TWI255272B - Humanized antibodies that recognize beta amyloid peptide - Google Patents

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TWI255272B
TWI255272B TW090130135A TW90130135A TWI255272B TW I255272 B TWI255272 B TW I255272B TW 090130135 A TW090130135 A TW 090130135A TW 90130135 A TW90130135 A TW 90130135A TW I255272 B TWI255272 B TW I255272B
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Guriq Basi
Jose Saldanha
Ted Yednock
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Guriq Basi
Jose Saldanha
Ted Yednock
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Description

1255272 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（1 ) 相關申請案 本申請案主張先前所提出，標題爲\\辨識yS -澱粉樣 蛋白肽之擬人化抗體"之臨時專利申請案，美國序號 60/251892 (2000年12月6臼提出）的優 先權。上述申請案之全部內容倂爲本文之參考資料 本發明之背景 阿茲海默氏症（A D )係一種會導致老人痴呆的進行 性疾病。一般見於：塞爾柯伊，TINS 16: 403 ( 1 993);哈迪， 等，WO 92/13069;塞爾柯伊，J. Neuropathol. Exp. Neurol. 53: 438 (1994);達夫，等，自然373:476(1995);嘉姆斯，等，自然 3 73:523 ( 1 995)。廣泛地說，此種疾病可分成二類型：晚期 發病類，此類型係發生於老年期（6 5 +歲）和早期發病 類，其係於老年期前即發展完善，也就是介於3 5和6〇 歲之間即發病。在二種類型之疾病中，其病理學相同，但 在較早年紀發病的案例中，其異常情況有較爲嚴重及普遍 的趨勢。此病之特徵爲在腦中至少有二型的病灶，神經纖 維糾結和老年斑。神經纖維糾結爲細胞內與t a u蛋白質 相關之微細管的沈積，此種蛋白質係由二種成對之單纖維 彼此扭轉所組成。老年斑（也就是澱粉樣斑）爲橫徑至多 1 5 0 // m之瓦解神經網區，其中心有細胞外澱粉樣沈積 ，此可藉腦組織切片之顯微鏡分析而見到。在腦內之澱粉 樣斑之堆積亦與唐氏症和其它認知失調相關。 斑之主要組成爲稱作A /3或B -澱粉樣蛋白肽的蛋白 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)
_4_ 1255272 A7 B7 五、發明説明（2) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 肽。A々蛋白肽爲一由3 9 - 4 3個胺基酸組成之較大穿 膜醣蛋白的4 - k D a內片段，此穿膜醣蛋白係稱爲澱粉 樣先驅蛋白質（A P P )。藉不同分泌酶之作用來水解 APP蛋白質，結果可發現二種主要的A/3型，一爲長度 爲4 0個胺基酸之短型，和長度在4 2 - 4 3個胺基酸範 圍內的長型。A P P疏水性穿膜功能區有部分被發現係在 A万之羧基端，且可能爲A /3能集結成斑的原因，尤其是 在長型的情況中。在腦中之澱粉樣斑的堆積最後會導致神 經元細胞死亡。與此型神經退化相關之生理症狀爲阿茲海 默氏症的特性。 在A P P蛋白質內之多種突變已與阿茲海默氏症之存 在相關連。見，如：高特，等之自然3 4 9 : 7 0 4 ( 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 19 9 1)(纈胺酸互異白胺酸）；查提爾•哈藍等之自 然3 5 3 : 8 4 4 ( 1 9 9 1 (纈胺酸至苯丙胺酸）；慕 蘭等之Nature Genet. 1 : 3 4 5 ( 1 9 9 2 )(將賴胺 酸5 9 5 —甲硫胺酸5 9 6改變成天門冬素5 9 5 -白胺酸5 9 6的 雙重突變）。這類突變被認爲可藉由該增加或改變A P P ，使其變成A /3的處理，尤其是處理A P P以增加A /3長 型（也就是AySl — 42和ΑΘ1— 43)之量，來引起 阿茲海默氏症。在其它基因（如：早老基因，P S 1和 P S 2 )中之突變被認爲會間接影響A P P的處理，而增 加長型A0的量（見：哈迪，TINS 20:154 ( 1 9 9 7 ))。 老鼠模型曾成功地用來決定澱粉樣斑在阿茲海默氏症 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -5- 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1255272 A7 _______ B7 五、發明説明（3 ) 中的顯著意義C嘉姆斯，等，如前述，強生一伍德等之
Proc’ Natl· Acad· Sci· USA 94: 1550 (1997))。尤其是，當 將長型A /3注入P D A P P導入外來基因小鼠（其表現人 類A P P之突變型，並在年輕時發展出阿茲海默氏症）時 ，牠們顯示出會減少阿茲海默氏症的進展，並增加對抗A /3蛋白肽的抗體效價（薛恩克，等之自然4 〇 〇， 1 7 3 ( 1 9 9 9 ))。上述所討論之觀察結果指出·· a Θ，尤 其是當以其長型存在時，爲阿茲海默氏症中的肇因成分。 馬麥克於E P 5 2 6，5 1 1中提出給予已有阿茲 海默氏症之患者順勢醫療劑量（低於或等於1 〇 - 2毫克/ 天）之A々。在一有約5升血漿的典型個人中，即使是給 予此劑量之上限，亦可預期其所產生的濃度不會超過2微 微克/毫升。在人類血漿中之正常A /3濃度通常係在5〇 一 2 0 0微微克/毫升的範圍內（休彳百特，等，自然 359:325(1992))。由於 E p 5 2 6，5 1 1所提出之劑量幾乎不會改變內生性 循環A /3的濃度，且因爲E P 5 2 6，5 1 1未建議使 用佐劑來做爲免疫剌激劑，因此，似乎令人難以相信可從 此種治療中得到任何益處。 因此，對於治療阿茲海默氏症之新療法和試劑，尤其 是能在生理學（如：非毒性）劑量下產生治療效果的療法 和試劑，是有需要的。 本發明之摘述 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐) ' ' ° (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)
1255272 A7 _________ B7 五、發明説明（4 ) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本發明特別說明新穎之免疫學試劑，尤其是用於預防 和治療產生源粉樣變性之疾病（如：阿茲海默氏症）的治 療性抗體試劑。本發明（至少有部分）係以能特異連接 A /3蛋白肽，且可有效減少與澱粉樣變性疾病相關之斑負 載量及/或神經炎性營養不良的二種單株抗體的鑑定和特 性爲基礎。這些抗體之構造和功能分析可用來設計用於預 防及/或治療方面的擬人化抗體。尤其是，本發明特別說 明這些抗體之可變區的擬人化作用，因此，可提供擬人化 免疫球蛋白或抗體鏈，完整之擬人化免疫球蛋白或抗體， 及機能性免疫球蛋白或抗體片段，尤其是，這些特別說明 之抗體的抗原連接段。 本發明亦揭示包含這些特別說明之單株抗體之互補決 定區的多肽類，以及適合編碼該多肽類之多核苷酸試劑， 介體和宿主。 本發明亦揭示用於治療那些產生澱粉粉樣變性之疾病 或失調（如：阿茲海默氏症）的方法及用於這類應用中之 製藥組成物和套組。 經濟部智1財產局員工消費合作社印製 本發明亦特別說明用來鑑定在此特性化單株抗體內之 殘質的方法，這些殘質對適當之免疫功能而言是很重要的 ，本發明也特別說明用於鑑定那些在設計具改良之親和性 及/或減低之致免疫性的擬人化抗體（做爲治療劑）時， 需要取代之殘質的方法。 圖形的簡單說明 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 1255272 A7 B7 五、發明説明（5 ) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 第1圖描寫老鼠3 D 6，擬人化3 D 6，Kabid 1 0 9 2 3 0和種系A 1 9抗體之輕鏈的胺基酸序列的一 致性比對。C D R區係以箭頭指出。 第2圖描寫老鼠3D6，擬人化3D6，Kabid 〇4 5 9 1 9和種系VH3 — 2 3抗體之重鏈的胺基酸序 列的一致性比對。C D R區係以箭頭指出。 第3圖以圖形描寫3D6，嵌合型3D6和10D5 之A /3連接性質。第3 A圖爲一描述與老鼠3 D 6相較下 ，AyS連接嵌合型3D6 (PK1614)的圖形。第 3 B圖爲一描述生物素化之3 D 6與未標示之3 D 6， PK1614和10D5競爭連接A冷的圖形。 第4圖描述3D6 VH和VL同源模型，顯示α-碳主鏈之圖形。V Η係以一點線顯示，而V Η以實線顯示 。C D R區係以帶型指出。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 第5圖以圖形描述嵌合型3 D 6和擬人化3 D 6之 A /3連接性質。第5 Α圖描述擬人化3 D 6 ν 1和嵌合型 3 D 6連接聚集之A /3的E L I S A測量結果。第5 B圖 描述擬人化3 D 6 v 1和擬人化3 D 6 v 2連接聚集之 A yS的E L I S A測量結果。 第6圖爲定量擬人化3 D 6和嵌合型3 D 6連接來自 p D A P P小鼠腦切片之A /3斑的圖形。 第7圖爲一測試擬人化3 D 6 v 1和v 2，嵌合型 3D6，老鼠3D6和10D5與老鼠3D6競爭連接 A /3之能力的競爭性連接分析結果的圖示。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -8- 1255272 A7 B7 五、發明説明（6) 第8圖以圖形描述測試擬人化3 D 6 v 2，嵌合型 3 D 6，和人類I g G傳介小神經膠質細胞攝取a卢之能 力的活體外呑噬作用分析。 第9圖描述10D5 VL和3D6 VL胺基酸序 列的一致性比對。黑體字指出與1 〇 D D 5 V L完全相 符的殘質。 第1〇圖描述l〇D5 VH和3D6 VH胺基酸 序列的一致性比對。黑體字指出與1 〇 D 5 v L完全相 符的殘質。 本發明的描細說明 本發明特別說明用於預防或治療阿茲海默氏症或其它 產生澱粉樣變性之疾病的新穎免疫學試劑和方法。本發明 至少有部分）係以二種單株免疫球蛋白3 D 6和1 〇 D 5 的特徵爲基礎，其可有效連接/9澱粉樣蛋白質（A /3 )( 如：連接可溶和聚集之A /3 )，傳介吞噬作用（如：聚集 之A /3的吞噬作用），減少斑的負載量及/或減少神經炎 性營養不良（如··在患者體內）。本發明還以測定和說明 這些免疫球蛋白之可變輕和重鏈的一級和二級構造的特性 ，以及鑑定那些對活性和致免疫性而言非常重要之殘質爲 基礎。 本發明特別說明那些包含本文所說明之較佳單株免疫 球蛋白的可變輕鏈和/或可變重鏈的免疫球蛋白。特別強 調之較佳的免疫球蛋白，如：治療性免疫球蛋白，爲那些 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210x 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 、1' 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -9- 1255272 Α7 Β7 五、發明説明（7 ) 包含擬人化可變輕鏈及/或擬人化可變重鏈者。較佳之可 變輕及/或可變重鏈包括來自單株免疫球蛋白（如：供給 者免疫球蛋白）之互補決定區（CDR)，和大體上來自 人類接受者免疫球蛋白之可變框構區。w大體上來自人類 接受者免疫球蛋白〃 一詞意指大部分或關鍵的框構殘質係 來自人類接受者序列，然而，在某些位置處之殘質可被篩 選出之用來改良擬人化免疫球蛋白之活性（如：改變活性 ，以使其更接近供給者免疫球蛋白的活性）的殘質所取代 或被篩選出以用來降低擬人化免疫球蛋白之致免疫性的殘 質所取代。 在一種體系中，本發明特別說明一擬人化免疫球蛋白 或輕或重鏈，其包括3 D 6可變區之互補決定區（ C D R s )(如：來自如S E Q ID N〇：2所提出 之輕鏈可變區序列，或來自如S E Q ID N〇：4所 提出之重鏈可變區序列的C D R s )，並包括來自人類接 受者免疫球蛋白輕或重鏈序列之可變框構區，而其先決條 件爲：至少有一框構殘質係被來自老鼠3 D 6輕或重鏈可 變區序列之相對應的胺基酸殘質所取代，其中該框構殘質 係選自如下群體：（a )以非共價連接方式直接連接抗原 之殘質；（b )鄰接C D R之殘質；（c ) 一 C D R -交 互作用殘質（如；藉由塑造在已解析之同源已知免疫球蛋 白鏈的構造上的輕或重鏈來鑑定）；及（d )參與V L -V Η界面的殘質。 在另一體系中，本發明特別說明一擬人化免疫球蛋白 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 $ 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -10- 1255272 A7 B7 五、發明説明（8 ) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 之輕或重鏈，其包括3D 6可變區CDRs和來自人類接 受者免疫球蛋白之輕或重鏈序列的可變框構區，其先決條 件爲：至少有一種框構殘質係被來自老鼠之3 D 6輕或重 鏈可變區序列的相對應胺基酸殘質所取代，其中該框構殘 質爲一種由可變區之三-次元模型分析所鑑定出之能影響 輕鏈可變區構造或功能的殘質，如：能與抗原交互作用之 殘質，接近抗原連接位置之殘質，能與C D R交互作用的 殘質，鄰接C D R之殘質，在C D R殘質之6 A內的殘質 ，標準殘質，游標區域殘質，鏈間裝塡殘質，不尋常殘質 ，或在構造模型表面上之醣化位置殘質。 在另一體系中，本發明特別說明-擬人化之免疫球蛋 白的輕鏈，其包括3 D 6可變區C D R s (如：來自如 S E Q ID N〇：2所提出之3 D 6輕鏈可變區序列 )，且包括一人類接受者免疫球蛋白可變框構區，其先決 條件爲至少有一選自Ll， L2， L36和L46 (卡巴 編號協定）之群體的框構殘質被來自老鼠3 D 6重鏈可變 區序列的相對應胺基酸殘質所取代。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 較佳之輕鏈包括亞型k Π (卡巴協定）之k Π框構區 ，例如：來自接受者免疫球蛋白Kabid 0 1 9 2 3 0, Kabid 0 0 5 1 3 1, Kabid 0 0 5 0 5 8, Kabid 0 0 5 0 5 7, Kabid 0 0 5 0 5 9, Kabid u 2 1 0 4 0和Kabid u 4 1 6 4 5之框構區。較佳之粗 鏈包括亞型m (卡巴協定）之框構區，例如：來自接受者 免疫球蛋白 Kabid 0 4 5 9 1 9, Kabid 0 0 0 4 5 9 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） -11 - 1255272 A7 B7 五、發明説明（9 ) ，Kabid 0 0 0 5 5 3, Kabid 〇〇〇 3 8 6 和 Kabid M 2 3 6 9 1的框構區。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 在另一體系中，除了上述之取代作用外，本發明特別 δ兌明稀有人類框構殘質的取代作用。例如：稀有殘質可被 在該位置處之人類可變鏈序列所共通的胺基酸殘質所取代 。或者，稀有殘質可被來自同源種系之可變鏈序列的相對 應胺基酸殘質所取代（例如：稀有之輕鏈框構殘質可被來 自Al，Α17，Α18，Α2，或Α19種系之免疫球 蛋白序列的相對應種系殘質所取代，或是，稀有之重鏈框 構殘質可被來自VH3—48，VH3—23，VH3— 7，VH3 — 2 1，或V Η 3-11種系之免疫球蛋白序 列的相對應種系殘質所取代）。 在另一體系中，本發明特別說明一包括如上述之輕鏈 和重鏈的擬人免疫球蛋白，或該免疫球蛋白之抗原-連接 片段。在一示範體系中，該擬人化免疫球蛋白連接（如： 特異性連接）yS澱粉樣蛋白肽（Α Θ )的連接親和力至少 爲1〇_7Μ， 10— 8麗或1〇— 9M。在另一體系中，該 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 免疫球蛋白或抗原連接片段包括一具同質體（isoform) r 1的重鏈。在另一體系中，該免疫球蛋白或抗原連接片 段連接（如：特異性連接）可溶性澱粉樣蛋白肽（A /3 ) 和集結之A /3二者。在另一體系中，該免疫球蛋白或抗原 連接片段傳介/3澱粉樣蛋白肽（A )之吞噬作用。而在 另一體系中，該免疫球蛋白或抗原連接片段穿過個體中之 血液-腦障壁。而在另一體系中，該免疫球蛋白或抗原連 本紙張尺度中國國家標準（CNS ) A4規格（2i0X 297公釐） 1255272 A7 B7 五、發明説明（10) 接片段可減少個體中之/3澱粉樣蛋白肽（A /3 )負載量和 神經炎性營養不良。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 在另一體系中，本發明特別說明包括3 D 6可變區之 嵌合型免疫球蛋白（例如：如SEQ ID NO: 2或 SEQ ID N〇：4中所提出之可變區序列）。而在 另一體系中，本發明特別說明一免疫球蛋白，或其抗原一 連接片段，其包括：一如S E Q ID N〇：8中所提 出之可變重鏈區，和如S E Q ID N〇：5中所提出 之可變輕鏈區。而在另一體系中，本發明特別說明一免疫 球蛋白，或其抗原-連接片段，其包括：一如S E Q ID N〇：1 2中所提出之可變重鏈區，和一如S E Q ID N〇：1 1中所提出之可變輕鏈區。而在另一體系 中，該免疫球蛋白，或其抗原-連接片段還包括來自 I g G 1之恆定區。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本文說明之免疫球蛋白特別適合用於以預防或治療那 些產生澱粉樣變性之疾病爲目的的治療方法中。在另一體 系中，本發明特別說明一預防或治療那些產生澱粉樣變性 之疾病（如：阿茲海默氏症）的方法，其牽涉到給予患者 一有效劑量之如本文所描述的擬人化免疫球蛋白。在另一 體系中，本發明特別說明包括如本文所描述之擬人化免疫 球蛋白和製藥上之載體的製藥組成物。本發明還特別說明 用於製造本文所描述之免疫球蛋白，或免疫球蛋白片段或 鏈的經分離出之核酸分子，介體及宿主細胞，以及用於製 造該免疫球蛋白，免疫球蛋白片段或免疫球蛋白鏈的方法 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） -13- 1255272 A7 B7 五、發明説明（ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本發明途ftr別g兌明當製造3D β免疫球蛋白時，用來 鑑疋需要取代之3 D 6殘質的方法。例如：用於鑑定可變 框構區內，需要取代之殘質的方法牽涉到在一解析之同源 免疫球蛋白構造上，塑造3 D 6可變區之三-次元構造的 模型，並分析該模型，以找出能影響3 D 6免疫球蛋白可 變區構造或功能之殘質，如此，可鑑定出需要取代之殘質 。本發明還特別說明如S E Q ID N〇：2或S E Q ID N 0 : 4中所提出之可變區序列或其任何部分在製 造3D6免疫球蛋白，3D6免疫球蛋白鏈，或其結構區 之三-次元影像方面的用途。 在說明本發明前，提出以下所使用之某些名詞的定義 可能有助於了解本發明。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 〜免疫球蛋白〃或〜抗體〃（本文可交換使用）一詞 係指具有由二條重鏈和二條輕鏈所組成之基本四一多肽鏈 構造的抗原-連接蛋白質，該鏈可藉由，如··鏈間之二硫 鍵來穩定，其具有特異連接抗原之能力。免疫球蛋白或抗 體可以單體，或聚合體型式存在。〜抗原-連接片段〃一 詞係指連接抗原或與完整抗體競爭（如··與爲其衍生來源 的完整抗原競爭）連接抗原（如：特異性連接）之免疫球 蛋白或抗體的多狀片段。 抗體之特異性連接〃係指標體顯出對抗原或較佳之 抗原決定部位有可感受到的親和性或，而且，較合適的爲 不存在顯著的交叉反應性。''可感受到的〃或較佳之連接 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -14 - 1255272 A7 B7 五、發明説明（12) 包括以至少爲1 ◦一6， 1〇—7， 1〇_8， 10—9M或 1 〇 — 1。Μ之親和力來連接。親和力宜大於1 0 - 7 Μ，而 以大於1 0 - 8 Μ更佳。本文所提出之那些數値的中間値亦 包含在本發明之範圍內，且較佳之連接親和力可以親和力 之範圍來表示，如：10— 6至l〇-1QM，宜爲10— 7至 1〇—1 ◦ Μ，而以1 0 - 8至1 〇 — 1 0 Μ更佳。、、不存在顯 著之交叉反應性〃的抗體係指那些令人無法感覺到其連接 -不符需要之實體（如：不符需要之蛋白質實體）的抗體 。例如，特異連接A /3之抗體可令人感受到其連接著A /3 ，但不會與非一 A /3蛋白質或蛋白肽（如：包含在斑中之 非- A yS蛋白質或蛋白肽）有顯著的交叉反應。特異於較 佳之抗原決定部位的抗體不會，如：與在同一蛋白質或蛋 白肽上之關係疏遠的抗原決定部位有顯著之交叉反應。特 異性連接可根據任何本領域已知之用於決定這類連接的方 法來測定。較合適的爲，特異性連接係根據司卡恰分析法 (Scatchard analysis)及/或競爭性連接分析來測定。 連接片段係藉重組D N A技術或藉酵素或化學方法分 裂完整之免疫球蛋白所製造出。連接片段包括F a b， Fab —，F(at>/)2，Fabc，Fv，單鏈，和單 -鏈抗體。除了 雙特異性〃或a雙功能〃免疫球蛋白外 ，已知-免疫球蛋白或抗體之各連接位置彼此一致。> 雙 特異性〃或 > 雙功能抗體〃係一種具二對不同之重/輕鏈 對和二個不同之連接位置的人工雜合抗體。雙特異性抗體 可藉不同方法來製造，包括：雜交瘤之融合或F a b ·片 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -口 4Γ 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -15- 1255272 A7 __ B7 五、發明説明（13) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 段之連接。見，如：宋司威來和來克曼，Clin. Exp. Fmmunol. 79: 3 1 5 - 3 2 1 ( 1 990);柯斯泰尼，等之 J· Immunol. 148，1 547- 1 5 5 3 ( 1 992)。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 ''擬人化免疫球蛋白〃或''擬人化抗體〃一詞係指包 括至少一擬人化免疫球蛋白或抗體鏈之免疫球蛋白或抗體 (也就是，至少有一擬人化之輕或重鏈）。'"擬人化免疫 球蛋白鏈〃或 ''擬人化抗體鏈〃一詞係指一免疫球蛋白或 抗體鏈（也就是一輕或重鏈），其具有一包括大體上來自 人類免疫球蛋白或抗體之可變框構區和大體上來自非人類 之免疫球蛋白或抗體的互補決定區（C D R s )(如：至 少一種CDR，宜有二個CDRs，更合適的爲具3個 C D R s )的可變區，還包括恆定區（如：在輕鏈的情況 中，至少有一恒定區，或其部分，在重鍵之情況中，宜有 三個恆定區）。、、擬人化之可變區〃（如：、、擬人化之輕 鏈可變區〃或 > 擬人化之重鏈可變區"）一詞係指包括大 體上來自人類免疫球蛋白或抗體之可變框構區和大體上來 自非-人類免疫球蛋白或抗體之互補決定區（C D R s ) 的可變區。 ''大體上來自人類免疫球蛋白或抗體〃或 ''大體上人 類〃一詞係指當與人類免疫球蛋白或抗體胺基酸序列進行 一致性比對時，此區與人類框構或恆定區序列有至少8〇 —9〇％，宜爲9 0 — 95%，以95 — 99%更佳，的 一致性（也就是局部序列一致），因此，可允許，如：保 留性取代作用，一致序列取代作用，種系取代作用，回復 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） -16- 1255272 A7 B7 五、發明説明（14) 突變，等。引入保留性取代，一致序列取代，種系取代， 回復突變等作用通常稱爲擬人化抗體或鏈之、、最優化作用 π 。 ''大體上來自非-人類免疫球蛋白或抗體〃或\、大體 上非-人類〃一詞係指與非人類有機體（如：非-人類哺 乳動物）之免疫球蛋白或抗體序列具有至少8 0 - 9 5 % ，宜爲 9 0 — 95%，以 96%， 97%， 98%，或 9 9 %更佳，的一致性。 因此，擬人化免疫球蛋白或抗體，或擬人化免疫球蛋 白鏈或抗體鏈的所有部分（C D R s可能除外）係大體上 相等於一或多種天生之人類免疫球蛋白序列的相對應部分 。''擬人化免疫球蛋白〃或'' 擬人化抗體〃 一詞並不包含 如下述定義之嵌合型免疫球蛋白或抗體。 ν'明顯的一致性〃 一詞係指當將二種多肽序列進行最 理想的一致性比對時（如：利用預設空隙重量，藉G A Ρ 或BESTFIT程式來比對），該二種多肽序列共享至少5 0 — 6 0 %之序列一致性，宜有6 0 - 7 0 %之序列一致性， 以具有7 0 - 8 0 %之序列一致性更佳，以至少有8 0 -9 0 %之一致性尤佳，而以至少有9 0 - 9 5 %之一致性 要更佳，以至少有9 5 %或更高比例之序列一致性（如： 9 9 %之序列一致性或更高）最佳。> 大體上一致〃一詞 係指當將該二種多肽序列進行最理想的一致性比對時（如 ••利用預設空隙重量，藉G A P或BESTFIT程式來比對）， 此二種序列共享至少8 0 - 9 0 %之序列一致性，宜有 9 0 - 9 5 %之序列一致性，而以有至少9 5 %之序列一 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210'乂297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 丨 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -17- 1255272 A7 B7 五、發明説明（15) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 致性或更高比例者（如：9 9 %序列一致性或更多）爲更 佳。在序列比較方面，通常係以一序列做爲參考序列，再 將測試序列與其進行比較。當使用序列比較演算法時，係 將測試和參考序列輸入電腦中，指定序列座標，若需要時 ，指定序列之演算程式參數。然後，根據指定之程式參數 ，以序列比較演算法來計算測試序列相對於參考序列的序 列一致性百分比。、序列一致性〃和''序列〃在本文中可 交換使用。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 用於比較目的之最理想的序列一致性比對可藉由如下 述之方法進行：史密斯和瓦特曼之局部同源演算法，Adv. Appl. Math. 2: 482 ( 1 98 1 )，尼德曼和溫契之同源一致性比 對的演算，；T. Mol. Biol. 48: 443 (1970)，尋找彼德森和利 普曼之類似性方法，Proc . Nat’l. Acad . S ci. US A 8 5 : 2444 ( 1 98 8)，或藉由這些演算法的電腦化執行進行（在威斯康辛 遺傳軟體套裝中之GAP, BESTFIT，F A S T A，和 T F A S T A，遺傳電腦群，威斯康辛州麥迪遜科學路 5 7 5號），或藉目視檢查進行（通常見於如上述之歐舒 貝爾，等）。一種適合用於決定序列一致性和序列類似性 之百分比的演算法實例爲B L A S T演算法，其說明於歐 茲休爾等之J. Mol. Biol. 215·· 403 (1990)。用於執行 B L A S T分析的軟體可透過國家生物科技資訊中心公開 取得（透過國家健康N C B I網路伺服器可很容易地公開 取得）。通常，預設程式參數可用來執行序列比較，但亦 可使用專門製定之參數。在胺基酸序列方面，BLAStp程式 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -18- 1255272 A7 B7 五、發明説明（16) 使用之預設値爲：字長爲3，預期値（E )爲1 〇，及 BLOSUM62記分矩陣（見··漢尼可夫&漢尼可夫，proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 1 09 1 5 ( 1 9 8 9))。 較合適的情況爲，由保留性胺基酸取代來分別不一致 之殘質位置。爲了將胺基酸取代分爲保留性或非保留性， 將胺基酸依下述分組：第I組（疏水性支鏈）：1 e u， met， ala, v a 1， leu, i 1 e ;第 Π 組（中 性親水性支鏈）：c y s，s e r， t h r ;第HI組（酸 性支鏈）：a s p，g 1 u ;第rv組（鹼性支鏈）： a s η，gin, his, 1 y s，a i* g ;第 V 組（殘 質影響鏈之定位）：g 1 y，p r ο ;及第VI組（芳族支 鏈）：t r p， t y r , P h e。保留性取代牽涉到介於 同組中之胺基酸間的取代作用。非一保留性取代構成這些 類型之一的成員與另一類型之成員交換。 vv嵌合型免疫球蛋白〃或★抗體〃一詞係指其輕鏈或 重鏈係從不同物種衍生而來的免疫球蛋白或抗體。嵌合型 免疫球蛋白或抗體可藉由遺傳工程，從屬於不同物種之免 疫球蛋白基因節段來構成。 抗原〃爲一抗體特異連接的實體（如：蛋白質性實 體或蛋白肽）。 ★抗原決定部位〃或、、抗原決定簇〃一詞係指在抗原 上的一個免疫球蛋白或抗體（或其抗原連接片段）所特異 連接的位置。抗原決定部位可從連續胺基酸形成，或藉蛋 白質之三度空間摺疊，從並列之非連續胺基酸形成。從連 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -19- 1255272 A7 B7 五、發明説明（17) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁} 續胺基酸形成之抗原決定部位在暴露於變性溶劑時通常可 保存，然而，藉三度空間摺疊所形成之抗原決定部位在以 變性溶劑處理時通常會遺失。一抗原決定部位在一獨特的 空間構造中，通常會包括至少3，4，5，6，7，8， 9 ’ 1 〇，11， 12， 13， 1 4 或 1 5 個胺基酸。； 決定抗原決定部位之空間構造的方法包括，如：X -光晶 體照像術和二-次元核磁共振。見，如：於分子生物學之 方法中的抗原決定部位遺傳繪圖方案，第6 6冊，G . E •莫里斯，編輯（1 9 9 6 )。 if 辨識相同抗原部位之抗體可在一簡單的免疫分析中鑑 定出來，抗體可在此分析中顯示出其阻斷另一抗體連接標 的抗原的能力，也就是，競爭性連接分析。競爭性連接係 在如下述之分析中測定：其中該受測試之免疫球蛋白會抑 制該參考抗體特異連接至共通抗原，如：A /9上。現已知 有多種競爭性連接分析，如：固相之直接或間接放射性免 疫分析（R I A )，固相之直接或間接酵素免疫分析（ 經濟部智慧財產局S工消費合作社印製 E I A )，三明治競爭分析（見，史塔利，等，酵素學中 的方法9 : 2 4 2 ( 1 9 8 3 ));固相之直接生物素一 卵白素E IA (見：柯克蘭，等之J. Immunol. 1 3 7: 3 6 1 4 ( 1 986));固相之經直接標示的分析，固相之經直接標示的 三明治分析（見：哈洛和藍，抗體：實驗室手冊，冷泉港 出版公司（1988));使用I — 125標示之固相的 直接標示R I A (見：莫瑞爾，等之“〇1.11111111111〇1.25(1): 7 ( 1 98 8) )·，固相之直接生物素一卵白素E I A (邱，等之 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -20- 1255272 A7 _ B7_______ 五、發明説明（1S) 病毒學1 7 6 ·· 5 4 6 ( 1 9 9 Ο ))，和經直接標示之 R I A (摩登豪爾，等，Scand. J. Immunol· 32: 77 (1990) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) )。典型上，這類分析牽涉到使用連接至一固體表面的純 化抗原或帶有一未標示之測試免疫球蛋白或已標示之參考 免疫球蛋白的細胞。競爭性抑制作用係藉由在該測試之免 疫球蛋白存在的情況下，測定該連接至固體表面或細胞之 標示量來測量的。通常該測試之免疫球蛋白係以過量存在 。通常，當競爭性抗體以過量存在時，其可抑制至少5 0 或7 5 %之參考抗體對共通抗原的特異性連接。 抗原決定部位亦可由免疫細胞，如：B細胞及/或T 細胞辨識。抗原決定部位之細胞辨識作用可藉由玻管內分 析，測量抗原-倚賴性之增殖作用來決定，如：藉由倂入 3 Η -胸腺核苷，藉由細胞活素之分泌，藉由抗體之分泌， 或藉由抗原-倚賴性消滅（細胞毒性Τ淋巴球分析）來測 量。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 示範性抗原決定部位或抗原決定簇可在人類澱粉樣先 驅蛋白質（ΑΡΡ)之內發現，而以在ΑΡΡ之Α/3蛋白 肽內發現者較佳。A Ρ Ρ有多種同質體存在，例如 APP6 9 5，APP751 和 APP77Q。在 APP 內之胺基 酸係根據A Ρ P 7 7 ^同質體之序列來指定號碼（見，如： 基因庫編號P 0 5 0 6 7 ) 。A (本文亦稱爲/3澱粉樣 蛋白肽和A — Θ )蛋白肽係一 3 9至4 3個胺基酸之 APP 的 4 — kDa 內片段（AyS39， AyS40， A A 4 1， A /3 4 2 和 A /3 4 3 )。例如：A /3 4 0 係由 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -21 - 1255272 A7 B7 五、發明説明（19) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) APP之殘質672 — 71 1所組成，而A/342係由 A P P之殘質6 7 3 — 7 1 3所組成。藉不同之分泌酵素 在活體內或原位將A P P進行蛋白質水解處理可產生二種 型式之ΑΘ， 一爲長40個胺基酸之短型，一爲長度在 4 2 - 4 3個胺基酸間的 ''長型〃。如本文所描述，較佳 之抗原決定部位或抗原決定簇係位於A 蛋白肽之N -端 內，且包括在A /S之胺基酸1 一 1 〇內的殘質，宜包括 A/342 之殘質 1 — 3， 1 — 4， 1 — 5， 1 — 6， 1- 7或3 - 7。其它提出之抗原決定部位或抗原決定簇包括 A/342 之殘質 2 — 6， 2 — 7， 2 — 8， 4 — 7。