1 jednym z 19 nienatywnych aminokwasów dla tej pozycji. Generuje się profil odzwierciedlający wpływ podstawienia w tej pozycji różnymi nienatywnymi resztami. Analogicznie generuje się profile w kolejnych pozycjach wzdłuż antygenowego peptydu. Połączony profil lub mapę epitopową, (odzwierciedlającą podstawienie w każdej pozycji wszystkimi spośród 19 nienatywnych reszt) można następnie porównać z podobnie wygenerowaną mapą dla drugiego przeciwciała. Zasadniczo podobne lub identyczne mapy wskazują, że porównywane przeciwciała mają taką samą lub podobną specyficzność względem epitopu.

Analizę tę przeprowadzono dla 3D6 i humanizowanego 3D6, wersja 2. Zbadano wiązanie przeciwciał przeciw natywnemu peptydowi Aβ DAEFRHDSGY (SEQ ID NO: 33). Reszty 1-8 systematycznie podstawiano każdą z 19 nienatywnych reszt dla tej pozycji. Wygenerowano odpowiednie mapy dla 3D6 i h3D6v2. Wyniki przedstawiono w postaci tabelarycznej w tabeli 17.

T a b e l a 17

Aβ: Mapowanie epitopowe wt3D6 i humanizowanego 3D6 techniką replacement Net (rNET)

Podstawienie	Typ dziki 3D6 [OD]	Humanizowane 3D6 [OD]	Podstawienie	Typ dziki 3D6 [OD]	Humanizowane 3D6 [OD]
1	2	3	4	5	6
Reszta 1 = A	0,464	0,643	Reszta 5 = A	0,275	0,435
C	0,450	0,628	C	0,359	0,635
D	0,577	0,692	D	0,080	0,163
E	0,576	0,700	E	0,115	0,187
F	0,034	0,062	F	0,439	0,569
G	0,569	0,738	G	0,485	0,679

PL 211 761 B1 cd. tabeli 17

1	2	3	4	5	6
H	0,054	0,117	H	0,577	0,680
I	0,048	0,118	I	0,510	0,671
K	0,033	0,057	K	0,573	0,693
L	0,073	0,148	L	0,517	0,691
M	0,039	0,072	M	0,418	0,611
N	0,587	0,757	N	0,476	0,655
P	0,069	0,144	P	0,093	0,198
Q	0,441	0,689	Q	0,388	0,565
R	0,056	0,155	R	0,613	0,702
S	0,569	0,762	S	0,487	0,633
T	0,450	0,702	T	0,530	0,639
V	0,057	0,190	V	0,493	0,562
W	0,031	0,070	W	0,393	0,461
Y	0,341	0,498	Y	0,278	0,230
Reszta 2 = A	0,548	0,698	Reszta 6 = A	0,587	0,707
C	0,553	0,694	C	0,585	0,703
D	0,119	0,222	D	0,584	0,701
E	0,563	0,702	E	0,579	0,702
F	0,577	0,717	F	0,586	0,704
G	0,527	0,720	G	0,592	0,709
H	0,534	0,741	H	0,596	0,688
I	0,522	0,722	I	0,602	0,708
K	0,548	0,722	K	0,585	0,691
L	0,482	0,705	L	0,584	0,688
M	0,535	0,705	M	0,583	0,687
N	0,525	0,735	N	0,580	0,686
P	0,445	0,707	P	0,587	0,705
Q	0,567	0,756	Q	0,570	0,695
R	0,562	0,719	R	0,576	0,686
S	0,587	0,705	S	0,573	0,689
T	0,552	0,712	T	0,573	0,700
V	0,550	0,702	V	0,588	0,715
W	0,553	0,701	W	0,576	0,696
Y	0,547	0,704	Y	0,595	0,708
Reszta 3 = A	0,038	0,061	Reszta 7 = A	0,580	0,688
C	0,222	0,410	C	0,559	0,676
D	0,019	0,027	D	0,573	0,681

PL 211 761 B1 cd. tabeli 17

1	2	3	4	5	6
E	0,542	0,689	E	0,565	0,677
F	0,034	0,060	F	0,546	0,668
G	0,016	0,019	G	0,562	0,679
H	0,016	0,020	H	0,557	0,675
I	0,019	0,024	I	0,552	0,681
K	0,053	0,090	K	0,565	0,685
L	0,019	0,026	L	0,566	0,701
M	0,019	0,027	M	0,562	0,697
N	0,024	0,032	N	0,573	0,688
P	0,017	0,020	P	0,582	0,678
Q	0,153	0,406	Q	0,563	0,679
R	0,015	0,023	R	0,551	0,677
S	0,016	0,021	S	0,563	0,674
T	0,015	0,019	T	0,560	0,685
V	0,016	0,021	V	0,563	0,687
W	0,149	0,304	W	0,547	0,685
Y	0,016	0,020	Y	0,560	0,682
Reszta 4 = A	0,016	0,020	Reszta 8 = A	0,573	0,687
C	0,020	0,023	C	0,583	0,700
D	0,017	0,020	D	0,586	0,697
E	0,016	0,021	E	0,601	0,701
F	0,557	0,703	F	0,586	0,687
G	0,016	0,020	G	0,569	0,681
H	0,470	0,723	H	0,559	0,683
I	0,119	0,360	I	0,568	0,686
K	0,015	0,018	K	0,557	0,698
L	0,559	0,716	L	0,570	0,686
M	0,549	0,725	M	0,571	0,693
N	0,085	0,089	N	0,573	0,700
P	0,030	0,056	P	0,574	0,694
Q	0,065	0,110	Q	0,590	0,703
R	0,016	0,019	R	0,589	0,699
S	0,026	0,031	S	0,599	0,719
T	0,016	0,021	T	0,586	0,689
V	0,213	0,494	V	0,578	0,688
W	0,291	0,568	W	0,567	0,687
Y	0,529	0,730	Y	0,574	0,680

PL 211 761 B1

Należy podkreślić, że profile są praktycznie identyczne dla 3D6 i h3D6v2, gdy spojrzy się na podstawienia w każdej pozycji (czyli wartości zmieniają się w identyczny sposób, gdy porówna się dane w kolumnie 1 (3D6) i w kolumnie 2 (h3D6v2). Dane te wykazują, że specyficzność h3D6v2 zostaje zachowana, gdyż mapa epitopowa rNET dla h3D6v2 jest praktycznie taka sama jak w przypadku m3D6 przy zastosowaniu reszt Aβ zarówno 1-4, jak i 5-8.

Badania immunohistochemiczne skrawków mózgów PDAPP wykazują specyficzność przeciwciała h3D6v1. Humanizowane przeciwciała 3D6v1 rozpoznawały Aβ w przygotowanych w kriostacie skrawkach mózgu myszy PDAPP. Humanizowane 3D6v1 i PK1614 wiążą się z płytkami PDAPP z takim samym charakterem odpowiedzi na dawkę, mierzonej ilością fluorescencji (mierzonej ilościowo w pikselach) na preparat histologiczny w funkcji ilości przeciwciała stosowanego do wybarwienia tkanki (fig. 6). W doświadczeniu tym zastosowano identyczne przeciw-ludzkie wtórne przeciwciała. Procedury przygotowywania preparatów, wybarwiania i otrzymywania obrazów opisano uprzednio. W identycznych doświadczeniach analiza obrazu po wybarwianiu h3D6v2 skrawków mózgów PDAPP i objętych AD ujawniła, że h3D6v2 rozpoznaje płytki Aβ w podobny sposób, jak 3D6v1 (np. płytki są silnie „udekorowane).

Analiza konkurencyjnego wiązania h3D6. Zdolność przeciwciał h3D6 v1 i v2 do konkurowania z mysim 3D6 zmierzono techniką ELISA z użyciem biotynylowanego przeciwciała 3D6. Analiza konkurencyjnego wiązania ujawniła, że h3D6v1, h3D6v2 i chimeryczne PK1614 mogą konkurować z m3D6 w wiązaniu z Aβ (fig. 7). h3D6v1 i h3D6v2 były identyczne pod względem zdolności konkurowania z 3D6 względem Aβ. Przeciwciało 10D5 zastosowano jako ujemną kontrolę, gdyż ma ono inny epitop wiązania niż 3D6. Analiza BIAcore również ujawniła wysokie powinowactwo h3D6v1 i h3D6v2 względem Aβ (tabela 18).

T a b e l a 18

Pomiary powinowactwa przeciwciał dla Λβ z użyciem techniki BIAcore

Przeciwciało	ka1 (1/Ms)	kd1 (1/s)	Kd (nM)
Mu 3D6	4,06E+05	3,57E-04	0,88
Chimeryczne 3D6	4,58E+05	3,86E-04	0,84
Hu 3D6v1	1,85E+05	3,82E-04	2,06
Hu 3D6v2	1,70E+05	3,78E-04	2,24

W porównaniu z 3D6, którego Kd wynosi 0,88 nM, h3D6v1 i h3D6v2 miały około 2 - 3-krotnie niższe powinowactwo wiązania, mierzone przy stężeniach h3D6v1 i h3D6v2 odpowiednio 2,06 nM i 2,24 nM. Próba ELISA konkurencyjnego wiązania ujawniła około 6-krotnie niższe powinowactwo wiązania w przypadku h3D6v1 i h3D6v2. Zazwyczaj humanizowane przeciwciała wykazują około 3-4-krotnie niższe powinowactwo wiązania w porównaniu z ich mysimi odpowiednikami. Z tego względu około 3-krotny spadek (średnia z wyników ELISA i BIAcore) w przypadku h3D6v1 i h3D6v2 mieści się w dopuszczalnym zakresie.

Próba ex vivo z zastosowaniem przeciwciała h3D6v2. Zdolność h3D6v2 do stymulowania komórek mikrogleju zbadano w próbie fagocytozy ex vivo (fig. 8). h3D6v2 było skuteczne jako chimeryczne 3D6 w wywoływaniu fagocytozy agregatów Aβ z tkanki mózgowej myszy PDAPP. IgG zastosowano jako ujemną kontrolę w tym doświadczeniu, gdyż jest ona niezdolna do wiązania Aβ i z tego względu nie może wywołać fagocytozy.

125

Lokalizacja in vivo h3D6 w mózgu. h3D6v2 znakowany ¹²⁵I, m3D6 i przeciwciało DAE13 wstrzyknięto dożylnie 14 myszom PDAPP w odrębnych doświadczeniach. Myszy uśmiercono po 7 dniach i wykonano perfuzję w celu przeprowadzenia dalszej analizy. Ich obszary mózgowe wycięto i wykonano pomia125 ry aktywności ¹²⁵I w różnych regionach mózgu. Aktywność znacznika radioaktywnego w mózgu porównano z aktywnością w próbkach surowicy. Wyniki zestawiono w poniższych tabelach 19 i 20, odpowiednio dla surowicy i obszarów mózgu.