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 v'產生澱粉樣變性之疾病〃一詞包括任何與不溶性澱 粉樣細纖維之形成或沈積相關（或由其引起）的疾病。示 範之產生澱粉樣變性的疾病包括，但不限於：系統I澱粉 樣變性病，阿茲海默氏症，成熟期發病之糖尿病，帕金森 氏病，杭汀頓氏病，額-顳痴呆，及與蛋白侵染子相關之 可傳染性海綿狀腦病（在人類爲〜庫路〃 （Kuru)和〜克 列茲費爾自—傑克伯〃 （Creutzfeldt-Jacob)病，而在羊和 牛中各爲羊搔癢症和B S E )。不同之產生澱粉樣變性的 疾病係由該沈積之細纖維多肽成分的性質所界定，或決定 其特性。因此，阿茲海默氏症爲一在如：個體或患者腦中 ，以A /S之沈積爲其特徵的疾病〃或一 > 與A /3之沈積 相關的疾病〃的實例。a /3 -澱粉樣蛋白質〃，、、β -殿 粉樣蛋白肽〃，'' A /3 〃和A /3蛋白肽〃在本文中可交 換使用。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） -22- 1255272 A7 B7 五、發明説明（20) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) "有效劑量〃或、、有效劑量規定〃之定義爲足夠達到 或至少部分達到所需效果的量。、、治療上有效之劑量"一 詞的定義爲足夠治癒或至少能部分遏制在染病患者體內之 疾病及其併發症的劑量。此用途之有效量將根據感染之嚴 重性及患者所擁有之免疫系統的一般狀態而定。 >患者"一詞包括接受預防性或治療性治療的人類和 其它哺乳動物個體。 w可溶性〃或、、分離〃之A /3係指非集結性或崩潰之 A /3多肽。vv不可溶〃 A /5係指集結性A /3多肽，如： A y3藉由非共價鍵而聚集在一起。一般相信：a /3 (如： A /S 4 2 )之集結係由於在蛋白肽之C端（A P P穿膜結 構區的部分）有疏水性殘質存在（至少有部分原因爲此） 。製備可溶性A /3的方法之一爲將凍乾蛋白肽溶於純淨之 D M S ◦中，並伴以音處理。將所產生之溶液離心以移除 任何不可溶之微粒。 1 .免疫和治療試齊[丨 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本發明之免疫和治療試劑含有如本文所定義之免疫原 和抗體，或其功能性或抗原連接片段，或係由其組成。已 知基本的抗體構造單位含有次單位之四聚體。各四聚體係 由二對相等的多肽鏈對所組成，各對具有一 Α輕"鏈（約 2 5 k D a )和一、'重"鏈（約 5 0 - 7 0 k D a )。各 鏈之胺基-端部分包括含有約1 0 0至1 1 0或更多之胺 基酸的可變區，其主要負責辨識抗原。各鏈之羧基-端部 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -23- 1255272 A7 B7 五、發明説明（21) 分界定一主要負責效應子功能的|互定區。 (請先閱讀背面之注意事項存填寫本頁) 輕鏈被分類爲k或；I，其長度約爲2 3 0個殘質。重 鏈被分類爲r，//，α，（5，或ε，其長度約爲4 5 0 -6 0 0個殘質，且各將抗體之同質體定義爲I gG， I g Μ， IgA, I g D和I g E。重鏈和輕鏈二者均摺 疊成結構區。''結構區"一詞係指蛋白質之球狀區，如： 免疫球蛋白或抗體。免疫球蛋白或抗體結構區包括，如： 3或4個藉yS —摺疊薄板穩定的蛋白肽環及一個鏈間二硫 鍵。完整之輕鏈具有，如：二個結構區（V L和C L )，而 完整重鏈具有，如：四或五個結構區（V Η，C Η 1， Ch2，和 Ch3)。 在輕鏈和重鏈內，可變區和恆定區係藉由一含約1 2 或更多個胺基酸之J 〃區連結，而重鏈亦包括約含1 〇 個或更多個胺基酸的v' D 〃區。（通常見於：基礎免疫學 (保羅，W，編輯，第2版，雷文出版公司，N · Y ·( 1989)，第7章，其全文倂爲參考資料）。 各輕/重鏈對的可變區形成該抗體連接位置。因此， 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 完整之抗體具有二個連接位置。除了在雙功能或雙特異性 抗體中的連接位置外，該二個連接位置彼此相同。所有的 鏈均顯示出相同之高度保留框構區（F R )的一般構造， 這些框構區係由三個高度可變區所連結，也稱爲互補決定 區或C D R s。來自各對之二種鏈的C D R s係藉框構區 調整，以使其能連接一特定抗原決定部位。輕鏈和重鏈二 者從N -端至C 一端均含有結構區F R 1，C D R 1， 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 24- 1255272 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（22) F R 2 , CDR2，F R 3 , CDR3 和 FR4。、、 F R 4 〃在本領域中亦稱爲可變重鏈的D / J區，及可變 輕鏈的J區。對各結構區所派定之胺基酸係根據卡巴（ Kabat)， v'免疫學所注意之蛋白質的序列〃中之定義（國 家健康機構，M D，貝塞斯達布，1 9 8 7和1 9 9 1 ) 。喬西亞（Chothia)等曾提出一替換的構造定義，、j. Mol· Biol. 1 96: 90 1 ( 1 987);自然 342 : 878 ( 1989);和 J. Mol.Biol.l86:651(1889)(以下共同稱 爲 > 喬西亞等〃，且其全文倂爲適用各目的之參考資料） 〇 A . A /3抗體 本發明之治療劑包括特異連接A yS或澱粉樣斑之其它 成分的抗體。這類抗體可爲單株或多株。這類抗體中有某 些係特異連接A /3之集結型，而不連接可溶型。某些則特 異性地連接可溶型而不連接集結型。某些抗體則會連集結 型和可溶型二者。某些這類抗體連接天然產生之A々的短 型（也就是A/939，40，或41)，而不連接天然產 生之A/3的長型（也就是ΑΘ42和A/343)。某些抗 體連接至長型之A /3，而不連接至短型之A /3。某些抗體 連接至A yS，而不連接至全長之澱粉樣先驅蛋白質。用於 治療方法中之抗體宜具有一完整的恆定區，或有至少足夠 之恆定區，以與一 F c受體交互作用。人類同質體 I gGl爲較佳者，這是因爲其爲人類同質體中，對吞噬 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)
-25- 1255272 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（23) 細胞上之F c R I受體具最高親和性者。亦可使用雙特異 性F a b片段，其中該抗體的一臂對A /3具特異性，而另 一臂對F c受體具特異性。某些抗體以高於（或等於）約 1 〇 6， 1 〇 7， 1 〇 8， 1 0 9，或 1 0 丄 0 Μ — 1 之親和力 連接A /3。 典型上，多株血淸含有混合之抗體群，其可連接延著 A /3長度的數個抗原決定部位。然而，多株血淸可特異於 一 A々的特殊節段，如：A /3 1 - 1 〇。單株抗體連接一 在A /3內的抗原決定部位，此可爲構造性或非構造性抗原 決定部位。抗體之預防和治療有效性可利用實例中所描述 之導入外來基因動物模型的步驟來測試。較佳之單株抗體 係連接在A/3之殘質1 一 1 〇 (天然AyS之第一個N端殘 質指定爲1 )內的抗原決定部位。某些較佳之單株抗體連 接在胺基酸1 - 5內之抗原決定部位，而某些則連接在胺 基酸5 - 1 0內的抗原決定部位。某些較佳之抗體連接在 胺基酸 1 — 3，1— 4，1 — 5，1— 6，1 — 7 或 3 — 7內的抗原決定部位。某些較佳之抗體連接從a yS之殘質 1 一 3開始，結束於殘質7 - 1 1的抗原決定部位。較差 之抗體包括那些連接在AyS殘質10 - 15，15 - 20 ，2 5 - 3 0, 1 0 - 2 0, 2 0, 3 〇，或 10 — 25 內之抗原決定部位的抗體。這類抗體最好在使用前先在實 例中所描述之老鼠模型中做活性的篩選。例如：已發現某 些抗體對在殘質10 — 18， 16 — 24， 18 — 21和 3 3 - 4 2內之抗原決定部位缺乏活性。在某些方法中係 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
-26- 1255272 A7 B7 五、發明説明（24) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 使用多種對不同之抗原決定部位具連接特異性的單株抗體 。這類抗體可依序給予或同時給予。也可使用（如：給予 或共同-給予）針對除了 A yS外之澱粉樣成分的抗體。例 如抗體可爲針對與澱粉樣相關之蛋白質、、塞紐克蘭〃（ synuclein )的抗體。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 當稱一抗體連接一在指明之殘質內（如：A /9 1 - 5 )的抗原決定部位時，意指該抗體特異連接一含有指明之 殘質（在此實例中也就是A /3 1 - 5 )的多肽。這類抗體 不一定接觸每一個在1 — 5內之殘質。在A/3 1 — 5 內之每個單-胺基酸取代或缺失也不一定能顯著影響連接 親和力。抗體之抗原決定部位特異性可藉由，如：形成一 噬菌體顯示庫（其中之不同成員顯示不同之A yS次序列） 來決定。然後，選擇集合庫中特異連接受測抗體的成員。 分離出一序列族。典型上，這類族群含有一共通的核心序 列，而在不同成員中的側翼序列有不同長度。顯示出可特 異連接抗體的最短核心序列即定義該由抗體連接之抗原決 定部位。亦可在一競爭性分析中測試抗體對抗原決定部位 之特異性，與測試抗體競爭之抗體，其對抗原決定部位之 特異性已決定好。例如，和3 D 6抗體競爭與A /9之連接 的抗體會連接至與3 D 6所連接者相同或類似的抗原決定 部位，也就是在殘質A /S 1 — 5內。同樣的，與1 〇 D 5 抗體競爭之抗體會連接至與其所連接者相同或類似之抗原 決定部位，也就是：在殘質A /3 3 - 6內。篩選抗體對抗 原決定部位之特異性爲一預測療效的有用預測法。例如： 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21〇X 297公釐） -27- 1255272 A7 B7 五、發明説明（25) 經過測定可連接在A /3之殘質丨一 7內的抗原決定部位之 抗體可能可有效地預防及治療阿茲海默氏症。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 特異連接一較佳之A /3節段而不會連接至Α β之其它 E的早株或多株抗體相對於那些連接至其它區的單株抗體 或連接至完整A /3之多株血淸而言具有很多優點。首先， 對相等質重之劑量而g，特異連接較佳節段的抗體劑量含 有較尚莫耳數之有效淸除澱粉樣斑的抗體劑量。第二，特 異連接較佳節段之抗體可誘導出對抗澱粉樣沈積的淸除反 應，而不會誘導出對抗整個A P P多肽的淸除反應，因此 ，可藉此減低可能的副作用。 .非-人類抗體的製備方法 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本發明特別說明非-人類抗體，如：對本發明之較佳 A /3抗原決定部位具特異性的抗體。這類抗體可用於調配 本發明之不同治療組成物，或者，較合適的爲，提供用於 製造擬人化或嵌合型抗體（詳述於下）的互補決定區。非 -人類單株抗體，如··鼠科動物，天竺鼠，靈長類，兔子 或大鼠可藉由如：以A /3免疫接種動物來製造。可使用含 有A /9之較長多肽或A /3之致免疫性片段，或對抗A /3抗 體之抗-特應性抗體。見··哈洛爾藍，如上述（此篇倂爲 適用於各種目的之參考資料）。這類免疫原可藉蛋白肽之 合成或重組表現來從天然來源取得。隨意地，可先將免疫 原如下述般，與一載體蛋白質融合或複合後再給予個體。 1½思地，免疫原可與一*佐劑一'同給予。、、佐劑〃 一^詞係指 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -28- 1255272 A7 _____B7 五、發明説明（26) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 一化合物，當將其與抗原一同給予個體時，其可增進對抗 原之免疫反應，但當將其單獨給予時，則不會對抗原產生 免疫反應。佐劑可藉多種機制來增進免疫反應，包括：補 充淋巴球，剌激B和/或T細胞，剌激巨噬細胞。許多型 態之佐劑可依下述來使用。在免疫接種實驗室之動物時， 宜先使用完整的弗洛德氏佐劑，再給予不完整之佐劑。 典型上係使用兔子或天竺鼠來製備多株抗體。多株抗 體（如；用於被動保護）之示範製備方法可依下述進行。 以100微克AA1-42加上CF/IFA佐劑來免疫 接種1 2 5隻非一導入外來基因之小鼠，並在4 一 5個月 時予以安樂死。自該免疫化之小鼠收集血液，將I g G與 其它血液成分分開。藉親和力色層分析法來部分純化特異 .於該免疫原之抗體。從每一隻老鼠中可取得平均約◦· 5 一 1毫克之免疫原一特異性抗體，全部爲6 0 — 1 2 0毫 克。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 通常小鼠係用於製造單株抗體。藉由將片段或長型 A /3注射入老鼠體內，可製備出雜交瘤，再將此雜交瘤進 行篩選，以選出可特異連接A /3之抗體，來製得單株抗體 。隨意地，篩選那些能連接Α β之特定區或所需片段，但 不會連接其它非重疊之A /3片段的抗體。後項篩選工作可 藉由測定抗體對A /3蛋白肽之缺失突變種集合體的連接， 並決定何種缺失突變種連接該抗體來完成°連接情況1可藉 由如：西方點漬或E L I S A法來評估。該顯示出能特異 連接抗體的最小片段即定義該抗體之抗原決定部位。或者 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐）_ 1255272 A7 B7 五、發明説明（27) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) ，ί几原決定部位之特異性可藉由競爭性分析來決定，該分 析中有一測試和參考抗體競爭連接A /3。若該測試和爹考 抗體互相競爭，則它們係連接至相同之抗原決定部位或足 夠接近之抗原決定部位，因此，一抗體的連接會干擾另一 抗體的連接。這類抗體之較佳同質體爲老鼠同質體 I g G 2 a或在其它物種中之相等同質體。老鼠同質體 1 gG2 a爲人類同質體I gGl之相等物。 2 嵌合型和擬人化抗體 本發明也特別說明特異於/3澱粉樣蛋白肽之嵌合型及 /或擬人化抗體（也就是嵌合型及/或擬人化免疫球蛋白 )。嵌合型及/或擬人化抗體與該可提供用於構造嵌合型 或擬人化抗體之起始物質的老鼠或其它非人類抗體具有相 同或類似的連接特異性和親和力。 A _嵌合型抗體的製備方法 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 嵌合型抗體爲那些其輕鏈和重鏈基因係從屬於不同物 種之免疫球蛋白基因節段來構成（通常係藉由基因工程處 理）的抗體。例如··可將來自老鼠單株抗體之基因的可變 C V )節段加入人類恆定（C )節段，如I g G 1和 I gG4。人類異構型I gGl爲較佳者。因此，典型之 嵌合型抗體爲一種由來自老鼠抗體之V或抗原-連接區及 來自人類抗體之C或效應子區所組成的雜種蛋白質。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -30- 1255272 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（28) B_ •擬人化抗體的製備方法 擬人化抗體爲那些具有大體上上來自人類抗體（稱爲 接受者抗體）之可變區框構殘質和大體上來自老鼠抗體（ 稱爲供給者免疫球蛋白）之互補決定區的抗體。見，昆， 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 1 0029- 1 003 3 ( 1 989)， US 5,53 0,1 0 1, US 5,5 8 5,089, US 5,693,76 1, US 5,693,762, 塞利克，等之〜〇 90/0786 1，和溫特，118 5,225,53 9 (其全 文倂爲本文所有目的之參考資料）。該恆定區（若存在時 )亦大體上或全部來自人類免疫球蛋白。 以老鼠C D R s取代人類可變區框構的作用在當人類 可變框構區係採用與老鼠可變框構區（C D R s源起處） 之相同或類似構造時，可保持其正確的空間方位。此可藉 由取得來自人類抗體（其框構序列顯示出與該C D R s之 衍生源-老鼠可變框構區具高度之序列一致性）的人類可 變區而達成。該輕和重鏈可變框構區可從相同或相異之人 類抗體序列衍生得來。該人類抗體序列可爲天然產生之人 類抗體序列，或可爲數種人類抗體之一致序列。見：凱特 保羅，蛋白質遺傳工程4 : 7 7 3 ( 1 9 9 1 );可賓格 ，等，蛋白質遺傳工程6 : 971 (1993)和卡特等 ，W〇 92/22653。 鑑定出鼠科供給者免疫球蛋白和適當之人類接受者免 疫球蛋白的互補決定區後，接下來要決定這些成分之殘質 (若有任何殘質時）中何者應被取代，以使所產生之擬人 化抗體最完美。一般來說，以鼠科取代人類胺基酸殘暂的 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
-31 - 1255272 A7 B7 五、發明説明（29) 作用應減至最少，因爲引入鼠科殘質會增加該抗體在人體 中誘出人類一抗一老鼠一抗體（H A Μ A )的風險。決定 鼠科反應之技藝-辨識法可用來監測在一特殊患者體中或 臨床試驗期間的H A Μ A反應。已給予擬人化抗體之患者 可在給予該治療的開始時和整個治療過程中進行免疫性評 估。例如：藉由偵測來自患者之血淸樣本中，針對擬人化 治療劑之抗體，來測量H A Μ A反應，此種測量可利用本 領域之已知方法來進行，包括：表面胞質基因共振技術（ BIACORE )及/或固相EL I SA分析。 根據其對C D R構造及/或對抗原之連接的可能影響 ，選出某些來自人類可變區框構殘質以供進行取代。鼠科 C D R區與人類可變框構區之非天然並排，會產生非天然 之構造限制，此點，除非藉由取代某些胺基酸殘質來修正 ，否則會導致連接親和力的喪失。 選擇供取代之胺基酸殘質係藉由電腦造型（有部分） 來進行。本文說明用於製造三-次元免疫球蛋白分子之影 像的電腦硬體和軟體。一般而言，製造分子模型係從解析 免疫球蛋白鏈或其結構區之構造開始。將欲塑形之鏈與已 解析之三-次元構造的鏈或結構區進行胺基酸序列之類似 性的比較，並選出那些顯示出具最大序列相似性的鏈或結 構區來做爲構造分子模型的起始點。改良已解析之起始構 造，以使塑造出之免疫球蛋白鏈或結構區中的真實胺基酸 和那些在起始構造中者有所差異。然後，將經改良的構造 組合成混合的免疫球蛋白。最後，藉能量最小化作用，以 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 、-1口 άν. 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -32- 1255272 A7 B7 五、發明説明（3〇) 及證明所有原子均彼此位在合適之距離內，且鍵之長度和 角度都在化學上可接受的限制內來精製此模型。 供取代之胺基酸殘質的選擇工作亦可部分藉由檢查在 特殊位置處之胺基酸特性，或完全根據實驗所觀察到之特 殊胺基酸的取代或致突變性效果來決定。例如：當在鼠科 可變區框構殘質和選出之人類可變區框構殘質之間有一胺 基酸相異時，若可合理預期該胺基酸： (1 )非共價性地直接連接抗原， (2 )鄰接C D R區， (3) 或者，與CDR區交互作用（如：在約CDR 區之3 — 6 A內（此係由電腦造型所決定）），或 (4) 參與VL-VH之界面， 則該人類框構胺基酸通常應被相等之老鼠胺基酸所取代。 v非共價性直接連接抗原〃之殘質包括在框構區之位 置中的胺基酸，根據確立的化學力量（如；藉氫鍵，凡得 瓦力，疏水性交互作用，等），則這些胺基酸有很好的機 會直接與在抗原上的胺基酸交互作用。 C D R和框構區係由卡巴，等或喬西亞，等（如上述 )所定義。當框構殘質（如上述卡巴等所定義者）構成如 上述喬西亞，等所定義之構造環時，可自存在於老鼠抗體 中之胺基酸選出用於取代作用，以進入擬人化抗體的胺基 酸。〜鄰接C D R區〃之殘質包括那些其所處位置立即鄰 接著在擬人化免疫球蛋白鏈之一級序列中的一或多個 C D R s的胺基酸殘質，例如：處於立即鄰接著如卡巴所 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
、1T 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -33- 1255272 A7 B7 五、發明説明（31) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 定義之CDR，或如喬西亞所定義之CDR(見，如：喬 西亞和來斯克JMB 196 : 9〇1 (1987))的 位置中。這些胺基酸若是選自接受者，則尤其可能與在 C D R中之胺基酸交互作用，以扭曲供給者C D R，並減 低親和力。還有，該鄰接之胺基酸可直接與抗原交互作用 (艾米特，等，科學，233 : 747 (1986)，其 內容倂爲本文之參考資料），而從供給者選出這些胺基酸 時可能需要保持與所有抗原之接觸，以提供在原始抗體中 之親和力。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 a或者- C D R區交互作用〃之殘質包括那些藉二級 構造分析決定在空間中之定位，以足夠影響- C D R區的 殘質。在一體系中，〜或者與CDR區交互作用〃之殘質 係藉由分析供給者之免疫球蛋白的三-次元模型（如：經 電腦產生之模型）來鑑定。三-次元模型，通常爲原始供 給者抗體之模型，其顯示出在C D R s外之某些胺基酸很 接近C D R s，且很可能藉氫鍵作用，凡得瓦力，疏水性 交互作用，等，與在CDR中之胺基酸交互作用。在那些 胺基酸位置處，寧可選擇供給者免疫球蛋白之胺基酸而非 接受者免疫球蛋白之胺基酸。根據此標準之胺基酸通常在 距離C D R s中之某些原子的約3埃單位（A )內會有一 支鏈原子，且一定含有一可原子，根據已有之化 學力（如上列者）來交互作用。 在可形成氫鍵的原子之情況中，其細胞核間之距離測 量爲3 A，但在不會形成鍵的原子之情況中，所測得之 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） -34- 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1255272 A7 B7 _ 五、發明説明（32) 3 A爲介於其凡得瓦表面間之距離。因此，在後者的情況 中，被認爲可交互作用之原子的原子核必須在約6 A之內 (3 A加上凡得瓦半徑的總和）。在許多情況中，該細胞 核將間隔4或5至6 A。在決定一胺基酸是否可與 CDRs交互作用時，最好不要把重鏈CDR2之最後8 個胺基酸當做C D R s，因爲從構造觀點而言，這8個胺 基酸的表現比較像框構的一部分。 能與在C D R s中之胺基酸交互作用的胺基酸還可以 另一種方式鑑定。各框構胺基酸之溶媒可近表面區域可以 —^種方式來計算：（1 )在完整抗體中，及（2)在一由 抗體所組成的假定分子中，其中該抗體之C D R s已被移 除。這些數字間約1 0平方埃或更大的顯著差距顯示出框 構胺基酸接近溶媒的機會至少有部分被C D R s所阻擋， 因此，該胺基酸與C D R s有所接觸。一胺基酸之溶媒可 近表面區域可根據抗體之三-次元模型，利用本領域中已 知之演算法（如：康諾利，J. Appl. Cryst. 16: 548 (1983) 和李及理查茲，j. Mol. Biol. 5 5:3 79 ( 1 97 1 )，二者均倂爲 本文之參考資料）來計算。框構胺基酸也可偶爾地與 C D R s間接交互作用，這是藉由先影響另一框構胺基酸 的構造，依次再與C D R s接觸來進行的。 已知在框構中之數個位置處的胺基酸可與許多抗體中 之CDRs交互作用（喬西亞和來斯克，如上述，喬西亞 ，等，如上述，和特洛蒙坦諾，等，；Γ Mol. Biol. 2 1 5 : 1 75 (1"0)，其全部倂爲本文之參考資料），値得注意地，已知 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)
-35- 1255272 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（33) 在輕鏈之位置2，4 8，6 4和7 1處和重鏈之位置9 4 處（根據柯白特編號）的胺基酸可與許多抗體中之 CDR s交互作用。在輕鏈中之位置3 5處，和在重鏈中 之位置9 3和1 0 3處的胺基酸亦可能與C D R s交互作 用。在所有這些編號位置處，宜選擇供給者胺基酸加入擬 人化免疫球蛋白中，而非接受者胺基酸（當它們相異時） 。另一方面，某些能與CDR區交互作用之殘質，如··輕 鏈之前5個胺基酸，有時亦可從接受者免疫球蛋白中選出 ，且其在擬人化免疫球蛋白中不會失去親和力。 ^參與V L - V Η界面〃的殘質或、、裝塡殘質〃包括 那些在V L和V Η間之界面的殘質，如：諾弗尼和哈伯， Proc. Natl. Acad. Sci. USA，82: 4 5 92 - 6 6 ( 1 9 8 5 )或喬西亞， 等（如上述）所定義者。一般而言，不尋常之裝塡殘質若 與那些在人類框構中之殘質不同時，其應被保留在擬人化 抗體中。 一般而言，滿足上述要件的一或多種胺基酸爲被取代 者。在某些體系中，所有或大部分滿足上述要件之胺基酸 均被取代。偶爾，一特殊胺基酸是否符合上述條件是有些 f旲稜兩可的，因而可能製造出替代的變異免疫球蛋白，其 中之一具有特殊取代，而另一則不。如此所製出之替代變 異免疫球蛋白可以本文所說明的任一分析來測試該所需之 活性，並選出較佳之免疫球蛋白。 通常，在擬人化抗體中之C D R區大體上相一致，而 更常的是，與供給者抗體之相對應C D R區相一致。雖然 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X29?公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)
-36- 1255272 A7 B7 五、發明説明（34) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 並不常令人滿意，但有時可製造一或多種CDR殘質之保 留性胺基酸取代，而不會些許影響到所產生之擬人化免疫 球蛋白的連接親和力。藉由保留性取代係意指組合，如： g 1 y , ala ; a 1 , ile， leu;asp， g 1 u ； a s n , gln;ser，t h r ； 1 y s , arg;和 phe， tyro 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 其它供取代之候選者爲人類免疫球蛋白中，在該位置 處不常有或'、少有〃之接受者人類框構胺基酸。這些胺基 酸可被來自老鼠供給者之相等位置，或來自更典型之人類 免疫球蛋白的相等位置之胺基酸所取代。例如當該在接受 者免疫球蛋白之人類框構區中的胺基酸對該位置而言爲少 有，而在供給者免疫球蛋白中之相對應胺基酸對於在人類 免疫球蛋白序列之該位置而言爲常有時，此取代可能是令 人滿意的；或者，當在接受者免疫球蛋白中之胺基酸對該 位置而言爲少有，而在供給者免疫球蛋白中之相對應的胺 基酸相對於其它人類序列而言亦爲少有時，此取代也可肯g 令人滿意。這些要件可協助確定在人類框構中之非典型胺 基酸不會混亂抗體之構造。還有，當以一來自供給者抗體 的胺基酸（剛好爲人類抗體之典型者）取代一不尋常之胺 基酸時，該擬人化抗體所產生之致免疫性可能較差。 本文所使用之 > 少有〃一詞係指一胺基酸在該位置處 之發生率低於代表性數據庫中之人類重鏈或輕鏈V區序列 的約2 0 %，但通常係低於約1 0 %，而該''常有〃一詞 係指，一胺基酸之發生率超過在代表性數據庫中之序列的 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） -37- 1255272 A7 B7 五、發明説明（35) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 約2 5 %，但通常係超過約5 0 %。所有人類重鏈和輕鏈 可變區序列係各自分組成彼此格外同源之序列、、次群"， 且在某些關鍵位置處具相同之胺基酸（卡巴，等，如上述 )°當決定該在人類接受者序列中之胺基酸在人類序列之 中是否爲、'少有〃或、、常有〃時，最好僅將那些在相同次 群中之人類序列視爲接受者序列。 其它供取代之候選者爲在喬西亞，等（如上述）所提 出之替代定義下，可被視爲CDR區之一部分的接受者人 類框構胺基酸。其它供取代之候選者爲那些在A b Μ和/ 或接觸之定義下，被鑑定爲C D R區之一部分的接受者人 類框構胺基酸。値得注意的是，在可變重鏈中之c D R 1 可被定義爲包括殘質26 - 3 2。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 除了上述所討論之特殊胺基酸取代外，擬人化·免疫球 蛋白之框構區通常大致上相一致，且更常有的是，與爲其 衍生來源之人類抗體的框構區相一致。當然，在框構區中 的許多胺基酸對抗體之特異性或親和力僅有很少或無直接 貢獻。因此，可容許許多個體之框構殘質的保留性取代， 但所產生之擬人化免疫球蛋白之特異性或親和力並無些許 改變。因此，在一種體系中，擬人化免疫球蛋白之可變框 構區與人類可變框構區序列或這類一致序列共享8 5 %的 序列一致性。在另一種體系中，擬人化免疫球蛋白之可變 框構區與人類可變框構區序列或這類一致序列共享至少 9〇％之序列一致性，而以9 5 %較佳，以9 6 % , 97 %， 98%或99%更佳。 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） -38- 1255272 Α7 Β7 五、發明説明（36) 擬人化抗體宜對抗原顯示出至少1 0 7，1 0 8， 1 0 9或1 0 1 ^ Μ - 1的特異性連接親和力。通常，擬人化 抗體對抗原之連接親和力的上限係在該供給者免疫球蛋白 對抗原之親和力的因子3，4或5倍內。通常，連接親和 力之下限也在供給者免疫球蛋白所具有之親和力的因子3 ，4或5倍內。或者，可將連接親和力與無取代之擬人化 抗體（如··具供給者C D r s和接受者F R s，但無F R 取代之抗體）的連接親和力相比較。在這類情況中，最優 化抗體（帶有取代者）之連接宜較未經取代之抗體至少高 出2至3倍，或3至4倍。爲了進行比較，不同抗體之活 性可藉，如：BIACORE (也就是，利用未經標示之試劑的 表面胞質基因共振）或競爭性連接分析來決定。 擬人化3 D 6杭體之製備方法 本發明之較佳體系特別說明一針對A /3之N -端的擬 人化抗體，以用於本文所描述之治療及/或診斷方法。特 別適合用來製造擬人化抗體的起始物質爲3 D 6。3 D 6 特異於A /3之-端，且已顯示出可傳介澱粉樣斑之吞噬作 用（見實例I 一 V )。實例VI中描述選殖和定序編碼 3 D 6抗體重鏈和輕鏈之c d N A的方法。 合適之人類接受者抗體序列係藉由電腦比較老鼠可變 區之胺基酸序列和已知之人類抗體序列來鑑定。重鏈和輕 鏈的比較係分開進行，但其各自之原則類似。尤其是，其 框構序列與老鼠V L和V Η框構區顯示出具高度之序列一 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 衣 ： 訂 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -39 - 1255272 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 Α7 Β7 五、發明説明（37) 致性的人類抗體的可變結構區係藉卡巴資料庫，利用 NCBIBLAST (可透過國家健康機構N C B I網路伺月S器公 開取得），查詢相對應之鼠科框構序列來鑑定° 此比較透露出3 D 6輕鏈顯示出與人類亞型k 11之輕 鏈具最大之序列一致性，而3 D 6重鏈顯示與人類亞型m 之重鏈（如上述卡巴等所定義者）具最大之序列一致性。 因此，輕和重人類框構區宜衍生自這些亞型人類抗體，或 衍生自這類亞型之一致序列。顯示出與來自3 D 6之相對 應區具最大之序列一致性的較佳輕鏈人類可變區係來自卡 巴 ID 號碼爲 019230，005131， 005058，005057, 005059, U21040 和 U41645 之抗體，而以 019230 爲較佳者，以及那些來自種系可變區A 1，A 1 7， A18， A2和A19者，而以A19爲更佳。顯示出與 來自3 D 6之相對應區具最高之序列一致性的較佳重鏈人 類可變區係來自卡巴I D號碼爲〇 4 5 9 1 9， 000459，〇〇〇 553， 00 0386 和 M23691之抗體，而以045919爲更佳者，以及 那些來自種系可變區VH 3’ — 48，VH3 - 2 3， VH3 — 7，λ，Η3 — 21 和 VH3 — 11 者，而以 V3 一 2 3爲更佳。 接著，依下述選出供取代之殘質。當3 D 6可變框構 區和一相等的人類可變框構區間有一胺基酸相異時，若可 合理預期該胺基酸： 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
-40- 1255272 A7 B7 五、發明説明（3S) (1 )非共價性地直接連接抗原， (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) (2 )係鄰近於一 C D R區，爲C D R區之一部分（ 此爲由喬西亞，等（如上述）所提出之替代定義下的 C D R區），或者，與一 C D R區交互作用（如：其係在 CDR區之約3A內）（如：在3D6之位置L2， Η 4 9和Η 9 4處的胺基酸），或 (3)參與VL—VH界面（如：在3D6之位置 L 3 6 , L46，和Η93處的胺基酸）， 則該人類框構胺基酸通常應被相等之老鼠胺基酸所取代。 實例W中說明3 D 6抗體重鏈和輕鏈可變區之電腦造 型，及3 D 6抗體之擬人化作用。簡單地說，三-次元模 型係根據已解析之最接近的老鼠抗體重鏈和輕鏈構造來製 造。爲了達到此目的，選擇定名爲1CR9之抗體（蛋白 質數據庫（P D B ) I D : 1 C R 9，肯瑤，等，J. Mol. Biol. 293: 85 5 ( 1 999))來做爲塑造3 D 6輕鏈模型的模板 ，而選擇定名爲10PG之抗體（PDB ID: 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1 〇 P G，柯丹達派尼（Kodandapani)，等，J. Biol. Chem. 270: 2268 ( 1 995))做爲塑造3 D 6重鏈模型的模板 。藉由一系列能量最小化步驟來解除不利之原子接觸，並 完美化靜電和凡得瓦交互作用，以進一步精製此模型。選 擇1 Q k z之解構造（P D B I D : 1 Q K Z，德瑞克 ，等，J. Mol. Biol. 293: 8 1 ( 1 999))做爲塑造重鏈之 C D R 3模型的模板，因爲當進行一致性比對之比較時， 3 D 6和1 0 P G在此區中並未顯示出顯著之序列同質性 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） -41 - 1255272 Α7 Β7 五、發明説明（39) 〇 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本文所描述之抗體的三-次元構造資料可公開從，如 :構造性生物資訊硏究合作室（Research Collaboratory for Structural Bioinformatic)蛋白質數據庫（p D B )取得。 該P D B可經由World Wide Web網路自由取得，且係由伯 曼，等之（2 0〇0 )核酸硏究2 8 : 2 3 5所說明。電 腦造型可鑑定出CDR -交互作用殘質。3D6構造之電 腦模型可依次做爲用來預測抗體之三-次元構造的起始點 ，該抗體含有在人類在框構構造中被取代之3 D 6互補決 定區。當還有其它胺基酸取代被引入時，可建構代表此構 造的模型。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 一般來說，取代一個大部分或全部符合上述條件之胺 基酸是有需要的。因此，本發明之擬人化抗體通常在至少 1，2或3，且更常爲4個之下列位置中含有一被相對應 之3 D 6殘質取代的人類輕鏈框構殘質：l 1，L 2， L36和L46。該擬人化抗體通常也會在至少1，2， 有時3個之下列位置中，含有一被相對應之3 D 6殘質所 取代的人類重鏈框構殘質：Η 4 9，Η 9 3，和Η 9 4。 然而，對於一特殊胺基酸是否符合上述要件，偶爾會有一 些模棱兩可的情形，因而可能製造出替代之變異免疫球蛋 白，其中之一具有該特殊取代，另一則無。在以鼠科殘質 取代的情況中，有可能會在人類免疫球蛋白之一特殊位置 處引入一少有的殘質，而測試有或沒有此特殊取代之抗體 的活性是有需要的。若在該帶有或沒帶有取代殘質之情況 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X 297公董） -42 - 1255272 Α7 Β7 五、發明説明（4〇) 中，其活性（如··連接親和力及/或連接特異性）大約相 同的話，則不帶有取代殘質的抗體爲較佳者，因爲，此種 抗體被認爲較不會誘導出如本文所描述之H A Η A反應。 其它供取代之候選者爲那些對人類免疫球蛋白中之該 位置而言，並不常有的接受者人類框構胺基酸。這些胺基 酸可被來自更典型之人類免疫球蛋白的相等位置處之胺基 酸所取代。或者，可將來自老鼠3 D 6中之相等位置處的 胺基酸引入人類框構區中（當這類胺基酸爲人類免疫球蛋 白中，在該相等位置處的典型胺基酸時）。 在其它體系中，當人類輕鏈框構之接受者免疫球蛋白 爲卡巴I D號碼〇 1 9 2 3 0時，該輕鏈在至少1，2， 3， 4， 5， 6， 7， 8， 9， 10， 11， 12或更常 爲1 3個之下列位置中含有取代殘質：L 7，L 1 0， L12，L15，L17，L39，L45，L63， L78， L83， L85， Ll〇〇或Ll〇4。在其它 體系中，當人類重鏈框構接受者免疫球蛋白爲卡巴I D號 碼0 4 5 9 1 9時，該重鏈在至少1，2，3,4, 5， 6， 7， 8， 9， 1〇，11， 12， 13， 14，或更 常爲1 5個下列位置中含有取代殘質：η 3，Η 5， Η13，Η16，Η19，Η4〇，Η41，Η42， Η44，Η72，Η77，Η82Α，Η83，Η84 或 Η 1 〇 8。這些位置係被來自具有更典型之胺基酸殘質的 人類免疫球蛋白的相等位置處之胺基酸所取代。第1和2 圖中顯示要取代之合適胺基酸的實例。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ 297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -43- A7 B7 ------- - .- ___ - ______ 五、發明説明（41 ) 其它供取代之候選者爲發生在框構區中之非一種系殘 質（如：當比較KABID 045919和VH3 — 2 3時，則爲殘質η 7 4，Η 7 7和/或Η 8 9 )。 表1摘述3 D 6 V Η和V L區之序列分析。其中提出 #它可用於3 D 6抗體之電腦造型的其它老鼠和人類構造 ，以及可用來選擇胺基酸取代之種系序列。表1中亦提出 少有之老鼠殘質。少有之老鼠殘質係藉由將該供給者之 V L和/或V Η序列與該供給者V L及/或V Η序列所屬 (根據 ''卡巴〃）之亞型其它成員之序列進行比較來鑑定 ，並鑑定那些與一致序列相異之殘質位置。這些供給者的 特異性差異可能指向那些會增強活性的體細胞突變。接近 連接位置之不尋常或少有的殘質可能接觸該抗原，因而保 留該老鼠殘質是有需要的。然而，若該不尋常之老鼠殘質 對連接而言並不重要，則宜使用相對應之接受者殘質，因 爲該老鼠殘質可能會在擬人化抗體中製造致免疫性新抗原 決定部位。當在供給者序列中之不尋常殘質實際上爲相對 應之接受者序列中的普通殘質時，很淸楚地，該較佳殘質 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 質 殘 者 受 接 爲 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） -44 - 1255272 A7 B7 5 、發明説明（42) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 表1:3D6-區之ί S述 鏈 重 輕 老鼠次群 IIID(002688) 11(005840-005844,005851- (柯白特seqlD#) 005853,005857,005863) 老鼠同質體 002727/163. rCL 005840/1210.7 (柯白物/基因庫） 002711/H35-C6，CL 005843/42.4b.l2.2’CL 002733/8-142-5-3-l(A2-l),CL 005842/BXW-14,CL 002715/ASWA2'CL 005841/42.7B3.2'CL 020669/#14'CL 005851/36-60CRI- 染有之胺基酸 N40(0.233%) YK.035%) (在類群中之發生頻 D42(0.699%) 115(3.3%) 率） D27(0.867%)-CDR1 178(0.677%) L85(0.625%) W89(0.815%)-CDR3 K106K0.295%) 人類次群 __ 111(0000488-000491,000503,000624) 11(005046) 喬西亞標準CDR編 HI:第 1 類[2fbj] LI:第 1 騎 lrmf] 組[pdb範例] H2:第 3 類[ligc] L2:第 1 類[llmW L3 澡 1 類[ltet] ____一 最接近之解析的老 PDB ID :1 OPG柯丹達派尼如上述 PDBID:1CR9;肯瑤等5 鼠構造 ；(72%2 A) supra; (94%, 2 A) PDB ID: 1NLD;戴維斯等5 Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallog. 53:186 (1997); (98%，2.8 A) 最接近之解析的人 1VH(68%? nmr) 1LVE(57%，LEN) 類構造 443560(65%，IgG，λ骨髓瘤，1.8 A) 1B6DA(54%,B-J 二聚體， KOL/2FB4H(60%，骨髓瘤 3 A) 2.8 A); 1VGEL(54%，自體抗體） 種系查詢(Hu) VH3-48(4512283/BAA75032.1) Al(x63402) 結果(前4項） VH3-23(4512287/BAA75046.1) A17(x63403) VH3-7(4512300/BAA75056.1) A18(X63396) VH3-21(4512287/BAA75047.1) A2(m31952) ----- VH3 -11 (41523 00/B AA75053.1) A19(x63397) *重鏈和輕鏈來自相同抗體（0-81，Hirabayashi等，NAR 20:2601) ° (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -45- 1255272 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（43) 在一特佳體系中，本發明之擬人化抗體含有3 D 6 CDRs (如：一，二或二個VL CDRs和/或一， 一或二個VH CDRs)，並隨意地，具至少一種（以 具二，三，四種或全部較佳）下述活性：（1 )連接集結 之A万1 — 4 2 (如：由E L I S A所決定者）；（2 ) 連接在斑塊中之A /3 (如：將A D及/或P D A P P斑加 以染色）；（3)與嵌合型3D6 (如：具老鼠CDRs 和人類接受者F R s之3 D 6 )相較下，可以二至三倍高 之連接親和力連接A石；（4 )呑噬A /3 (如：在一如本 文所描述之活體外吞噬作用分析中）；及（5 )穿越血液 -腦障壁（如：在如本文所描述之P D A P P動物模型中 ，證明短期之腦部定位）。 3.人類抗體 藉下述之多種技術可提供對抗A /3之人類抗體。某些 人類抗體係藉競爭性連接實驗或其它方法來篩選，以與一 特殊老鼠抗體（如：本文所描述的一種老鼠單株抗體）具 相同的抗原決定部位特異性。人類抗體也可經由僅利用-A /3片段做爲免疫原來篩選其對一特殊的抗原決定部位特 異性，及/或經由篩選對抗A /3之缺失變種集合體的抗體 來進行。人類抗體宜具人類I g G 1同質體特異性。 a ·三合瘤（trioma)方法論 其基本方法及用於此法中之示範性細胞融合伙伴， 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） --------Φ---------，玎——ΙΛΤ (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) -46- 1255272 A7 B7 五、發明説明（44) S p A Z — 4已說明於歐斯特伯格，等之雜交瘤2 : 3 6 1 ( 1 9 8 3 ):歐斯特伯格，美國專利號 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 4，6 3 4, 6 6 4 ;和英格曼，等之美國專利號 4，6 3 4，6 6 6中（各篇全文倂爲本文中適用各種目 的的參考資料）。由此方法取得之抗體-製造性細胞株稱 爲三合瘤，因爲它們係來自三種細胞；二種人類的和一種 老鼠的。首先，將老鼠骨髓瘤株與一人類B -淋巴球融合 以取得非-抗體-製造性異種雜合細胞，如：由上述歐斯 特伯格所描述者。然後，將該異種雜合細胞與一免疫化之 人類B -淋巴球融合以取得-抗體-製造性三合瘤細胞株 。現已發現三合瘤可製造比從人類細胞製得之一般雜交瘤 所能製造者更穩定的抗體。 經濟部智慧財產局員工消費合作杜印製 該免疫化之B -淋巴球係從人類供給者之血液，脾臟 ，淋巴結或骨髓取得。若需要能對抗特定抗原或抗原決定 部位之抗體，則宜使用其抗原或抗原決定部位來免疫。免 疫可在活體內或玻管內進行。在活體內免疫方面，B細胞 通常係從那些以A /3，其片段，含A yS或片段之較大多肽 ，或對抗A /3抗體之抗-特應型抗體免疫過之人體中分離 出來。在某些方法中，B細胞係從該最終需給予抗體治療 之相同患者的體內分離出來。在玻管內免疫方面，通常係 將B -淋巴球暴露在置於介質（如：RPMI - 1 6 4 0 (見：英格曼，如上述），其補充有1 0 %之人類血漿） 中之抗原7—14天。 將免疫過之B -淋巴球藉由本領域所熟知之方法融合 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -47- 1255272 A7 B7 五、發明説明（45) 至一異種雜合細胞，如：s P A 2 - 4。例如，在約3 7 t：下，以MW1〇〇一4〇0〇之4〇一 5 0%聚乙二醇 處理細胞約5 - 1 0分鐘。將細胞從融合的混合物中分離 出來，並在能選擇所需之雜種（如：H A T或A Η )的介 質中繁殖。藉由分析該三合瘤培養介質之連接A /3或其片 段的能力來鑑定具有所需之連接特異性的抗體分泌營養系 〇 將該能製造具有所需特異性之人類抗體的三合瘤藉由 限定稀釋技術來進行次選殖，並讓其在玻管中之培養介質 內生長。測試所得之三合瘤細胞株連接A /3或其片段的能 力。 雖然，三合瘤爲遺傳上穩定的，但它們不會製造高濃 度抗體。其表現程度可藉由將抗體基因從三合瘤選殖入-或多個表現介體中，再將介體轉化入標準的哺乳動物，細 胞或酵母細胞株中來增加。 b .導入外來基因之非一人類哺乳動物 抗A々之人類抗體也可從具轉移基因之非一人類導入 外來基因哺乳動製得，該轉移基因係編碼至少一人類免疫 球蛋白基因位的節段。通常，這類導入外來基因之哺乳動 物的內生性免疫球蛋白爲功能上去活化的。較合適的爲， 人類免疫球蛋白基因位之節段包括未經重排之重和輕鏈成 分的序列。將內生性免疫球蛋白基因去活化和導入外生性 免疫球蛋白基因的作用可藉瞄準之同源重組來達成，或藉 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ 297公釐） (请先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
、1T 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -48 - 1255272 A7 B7 五、發明説明（46) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 由引入YA C染色體來達成。由此方法所產生之導入外來 基因的哺乳動物能夠在功能上重排該免疫球蛋白成分之序 列，並表現出由人類免疫球蛋白基因所編碼之不同同質體 抗體的總集，而不會表現出內生性免疫球蛋白基因。具這 些性質之哺乳動物的製造方法和性質詳細說明於下列群體 中：如：隆伯格，等，W093/1 2227 ( 1 993); US 5,877,3 97， US 5,874,299，US 5,814,318，US 5,789,650，US 5,770,429， US 5 66 1，016，US 5,63 3,425，US 5,625，126，US 5,569,825， US 5,545,806，自然 1 48:1 547( 1 994)，自然生物技術 14:826 ( 1 996)，庫契拉帕提，W091/10741 (1991)(各篇全文倂爲本 文適用各種目的之參考資料）。導入外來基因之小鼠尤其 合適。抗一 A/?抗體係藉由以A/3或其片段免疫接種一導 入外來基因之非人類哺乳動物來取得，如：藉由t隆伯格 〃或'v庫契拉帕提〃（如上述）之說明。單株抗體係藉由 ，如：將來自這類晡乳動物之B -細胞利用傳統之''可勒 -米爾斯坦〃技術融合至合適之骨髓瘤細胞株來製造。人 類多株抗體亦可以來自人類之血淸的型式提供，而該人類 係經一致免疫試劑免疫過。隨意地，可利用A /3或其它澱 粉樣蛋白肽做爲親和力試劑，藉由親和力純化作用來濃縮 這類多株抗體。 c .噬菌體表現方法 另一用來取得人類抗- A /3抗體的方法爲根據''休斯 ，等之科學 2 4 6 : 1 2 7 5 — 1 2 8 1 ( 1 9 8 9 ) 〃 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） -49- 1255272 A7 B7 五、發明説明（47) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 所 槪 述 的 -Λ 般 方 案 從 人 類 Β 細 胞 篩 選 出 — D Ν A 集 合 庫 0 如 • 關 於 二 合 瘤 方 法 之 描 述 這 類 B 細 胞 可從 — 以 A β ， 片 段 含 A β 之 較 長 多肽 或 片 段 ， 或 抗 — 特 應 型 抗 體 免 疫 過 之 人 類 中 取 得 〇 隨 思 地 這 類 B 細 胞 可 從 -- 最 終 將 接 受 抗 體 處 理 之 患 者 體 內 取得 〇 篩 選 出 連 接 A β 或 其片 段 的 抗 體 〇 然 後 > 心巳巳 殖 並 擴 大 編 碼 這 類 抗 體 ( 或 連 接 片 段 ) 的 序 列 藉 由 \\ 休斯 // 所描 述 之 方 案 並加 上 噬 菌 體 — 表 現技 術 可 使本 方 法 更 爲 有 效 0 見 如 道 爾 等 之 W 〇 9 1 / 1 7 2 7 1 J 麥 克卡 菲 提 等 之 W 〇 9 2 / 〇 1 〇 4 7 赫 里 格 y 等 之 U S 5 8 7 7 2 1 8 溫 特 等 之 U S 5 1 8 7 1 9 0 7 溫 特 等 之 U S 5 y 8 5 8 ， 6 5 7 ， 荷 里 格 等 之 U S 5 y 8 3 7 2 4 2 強 生 等 之 U S 5 > 7 3 3 ， 7 4 3 和 霍 根 本 y 等 之 U S 5 ， 5 6 5 ， 3 3 2 ( 各 篇 全 文倂 爲 本 文 適 用 各 種 S 的 之 參 考 資 料 ) 0 在 這 起 方 法所 製 的 爲 其 中 成 員 會 在 其 外 表 面 上 顯 示 出 不 同 抗 體 的 口遼 f r * 囷 體 集 合 庫 〇 抗 體 通 常 係 以 F V 或 F a b 片 段 來 顯 示 〇 帶 有所 而 之 特 異 性 的 噬 -hr* 囷 體 顯 示 抗 體 R-ijt* 係 藉 對 一 A β 蛋 白 肽 或 其 片段 之 親 和 力 增 強 性 來 篩 選 〇 在 一 做 爲 VV 噬 菌 體 一 顯 示 法 // 的 變 化方 法 中 可 製 造 出 那 些 具 有 篩 選 出 之 鼠 科抗 體 之 連 接 特 異 性 的 人 類 抗 體 〇 見，溫特W〇 9 2 / 2 0 7 9 1。在此方法中，係使用 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -50- 1255272 A7 B7 五、發明説明（48) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 所選出之鼠科抗體的重或輕鏈可變區做爲起始物質。例如 :若選擇一輕鏈可變區做爲起始物質，則可建構出其中成 員會顯示出相同之輕鏈可變區（也就是該鼠科起始物質） 和一不同之重鏈可變區的噬菌體集合庫。該重鏈可變區係 從一重組之人類重鏈可變區集合庫取得。選擇顯示出對A yS具強特異性連接（如：至少1 〇 8，以至少1 〇 9 Μ — 1較 佳）之噬菌體。然後，以來自此噬菌體之人類重鏈可變區 做爲建構另一噬菌體集合庫之起始物質。在此集合庫中， 各噬菌體顯示出相同之重鏈可變區（也就是從第一個顯示 集合庫鑑定出的區）及一不同之輕鏈可變區。該輕鏈可變 區係從一重組之人類可變輕鏈區集合庫取得。同樣的，選 出顯示出對A /3具強特異性連接的噬菌體。這些噬菌體顯 示出完全之人類抗- A /3抗體的可變區。這些抗體通常與 鼠科起始物質具相同或類似性的抗原決定部位特異性。 4.可變區之製備方法 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 在已槪念上地選擇過擬人化免疫球蛋白之C D R和框 構成分後，可利用許多方法來製造這類免疫球蛋白。由於 該密碼之簡倂性，許多核酸序列可編碼各免疫球蛋白之胺 基酸序列。所需之核酸序列可藉 ''重新開始固相D N A合 成法 〃（de novo solid-phase DNA synthesis)或藉由一早 期製備之所需多核苷酸的變異體之P C R致突變作用來製 備。由寡核苷酸傳介之致突變作用爲一種用來製備標的多 肽D N A之取代，缺失和插入變異體的較佳方法。見，阿 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） -51 - !255272 A7 B7 五、發明説明（49) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 德曼等之D N A 2 : 1 8 3 ( 1 9 8 3 )。簡單的說， 標的多肽D N A的改變係藉由將一編碼所需突變之寡核替 酸雜合至一單股D N A模板來進行。雜合後，使用 DNA聚合酶來合成已合倂該寡核苷酸引物，並編碼所選 出之標的多肽D N A中的變化的完全第二互補股。 且.悔定區的選擇 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 依上述所製出之可變抗體節段（如：嵌合型，擬人化 ，或人類抗體之重鏈和輕鏈可變區）通常係連接至少一部 分之免疫球蛋白的恆定區（F c )，此恆定區通常爲人類 免疫球蛋白之恆定區。人類恆定區D N A序列可根據本領 域所熟知之步驟從多種人類細胞中分離出，但以從永生化 之B細胞中分離出較佳（見卡巴，等，如上述，及劉，等 之W〇 87/02671 )(各篇全文倂爲本文適用所 有目的之參考資料）。通常，抗體會包含輕鏈和重鏈恆定 區。重鏈恆定區通常包括CH1，絞鏈，CH2，C Η 3 和C Η 4區。本文所描述之抗體包括那些具全部恆定區型 式的抗體，包括：IgM， I g G , I g D , IgA和 IgE，及任何同質體，包括IgGl， I g G 2 , I g G 3和I g G 4。恆定區之選擇有部分係根據是否需 要抗體-依賴性補體及/或經細胞傳介之毒性而定。例如 ，同質體I g G 1和I g G 3具補體活性，而同質體 I g G 2和I g G 4則不。當需要抗體（如：擬人化抗體 )顯示出細胞毒性活性時，該恆定區通常爲一補體固定恆 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） -52- 1255272 A7 B7 五、發明説明（5〇) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 定區，而其類型通常爲I g G 1。當不需要這類細胞毒性 活性時，該恆定區可能爲I g G 2類之恆定區。同質體之 選擇亦可影響抗體進入腦部的通道。人類同質體I g G 1 爲較佳者。輕鏈恆定區可爲λ或k。該擬人化抗體可含有 來自超過一類同質體的序列。抗體可以如下述之型式來表 現：含二個輕鏈和二個重鏈的四聚體，分開之重鏈，輕鏈 ，Fab, Fab^F (ab^) 2，和 Fv，或其中重 和輕鏈可變區係透過一間隔子來連接之單鏈抗體。 6.電組杭體之表現 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 嵌合型，擬人化和人類抗體通常係藉重組表現來製造 。將編碼擬人化之輕和重鏈可變區，隨意地連接恆定區之 核酸插入表現介體。可將輕鏈和重鏈選殖在相同或相異之 表現介體中。將編碼免疫球蛋白鏈之D N A節段操作連接 至在確定能表現免疫球蛋白多肽類之表現介體內的控制序 列上。表現控制序列包括，但不限於：啓動因子（如：天 然-相關或異質啓動因子），信號序列，增強子成分，及 轉錄終止序列。較合適的爲，該表現控制序列係該種能轉 化或轉染真核宿主細胞之介體中的真核啓動因子系統。一 旦已將介體倂入合適之宿主後，將宿主維持在適合高度表 現核苷酸序列的條件下，並收集和純化該交叉反應抗體。 這些表現介體通常係以基因附體型式或宿主染色體 D NA之主要部分的型式在宿主有機體中進行複製。通常 ，表現介體含有選擇標記（如：安苄青黴素-抗性，潮黴 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X29?公釐） -53 - 1255272 A7 B7 五、發明説明（51) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 素-抗性，四環素-抗性，或新黴素一抗性）可用來偵測 那些經所需之D N A序列轉化過的細胞（見，如：伊塔庫 拉，等，美國專利4704362)。 大腸桿菌爲一種特別適合選殖本發明多核普酸（如： D Μ A序列）的原核宿主。其它適合使用之微生物宿主包 括桿菌，如：枯草桿菌，和其它腸內菌，如：沙門氏菌， 鋸桿菌屬，和不同的假單胞菌種。在這些原核宿主中，亦 可製造通常含有能與宿主細胞相容之表現控制序列（如： 複製之起源）的表現介體。另外，會呈現任何數目之多種 ，爲人所熟知之啓動因子，如··乳糖啓動因子系統，色胺 基酸（t r p )啓動因子系統，/5 一內醯胺酶啓動因子系 統，或來自噬菌體入之啓動因子系統。通常，該啓動因子 會隨意地以一操縱子序列控制表現，且具有核醣體連接位 置序列，等，以開始並完成轉錄和轉譯作用。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 其它微生物，如：酵母菌，也可用於表現作用中。釀 母菌爲較佳之酵母菌宿主，其依需要帶有合適之具表現控 制序列（如：啓動因子），複製源，終止序列，等的介體 。典型之啓動因子包括3 -磷酸甘油酸激酶及其它糖解酶 。可誘導之酵母菌啓動因子包括：來自醇脫氫酶，同種色 素細胞C，和負責麥芽糖及半乳糖利用之酶的啓動因子。 除了微生物外，也可使用哺乳動物組織細胞培養來表 現並製造本發明多肽（如：編碼免疫球蛋白或其片段之多 核苷酸）。見：溫內克，從基因至營養系，VCH出版者 ，N · Y .，N · Y · ( 1 9 8 7 )。實際上，真核細胞 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） -54- 1255272 A7 B7 五、發明説明（52) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 爲較佳者，因爲本領域中已發展出許多能分泌異源蛋白質 (如：完整免疫球蛋白）的宿主細胞株，其包括C Η〇細 胞株，不同的C 〇 s細胞株，海拉（Hela )細胞，而以骨 髓瘤細胞株或轉化過之B -細胞或雜交瘤較佳。較合適的 爲，該細胞爲非人類。這些細胞之表現介體可包括表現控 制序列，如：複製起源，啓動因子，和增強因子（昆，等 Immunol. Rev. 89: 49 (1986))，及必須之處理資料位置， 如：核醣體連接位置，R N A剪接位置，聚腺苷酸化位置 ，和轉譯終止序列。較佳之表現控制序列爲從免疫球蛋白 基因衍生之啓動因子，S V 4 0，腺病毒，牛乳頭瘤病毒 ，巨細胞病毒，等。見 Co.等，J. Immunol. 148: 1 149 (1992)。 或者，可將抗體-編碼序列倂入轉移基因中，以供引 入-導入外來基因動物之基因組中，並接著將其表現在導 入外來基因之動物的乳汁中（見，如：戴伯，等， US 5，741， 957，羅生， US 5， 3〇4， 489，和美德，等， 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 US 5， 849， 992)。合適之轉移基因包括可操 作連接來自乳腺特異基因，如：酪蛋白或-乳球蛋白之 啓動因子和增強因子的輕及/或重鏈編碼序列。 含所注意之多核苷酸序列的介體（如：該重和輕鏈編 碼序列及表現控制序列）可藉爲人熟知之方法來轉移入宿 主細胞內，這些方法係根據細胞宿主之型態而有不同。例 如··原核細胞通常係使用氯化鈣轉染，然而，其它細胞宿 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） -55- 1255272 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 Α7 Β7 五、發明説明（53) 主可使用磷酸鈣處理，電穿孔，微脂粒感染作用（ Hpofection)，biolistics，或以病毒爲基礎之轉染作用（通 常見於：山布魯克，等，分子選殖：實驗室手冊（冷泉港 出版公司，第2版，1989)(其全文倂爲本文適用各 種目的之參考資料）。其它用來轉化哺乳動物細胞之方法 包括：使用聚凝胺製劑，原漿融合，脂類，電穿孔，及顯 微注射（一般見於：山布魯克，等，如上述）。在製備導 入外來基因動物方面，可將移轉基因顯微注射入受精的卵 母細胞內，或可將其倂入胚胎幹細胞之基因組中，以及將 這類細胞之細胞核轉移入摘出之卵母細胞中。 當將重鏈和輕鏈選殖在分開的表現介體上時，可將介 體共同轉染以取得完整之免疫球蛋白的表現和組合。一旦 表現出後，可根據本領域之標準步驟，包括：硫酸·銨沈澱 法，親和性管柱，管柱色層分析，Η P L C純化，凝膠電 泳，等（一般見於史卡普，蛋白質純化（史賓格-維勒， N . Υ . , (1982 ))來將本發明之全抗體，其二聚 體，個別輕和重鏈，或其它型式之免疫球蛋白加以純化。 在製藥用途方面，較佳的爲至少約爲9 0至9 5 %同質之 大體上純化的免疫球蛋白，而以至少約爲9 8至9 9 %或 同質性更高者爲最佳。 7 .抗體片段 本發明之範圍亦涵蓋抗體片段。在一種體系中係提供 非-人類的，嵌合型的及/或人類抗體。在另一種體系中 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ 297公釐） J1Τ (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) -56 - 1255272 A7 B7 五、發明説明（54) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 係提供擬人化之抗體片段。通常，這些片段顯示出其對抗 原之特異性連接的親和力至少爲1 0 — 7，更典型的爲 1〇-8或1 0 1 Μ。擬人化抗體片段包括分別之重鏈，輕 鍵 Fab， Fab^F(ab")2， Fabc，和 Fv 。此種片段係藉由重組D N A技術，或藉由酶的或化學的 完整免疫球蛋白分離法來製造。 8 .測試杭體在動物模型中之治療效果 在各組7 - 9個月大的P D A P P小鼠體內注射入 0 · 5毫克在PBS中之多株抗一 Ay3抗體或特異性抗一 A沒單株抗體。將所有抗製品加以純化，以使其具低內毒 素濃度。藉由下述方法來製造對抗-片段的單株抗體：將 一片段或A A之較長型注射入老鼠體內，製備雜交瘤，並 篩選雜交瘤，以找出可特異連接至所需之A yS片段，但不 會連接至其它A yS之非重疊片段的抗體。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 依需要，在4個月的期間後再經腹膜內途徑給予老鼠 注射，以使對抗A /3 4 2或其它免疫原之循環抗體的濃度 維持高於1 / 1〇0〇 E L I S A效價（由E L I S A 所定義）。測量效價，並在注射後的第6個月底時，將老 鼠安樂死。驗屍時進行組織化學，A /3濃度及毒物學檢查 。每一組使用1 0隻小鼠。 9 .篩選用於淸除活件之杭體 本發明也提供用來篩選抗體之淸除活性的方法，此活 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21〇X 297公釐） -57- 1255272 A7 B7 五、發明説明（55) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 性係用來淸除澱粉樣沈積或需要該淸除活性之任何其它抗 原，或相關生物實體。爲了篩選該對抗澱粉樣沈積之活性 ，自阿茲海默氏症患者之腦部，或具獨特之阿茲海默氏症 病理學特性的動物模型中取得組織樣本，將此樣本在玻管 內與帶有F c受體之呑噬細胞，如：小神經膠質細胞及介 質中的測試抗體接觸。吞噬細胞可爲初級培養或細胞株， 如：BV— 2，C8-B4，或THP— 1。在某些方法 中，這些成分係在顯微鏡載玻片上混合在一起以幫助顯微 鏡之監測。在某些方法中，在微量滴定盤之槽內同時進行 數種反應。在這類格式中，可將分別之小型，顯微鏡載玻 片固定在分別的槽中，或者是可使用非顯微鏡偵測格式， 如：以E L I S A偵測Α Θ。較合適的爲，對玻管中之反 應混合物內的澱粉樣沈積物進行一系列測量，在反應進行 前先從基線値開始，然後於反應中間再測量一或多個測試 値。該抗原以，如：經螢光標示之抗A /3或殿粉樣斑之其 它成分的抗體來染色。用於染色之抗體可以與測試淸除活 性之抗體相同或不同。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 在澱粉樣沈積之反應期間，若所得數値較基線爲低， 則表示該測試抗體具淸除活性。這類抗體似乎可用在預防 或治療阿茲海默氏症及其它產生澱粉樣變性的疾病中。 類似方法可用來篩選抗體淸除其它類型之生物實體的 活性。該分析可用來偵測茲可對抗幾乎任何生物實體的淸 除活性。通常，該生物實體在人類或動物疾病中扮演某些 角色。該生物實體可以組織樣本成分離出之型式來提供。 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） - 58 - 1255272 A7 B7 五、發明説明（56) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 若以組織樣本型式提供時，該組織樣本宜爲未固定者，以 使抗體容易接近組織樣本之成分，並避免因固定而擾亂成 分之結構。可以此分析測試之組織樣本實例包括癌症組織 ，尙未成癌的組織，含良性發育之組織（如·抚或癒）， 被致病性微生物感染之組織，被發炎細胞浸潤之組織，在 細胞間帶有病態基質的組織（如：纖維蛋白性心包炎）， 帶有異常抗原之組織，及疤痕組織。可使用之分離出的生 物實體範例包括：A /3，病毒抗原或病毒，蛋白多醣，其 它致病微生物之抗原，腫瘤抗原，及附著分子。這類抗原 可從天然來源，重組表現或化學合成等方法取得。將組織 樣本或分離出之生物實體與帶有F c受體之呑噬細胞（如 :單核細胞或小神經膠質細胞），及在介質中之欲測試的 抗體接觸。該抗體可爲針對欲測試之生物實體或與該實體 相關之抗原的抗體。在後項情況中，其目的係測試該抗原 是否會替代該生物體被吞噬。通常，雖然並非必須的，該 抗體和生物實體（有時帶有一相關抗原）係在加入呑噬細 胞前先彼此接觸。然後，監測仍剩餘在介質中之生物實體 及/或相關抗原（若存在時）的濃度。介質中之抗原或生 物實體的量或濃度減少時，表示抗體加上吞噬細胞時對抗 原及/或相關生物實體具淸除反應（見，如：實例IV )。 B .編碼免痔和治瘠劑之核酸 對抗澱粉樣沈積的免疫反應也可經由給予患者那些編 碼用於被動免疫之抗體及其成分鏈的核酸來誘導出。這類 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） -59- 1255272 A7 B7 五、發明説明（57) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 核酸可爲D N A或R N A。通常，編碼免疫原之核酸節段 係連接至調節成分上（如：啓動因子和增強因子），以使 D N A節段表現在所要的患者標的細胞上。在表現於血液 細胞方面，來自輕或重鏈免疫球蛋白基因之啓動因子和增 強子成分，或該C Μ V之主要中間早期啓動因子和增強子 可適合用來指導表現，以誘導出免疫反應。通常，經連接 之調節成分和編碼序列係選殖入一介體中。在給予雙鏈抗 體方面，該二種鏈可被選殖在相同或分開的介體中。 可使用的病毒介體系統有許多種，包括：逆轉錄病毒 系統（見，如：勞利和吐明，Cur. Opin. Genet. Develop. 3: 1 02- 109 (1 993));腺病毒介體（見，如··饒，等之J. Exp. Med. 179: 1867 (1994))，來自痘病毒一族的病毒介體，包 括：牛痘病毒和禽類痘病毒，來自^ -病毒屬之病毒介體 ，如：那些衍生自Sindbis&SemlikiForest病毒（見，如： 杜本斯基，等，Virol. 70:5 08 ( 1 996))，Venesulan馬腦 炎病毒（見：強斯頓，等，US 5，643，5 7 6 ) 和棒狀病毒，如：水泡狀口炎病毒（見，羅斯， W 0 9 6 / 3 4 6 2 5 )和乳頭瘤病毒（歐，等，人類 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 基因治療6 : 325 (1995);伍，等， W 0 9 4 /12629和蕭&布蘭茲馬，核酸硏究 2 4，2630-2622 (1996) ° 編碼免疫原之D N A，或含該相同物質之介體可被裝 塡.