PL 211 761 B1

T a b e l a 19

m3D6	DAE13	Hu3D6
30389,1	17463,9	40963,8
12171	13200,6	24202,2
3418,2	36284,7	12472,4
18678,9	421,3	33851,8
27241	19702	27187,3
26398,8	24855,8	29016,9
27924,8	29287,4	33830,7
12008,4	12733,1	26734,9
29487,8	27722,5	30144,5
25498,6	30460,7	35126,9
9652	23320,1	28414,8
24599,3	7119,1	16956,1
29240	28093,5	18190,7
11922,7	24659,7	25671,4
17443,1	26748,9

T a b e l a 20

m3D6	DAE13	Hu3D6 (H2L2)
móżdżek	kora	hipokamp	móżdżek	kora	hipokamp	móżdżek	kora	hipokamp
1991,9	1201,1	4024	1277,5	2522,9	5711,9	2424,6	3759,4	11622
238,9	746,1	2523	502,5	2123,5	6965,8	1509,8	2274,9	7018,2
645,9	603	1241,1	2325	3528,2	7801,6	500	2265,9	5316,3
1000	2508,2	4644,2	232,7	849,8	1891,9	2736,2	5703,7	10395,5
1266,9	3737,9	7975,8	891,6	2621	8245,2	1192,2	3188	10170
1422	2398,7	7731,1	1102,6	2087,5	7292,3	2269,4	3481,4	9621,6
1700,4	2154,4	7124,1	1650,6	3488,4	10284,8	1526,7	3028	8331,3
542,5	812,4	2456,8	712,9	2318,5	6643,3	1538,1	4194,1	11244,8
1309	3010,5	8693,5	1172,9	1953,6	7363	1245,7	1699,4	6831,2
1372,2	997,5	2425,4	1067,9	3697,2	12280,7	2708,8	2789	7887,4
778,6	1291,9	5654,4	1952,2	2120,7	6412,7	2251,3	3897,5	11121,5
1199,3	1683,4	4887,3	1005,2	1852,5	5121,4	1529,6	1772,2	7986,9
1021,8	3234,5	8036,2	961,5	3382,9	8473,1	644,1	1663,4	5056,5
742,1	1056,7	3405,2	852,3	1943,2	6717,4	1516,4	1620,6	9888
1273,7	1320,8	4262,6	997,5	3065,7	10213,1

Dane wskazują, że h3D6v2 lokalizował się w mózgu, a zwłaszcza gromadził się w obszarze hipokampu, gdzie jak wiadomo odkłada się Αβ. Miana w mózgu m3D6 i DAE13 były porównywalne z mianem h3D6v2. Wszystkie 3 przeciwciała były zdolne do przekraczania bariery z krwi, co wykazało wiązanie z płytkami Αβ in vivo.

PL 211 761 B1

P r z y k ł a d X. Klonowanie i sekwencjonowanie mysich zmiennych regionów 10D5 Klonowanie i analiza sekwencji VH 10D5. Regiony VH i VL 10D5 z komórek hybrydowy sklonowano techniką RT-PCR z zastosowaniem procedur 5'RACE. Sekwencję nukleotydową (SEQ ID NO: 13) i wydedukowaną sekwencję aminokwasową (SEQ ID NO: 14) pochodzącą z dwóch niezależnych klonów cDNA kodujących przypuszczalną domenę VL 10D5, podano w tabeli 21 i na fig. 9. Sekwencję nukleotydową (SEQ ID NO: 15) i wydedukowaną sekwencję aminokwasową (SEQ ID NO: 16) pochodzącą z dwóch niezależnych klonów cDNA kodujących przypuszczalną domenę VH 10D5, podano w tabeli 22 i na fig. 10. Sekwencje VL i VH 10D5 spełniają kryteria funkcjonalnych regionów V w tym, że zawierają one ciągłą ORF od inicjatora metioniny do regionu C oraz zawierają reszty konserwatywne charakterystyczne dla genów regionu V immunoglobuliny.

T a b e l a 21

Mysia sekwencja DNA VL 10D5

ATGAAGTTGCCTGTTAGGCTGTTGGTACTGATGTTCTGGATTCCTGCTTCCAGCAGTGA

TGTTTTGATGACCCAAACTCCACTCTCCCTGCCTGTCAGTCTTGGAGATCAAGCCTCCA TCTCTTGCAGATCTAGTCAGAACATTATACATAGTAATGGAAACACCTATTTAGAATGG TACCTGCAGAAACCAGGCCAGTCTCCAAAGCTCCTGATCTACAAAGTTTCCAACCGATT TTCTGGGGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTCAAGA TCAAGAAAGTGGAGGCTGAGGATCTGGGAATTTATTACTGCTTTCAAGGTTCACATGTT CCGCTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGGAA (SEQ ID NO: 13) *Peptyd liderowy podkreślono

T a b e l a 22

Mysia sekwencja DNA VH 10D5

ATGGACAGGCTTACTTCCTCATTCCTGCTGCTGATTGTCCCTGCATATGTCCTGTCCCA

GGCTACTCTGAAAGAGTCTGGCCCTGGAATATTGCAGTCCTCCCAGACCCTCAGTCTGA

CTTGTTCTTTCTCTGGGTTTTCACTGAGCACTTCTGGTATGGGAGTGAGCTGGATTCGT

CAGCCTTCAGGAAAGGGTCTGGAGTGGCTGGCACACATTTACTGGGATGATGACAAGCG

CTATAACCCATCCCTGAAGAGCCGGCTCACAATCTCCAAGGATACCTCCAGAAAGCAGG

TATTCCTCAAGATCACCAGTGTGGACCCTGCAGATACTGCCACATACTACTGTGTTCGA

AGGCCCATTACTCCGGTACTAGTCGATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGT

CACCGTCTCCTCA (SEQ ID NO: 15) *Peptyd liderowy podkreślono

P r z y k ł a d XI. Profilaktyka i leczenie ludzi

Jednodawkowe badanie fazy I przeprowadza się w celu ustalenia bezpieczeństwa dla ludzi. Środek terapeutyczny podawano we wzrastających dawkach różnym pacjentom, wychodząc z około 0,01 przypuszczalnego skutecznego poziomu i zwiększając dawkę trzykrotnie aż do osiągnięcia poziomu odpowiadającego około 10-krotnej skutecznej dawki dla myszy.

Badania fazy II przeprowadza się w celu ustalenia skuteczności terapeutycznej. Wybiera się pacjentów z wczesnym do średniego stadium choroby Alzheimera, określoną z wykorzystaniem kryteriów Alzheimer's Disease and Related Disorders Association (ADRDA) dla prawdopodobnej AD. Odpowiednich pacjentów ocenia się w skali 12-26 w krótkiej skali oceny stanu psychicznego (MMSE). Do innych kryteriów należy warunek prawdopodobieństwa przeżycia przez pacjentów okresu badań i brak komplikujących sytuacji, takich jak równoczesne stosowanie innych leków mogących spowodować zakłócenia. Wyjściową ocenę stanu pacjentów wykonuje się z użyciem klasycznych środków psychometrycznych, takich jak MMSE i ADAS, będącą wszechstronną skalą oceny stanu i funkcjono60

PL 211 761 B1 wania pacjentów z chorobą Alzheimera. Te skale psychometryczne umożliwiają określenie postępu w stanie choroby Alzheimera. Odpowiednie skale jakości życia można również zastosować do monitorowania leczenia. Postęp choroby można również monitorować techniką MRI. Można także monitorować profile krwi u pacjentów w próbach obejmujących specyficzne dla immunogenu przeciwciała i odpowiedzi komórek T.

Po pomiarach podstawowych pacjenci rozpoczynają leczenie. Randomizuje się ich i podaje środek terapeutyczny lub placebo, w utajnionym (ślepym) trybie. Pacjentów monitoruje się co najmniej co 6 miesięcy. Skuteczność ustala się w oparciu o istotne zmniejszenie postępu w grupie leczonej w porównaniu z grupą placebo.

Drugie badanie fazy II przeprowadza się, aby ocenić przejście pacjentów z fazy wczesnej utraty pamięci nie będącej chorobą Alzheimera, czasami określanej jako upośledzenie pamięci związane z wiekiem (AAMI) lub łagodne upośledzenie funkcji poznawczych (MCI), do prawdopodobnej choroby Alzheimera, zdefiniowanej kryteriami ADRDA. Pacjentów z wysokim ryzykiem przejścia do choroby Alzheimera wybiera się z nie klinicznej populacji drogą selekcji populacji odniesienia pod względem wczesnych objawów utraty pamięci lub innych trudności związanych z symptomami pre-alzheimerowskimi, historii choroby Alzheimera w rodzinie, genetycznych czynników ryzyka, wieku, płci i innych cech przydatnych przy ustalaniu wysokiego ryzyka choroby Alzheimera. Zbiera się oceny wyjściowe z odpowiednich pomiarów, obejmujących MMSE i ADAS, wraz z innymi pomiarami zaprojektowanymi do oceny bardziej normalnej populacji. Te populacje pacjentów dzieli się na odpowiednie grupy z placebo do porównywania z grupami z wariantowym podawaniem środka. Te populacje pacjentów bada się co około 6 miesięcy i kończy się w przypadku każdego pacjenta bez względu na to, czy nastąpiło u niego przejście do prawdopodobnej choroby Alzheimera, ustalone w oparciu o kryteria ADRDA na zakończenie obserwacji.

Ogólne materiały i metody

Λ. Wytwarzanie poliklonalnych i monoklonalnych przeciwciał Λβ

Poliklonalne przeciwciało przeciw-Aji otrzymano z krwi zebranej z dwóch grup zwierząt. Pierwszą grupę stanowiło 100 samic myszy Swiss Webster, w wieku 6 - 8 tygodni. Immunizowano je w dniach 0, 15 i 29 100 μg AN1792 w połączeniu z CFA/IFA. Czwartą iniekcję wykonano w dniu 36 z użyciem połowy dawki AN1792. Zwierzęta wykrwawiono po uśmierceniu w dniu 42, surowicę wydzielono i surowice połączono otrzymując łącznie 64 ml. Drugą grupę stanowiły 24 samice myszy izogenicznych z myszami PDAPP, ale nietransgenicznych w stosunku do ludzkiego genu APP, w wieku 6 - 9 tygodni. Immunizowano je w dniach 0, 14, 28 i 56 100 μg AN1792 w połączeniu z CFA/IFA. Zwierzęta te również wykrwawiono po uśmierceniu w dniu 63, surowicę wydzielono i połączono, otrzymując łącznie 14 ml. Dwie partie surowicy połączono. Frakcję przeciwciał oczyszczono w dwóch kolejnych rundach wytrącania 50% nasyconym siarczanem amonu. Końcowy wytrącony materiał dializowano wobec PBS i zbadano na obecność endotoksyny. Poziom endotoksyny wynosił poniżej 1 EU/mg.

Monoklonalne przeciwciała przeciw-Aji otrzymano z płynu puchliny brzusznej. Płyn najpierw odlipidowano przez dodanie stężonego roztworu soli sodowej siarczanu dekstranu do lodowatego płynu puchlinowego przez mieszanie na lodzie, do osiągnięcia ostatecznego stężenia 0,238%. Następnie dodano w trakcie mieszania stężonego CaCl2, do osiągnięcia ostatecznego stężenia 64 mM. Roztwór ten odwirowano przy 10000 x g i osad odrzucono. Supernatant mieszano na lodzie z równą objętością wkroplonego nasyconego roztworu siarczanu amonu. Roztwór ponownie odwirowano przy 10000 x g i supernatant odrzucono. Osad przeprowadzono ponownie w stan zawiesiny i dializowano wobec 20 mM Tris-HCl, 0,4 M NaCl, pH 7,5. Frakcję wprowadzono na kolumnę Pharmacia FPLC Sepharose Q i eluowano z odwrotnym gradientem od 0,4 M do 0,275 M NaCl w 20 mM Tris-HCl, pH 7,5.

Pik przeciwciał zidentyfikowano na podstawie absorbancji przy 280 nm i odpowiednie frakcje połączono. Oczyszczony preparat przeciwciał scharakteryzowano przez pomiar stężenia białka metodą BCA oraz czystości metodą SDS-PAGE. Połączony materiał zbadano na obecność endotoksyny. Poziom endotoksyny wynosił poniżej 1 EU/mg. Mianom o wartości poniżej 100 arbitralnie przypisywano wartość miana 25.