入脂粒中。合適之脂質和相關類似物說明於艾普斯坦， 等之US 5， 208， 036，費格納，等， -60 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21〇X 297公釐） 1255272 A7 B7 五、發明説明（58) US 5， 264， 618，羅斯， US 5， 279， 833，和艾本，等之 U S 5，2 8 3, 1 8 5。也可將介體和編碼免疫原的 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁} D N A吸附至微粒載體，或與其聯合，這類實例包括：聚 ΐ S丙;C希酸甲酯聚合物及聚交酯類，和聚（交酯一共一乙 父酯），見，如：麥克吉，等 J. MicroEncap. (1996)。 基因治療介體或裸出之多肽類（如：D N A )的遞送 胃經由活體內途徑給予個別患者來進行，其通常係藉系統 給予（如：靜脈內，腹膜內，鼻，胃，皮內，肌肉內，皮 下，或顱內注入）或局部施用（見，如：安德森，等， us 5， 399， 346)來進行。、裸出之多核苷酸 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 "一詞係指未與膠體物質複合之多核苷酸。裸出之多核苷 酸有時係選殖在質體介體中。這類介體還可包括促進劑， 如：bupivacine (艾塔，杜等，US 5，593，970 )。亦可使用基因槍來給予D N A。見：蕭&布藍茲馬， 如上述。可將編碼免疫原之D N A沈澱至顯微鏡金屬小珠 的表面上。以一震盪波或擴張的氦氣滲入數層細胞深之組 織內來加速粒子槍給予，例如：可適用的有由威斯康辛州 密德頓之阿格塞德斯（Agacetus)公司所製造之艾塞爾（ Accel )基因遞送裝置。或者，裸出之DNA的遞送可僅藉 由將D N A點漬到皮膚，加上化學或機械刺激，以通過皮 膚到達血流中（見，霍威爾，等W0 95/05853 )來進行。 在另一種變化中，可將編碼免疫原之介體遞送至活體 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -61 - Ϊ255272 A7 B7 五、發明説明（59) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 外之細胞中，如：來自個別患者之外植細胞（如：淋巴球 ，骨髓抽取液，活體組織切片）或全體供給者造血幹細胞 ，然後再重新將細胞植入患者體內，這通常係在篩選出已 將介體倂入之細胞後進行。 防和治療方法 本發明尤其針對治療阿茲海默氏症及其它產生澱粉樣 變性疾病的方法，尤其是該種藉由將治療性免疫試劑（如 :擬人化免疫球蛋白），在可於患者體內產生有益反應的 條件下（如：細胞吞噬A A，減少斑的負載量及/或減少 神經炎性營養不良），給至患者之A /3內的特異性抗原決 定部位上的方法。本文所使用之、、治療〃一詞係定義爲給 予患者一治療劑，或將其施用至患者，或者是將治療劑用 至或給至一從患者（其具有一疾病，疾病之症狀，或疾病 傾向）體內分離出之組織或細胞株上，以治癒，癒合，緩 解，減輕，改變，補救，改善，改進或影響疾病，疾病症 狀或疾病傾向。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 在某一方面，本發明提供預防或治療一與患者腦中 A yS之澱粉樣沈積有關的疾病。這類疾病包括阿茲海默氏 症，唐氏症及認知失調。後者可有或沒有其它產生澱粉樣 變性疾病的特徵。某些本發明之方法需要給予患者一有效 劑量之連接A A的抗體。較佳之方法係需要給予患者有效 量之特異連接在A Θ殘質1 - 1 〇內之抗原決定部位的抗 體，例如：特異連接在A /3殘質i 一 3內之抗原決定部位 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） - 62- 1255272 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（6〇 ) 的抗體，特異連接在Α Θ殘質1 - 4內之抗原決定部位的 抗體，特異連接在A A殘質1 - 5內之抗原決定部位的抗 體，特異連接在Α Θ殘質1 - 6內之抗原決定部位的抗體 ，特異連接在A 0殘質1 - 7內之抗原決定部位的抗體， 或特異連接在A A殘質3 - 7內之抗原決定部位的抗體。 而在另一方面，本發明特別說明給予患者一連接至含有 A /3 N —端殘質之抗原決定部位的抗體。而在另一方面 ，本發明特別說明給予患者連接至A /3殘質1 - 1 〇內之 抗原決定部位的抗體，其中Α Θ之殘質1及/或殘質7爲 天門冬酸。在另一方面，本發明特別說明給予患者特異連 接A/3蛋白肽而不連接全長澱粉樣先質蛋白質（AP P ) 之抗體。在另一方面，該抗體之同質體爲人類IgGl。 而在另一方面，本發明特別說明給予患者可連接至患 者體內之澱粉樣沈積，並誘發淸除澱粉樣沈積之反應的抗 體。例如，這類淸除反應可藉由該F c受體所傳介之吞噬 作用來生效。 本發明之治療劑通常爲大體上不含那些令人不滿之污 染物的純型。這表示試劑通常爲約至少5 0 % w/w ( 重量/重量）之純度，且大體上不含干擾之蛋白質及污染 物。有時，該試劑至少約爲8 0 % w/w，且更合適的 爲約至少9 0 %或9 5 % w/w純度。然而，利用傳純 之蛋白質純化技術可取得至少約9 9 % w/w同質的蛋 白肽。 本方法可用於無症狀患者及那些目前顯示出疾病症狀 本紙張尺度適用中國國家榡準（CNS) Μ規格（：淑297公釐） ------------^---1T------AWVI (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1255272 A7 B7 五、發明説明（61 ) 之患者身上。用於這類方法中之抗體可爲人類，擬人化， 嵌合型或非人類抗體，或其片段（如··抗原A 片段）， 並可爲如本文所描述之單株或多株抗體。而另一方面，本 發明特別說明給予患者那些從以A々蛋白肽免疫接種之人 類製備得來的抗體，其中之人類可爲該欲以抗體治療之患 者。 在另一方面，本發明特別說明給予患者一加上製藥載 體而成爲製藥組成物的抗體。或者，該抗體可藉由給予患 者一種編碼至少一抗體鏈之多核苷酸來給予。在患者體內 表現出該多核苷酸以製造抗體鏈。隨意地，該多核苷酸編 碼抗體之重和輕鏈。在患者體內表現該多核苷酸以製造重 和輕鏈。在示範之體系，監測所給予之抗體在患者血液內 的濃度。 因此，本發明可滿足用來預防或緩和神經病變，及在 某些患者體內與阿茲海默氏症相關的認知失調之治療法的 長期需要。 A ·應予治療之患者 應予以治療之患者包括處在疾病風險中，但未顯出症 狀之個體，以及正顯出症狀之患者。在阿茲海默氏症的情 況中。實際上，個人只要活得夠久，均會處於罹患阿茲海 默氏症的風險中。因此，本發明方法可預防性地給予一般 大眾，而不需要評估個體患者之風險性。本發明方法對已 知有阿茲海默氏症遺傳風險的個體而言尤其有用。這類個 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 $ 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -64_ 1255272 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 Α7 Β7 五、發明説明（62 ) 體包括那些有親戚罹患這類疾病的個人，及那些其風險係 經由分析遺傳或生化標記來決定的個人。指向阿茲海默氏 症之遺傳風險標記包括：在A P P基因中之突變，尤其是 在各稱爲、、哈迪〃 （Hardy )和史威迪須（Swedish )突變 之位置7 1 7和位置6 7。反6 7 1處的突變（見哈迪， 如上述）其它風險標記爲在早老基因，PS1和PS2， 及Ap〇E4中的突變，AD家族病史，高膽固醇血症， 或動脈硬化症。正罹患阿茲海默氏症之個人可從特徵性之 痴呆，及上述風險因子之存在來辨識。另外，有多種診斷 測試可用來鑑定那一位個體具A D。這些包括測量C S F 13 1!和厶/342之濃度。13 1^濃度增高和六占42濃 度減少表示有A D存在。罹患阿茲海默氏症之個人也可藉 由如實例章節中所討論之A D R D A要件來診斷。 在無症狀患者體內，可在任何年紀（如：1 〇，2 0 ，3 0 )時開始治療，然而，在患者達4 0， 5 0，6〇 ，7 〇歲前通常不需要開始治療。治療時通常需在一段期 間內給予數個劑量。治療可藉由在一段時間內分析抗體來 監測。若反應減低，則表7^需一加強之劑量。在可能有唐 氏症患者的情況中，治療方法可藉由替代給予母親一治療 劑，或在其出生後不久給予來開始 B .治療養生法和齊 在預防性的施用方法中係將足夠量之製藥組成物或醫 藥給予易受影響，或具阿茲海默氏症之風險的患者，以 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ 297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)
-65- 1255272 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（63) 除或減輕病症之風險，減輕嚴重性，或拖延發病的開始， 包括生化，組織學及或疾病的行爲症狀，在疾病發展情間 所呈現之倂發症和中間病理學表型。在治療性的應用中， 係將足夠量之組成物或醫藥給予懷疑，或已罹患這類疾病 的患者，以治癒，或至少部分遏止疾病之症狀（生化，組 織學及/或行爲），包括其倂發症和疾病發展過程中之中 間病理學表型。 在某些方法中係給予藥劑以減低或排除在尙未發展出 特徵性阿茲海默氏病理之患者體內的肌肉認知失調。達成 治療或預防性治療目的之適當量的定義爲治療上或預防上 之有效劑量。在預防和治療養生法中，通常係給予數種劑 量之藥劑直到達到足夠的免疫反應。、免疫反應〃或 ''免 疫學反應〃包括那些針對在接受者個體內之抗原的體液性 (由抗體所傳介者）及/或細胞性（由抗原-特異性T細 胞或其分泌產物所傳介者）反應。這類反應可爲一種主動 反應，也就是：經由給予免疫原所誘導出者，或被動反應 ，也就是：經由給予免疫球蛋白或抗體或已接觸抗原之T -細胞來誘導出者。 'v致免疫試劑"或〜免疫原〃能在被給至哺乳動物後 (隨意地加上一佐劑）誘導出一針對其本身之免疫反應。 通常需監測免疫反應，且若免疫反應開始降低時需給予重 覆劑量。 用於治療上述狀況之本發明組成物的有效劑量係根據 許多不同因子而有不同，包括：給予方法，標的位置，患 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
-66 - 1255272 A7 -- B7____ 五、發明説明（64 ) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 者之生理狀態，該患者是否爲動物或人類，其它給予的醫 藥品及該治療爲預防或治療性質。通常，該患者爲人類， 但亦可用來治療非-人類之哺乳動物，包括導入外來基因 之哺乳動物。所使用之治療劑量必須進行滴定，以使其安 全性及有效性達到最優。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 在以抗體進行被動免疫方面，該劑量係從約 0 · 0 0 0 1至1 0 〇毫克/公斤宿主體重且更常爲 〇· 0 1至5毫克/公斤宿主體重。例如：劑量可爲1毫 克/公斤體重或1 0毫克/公斤體重，或在1 一 1 〇毫克 /公斤之範圍內，而宜爲至少1毫克/公斤。可每天給予 個體這類劑量，或隔天給予，或每週給予一次，或根據其 它憑經驗分析所決定的時間表。一種示範治療法爲：在一 段延長期間（如：至少6個月）中，需要給予多數劑量。 其它示範性之治療養生法需每二週給藥一次或每月給藥一 次，或每3至6個月給藥一次。示範之給藥時間表包括： 當連續每天給藥時，給予1 - 1 0毫克/公斤或1 5毫克 /公斤，在隔天給藥時，給予3 0毫克/公斤，或每週給 藥6 0毫克/公斤。在某些方法中，可同時給予具不同連 接特異性之二或多種單株抗體，在此情況中，所給予之各 抗體的劑量係在所指明之範圍內。 抗體通常係在多種時期中給予。介於單一劑量間的期 間可爲每週，每個月或每年。間隔期亦可藉由測量患者體 內對抗A /3之抗體的血液濃度結果而變更爲不規則。在某 &方法中，調整劑量，以使血獎丨几體濃度爲1 - 1 〇〇0 本紙張尺度適用中國國家標準（cns )A4規格（210x 297公釐） -67- 1255272 A7 B7 五、發明説明（65 ) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 微克/毫升，而在某些方法中爲2 5 一 3 〇 〇微克/毫升 。或者，可以持續釋出之配方型式來給予抗體，在此情況 中，所需之給藥頻率較低。劑量和給藥頻率係根據患者體 內之抗體半生期而有不同。一般來說，人類抗體顯示出具 最長的半生期，其次則爲嵌合型抗體，及非人類抗體。 給予之齊J S和頻率可根據該治療爲預防性或治療性而 有不同。在預防性應用中，係將含本發明抗體之組成物或 其混合物給予尙未處於疾病狀態中的患者，以加強患者之 抵抗力。這類劑量係定義爲、、預防性有效劑量"。在此用 途中，確實之劑量亦是根據患者之健康和一般免疫力而有 不同，但每劑量一般係在〇 . 1至2 5毫克的範圍內，尤 其是在每劑量爲〇 . 5至2 · 5毫克的範圍內。在一段長 時間內係以相當不頻繁之間隔期，給予相當低的劑量。某 些患者終生持續接受治療。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 在治療應用中，有時需要在非常短的間隔期中，給予 相當高的劑量（如：每劑量從約1至2 0 0毫克之抗體， 更常使用的爲從5至2 5毫克），直到疾病的進程減緩或 終止，且宜持續至患者顯示出疾病症狀部分或完全改善。 然後，可給予該患者一預防性養生法。 編碼抗體之核酸的劑量範圍係爲每患者約1 〇毫微克 至1克，100毫微克至100毫克，1微克至10毫克 或3 0 - 3 0 0微克DNA。感染性病毒介體之劑量係每 劑量約1 0 - 1 0 0，或更多的病毒顆粒。 可藉由下列途徑來給予預防性及/或治療性治療：非 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） - 68- 1255272 A7 B7 五、發明説明（66 ) 注腸胃道，局部，靜脈內，口腔，及下，動脈內，顱內， 腹膜內，鼻內或肌肉內。最典型之致免疫試劑給予途徑爲 皮下，但其它途徑亦可同樣有效。次常用之途徑爲肌肉內 注射。此型注射最常執行於手臂或腿部肌肉中。在某些方 法中，係將試劑直接注入一已有沈積物累積的特殊組織內 ，例如：顱內注射。肌肉內注射或靜脈內注入爲較佳之抗 體給予法。在某些方法中，抗體係以持續釋出之組成物或 裝置（如：MedipanTM裝置）的型式來給予。 本發明之試劑可隨意地與其它至少能部分有效治療產 生澱粉樣變性之疾病的試劑一同給予。在阿茲海默氏症和 唐氏症的情況中（其中有澱粉樣沈積發生在腦中），也可 將本發明試劑與其它可增加本發明試劑穿過血液-腦障壁 之試劑一同給予患者。 C .製藥細成物 本發明之試劑通常係以含一活性治療劑，及多種其它 製藥上可接受之成分的製藥組成物來給予患者。見：雷明 頓製藥科學（第1 5版，馬克出版公司，賓州伊斯頓（ 1 9 8 0 ))。較佳之型式係根據欲給予之模式和治療應 用而定。本組成物也可包括（根據所需之配方）製藥上可 接受之非毒性載體或稀釋劑，這些載體或稀釋劑之定義爲 :常用來調配給予動物或人類之製藥組成物的賦形劑。選 擇之稀釋劑需使其不要影響組合物之生物活性。這類稀釋 劑之實例有：蒸餾水，生理學上之磷酸-緩衝生理食鹽水 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21〇x297公釐） — (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -69 - 1255272 Α7 Β7 五、發明説明（67 ) ，林格氏液，右旋糖溶液，及漢克氏（HatiL2 )溶液。另 外，製藥組成物或配方亦可包括其它載體，佐劑，或非毒 性，非治療性，非致免疫性穩定劑，等。 製藥組成物也可包括大型，緩慢代謝之巨分子，如： 蛋白質，多醣類，如：聚甲殼糖，聚乳酸，聚乙醇酸和共 聚物類（如：膠乳-機能化之瓊脂糖凝膠（T Μ )，瓊脂 糖，纖維素，等），聚合的胺基酸，胺基酸共聚物，及脂 質凝集物（如：油滴或脂粒）。另外，這些載體可做爲免 疫剌激劑（也就是佐劑）。 在非經腸胃道給藥方面，本發明之試劑可以一加上製 藥載體之置於生理學上可接受之稀釋劑中的物質溶液或懸 浮液注射劑型來給予，該製藥載體可爲一無菌液體，如= 水，油，生理食鹽水，甘油，或乙醇。另外，組成物中亦 可存在輔助物質，如：濕潤劑或乳化劑，界面活性劑， Ρ Η値緩衝物質，等。製藥組成物之其它成分爲那些石油 ，動物，蔬菜，或合成來源之成分，如：花生油，大豆油 ，礦物油。一般來說，二醇類，如：丙二醇，或聚乙二醇 爲較佳之液態載體，尤其適用於可注射之溶液。抗體可以 貯存注射藥或植入製品型式來給予，其可以，如：讓活性 成分持續釋出之這類方式來調配。一種示範性組成物，其 含有5毫克/毫升之單株抗體，且調配於由如下群體所組 成之水溶性緩衝液中：5 m M L -組織胺，1 5 0 m Μ NaCl，以 HC1 調爲 ρΗ6·0。 通常，組成物係製成可注射之液體溶液或懸浮液型式 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
、1T 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -70- 1255272 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（68 ) ;也可製備成適合在注射前溶於，或懸浮於液態賦形劑中 的固體型式。該製品亦可乳化於或包來於脂粒或微粒中， 如：聚乳酸交酯，聚乙交酯，或如上述討論之用於增強佐 劑效果的共聚物中（見，藍格，科學2 4 9 : 1 5 2 7 ( 1 9 9 0 )和漢尼斯，進階藥物遞送回顧2 8 : 9 7 ( 1 9 9 7 ))。本發明之試劑可以貯存注射物或植入物製 品之型式來給予，其可調配成能讓活性成分持續或搏動釋 出的型式。 其它適合用於其它給藥模式的配方包括：口服，鼻內 ，及肺部配方，栓劑和穿皮敷藥。在栓劑方面，連接劑和 載體包括，如：聚烷二醇類或三酸甘油酯類；這類栓劑可 以從那些含有0 . 5 %至1 0 %活性成分（宜爲1 % - 2 % )的混合物形成。口服配方包括：賦形劑，如：製藥級 甘露糖醇，乳糖，澱粉，硬脂酸鎂，鈉醣，纖維素，和碳 酸鎂。這些組成物的型式有溶液，懸浮液，錠劑，藥九， 膠束，持續釋出之配方或粉末，且含有1 0 %〜9 5 %之 活性成分，而以含2 5 % - 7 0 %較佳。 局部施放可得到穿皮或皮內遞送。藉由共同給予帶有 霍亂毒素或其脫毒之衍生物或次單位或其它類似之細菌毒 素的試劑可幫助局部給予（見：格藍，等，自然3 9 1， 8 5 1 ( 1 9 9 8 ))。共同給予可藉由使用爲混合物型 式之成分或爲連接分子型式之成分（其係藉化學性交叉連 接取得）來達成或以融合蛋白質來表現。 或者，穿皮遞送可藉使用皮膚貼布或利用傳送體（ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） ΛΨ r ^ ΛΨ (請先閲讀背面之注意事項存填寫本頁) -71 - 1255272 A7 B7 五、發明説明（69 ) iransferosome)來達到（保羅，等，Eur. J. Immunol. 25: 3 5 2 1 ( 1 995); Cevc，等之 Biochem. Biophys. Acta 1 3 68: 20 1 15(1998))。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁} 1偵察治療的涂稈 本發明提供用來偵察在阿茲海默氏患者體內之治療的 方法，也就是，偵察該給予患者之治療的過程。此方法可 用來偵察對有症狀之患者的治療性治療，及對無症狀患者 之預防性治療。尤其是，此方法可用來監測被動免疫（如 :測量所給予之抗體的濃度）。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 某些方法需要在給予一劑量之試劑前，先決定如：在 患者體內之抗體濃度或略圖的基線値，以將其與治療後之 略圖或濃度値相比較。當濃度或略圖値顯著增加時（也就 是：在重覆測量相同樣本時高於典型之實驗誤差極限，以 這類測量之平均値的一個標準差來表示）則爲正向治療結 果的信號（也就是，給予該試劑已達到所需之反應）。若 該免疫反應値並未顯著改變或降低，則表示該治療結果爲 負向。 在其它方法中，決定一對照族群之濃度或略圖的對照 値（也就是：平均値和標準差）。通常，在對照群中之個 體並未接受先前治療。然後，在給予患者治療劑後，測量 其體內之濃度和略圖値，再將此値與對照値比較。若結果 相對於對照値而言，爲顯著增加（高於一個平均値標準差 )的値時，見此爲正向而充分之治療結果的信號。若無顯 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） -72- 1255272 A7 B7 五、發明説明（7〇) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 著增加，或降低的値，則爲負向或不充分之治療結果的信 號。一般來說，當濃度相對於對照値而言，爲持續增加時 ，則持續給予試劑。如前述，相對於對照値而言，濃度係 維持在高原期時，則此爲可中斷治療性給藥，或減少劑量 及/或頻率的指標。 在其它方法中，濃度或略圖之對照値（如：平均値及 標準差）係從那些已接受治療劑之治療，且其對治療之反 應的濃度或略圖係維持在高原期的對照群中決定。測量患 者體內之濃度或略圖値，並將其與對照値比較。若在患者 體內之測量値並未與對照値顯著不同（如：超過一個標準 差），則可中止治療。若在患者體內之濃度顯著低於對照 値，則可持續給予治療劑。若患者體內之濃度持續低於對 照値，則可能是表示需要改變治療。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 在其它方法中，偵察一目前未接受治療但先前已接受 一療程之患者體內的抗體濃度或略圖，以決定是否需恢復 治療。將於患者體內所測得之濃度或略圖與先前經過一段 療程後，於患者體內所測得之値相比較。相對於先前之測 量値而言，明顯降低的値（也就是在重覆測量相同樣本時 ，大於典型的誤差極限）係表示可重新開始治療。或者， 可將於患者體內所測得之値與從那些已經過一段療程之患 者群中所測得之對照値（平均値加標準差）相比較。或者 ，可將在患者體內所測得之値與從那些接受預防性治療且 維持無疾病症狀之患者群，或接受治療性治療且顯示出疾 病已緩和之特性的患者群體內所測得之對照値相比較。在 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） -73 - 1255272 A7 B7 五、發明説明（71) 所有這些情況中，相對於對照値而言，明顯降低的値（也 就是超過一標準差）係表示患者應重新開始接受治療。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 用於分析之組織樣本通常係來自患者之血液，血漿， 血淸，黏膜液或腦脊髓液。分析該樣本中之如：對抗A冷 蛋白肽之抗體的濃度或略圖，如：擬人化抗體之濃度或略 圖。該用來偵測特異於A卢之抗體的E L I S A法說明於 實例部分。在某些方法中，所給予之抗體的濃度或略圖係 利用淸除分析來決定，如：本文所描述之玻管內吞噬作用 分析。在這類方法中，將來自測試患者之組織樣本與澱粉 樣沈積物（如：來自P D A P P老鼠）和帶有F c受體之 吞噬細胞接觸。然後，偵察接下去之澱粉樣沈積的淸除作 用。有無淸除反應存在及此反應之程度可提供在受測患者 之組織樣本內，是否有能有效淸除A /3之抗體存在及其濃 度的指標。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 通常，在經過被動免疫後之抗體略圖會顯示出一抗體 濃度的立即尖峰，接下去的則爲指數衰退期。當無進一步 之劑量時，此抗體會根據所給予之抗體的半生期，而在數 天到數月間衰退到接近治療前的濃度。例如：某些人類抗 體之半生期的規律爲2 0天。 在某些方法中，給藥前需先測量患者體內之抗體對 A 的基線値，給藥後，立即進行第二次測量，以決定尖 峰抗體濃度，然後，每隔一段時間進行一或多次測量以偵 察抗體濃度的衰退情形。當抗體濃度已降至基線値或該預 先決定之尖峰百分比已低於基線時（如：5 0 %，2 5 % 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -74- 1255272 A7 B7 五、發明説明（72) 或1 0 % )，需再給予另一抗體劑量。在某些方法中係將 然後，將此二 它患者體內之 之抗體濃度明 考濃度（如：低於平均値減去一個參考値標準差 測得者），則 尖峰濃度 値與預先 有益的預 顯低於參 ，而該參 表示需給 其它 察任何由 狀），以 海默氏症 默氏症及 它特徵的 或接下去之測量濃度減去背景値， 決定之參考濃度相比較以建立在其 防性或治療性治療養生法。若測得 考値係在受益於治療之患者群中所 予額外劑量之抗體。 方法包括在整個療程中，由硏究者 本技藝所辨識之生理學症狀（如： 診斷或偵察該產生澱粉樣變性之疾 )。例如：個人可偵察認知失調。 唐氏症之症狀，但亦可在無這些疾 情況下發作。例如：認知失調可藉 或醫師例行偵 生理或心理症 病（如：阿茲 後者爲阿茲海 病之任一種其 由在整個療程 中，根據常規決定患者之 ''迷你-心理狀態檢查〃積分來 監測。
經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 C .套組 本發明還提供用於執行上述偵察方法的套組。通常， 這類套組含有可特異連接抗A 之抗體的試劑。此套組亦 可包括一種標示。爲了偵測抗A /3之抗體，此標示通常爲 經過標示之抗-特應型抗體之型式。爲了偵測抗體，可將 此試劑以預先連接至一固相（如：連接至一微量滴定盤之 凹槽上）上的型式供應。套組中通常也含有使用該套組之 標示裝備的指示。該標示也可包括一用來將所測得之標示 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） - 75- 1255272 A7 B7 五、發明説明（73) 濃度與抗A /3抗體之濃度做相關對照的圖表或其它類似之 體制。'"標示〃 一詞係指任何在套組之製造，轉運，銷售 或使用期間中，附於或伴隨此套組之書寫或記錄物質。例 如：、標示"一詞包含說明書和小冊，包括物質，指示， 錄音或錄影帶，電腦碟片，以及那些直接書寫印刷於套組 上者。 本發明也提供診斷套組，例如：硏究，偵測及/或診 斷用套組（如：用於執行活體內成像者）。這類套組通常 含有一用來連接A/3之抗原決定部位（以在殘質1 一 1 〇 內者較佳）的抗體。較合適的爲，該套組加上用於執行所 需用途的指示標示，例如：用於執行活體內成像分析。抗 體的實例爲那些本文所描述者。 D .活體內成像 本發明提供在患者體內反映澱粉樣沈積之影像的方法 °這類方法可用來診斷或確認阿茲海默氏症的診斷，或對 其之感受性。例如，本方法可用在具痴呆症狀的患者身上 。若該患者具異常之澱粉樣沈積，則該患者可能罹患阿茲 海默氏症。本方法亦可用在無症狀患者上。呈現異常之澱 粉樣沈積表示對未來之徵候疾病具感受性。本方法也可用 來偵察已診斷出染有阿茲海默氏症之患者的疾病進程和對 治療內的反應。 本方法係經由下述步驟來進行：給予患者一試劑，如 :連接A yS之抗體，然後，待該試劑已連接後再偵測之。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -76- 1255272 A7 B7 五、發明説明（74 ) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 較佳之抗體可在患者體內連接A /3沈積物而不會連接全長 之AP P多肽。連接在胺基酸1 一 1 〇內之A/S抗原決定 部位的抗體尤其較佳。在某些方法中，該抗體係連接在 A冷胺基酸7 - 1 0內之抗原決定部位。這類抗體通常在 連接後不會誘導出實質的淸除反應。在其它方法中，該抗 體係連接在A /3胺基酸1 - 7內之抗原決定部位。這類抗 體通常可連接A /3並誘導出一淸除反應。然而，該淸除反 應亦可藉由使用缺少全長之恆定區的抗體片段（如： F a b s )來避免。在某些方法中，相同抗體可同時做爲 治療和診斷試劑。一般來說，連接對著A /3殘質1 〇之C 端抗原決定部位的抗體不會顯示出與該連接，殘質1 -1 0內之抗原決定部位的抗體一樣強的信號，這可能是因 爲在澱粉樣沈積中之C -端抗原決定部位較難接近。因此 ，這類抗體爲較差者。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 診斷試劑可經由下列途徑來給予：經由靜脈內注射入 患者體內，或藉由顱內注射或經由鑽一個通過頭骨的孔來 直接注入腦部。試劑之劑量應與治療方法中所使用的劑量 。範圍相同。通常，該試劑係經過標示，但在某些方法中 ，對A yS具親和力之一級試劑爲未標示者，而使用第二標 示試劑來連接一級試劑。標示之選擇係根據偵測方式而定 。例如：螢光標示可適用於光學偵測。順磁性標示可適合 用於不需使用手術的X光斷偵測層。放射活性標示也可利 用P E T或S P E C T偵測。 藉由將經標示之位點的數目，大小，及/或強度與相 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -77- A7 B7 1255272 五、發明説明（75) 對應之基線値相比較來執行診斷。該基線値可代表在未染 病之個體群中的平均値。基線値也可代表在相同患者體內 所預先決定的値。例如：基線値可在患者開始治療前先決 定，然後將治療後之測量値與基線値相比較。相對於基線 値而言，降低的數値表示對該治療爲正向反應的信號。 本發明藉下列非限制性實例做更完整的說明。 實施例 y 例 I .杭一A /9 抗體：m A b 2 Η 3，m A b 」0 D 5，m A b 2 6 Γ)，m A b 2 1 F 1 2 和 _p A b A/31 — 42 之療效 本實施例測試不同單株抗體和多株抗體對抗A ，以 抑制A 在異型接合之導入外來基因小鼠腦中堆積的療效 A .硏究設計 從查爾斯河（C h a r 1 e s R i v e r )實驗室取得6 0隻公和母 異型接合之PDAPP導入外來基因小鼠，其年齡爲 8 . 5至1 0 · 5個月大。將小鼠分成6組，並以針對 A yS之不同抗體治療之。儘可能將動物分配成在各組內之 動物的性別，年齡親代及來源相符。表2描述此實驗設計 C请先閱讀背面之注意事項存填寫本頁)
經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -78- 1255272 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（76 ) 表2 :實驗設計 治療組 N a 治療抗體 抗體特異性 抗體同質體 1 9 紐 (單獨之PBS) NAb ΝΑ 2 10 多株 Αβ1-42 混合的 3 0 mAbd 2H3 Αβ1-12 IgGl 4 8 m Ab 1 0D 5 A33-7 IgGl 5 6 mAb 266 Αβ13-28 IgGl 6 8 mAb 21F12 Αβ33-42 IgG2a a·在實驗終止時，組內之小鼠數。每組開始時均爲i〇隻動物 b . N A :不適用 c. 老鼠多株：抗集結之Α β 4 2 d. mAb:單株抗體 如表2中所顯示者，該抗體包括四種老鼠A /3 -特異 性單株抗體·· 2 Η 3 (針對A /3殘質1 - 1 2 )， 1〇D 5 C針對A /3殘質3 — 7 ) ， 2 6 6 (針對A /3殘 質1 3 - 2 8，且連接至可溶的，但不連接集結的 AN1792)， 21F12(針對 A/3 殘質 33 — 42 )。第5組係以A /3 -特異性多株抗體部分（藉由免疫接 種A N 1 7 9 2所引起者）來治療。陰性對照組所接受的 爲僅含P B S之稀釋劑，無抗體。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
-79- 1255272 A7 _—_ __B7 五、發明説明（77 ) 旦貞察治療過稃 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 單株抗體的注射劑量爲約1 〇毫克/公斤（假設小鼠 稱重5 0克）。在整個2 8週的治療中均偵察抗體效價。 平均每七天經腹膜內注射給藥，以維持抗一 A /3之效價高 於1 0 0 0。由於m A b 2 6 6無法良好連接本分析中 做爲捕捉抗原之集結型A N 1 7 9 2，因此所測得之效價 較低，但本組仍維持相同的給藥計劃。接受單株抗體 2 Η 3的組別則由於該抗體在活體內淸除得太快，因此在 前三週即停止給藥。 爲了決定抗體效價，從各組中任意選出三隻小鼠，將 此分組在各次腹膜內接種前先抽血，共得到3 0個抽血樣 本。依〜一般材料和方法〃中的詳細說明，在塑膠製之多 槽盤內覆上一層Α沒1—42，利用三明治ELISA方 法，以A /3 1 - 4 2連接抗體的型式來測量抗體效價。各 血液樣本之多株抗體1 0D 5和單株抗體2 1 F 1 2的平 均效應列於表3中。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） -80- 1255272 A7 B7 五、發明説明（78 ) 表3: 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 21F12 週數 21F12 10D5 週數 10D5 多株週數 多株 0.15 500 0.15 3000 0.15 1600 0.5 800 0.5 14000 0.5 4000 1 2500 1 5000 1 4500 1.5 1800 1.1 5000 1.5 3000 2 1400 1.2 1300 2 1300 3 6000 2 3000 3 1600 3.5 550 3 4000 3.5 650 4 1600 3.5 500 4 1300 5 925 4 2400 5 450 6 3300 5 925 6 2100 7 4000 6 1700 7 1300 8 1400 7 1600 8 2300 9 1900 8 4000 9 700 10 1700 9 1800 10 600 11 1600 10 1800 11 600 12 1000 11 2300 12 1000 13 1500 12 2100 13 900 14 1300 13 2800 14 1900 15 1000 14 1900 15 1200 16 1700 15 2700 16 700 17 1700 16 1300 17 2100 18 5000 17 2200 18 1800 19 900 18 2200 19 1800 20 300 19 2500 20 1200 22 1750 20 980 22 1000 23 1600 22 2000 23 1200 24 1000 23 1000 24 675 25 1100 24 850 25 850 26 2250 25 600 26 1600 27 1400 26 1100 27 1900 28 27 1450 28 28 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -JAW.
，1T 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X 297公釐） -81 - 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1255272 A7 ___ B7 _ _ _ 五、發明説明（79 ) 多株抗體製品在這段期間內之效價平均約1 Q 〇〇， 而以1 0 D 5 -和2 1 F 1 2處理過的動物，其値稍高於 此程度。 治療共持續6個月長，共1 9 6天。在給予最後一個 劑量的一週後將動物安樂死。 腦中之A /3和A P P濃度 以不同之抗- A /3抗體製品治療6個月後，先灌注生 理食鹽水再將動物的腦移出。準備一腦半球以用於免疫組 織化學分析，而另一半則用於定量A yS和A P P濃度。爲 了測量不同型式之/3澱粉樣多肽和澱粉樣先驅蛋白質（ A P P )之濃度，解剖該腦半球，並將海馬區，皮質區和 小腦區於5 Μ胍中製成均質液。將這些均質液做系列稀釋 ，並藉由與一系列在EL I SA格式中，已知濃度之Α冷 蛋白肽或A P P的標準稀釋液相比較來定量澱粉樣蛋白肽 或A P P的濃度。 藉由E L I S A所測得之皮質區和海馬區均質液中的 全部A ^和A /3 1 — 4 2濃度，及小腦區均質液中之全部 A /3濃度分別顯示於表4，5，和6中。在海馬區中，以 P B S接種之對照組的全部A /3中位數濃度比在皮質區中 者高出3 _ 6倍（與皮質區之1 7 8 1 8毫微克/克組織 相較下，海馬區的中位數爲6 3 3 8 9毫微克/克組織） 。對照組之小腦區中位數濃度（3 0 . 6毫微克/克組織 )比海馬區中者低2 0 0 0倍。這些濃度類似於先前所報 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） ΛΨ----»—、τ*----JttT (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) -82- 1255272 A7 _ B7 ' ' """ — 一 五、發明説明（80 ) -- 導之此年齡的異型接合P D A P P導入外來基因小鼠所具 有的濃度（強生-伍德，等，如上述）。 在皮質區方面，有一治療組具有與對照組明顯不同之 中ίιι數A /3濃度（p〈 0 · 0 5 )，此中位數a /3濃度係 以A々1 - 4 2來測量，在該治療組中的那些動物係接受 如表4中所顯示之多株抗- A /3抗體。與對照組相比，此 治療組之A /3 1 — 4 2中位數濃度減少6 5 %。在另一接 受m A b 1 0 D 5的治療組中，與對照組相比下，其 A/31 — 42之中位數濃度亦顯著（p = 0 · 0433) 減少5 5 %。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） -83- 1255272 A7 B7五、發明説明（81 ) 寸術 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 iM Αβ42 ELISA 値 12621+/-5738 4454+/.3347 6943+/-3351 7489+/-6921 11005+/-6324 全部Αβ ELISA 値 16150+/-74566 5912+/-4492 9695+/-6929 9204+/-9293 12481+/-7082 Αβ42 %改變 < 1 1 On cn CN ig Ph c 2 0.0071 0.0433 1 0.1255 0.7003 ELISA 値 13802 4892 6214 8481 13578 Se 全部Αβ %改變 < 2 in VD VO On 1 ο i® Ph Z 0.0055 0.1019 0.1255 0.2898 ELISA 値匕 17818 6160 7915 9144 15158 CTn O 〇〇 OO 治療組 PBS 多株抗-Αβ42 mAb 10D5 mAb 266 mAb 21F12 _»©•❸ 旺賴κ:νΜ·ρ (sisA^UB A9u.rqAV υυυΗ)^φκ^»·Λ·〇 够5职/职藜«•q 籲擊«^題®盤X錾盤、« ‘I+H細 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)
本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X 297公釐） -84- 1255272 A7 B7 五、發明説明（82 ) 在海馬區中，與以多株抗- A yS抗體治療相關之全部 A /3的中位數百分比的降低程度（5 0 %，P二 0.0055)並不如在皮質區中（65%)(表5)所 觀察到者那廣大。然而，在海馬區中所減少之絕對幅度幾 乎是高於在皮質區中之3倍，在海馬區中淨減少 3 1 6 8 3毫微克/克組織，而在皮質區中係淨減少 1 1 6 5 8毫微克/克組織。當所測量的爲A yS，A /3 1 - 4 2這類更爲致澱粉樣變性之型式的濃度，而非全部A 的濃度時，以多株抗體所得之減少程度爲顯著的（P = 〇.0025)。以mAbs 10D5和266處理之 治療組的中位數濃度各減少3 3 %和2 1 %。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)
、1T 經濟部智慧財產局員工消費合作杜印製 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） - 85- 1255272
A
7 B 五、發明説明 、—/ 3 8 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 Μ Μ < 3 ι-1 ι-( r—i g CO un csi C^l oo t—< CO uo oo 1-< 卜 τ—Η υη \ο ΓΟ CN ιη 0<1 σ\ r—~i 〇\ CN1 cn On cn C^l s s I^L ja < w o cn CO \ ί i\ un cn oo L〇 CN! oo o cn CNI cn VD οο ΐ ( 1 r—i οο CO T—( s CO 〇5 On OO CNl uo CN <c Μ c z 1 CO cn CN T—H 1 Ρη C 2 un csi O 〇 S Ο § g o On On g 〇 1Μ < 3 w On CN 言 uo r—H ο σ> CN1 VD cn 艺 o i I VO CTn fc£l 书n 制 孕 Μ < z CS cn CNl On ο iM Ρη Z lJ〇 o 〇 UO ο ο 冢 g o OO CN) r- o G\ 00 cn cn Ό 卜 \ < CO α\ 寸 ON oo VsO 等 CO VD υη ,—< uo On o οο oo 〇0 PQ PLh i # Q ο r-H ε VO (Nl s cs r—H Ph a 旺濶νΜ·ρ ®3职/职義w,q 籲髮«£璁谢篮^燊盤、|1(^ --------MWII(請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 、11 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） -86- 1255272 A7 B7 五、發明説明（84 ) 在小腦區中亦測量全部Α β (表6 )。那些接受多株 抗-A 及2 6 6抗體的群體顯示出全部A Θ濃度已顯著 減少（各爲4 3%和46%，P = 〇.0〇33和P = 〇.0 1 8 )，而以1 〇 D 5治療過的組；其降低程度近 似顯著（2 9 %， P = 〇 ，〇 6 7 5 )。 表6 小腦區 治療組 N a 中位數 平均値 全部A /3 全部A /5 ELISAfg b %改變 ELISA 値 PBS 9 30.64 NAd ΝΑ 40.00 + /-3 1.896 多株抗-Αβ42 10 17.61 0.0033 -43 18.15 + /-4.36 m Ab 1 0D 5 8 21.68 0.0675 -29 27.29 + /- 19.43 mAb 266 6 16.59 0.0184 -46 19.59 + /-6.59 mAb 21F12 8 29.80 >0.999 -3 32.8 8 + /-9.90 番 ,——-w--- (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 a. 實驗終了時每組的動物數 b. 毫微克/克組織 c. 曼•惠特尼分析 d. NA:不適用 e. 標準差 亦可藉E L I S A來測定來自抗體治療組，及對照組 經P B S治療過）之小鼠皮質區和小腦區中的A P P濃度 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -87 - 1255272 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（85) 。使用二種不同的A P P分析。第一種，定名爲A P P -a / F L，其辨識A P P — a ( α，先爲已在A 序列內 分裂過之APP分泌型），及APP全長型，而第二種不 僅辨識A P P - α。相對於在一治療分組中，因治療關係 而使A /3減少，在所有治療組中，A Ρ Ρ之濃度與對照組 動物相比下實際上並沒有改變。這些結果表示以A /3抗體 來進行免疫時，只損耗A /3而不會損耗 A P P 〇 總括而g，在以對抗A N 1 7 9 2之多株ί几體治療過 的動物體內，皮質區，海馬區和小腦區中的A /3濃度顯著 減少。較低濃度之對抗Α θ 1 - 4 2的胺基端區，尤其是 對抗胺基酸1 一 1 6和1 3 - 2 8的單株抗體也顯示出顯 著的治療效果。 D · 組織化學的分析 將來自PBS，多株抗體A/342，21F12， 2 6 6和1 〇 D 5治療組之小鼠大腦分組中的A /3 -免疫 反應斑與來自先前以A /3 4 2，依照標準免疫步驟所進行 之硏究中的反應斑進行型態方面的定性比較。 澱粉樣斑之程度和外形改變最大的情形係發生在以多 株Α Θ 4 2抗體免疫的動物體內。該澱粉樣負載量減少的 程度，受侵蝕之斑形態，及與細胞相關的A ^免疫反應性 很像由標準之免疫步驟所產生的效果。這些觀察支持 E L I S A的結果，其中藉由給予多株A /3 4 2抗體可顯 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)
-88- 1255272 A7 B7 五、發明説明（86) 著降低全部A /3和A /? 4 2。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 在類似之定性評估中，1 〇 D 5組中之澱粉樣斑的數 目和外形亦減少，帶有些與細胞相關之A /3免疫反應性的 證據。相關於經對照處理的動物，該對抗A /3之多株I g 部分及單株抗體之一（1 〇 D 5 )可各減少澱粉樣斑之負 載量93%和81%(p<0.〇〇5) °21F12對 澱粉樣斑負載量顯示出相當有限的效果。以p A b A 1 - 4 2治療後之腦部顯微鏡檢查顯示出瀰漫的沈積物，且 相關於經對照處理之動物，在經p A b A石1 - 4 2治療 過的組別中，缺少許多較大之緻密斑塊。 E .類淋巴組織增牛反應 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 在最後一次注入抗體後八天，收集脾臟細胞，利用此 細胞來測量Α yS -倚賴性類淋巴組織增生。將新鮮採集之 細胞（每槽1 0 5個細胞）在有濃度5 // Μ之A石1 一 4 0 的存在下（用於剌激作用），培養5天。將額外細胞與T 細胞有絲分裂因子一同培養以做爲陽性對照組，另外，將 細胞不外加蛋白肽單獨培養，以做爲陰性對照組。 在玻管內，以A N 1 7 9 2剌激來自老化之 P D A P P小鼠的脾臟細胞（該小鼠係以不同之抗一 A 抗體被動免疫過），並測量增生反應和細胞活素反應。這 些分析的目的係用來決定被動免疫作用是否會促進抗原呈 現，且因此而激活T細胞特異於A N 1 7 9 2的免疫反應 。在經抗- A yS抗體被動免疫過之小鼠體內並沒有觀察到 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -89 - 1255272 五、發明説明（87) A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A N 1 7 9 2 — 特 異 性 增 生 或 細 胞 活 素 反 應 〇 實 施例 Π . 抗 A 抗 p A b 2 Η 3 m A b 1 0 D 5 y 111 A b 2 6 丄X丄 1XL A b 2 1 F 1 2 111 A b 3 D 6 y m A h y 1 R c 1 1 和 Ρ A b A X 1 一 的 療 效 丄 \J 丄 在 第 二 種 硏究 中 y 重 覆 該 以 1 〇 D 5 進 行 的 治 療 並 測 §式另外二 種 抗 A β — 抗 體 • 單 株抗 體 3 D 6 ( A β 1 一 5 )和 1 6 C 1 1 ( A β 3 3 — 4 2 ) 〇 對 照 組 係 接 受 P B S 或 不 相 關 之 同 質 體 — 相符 抗 骨趄 ( Τ Μ 2 a ) 〇 小 鼠 的 年紀 較 先 ,Λ. 刖 硏 究 中 者 大 ( 1 1 . 5 一 1 2 個 月 大 之 異 型 接 合體 ) 或 者 爲 相 同 的 實 田a 設 計 〇 同 樣 的 ， 在 治 療 6 個 月 後， 相 對 於 接 受 Ρ B S 或 同 質 體 — 相符抗 體 之 對 照 組 而 言 ，1 0 D 5 組 之 斑 負 載 量 減 少 超 CJH, 過 8 0 % ( P 〇 • 0 〇 3 ) 0 另 — 種 對 抗 A β 之 抗 體 ， 3 D 6 與 1 0 D 5 效 果相 等 > 可 減 少 8 0 % ( Ρ 二 0 • 0 0 3 ) 〇 相 反的 第 二 種 對 抗 該 蛋 白 肽 之 抗 體 y 1 6 C 1 1 y 對 斑 負 載量 不 具 任何 效 果 〇 以 A β 4 2 E L I S A 測 量 可 取 得 類似 的 結 果 〇 這 些 結 果 證 明 Μ j\\\ T 細 胞 免 疫 性存在時 對 抗 A β 蛋 白 肽 之抗 體 反 !m 已 足 夠 減 少 P D A P Ρ 小 鼠 體 內 之 澱 粉 樣 沈 積 ，但 並 非所有抗 — A β 抗 體 均 同 等 有 效 〇 針 對 含有 A β 胺 基酸 1 — 5 或 3 — 7 之 抗 原 決 定 部 位 的 抗 體 爲 特別有 效 的 抗體 0 總 言 之 ， 結 果 可 證 明 被 動 給 予 對 抗 A β 之 抗 體 ( 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X29?公釐） ------------^---1T----— (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -90- 1255272 A7 B7 五、發明説明（88 ) 也就是被動免疫）可減少在阿茲海默氏症之老鼠模型中的 澱粉樣斑沈積程度。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 實施例m :偵察在c n s中之抗體連接 本實驗證明當保持在適當之血淸濃度（2 5 - 7 0微 克/毫升）時，該抗體可以足夠濃度接近C N S以修飾/5 一激粉樣斑。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 爲了證明對抗A /3之抗體是否能直接在C N S內作用 ，檢查在實施例Π終了時，從經生理食鹽水灌注過之小鼠 身上取出的腦，以確定是否有經周圍途徑給予的抗體。將 未固定之冷凍腦切片暴露於對抗老鼠免疫球蛋白之螢光試 劑中（山羊抗—老鼠IgG — Cy3)。在10D5和 3 D 6群之腦部內的斑被抗體高度修飾，而在1 6 C 1 1 群中則無染色。爲了完全揭露斑的沈積程度，讓一系列各 腦部切片先與抗- A /3抗體進行免疫反應，然後，再與第 二種試劑作用。經由周圍途徑給予第二種試劑可使其有機 會接近在C N S內之大部分的斑。與1 6 C 1 1群相比下 ，這些治療組中之斑負載量已大爲減少。抗體能夠進入 C N S並非因爲血液-腦障壁有異常滲漏，因爲當以伊凡 斯•藍（Evans Blue )，在P D A P P小鼠體中測量時，血 管滲透性並未增加。另外，在老化之P D A P P小鼠的腦 主質中，其抗體濃度與在非導入外來基因之小鼠中者相同 ，這代表在血淸中有0 . 1%之抗體濃度（不管同質體的 種類爲何）。 本纸張又度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -91 - 1255272 A7 B7 五、發明説明（89) 這些數據表示經周圍途徑給予抗體時其可進入c N S 中，在此處，它們可啓動澱粉樣的淸除作用。1 6 C 1 1 似乎也可接近斑，但不能與其連接。 實施例IV :抗體對抗澱粉樣沈積之活性的活體外篩選分析 建立一活體外分析，其中將初級小神經膠質細胞與未 固定之P D A P P老鼠或人類A D腦部冷凍切片一同培養 ，以檢查抗體對澱粉樣斑之淸除效果。從新生D B A / 2 N小鼠（1 - 3天）之大腦皮質取得小神經膠質細胞。 將皮質在加有5 0微克/毫升D N a s e I (司格馬（ Sigma))的Η B S S漢克氏平衡鹽溶液，史格馬公司）中 ，以機器處理使之分離。將分離的細胞以一 1 0 0微米細 胞過濾器（費爾康（Falcon))進行過濾並在1 〇 〇 〇 r p m下離心5分鐘。將沈積下來的小九重新懸浮於生長 介質（高葡萄糠DMEM，10% FBS，25毫微克 /毫升rmGM— CSF)中，以每一 T — 75塑膠培養 盒中含2個腦的密度，將細胞平盤接種。7 - 9天後，將 懸浮液在1 0 〇 〇 r p m下離心並重新懸浮於分析介質中 〇
將P D A P P老鼠或人類A D腦（死後間隔< 3小時 )的1 0 -微米冷凍切片解凍封固在以聚-賴胺酸覆層過 的圓形玻璃蓋玻片上，並將其置於2 4 -槽組織培養盤的 槽中。以含下列各項之分析介質淸洗蓋玻片二次：H -SFM (雜交瘤一不含血淸介質，吉布可（Gibco) BRL 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） ----------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 經濟部智慧財產局員工消費合作杜印製 -92- 1255272 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明説明（9〇) )，加上1 % F B S，麩胺，青黴素/鏈黴素，及5毫微 克/毫升rmGM— CSF (R&D)。加入2X濃度（ 最終爲5微克/毫升）之對照或抗- a θ抗體1小時。然 後，將小神經膠質細胞以〇 · 8 X 1 〇 6細胞/毫升分析介 質的密度進行接種。將培養維持在潮濕的培養箱（3 7 °C ，5 % C〇2 )中2 4小時或更久。在培養終了時，以4 % 三聚甲醛固定之，並以〇·1%三硝基曱苯令其成爲可滲 透性。以生物素化之3 D 6將切片染色，接著再以抗生蛋 白鏈菌素/ C y 3結合物（傑克森免疫硏究）染色。藉核 染色（D A P I )來目視外生性的小神經膠質細胞。以倒 立螢光顯微鏡（Nikon，TE300 )來觀察培養，並利用 S P〇T數位相機，使用S P ◦ T軟體（診斷儀器公司） 來照像。在西方點墨分析方面，在8 Μ尿素中萃取培養， 於減低之tricine樣本緩衝液中做1 : 1稀釋，並將其裝載到 1 6 % 11· i c i n e凝膠上（N 〇 v e X)。在轉移至轉漬紙（ immobilon)上後·譲墨點暴露於5微克/毫升之 P a bA/34 2 再暴露於經HRP結合之抗老鼠抗體中 並以 ECL 顯影（Amersham)。 當於1 6 c 1 1之存在下（一種在活體內無效之對抗 A /9的抗體），以P D A P P腦切片進行此分析時，石一 澱粉樣仍維持完整，且未觀察到呑噬作用。相反的，當將 鄰近的切片在1 0 D 5之存在下進行培養時，該澱粉樣沈 積會大量消失，且該小神經膠質細胞會顯示出許多含A /3 的吞噬泡。以A D腦切片可取得相同的結果；1 〇 D 5可 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -93- 1255272 A7 B7 五、發明説明（91) 誘導出A D斑的吞噬作用，而1 6 C 1 1爲無效。另外， 當以老鼠或人類小神經膠質細胞，及對抗Α ^之老鼠，兔 子，或靈長類抗體來進行分析時，此分析能提供可比較的 結果。 表7爲數種不同抗體連接特異性之Α Θ連接對吞噬作 用的比較。其中可見到連接在a a 1 - 7內之抗原決定 部位的抗體可同時連接並淸除澱粉樣沈積，然而連接在胺 基酸4 - 1 0內之抗原決定部位的抗體僅能連接而不會淸 除澱粉樣沈積物。連接對著殘質1 〇之C端抗原決定部位 的抗體既不會連接也不會淸除澱粉樣沈積。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） -94- 1255272 A7 B7 五、發明説明（92) 表7:抗原決定部位特異性之分析 抗體 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 抗原決定部位 同質體 染色 呑噬作用 Ν-端 mab 3D6 1-5 Ig〇2 + + 10D5 3-7 IgGl + + 22C8 3-7 IgG2a + + 6E10 5-10 IgGl + - 14A8 4-10 rat IgGl + - aa 13-28 18G11 10-18 rat IgGl - 266 16-24 IgGl - - 22D12 18-21 IgG2b - - C-端 2G3 -40 IgGl - - 16C11 -40/-42 IgGl - - 21F12 -42 IgG2a - - 免疫血淸 兔子(CFA) 1-6 + + 老鼠(CFA) 3-7 + + 老鼠(QS-21) 3-7 + + 猴子(QS-21) 1-5 + + 猴子(MAP 1-7) + + (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
、1T $ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210 X 297公釐） - 95- 1255272 A7 B7 五、發明説明（93) 表8顯示出以數種抗體對抗A /3所取得的結果，比較 它們在活體外分析中誘導出吞噬作用，及在活體內，於被 動轉移硏究中，減少斑負載量的能力。雖然1 6 C 1 1和 2 1 F 1 2能以高度親和力連接集結之合成Α Θ蛋白肽， 但這類抗體無法與那些在未固定之腦切片中的/5 -澱粉樣 斑反應，不能觸發在活體外分析中之吞噬作用，且在活體 內亦無效。對抗Α Θ之1 0 D 5，3 D 6，和多株抗體在 三種測量中都有活性。這些結果顯示出在活體中之有效性 係舊因於該直接由抗體所傳介之C N S內澱粉樣斑的淸除 作用，而在活體外之分析可預測抗體在活體內的有效性。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -96- 1255272 A7 B7 五、發明説明（94) 表8:做爲活體內有效性預言者的活體外分析 抗體 同質體對集結之連接至β-活體外有活體內有 Αβ的親澱粉樣斑 效性 效性 和力 Ap(Pm) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 單株抗體 3D6 IgG2b 470 + + + 10D5 IgGl 43 + + + 16C1 1 IgGl 90 - - - 21F12 IgG2a 50 - - - TM2a IgGl _ - - - 多株抗體 1-42 混合 600 + + + 經·#部智慧財產局員工消費合作社印製 相同分析曾用來測試對抗稱爲N A C之塞紐克蘭片段 的抗體的淸除活性。塞紐克蘭已顯示出其爲與澱粉樣斑相 關之蛋白質。將對抗N A C之抗體與含澱粉樣斑之腦組織 樣本及小神經膠質細胞依前述方法相接觸。使用兔子血淸 做爲對照。接下去之偵察顯示出斑的數目和大小已顯著減 少，而此爲抗體之淸除活性的指示。 使用同焦聚顯微鏡來確認A yS在活體外分析期間被內 在化。在對照組抗體之存在下，該外生性小神經膠質細胞 仍維持在組織上面之同焦聚平面中，其中並無含Α Θ之呑 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -97 - 1255272 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明説明（95) 噬泡，且在切片內之斑塊仍維持完整。爲了決定內在化蛋 白肽之命運，在不同時間點，以8 Μ尿素萃取經1 0 D 5 處理過的培養，並藉西方點墨分析來檢查。在第1小時之 時間點，當尙無吞噬作用發生時，該以對抗A /9之多株抗 體進行的反應顯露出一個強的4 k D帶（相當於A /3蛋白 肽）。A石免疫反應性在第1天時降低，在第3天時消失 。因此，由抗體傳介之A /3呑噬作用會導致其變質。 爲了決定活體外分析中之吞噬作用是否由F c傳介， 製備抗一 AyS抗體3D6之F (ab>) 2片段。雖然該 (F a b /) 2片段可保持其與斑反應的全部能力，但它 們無法啓動由小神經膠質細胞進行之吞噬作用。另外，以 全抗體產生的吞噬作用可由一對抗老鼠F c受體的試劑（ 抗一 CD 1 6/3 2)來阻斷。這些數據表示A/3之活體 內淸除作用係透過由F c -受體傳介之吞噬作用進行。 复施例V :抗體涌過血液-腦障壁的通道 本實施例係測定在將抗體經靜脈內途徑注射入正常或 P D A P P小鼠之周圍組織後，能遞送至腦部的抗體濃度 。治療後，以0 · 9 % N a C 1灌流P D A P P小鼠或 對照之正常小鼠。解剖腦部區域（海馬區或皮質區）並立 刻冷凍之。將腦在〇 · 1 %三硝基甲苯+蛋白酶抑制劑中 均質化。藉E L I S A偵測在萃取物中之免疫球蛋白。將 F (ab) >2山羊抗一老鼠IgG覆層至一RIA盤上 以做爲捕捉劑。將血淸或腦萃取物培養1小時。以抗-老 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -Φ 訂 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -98- 1255272 A7 B7 五、發明説明（96) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本I) 鼠 I gGl— HRP 或 I gG2a — HRP 或 I gG2b - HRP ( Caiug)偵測該同質體。不管是何種 同質體，存在於CNS中之抗體濃度爲血液中所發現者之 1 : 1 0 0 0。例如：當I g G 1之濃度爲血液中之 Ϊ g G 2 a的三倍時，其亦爲腦中；[g g 2 a的三倍，二 種均以其血液中之相對應濃度的〇 . 1 %存在於腦中。此 結果可在導入外來基因和非導入外來基因小鼠中觀察到， 這表示P D A P P並不具有獨特之滲漏的血一腦障壁。 實· A1LY?, . _老嵐3 16可變區的選殖和定序 3 D 6 V Η之選殖和序列分析。藉由二種各自獨立 的方法從雜交瘤細胞中製備ηΊ r N A，利用此m R N A， 藉由RT - P C R來選殖3 D 6之重鏈可變VH區。首先 ，使用一致引物，以針對包含該轉譯起始密碼子之V Η區 前導蛋白肽的引物做爲5 >引物（D N A # 3 8 1 8 — 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 3 8 2 9 )，而以 g 2 b ( D N A # 3 8 3 2 )恆定區特 異性引物爲3 >引物。該來自p C r擴大產物之序列與來 自多次，經獨立衍生之選殖株彼此完全一致。當對3 D 6 V Η區之序列做進一步檢查時，此結果可藉由使用5 / RACE R T — P c R方法及3 — g 2 b特異性引物（ D N A # 3 8 3 2 )，對v Η片段進行定序而獲得確認。 再一次，從P C R產物衍生得來之序列，及經多次，獨立 分離出之選殖株，二者序列彼此完全一致（除了在來自 5 > RACE產物之前導區有ν8 I取代外），這表示該 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） -99- 1255272 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（97) 序列係衍生自編碼3 D 6之V Η區的m R N A。3 D 6 V Η區之核苷酸序列C S E Q ID N〇：3 7 )和胺 基酸序列（S E Q ID N〇：4 )各列於表9和第2 圖中。 表9 :老鼠3 D 6 V Η核苷酸序列 ATGAACTTCGGGCTCAGCTTGATTTTCCTTGTCCTTGTTTTA7VAAGGTGTCCAGTGTGA AGTGAAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTAGTGAAGCCTGGAGCGTCTCTGAAACTCT CCTGTGCAGCCTCTGGATTCACTTTCAGTAACTATGGCATGTCTTGGGTTCGCCAGAAT TCAGACAAGAGGCTGGAGTGGGTTGCATCCATTAGGAGTGGTGGTGGTAGAACCTACTA TTCAGACAATGT7UU\GGGCCGATTCACCATCTCCAGAGAGAATGCCAAGAACACCCTGT ACCTGCAAATGAGTAGTCTGAAGTCTGAGGACACGGCCTTGTATTATTGTGTCAGATAT GATCACTATAGTGGTAGCTCCGACTACTGGGGCCAGGGCACCACT (SEQ 工D N〇：3) *下加線者爲前導蛋白肽 3 D 6 V L之選殖和序列分析。將3 D 6之輕鏈可 變區V L依類似於V Η區之方式進行選殖。在第一次試驗 中，依下述設計一組一致引物以用來擴大老鼠V L區：設 計5 >引物（DNA#3806 — 3816)以與包含轉 譯起始密碼子之V L區雜合，而3 /引物（ϋ N A # 3 8 1 7 )則特異於老鼠V - J連結區之C K區下游。 P C R片段之D Ν Α序列分析，及利用此一致輕鏈引物組 分離出之經獨立衍生的選殖株顯露出：所取得之c D N A 係從一經非功能性重整過的信息所衍生得來，因爲該序列 在V - J區接合點之間含有一移碼突變。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
-100- 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1255272 A7 B7 _ ___ 五、發明説明（98) 在第二種試驗中，使用5 — R A C E來選殖編碼 c. D N A的第二V L。此產品之D N A序列分析（一致序 列1 1 )顯示出其編碼一功能性m R N A。因此，可得到 的結論爲：該序列編碼正確的3 D 6輕鏈m R N A ° 3 D 6之V L區的核苷酸（S E Q ID N〇：1 )和 胺基酸序列（S E Q ID N〇：2 )分別列於表1 0 和第1圖中。 表1 0 :老鼠3 D 6 v L核苷酸序列
ATGATGAGTCCTGCCCAGTTCCTGTTTCTGTTAGTGCTCTGGATTCGGGAAACC7\ACGG TTATGTTGTGATGACCCAGACTCCACTCACTTTGTCGGTTACCATTGGACAACCAGCCT CCATCTCTTGCAAGTCAAGTCAGAGCCTCTTAGATAGTGATGGAAAGACATATTTGAAT TGGTTGTTACAGAGGCCAGGCCAGTCTCCAAAGCGCCTAATCTATCTGGTGTCTAAACT GGACTCTGGAGTCCCTGACAGGTTCACTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTTACACTGA AAATCAGCAGAATAGAGGCTGAGGATTTGGGACTTTATTATTGCTGGCAAGGTACACAT TTTCCTCGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGG7\AATCAAA (SEQ 工D N〇：l) *下加線者爲前導蛋白肽 輕鏈和重鏈二者從N -端至C -端均含結構區F R 1 ，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3 和 F R 4。各結構區所派定之胺基酸係根據卡巴，等（如上 述）之編號協定。 嵌合型3 D 6抗體之表現：將可變重鏈和輕鏈區重新 經遺傳工程處理，以編碼各自之V D J或V J接合點的剪 接的供給者序列下游，並將其選殖入哺乳動物表現介體 本紙張尺度適用中國國家檩準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
1255272 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 ___B7 _五、發明説明（"） p C Μ V — h r 1 (重鏈方面），和 P C Μ V - h /c 1 ( 輕鏈方面）中。這些介體編碼人類T 1和C k恆定區以做 爲插入之可變區卡匣的外顯子片段下游。在確認序列後， 將重鏈和輕鏈表現介體共同轉染之C 0 S細胞中。將二種 不同的重鏈轉殖株C Η 2 · 2 &· Η 3 · 2 )各自獨立 地與三種不同的嵌合型輕鏈轉殖株（L 3，L 4 & L 1 〇 )共同轉染，以確認結果之可複製性。進行嵌合型 2 1 . 6抗體之轉染，以做爲介體之陽性對照組。在轉染 後4 8小時收集條件介質，並藉由西方點墨分析來分析抗 體的製造，或藉由EL I SA分析AyS連接。 該多種轉染株均可表現出在西方點墨分析上，可被山 羊抗一人類I g G ( Η T L )抗體所辨識出之重鏈+輕鏈 組合。 藉由E L I S Α分析來測試3 D 6和嵌合型3 D 6 ( P K 1 6 1 4 )抗體對A /3的直接連接。結果發現嵌合型 3 D 6可以高親和力連接A /3，此點類似於以3 d 6所證 明出的結果（第3A圖）。還有，以el I SA爲基礎之 競爭性分析透露出嵌合型3 D 6和老鼠3 D 6抗體與生物 素化之3D6同等競爭連接Ay5(第3B圖）。該嵌合型 抗體顯示出與3 D 6參考樣本間無法辨別之連接性晳。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21〇X 297公釐） -102 - 1255272 Α7 Β7 五、發明説明（1〇0 表1 ] 濃度（微克/毫升） 3D6 ΡΚ1614 _^.....—......^...... I g G ^^ 0.037 119.3 0.11 118.6 118.9 0.33 99.7 71.25 1 —---- 98.63 84.53 134. C请先閱讀背面之注意事項存填寫本育〇 再者，3D6和PK16 14二者均可有效淸除A/5 斑。活體外分析證明：當抗體濃度增加時，在老鼠和嵌合 型3 D 6抗體這二方面，A /3量係以相同方式減少。因此 ，可獲得結論爲：該序列分別編碼功能性3 D 6重鏈和輕 鍵。
Jf 實__施例W · 3 D 6的擬人化作用 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 同質性/分子造型。爲了鑑定在老鼠3 D 6抗體中之 關鍵構造性框構殘質，以最接近的老鼠抗體爲根據，製造 一重鏈和輕鏈的三-次元模型。爲了達到此目的，選出命 名爲1 C F R 9之抗體做爲模板，以塑造3 D 6輕鏈（ P D B ID : 1CR9，肯瑤，等，如上述）的模型， 及一命名爲1OPG之抗體做爲塑造重鏈（PDB ID :1 0 P G柯丹達本尼，等，如上述）的模型（也見於表 1中）。將3 D 6之胺基酸序列與這些抗體的輕鏈和重鏈 進行一致性比對，結果顯示：除了重鏈之C D r 3以外， 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Μ規格（210 '乂297公釐） 一 ^ 1255272 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 Α7 Β7 五、發明説明（10) 該1 C R 9和1 0 P G抗體與3 D 6共享顯著的序列同質 性。另外，該所選出之抗體的C D R環與3 D 6之C D R 環係爲相同的標準喬西亞構造類型（重鏈之C D r 3亦爲 例外情況）。因此，開始時，選出1 C R 9和1 0 P G來 做爲3 D 6同質性造型之解析構造的抗體。 第一個合格之以上述所指出之抗體爲基礎的3 D 6可 變區问質性|旲型係利用Look & SegMod Modules GeneMine (v3 . 5)軟體包所建構成。此軟體係從分子應用集團（加州， Palo Alto )購得永久使用權。此由麥可•賴維特和克里斯 •李博士所創作之軟體包可幫助藉由自動化步驟來做分子 造型的過程，這些步驟牽涉到根據序列同質性，在已知構 造的模板上製作一級序列的構造模型。在U N I X操作系 統中，於Silicon Graphics IRIS工作站操作時，該製作出之 丰旲型可藉由一系列能量最小化步驟來解除不利的原子接觸 ，並使靜電和凡得瓦交互作用最完美化，將模型自動地加 以精製。 另一精製的模型係利用Quanta®的造型能力來建構。藉 PDB資料庫代查3D6重鏈之CDR3，可鑑定出1 q k z爲最具同質性者，且其與3 d 6具一致之殘質號碼 。因此，3 D 6之重鏈的C D R 3係利用1 q k z的結晶 構造做爲模板。3 D 6模型之α -碳主鏈圖形顯示於第4 圖中。該V Η結構區係以點線顯示，V L結構區係以實線 絲頁不，而C D R環則以帶型指出。 人類接受者抗體序列的選擇。合適之人類接受者抗體 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ 297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)
-104- 1255272 A7 B7 五、發明説明（1〇》 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 序列係藉由將老鼠可變區之胺基酸序列與已知之人類抗體 序列經由電腦比較來鑑定出。3 D 6重鏈和輕鏈之比較係 分開進行。尤其是，來自其框構序列與老鼠之V L和V Η 框構區具高度序列一致性之人類抗體的可變結構區係藉由 卡巴資料庫，利用NCB I BLAST (可透過國家健 康組織N C B I網路伺服器很容易地公開取得）代查相對 應之老鼠框構序列而鑑定出來。 根據下列要件選出二種候選序列做爲接受者序列：（ 1 )與主體序列具同質性；（2 )與供給者序列共享標準 的C D R構造；及（3 )在框構區不含任何稀有之胺基酸 殘質。在V L方面所選出之接受者序列爲卡巴I D編號（ KABID) 019230 (基因庫編號 S40342) ，而在VH方面者爲KABID 045919 (基因庫 編號A F 1 1 5 1 1 0 )。第一種擬人化3 D 6抗體之變 體係使用這些選出來之接受者抗體序列。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 胺基酸殘質之取代。如上述，本發明之擬人化抗體含 有大體上來自人類免疫球蛋白（接受者免疫球蛋白）之可 變框構區，及大體上來自稱爲3D 6之老鼠免疫球蛋白（ 供給者免疫球蛋白）的互補決定區。在鑑定出3 D 6之互 補決定區及合適之人類接受者免疫球蛋白後，下一步即決 定來自這些成分之殘質中，何者（如有任一種時）要進行 取代以將所產生之擬人化抗體完美化。使用上述之要件來 選出供取代之殘質。 第1和第2圖分別描述該原始之老鼠3 D 6 V L和 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） -105- 1255272 Α7 Β7 五、發明説明（1〇泠 V Η與各自之擬人化序列變體1，相對應之人類框構接受 者序列，及顯出與人類框構接受者序列具最高同質性的人 類種系V區序列的一致性比對。該色度部分表示標準（塡 滿的實體），游標（虛線輪廓），裝塡（黑體字的），及 少有之胺基酸（黑體斜體字），其表示在圖上。該星號表 示在人類接受者框構序列中，回復突變成老鼠殘質之殘質 ，C D R區以上加線表示。表1 2中爲倂入擬人化3 D 6 V Η和V L變體1之變化的摘要。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)
經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） -106- 1255272 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明説明（ 表12.在擬人化3D6.V1中之變化的摘要 變化 VL(112 殘質） VH(119 殘質） Hu->Mu:框構 4/112 3/119(標準，1裝塡） CDR1 6/16 3/5 CDR2 4/7 7/14 CDR3 5/8 4/10 Hu->Mu 19/112(17%) 17/119(14%) Mu->Hu:框構 13/112 14/119 回復突變註釋 1.I2V，其係一標準位置 4.游標/在CDR下 2.Y36L，其係一裝塡殘質且亦 5.A93V其係一裝塡及游標 在CDR2下。 區殘質 3.L46R,其係一裝塡殘質且亦 6.K94R，其係一標準殘質 在CDR之下 接受者註釋 7.KABID 019230/基因庫 11.KABID045919/基因庫 Acc#S40342 Acc#AF115110 8.HukLC 子群 II 12Hu HC 子群 III 9_CDRs來自與供給者相同之 13.CDRS來自與供給者相同 標準構造群(m3D6) 的標準構群 Ll=第4類 出=第1類 L2=第1類 H2=第3類 L3=第1類 14.辨識腦膜炎球菌之來多醣 接受者種系 15.H3-23 16.A3 & A19 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） -107- 1255272 A7 B7五、發明説明（1〇弓表1 3和表1 4各提出不同輕和重鏈之卡巴編號要點 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)
、1T 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） -108- 1255272 A7 B7五、發明説明（10弓表π:輕鏈之卡巴編號要點 KAB η # 型態 老鼠 3D6 VL HUM 3D6VL KABID 019230 A19- 禪系 士 f - 5¾ riXri 幸 1 1 FR1 Υ Y D D I 少有之老鼠的可接觸CDR 2 2 V V I I 標準/CDR接觸 VMTQSPLSLPVTPGEPASISC VMTQSPLSLPVTPGEPASISC VMTQSPLSLPVTPGEPASISC V Μ T Q tpltlsvtigqpasisc 345678910::121314151617181920212223 34567891011121314151617181920212223 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)
本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -109 1255272 A7
7 B 五、發明説明（1〇》 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 24 24 CDR1 25 25 26 26 27 27 27A 28 27B 29 27C 30 27D 31 27E 32 28 33 29 34 30 35 31 36 32 37 33 38 34 39 35 40 FR2 36 41 37 42 38 43 39 44 40 45 41 46 42 47 43 48 44 49 45 50 46 51 47 52 48 53 49 54 50 55 CDR2 51 56 52 57 53 58 54 59 55 60 56 61
KSSQSLLDSDGKTYLN WLLQRPGQSPKRL1Y LVSKLDS
KSSQSLLDSDGKTYLN WLLQKPGQSPQRLIY LVSKLD
RSSQSLLHSNGYNYLD WYLQKPGQSPQLLIY LGSNRAS
R S SQ S L L Η S Ν G Υ Ν Υ L D WΥ 裝塡殘質 LQ Κ Ρ GQ S ΡQL 裝塡殘質 L ' I Y L G S N R A S (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)
本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） -110 1255272
A
7 B 五、發明説明（1〇会 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 57 62 FR3 58 63 59 64 60 65 61 66 62 67 63 68 64 69 65 70 66 71 67 72 68 73 69 74 70 75 71 76 72 77 73 78 74 79 75 80 76 81 77 82 78 83 79 84 80 85 81 86 82 87 83 88 84 89 85 90 86 91 87 92 88 93 89 94 CDR3 90 95 91 96 92 97 93 98 94 99 95 100 96 101 97 102 gvpdrftgsgsgtdftlkisrieaedlglyyc wqgthfpr gvpdrfsgsgsgtdftlkisrveaedvgvyyc wqgthfpr gvpdrfsgsgsgtdftlkisrveaedvgvyyc mqalqtpr
GVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQALQTP (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
JW 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -111 - 1255272 A7 B7五、發明説明（1〇令 FGQGTKVEIK FGQGTKVEIK FGGGTKLEIK R4 F 3 45678901 2 ooooooolll 11 '~- 11 n n n -...- n 11 98990001020304050636A n 1* 11 n n II n o (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
、1T ύτ 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -112 - 1255272 A7 B7 五、發明説明（11〇)表14:¾鏈之卡巴編號要點 老鼠KAB ~^D6 HUM KABID VH3-23# ^ 型態 VH 3D6 VH 045919種系 註譯 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 234567891011121314151617181920212223242526272829303132333435 345678910111213141516171819202122232425262728293031323334