B. Pomiar miana przeciwciał

Myszom pobrano krew przez wykonanie małego nakłucia w żyle ogonowej i zebrano około 200 μl krwi do probówki mikrowirówkowej. Świnkom morskim pobrano krew przez wygolenie najpierw obszaru pęciny, a następnie zastosowanie igły nr 18 do nakłucia żyły śródstopowej i zebranie krwi do probówek mikrowirówkowych. Krew pozostawiono do skrzepnięcia na 1 godzinę w temperaturze pokojoPL 211 761 B1 wej, wymieszano w aparacie Vortex, a następnie odwirowano przy 14000 x g przez 10 minut w celu oddzielenia skrzepu od surowicy. Surowicę przeniesiono następnie do czystej probówki mikrowirówkowej i przechowywano w 4°C aż do mianowania.

Miana przeciwciał zmierzono metodą ELISA. 96-Studzienkowe płytki do mikromianowania (płytki Costar EIA) powleczono 100 μl roztworu zawierającego 10 μg/ml A342 lub SAPP albo innych antygenów, jak to podano w każdym z konkretnych raportów, w buforze do powlekania studzienek (0,1 M fosforan sodu, pH 8,5, 0,1% azydku sodu) i utrzymywano przez noc w temperaturze pokojowej. Płyn ze studzienek odessano i surowice dodano do studzienek, rozpoczynając od rozcieńczenia 1/100 w rozcieńczalniku do próbek (0,014 M fosforan sodu, pH 7,4, 0,15 M NaCl, 0,6% albuminy surowicy bydlęcej, 0,05% tiomersalu). Siedem seryjnych trzykrotnych rozcieńczeń próbek wykonano bezpośrednio na płytkach, tak że końcowe rozcieńczenie wynosiło 1/218700. Rozcieńczone próbki inkubowano w studzienkach powleczonej płytki przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Płytki przemyto następnie czterokrotnie PBS zawierającym 0,05% Tween 20. Drugie przeciwciało, kozią przeciwmysią Ig skoniugowaną z peroksydazą chrzanową (otrzymaną z Boehringer Mannheim), dodano do studzienek jako 100 μl rozcieńczenia 1/3000 w rozcieńczalniku do próbek i inkubowano przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Płytki ponownie przemyto czterokrotnie PBS z Tween 20. W celu wywołania chromogenu 100 μl Slow TMB (3,3',5,5'-tetrametylobenzydyny otrzymanej z Pierce Chemicals) dodano do każdej studzienki i inkubowano przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Reakcje przerwano przez dodanie 25 μl 2M H₂SO₄. Natężenie barwy odczytywano następnie aparatem Molecular Devices z Vmax przy (450 nm - 650 nm).

Miana wyrażano jako odwrotność rozcieńczenia surowicy odpowiadającego połowie maksimum OD (gęstości optycznej). Maksimum OD osiągano zazwyczaj przy wyjściowym rozcieńczeniu 1/100, z wyjątkiem przypadku bardzo wysokich mian, gdy wyjściowe wysokie rozcieńczenie było niezbędne do osiągnięcia maksymalnej OD. Gdy punkt 50% wypadał pomiędzy dwoma rozcieńczeniami, wykonywano liniową ekstrapolację w celu obliczenia ostatecznego miana. W celu obliczenia średniej geometrycznej mian przeciwciał, mianom poniżej 100 arbitralnie przypisywano wartość miana 25.

C. Preparowanie tkanki mózgowej

Po uśmierceniu mózgi usuwano i jedną półkulę preparowano do analizy immunohistochemicznej, a 3 obszary mózgu (hipokamp, korę i móżdżek) wycinano z drugiej półkuli i stosowano do pomiaru stężenia różnych białek Ap i postaci APP, stosując specyficzne testy ELISA (Johnson-Wood i inni, supra).

Tkanki przeznaczone do testów ELISA homogenizowano w 10 objętościach lodowatego buforu guanidynowego (5,0 M chlorowodorek guanidyny, 50 mM Tris-HCl, pH 8,0). Homogenaty wymieszano przez łagodne mieszanie aparatem Adams Nutator (Fisher) przez 3-4 godziny w temperaturze pokojowej, po czym przechowywano w -20°C przed ilościowym oznaczaniem Ap i APP. Wcześniejsze doświadczenia wykazały, że anality zachowywały trwałość w tych warunkach przechowywania oraz że syntetyczne białko Ap (Bachem) można ilościowo odzyskać po dodaniu do homogenatów kontrolnej tkanki mózgowej myszy z tego samego miotu (Johnson-Wood i inni, supra).

D. Pomiar poziomów Ap

Homogenaty mózgu rozcieńczono 1:10 lodowatym rozcieńczalnikiem kazeinowym (0,25% kazeiny, PBS, 0,05% azydku sodu, 20 μg/ml aprotyniny, 5 mM EDTA pH 8,0, 10 μg/ml leupeptyny) i wirowano przy 16000 x g przez 20 minut w 4°C. Syntetyczne wzorce białka Ap (aminokwasy 1-42) i wzorce APP przygotowano tak, aby zawierały 0,5 M guanidynę i 0,1% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) w końcowej kompozycji. W teście sandwiczowym ELISA z „pełnym Ap stosuje się monoklonalne przeciwciało 266, specyficzne wobec aminokwasów 13-28 w Ap (Seubert i inni, supra), jako wychwytujące przeciwciało, oraz biotynylowane monoklonalne przeciwciało 3D6, specyficzne wobec aminokwasów 1-5 w Ap (Johnson Wood i inni, supra), jako przeciwciało reporterowe. Monoklonalne przeciwciało 3D6 nie rozpoznaje wydzielonego APP lub pełnej długości APP, ale wykrywa jedynie fragmenty Ap z kwasem asparaginowym na końcu aminowym. Próba ta ma dolną granicę czułości ~50 ng/ml (11 nM) i nie powoduje reakcji krzyżowej z endogennym mysim białkiem Ap w stężeniu do 1 ng/ml (Johnson-Wood i inni, supra).

W próbie sandwiczowej ELISA specyficznej względem Ap 1-42 stosuje się mAp 21F12, specyficzne względem aminokwasów 33-42 w Ap (Johnson-Wood i inni, supra), jako przeciwciało wychwytujące. Biotynylowane mAp 3D6 stosuje się również jako przeciwciało reporterowe w tej próbie o dolnej granicy czułości około 125 μg/ml (28 μM, Johnson-Wood i inni, supra). Do prób ELISA z Ap 100 μl mAp 266 (w stężeniu 10 μg/ml) lub mAp 21F12 (w stężeniu 5 μg/ml) powleczono studzienki 96-stu62

PL 211 761 B1 dzienkowych płytek do prób immunologicznych (Costar) prowadząc przez noc inkubację w temperaturze pokojowej. Roztwór usuwano przez odessanie i studzienki blokowano przez dodanie 200 gl 0,25% ludzkiej albuminy surowiczej w buforze PBS przez co najmniej 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Roztwór blokujący usuwano i płytki przechowywano w stanie osuszonym w 4°C aż do zastosowania. Płytki ponownie nawilżano buforem do przemywania [fizjologiczny roztwór soli buforowany Tris (0,15 M NaCl, 0,01 M Tris-HCl, pH 7,5), + 0,05% Tween 20] przed użyciem. Próbki i wzorce dodawano w trzech powtórkach w ilości po 100 gl/studzienkę i inkubowano przez noc w 4°C. Płytki przemywano co najmniej 3 razy buforem do przemywania pomiędzy każdym etapem w próbie. Dodawano biotynylowane mAp 3D6, rozcieńczone do 0,5 gg/ml w buforze kazeinowym do prób (0,25% kazeiny, PBS, 0,05% Tween 20, pH 7,4) i inkubowano w studzienkach przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Koniugat awidyna-peroksydaza chrzanowa, (Avidin-HRP, otrzymany z Vector, Burlingame, CA), rozcieńczony 1:4000 w buforze kazeinowym do prób dodawano do studzienek na 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Dodawano kolorymetryczny substrat, Slow TMB-ELISA (Pierce) i umożliwiono jego reagowanie przez 15 minut w temperaturze pokojowej, po czym reakcję enzymatyczną przerywano przez rozcieńczenie 25 gl 2 N H2SO4. Produkt reakcji oznaczano ilościowo aparatem Molecular Devices Vmax, mierzącym różnicę w absorbancji przy 450 nm i 650 nm.

E. Pomiar poziomów APP

Zastosowano 2 różne próby w przypadku APP. Pierwsza, oznaczona jako APP-a/FL, rozpoznaje zarówno APP-alfa (a), jak i pełnej długości (FL) postacie APP. Druga próba jest specyficzna dla APP -a. Próba APP-a/FL rozpoznaje wydzielone APP, zawierające pierwsze 12 aminokwasów Ap. Z uwagi na to, że przeciwciało reporterowe (2H3) nie jest specyficzne dla miejsca a-spinki, występującego pomiędzy aminokwasami 612-613 w ΛPP⁶⁹⁵ (Esch i inni, Science 248: 1122-1124 (1990)); próba ta rozpoznaje również pełnej długości APP (APP-FL). Wstępne doświadczenia z użyciem unieruchomionych przeciwciał APP do cytoplazmatycznego ogonka APP-FL, w celu pozbawienia homogenatów mózgowych APP-FL sugerują, że około 30-40% ΛPP-α/FL ΛPP stanowi FL (danych nie pokazano). Wychwytującym przeciwciałem zarówno w próbie APP-a/FL, jak i ΛPPα, jest mAb 8E5, skierowane przeciw aminokwasom 444 - 592 w postaci ΛPP⁶⁹⁵ (Games i inni, supra). Reporterowym mAb w próbie APP-a/FL jest mAb 2H3, specyficzny względem aminokwasów 597-608 w APP⁶⁹⁵ (Johnson-Wood i inni, supra), a reporterowym przeciwciałem w próbie APP-a jest biotynylowana pochodna mAb 16H9, skierowana na aminokwasy 605 - 611 w APP. Dolna granica czułości w próbie APP-aFL wynosi około 11 ng/ml (150 pM) (Johnson-Wood i inni), a w próbie specyficznej dla APP-a wynosi 22 ng/ml (0,3 nM). W obydwu próbach APP, mAb 8E5 naniesiono na studzienki 96-studzienkowych płytek EIA, w sposób opisany powyżej dla mAb 266. Oczyszczone, rekombinowane, wydzielone APP-a zastosowano jako wzorzec odniesienia w próbie APP-a oraz w próbie APP-a/FL (Esch i inni, supra). Próbki homogenatu mózgowego w 5 M guanidynie rozcieńczono 1:10 w rozcieńczalniku do próbek ELISA (0,014 M bufor fosforanowy, pH 7,4, 0,6% albuminy surowicy bydlęcej, 0,05% tiomersalu, 0,5 M NaCl, 0,1% NP40). Rozcieńczono je następnie 1:4 rozcieńczalnikiem do próbek, zawierającym 0,5 M guanidynę. Rozcieńczone homogenaty wirowano następnie przy 16000 x g przez 15 s w temperaturze pokojowej. Wzorce APP i próbki dodano na płytkę w podwójnych porcjach i inkubowano przez 1,5 godziny w temperaturze pokojowej. Biotynylowane reporterowe przeciwciało 2H3 lub 16H9 inkubowano z próbkami przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Streptawidynę-fosfatazę alkaliczną (Boehringer Mannheim), rozcieńczoną 1:1000 w rozcieńczalniku do próbek, inkubowano w studzienkach przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Dodano substrat fluorescencyjny, 4-metyloumbeliferylofosforan, prowadzono inkubację przez 30 minut w temperaturze pokojowej i wykonano pomiary płytek we fluorymetrze Cytofluor tm 2350 (Millipore), z wzbudzaniem przy 365 nm i emisją przy 450 nm.