R F R DI. c evklvesggglvkpgaslklscaasgftfsnygms
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYGMS
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS SYAVS
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS SYAMS (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 .dw. 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） -113- 1255272 A7 B7 五、發明説明（11) 36 36 FR2 37 37 38 38 39 39 40 40 41 41 42 42 43 43 44 44 45 45 46 46 47 47 48 48 49 49 50 50 CDR2 51 51 52 52 52A 53 53 54 54 55 55 56 56 57 57 58 58 59 59 60 60 61 61 62 62 63 63 64 64 65 65 66
WVRQNSDKRLEWVA SIRSGGGRTYYSDNVKG
WVRQAPGKGLEWVA S1RSGGGRTYYSDNVKG
WVRQAPGKGLEWVS AISGSGGSTYYADSVKG
W V RQΑ 少有之老鼠的，代替w/H_ PG 少有之老鼠的，代替w/Hum K G L E W V S CDR接觸/覆蓋 A I S G S G G S T V V A D S V K G 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -114 - 1255272 A7 B7 五、發明説明（11会 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 66 67 67 68 68 69 69 70 70 71 71 72 72 73 73 74 74 75 75 76 76 77 77 78 78 79 79 80 80 81 81 82 82 83 82A 84 82B 85 82C 86 83 87 84 88 85 89 86 90 87 91 88 92 89 93 90 94 91 95 92 96 93 97 94 98 95 99 96 100 97 101 98 102 99 103 100 104 100Α 105 100Β 106 100C 107 100D 108 101 109 102 110 FR3 R Γ Τ I S R Ε Ν A K N T L Y LQ Μ S S L K S E D T Λ L Y Y C Y R CDR3 Y D H Ys G Ss
D Y SRDNAKNSLYLQMNSLR 八 EDTALYYCAK DNYDFWSG - ID-Y srdnaknslylqmnslraedtalyycvr ydhysgss d y R F T I , S R D N S K N T L Y LQ M N S L R A E D T A Y Y Yc A 裝塡殘質，使用老鼠的 K 標準，使用老鼠的 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)
本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） -115- 1255272 A7 B7 W w w G G G Q Q Q G G G T T T L T L V V V T T T V V V s s s s s s 五、發明説明（1)13 103 m FR4 104 1 12 105 113 106 1 14 107 I 15 ^ 108 116 ' 109 117 110 118 . Ill 1 19 112 120 1 13 121 /3具至少1〇7， 10 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 該擬人化抗體宜顯示出對A 1 0 9或1 0 1 ° Μ _ 1的特異性連接親和力。通常，該擬人 化抗體對A /3之連接親和力的上限係在3 D 6之連接親和 力也就是，〜109M— 1的3，4或5倍因子內。通常， 連接親和力之下限亦在3 D 6之連接親和力的3，4，或 5倍因子內。 擬人化3 D 6 V Η和V L，變體1之組合與表現。 簡單地說，在各V區方面係合成4個大的單股重疊寡核苷 。另外，各V區亦合成4個短的P C R引物以進一步促進 該特殊V區之組合。用於此目的之寡核苷酸的D Ν Α序列 係顯示於表1 5中。 表15DNA寡核苷酸 ： 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 DNA# :人小 ;編®^ 序列 、註釋 4060 136 田 疋 tccgc aagct tgccg ccacc hum 3D6 VL-A ATGGA CATGC GCGTG CCCGC CCAGC TGCTG GGCCT GCTGA TGCTG TGGGT GTCCG GCTCC TCCGG CTACG TGGTG ATGAC CCAGT CCCCC CTGTC CCTGC CCGTG ACCCC CGGCG A (SEQ ID NO:17) 4061 131 是 CTGGG GGGAC TGGCC GGGCT hum3D6 VL-B TCTGC AGCAG CCAGT TCAGG TAGGT CTTGC CGTCG GAGTC CAGCA GGGAC TGGGA GGACT TGCAG GAGAT GGAGG CGGGC TCGCC GGGGG TCACG GGCAG GGACA GGGGG G 1 (SEQ ID NO:18) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） -116- 1255272 A7 B7 五、發明説明（11今 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 4062 146 疋 ACCTG AACTG GCTGC TGCAG hum 3D6 VL-C AAGCC CGGCC AGTCC CCCCA GCGCC TGATC TACCT GGTGT CCAAG CTGGA CTCCG GCGTG CCCGA CCGCT TCTCC GGCTC CGGCT CCGGC ACCGA CTTCA CCCTG AAGAT CTCCC GCGTG GAGGC C (SEQ ID NO:19) 4063 142 aat tc tagga tccac tcacg hum 3D6 VL-D CTTGA TCTCC ACCTT GGTGC CCTGG CCGAA GGTGC GGGGG AAGTG GGTGC CCTGC CAGCA GTAGT ACACG CCCAC GTCCT CGGCC TCCAC GCGGG AGATC TTCAG GGTGA AGTCG GTGCC GG (SEQ ID NO:20) 4064 16 否 CTGGG GGGAC TGGCC G hum 3D6 VL A+B (SEQ ID NO: 21) back %A+T = 18.75 [3]; % C+-G-= 81.2[13] 戴維靳,波茲坦，羅斯 熔解溫度c. 66.96 4065 22 是 ACCTG AACTG GCTGC TGCAG hum 3D6 VL C+D AA (SEQ ID NO:22) forward % A+T = 45.45 [10]; % C+G = 54.55 [12] 戴維斯,波茲坦，羅斯 m解溫度c. 64.54 4066 Ί38 是 acaga aagct tgccg ccacc hum 3D6 VH-A ATGGA GTTTG GGCTG AGCTG GCTTT TTCTT GTGGC TATTT TAAAA GGTGT CCAGT GTGAG GTGCA GCTGC TGGAG TCCGG CGGCG GCCTG GTGCA GCCCG GCGGC TCCCT GCGCC TGT (SEQ ID NO:23) 4067 135 否 GCCGC CGGAG CGGAT GGAGG hum 3D6 VH-B CCACC CACTC CAGGC CCTTG CCGGG GGCCT GGCGC ACCCA GGACA TGCCG TAGTT GGAGA AGGTG AAGCC GGAGG CGGCG CAGGA CAGGC GCAGG GAGCC GCCGG GCTGC ACCAG (SEQ ID NO:24) 4068 142 是 CTGGA GTGGG TGGCC TCCAT hum 3D6 VH-C CCGCT CCGGC GGCGG CCGCA CCTAC TACTC CGACA ACGTG AAGGG CCGCT TCACC ATCTC CCGCG ACAAC GCCAA GAACT CCCTG TACCT GCAGA TGAAC TCCCT GCGCG CCGAG GACAC CG (SEQIDNO：25) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂
Jmw. 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21〇Χ 297公釐） -117- 1255272 A7 B7 五、發明説明（1諱 4069 144 否
ctgca GAGGA GCCCT AGGAG TAGCG GGCGG GGGAG AGGG aggat ccact CACGG TCACC GGCCC CAGTA CCGGA GTAGT CACGC AGTAG TGTCC TCGGC TTCAT CTGCA (SEQID NO:26)
caccG AGGGT GTCGG GGTCG TACAG GCGCA GGTAC
hum 3D6 VM-D 4070 16 否 GCCGC CGGAG CGGAT (SEQ ID NO:27) hum 3D6 VH A+B back % A+T = 18.75 [3]; % C+G-^= 81.25[13] 锻維斯:波茲坦:羅斯 熔解溫度C. 66.96 4071 20 CTGGA GTGGG TGGCC TCCAT (SEQ ID NO:28) hum 3D6 VH C+D forward % A+T = 35.00 [7]; % C+G = 65.00 [13】 «維斯，波茲坦，羅斯 熔解溫度C. 66.55 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 4072 19 是 tcc gca age ttg ccg cca c (SEQ ID NO:29)
Hum3D6 VL A+B Forward % A+T = 31.58 [6】； % C+G = 68.42[13] «維斯,波茲坦，羅斯 熔解溫度 66.64
、1T 4073 29 否 aat tet agg ate cac tea cgC TTG ATC TC (SEQID NO:30)
Hum3D6 VLC+D Back % A+T = 55.17[16]; % C+G = 44.83. [13] •敢維斯.波茲坦，羅斯 熔解溫度C, 66.04 mr· 4074 23 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 4075 22 aca gaa age ttg ccg cca ccA TG (SEQ ID NO:31) ctg caa gga tec act cac eGG A (SEQ ID NO:32) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐）
Hum 3D6 VH A+B Forward % A+T = 43.48 [10]; % Γ+G = 56.52 [13】 戴維斯，波茲坦，羅斯 熔解溫度C. 66.33
Hum3D6 VH C+D Back % A+T = 40.91 [9]; % C+G- S9.09[13] 歟維斯，波茲坦，羅断 熔解溫度C. 66.40 -118- 1255272 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 Α7 Β7 五、發明説明（11今 利用P C R來組合該擬人化輕鏈。超過二打之選殖株 的D N A序列分析結果顯露出在預期之序列的整個V L區 i都零星散佈著單點突變和缺失。該序列之分析指出選殖 株2 · 3需要進行修復二個在N -端區中，間隔相近之單 一核苷酸缺失。因此，特定部位突變係利用寡核苷酸，在 選殖株pCRShum3D6vl2.3上執行，以引入該2種缺失的核 苷酸，而單點突變之修復係藉D N A序列分析來確認，該 V L嵌入段則被選殖入輕鏈表現介體p C Μ V - c K中。 利用以P C R爲基礎之方法來組合擬人化V Η會造成 在序列之5 >的那一半帶有顯著缺失的選殖株。將P C R 條件進一步完美化可達到部分效果。經由完美化之P C R 條件所組合之選殖株在基因圖譜上，標示爲A + Β片段之 重疊的區域中仍具有1 0 — 2 0個n t缺失。因此，使用 一種替換策略，來組合選殖株，此係利用經D N A聚合酶 (T 4，克氏（Klenow)，及Sequenase)傳介之重疊延長 ，及接下去之藉由T 4 D N A連接酶所進行的共價連接重 疊端來完成。由該利用後項方法所組合成之V Η所產生之 選殖株分組的D Ν Α序列分析顯露出在選殖株間有零星散 布之單點突變。超過二打選殖株之分析結果顯露出其具有 大體上與關於這些選殖株之說明相同的型式。在第一種合 格之組合的V Η和V L選殖株中所觀察到的類似結果提出 ••所觀察到之D Ν Α序列錯誤係由於使用長型D Ν Α進行 組合的合成過程期間，因自動合成器發生錯誤而造成的。 選出擬人化V Η選殖株2 · 7來用於由S D Μ所傳介 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
-119- 1255272 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（1作 之3個核苷酸的缺失修復工作，該核苷酸缺失係那些s @ 觀察到含在其中者。 實施例X m ·擬人化3 D 6 v 2抗體的特性描述 除了在殘質1處之D — Y取代外，所製造之擬人化 3 D 6第二變體具有變體1所有之各項取代。在變體1中 進行此殘質處之取代係因爲該殘質被確認爲一種C D R交 互作用殘質，然而，取代作用刪除一在該位置處爲人類免 疫球蛋白所少有的殘質。因此，產生一無取代之變體。還 有，在重鏈框構區中之非一種系殘質係被種系殘質所取代 ，也就是，H74=S， H77=T及H89=V。變體 2輕鏈和重鏈之卡巴編號各如同表1 3和1 4中所描述者 ，但變體2輕鏈之殘質1爲a s p ( D )，重鏈之殘質 74爲s e r (S)，重鏈之殘質77爲thr (T)， 且輕鏈之殘質8 9爲val (V)。擬人化3D6，變體 1和2之核苷酸序列各如S E Q ID N〇s : 3 3和 3 4所提出者。 實施例I X :擬人化3 D 6抗體之功能測試 連接擬人化3 D 6 v 1至集結的A /3。擬人化 3 D 6 v 1之功能測試係利用該來自經短暫轉染之c〇s 細胞的條件介質來進行。該細胞係經完全嵌合型抗體轉染 過，此種嵌合型抗體爲嵌合型重鏈+擬人化輕鏈，或嵌合 型輕鏈+擬人化重鏈的混合物，且最終被完全擬人化之抗 本紙張尺度適用中國國家標举（CNS ) A4規格（210X 297公釐） " ' -- -120- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
1255272 A7 B7 五、發明説明（11令 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 體。藉由E L I S A分析來測試條件介質對集結之A yS的 連接。該擬人化抗體顯示出在實驗誤差內之良好活性，且 顯示出與嵌合型3 D 6參考樣本無法區分的連接性質。結 果顯示於表1 6中。 表1 6 : 毫微克 /毫升 嵌合型 hu VH/ ChVL CliYH/ HuVL Hu VH/ HuVL 690 0.867 600 0.895 260 0.83 230 0.774 200 0.81 190 0.811 87 0.675 77 0.594 67 0.689 63 0.648 29 0.45 25 0.381 22 0.496 21 0.438 9.6 0.251 8.5 0.198 7.4 0.278 7 0.232 3.2 0.129 2.3 0.124 爲了比較擬人化3 D 6 v 1和3 D 6 v 2抗體之連接 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 親和力，利用集結之A /3做爲抗原來進行E L I S A分析 。結果顯示出3 D 6 v 1 ( Η 1 L 1 )和3 D 6 v 2 ( Η 2 L 2 )具有接近一致之A yS連接性質（第5圖）。 h3D6v2之替代NET(rNET)分析。該 r N E T抗原決定部位遺傳圖譜分析提供關於在抗原決定 部位內之個別殘質對抗體的總體連接活性的貢獻。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） -121 - 1255272 A7 B7 五、發明説明（11令 r Μ E T分析係利用合成的系統性經單一取代之蛋白肽類 似物來進行。測試抗體之連接係針對天然蛋白肽（天然抗 原）及1 9個替代之經單一取代的蛋白肽〃進行，各蛋 白肽係在第一個位置中被1 9個對該位置而言爲非天然胺 基酸的其中之一所取代。結果可產生一反映出在該位置處 ，以不同非天然殘質取代後之效果的略圖。同樣地，沿著 該抗原性蛋白肽的連續位置處製造略圖。；然後，可將合 倂的略圖，或抗原決定部位圖譜（反映出以全部1 9個非 -天然殘質在各個位置處的取代）與經類似方法產生之第 二種抗體的圖譜比較。大體上類似或相一致的圖譜表示所 比較的抗體具有相同或類似的抗原決定部位特異性。 此分析係對3 D 6和擬人化3 D 6，變體2進行。抗 體係測試其對天然A万蛋白肽DAEFRHDSGY ( S E Q ID N〇：3 3 )之連接情形。殘質1 一 8係以1 9個 對該位置而言爲非天然殘質的各胺基酸來進行系統性取代 。依此，可產生3 D 6和h 3 D 6 v 2之遺傳圖譜。結果 以條形呈現於表1 7中。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂
Jfn 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -122- 1255272 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（12〇ι 表l.7:Ap:wt3D6和擬人化3D6之代替Net杭原決定郃位(Rnet)遺傳關譜 似代. 野生型 3D6 [〇D] 擬人化 3D6 [〇D] ifi代 野生塑 3D6 [〇D] 擬人化 3D6 [〇D] 磅質1 = A 0.464 0.643 殘質 5 = A 0.275 0.435 C 0.450 0.628 C 0.359 0.635 D 0.577 0.692 D 0.080 0.163 E 0.576 0.700 E 0.115 0.187 F 0.034 0.062 F 0.439 0.569 G 0.569 0.738 G 0.485 0.679 Η 0.054 0.117 H 0.577 0.680 I 0.048 0.118 I 0.510 0.671 κ 0.033 0.057 K 0.573 0.693 L 0.073 0.148 L 0.517 0.691 Μ 0.039 0.072 M 0.418 0.611 Ν 0.587 0.757 N 0.655 Ρ 0.069 0.144 P 0.093 0.198 Q 0.441 0.689 Q 0.388 0.565 R 0.056 0.155 R 0.613 0.702 S 0.569 0.762 S 0.487 0.633 Τ 0.450 0.702 T 0.530 0.639 V 0.057 0.190 V 0.493 0.562 W 0.031 0.070 w 0.393 0.461 Υ 0.341 0.498 Y 0.278 0.230 殘質 2 = A 0.548 0.698 W& 6 = A 0.587 0.707 C 0.553 0.694 ’ c 0.585 0.703 D 0.119 0.222 D 0.584 0.701 E 0.563 0.702 E 0.579 0.702 F 0.577 0.717 F 0.586 0.704 G 0.527 0.720 G 0.592 0.709 H 0.534 0.741 H 0.596 0.688 工 0.522 0.722 I 0.602 0.708 K 0.548 0.722 K 0.585 0.691 L 0.482 0.705 L 0.584 0.688 M 0.535 0.705 M 0.583 0.687 N 0.525 0.735 N 0.580 0.686 P 0.445 0.707 P 0.587 0.705 Q ' 0.567 0.756 Q 0.570 0.695 R 0.562 0.719 R 0.576 0.686 S 1 0.587 0.705 S 0.573 0.689 Ί 0.552 0.712 T 1 0.573 0.700 \ ^ 0.550 i 0.702 V 0.588 0.715 V J 0.553 0.701 W 〖0.576 0.696 \ Γ 0.54Ί | 0.704 Y 0.595 0.708 殘質 3 = / i 0.03G 5 0.061 -殘贸 Ί二P ^ 0.58C 丨 0.688 C ： 0.22： ί 0.41C ) C :0.555 » 0.676 Γ 〕 0.01S ) 0.02Ί l E ) 0.573 丨 0.681 I S 0.54： J 0.68S ) E ί 0.56Ξ >0.677 I " 0.03< l 0.06( ) Γ 0.546 i 0.668 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) Φ
、1T
If. 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） -123- 1255272 A7 B7 五、發明説明（12)
G Η I K L Μ Ν ΡQ R S Τ V W Υ ?曼質4 = A C D E F G H I K L M N P Q R S T V W Y 0.016 0.016 0.019 0.053 0.019 0.019 0.024 0.017 0.153 0.015 0.016 0.015 0.016 0.149 0.016 0.016 0.020 0.017 0.016 0.557 0.016 0.470 0.119 0.015 0.559 0.549 0.085 0.030 0.065 0.016 0.026 0.016 0.213 0.291 0.529 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 019 020 024 090 026 027 032 020 406 023 021 019 021 304 020 020 023 G 0.562 0.679 Η 0.557 0.675 工 0.552 0.681 Κ 0.565 0.685 L 0.566 0.701 Μ 0.562 0.697 Ν 0.573 0.688 Ρ 0.582 0.678 Q 0.563 0.679 R 0.551 0.677 S 0.563 0.674 Τ 0.560 0.685 V 0.563 0.687 W 0.547 0.685 Υ 0.560 0.682 殘質8 = A 0.573 0.687 〜· C 0.583 0.700 D 0.586 0.697 E 0.601 0.701 F 0.586 0.687 丨 G 0.569 0.681 ' Η 0.559 0.683 ，工 0.568 0.686 ΐκ 0.557 0.698 ; L 0.570 0.686 > Μ 0.571 0.693 ? Ν 0.573 0.700 ; Ρ 0.574 0.694 ) Q 0.590 0.703 5 R 0.589 0.699 L S 0.599 0.719 L Τ 0.586 0.689 1 V 0.578 0 · 688 3 w 0.567 0.68 7 Υ 0.574 0.680 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 値得注意地，當檢查在各位置處的取代時，可發現 3 D 6和h 3 D 6 v 2的略圖實際上是相一致的（也就是 ，當比較在第1欄（3 D 6 )和第2欄（h 3 D 6 ν 2 ) 的數據時，其數値係以相同方式變動）。這些數據證明 h 3 D 6 ν 2之特異性被保存，因爲該h3D6v2i.NET抗原決 定部位之遺傳圖譜實際上與使用A yS殘質1 - 4和5 - 8 二者的m 3 D 6相同 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -124- 1255272 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7五、發明説明（12》 對P D A P P腦切片之免疫化學分析證明 h 3 D 6 v 1抗體的特異性。擬人化3 D 6 v 1抗體可辨 識從P D A P P小鼠製得之冷凍切片中的A /?。擬人化 3 D 6 v 1和P K 1 6 1 4二者以相同的劑量反應型式連 接P D A P P斑，此係藉由測量在每一玻片上，用於將組 織染色的抗體量所反映出之螢光量（以映像點定量）來決 定（第6圖）。在此實驗中係使用完全相同的抗-人類第 二抗體。切片，染色和成像步驟說明於前。在完全相同的 實驗中，對PDAPP和AD腦切片上之h3D6v2染 色的影像分析顯示出h 3 D 6 v 2係以類似3 D 6 v 1的 方式辨識Α Θ斑（如：經高度修飾的斑）。 h 3 D 6之競爭性連接分析。h 3 D 6抗體v 1和 v 2與老鼠3 D 6競爭的能力係利用生物素化之3 D 6抗 體，藉由E L I S A來測量。競爭性連接分析顯露出 h3D6vl， h3D6v2，和嵌合型PK1614都 可與m3D6競爭連接A/3(第7圖）°h3D6vl和 h 3D 6 v 2與3D6競爭連接A/3的能力完全相同。使 用1 0 D 5抗體做爲陰性對照組，因爲其具有與3 D 6不 同之連接抗原決定部位。B I A核心分析亦透露 h3D6 v 1和h3D6v2對A/S具高親和力C表1 8 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -125- 1255272 ^d(nM) J.88 0.84 ^06 2.24 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（12》 表1 8:利用BIAcore技術測量Αβ抗體親和力 抗體 kal (1/Ms) kda (1 /s) 一 Mu 3D6 4.06E + 05 3.57E-04 一 Chimeric 3D6 4.58E + 05 3.86E-04 一 Hu 3D6vl 1.85E + 05 3.82E-04 一 Hu3D6v2 1.70E + 05 3.78E-04 與 Kd 爲〇.88 11]\4之3〇6相比，h3D6vl 和h 3 D 6 v 2二者的連接親和力均約低於3 D 6之2至 3倍，其所測得之K d各爲2 , 0 6 η Μ和2 _ 2 4 η Μ 。E L I S Α競爭性連接分析顯露出h 3 D 6 ν 1和 h 3 D 6 v 2之連接親和力較3 D 6低約6倍。通常，擬 人化抗體與其老鼠相對物比較時會損失約3 - 4倍之連接 親和力。因此，h 3 D 6 v 1和h 3 D 6 v 2損失約3倍 連接親和力（E L I S A和B I A c 〇 r e結果的平均値 )係在可接受之範圍內。 利用h 3 D 6 v 2抗體之活體外分析。透過活體外吞 噬作用分析（第8圖）來測試h 3 D 6 v 2剌激小神經膣 質細胞的能力。在誘導來自P D A P P老鼠腦組織之A冷 集結物的吞噬作用方面，113〇6^2與嵌合型3〇6〜 樣有效。在此實驗中，使用I g G做爲陰性對照組，因爲 其無法連接A /3，且因此無法誘導出吞噬作用。 活體內，h 3 D 6之腦部局限化。將經所標示之 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210>< 297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)
126- 1255272 A7 B7 五、發明説明（12> h 3 D 6 v 2，m 3 D 6，和抗體D A E 1 3各經IV注入 1 4隻在不同實驗中之個別P D A P P小鼠中。在第7天 時殺死老鼠，並灌注之，以供進一步分析。解剖其腦部區 域並測量特定之腦部區域中的1 2 5 I活性。將腦中之放射 標示活性與血淸樣本中之活性相比。血淸和腦部區域之結 果各列於表1 9和2 0中。 表1 9 m3D6 DAE13 Hu3D6 30389.1 17463.9 40963.8 12171 13200.6 24202.2 3418.2 36284.7 12472.4 18678.9 421.3 33851.8 27241 19702 27187.3 26398.8 24855.8 29016.9 27924.8 29287.4 33830.7 12008.4 12733.1 26734.9 29487.8 27722.5 30144.5 25498.6 30460.7 35126.9 9652 23320.1 28414.8 24599.3 7119.1 16956.1 29240 28093.5 18190.7 11922.7 24659.7 25671.4 17443.1 26748.9 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -127- 1255272 A7 B7 五、發明説明（12令 表2〇 cere 1991.9 238.9 645.9 1000 1266.9 1422 1700.4 542.5 1309 1372.2 778.6 1199.3 1021.8 742.1 1273.7 m3D6 DAE13 cort 1201.1 746.1 603 2508.2 3737.9 2398.7 2154.4 812.4 3010.5 997.5 1291.9 1683.4 3234.5 1056.7 1320.8 hipp 4024 2523 1241.1 4644.2 7975.8 7731.1 7124.1 2456.8 8693.5 2425.4 5654.4 4887.3 8036.2 3405.2 4262.6 cere 1277.5 502.5 2325 232.7 891.6 1102.6 1650.6 712.9 1172.9 1067.9 1952.2 1005.2 961.5 852.3 997.5 cort 2522.9 2123.5 3528.2 849.8 2621 2087.5 3488.4 2318.5 1953.6 3697.2 2120.7 1852.5 3382.9 1943.2 3065.7
Hu3D6 (H2L2) hipp 5711.9 6965.8 7801.6 1891.9 8245.2 7292.3 10284.8 6643.3 7363 12280.7 6412.7 5121.4 8473.1 6717.4 10213.1 cere 2424.6 1509.8 500 2736.2 1192.2 2269.4 1526.7 1538.1 1245.7 2708.8 2251.3 1529.6 6.44.1 1516.4 cort 3759.4 2274.9 2265.9 5703.7 3188 3481.4 3028 4194.1 1699.4 2789 3897.5 1772.2 1663.4 1620.6 hipp 11622 7018.2 5316.3 10395.5 10170 9621.6 8331.3 11244.8 6831.2 7887.4 11121.5 7986.9 5056.5 9888 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) P C R，利用 數據顯示出h 3 D 6 v 2局限在腦部，且特別集中在 A /3集結之海馬區。在腦中所計算出之m 3 D 6和 DAE13的數値與h3D6v2相當。由活體內之A卢 斑連接分析可證明三種抗體均能穿越血液一腦障壁。 實施例XX .老鼠1〇D 5可變區之選殖和定見 1〇D 5 V Η之選殖和序列分析。藉由R Τ — R A C Ε步驟來選殖來自雜交瘤細胞之 5 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製
列 序 D酸 ο 苷 1 核 之的 定出 假生 碼衍 編中 個庫 二殖 從選 〇 A 區N L D V C 和立 Η 獨 V的 的區 5 構 D 結 〇 L 1—IV
〇 : N 〇 N D I D I Q E Q s E ( S 4 3 列中 序 圖 酸 9 基第 胺和 之 1 出 2 演表 推於 及列 各 獨 I 的 I 區 Q 構 E Q 結 s E H ( S V列 C 序列 5 酸序 D 苷酸 ο 核基 ^^^的胺 之出的 定生出 假衍演 碼所推 編中和 個庫 } 二殖 5 從選 1
A : N 〇 D N C 立 D
〇 N D 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -128- 1255272 A7 B7 五、發明説明（12令 1 6 )各列於表2 2和第1 0圖中。該1 — D 5 V L和 V Η序列可符合功能性V區之要件係因爲其包含一從起始 子甲硫胺酸至C -區的連續0 R F，並共享免疫球蛋白V 區基因之保留性殘質的特性。 表2 1 :老鼠1 0 D 5 V L D Ν Α序列 ΑΤΠΆΆΠΤΤΠΓΓΤΟΤΤΆΠΠΓΤΟΤΤΠΠΤΆΠΤΠΆΤΠΤΤΓΤΠΠΆΤΤΓΓΤΓίΓΤΤΓΓΆΠΓΆΠΤΠΑ TGTTTTGATGACCCAAACTCCACTCTCCCTGCCTGTCAGTCTTGGAGATCAAGCCTCCA TCTCTTGCAGATCTAGTCAGAACATTATACATAGTAATGGAAACACCTATTTAGAATGG TACCTGCAGAAACCAGGCCAGTCTCCAAAGCTCCTGATCTACAAAGTTTCCAACCGATT TTCTGGGGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTCAAGA TCAAGAAAGTGGAGGCTGAGGATCTGGGAATTTATTACTGCTTTCAAGGTTCACATGTT CCGCTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGGAA (SEQ ID NO:13) *下加線者爲前導蛋白肽 表22:老鼠10D5 V H DNA序列 ATGGACAGGCTTACTTCCTCATTCCTGCTGCTGATTGTCCCTGCATATGTCCTGTCCCA GGCTACTCTGAAAGAGTCTGGCCCTGGAATATTGCAGTCCTCCCAGACCCTCAGTCTGA CTTGTTCTTTCTCTGGGTTTTCACTGAGCACTTCTGGTATGGGAGTGAGCTGGATTCGT CAGCCTTCAGGAAAGGGTCTGGAGTGGCTGGCACACATTTACTGGGATGATGACAAGCG CTATAACCCATCCCTGAAGAGCCGGCTCACAATCTCCAAGGATACCTCCAGAAAGCAGG TATTCCTCAAGATCACCAGTGTGGACCCTGCAGATACTGCCACATACTACTGTGTTCGA AGGCCCATTACTCCGGTACTAGTCGATGCTATGGACTACTGGGGTC7U\GGAACCTCAGT CACCGTCTCCTCA (SEQ ID NO:15) *下加線者爲前導蛋白肽 實施例X I .人類個體之預防和治瘦_ 進行單一劑量第I期試驗，以決定在人體中之安全性 。從假定之有效濃度0 · 〇 1開始，且逐漸增加至三倍因 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 經濟部智慧財產局g(工消費合作社印製 -129- 1255272 Α7 Β7 五、發明説明（12》 子，直到達到約1 0倍之有效老鼠劑量爲止，將此逐漸增 加之治療劑的劑量給予不同患者。
進行第π期試驗以決定療效。根據阿茲海默氏症及相 關失調協會（A D R D A )對可能之A D所定義的要件， 選出前至中期阿茲海默氏患者。合適之患者爲那些迷你一 心理狀態檢查（Μ M S E )積分在1 2 - 2 6範圍內者。 其它選擇要件爲患者可在硏究期間內存活，並且不具有使 情況複雜化的爭議，如：伴隨使用可能會干擾的藥品。利 用傳統的心理測定法，如：用於評估具阿茲海默氏症狀態 和功能之患者的理解力的Μ M S Ε，和A D A S，來製作 患者功能的基線評估。這些心理測定尺度可測量阿茲海默 氏狀況的進展。合適之定性生活尺度亦可用來偵察治療情 況。疾病進展亦可藉MR I來偵察。患者之血液略圖亦可 藉由包括免疫原-特異性抗體和T -細胞反應等分析來偵 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 始接受治療。以盲試驗方式， 慰劑治療。偵察患者至少六個 而言，治療組是否在進程上有 〇 以S平估患者從非-阿茲海默氏 爲與年齡相關之記憶衰退（ 失調（M C I )轉變成如 茲海默氏症。具高度轉變成阿 由篩選下述相關群體，來從非 在基線測量後，患者開 讓患者任意接受治療劑或安 月。藉由決定相對於安慰組 顯著減緩的情形來決定效果 進行第二個第Π期試驗 症之早期記憶損失（有時稱 A A Μ I ))或溫和之認知 ADRDA要件所定義之阿 茲海默氏症風險的患者係藉 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X 297公釐） -130- 1255272 A7 B7 五、發明説明（12$ 臨床群體中選出：具有與前-阿茲海默氏症之症狀相關的 記憶損失或其它困難等早期徵狀的族群，有阿茲海默氏家 族病史者，有遺傳風險因子者，具有年齡，性別及其它被 發現可預測有罹患阿茲海默氏症之高度風險的特性者。收 集合適之分析程式（包括Μ M S E和A D A S )，以及用 來評估更正常之族群的其它分析程式的基線積分。將這些 患者群體分成合適之安慰劑組與給予替換之治療劑組以進 行比較。在約6個月的期間內，每隔一段時期即追蹤這些 患者群體，而各患者之追蹤終點爲他或她在觀察終點時是 否轉變成由A D R D A要件所定義之可能的阿茲海默氏症 〇 二_般材料與方法 A ·多株和單株A /3杭體的製備方法 自二組動物收集血液來製備抗- A /3多株抗體。第一 組係由1 〇 〇隻6 - 8週大的母瑞士威伯斯特（Webster) 小鼠所組成。在第0，1 5，和2 9天時，以1 0 0微克 AN 1 7 9 2加上C F A/ I F A來免疫接種這些小鼠。 在第3 6天時，以一半劑量之A N 1 7 9 2給予小鼠第四 次注射。在第4 2天殺死動物時將其放血，製備血淸並累 積血淸使全部體積爲6 4毫升。第二組係由2 4隻6至9 週大母鼠所組成，其與p D A P P小鼠爲同源，但並非人 類APP基因之導入外來基因動物。在第〇， 14， 28 ，和56天時，以100微克AN1792加上CFA/ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 、11 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -131 1255272 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明説明（1)29 I F A來免疫接種這些動物。在第6 3天殺死動物時，亦 將其放血，製備血淸並累積血淸，使全部體積爲1 4毫升 。將一批血淸累積起來。連續以5 〇 %飽和硫酸銨沈激二 回合來純化抗體部分。將最終沈澱物對P B S進行透析， 並測試內毒素。該內毒素濃度低於1 E U /毫克。 從腹水製備抗- A /3單株抗體。首先，藉由將濃縮的 葡聚糖硫酸鈉加入冰冷的腹水中，一邊在冰上攪拌，使最 終濃度爲0 _ 2 3 8 %，以將腹水去脂化。然後，將濃縮 C a C 1 2加入其中，一邊攪拌，以使最終濃度爲6 4 ηΊ μ 。將此溶液在1 Ο Ο Ο 0 x g下離心，並丟棄沈澱下來的 小九。將等量之飽和硫酸銨一滴滴地加入上淸液中，且一 邊在冰上攪拌。再一次將溶液在1 〇 〇 〇 〇 X g下離心， 並丟棄上淸液。將沈源小九重新懸浮並對2 0 m Μ Tris-HCl, 0.4M NaCl，pH7.5 進 行透析。將此部分置於Pharmacia FPLC瓊脂糖Q管柱上，以 在2〇mM Tr i s— HC1中之Ο · 4M至 Ο·275M的反梯度NaCl， pH7·5洗提之。 藉由在2 8 Ο n m的吸收來鑑定抗體高峰，並將合適 部分累積起來。利用B C A方法測量蛋白質濃度，並以 S D S - P A G E測量其純度以鑑定純化之抗體製品的特 性。亦測試累積物之內毒素。該內毒素濃度係低於1 E U /毫克效價，將效價低於1 0 0者任意指定爲效價値2 5 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂
本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -132 1255272 A7 B7 五、發明説明（1》0 B •杭f§效價之測量 在小鼠尾部靜脈製作一小切痕，並自此刻痕抽血約 2 0 〇微升至微量離心管。首先，將天竺鼠背部腳腕區剔 毛，然後，利用1 8號針在跪骨靜脈切出切痕，並將血液 收集在微量離心管中。讓血液在室溫下凝固一小時，震盪 混合之，並在1 4 0 〇 〇 X g下離心1 〇分鐘，以將凝血 塊與血淸分開。然後，將血淸轉移至一乾淨的微量離心管 ，貯存在4 °C中，直到需測量效價時。 藉E L I S A測量抗體價。以1 0 0微升含1 0微克 /毫升A /3 4 2或S A P P或其它在'^凹槽覆層緩衝液〃 (Well Coating Buffer ) (0 . 1M 磷酸鈉，pH8 . 5， 〇.1 %疊氮化鈉）中之個別報告所註明的各抗原的溶液 來將9 6 -槽微量滴定盤（Costar ElA盤）覆層，並置於室 溫下一整夜。吸乾槽內溶液，並將在樣本稀釋液（ SpecimenDiluent，◦ . 014M 磷酸鈉，pH7 · 4， 〇.15M NaCl， 0 . 6%牛血清白蛋白， 〇.0 5 %硫柳汞）中之稀釋1 0 0倍的血淸加入槽中， 做爲起始濃度。直接在培養盤內，於三-重步驟中，將樣 本做七次系列稀釋，以使最終濃度爲1 / 2 1 8 7 0 0。 在室溫下，將稀釋液溫育在經過覆層的盤內1小時。然後 ，以含0 . 〇 5 %吐溫2 0 ( Tween 20 )之P B S淸洗培 養盤四次。將1 〇 〇微升第二種抗體（此抗體爲連接至辣 根過氧化酶之山羊抗一老鼠I g，其可從Boehringer M a η n h e i m取得）的1 / 3 〇 0 0稀釋液（在樣本稀釋液中 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂
經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -133- 1255272 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明説明（ 稀釋加入槽內，並在室溫下溫育1小時。再以P B S，吐 溫2 0淸洗培養盤四次。爲了讓色原發展出來，將1 0〇 微升Slow TMB (3，3一，5， 5 / —四甲基聯苯胺，其 可從皮爾斯（Pierce)化學取得）加入各槽中，並在室溫下 溫育15分鐘。藉由加入25微升2M H2S〇4來終止 反應。然後，於4 5 0 n m — 6 5 0 n m處，在分子裝 置 V m a x " ( Molecular Devices Vmax)上讀取顏色濃度 ο 效價之定義爲，產生最大〇 D之一半的血淸稀釋倒數 。通常可從原始之1 / 1 0 0稀釋液取得最大〇D，但當 樣本中具相當高之效價時則例外，在該案例中需要較高之 起始稀釋來建立該最大〇D。若有5 0 %之點均落在二次 稀釋之間時，則需製作線性插補，以計算最終效價。爲了 計算幾何平均抗體效價，將小於1 0 0之效價任意指定爲 效價値2 5。 C .腦組織之製備方法 在安樂死後，移出腦組織，並取一半腦半球用於免疫 化學分析中，從另一腦半球解剖三個腦區（海馬區，皮質 區和小腦區），並利用特異性E L I S A s測量不同A石 之濃度和A P P型（強生-伍德，等，如上述。 將用於E L I S A s之組織在1 0倍體積之冰冷的狐 緩衝液（5 .〇 Μ 胍—H C 1， 5 0 m Μ T r i s — H C 1，P H 8 · 〇 )中均質化。在室溫下，利用亞當斯 (讀先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
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T 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -134 - 1255272 Α7 Β7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明説明（1》2 Nutator ( Adams Nutator，費雪公司）溫和攪動均質液3 - 4小時，以混合均質液，然後，將其貯存在- 2 〇 °C下， 直到需定量A yS和A P P時。先前的實驗已顯示出在此貯 存條件下之分析物很穩定，而在將該合成之A /3蛋白質（ B a c h e m )注入來自同胎老鼠的對照組腦組織均質液中後， 此A /3蛋白質可被定量回復。（強生-伍德，等，如上述 )〇 D .測量A /3濃度 以冰冷之酪蛋白稀釋液（0 · 2 5 %酪蛋白，P B S ，0.05%疊氮化鈉，20微克/毫升抗蛋白酶酞，5 m Μ E D T A ρΗ8 · 0，1 0微克/毫升、、留派叮 〃 （leupeptin))將腦均質液做1 : 1 0之稀釋，然後， 在4艺下，於16〇〇0xg離心20分鐘。製備合成之 A /3蛋白質標準（1 一 4 2胺基酸）和A P P標準，以使 最終組成物中包含0 . 5 Μ胍，和0 · 1 %牛血淸白蛋白 (B S A )。、、全部〃 A /3之三明治E L I S A係利用特 異於A /3之胺基酸1 3 — 2 8的單株抗體2 6 6 (休伯特 ，如上述）做爲捕捉抗體，並以特異於A /S之胺基酸1 -5的生物素化單株抗體3 D 6 (強生-伍德，等，如上述 )做爲通訊者抗體。該3 D 6單株抗體不會辨認分泌出之 APP或全長APP，而僅偵察帶有胺基端天門冬酸之 A万。本分析之感受性下限爲〜5 0毫微克/毫升（1 1 η M)，並且顯示出不會與濃度高至1毫微克/毫升的內 (請先閱讀背面之注意事項存填寫本頁)
-•呑
本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X 297公釐） -135 1255272 A7 B7 五、發明説明（作3 生性老鼠A /3蛋白質有交叉-反應性（強生一伍德，等， 如上述）。 該A /3 1 - 4 2之特異性三明治E L I S A係使用特 異於A /3之胺基酸3 3 — 4 2的m A冷2 1 F 1 2 (強生 -伍德，等，如上述）來做爲捕捉抗體。在本分析中，生 物素化之m A /3 3 D 6亦爲通訊者抗體，其感受性下限爲 約1 2 5微克/毫升（2 8 // Μ，強生一伍德，等，如上 述）。在A/S ELISAs方面，藉由在TR下溫育一 整夜，將100微升之mA/3266 (濃度10微克/毫 升）或m A /3 2 1 F 1 2 (濃度5微克/毫升）覆層至 9 6 -槽免疫分析盤（柯斯達（Co star))上。將溶液吸除 ，並藉由在室溫下，將200微升在PBS緩衝液中之 〇.2 5 %人類血淸白蛋白加入槽中至少1小時來阻斷這 些培養槽。移除阻斷溶液，並將培養盤除濕貯存在4 t下 ，直到需使用時。使用前，以淸洗緩衝液〔T r i s -緩 衝之生理食鹽水（0.15M N a C 1 , 0 . 0 1 Μ T i* i s — H C 1， ρ Η 7 · 5 )，加 0 .〇 5 % 吐溫 2〇〕將此盤再水化。將樣本和標準加入凹槽內，每一槽 爲10 0微升，一'式二份，然後，將它們在4 C下培養一 整夜。在分析中的各個步驟間，以淸洗緩衝液淸洗培養盤 至少三次。以酪蛋白分析緩衝液（0 · 2 5 %酪蛋白， P B S，〇 . 〇 5 %吐溫2 0，P Η 7 . 4 )將生物素化 之m A /3 3 D 6稀釋成〇 . 5微克/毫升，在室溫下， 將其加入槽中並培養1小時。將在酪蛋白分析緩衝液中稀 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -136 - 1255272 A7 _ _ B7 五、發明説明（1>4 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 釋4 0 〇 0倍之抗生物素-辣根過氧化酶結合物（抗生物 素—HRP可自維克多（Victor )公司，加州柏林根市，取 得）加入槽中，在室溫下置放1小時。將比色受質Slow TMB-ELISA(皮爾斯（Pierce))加入其中，並在室溫下反 應1 5分鐘，然後，藉由加入25微升2N H2S〇4來 終止酵素反應。利用分子裝置V m a X測量在吸收度 4 5 〇 n m和6 5 0 n m處的差異，以定量反應產物。 1 .測量A P P濃度 使用_^種不同的A P P分析。第一種分析命名爲 APP - α/FL，其辨識APP的ΑΡΡ — α和全—長 (F L )型。第二種分析係特異於A Ρ Ρ — α。該A Ρ Ρ —a / F L分析辨認分泌出之A P P，包括A /3的前1 2 個胺基酸。由於該通訊者抗體（2 Η 3 )並不特異於^ -夾一位置（此位置係發生在A Ρ Ρ 6 9 5之胺基酸6 1 2 -6 1 3之間）（伊斯克，等，科學2 4 8 ·· 1 1 2 2 —
1 1 2 4 ( 1 9 9 0 ));此分析也可辨識全長之A P P 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 (A P P — F L )。該利用針對A P P - F L細胞質尾端 之固定的A P P抗體來消耗盡A P P - F L之腦部均質液 的預備性竇驗提出：約有3 0 — 4 0 %之A P P — α / F L A P P爲F L (數據並未顯示）。A P P — α / F L和A P p — α二種分析的捕捉抗體爲m A b 8 E 5， 此係針對A P p 6 9 5型之胺基酸4 4 4至5 9 2所產生的 抗體（嘉姆斯，等，如上述）〇APP - α/FL分析之 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -137 1255272 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明説明（作5 通訊者m A b爲特異於A P P 6 9 5之胺基酸5 9 7 -6〇8的m A b 2 Η 3 (強生一伍德等，如上述），而 ΑΡΡ—α分析之通訊者抗體爲一種mAb16H9之生 物素化衍生物，此係針對A P P之胺基酸6 0 5至6 1 1 所產生。該A P P - a F L分析之感受性的下限約爲1 1 毫微克/毫升（150ΡΜ)(強生一伍德，如上述）， 而A Ρ Ρ - α特異性分析之感受性下限爲2 2毫微克/毫 升（0 . 3 η Μ )。在二種A Ρ Ρ分析方面，將 m A b 8 E 5依上述關於m A b 2 6 6之描述覆層至9 6 -槽E I A盤的凹槽上。使用經純化及重組之分泌出的 ΑΡΡ — α來做爲ΑΡΡ — α分析和APP — α/FL分 析的參考標準（伊斯克，等，如上述）。將在5 Μ胍中之 腦均質液樣本以E L I S Α樣本稀釋液（〇 . 〇 1 4 Μ磷 酸緩衝液，Ρ Η 7 · 4，0 . 6 %牛血淸白蛋白， 〇.〇5 %硫柳汞，〇· 5 Μ N a C 1 ，〇.1 % Ν Ρ 4 Ο )稀釋1 0倍。然後，將其在含〇 . 5 Μ胍之樣 本稀釋液中做1 : 4之稀釋。然後，在室溫下，將稀釋之 均質液在1 6 Ο Ο Ο X g離心1 5秒。將A Ρ Ρ標準和樣 本加入盤中，一式二份，並在室溫下培養1 · 5小時。將 生物素化之通訊者抗體2 Η 3或1 6 Η 9與樣本在室溫下 培養1小時。將抗生蛋白鏈菌素-鹼性磷酸酶（Boehringer Mannheim )在樣本稀釋劑中做1 : 1 〇 〇 〇稀釋，然後置 於凹槽中，於室溫下培養1小時。加入螢光受質4 _甲基 -繳形基-磷酸鹽，並在室溫下培養3 〇分鐘，然後，在 (请先閱讀背面之注意事項存填寫本頁)
装· 訂 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） -138- 1255272 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（作6 〇丫1:〇!'111〇1*1；111 235〇營光5十（]\411110〇^)上，於 3 6 5 nrn 的 激動波和4 5 0 n m的發射波處讀取培養盤之結果。 F .免疫組織化學 將腦邰在4 0 C下，於P B S中之4 %三聚甲醛中固 定三天，然後，在4 °C下，貯存於1 %三聚甲醛中1至7 天，直到進行切片。在一組織切片機上，於室溫下進行切 片，其大小爲4 0微米厚之冠狀切片，並將其貯存在2〇 t之冷凍保護劑（在磷酸緩衝液中之3 〇 %甘油，3 〇 % 乙二醇）中，直到進行免疫組織化學的處理。將每個腦在 背側海馬區水平處做6片切片，各切片間係藉連續的 2 4 0微米間隔來分開，將這些切片與下列抗體之一培養 一整夜：（1)生物素化之抗一厶/3(111厶13，3〇6， 特異於人類A /3 )，其係在P B S和1 %馬血淸中稀釋爲 濃度2微克/毫升；或（2)特異於人類APP，8 E 5 之生物素化m A b，其係在P B S和1 . 0 %馬血淸中稀 釋爲濃度3微克/毫升；或（3 )特異於神經膠質原纖維 酸性蛋白質之m A b ( G F A P，史格馬（Sigma )化學公 司），其係以〇 . 2 5 %三硝基甲苯和1 %馬血淸（在 T r i s -緩衝之生理食鹽水中，p Η 7 . 4 ( T B S ) )稀釋5 0 0倍；或（4 )特異於C D 1 1 b，M A C -1抗原之m A b ( Chemicon國際公司），其係以在T B S 中之0 · 2 5 %三硝基甲苯和1 %兔子血淸稀釋1 〇 0倍 ;或（5 )特異於 Μ H C Π 抗原之 m A b ( Pharmingen 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
-139, 1255272 A7 B7 五、發明説明（1》7 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) )，其係以在T B S中之〇 · 2 5 %三硝基甲苯和1 %兔 子血淸稀釋1 0 0倍；或（6 )特異於c D 4 3之大鼠 ill A b ( Pharmingen )，其係以在PBS中之1%兔子血 淸稀釋1 0 0倍；或（7 )特異於C D — 4 5 R A之大鼠 mA/3 (Pharmingen)，其係以在PBS中之1%兔子血 淸稀釋1 0 0倍；或（8)特異於CD45RB之大鼠單 株A/5 (Pharmingen)，其係以在PBS中之1%兔子血 淸稀釋1 0 0倍；（9 )特異於C D 4 5之大鼠單株A /3 (Pharmingen )，其係以在PBS中之1%兔子血淸稀釋 1〇0倍，或（1 0 )特異於c D 3 e之生物素化多株鼠 鼠A yS ( Pharmingen)，其係以在PBS中之1%兔子血 淸稀釋1 0 0倍，或（1 1 )特異於C D 3之大鼠m A b (Serotec)，其係以在P B S中之1 %兔子血淸稀釋 2 〇 〇倍；或與（1 2 )缺乏初級抗體，含1 %正常的血 淸之P B S溶液一起培養。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 在室溫下，將與列於上述1，2和6 — 1 2之抗體溶 液進行反應的切片先以在P B S中之1 · 〇 %三硝基甲苯 ，0 . 4 %過氧化氫預先處理2 0分鐘，以阻斷內生性過 氧化酶。接著，將它們與初級抗體在4 °C下培養一整夜。 然後，將與3D6或8E5或CD3e mAbS反應之 切片在室溫下與辣根過氧化酶-卵白素-生物素一複合物 加上在P B S中稀釋7 5倍之套組成分'、A 〃和、、B 〃 （
Vector Elite標準套組，維克多實驗室，加州伯林根）一起 反應1小時。將與特異於C D 4 5 R A , CD 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） -140, 1255272 A7 _B7_ 五、發明説明（作8 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 4 5 R B , CD 4 5 ; C D 3之抗體和缺乏初級抗體之 P B S溶液進行反應的切片在室溫下，分別與在P B S中 ，稀釋7 5倍之生物素化的抗一大鼠I g G ( V e c t 〇 r )，或 在P B S中，經1 : 7 5稀釋過之生物素化的抗一老鼠 I g G ( Vector ) —起培養1小時。然後，將切片在室溫下 與辣根過氧化酶-卵白素-生物素-複合物加上在P B S 稀釋5倍之套組成分'' A 〃和B 〃 （ V e c t 〇 r E1 i t e標準套 組，維克多實驗室，加州伯林根）一起反應1小時。 將切片在室溫下於0.01%過氧化氫，0.05%
經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 3，3 / —二胺基聯苯胺（D A B )中逐漸作用。將該指 定與GFAP —，MAC—1 -和MHCn —特異性抗體 培養之切片預先以0 _ 6 %過氧化氫在室溫下處理，以阻 斷內生性過氧化酶，然後，與初級抗體在4 °C下培養一整 夜。將與G F A P抗體反應之切片在室溫下與在T B S中 稀釋2 0 0倍之生物素化的抗老鼠I g G (於馬體內製造 者，維克多實驗室；Vectastain Elite ABC套組）一起培養 1小時。接著，將與做爲初級抗體之M A C - 1 一或 Μ H C Π -特異性單株抗體一起培養的切片在室溫下，與 在T B S稀釋2 0 0倍之生物素化的抗一大鼠I g G (在 兔子體內製造）進行反應，接著，再與卵白素-生物素-過氧化酶複合物（以T B S稀釋1 0 〇倍）培養1小時。 然後，將與G F A P -，M A C — 1和Μ H C Π —特異性 抗體一起培養的切片在室溫下以0.05%DAB， 0 · 0 1 %過氧化酶，0 · 0 4 %氯化鎳，T B S分別處 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） -141 - 1255272 A7 B7 五、發明説明（1》9 理4和1 1分鐘，以藉目視檢查之。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 將經過免疫標示之切片封固在玻片上（VWR， Superfrost載玻片），風乾一整夜後，浸在Propar ( Anatech )中，並以蓋玻片，利用Permount (費雪公司）做爲封固 介質，蓋在上面。 爲了將A /3斑做對比染色，將G F A P -陽性切片之 分組封固在Super fro st載玻片上，並在1 %硫黃素S水溶液 (史格馬公司）中培養7分鐘，再做免疫組織化學處理。 然後，將切片脫水並在Propar中澄淸，然後以Permount，將 蓋玻片固封在上面。 G .影像分析 透過一 C C D攝影機，將Videometric 150影像分析系 統（女可（Oncor)公司，馬利蘭州盍瑟堡）連接至Nikon Mi crop hot-FX顯微鏡，並使用新力Trinitron偵察器來定量該 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 免疫反應玻片。將切片的影像儲存在影像緩衝液中，決定 以顏色和飽和度爲根據之閾，以選擇並計算由經免疫標示 之構造所佔據的映像點區。在各個切片方面，以手工描出 海馬區之輪廓，並計算由海馬區所佔據之全部映像點區域 。殿粉樣負載量之百分比的測量係以下式表示：（與 m A b 3 D 6免疫反應之含A yS沈積物的海馬區部分） X 1 0 0。類似地，神經炎負載量之百分比的測量係以下 式表示：（與單株抗體8 E 5反應之含營養不良神經突的 海馬區部分）X 1 0 0。透過—Optronic相機，將操作 本抵張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） ' ' 一 -142- 1255272 A7 B7 五、發明説明（1》0 811^1632軟體應用程式的（：一成像系統（（：〇11^\公司，賓 州克蘭貝利鎭）連接至NikonMicrophot-FX顯微鏡，並用來 疋量被G F A P -陽性星形細胞和M A C - 1 一及 M A C Π -陽性神經膠質細胞所佔據之胼胝體結後皮質區 。將免疫反應切片之影像貯存在影像緩衝液中，並決定以 單色爲根據的閾，以選出並計算由經免疫標示之細胞所佔 據之全部影像點區域。在每一切片部分，以手工描出胼胝 體結後皮質區（R S C )的輪廓，並計算由R S C所佔據 之全部影像點區域。星形細胞增多症之百分比以下式來定 義：（由G F A P -反應性星形細胞所佔據之R S C部分 )X 1 0 0。在所有影像分析方面，定量各動物位在背側 海馬區水平的六個切片（各由連續之2 4 0微米間隔所分 開）。在所有情況中，觀察者並不知道動物之治療狀態。 雖然前述之本發明爲了讓人淸楚了解已做了詳細說明 ，但很淸楚的是仍可在附屬之申請專利範圍內做某些改良 。所有本文所列出之申請案和專利文件，以及在圖形和序 列表中所出現之內容全部倂爲本文中適用所有目的的參考 資料，其適用程度就如它們係被個別指出般。 從前述可淸楚知道本發明提供許多用途。例如，本發 明提供上述任何針對A /3之抗體在治療，預防或診斷產生 澱粉樣變性之疾病方面的用途，或在製造用於相同疾病中 之藥品或診斷組成物方面的用途。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂
經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -143- 1255272 A7 五、發明説明（14) 序列表 <110〉 Basi, Guriq 等 <12 Q >辨識P -澱粉樣蛋ή肽之擬人化沆體 <130> ELM-002 <150> 60/251,892 <151> 2000-12-06 <160> 32
<170>片1於視窗4.0版之FastSEQ
<210> 1 <211〉 396 <212> DNA <213>家鼠 <220> <221> CDS <222〉 （1)…（396) <221> sig_蛋白呔 <222> (1)...(60) <400> 1 atg atg agt cct gcc cag ttc ctg ttt ctg tta gtg etc tgg att egg 48
Met Met Ser Pro Ala Gin Phe Leu Phe Leu Leu Val Leu Trp lie Arg -20 -15 -10 -5 gaa acc aac ggt tat gtt gtg atg acc cag act cca etc act ttg teg 96 mu Thr Asn Gly Tyr Val Val Met Thr Gin Thr Pro Leu Thr Leu Ser 1 5 10 gtt acc att gga caa cca gcc tcc ate tet tgc aag tea agt cag age 144
Val Thr lie Gly Gin Pro Ala Ser lie Ser Cys Lys Ser Ser Gin Ser 15 20 25
U etc tta gat agt gat gga aag aca tat ttg aat tgg ttg tta cag agg 192
Leu Leu Asp Ser Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gin Arg 30 35 · 40 cca ggc cag tet cca aag ege eta ate tat ctg gtg tet aaa ctg gac 240
Pro Gly Gin Ser Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp 45 50 55 60 tet gga gtc cct gac agg ttc act ggc agt gga tea ggg aca gat ttt 288
Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe 65 70 75 aca ctg aaa ate age aga ata gag get gag gat ttg gga ett tat tat 336
Thr Leu Lys lie Ser Arg lie Glu 八la Glu Asp Leu Gly Leu Tyr Tyr 80 85 90 tgc tgg caa ggt aca cat ttt cct egg aeg ttc ggt gga ggc acc aag 384
Cys Trp Gin Gly Thr His Phe Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys 95 100 105 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) # 訂 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -144- 1255272 A7 Β7 五、發明説明（地¥ ctg gaa ate aaa 396 Leu Glu lie Lys 110 <210> 2 <211> 132 <212> PRT <213>家鼠1 <220> <221> SIGNAL <222> (1)...(20) <400> 2 Met Met Ser Pro Ala Gin Phe Leu Phe Leu Leu Val Leu Trp lie Arg -20 -15 -10 -5 Glu Thr Asn Gly Tyr Val Val Met Thr Gin Thr Pro Leu Thr Leu Ser 1 5 10 Val Thr lie Gly Gin Pro Ala Ser lie Ser Cys Lys Ser Ser Gin Ser 15 20 25 Leu Leu Asp Ser Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gin Arg 30 35 40 Pro Gly Gin Ser Pro Lys Arg Leu He Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp 45 50 55 60 Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe 65 70 75 Thr Leu Lys lie Ser Arg lie Glu Ala Glu Asp Leu Gly Leu Tyr Tyr 80 85 90 Cys Trp Gin Gly Thr His Phe Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys ；95 100 105 Leu Glu lie Lys 110 _ - A一.- <210> 3 <211> 414 <212> DNA <213>家鼠 <220> <221> CDS <222> (1) . . . (414) <221> sig_蛋臼肽 <222> (1)...(57) ---- tti -- I— -- i! I - ....... I (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
、1T 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 <400> 3 atg aac ttc ggg etc age ttg att t tc ett gtc ett gtt tta aaa ggt 4 8 Met Asn Phe Gly Leu Ser Leu lie Phe Leu Val Leu Val Leu Lys Gly -15 -10 -5 gtc cag tgt gaa gtg aag ctg gtg gag tet ggg gga ggc tta gtg aag 96 Val Gin Cys Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys 1 5 10 cct: gga gcg tct ctg aaa etc tcc tgt gca gcc tet gga title act ttie 1 4 Pro Gly Ala Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe 15 20 25 本紙張尺度適用中國國家樣準（CNS ) Α4規格（210'乂297公釐） -145- 1255272 A7 B7 五、發明説明（14 agt aac tat ggc atg tct tgg gtt cgc cag aat tea gac aag agg ctg Ser Asn Tyr Gly Met Ser Trp Val Arg Gin Asn Ser Asp Lys Arg Leu 30 35 40 45 192 gag tgg gtt gca tcc att agg agt ggt ggt ggt aga acc tac tat tea 240 Glu Trp Val Ala Ser lie Arg Ser Gly Gly Gly Arg Thr Tyr Tyr Ser 50 55 60 gac aat gta aag ggc ega ttc acc ate tcc aga gag aat gcc aag aac 288 Asp Asn Val Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Glu Asn Ala Lys Asn 65 70 75 ,, acc ctg tac ctg caa atg agt agt ctg aag tct gag gac aeg gcc ttg 336 Thr Leu Tyr Leu Gin Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Leu 80 85 90 tat tat tgt gtc aga tat gat cac tat agt ggt age tcc gac tac tgg 384 Tyr Tyr Cys Val Arg Tyr Asp His Tyr Ser Gly Ser Ser Asp Tyr Trp 95 100 105 ggc cag ggc acc act gtc aca gtc tcc tea Gly Gin Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 110 115 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印1 <210> 4 <211> 138 <212> PRT <213>家鼠 <220> <221> SIGNAL <222> (1)...(19) <400> 4 ‘ ^'Met Asn Phe Gly Leu Ser Leu He Phe Leu Val Leu Val Leu Lys Gly -15 -10 -5 Val Gin Cys Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys 15 10 Pro Gly Ala Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe 15 20 25 Ser Asn Tyr Gly Met Ser Trp Val Arg Gin Asn Ser Asp Lys Arg Leu 30 35 40 45 Glu Trp Val Ala Ser lie Arg Ser Gly Gly Gly Arg Thr Tyr Tyr Ser 50 55 60 Asp Asn Val Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Glu Asn Ala Lys Asn 65 70 75 Thr Leu Tyr Leu Gin Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Leu 80 85 90 Tyr Tyr Cys Val Arg Tyr Asp His Tyr Ser Gly Ser Ser Asp Tyr Trp 95 100 105 Gly Gin Gly Thr Thr lie Thr Val Ser Ser 110 115 <210> 5 <211> 132 <212> PRT <213>人丨：序列 <220> 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐）
-146- 1255272 A7 B7 五、發明説明（14 ❹ <221> SIGNAL <222> (1)...(20) :223>擬人化之3D6重鏈可變區 <400> 5 Met Met Ser Pro Ala -20 Glu Thr Asn Val Thr Pro 15 Leu Leu Asp 30 Pro Gly Gin 45 Ser Gly Val Thr Leu Lys
Cys Trp Gin 95 Val Glu lie Lys 110
Gly Tyr 1 Gly Glu Ser Asp Ser Pro Pro Asp 65 lie Ser 80 Gly Thr
Gin Phe -15 Val Val Pro Ala Gly Lys 35 Gin Arg 50 Arg Phe Arg Val His Phe
Leu Phe Met Thr 5 Ser lie 20 Thr Tyr Leu lie Ser Gly Glu Ala 85 Pro Arg 100
Leu Leu -10 Gin Ser Ser Cys Leu Asn Tyr Leu 55 Ser Gly 70 Glu Asp Thr Phe
Val Leu Trp lie Pro Leu
Lys Ser 25 Trp Leu 40 Val Ser Ser Gly Val Gly Gly Gin 105
Ser Leu 10 Ser Gin Leu Gin Lys Leu Thr Asp 75 Val Tyr 90 Gly Thr
Arg -5 Pro Ser Lys Asp 60 Phe Tyr Lys (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) <210> 6 <211> 125 <212> PRT <213>現代人 <220> . <221> SIGNAL <222> (1)...(19) *<400> 6 Met Gly Leu Leu Met Leu Trp Val
Met Thr Gin Ser lie Ser 15 Asn Tyr Leu 30 Leu lie Tyr Ser Gly Ser Glu Ala Glu 80 Pro Arg Thr 95 -15 Ser Pro 1 Cys Arg Asp Trp Leu Gly 50 Gly Ser 65 Asp Val Phe Gly
Leu Ser Leu 5 Ser Ser Gin 20 Tyr Leu Gin 35 Ser Asn Arg Gly Thr Asp Gly Val Tyr 05 Gin Gly Thr 100
Ser Gly -10 Pro Val Ser Leu Lys Pro Ala Ser 55 Phe Thr 70 Tyr Cys Lys Val
Ser Ser Gly Thr Pro Gly 10 Leu His Ser 25 Gly Gin Ser 40 Gly Val Pro Leu Lys lie Met Gin Ala 90 Glu lie Lys 105
Asp lie -5 Glu Pro Asn Gly Pro Gin Asp Arg 60 Ser Arg 75 Leu Gin
Val Ala Tyr Leu 45 Phe Val Thr
<210> 7 <211> 100 <212> PRT <213>現代人 <_> 7 Asp He Val Met Thr Gin Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 本紙張足度適用中國國家標隼（CNS ) A4規格（210X 297公潼）
147 1255272 A7 B7 五、發明説明（ 1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser He Ser Cys Arg Ser Ser Gin Ser Leu Leu His Ser 2〇 25 30
Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gin Lys Pro Gly Gin Ser 35 40 45
Pro Gin Leu Leu He Tyr Leu Gly Ser Asn Arg 7\la Ser Gly Val Pro 50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys He 65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gin Ala 85 90 95
Leu Gin Thr Pro 100
<210> 8 <211> 138 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>擬人化之3D6重鏈可變區 <221> SIGNAL <222> (1)...(19) <400> 8
Met Asn Phe Gly Leu Ser Leu lie Phe Leu Val Leu Val Leu Lys Gly -15 -10 -5
Val Gin Cys Glu Val Gin Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin 1 5 10
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe 15 20 25
Ser Asn Tyr Gly Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu 30 35 4 0 4 5 ..^Glu Trp Val Ala Ser He Arg Ser Gly Gly Gly Arg Thr Tyr Tyr Ser 5〇 55 60
Asp Asn Val Lys Gly Arg Phe Thr He Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn 65 70 75
Ser Leu Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu 80 ’ 85 90
Tyr Tyr Cys Val Arg Tyr Asp His Tyr Ser Gly Ser Ser Asp Tyr Trp 95 100 105
Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 110 115 <210> 9 <211> 121 <212> PRT <213>現代人 •f <400> 9
Glu Val Gin Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 2〇 25 30
Ala Val Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ser Ala He Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 5 5 60
(請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
訂
^ 本_適用____-2_ _148_ 1255272 A7 1五.I___ -· ______________—----1----經濟部智慧財產局員工消費合作社印製
Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ala Lys As/i Ser Leu Tyr 65 7〇 75 80 Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Asp Asn Tyr Asp Phe Trp Ser Gly Thr Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 10 <211> 98 <212> PRT <213>現代人 <400> 10 Glu Val Gin Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro 1 5 10 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 Ser Ala lie Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr 65 70 75 Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 Ala Lys <210> 11 <211> 132 … <212> PRT W<<213>人工序列 <220> <221> SIGNAL <222> (1) . . . (20) <223>擬人化之3D6重鏈可變區 <400> 11 Met Met Ser Pro Ala -20 Glu Thr Asn Gly Asp 1 Val Thr Pro Gly Glu 15 Leu Leu Asp Ser Asp 30 Pro Gly Gin Ser Pro 45 Ser Gly Val Pro Asp 65 Thr Leu Lys lie Ser 80 Cys Trp Gin Gly Thr 95 Val Glu lie Lys
Gly Gly 15 Ser Tyr Trp Val Ser Val Leu Tyr ，80 ; Tyr Cys 95
Gin Phe Leu Phe Leu Leu Val Leu Trp -15 Val Val Pro Ala Gly Lys 35 Gin Arg 50 Arg Phe Arg Val His Phe
Met Thr 5 Ser lie 20 Thr Tyr Leu lie Ser Gly Glu Ala 85 Pro Arg 100 -10 Gin Ser Pro Ser Cys Lys Leu Asn Trp 40 Tyr Leu Val 55 Ser Gly Ser 70 Glu Asp Val Thr Phe Gly
Leu Ser 10 Ser Ser 25 Leu Leu Ser Lys Gly Thr Gly Val 90 Gin Gly 105
He Arg -5 Leu Pro Gin Ser Gin Lys Leu Asp 60 Asp Phe 75 Tyr Tyr Thr Lys -------If (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（ 210X 297 公釐） -149 - l255272 A7B7 五 110
<21〇> 12 <211> 138 <212> PRT 人工序列 <220〉 <223> 擬人化之3D6輕鏈可變區 <221> SIGNAL <222〉 （1)…（19) <400> 12
Met Asn Phe Gly Leu Ser Leu lie Phe Leu Val Leu Val Leu Lys Gly -15 -10 -5
Val Gin Cys Glu Val Gin Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin 1 5 10
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe 15 20 25
Ser Asn Tyr Gly Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu
Tf 30 35 . 40 . 45 GLu Trp Val Ala Ser lie Arg Ser Gly Gly Gly Arg Thr Tyr Tyr Ser 50 55 60
Asp Asn Val Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn ; 65 70 75
Thr Leu Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val 80 85 90
Tyr Tyr Cys Val Arg Tyr Asp His Tyr Ser Gly Ser Ser Asp Tyr Trp 95 100 105
Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 110 115 <210> 13 <211> 393 <212> DNA <213>家鼠1 <220> <221> CDS <222〉 （1)…（393) <221> 白肽 <222> (1)7..(57) <400> 13 atg aag ttg cct gtt agg ctg ttg gta ctg atg ttc tgg att cct get 48
Met Lys Leu Pro Val Arg Leu Leu Val Leu Met Phe Trp lie Pro Ala -15 -10 -5 tcc age agt gat gtt ttg atg acc caa act cca etc tcc ctg cct gtc 96
Ser Ser Ser Asp Val Leu Met Thr Gin Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val 1 5 10
agt ett gga gat caa gcc tcc ate tet tgc aga tet agt cag aac att 1AA
Ser Leu Gly Asp Gin Ala Ser lie Ser Cys Arg Ser Ser Gin Asn lie 15 20 25 ata cat agt aat gga aac acc tat tta gaa l:gg tac ctg cag aaa cca 192 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X 297公釐]1 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) #
、1T 經濟部智慧財產局員工消費合作杜印製 -150- I2s5272
五 _ _I____ -1^-- I , I , 經濟部智慧財產局員工消費合作杜印製 lie His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gin Lys Pro 30 35 40 45 ggc cag tct cca aag etc ctg ate tac aaa g11 tcc aac ega ttt tet 2 4 0 Gly Gin Ser Pro Lys Leu Leu lie Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser 50 ' 55 60 ggg gtc cca gac agg ttc agt ggc agt gga tea ggg aca gat ttc aca 288 :, Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 65 70 75 etc aag ate aag aaa gtg gag get gag gat ctg gga att tat tac tgc 336 Leu Lys lie Lys Lys Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly lie Tyr Tyr Cys 80 85 90 ttt caa ggt tea cat gtt ccg etc aeg ttc ggt get ggg acc aag ctg 384 Phe Gin Gly Ser His Val Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu 95 100 105 gag ctg gaa Glu Leu Glu 110 <210> 14 <211> 131 <212> PRT <2U>家鼠^ <220> <221> SIGNAL <222> (1.) ...(19) <400> 14 Met Lys Leu Pro Ser Ser Ser Asp 1 Ser Leu Gly Asp 15 lie His Ser Asn 30 Gly Gin Ser Pro Gly Val Pro Asp 65 Leu Lys lie Lys 80 Phe Gin Gly Ser 95 Glu Leu Glu 110 <210> 15 <211> 426 <212> DNA <213>家鼠
<220> <221> CDS 393 ---------- (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)
、1T
Val Arg Leu Leu Val Leu Met Phe Trp -15 Va.l Leu Gin Ala Gly Asn 35 Lys Leu 50 Arg Phe Lys Val His Val
Met Thr Gin 5 Ser lie Ser 20 Thr Tyr Leu Leu lie Tyr Ser Gly Ser 10 Glu Ala Glu 85 Pro Leu Thr 100 -10 Thr Pro Cys Arg Glu Trp 40 Lys Val 55 Gly Ser Asp Leu Phe Gly
Leu Ser 10 Ser Ser 25 Tyr Leu Ser Asn Gly Thr Gly lie 90 Ale Gly 105 lie Pro Ala -5 Leu Pro Val Gin Asn lie Gin Lys Pro 45 Arg Phe Ser 60 Asp Phe Thr 75 Tyr Tyr Cys Thr Lys Leu 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 1255272 A7 B7 五、發明説明（1伞 <222> (1)…（426) < 2 2 1 > s i g_ 蛋 I，」FI太 <222> (1)7. . (57) <400> 15 atg gac agg ctt act tcc tea l:tc ctg ctg ctg att gtc cct gca tat Met Asp Arg Leu Thr Ser Ser Phe Leu Leu Leu lie Val Pro Ala Tyr 48 -15 -10 -5 gtc ctg tcc cag get act ctg aaa gag tet ggc cct gga ata ttg cag 96 Val Leu Ser Gin Ala Thr Leu Lys Glu Ser G1y Pro Gly lie Leu Gin 15 10 tcc tcc cag acc etc agt ctg act tgt tet ttc tet ggg ttt tea ctg 144 Ser Ser Gin Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu 15 20 25 age act tet ggt atg gga gtg age tgg att cgt cag cct tea gga aag 192 Ser Thr Ser Gly Met Gly Val Ser Trp lie Arg Gin Pro Ser Gly Lys 30 35 40 45 (讀先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) % ggt ctg gag tgg ctg gca cac att tac tgg gat gat gac aag ege tat 240
Gly Leu Glu Trp Leu Ala His lie Tyr Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr 50 55 60 aac cca tcc ctg aag age egg etc aca ate tcc aag gat acc tcc aga 288 訂
Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Leu Thr lie Ser Lys Asp Thr Ser Arg 65 70 75 aag cag gta ttc etc aag ate acc agt gtg gac cct gca gat act gcc Lys Gin Val Phe Leu Lys lie Thr Ser Val Asp Pro Ala Asp Thr Ala 80 85 90 ，aca tac tac tgt gtt ega agg ccc att act ccg gta eta gtc gat get ^Thr Tyr Tyr Cys Val Arg Arg Pro He Thr Pro Val Leu Val Asp Ala 95 100 105 atg gac tac tgg ggt caa gga acc tea gtc acc gtc tcc tea Met Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 110 115 120 336 384 426 經· 濟 部 智 慧 財 產 局 員 X 消 費 合 作 社 印 製