F. Badania immunohistochemiczne

Mózgi utrwalano przez 3 dni w 40°C w 4% paraformaldehydzie w PBS, a następnie przechowywano przez 1 - 7 dni w 4°C w 1% paraformaldehydzie w PBS, przed pokrojeniem. Wykonano skrawki korowe o grubości 40 gm urządzeniem vibratome w temperaturze pokojowej, po czym przechowywano je w środku krioochronnym (30% gliceryny, 30% glikolu etylenowego w buforze fosforanowym) w 20°C przed obróbką immunohistochemiczną. W przypadku każdego mózgu 6 skrawków na poziomie grzbietowej części hipokampu, rozdzielonych kolejnymi przerwami 240 gm, inkubowano przez noc z jednym z następujących przeciwciał: (1) biotynylowane przeciw-Λβ (mAb, 3D6, spePL 211 761 B1 cyficzne względem ludzkiego Ap), rozcieńczone do stężenia 2 pg/ml w PBS z 1% końskiej surowicy; lub (2) biotynylowane mAb, specyficzne względem ludzkiego APP, 8E5, rozcieńczone do stężenia 3 pg/ml w PBS z 1,0% końskiej surowicy; lub (3) mAb specyficzne względem włóknistego kwasowego białka glejowego (GFAP; Sigma Chemical Co.), rozcieńczone 1:500 0,25% Tritonem X-100 z 1% końskiej surowicy, w fizjologicznym roztworze soli buforowanym Tris, pH 7,4 (TBS); lub (4) mAb specyficzne względem CD11b, antygen MAC-1 (Chemicon International) rozcieńczone 1:100 0,25% Tritonem X-100 z 1% surowicy króliczej w TBS; lub (5) mAb specyficzne względem antygenu MHC II, (Pharmingen) rozcieńczone 1:100 w 0,25% Tritonu X-100 z 1% surowicy króliczej w TBS; lub (6) szczurze mAb specyficzne względem CD 43 (Pharmingen), rozcieńczone 1:100 z 1% surowicy królika w PBS lub (7) szczurze mAb specyficzne względem CD 45RA (Pharmingen), rozcieńczone 1:100 z 1% surowicy królika w PBS; lub (8) szczurze monoklonalne Ap specyficzne względem CD 45RB (Pharmingen), rozcieńczone 1:100 z 1% surowicy królika w PBS; lub (9) szczurze monoklonalne Ap specyficzne względem CD 45 (Pharmingen), rozcieńczone 1:100 z 1% surowicy królika w PBS; lub (10) biotynylowane poliklonalne Ap chomika, specyficzne względem CD3e (Pharmingen), rozcieńczone 1:100 z 1% surowicy królika w PBS lub (11) szczurze mAb specyficzne względem CD3 (Serotec), rozcieńczone 1:200 z 1% surowicy królika w PBS; lub z (12) roztworem PBS bez pierwotnego przeciwciała, zawierającym 1% normalnej surowicy końskiej.

Skrawki poddawane reakcji z roztworami przeciwciał wymienionych powyżej w 1, 2 i 6-12, poddano wstępnej obróbce 1,0% Tritonu X-100, 0,4% nadtlenku wodoru w PBS przez 20 min w temperaturze pokojowej, w celu zablokowania endogennej peroksydazy. Inkubowano je następnie przez noc w 4°C z przeciwciałem pierwszorzędowym. Skrawki poddane reakcji z mAb 3D6 lub 8E5 lub CD3e poddawano następnie reakcji przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej z kompleksem peroksydaza chrzanowa-awidyna-biotyna, ze składnikami „A i „B zestawu, rozcieńczonymi 1:75 w PBS (Vector Elite Standard Kit, Vector Labs, Burlingame, CA.). Skrawki poddane reakcji z przeciwciałami specyficznymi względem CD 45RA, CD 45RB, CD 45, CD3 i z roztworem PBS pozbawionym pierwszorzędowego przeciwciała, inkubowano przez 1 godzinę w odpowiednio z biotynylowaną przeciw-szczurzą IgG (Vector), rozcieńczoną 1:75 w PBS lub biotynylowaną przeciwmysią IgG (Vector) rozcieńczoną 1:75 w PBS. Skrawki poddawano następnie reakcji przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej kompleksem peroksydaza chrzanowa-awidyna-biotyna, ze składnikami „A i „B zestawu, rozcieńczonymi 1:75 w PBS (Vector Elite Standard Kit, Vector Labs, Burlingame, CA).

Skrawki wywoływano w 0,01% nadtlenku wodoru, 0,05% 3,3'-diaminobenzydynie (DAB) w temperaturze pokojowej . Skrawki przeznaczone do inkubacji z przeciwciałami specyficznymi względem GFAP, MAC-1 i MHC II, potraktowano wstępnie 0,6% nadtlenkiem wodoru w temperaturze pokojowej w celu zablokowania endogennej peroksydazy, po czym inkubowano przez noc z pierwszorzędowym przeciwciałem w 4°C. Skrawki poddane reakcji z przeciwciałem GFAP inkubowano przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej z biotynylowaną przeciwmysią IgG wytworzoną u koni (Vector Laboratories; Vectastain Elite ABC Kit) rozcieńczoną 1:200 w TBS. Skrawki poddawano następnie reakcji przez 1 godzinę z kompleksem awidyna-biotyna-peroksydaza (Vector Laboratories; Vectastain Elite ABC Kit) rozcieńczonym 1:1000 w TBS. Skrawki inkubowane z monoklonalnym przeciwciałem specyficznym względem MAC-1 lub MHC II jako pierwszorzędowym przeciwciałem, poddawano następnie reakcji przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej z biotynylowaną przeciwszczurzą IgG wytworzoną u królika, rozcieńczoną 1:200 w TBS, a następnie inkubowano przez 1 godzinę z kompleksem awidyna-biotyna-peroksydaza rozcieńczonym 1:1000 w TBS.

Skrawki inkubowane z przeciwciałami specyficznymi względem GFAP, MAC-1 i MHC II wizualizowano następnie przez podziałanie w temperaturze pokojowej 0,05% DAB, 0,01% nadtlenkiem wodoru, 0,04% chlorkiem niklu, TBS odpowiednio przez 4 i 11 minut.

Immunologicznie znaczone skrawki zamocowano na szkiełkach mikroskopowych (VWR, szkiełka Superfrost), wysuszono na powietrzu przez noc, zamoczono w Propar (Anatech) i nakryto szkiełkami nakrywkowymi z użyciem Permount (Fisher) jako środka mocującego.

W celu kontrastowego wybarwienia płytek Ap zestaw GFAP-dodatnich skrawków zamocowano na szkiełkach Superfrost i inkubowano w 1% wodnym roztworze Thioflavin S (Sigma) przez 7 minut, po czym poddano obróbce immunohistochemicznej. Skrawki odwodniono i wyklarowano w Propar, po czym nakryto szkiełkami nakrywkowymi, które zamocowano środkiem Permount.

PL 211 761 B1

G. Analiza obrazu

Do ilościowej oceny preparatów immunoreaktywnych zastosowano Videometric 150 Image Analiz System (Oncor, Inc., Gaithersburg, MD), połączony z mikroskopem Nikon Microphot-FX poprzez kamerę video CCD i monitor Sony Trinitron. Obraz skrawków przechowywano w buforze video i wyznaczano próg na bazie barwy i nasycenia w celu dokonania selekcji i obliczenia całkowitej powierzchni w pikselach zajmowanej przez immunologicznie znakowane struktury. Dla każdego skrawka hipokamp ręcznie obrysowywano i obliczano całkowitą powierzchnię w pikselach zajmowaną przez hipokamp. Procent obciążenia amyloidem mierzono jako: (ułamek powierzchni hipokampu zawierający złogi Aβ reagujące immunologicznie z mAb 3D6) x 100. Podobnie procent obciążenia neurytami mierzono jako: (ułamek powierzchni hipokampu zawierający dystroficzne neuryty reagujące z monoklonalnymi przeciwciałami 8E5) x 100. C-Imaging System (Compix, Inc., Cranberry Township, PA), wykorzystujący program komputerowy Simple 32 Software Application, połączono z mikroskopem Nikon Microphot-FX poprzez kamerę Optronics i stosowano do oznaczania procentu kory retrosplenialnej, zajmowanego przez GFAP-dodatnie astrocyty oraz MAC-1- i MHC II-dodatni mikroglej. Obraz skrawka poddanej reakcji immunologicznej przechowywano w buforze video i wyznaczano próg monochromatyczny w celu dokonania selekcji i obliczenia całkowitej powierzchni w pikselach zajmowanej przez immunologicznie znakowane komórki. W przypadku każdego skrawka korę retrosplenialną (RSC) ręcznie obrysowywano i obliczano całkowitą powierzchnię w pikselach zajmowaną przez RSC. Procent astrocytozy definiowano jako: (ułamek RSC zajmowanej przez astrocyty reagujące z GFAP) X 100. Podobnie, procent mikroglejozy definiowano jako: (ułamek RSC zajmowanej przez mikroglej reagujący z MAC-1 lub MHC II) X 100. W przypadku wszystkich analiz obrazu dla każdego zwierzęcia analizowano ilościowo 6 skrawków na poziomie grzbietowej części hipokampu, rozdzielonych kolejnymi przerwami 240 gm. We wszystkich przypadkach status leczenia zwierząt był nieznany dla obserwatora.

Choć powyższy wynalazek opisano szczegółowo dla ułatwienia jego zrozumienia, oczywiste jest, że można dokonać pewnych modyfikacji.

Na podstawie powyższego opisu oczywiste jest, że wynalazek dostarcza szereg zastosowań. Przykładowo wynalazek dostarcza zastosowanie dowolnego z przeciwciał przeciw Aβ, opisanych powyżej, w leczeniu, profilaktyce lub diagnostyce choroby amyloidogennej lub do wytwarzania leku albo kompozycji diagnostycznej do takich zastosowań.

PL 211 761 B1

Wykaz sekwencj i <11Q> Janssen Alzheimer Immunotherapy i Wyeth LLC <120> Humanizowana immunoglobulina, która specyficznie wiąże się z peptydem β-amyloidu (Αβ), oraz jej fragment wiążący antygen, zawierająca je kompozycja farmaceutyczna i ich zastosowanie oraz kodująca je wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego i wektor zawierający tę cząsteczkę <130> ELN-002PC cl50> 60/251,892 <1S1> 2000-12-06 <160^ 63 <170> FastSEQ dla Windows wersja 4.0 <210:· 1 <211> 396 <212> DNA <213> Mus musculus <220>

<221> CDS <222> (1)...(396) <22l> sig_peptide <222> (1) ... (60) <400> 1

atg Met -20

atg Met

agt Ser

cct Pro

gcc Ala

cag Gin -15

ttc Phe

ctg Leu

ttt Phe

ctg Leu

tta gtg Leu Val -10

ctc Leu

tgg att

cgg Arg -5

48

Trp

Ile

gaa

acc

aac

ggt

tat

gtt

gtg

atg

acc

cag

act

cca

ctc

act

ttg

teg

96

Glu

Thr

Asn

Gly

Tyr

Val

Met

Thr

Gin

Thr

Pro

Leu

Thr

Leu

Ser

1

5

10

gtt

acc

att

gga

caa

cca

gcc

tcc

atc

tct

tgc

aag

tea

agt

cag

agc

144

Val

Thr

Ile

Gly

Gin

Pro

Ala

Ser

Ile

ser

Cys

Lys

Ser

Gin

Ser

15

20

25

ctc

tta

gat

agt

gat

gga

aag

aca

tat

ttg

aat

tgg

ttg

tta

cag

agg

192

Leu

Asp

Ser

Asp

Gly

Lys

Thr

Tyr

Leu

Asn

Trp

Leu

Gin

Arg

30

35

40

cca

ggc

cag

tct

cca

aag

cgc

eta

atc

tat

ctg

gtg

tct

aaa

ctg

gac

240

Pro

Gly

Gin

Ser

Pro

Lys

Arg

Leu

Ile

Tyr

Leu

Val

Ser

Lys

Leu

Asp

45

50

55

60

tct

gga

gtc

cct

gac

agg

ttc

act

ggc

agt

gga

tea

ggg

aca

gat

ttt

288

Ser

Gly

Val

Pro

Asp

Arg

Phe

Thr

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

ASp

Phe

65

70

75

aca

ctg

a aa

atc

agc

aga

ata

gag

get

gag

gat

ttg

gga

ctt

tat

336

Thr

Leu

Lys

Ile

Ser

Arg

Ile

Glu

Ala

Glu

Asp

Leu

Gly

Leu

Tyr

80

85

90

PL 211 761 B1

tgc

tgg

caa

ggt aca

cat

ttt

cct

cgg

acg

ttc

ggt

gga

ggc

acc

aag

Cys

Trp

Gin

Gly Thr

His

Phe

Pro

Arg

Thr

Phe

Gly

Thr

Lys

95

ICO

105

ctg

gaa

aLc

□ 35

Leu

Glu

Ile

Lys

110

<210? 2 <211? 132 <212? PRT

<213? Mus musculus

< 2 2 0 >

<221? SIGNAL

<222? (1) . . .

(20)

<400? 2 Met Met Ser

Prc

Ala

Gin

Phe

Leu

Phe

Leu

Val

Leu

Trp

Ile

Arg

-20

-15

-10

- 5

Glu Thr Asn

Gly

Tyr

Val

Met

Thr

Gin

Thr

Pro

Leu

Thr

Leu

Ser

1

5

10

Val Thr Ile

C-ly

Gin

Pro

Ala

Ser

Tle

Ser

Cys

Lys

Ser

G1 n

Ser

15

20

25

Leu Leu Asp

Ser

A_sp

Gly

Lys

Thr

Tyr

Lei;

Asn

Trp

Leu

Gir

Arg

30

35

40

Pro Gly Gin

Ser

Pro

Lys

Arg

Leu

Ile

Tyr

Leu

Val

Ser

Lys

Leu

Asp

45

50

55

60

Ser Gly Val

Pro

Asp

Arg

Phe

Thr

Gly

Ser

Glv

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

65

70

75

Thr Leu Lys

Ile

Ser

Arg

Ile

Glu

Ala

Glu

ASP

Leu

Gly

Leu

Tyr

80

65

90

Cys Trp Gin

Gly

Thr

His

Phe

Pro

Arg

Thr

Phe

Gly

Thr

Lys

95

100

105

Leu Glu Ile

Lys

110

<21lb 3 <211? 414 <212? DNA <213? Mus r.usculus <220?

<221? CDS <222? (1)...(414) <221? sig_peptide <222? (1)...(57) <400? 3

atg Met

aac Asn

ttc Phe

ggg Gly

ctc Leu -15

agc Ser

ttg Leu

att ile

ttc Phe

ctt Leu -10

gtc Val

ctt Leu

gtt Val

tta Leu

aaa Lys -5

ggt Gly

48

gtc

cag

tgt

gaa

gtg

aag

ctg

gtg

gag

tct

ggg

gga

ggc

tta

gtg

aag

96

Val

Gin

Cys

Glu

val

Lys

Leu

Val 5

Glu

Ser

Gly

Gly 10

Leu

Val

Lys

cct gga gcg tct ctg aaa ctc tcc tgt gca gcc tct gga ttc act ttc

144

PL 211 761 B1

Pro

Gly 15

Ala

Ser

Leu

Lys

Leu 20

Ser

Cys

Ala

Ser 25

Gly

Phe

Thr

Phe

agt

aac

tat

ggc

atg

tct

tgg

gtt

ege

cag

aat

tea

gac

aag

agg

ctg

192

Ser

Asn

Tyr

Gly

Met

Ser

Trp

Val

Arg

Gin

Asn

Ser

Asp

Lys

Arg

Leu

30

35

40

45

gag

tgg

gtt

gca

tcc

att

agg

agt

ggt

aga

acc

tac

tat

Lca

240

Glu

Trp

Val

Ala

Ser

Tle

Arg

Ser

Gly

Arg

Thr

Tyr

Ser

50

35

60

gac

aat

gta

aac

ggc

ega

ttc

acc

atc

tcc

aga

gag

aat

gcc

aac

238

Asp

Asn

Val

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

I_e

Ser

Arg

Glu

Asn

Ala

Lys

Asn

es

70

75

acc

ctg

tac

ctg

caa

atg

agt

ctg

aag

tct

gag

gac

acg

gcc

ttg

336

Thr

Leu

Tyr

Leu

Gin

Met

Ser

Leu

Lys

Ser

Glu

Asp

Thr

Ala

Leu

80

85

90

tat

tgt

gtc

aga

tat

gat

cac

tat

agt

ggt

age

tcc

gac

tac

tgg

3 84

Tyr

Cys

val

Arg

Tyr

Asp

His

Tyr

Ser

Gly

Ser

Asp

Tyr

Trp

95

100

105

ggc

cag

ggc

acc

act

gtc

aca

gtc

tcc

tea

414

Gly

Głn

Gly

Thr

Val

Thr

val

Ser

110

115

<210> 4 <211> 138 <212> PRT <213> Mus musculus

<220>

<22 1> SIGNAL

<222> (1)...

(19)

<400> 4 Met Asn

Phe

Gly

Leu

Ser

Leu

Ile

Phe

Leu

Val

Leu

Val

Leu

Lys

Gly

-1S

-10

-5

Val Gin

Cys

Clu

Val

Lys

Leu

Val

Glu

Ser

Gly

Leu

Val

Lys

1

5

1C

Pro Gly

Ala

Ser

Leu

Lys

Leu

Ser

Cys

Ala

Ser

Gly

Phe

Thr

Phe

15

20

25

Ser Asn

Tyr

Gly

Met

Ser

Trp

Val

Arg

Gin

Asn

Ser

Asp

Lys

Arg

Leu

30

35

4C

45

Glu Trp

Val

Ala

Ser

Ile

Arg

Ser

Gly

Arg

Thr

Tyr

Ser

50

55

60

Asp Asn

Val

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Arg

Glu

Asn

Ala

Lys

Asn

65

70

75

Thr Leu

Tyr

Leu

Gin

Met

Ser

Leu

Lys

Ser

Glu

Asp

Thr

Ala

Leu

80

05

90

Tyr Tyr

Cys

Val

Arg

Tyr

Asp

His

Tyr

Ser

Gly

Ser

Asp

Tyr

Trp

100 105

Gly Gin Gly Thr Thr Ile Thr Val Ser Ser 110 115 <210> 5 <21I> 132 <212> PRT

PL 211 761 B1 <213> Sekwencja sztuczna <220>

<2 21> SIGNAL <222? (1)...(20) <223> humanizowany zmienny region lekkiego łańcucha 3D6 <400> 5

Met - 2 0

Met

Ser

Pro

Ala

Gin -15

Phe

Leu

Phe

Leu

Leu -10

Val

Len

Trp

Ile

Arg -5

Glu

Thr

Asn

Gly

Tyr

Val

Met

Thr

Gin

Ser

Pro

Leu

Ser

Leu

Pro

1

5

10

val

Thr

Pro

Gly

Glu

Pro

Ala

Ser

Tle

Ser

Cys

Lys

Ser

Gin

Ser

15

20

25

Leu

Asp

Ser

Asp

Gly

Lys

Thr

Tyr

Leu

Asn

Trp

Leu

Gin

Lys

30

35

4 0

Pro

Gly

Gin

Ser

Pro

Gin

Arg

Leu

Ile

Tyr

Leu

Val

Ser

Lys

Leu

Asp

45

50

55

60

Ser

Gly

Val

Prc

Asp

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

65

7 0

75

Thr

Leu

Lys

Ile

Ser

Arg

Val

Glu

Ala

Glu

Asp

Val

Gly

Val

Tyr

80

85

90

Cys

Trp

Gin

Gly

Thr

His

Phe

Pro

Arg

Thr

Phe

Gly

Gin

Gly

Thr

Lys

95

ICO

105

Vd 2.

Glu

Ile

Lys

110

<210> 6

<211? 125 <212? PRT

<213> Homo sapiens

< 2 2 0 >

<221? SIGNAL

<222> (1

) . . .

(19)

<400? 6 Met Gly

Leu

Met

Leu

Trp

Val

Ser

Gly

Ser

Gly

Aep

Ile

Val

-1E

-10

-5

Met Thr

Gin

Ser

Pro

Leu

Ser

Leu

Pro

Val

Thr

Pro

C-ly

Glu

Pro

Ala

1

5

10

Ser I 1e

Ser

Cys

Arg

Ser

C-ln

Ser

Leu

His

Ser

Aon

Gly

Tyr

15

20

25

Asn Tyr

Leu

Asp

Trp

Tyr

Leu

Gin

Lys

Pro

Gly

Gin

Ser

Pro

Gin

Leu

30

35

40

45

Leu Ile

Tyr

Leu

Gly

Ser

Asn

Arg

Ala

Ser

Gly

Val

Pro

Asp

Arg

Phe

50

55

60

Ser Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

Thr

Leu

Lys

Ile

Ser

Arg

Val

65

70

75

Glu Ala

Glu

Asp

Val

Gly

Val

Tyr

Cys

Met

Gin

Ala

Leu

Gin

Thr

80

65

90

Pro Arg

Thr

Phe

Gly

Gin

Gly

Thr

Lys

Val

Glu

Ile

Lys

100 105 <210? 7 <211> 100 <212? PRT <213? Homo sapiens

PL 211 761 B1 <400> 7

Asp 1

Ile

Val

Met

Thr 5

Gin

Ser

Pro

Leu

Ser 10

Leu

Pro

Val

Thr

Pro 15

Gly

Glu

Pro

Ala

Ser

Ile

Ser

Cys

Arg

Ser

Gin

Ser

Leu

His

Ser

20

25

30

Asn

Gly

Tyr

Asn

Tyr

Leu

Asp

Trp

Tyr

Leu

Gin

Lys

Pro

Gly

Gin

Ser

35

40

45

Pro

Gin

Leu

Ile

Tyr

Leu

Gly

Ser

Asn

Arg

Ala

Ser

Gly

Val

Pro

50

55

60

Asp

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

Thr

Leu

Lys

Ile

65

70

75

80

Ser

Arg

Val

Glu

Ala

Glu

Asp

Val

Gly

Val

Tyr

Cys

Met

Gin

Ala

90 95

Leu Gin Thr Pro 100 <210> 8 <211> 138 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> humanizowany zmienny region ciężkiego łańcucha 3D6 <221> SIGNAL <222> (1) . . . (19) <400> 8

Met Asn Phe Gly Leu Ser

Leu

Ile

Phe Leu Val -10

Leu

Val

Leu

Lys -5

dy

-15

Val

Gin

Cys

Glu

Val

Gin

Leu

Glu

Ser

Gly

Giy

Gly

Leu

Val

Gin

1

5

10

Pro

Gly

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Ser

Gly

Phe

Thr

Phe

15

20

25

Ser

Asn

Tyr

dy

Met

Ser

Trp

Val

Arg

Gin

Ala

Pro

Gly

Lys

Gly

Leu

30

35

4 0

45

Glu

Trp

Val

Ala

Ser

Ile

Arg

Ser

Gly

Arg

Thr

Tyr

Ser

50

55

60

Asp

Asn

Val

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Arg

Asp

Asn

Ala

Lys

Asn

65

70

75

Ser

Leu

Tyr

Leu

Gin

Met

Asn

Ser

Leu

Arg

Ala

Glu

Asp

Thr

Ala

Leu

80

85

90

Tyr

Cys

Val

Arg

Tyr

Asp

His

Tyr

Ser

Gly

Ser

Asp

Tyr

Trp

95

100

105

Gly

Gin

Gly

Thr

Leu

Val

Thr

Val

Ser

110

115

PL 211 761 B1 <210> 9 <211> 121 <212> PRT

<213> Homo £

>apiens

<400> 9

Glu

Val

Gin

Leu

Glu

Ser

Gly

Leu

Val

Gin

Pro

Gly

1

5

10

15

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Ser

Gly

Phe

Thr

Phe

Ser

Tyr

20

25

30

Ala

Val

Ser

Trp

Val

Arg

Gin

Ala

Pro

Gly

Lys

Gly

Leu

Glu

Trp

Val

35

40

45

Ser

Ala

Ile

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Thr

Tyr

Ala

Asp

Ser

Val

50

55

60

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Arg

Asp

Asn

Ala

Lys

Asn

Ser

Leu

Tyr

65

70

75

80

Leu

Gin

Met

Asn

Ser

Leu

Arg

Al a

Glu

Asp

Thr

Ala

Leu

Tyr

Cys

85

90

95

Ala

Lys

Asp

Asn

Tyr

Asp

Phe

Trp

Ser

Gly

Thr

Phe

Asp

Tyr

Trp

Gly

100

105

110

Gin

Gly

Thr

Leu

Val

Thr

Val

Ser

115

120

<210> 10

<211> 98

<212> PRT

<21 3> Homo sapiens

<400> 10

Glu Val

Gin

Leu

Glu

Ser

Gly

Leu

Val

Gin

Pro

Gly

1

5

10

15

Ser Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Ser

Gly

Phe

Thr

Phe

Ser

Tyr

20

25

30

Ala Met

Ser

Trp

Val

Arg

Gin

Ala

Pro

Gly

Lys

Gly

Leu

Glu

Trp

Val

35

40

45

Ser Ala

Ile

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Thr

Tyr

Ala

Asp

Ser

Val

50

55

60

Lye Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Arg

Asp

Asn

Ser

Lys

Asn

Thr

Leu

Tyr

65

70

75

80

Leu Gin

Met

Asn

Ser

Leu

Arg

Ala

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Cys

85

90

95

Ala Lys <210> 11 <211> 132 <212 > PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

<22 1> SIGNAL <222> (1) . . . (20) <223> humanizowany zmienny region lekkiego łańcucha 3D6

PL 211 761 B1 <400> 11

Met

Ser

Pro

Ala

Gin

Phe

Leu

Phe

Leu

Val

Leu

Trp

Ile

Arg

-20

15

-10

-5

Glu

Thr

Asn

Gly

Asp

Val

Met

Thr

Gin

Ser

Pro

Leu

Ser

Leu

Pro

1

5

10

Val

Thr

Pro

Gly

Glu

Pro

Ala

Ser

Ile

Ser

Cys

Lys

Ser

Gir.

Ser

15

20

25

Leu

Asp

Ser

Asp

Gly

Lys

Thr

Tyr

Leu

Asn

Trp

Leu

Gin

Lys

30

35

40

Pro

Gly

Gin

Ser

Pro

Gin

Arg

Leu

Ile

Tyr

Leu

Val

Ser

Lys

Leu

Asp

45

50

55

60

Ser

Gly

Val

Pro

Asp

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

65

70

75

Thr

Leu

Lys

Ile

Ser

Arg

Val

Glu

Ala

Glu

Asp

Val

Gly

Val

Tyr

80

85

90

Cys

Trp

Gin

Gly

Thr

Hi ε

Phe

Pro

Arg

Thr

Phe

Gly

Gin

Gly

Thr

Lys

100 105

Val Glu Ile Lys 110 <210> 12 <2I1> 138 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> humanizowany zmienny region lekkiego łańcucha 3D6 <221> SIGNAL <222> (1)...(19) <400> 12

Met

Asn

Phe

Gly

Leu -15

Ser

Leu

Tle

Phe

Leu -10

Val

Leu

Val

Leu

Lys -5

Gly

Val

Gin

Cys

Glu

val

Gin

Leu

Glu

Ser

Gly

Leu

Val

Gin

1

5

10

Pro

Gly

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Ser

Gly

Phe

Thr

Phe

15

20

25

Ser

Asn

Tyr

Gly

Met

Ser

Trp

Val

Arg

Gin

Ala

Pro

Gly

Lys

Gly

Leu

30

35

40

45

Glu

Trp

Val

Ala

Ser

Ile

Arg

Ser

Gly

Arg

Thr

Tyr

Ser

50

55

60

Asp

Asn

Val

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Arg

Asp

Asn

Ser

Lys

Asn

65

70

75

Thr

Leu

Tyr

Leu

Gin

Met

Asn

Ser

Leu

Arg

Ala

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

80

85

90

Tyr

Cys

Val

Arg

Tyr

Asp

His

Tyr

Ser

Gly

Ser

Asp

Tyr

Trp

95

1 00

105

Gly

Gin

Gly

Thr

Leu

Val

Thr

Val

Ser

110

115

<210> 13 <211> 393 <212> DNA <213> Mus musculus

PL 211 761 B1 <220>

<221;= CDS <222> (1)...(353) <221> s_g_peptiće <222> (1)...(57) <400? 13

atg Met

aag Lys

ttg Leu

cct Pro

gtt Val “15

agg Arg

ctg Leu

ttg Leu

gta Val

ctg Leu -10

atg Met

ttc Phe

tgg Trp

att Ile

cct Pro 5

gct Ala

48

tcc

agc

agt

gat

gtt

ttg

atg

acn

caa

act

cca

ctc

tcc

ctg

cct

gtc

96

Ser

Αερ

Val

Leu

Met

Thr

Gin

Thr

Pro

Leu

Ser

Leu

Pro

Val

1

5

10

agt

ctt

gga

gat

caa

gcc

tcc

a_c

tct

tgc

aga

tct

agt

cag

aac

att

144

Ser

Leu

Gly

Asp

Gin

Ala

Ser

Ile

Ser

Cys

Arg

Ser

Gin

Asn

Ile

15

20

25

a ta

cat

agt

aat

gga

aac

acc

tat

tta

gaa

tgg

tac

ctg

cag

aaa

cca

192

Ile

His

Ser

Asn

Gly

Asn

Thr

Tyr

Leu

Glu

Trp

Tyr

Leu

Gin

Lys

Pro

30

35

40

45

ggc

cag

tct

cca

aag

ctc

ctg

atc

tac

aaa

gtt

tcc

aac

ega

ttt

tct

240

Gly

Gin

Ser

Pro

Lys

Leu

Ile

Tyr

Lys

Val

Ser

Asn

Arg

Phe

Ser

50

55

6C

999

gtc

cca

gac

agg

ttc

agt

ggc

agt

gga

tca

ggg

aca

gat

ttc

aca

208

Gly

Val

Pro

Asp

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

A_sp

Phe

Thr

5 5

70

75

ctc

aag

atc

aag

aaa

gtg

gag

gct

gag

gat

ctg

gga

att

tat

tac

tgc

336

Leu

Lys

ile

Lys

Val

Glu

Ala

Glu

Asp

Leu

Gly

Ile

Tyr

Cys

80

85

90

ttt

caa

ggt

tca

cat

gtt

ccg

ctc

acg

ttc

ggt

gct

ggg

acc

aag

ctg

384

Phe

Gin

Gly

Ser

His

Val

Pro

Leu

Thr

Phe

Gly

Al a

Gly

Thr

Lys

Leu

95

10C

105

gag

ctg

gaa

393

Glu

Leu

Glu

110

<2I0> 14 <211> 131 <212> PRT

<213> Mus musculus

<220?

<221? SIGNAL

<222> (1)..

. (19

)

<400? 14

Met

Lys

Leu

Pro

Val

^Ar9

Leu

Val

Leu

Met

Phe

Trp

Ile

Pro

Ala

-15

-10

-5

Ser

Asp

Val

Leu

Met

Thr

Gin

Thr

Pro

Leu

Ser

Leu

Pro

Val

1

5

10

Ser

Leu

Gly

Asp

Gin

Ala

Ser

Ile

Ser

Cys

Arg

Ser

Gin

Asn

Ile

20 25

PL 211 761 B1

Ile

His

Ser

Asn

Gly

Asn

Thr

Tyr

Leu

Glu

Trp

Tyr

Leu

Gin

Lys

Pro

30

35

40

45

Gly

Gin

Ser

Pro

Lys

Leu

Ile

Tyr

Lys

Val

Ser

Asn

Arg

Phe

Ser

50

55

60

Gly

Val

Pro

Asp

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

Thr

65

70

75

Leu

Lys

Ile

Lys

Val

Glu

Ala

Glu

Asp

Leu

Gly

Ile

Tyr

Cys

80

85

90

Phe

Gin

Gly

Ser

His

Val

Pro

Leu

Thr

Phe

Gly

Ala

Gly

Thr

Lys

Leu

100 105

Glu Leu Glu 110 <210> 15 <211? 426 <212? DNA <213> Mus musculus <220?

<221> CDS <222> (1)...(426) <221> sig_peptide <222> (1)...(57) <400> 15

atg Met

gac Asp

agg Arg

ctt Leu

act Thr -15

tcc Ser

tca Ser

ttc Phe

ctg Leu

ctg Leu -10

ctg Leu

att Ile

gtc Val

cct Pro

gca Ala 5

tat Tyr

48

gtc

ctg

tcc

cag

gct

act

ctg

aaa

gag

tct

ggc

cct

gga

ata

ttg

cag

96

Val

Leu

Ser

Gin

Ala

Thr

Leu

Lys

Glu

Ser

Gly

Pro

Gly

Ile

Leu

Gin

5

10

tcc

cag

acc

ctc

agt

ctg

act

tgt

tct

ttc

tct

ggg

ttt

tca

ctg

144

Ser

Gin

Thr

Leu

Ser

Leu

Thr

Cys

Ser

Phe

Ser

Gly

Phe

Ser

Leu

15

20

25

agc

act

tct

ggt

atg

gga

gtg

agc

tgg

att

cgt

cag

cct

tca

gga

aag

192

Ser

Thr

Ser

Gly

Met

Gly

Val

Ser

Trp

Ile

Arg

Gin

Pro

Ser

Gly

Lys

30

35

40

45

ggt

ctg

gag

tgg

ctg

gca

cac

att

tac

tgg

gat

gac

aag

cgc

tat

240

dy

Leu

Glu

Trp

Leu

Ala

His

Ile

Tyr

Trp

Asp

Lys

Arg

Tyr

50

55

60

aac

cca

tcc

ctg

aag

agc

cgg

ctc

aca

atc

tcc

aag

gat

acc

tcc

aga

288

Asn

Pro

Ser

Leu

Lys

Ser

Arg

Leu

Thr

Ile

Ser

Lys

Asp

Thr

Ser

Arg

65

70

75

aag

cag

gta

ttc

ctc

aag

atc

acc

agt

gtg

gac

cct

gca

gat

act

gcc

336

Lys

Gin

Val

Phe

Leu

Lys

Ile

Thr

Ser

Val

Asp

Pro

Ala

Asp

Thr

Ala

80

85

90

PL 211 761 B1

aca Thr

tac Tyr 95

tac Tyr

tgt Cys

gtt Val

ega Arg

agg Arg 100

ccc Pro

att Ile

act Thr

ccg Pro

gta Val 105

eta Leu

gtc Val

gat A.S

gct Ala

3 04

atg

gac

tac

tgg

ggt

caa

gga

acc

tea

gtc

acc

gtc

tcc

tea

426

Met

Asp

Tyr

Trp

Gly

Gin.

Gly

Thr

Ser

Val

Thr

Val

Ser

110

115

120

<210> 16 <211? 142 <212> PRT <213> Mus musculus <220?

<221> SIGNAL <222? (1)...(19) <400? 16

Met

Asp

Arg

Leu

Thr -15

Ser

Phe

Leu

Leu -10

Leu

Ile

Val

Pro

Ala -5

Tyr

Val

Leu

Ser

Gin

Ala

Thr

Leu

Lys

Glu

Ser

Gly

Pro

Gly

Ile

Leu

Gin

1

5

10

Ser

Gin

Thr

Leu

Ser

Leu

Thr

Cys

Ser

Phe

Ser

Gly

Phe

Ser

Leu

15

2C

25

Ser

Thr

Ser

Gly

Met

Gly

Val

Ser

Trp

Ile

Arg

Gin

Pro

Ser

Gly

Lys

30

35

40

45

Gly

Leu

Glu

Trp

Leu

Ala

His

Ile

Tyr

Trp

Asp

Lys

Arg

Tyr

50

55

60

Asn

Pro

Ser

Leu

Lys

Ser

Arg

Leu

Thr

I le

Ser

Lys

Asp

Thr

Ser

Arg

65

70

75

Lys

Gin

Val

Phe

Leu

Lys

Ile

Thr

Ser

Val

Asp

Pro

Ala

Asp

Thr

Ala

eo

85

90

Thr

Tyr

Cys

Val

Arg

Pro

Ile

Thr

Pro

Va 1

Leu

Val

Asp

Ala

95

100

105

Met

Asp

Tyr

Trp

Gly

Gin

Gly

Thr

Ser

Val

Thr

Val

Ser

110

115

120

<210> 18 <211> 131 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna

PL 211 761 B1 <220>

<223> Starter

<4C0> 1S
ctggggggac tggccgggct tctgcagcag	ccagttcaga	taggrcttgc	tgtcggagtc	60
cagcagggac tgggaggact tgcaggsgst ggacaggggg g <210> 1? <2 lis 14S < 2 12 > DNA. <213> Sekwencja sztuczna <22C> <223> Starter	ggaggccggc	tcgccggggg	tcacggacag	120 131
<400> 19
acctgaactg gctgctgcag aagcccggcc	agtccccccs	gcgcctgat c	tacctggtgt	60
ccaagctggs ctccggcctg cccgaccgct ccctgaaaat ctcccgcgtą gaogc; <210> 23 <211> 142 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220> <223> Starter	tctccggctc	cggctccggc	accgacttca	120 146
<400> 20
aattctagga tccactcacg cttgatctcc	acctrggtgc	cctggccgaa	ggtgcggggg	60
aagtgggtgc cctgccagca gtaatacacg	cccacgrcct	cggccrccac	gcgggagatc	120

tcagggtga agtcggtgcc gg 142 <210> 21 <211> 16 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Starter <40C> 21 cr.ggggggac tggccg 16 <210> 22 <2I1> 22 <212 > DNA <<213> Sekwencja sztuczna <22C>

<223> Starter <400> 22 acctgaactg gctgctgcag aa 22 <210> 23 <211> 138 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna

PL 211 761 B1

<210> 28 <211> 20 <212> DNA

PL 211 761 B1

Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr 1 5 10 <210> 34 <211> 402 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna < 2 2 0 >

< 2 2 3 > h 3 D 6 werΞja 1 VL <400> 34 atggacatgc tccggct acg gcctccatct aactggctgc ctggactccg aagatctccc ttcccccgca gcgtgcccgc tggtgatgac cctgcaagtc tgcagaagcc gcgtgcccga gcgtggaggc ccttcggcca ccagctgctg ccagtccccc ctcccagtcc cggccagtcc ccgcttctcc cgaggacgtg gggcaccaag ggcctgctga ctgtccctgc ctgctggact ccccagcgcc ggctccggct ggcgtgtact gtggagatca tgctgtgggt ccgtgacccc ccgacggcaa tgatctacct ccggcaccga actgctggca ag gtccggctcc 60 cggcgagccc 120 gacctacctg 180 ggtgtccaag 240 cttcaccctg 300 gggcacccac 360

402 <21C > 35 <211> 402 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> h3D6 wersja 2 VL <400> 35 atggacatgc tccggcgacg gcctccatct aactggctgc ctggactccg aagatctccc ttcccccgca gcgtgcccgc tggtgatgac cctgcaagtc tgcagaagcc gcgtgcccga gcgtggaggc ccttcggcca ccagctgctg ccagtccccc ctcccagtcc cggccagtcc ccgcttctcc cgaggacgtg gggcaccaag ggcctgctga ctgtccctgc ctgctggact ccccagcgcc ggctccggct ggcgtgtact gtggagatca tgctgtgggt ccgtgacccc ccgacggcaa tgatctacct ccggcaccga actgctggca ag gtccggctcc 60 cggcgagccc 120 gacctacctg 130 ggtgtccaag 240 cttcaccctg 300 gggcacccac 360

02 <210> 36 <211> 414 <212> DKA <21 3> Sekwencja sztuczna <220>

<223> h3D6 wersja 1 VH <400> 36 atggagtttg gtgcagctgc tgcgccgcct ggcaagggcc gacaacgtga cagatgaact tactccggct ggctgagctg tggagtccgg ccggcttcac tggagtgggt agggccgctt ccctgcgcgc cctccgacta gctttttctt cggcggcctg cttctccaac ggcctccatc caccatctcc cgaggacacc ctggggccag gtggctattt gtgcagcccg t acggcatgt cgctccggcg cgcgacaacg gccctgtact ggcaccctgg taaaaggtgt gcggctccct cctgggtgcg gcggccgcac ccaagaactc actgcgtgcg tgaccgtgtc ccagtgtgag 60 gcgcctgtcc 120 ccaggccccc 180 ctactactcc 240 cctgtacctg 300 ctacgaccac 360 ctcc 414 <210> 31 <211> 414 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

PL 211 761 B1 <223> h.3D6 wersja 2 VH <400? 37 atggagtttg ggctgagctg gcttttcctt gtggctattt taaaaggtgt ccagtgtgag 60 gtgcagctgc tggagtccgg cggcggcctg gtgcagcccg gcggctccct gcgcctgtcc 120 tgcgccgcct ceggcttcac cttctccaac tacggcatgt cctgggtgcg ccaggccccc 18C ggcaagggcc tggagtgggt ggcctccatc cgctccggcg gcggccgcac ctactactcc 240 gacaacgtga agggccgctt caccatctcc cgcgacaact ccaagaacac cctgtacctg 30C cagatgaact ccctgcgcgc cgacgacacc gccgtgtact actgcgtgcg ctacgaccac 36C tactccggct cctccgacta ctgaggccag ggcaccctgg tgaccgtgtc <210> 33 <211? 770 <212? PRT <213? Homo Sapiens <400? 38

Met 1

Leu

Pro

Gly

Leu 5

Ala

Leu

Leu 10

Ala

Trp

Thr

Ala 15

Arg

Ala

Leu

Glu

Val

Prc

Thr

Asp

Gly

Asn

Ala

Gly

Leu

Al a

Glu

Pro

20

25

3C

Gir.

Ile

Al a

Met

Phe

Cys

Gly

Arg

Leu

Asn

Met

His

Met

Asn

Val

Gin

35

40

45

Asr.

Gly

Lys

Trp

Asp

Ser

Asp

Pro

Ser

Gly

Thr

Lys

Thr

Cys

Ile

Asp

50

55

60

Thr

Lys

Glu

Gly

Ile

Leu

Gir.

Tyr

Cys

Gin

Glu

Val

yr

Prc

Glu

Leu

65

70

75

80

Glu

Ile

Thr

Asn

Val

Glu

Al a

Asn

Gin

Pro

Val

Thr

I le

Gin

Asn

85

90

95

Trp

Cys

Lys

Arg

Gly

Arg

Lys

Gin

Cys

Lys

Thr

His

Pro

His

Phe

Val

100

105

110

Ile

Pro

Tyr

Arg

Cys

Leu

Val

Gly

Glu

Phe

Val

Ser

Asp

Ala

Leu

115

120

125

Val

Pro

Asp

Lys

Cys

Lys

Phe

Leu

His

Gin

Glu

Arg

Met

Asp

Val

Cys

130

135

140

Ol u

Thr

His

Leu

His

Trp

His

Thr

Val

Ala

Lys

Glu

Thr

Cys

Ser

Glu

145

150

155

160

T.ys

Ser

Thr

Asn

Leu

His

Asp

Tyr

Gly

Met

Leu

Pro

Cys

Gly

Ile

165

17 0

175

Asp

Lys

Phe

Arg

Gly

Val

Glu

Phe

Val

Cvs

Cys

Pro

Leu

Ala

Glu

180

185

190

Ser

Asp

Asn

Val

Asp

Ser

ΑΊ a

Asp

Ala

Glu

Asp

Ser

Asp

Val

195

200

205

Trp

Gly

Ala

Asp

Thr

Asp

Tyr

Ala

Asp

Gly

Ser

Glu

Asp

Lys

210

215

220

Val

Glu

Val

Ala

Glu

Val

A.la

Glu

Val

Glu

2 2 5

230

235

240

Glu

Ala

Asp

Glu

Asp

Glu

Asp

Gly

Asp

Glu

Val

Glu

245

250

255

Glu

Ala

Glu

Pro

Tyr

Glu

Ala

Thr

Glu

Arg

Thr

Ser

Ile

260

2S5

270

Ala

Thr

Glu

Ser

Val

Glu

Val

Arg

275

280

285

Glu

Val

Cys

Ser

Glu

Gin

Ala

Glu

Thr

Gly

Pro

Cys

Arg

Ala

Met

Ile

290

295

300

Ser

Arg

Trp

Tyr

Phe

Asp

Val

Thr

Glu

Gly

Lys

Cys

Ala

Pro

Phe

305

310

315

320

Tyr

Gly

Cys

Gly

Asn

Arg

Asn

Phe

Asp

Thr

Glu

Tyr

325

330

335

Cys

Met

Ala

Val

Cys

Gly

Ser

Ala

Met

Ser

Gin

Ser

Leu

Lys

Thr

340

345

350

PL 211 761 B1

Thr

Gin

Glu 355

Pro

Leu

Ala

Arg Asp 360

Pro Val

Lys

Leu

Pro 365

Thr

Ala

Ser

Thr

Pro

Asp

Ala

Val

Asp

Lys

Tyr

Leu

Glu

Thr

Pro

Gly

Asp

370

375

380

Glu

Asn

Glu

His

Ala

His

Phe

Gin

Lys

Ala

Lys

Glu

Arg

Leu

Glu

Ala

385

390

395

400

Lys

His

Arg

Glu

Arg

Met

Ser

Gin

val

Met

Arg

Glu

Trp

Glu

Ala

405

410

415

Glu

Arg

Gin

Ala

Lys

Asn

Leu

Pro

Lys

Ala

Asp

Lys

Ala

Val

Ile

420

425

430

Gin

His

Phe

Gin

Glu

Lys

Val

Glu

Ser

Leu

Glu

Gin

Glu

Ala

Asn

435

440

445

Glu.

Arg

Gin

Leu

Val

Glu

Thr

His

Met

Ala

Arg

Val

Glu

Ala

Met

450

455

460

Leu

Asn

Asp

Arg

Leu

Ala

Leu

Glu

Asn

Tyr

Ile

Thr

Ala

Leu

465

470

475

4 80

Gin

Ala

Val

Pro

Arg

Pro

Arg

His

Val

Phe

Asn

Met

Leu

Lys

485

490

495

Tyr

Val

Arg

Ala

Glu

Gin

Lys

Asp

Arg

Gin

His

Thr

Leu

Lys

His

Phe

500

505

510

Glu

His

val

Arg

Met

Val

Asp

Pro

Lys

Ala

Gin

Ile

Arg

Ser

515

520

525

Gin

Val

Met

Thr

His

Leu

Arg

Val

Ile

Tyr

Glu

Arg

Met

Asn

Gin

Ser

530

535

540

Leu

Ser

Leu

Tyr

Asn

Val

Pro

Ala

Val

Ala

Glu

Ile

Gin

Asp

545

550

555

560

Glu

Val

Asp

Glu

Leu

Gin

Lys

Glu

Gin

Asn

Tyr

Ser

Asp

Val

565

570

575

Leu

Ala

Asn

Met

Ile

Ser

Glu

Pro

Arg

Ile

Ser

Tyr

Gly

Asn

Asp

Ala

580

585

590

Leu

Met

Pro

Ser

Leu

Thr

Glu

Thr

Lys

Thr

Val

Glu

Leu

Pro

595

600

605

Val

Asn

Gly

Glu

Phe

Ser

Leu

Asp

Leu

Gin

Pro

Trp

His

Ser

Phe

610

615

620

Gly

Ala

Asp

Ser

Val

Pro

Ala

Asn

Thr

Glu

Asn

Glu

Val

Glu

Pro

Vai

625

630

635

640

Asp

Ala

Arg

Pro

Ala

Asp

Arg

Gly

Leu

Thr

Arg

Pro

Gly

Ser

645

650

655

Gly

Leu

Thr

Asn

Ile

Lys

Thr

Glu

Ile

Ser

Glu

V a 1

Lys

Met

Asp

6 6 0

665

670

Ala

Glu

Phe

Arg

His

Asp

Ser

Gly

Tyr

Glu

Val

His

Gin

Lys

Leu

675

680

6 8 5

Val

Phe

Ala

Glu

Asp

Val

Gly

Ser

Asn

Lys

Gly

Ala

Ile

Gly

690

695

700

Leu

Met

Val

Gly

Val

Ile

Ala

Thr

Val

Ile

Val

Ile

Thr

Leu

705

710

715

720

Val

Met

Leu

Lys

Gin

Tyr

Thr

Ser

Ile

His

Gly

Val

725

730

735

PL 211 761 B1

Glu

Val

Asp

Ala

Val

Thr

Pro

Glu

Arg

His

Leu

Ser

Lys

Met

740

745

750

Gin

Asn

Gly

Tyr

Glu

Asn

Pro

Thr

Tyr

Lys

Phe

Glu

Gin

Met

755

760

765

Gin

'Asn

770

<210? 39 <211? 15 <212? DNA <213? Sekwencja sztuczna <220?

<223? Startery <400? 39 acttatatct gtttt <210? 40 <211? 15 <212? DNA <213? Sekwencja sztuczna <220?

<223? Startery <400? 40 acttatacac tttgt <210? 41 <211? 15 <212? DNA <213? Sekwencja sztuczna <220?

<223? Startery <400? 41 acttatgttc atts:

<210? 42 <211? 16 <212? DNA <213? <213? Sekwencja sztuczna <220?

<223? Startery <400? 42 acttatgccc attgtt <210? 43 <211? 15 <212? DNA <213? <213? Sekwencja sztuczna <220?

<223? Startery <400? 43

PL 211 761 B1

acttatatat attgt	15
<210? 44 <211? 14 <212? DNA <213? <213? Sekwencja sztuczna <220? <223> Startery <400? 44 acttatgkyy attg	14
<210? 45 <211? 15 <212> DNA <213? <213? Sekwencja sztuczna <220? <223? Startery <400? 45 acttatgtat acayw	15
<210? 46 <211? 15 <212? DNA <213> <213> Sekwencja sztuczna <220? <223? Startery <400? 46 acttatggct ymtct	15
<210? 47 <211? 13 <212? DNA <213? <213? Sekwencja sztuczna <220? <223? Startery <400? 47 acttattccc att	13
<210? 48 <211? 14 <212? DNA <213? <213? Sekwencja sztuczna <220? <223? Startery <400? 48 acttatatgt tctc	14
<210? 49 <211? 14 <212? DNA <213? <213? Sekwencja sztuczna

PL 211 761 B1

<220? <223? Startery
<400? 49 acttataccc attt		14
<210? 50 <211? 11 <212? DNA <213? <213? Sekwencja	sztuczna
<220? <223? Startery
<400? 50 ggacggttgg g		12
<210? 51 <211? 14 <212? DNA <213? <213? Sekwencja	sztuczna
<220? <223? Startery
<400? 51 acttataggg tttt		14
<210? 52 <211? 14 <212? DNA <213? <213? Sekwencja	sztuczna
<220? <223? Startery
<400? 52 acttatgggr tttt		14
<210? 53 <211? 14 <212? DNA <213? <213? Sekwencja	sztuczna
<22 0 > <223? Startery
<400? 53 acttatatgt agtt		14
<210? 54 <211? 13 <212? DNA <213? <213? Sekwencja	sztuczna
<220? <223? Startery
<400? 54 acttatatgt gtt		13

PL 211 761 B1 <210? 55 <211> 15 <212? DNA <213·? <213? Sekwencja sztuczna <220?

<223? Startery <400? 55 acttatacgt atttt <210? 56 <211? 14 <212? DNA <213? <213? Sekwencja sztuczna <220?

<223? Startery <40 0 > 56 acttatctts tttg <210? 57 <211? 14 <212? DNA <213? <213? Sekwencja sztuczna <220?

<223? Startery <400? 57 acttatrggg tttt <210? 58 <211? 13 <212? DNA <213? <213? Sekwencja sztuczna <220?

<223? Startery <400? 58 acttatgttt ttg <210? 59 <211? 15 <212? DNA <213? <213? Sekwencja sztuczna <220?

<223? Startery <400? 59 acttatmgtg mtttt <210? 60 <211? 14 <212? DNA <213? <213? Sekwencja sztuczna

Claims

1. Humanizowana immunoglobulina, która specyficznie wiąże się z peptydem p-amyloidu (Ap), lub jej fragment wiążący antygen, przy czym humanizowana immunoglobulina lub fragment wiążący antygen obejmuje:

PL 211 761 B1

2. Humanizowana immunoglobulina lub fragment wiążący antygen według zastrz. 1, gdzie CDR lekkiego łańcucha są jak następuje:

3. Humanizowana immunoglobulina lub fragment wiążący antygen według zastrz. 1 albo 2, gdzie CDR ciężkiego łańcucha są jak następuje:

CDR2 ciężkiego łańcucha: Ser Ile Arg Ser Gly Gly Gly Arg Thr Tyr Tyr Ser Asp Asn Val Lys Gly, czyli reszty 50-66 SEQ ID NO: 4; oraz

CDR3 ciężkiego łańcucha: Tyr Asp His Tyr Ser Gly Ser Ser Asp Tyr, czyli reszty 99-108 SEQ ID NO: 4.

4. Humanizowana immunoglobulina lub fragment wiążący antygen według zastrz. 1-3, gdzie ludzki akceptorowy lekki łańcuch stanowi Kabat ID 019230.

5. Humanizowana immunoglobulina lub fragment wiążący antygen według zastrz. 1-4, gdzie ludzki akceptorowy ciężki łańcuch stanowi Kabat ID 045919.

6. Humanizowana immunoglobulina lub fragment wiążący antygen według zastrz. 1-5, które (i) wiążą się zarówno z rozpuszczalnym peptydem β-amyloidu (Ap) i zagregowanym Ap; (ii) pośredniczą w fagocytozie peptydu β-amyloidu (Ap); (iii) przekraczają barierę krew-mózg u leczonego osobnika; lub (iv) zmniejszają obciążenie peptydem β-amyloidu (Ap) u leczonego osobnika.

7. Humanizowana immunoglobulina lub fragment wiążący antygen według zastrz. 1-6, gdzie sekwencja zmiennego regionu ciężkiego łańcucha jest taka jak reszty 1-119 SEQ ID NO: 12.

8. Humanizowana immunoglobulina lub fragment wiążący antygen według zastrz. 1-6, gdzie sekwencja zmiennego regionu lekkiego łańcucha jest taka jak reszty 1-112 SEQ ID NO: 11.

9. Humanizowana immunoglobulina lub fragment wiążący antygen według zastrz. 1, gdzie sekwencja zmiennego regionu lekkiego łańcucha jest taka jak reszty 1-112 SEQ ID NO: 11, a sekwencja zmiennego regionu ciężkiego łańcucha jest taka jak reszty 1-119 SEQ ID NO:12.

10. Humanizowana immunoglobulina lub fragment wiążący antygen według zastrz. 1-9, gdzie humanizowana immunoglobulina lub fragment wiążący antygen ma stały region pochodzący z ludzkiej IgG1 lub ludzkiej IgG4.

11. Fragment wiążący antygen według zastrz. 1 - 10, gdzie ten fragment wiążący antygen stanowi fragment Fab, Fab', Fabc, Fv, F(ab')2, lub jednołańcuchowe przeciwciało.

12. Kompozycja farmaceutyczna zawierająca składnik czynny oraz farmaceutyczny nośnik, znamienna tym, że jako składnik czynny zawiera humanizowaną immunoglobulinę lub fragment wiążący antygen zdefiniowane w zastrz. 1-11.

13. Humanizowana immunoglobulina lub fragment wiążący antygen zdefiniowane w zastrz. 1 - 11 do stosowania jako lek.

14. Zastosowanie skutecznej dawki humanizowanej immunoglobuliny lub fragmentu wiążącego antygen zdefiniowanych w zastrz. 1 - 11 do wytwarzania leku do profilaktyki lub leczenia choroby amyloidogennej u pacjenta.

15. Zastosowanie według zastrz. 14, w którym chorobą amyloidogenną jest choroba Alzheimera.

16. Zastosowanie według zastrz. 14 albo 15, w którym skuteczna dawka wynosi (i) 0,01 - 5 mg/kg masy ciała; (ii) około 1 mg/kg masy ciała; (iii) 1-10 mg/kg masy ciała; albo (iv) około 10 mg/kg masy ciała.

17. Zastosowanie według zastrz. 14 - 16, w którym humanizowaną immunoglobulinę stosuje się do podawania w wielu dawkach w odstępach dawkowania wynoszących około 2 tygodnie, około jednego miesiąca, 3-6 miesięcy lub około roku.

18. Wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego kodująca humanizowaną immunoglobulinę lub fragment wiążący antygen, zdefiniowane w zastrz. 1-11.

19. Wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego według zastrz. 18, w której ta cząsteczka kwasu nukleinowego zawiera sekwencję nukleotydową podaną jako SEQ ID NO: 35 oraz SEQ ID NO: 37.

20. Wektor, zawierający cząsteczkę kwasu nukleinowego zdefiniowaną w zastrz. 18 albo 19.