<210> 16 <211> 142 <212> PRT <213>家鼠i <220> · <221> SIGNAL ’ <222> (1)...(19) <_> 16
Met Asp Arg Leu Thr Ser Ser Phe Leu Leu Leu He Val Pro Ala Tyr -15 -10 -5
Val Leu Ser Gin Ala Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly He Leu Gin 1 5 10
Ser Ser Gin Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu 15 20 25
Ser Thr Ser Gly Met Gly Val Ser Trp He Arg Gin Pro Ser Gly Lys 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X?97公釐； -152 - 1255272 A7 B7 五、發明説明（15jD丨} (、、 w 、_· 30 35 40 45
Gly Leu Glu Trp Leu Ala His lie Tyr Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr 50 55 60
Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Leu Thr lie Ser Lys Asp Thr Ser Arg 65 70 75
Lys Gin Val Phe Leu Lys lie Thr Ser Val Asp Pro Ala Asp Thr Ala 80 05 90
Thr Tyr Tyr Cys Val Arg Arg Pro He Thr Pro Val Leu Val Asp Ala 95 100 105
Met Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser HO 115 120 <210> 17 <211〉 136 <212> DNA <213>人丁序列 <220> <223>引物 <400> 17 tccgcaagct tgccgccacc atggacatgc gcgtgcccgc ccagctgctg ggcctgctga 60 tgctgtgggt gtccggctcc tccggctacg tggtgatgac ccagtccccc ctgtccctgc 120 \% ccgtgacccc cggcga 136
<210> 18 <211> 131 <212> DNA <213>人工序列 <220> .· <223>引物 <400> 18 〜btggggggac tggccgggct tctgcagcag ccagttcagg taggtctt.gc cgtcggagtc 60 cagcagggac tgggaggact tgcaggagat ggaggcgggc tcgccggggg tcacgggcag 120 ggacaggggg g 131 <210> 19 <211> 146 <212> DNA <213>人：1:序列 <220> <223>引物 T/ <400> 19 acctgaactg gctgctgcag aagcccggcc agtcccccca gcgcctgatc tacctggtgt ccaagctgga ctccggcgtg cccgaccgct tctccggctc cggctccggc accgacttca ccctgaagat ctcccgcgtg gaggcc
<210> 20 <211> 142 <212〉 DNA •人£序列 <220> <223>引物 <400> 20 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐丄扣 ---------- (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製
0 2 4 i—I IX -153- !255272 五、發明説明（15) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 aattctagga tccactcacg cttgatctcc accttggtgc cctggccgaa ggtgcgggg aagtgggtgc cctgccagca gtagtacacg cccacgtcct cggcctccac gcgggagat ttcagggtga agtcggtgcc gg <210> 21 <211> 16 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>引物 <400> 21 ctggggggac tggccg <210> 22 <211> 22 <212> DNA <<213>人工序列 <22〇> <223>引物 <400> 22 acctgaactg gctgctgcag aa
<210> 23 <211> 138 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>引物 .<400> 23 acagaaagct tgccgccacc atggagtttg ggctgagctg gctttttctt gtggctat taaaaggtgt ccagtgtgag gtgcagctgc· tggagtccgg cggcggcctg gtgcagcc gcggctccct gcgcctgt
<210〉 24 <211> 135 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>引物 <400> 24 gccqccggaq cggatggagg ccacccactc caggcccttg ccgggggcct ggcgcacc ggacatgccg tagttggaga aggtgaagcc ggaggcggcg caggacaggc gcagggag gccgggctgc accag
<210> 25 <211> 142 <212> DNA <213>人工序列. <220> <223>引物 <400> 2'5
本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐J
-154- Ϊ255272 A7 B7 五、發明説明（ ctggagtggg tggcctccat ccgctccggc ggcggccgca cctactactc cgacaacgtg 60 aagggccgct tcaccatctc ccgcgacaac gccaagaact ccctgtacct gcagatgaac 120 tccctgcgcg ccgaggacac eg 142
<210> 26 <211> 144 <212> DMA <213>人J:序列 <220> <223>引物 <400> 26 ctgcaaggat ccactcaccg gaggacacgg tcaccagggt gccctggccc cagtagtcgg 60 aggageegga gtagtggtcg tagcgcacgc agtagtacag ggcggtgtcc tcggcgcgca 120 gggagttcat ctgcaggtac aggg 144 <210> 27 <211> 16 <212> DNA ·. <213>人工序列 <220> <223>引物 <400> 27 gccgccggag eggatg
<210> 28 <211> 20 <212> DNA <213>人工序列 <220> β223>引物 <400> 28 ctggagtggg tggcctccat <210> 29 <211> 19 <212> DNA <213>人工序列 16 20 經濟、t智慧財產局員工消費合作社印製 <220> <223>引物 <400〉 29 tccgcaagct tgccgccac <210> 30 · <211> 29 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>引物 <400> 30 aattctagga tccactcacg cttgatetc 19 29 155- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297处着^ 1255272 A7 B7 五、發明説明（15$ 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製
<21〇> 31 <211> 23 <212> DNA <213>人！；序列 V <220> <223>引物 <400> 31 acagaaagct tgccgccacc atg
<210> 32 <211> 22 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>引物 <400> 32 ctgcaaggat ccactcaccg ga 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21 OX 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
-156- 1255272 A7 B7 五、發明説明（1分 (suppSeqLsl.txt) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) <210〉 33 <211〉 10 <212〉 PRT <2Π>人工序列 <220> <223>內蛋白肽 <400〉 33
Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr 1 5 10 <210> 34 <211> 402 . <212> DNA <213>人工序列 λ <220> <223〉h3D6 變體 1 VL <400〉 34 atggacatgc gcgtgcccgc ccagctgctg ggcctgctga tgctgtgggl gtccggctcc 60 tccggetacg tggtgatgac ccagtccccc clgtccctgc ccgtgacccc cggcgagccc 120 gcctccatct cctgcaagtc ctcccagtcc ctgctggact ccgacggcaa gacctacctg 180 aactggctgc tgcagaagcc cggccagtcc ccccagcgcc tgalctacct ggtgtccaag 240 ctggactccg gcgtgcccga ccgcttctcc ggctccggct ccggcaccga cllcaccctg 300 aagatctccc gcgtggaggc cgaggacgtg ggcgtgtacl actgctggca gggcacccac 360 ttcccccgca ccttcggcca gggcaccaag gtggagatca ag 402 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 <210> 35 <211> 402 <212> DNA <213>人工序列 <220> ,
<223〉h3D6 變體 2VL <400> 35 atggacatgc gcgtgcccgc ccagctgctg ggccigclga Igctgtgggt gtccggctcc 60
Iccggcgacg [ggtgatgac ccagtccccc ctgLccctgc ccgtgacccc cggcgagccc 120 gcctccatct cctgcaagtc clcccagtcc ctgctggact ccgacggcaa gacctacctg 180 aactggctgc tgcagaagcc cggccagtcc ccccagcgcc tgatctacct ggtgtccaag 240 ctggactccg gcgtgcccga ccgctIctcc ggctccggct ccggcaccga ct tcaccctg 300 aagatctccc gcgtggaggc cgaggacgtg ggcgtgtact actgctggca gggcacccac 360 ttcccccgca ccllcggcca gggcaccaag gtggagatca ag 402 本紙張尺度適用中國國家標準（峰卿1〇x赠） _ 1255272 A7 B7 五、發明説明（1钵 ^supp^eqLSi.txt j
Q <210> 36 <211> 414 <212> DNA <213〉人工序列
<220> <223〉h3D6 變體 1 VL <400> 36 atggagtttg gtgcagctgc tgcgccgcct ggcaagggcc gacaacgtga cagatgaact tactccggct ggctgagctg tggagtccgg ccggcttcac tggagtgggt agggccgctt ccctgcgcgc cctccgacta gcUtttctl cggcggcctg cttctccaac ggcctccatc caccatctcc cgaggacacc ctggggccag glggctattt gtgcagcccg tacggcatgt cgctccggcg cgcgacaacg gccctgtact ggcaccctgg taaaaggtgt gcggctccct cctgggtgcg gcggccgcac ccaagaactc actgcgtgcg tgaccgtgtc ccagtgtgag 60 gcgcctgtcc 120 ccaggccccc 180 ctactactcc 240 cctgtacctg 300 ctacgaccac 360 ---------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本買) <210> 37 <211> 414 <212〉 DNA <213〉人工序列
<220> <223〉、i3D6 變體 2 VL <400> 37 atggagtttg gtgcagctgc tgcgccgcct ggcaagggcc gacaacgtga cagatgaact lactccggct 訂 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 ggctgagctg tggagtccgg ccggct tcac tggagtgggt agggccgctt ccctgcgcgc cctccgacta gctUtlctt cggcggcctg ct tctccaac ggcctccatc caccatctcc cgaggacacc ctggggccag gtggctat U gtgcagcccg tacggcatgt cgctccggcg cgcgacaact gccgtgtact ggcaccctgg laaaaggtgt gcggctccct cclgggtgcg gcggccgcac ccaagaacac actgcgtgcg tgaccgtgtc ccagtgtgag 60 gcgcctgtcc 120 ccaggccccc 180 ctactactcc 240 cctgtacctg 300 ctacgaccac 360 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐 -158

Claims (1)

1255272
A8 B8 C8 D8 六利範圍1 "r. ； v ' I 附件2A : 第90 1 30 1 3 5號專利申請案 中文申請專利範圍替換本 民國95年1月19日修正 1 · 一種擬人化免疫球蛋白輕鏈，其包含來自如 SEQ ID NO : 2所提出之3D6免疫球蛋白輕鏈 可變區序列的可變區互補決定區（CDRs)，並含有來 自一人類接受者免疫球蛋白輕鏈序列的可變框構區，其先 決條件爲至少有一框構殘質係被來自老鼠3 D 6輕鏈可變 區序列之相對應的胺基酸殘質所取代，其中該框構殘質係 選自如下群體= (a )非共價性地直接結合抗原之殘質； (b) 鄰接一CDR之殘質； (c) CDR —交互作用殘質；及 (d) 參與VL-VH界面之殘質。 2 . —種擬人化免疫球蛋白重鏈，其包含來自如 SEQ ID N〇：4所提出之3D6免疫球蛋白輕鏈 可變區序列的可變區互補決定區（CDRs)，並含有來 自一人類接受者免疫球蛋白輕鏈序列的可變框構區，其先 決條件爲至少有一框構殘質係被來自老鼠3 D 6輕鏈可變 區序列之相對應的胺基酸殘質所取代，其中該框構殘質係 選自如下群體： (a )非共價性地直接結合抗原之殘質； (b )鄰接一 C D R之殘質； 本紙張尺度逋用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲囀背面之注意事項再本頁) 訂' 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1255272 A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍 2 (c ) C D R -交互作用殘質；及 (d )參與VL - VH界面之殘質。 3 ·如申請專利範圍第1項之輕鏈，其中C D R -交 互作用殘質係藉由根據已解析之抗朊病毒抗體1 F 4的結 構來模塑該3 D 6輕鏈所鑑定，其中該解析之結構命名爲 1 C R 9 0 4 .如申請專利範圍第1項之輕鏈，其中C D R -交 互作用殘質係藉由根據已解析之抗G p 4 1抗體的結構來 模塑該3 D 6輕鏈所鑑定，其中該解析之結構命名爲 1 N L D。 5 .如申請專利範圍第2項之重鏈，其中C D R -交 互作用殘質係藉由根據已解析之◦ P G 2抗受體抗體的結 構來模塑該3 D 6重鏈所鑑定，其中該解析之結構命名爲 1 〇 P G。 6 . —種擬人化免疫球蛋白輕鏈，其包含來自如 SEQ ID N〇：2所提出之3D6免疫球蛋白輕鏈 可變區序列的可變區互補決定區（CDRs)，並含有來 自一人類接受者免疫球蛋白輕鏈序列的可變框構區，其先 決條件爲至少有一框構殘質係被來自老鼠3 D 6輕鏈可變 區序列之相對應的胺基酸殘質所取代，其中該框構殘質係 一藉由分析該可變區之三-次元模型而鑑定出的能影響輕 鏈可變區構造或功能之殘質。 7 . —種擬人化免疫球蛋白重鏈，其包含來自如 SEQ ID NO : 2所提出之3D6免疫球蛋白輕鏈 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -2 - (請先閲·#背面之注意事項存填寫本頁) 訂 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1255272 A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍3 可變區序列的可變區互補決定區（CDRs)，並含有來 自一人類接受者免疫球蛋白輕鏈序列的可變框構區’其先 決條件爲至少有一框構殘質係被來自老鼠3 D 6輕鏈可變 區序列之相對應的胺基酸殘質所取代，其中該框構殘質係 一藉由分析該可變區之三-次元模型而鑑定出的能影響重 鏈可變區構造或功能之殘質。 8 .如申請專利範圍第6項之輕鏈，其中該框構殘質 係選自如下群體：能與抗原交互作用之殘質’最接近抗原 結合位置之殘質，能與一 CDR交互作用之殘質’鄰接一 CDR之殘質，在一 CDR殘質之6 A內的殘質’標準殘 質，游標區殘質，鏈間裝塡殘質，稀有殘質’及一在構造 模型之表面上的醣化位置殘質。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 9 .如申請專利範圍第7項之重鏈，其中該框構殘質 係選自如下群體··能與抗原交互作用之殘質’最接近抗原 結合位置之殘質，能與一 C D R交互作用之殘質’鄰接一 CDR之殘質，在一 CDR殘質之6 A內的殘質’標準殘 質，游標區殘質，鏈間裝塡殘質，不平常之殘質，及一在 構造模型之表面上的醣化位置殘質。 1 〇 ·如申請專利範圍第6項之輕鏈，其中該框構殘 質係藉由根據已解析之抗朊病毒抗體1 F 4的結構來模塑 該3 D 6輕鏈所鑑定，其中該解析之結構命名爲1 C R 9 〇 1 1 ·如申請專利範圍第6項之輕鏈，其中該框構殘 質係藉由根據已解析之抗G p 4 1抗體的結構來模塑該 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） _ 3 - 1255272 A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍 4 3 D 6輕鏈所鑑定，其中該解析之結構命名爲1 N L D。 1 2 .如申請專利範圍第7項之重鏈，其中該框構殘 質係藉由根據已解析之0 P G 2抗受體抗體的結構來模塑 該3 D 6重鏈所鑑定，其中該解析之結構命名爲1〇P G 〇 1 3 . —種擬人化免疫球蛋白輕鏈，其包含來自如 SEQ ID NO : 2所提出3D6免疫球蛋白輕鏈可 變區序列的可變區互補決定區（CDRs)，及來自一人 類接受者免疫球蛋白輕鏈的可變框構區，其先決條件爲至 少有一選自LI ，L2，L36，和L46 (卡巴編號協 定）之群體的框構殘質係被來自老鼠3 D 6輕鏈可變區序 列之相對應的胺基酸殘質所取代。 1 4 · 一種擬人化免疫球蛋白重鏈，其包含來自如 SEQ ID NO: 4所提出來自3D6免疫球蛋白重 鏈可變區序列的可變區互補決定區（CDRs)，及來自 一人類接受者免疫球蛋白重鏈的可變框構區，其先決條件 爲至少有一選自H49，H93，和H94 (卡巴編號協 定）之群體的框構殘質係被來自老鼠3 D 6重鏈可變區序 列之相對應的胺基酸殘質所取代。 1 5 .如申請專利範圍第1 ，3 ，4，6 ，8，1 〇 ，1 1和1 3項中之任一項的輕鏈，其中該人類接受者輕 鏈爲亞型ΚΠ之輕鏈（卡巴協定）。 1 6 ·如申請專利範圍第2，5，7，9，1 2和 1 4項中之任一項的重鏈，其中該人類接受者重鏈爲亞型 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21〇><297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -4 - 1255272 A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍 5 ΚΠ之重鏈（卡巴協定）。 Γ%先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 1 7 ·如申請專利範圍第1 5項之輕鏈’其中該人類 接受者輕鏈係選自如下之群體··卡巴ID 01923〇 ’卡巴 ID 0 05131，卡巴 ID 0 05058, 卡巴 ID 005057，卡巴 ID 005059,卡 巴ID U21040,和卡巴ID U41645。 1 8 ·如申請專利範圍第1 5項之輕鏈，其中該人類 接受者輕鏈爲卡巴ID 019230。 1 9 ·如申請專利範圍第1 6項之重鏈，其中該人類 接受者重鏈係選自如下之群體：卡巴I D 0 4 5 9 1 9 ，卡巴 ID 00 0 459，卡巴 ID 000553, 卡巴000386，和卡巴ID M23691。 2 0 ·如申請專利範圍第1 6項之重鏈，其中該人類 接受者重鏈爲卡巴ID 045919。 2 1 ·如申請專利範圍第1 ，3，4，6 ，8，1 〇
經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 ，11和13項中之任一項之輕鏈，其中至少一種稀有之 人類框構殘質係被一個對人類可變輕鏈序列上之該位置而 言，爲常有之胺基酸所取代。 2 2 ·如申請專利範圍第1 ，3，4，6 ，8，1 0 ，1 1和1 3項中之任一項之輕鏈，其中至少一種稀有之 人類框構殘質係被一來自種系可變輕鏈序列之相對應的胺 基酸殘質所取代。 2 3 ·如申請專利範圍第2 2項之輕鏈，其中該種系 可變輕鏈序列係選自如下之群體：Al ，A1 7，A1 8 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公羡） -5 - 1255272 Α8 Β8 C8 D8 i、申請專利範圍6 ’ A 2 和 A 1 9。 2 4 ·如申請專利範圍第2，5，7，9，1 2和 1 4項中之任一項之重鏈，其中至少有一種稀有之人類框 _殘質係被一個對人類可變重鏈序列上之該位置而言，爲 常有之胺基酸所取代。
2 5 ·如申請專利範圍第2，5，7，9，1 2和 1 4項中之任一項之重鏈，其中至少一種稀有之人類框構 @ ®係被一來自種系可變重鏈序列之相對應的胺基酸殘質 所取代。 2 6 .如申請專利範圍第2 5項之重鏈，其中該種系 可變重鏈序列係選自如下之群體：VH3 - 48，VH3 一 23，VH3-7，VH3 — 21 和 VH3-1 1。 2 7 ·如申請專利範圍第2 5項之重鏈，其中該種系 可變重鏈序列係V Η 3 - 2 3。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 2 8 ·如申請專利範圍第1 3項之輕鏈，其包含來自 單株抗體3 D 6輕鏈之互補決定區（C DR s )和可變區 框構殘質LI ，L2，L36和L46 (卡巴編號協定） ，其中該剩餘之輕鏈係來自人類免疫球蛋白。 2 9 ·如申請專利範圍第1 4項之重鏈，其包含來自 單株抗體3 D 6重鏈之互補決定區（CDR s )和可變區 框構殘質Η49，Η93和Η94(卡巴編號協定），其 中該剩餘之重鏈係來自人類免疫球蛋白。 3 0 · —種擬人化免疫球蛋白，其包含申請專利範圍 第 1，3 ，4，6，8，10，11，13，15，17 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） -6 - Ϊ255272 A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍7 和1 8項中之任一項之輕鏈，和申請專利範圍第2 , 5 ， 7 ，9 ，12 ，14 ，16 ，19和20項中之任一項之 重鏈，或該免疫球蛋白之抗原-結合片段。 3 1 ·如申請專利範圍第3 0項之免疫球蛋白或抗原 結合片段，其係以至少1 0 — 7 Μ之結合親和力來特異結合 冷澱粉樣蛋白肽（A 0 )。 3 2 ·如申請專利範圍第3 0項之免疫球蛋白或抗原 結合片段，其係以至少1 0 — 8 Μ之結合親和力來特異結合 /3澱粉樣蛋白肽（Α点）。 3 3 ·如申請專利範圍第3 0項之免疫球蛋白或抗原 結合片段，其係以至少1 0 _ 9 Μ之結合親和力來特異結合 /3澱粉樣蛋白肽（Α ^ )。 3 4 ·如申請專利範圍第3 0項之免疫球蛋白或抗原 結合片段，其中該重鏈同質體爲^ 1。 3 5 ·如申請專利範圍第3 0項之免疫球蛋白或抗原 結合片段，其係結合至可溶性Θ澱粉樣蛋白肽（Α Θ )和 集結之A 0二者。 3 6 ·如申請專利範圍第3 5項之免疫球蛋白，其中 該可溶性澱粉樣蛋白肽（A yS )爲崩解之A /3。 3 7 ·如申請專利範圍第3 0項之免疫球蛋白或抗原 結合片段，其傳介0澱粉樣蛋白肽（A /3 )之呑噬作用。 3 8 ·如申請專利範圍第3 0項之免疫球蛋白或抗原 結合片段，其可穿越在個體中之血液-腦障壁。 3 9 ·如申請專利範圍第3 0項之免疫球蛋白或抗原 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）- ------ (請先閲背背面之注意事項再填寫本頁) 訂 •T 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1255272 A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍8 結合片段，其減少個體中之Θ澱粉樣蛋白肽（A /3 )的負 載及神經炎性營養不良。 4 0 . —種擬人化免疫球蛋白，其包含一擬人化重鏈 和一擬人化輕鏈，其中 (a )該擬人化輕鏈含有①三種互補決定區（ CDR1 ，CDR2和CDR3)，其具有來自於定名爲 SEQ ID NO : 2之老鼠3D6免疫球蛋白輕鏈可 變結構區之相對應互補決定區的胺基酸序列，及②一來自 人類輕鏈可變區框構序列的可變區框構，其先決條件爲： 至少有一選自第1群（此係由LI，L2，L36和 L 4 6 (卡巴編號協定）所組成）的位置係被存在於老鼠 3 D 6免疫球蛋白輕鏈可變區框構之相等位置中的相同胺 基酸殘質所佔據；且 (b )該擬人化重鏈含有①三種互補決定區（ CDR1 ，CDR2和CDR3)，其具有來自於定名爲 SEQ ID N〇：4之老鼠3D6免疫球蛋白重鏈可 變結構區之相對應互補決定區的胺基酸序列，及②一來自 人類重鏈可變區框構序列的可變區框構，其先決條件爲： 至少有一選自第2群（此係由H49，H93和H94 ( 卡巴編號協定）所組成）的位置係被存在於老鼠3 D 6免 疫球蛋白重鏈可變區框構之相等位置中的相同胺基酸殘質 所佔據； 其中該擬人化免疫球蛋白係以至少1 0 — 7 Μ之結合親 和力特異結合至沒澱粉樣蛋白肽（A /3 〃 ），其中該 (請先閲·«背面之注意事項再填寫本頁) -#«»
經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家樣準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -8 - 1255272 A8 B8 C8 D8 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 t、申請專利範圍 9 3D6免疫球蛋白具有該帶有定名爲SEQ ID N Ο :2之可變結構區的輕鏈，及該帶有定名爲SEQ ID N〇：4之可變結構區的重鏈。 4 1 ·如申請專利範圍第4 0項之擬人化免疫球蛋白 ，其中該人類輕鏈可變區框構係來自k輕鏈可變區。 4 2 ·如申請專利範圍第4 0項之擬人化免疫球蛋白 ，其中該人類重鏈可變區框構係來自I g G重鏈可變區。 4 3 ·如申請專利範圍第4 0項之擬人化免疫球蛋白 ，其中該擬人化輕鏈可變區框構係來自一選自如下群體的 輕鏈：卡巴ID 019230，卡巴ID 005131 ，卡巴 ID 005058，卡巴 ID 0 0 5 0 5 7，卡巴 I D 0 0 5 0 5 9，卡巴 I D U21040和卡巴ID U41645。 4 4 .如申請專利範圍第4 0項之擬人化免疫球蛋白 ，其中該擬人化重鏈可變區框構係來自一選自如下群體的 重鏈：卡巴ID 045919，卡巴ID 000459，卡巴ID 000553，卡巴ID 000386，和卡巴ID M23691。 4 5 .如申請專利範圍第4 0項之擬人化免疫球蛋白 ，其中該擬人化輕鏈可變區框構除了至少有四個位置係來 自第1群以外，其係與卡巴I D 0 9 1 2 3 0輕鏈可變 區框構序列相一致，而該重鏈可變區框構除了至少有三個 位置係來自第2群以外，其係與卡巴ID 045919 重鏈可變區框構序列相一致。 請 先 閲 面 之 注
訂 I 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -9 - 1255272 Α8 Β8 C8 D8 々、申請專利範圍1Q 4 6 .如申請專利範圍第4 0項之擬人化免疫球蛋白 ，其中該擬人化輕鏈含有與相對應之老鼠3 D 6輕鏈的互 補決定區相一致的互補決定區，而該擬人化重鏈含有與相 對應之老鼠3 D 6重鏈的互補決定區相一致的互補決定區 〇 4 7 . —種擬人化免疫球蛋白，其含有如S EQ ID NO : 2所提出之3D6可變輕鏈序列的互補決定 區（CDR1，CDR2 和 CDR3)。 4 8 · —種擬人化免疫球蛋白，其含有如S EQ ID NO : 4所提出之3D6可變重鏈序列的互補決定 區（CDR1，CDR2 和 CDR3)。 4 9 . 一種特異結合/5澱粉樣蛋白肽（A0)之擬人 化免疫球蛋白，或其抗原-結合片段，其含有一包含相當 於來自老鼠3 D 6抗體之CDR s的互補決定區（ CDRs)的可變區。 5 0 · —種以至少1 0 _ 7 Μ之親和力結合沒澱粉樣蛋 白（A；S )的擬人化免疫球蛋白，其中該免疫球蛋白包含 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 (a ) —輕鏈可變結構區，其包含老鼠3 D 6互補決 定區（C D R )胺基酸殘質，和人類V L次群Π可變結構 區框構區（F R )胺基酸殘質；及 (b ) —重鏈可變結構區，其包含老鼠3 D 6互補決 定區（C D R )胺基酸殘質，和人類V Η次群ΠΙ可變結構 區框構區（F R )胺基酸殘質。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） -10 - A8 B8 C8 D8 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1255272 六、申請專利範圍 11 5 1 · —種嵌合型免疫球蛋白，其包含實質上示於 SEQ ID N〇：2 或 SEQ ID NO :4 之 3 D 6可變區序列。 5 2 . —種免疫球蛋白或其抗原-結合片段，其包含 如SEQ ID N〇：8所示之可變重鏈區及如SEQ ID N〇：5所示之可變輕鏈區。 5 3 ·如申請專利範圍第5 2項之免疫球蛋白或其抗 原一結合片段，其包含如SEQ ID NO:12所示 之可變重鏈區及如SEQ ID N〇：11所示之可變 輕鏈區。 54 · —種免疫球蛋白，其包含如SEQ ID N〇：8所示之可變重鏈區、如SEQ ID N〇：5 所示之可變輕鏈區及來自I g G 1之恆定區。 5 5 _如申請專利範圍第5 4項之免疫球蛋白，其包 含如SEQ ID N〇：12所示之可變重鏈區、如 SEQ ID N〇：11所示之可變輕鏈區及來自 I g G 1之恆定區。 5 6 · —種用於預防或治療患者之產生澱粉樣變性疾 病的藥學組成物，其包含有效劑量之申請專利範圍第 3 0 - 5 5項中之任一項的免疫球蛋白或抗原結合片段。 5 7 . —種用於預防或治療患者之阿茲海默氏症的藥 學組成物，其包含有效劑量之申請專利範圍第3 0 - 5 5 項中之任一項的免疫球蛋白或抗原結合片段。 5 8 .如申請專利範圍第5 7項之藥學組成物，其中
本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（ 210X297公釐） -11 - 1255272 A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍 12 該擬人化免疫球蛋白之有效劑量爲1毫克/公斤體重。 5 9 .如申請專利範圍第5 7項之藥學組成物，其中 該擬人化免疫球蛋白之有效劑量爲1 0毫克/公斤體重。 6 0 . —種藥學組成物，其包含申請專利範圍第3 0 -5 5項中之任一項的免疫球蛋白及藥學載體。 6 1 . —種分離出的多肽，其包含一選自如下群體之 SEQ ID N〇：2 的片段：SEQ ID N Ο ： 2之胺基酸24 — 39，SEQ ID NO :2之胺基 酸55 — 61，及SEQ ID N〇：2之胺基酸94 -10 2。 6 2 .如申請專利範圍第6 1項之分離出的多肽，其 包含SEQ ID N〇：2之胺基酸24—39， SEQ ID N〇·· 2之胺基酸55 — 61，和SEQ ID N〇：2之胺基酸94— 102。 6 3 · —種分離出的多肽，其包含一選自如下群體之 SEQ ID N〇：4 的片段：SEQ ID Ν Ο ： 4之胺基酸31— 35，SEQ ID NO :4之胺基 酸50 — 66，及SEQ ID NO :4之胺基酸99 一 1 0 8。 64·—種分離出的多肽，其包含SEQ ID N〇：4 之胺基酸 31 — 35、SEQ ID Ν Ο ： 4 之胺基酸50—66及SEQ ID NO:4之胺基酸 9 9 一 1 0 8。 65.—種分離出之多肽，其包含SEQ ID 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐) -12 ：~一 一 (請先閲脅背面之注意事項再填寫本頁) 訂
經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1255272 A8 B8 C8 D8 夂、申請專利範圍 13 N 0 : 2之胺基酸序列。 66·—種分離出之多肽，其包含SEQ ID N 〇 : 4之胺基酸序列。 6 7 .如申請專利範圍第6 5項之分離出之多肽’其 包含至少一個保留性胺基酸取代，其中該多肽保持至少 1 〇 ~ 7 Μ之結合親和力直接專一性結合澱粉樣蛋白肽（ Α冷）的能力。 6 8 .如申請專利範圍第6 6項之分離出之多肽，其 包含至少一個保留性胺基酸取代，其中該多肽保持至少 1 〇 ^ 7 Μ之結合親和力直接專一性結合/3澱粉樣蛋白肽（ Α冷）的能力。 6 9 ·如申請專利範圍第6 5或6 6項之分離出之多 肽，其包含S E Q ID N 0 ·· 2之胺基酸序列的殘質 1 一 1 1 2或S E Q ID N〇·· 4之胺基酸序列的殘 質 1 - 1 1 9。 7 0 · —種分離出之核酸分子，其編碼如申請專利範 圍第 1，3，4，6，8，10，11，13,15， 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1 7和1 8項中之任一項的輕鏈。 7 1 . —種分離出之核酸分子，其編碼如申請專利範 圍第 2 ，5 ，7，9 ，12，14，16，19 和 20 項 中之任一項的重鏈。 7 2 · —種分離出之核酸分子，其編碼如申請專利範 圍第6 2 - 6 9項中之任一項的多肽。 7 3 _ —種分離出之核酸分子，其編碼如申請專利範 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -13 - 1255272 A8 B8 C8 D8 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 六、申請專利範圍14 圍第3 0 - 5 5項中之任一項的免疫球蛋白。 74 .—種分離出之核酸分子，其包含選自SEQ ID N〇：1、SEQ ID NO: 3、 SEQ ID N 0:34、 SEQ ID N 0:35、 SEQ ID N〇：36或SEQ ID N〇：37之核苷酸 序歹！J。 75 ·—種載體，其包含如申請專利範圍第70-7 4項中之任一項的核酸分子。 7 6 . —種宿主細胞，其包含如申請專利範圍第7 0 - 7 4項中之任一項的核酸分子。 77 .—種製造抗體或其片段之方法，其包含在可製 造該抗體或片段之條件下培養申請專利範圍第7 6項之宿 主細胞，並將該抗體從宿主細胞或培養中分離出來。 7 8 . —種製造抗體或其片段（其包含選自如下群體 之SEQ ID N〇：2的片段：SEQ ID N〇：2之胺基酸24 — 39，SEQ ID N〇：2 之胺基酸55-61，和SEQ ID N〇：2之胺基 酸9 4 - 1 0 2 )的方法，該方法包含將含有編碼該抗體 或其片段之核酸分子的宿主細胞在能製造該抗體或片段之 條件下培養，並從宿主細胞或培養中分離出該抗體。 7 9 · —種製造抗體或其片段（其包含選自如下群體 之SEQ ID N〇：4的片段：SEQ ID N〇：4之胺基酸31 — 35，SEQ ID N〇：4 之胺基酸50 — 66，和SEQ ID N〇：4之胺基 (請先閲令背面之注意事項再 本育) 訂
本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -14 - 1255272 A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍15 酸9 9 - 1 0 8 )的方法，該方法包含將含有編碼該抗體 或其片段之核酸分子的宿主細胞在能製造該抗體或片段之 條件下培養，並從宿主細胞或培養中分離出該抗體。 8 0 · —種用於鑑定在擬人化3 D 6免疫球蛋白可變 框構區中需要接受取代之殘質的方法，其包含根據已解析 之免疫球蛋白構造來塑造3 D 6可變區的三-次元構造， 並分析該構造，以找出能影響3 D 6免疫球蛋白可變區構 造或功能的殘質，如此可鑑定出需要接受取代之殘質。 8 1 ·如申請專利範圍第6 5或6 6項之多肽，或其 任何部分，其可用於製造3D6免疫球蛋白、3D6免疫 球蛋白鏈、或其結構區的三-次元影像。 8 2 · —種擬人化免疫球蛋白輕鏈，其包含來自如 SEQ ID NO:14所提出之10D5免疫球蛋白 輕鏈可變區序列的可變區互補決定區（C D R s )，並含 有來自一人類接受者免疫球蛋白輕鏈序列的可變框構區， 其先決條件爲至少有一框構殘質係被來自老鼠1 〇 D 5輕 鏈可變區序列之相對應的胺基酸殘質所取代，其中該框構 殘質係選自如下群體： (a )非共價性地直接結合抗原之殘質； (b) 鄰接一CDR之殘質； (c) CDR-交互作用殘質；及 (d )參與VL— VH界面之殘質。 8 3 · —種擬人化免疫球蛋白輕鏈，其包含來自如 SEQ ID N〇：16所提出之10D5免疫球蛋白 本紙張尺度適用中國國家樣準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -15 - (請先閲讀背面之注意事項 丨_| 再本頁
經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1255272 A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍 16 輕鏈可變區序列的可變區互補決定區（C D R s )，並含 有來自一人類接受者免疫球蛋白輕鏈序列的可變框構區， 其先決條件爲至少有一框構殘質係被來自老鼠1 0 D 5重 鏈可變區序列之相對應的胺基酸殘質所取代，其中該框構 殘質係選自如下群體： (a )非共價性地直接結合抗原之殘質； (b )鄰接一 C D R之殘質； (c ) C D R -交互作用殘質；及 (d)參與VL - VH界面之殘質。 8 4 .如申請專利範圍第8 2項之輕鏈，其中CDR 交互作用殘質係藉由根據已解析之老鼠免疫球蛋白輕鏈構 造來塑造1 0 D 5輕鏈之模型而鑑定出來，而該老鼠免疫 球蛋白輕鏈與1 0 D 5輕鏈共享至少9 0 %之序列一致性 〇 8 5 ·如申請專利範圍第8 3項之重鏈，其中CDR 交互作用殘質係藉由根據已解析之老鼠免疫球蛋白重鏈構 造來塑造1 0 D 5重鏈之模型而鑑定出來，而該老鼠免疫 球蛋白重鏈與1 0 D 5重鏈共享至少9 0 %之序列一致性 〇 8·6 . —種擬人化免疫球蛋白輕鏈，其包含來自如 SEQ ID NO: 14所提出之10D5免疫球蛋白 輕鏈可變區序列的可變區互補決定區（CDRs)，並含 有來自一人類接受者免疫球蛋白輕鏈序列的可變框構區， 其先決條件爲至少有一框構殘質係被來自老鼠1 〇 D 5輕 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公Ϊ) -16- (請先聞蘋背面之注意事項再填寫本頁) ，1T
經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1255272 A8 B8 C8 D8 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 六、申請專利範圍17 鏈可變區序列之相對應的胺基酸殘質所取代，其中該框構 殘質係一藉由分析該可變區之三-次元模型而鑑定出的能 影響輕鏈可變區構造或功能之殘質。 8 7 · —種擬人化免疫球蛋白重鏈，其包含來自如 SEQ ID NO: 16所提出之10D5免疫球蛋白 重鏈可變區序列的可變區互補決定區（C D R s )，並含 有來自一人類接受者免疫球蛋白Μ鏈序列的可變框構區， 其先決條件爲至少有一框構殘質係被來自老鼠1 0 D 5重 鏈可變區序列之相對應的胺基酸殘質所取代，其中該框構 殘質係一藉由分析該可變區之三-次元模型而鑑定出的能 影響重鏈可變區構造或功能之殘質。 8 8 .如申請專利範圍第8 6項之輕鏈，其中該框構 殘質係選自如下群體：能與抗原交互作用之殘質，最接近 抗原結合位置之殘質，能與一 C D R交互作用之殘質，鄰 接一 CDR之殘質，在一 CDR殘質之6 Α內的殘質，標 準殘質，游標區殘質，鏈間裝塡殘質，稀有殘質，及一在 構造模型之表面上的醣化位置殘質。 8 9 .如申請專利範圍第8 7項之重鏈，其中該框構 殘質係選自如下群體：能與抗原交互作用之殘質，最接近 抗原結合位置之殘質，能與一 CDR交互作用之殘質，鄰 接一 CDR之殘質，在一 CDR殘質之6 A內的殘質，檫 準殘質，游標區殘質，鏈間裝塡殘質，不平常殘質’及〜 在構造模型之表面上的醣化位置殘質。 9 〇 ·如申請專利範圍第8 6或8 8項之輕鏈，其中 (請先聞令背面之注意事項 -- 再@本育) 訂
本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -17 - 8 88 8 ABCD 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1255272 六、申請專利範圍 18 _亥框構殘質係藉由根據已解析老鼠免疫球蛋白輕鏈構造來 〇 D 5輕鏈之模型而鑑定出來，而該老鼠免疫球蛋 白輕鏈與1 〇 D 5輕鏈共享至少9 0 %之序列一致性。 9 1 ·如申請專利範圍第8 7或8 9項之重鏈，其中 該1匡彳冓殘質係藉由根據已解析老鼠免疫球蛋白重鏈構造來 Miil 〇 D 5重鏈之模型而鑑定出來，而該老鼠免疫球蛋 白重鏈與1 〇 D 5重鏈共享至少9 0 %之序列一致性。 9 2 .如申請專利範圍第8 2，8 4，8 6 ，8 8和 9 0項中之任一項之輕鏈，其中至少有一種稀有之人類框 構殘質係被一個對人類可變輕鏈序列上之該位置而言，爲 常有之胺基酸所取代。 9 3 .如申請專利範圍第8 2，8 4，8 6，8 8和 9 0項中之任一項之輕鏈，其中至少一種稀有之人類框構 殘質係被一來自種系可變輕鏈序列之相對應的胺基酸殘質 所取代。 9 4 ·如申請專利範圍第9 3項之輕鏈，其中該種系 可變輕鏈序列爲與SEQ ID N〇：14之可變輕鏈 序列共享至少9 0 %之序列一致性的免疫球蛋白的輕鏈序 列。 9 5 ·如申請專利範圍第8 3，8 5 ，8 7和9 1項 中之任一項之重鏈，其中至少有一種稀有之人類框構殘質 係被一個對人類可變重鏈序列上之該位置而言，爲常有之 胺基酸所取代。 9 6 .如申請專利範圍第8 3，8 5，8 7和9 1項 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）-18 -
1255272 A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍19 中之任一項之重鏈，其中至少一種稀有之人類框構殘質係 被一來自種系可變重鏈序列之相對應的胺基酸殘質所取代 〇 9 7 ·如申請專利範圍第9 6項之重鏈，其中該種系 可變重鏈序列係爲SEQ ID NO ·· 16之可變重鏈 序列，或與其共享至少9 0 %之一致性。 9 8 · —種擬人化免疫球蛋白，其包括如申請專利範 圍第82 ，84，86，88和90項中之任一項之輕鏈 ，及如申請專利範圍第8 3，8 5，8 7和9 1項中之任 一項之重鏈，或該免疫球蛋白之抗原-結合片段。 9 9 ·如申請專利範圍第9 8項中之免疫球蛋白或抗 原結合片段，其係以至少1 0 - 7 Μ之結合親和力來特異結 合/5澱粉樣蛋白肽（A 0 )。 1 0 0 ·如申請專利範圍第9 8項中之免疫球蛋白或 抗原結合片段，其係以至少1 0 — 8 Μ之結合親和力來特異 結合沒澱粉樣蛋白肽（Α沒）。 1 0 1 .如申請專利範圍第9 8項中之免疫球蛋白或 抗原結合片段，其係以至少1 0 — 9 Μ之結合親和力來特異 結合/3澱粉樣蛋白肽（A 0 )。 1 0 2 ·如申請專利範圍第9 8項之免疫球蛋白或抗 原結合片段，其中該重鏈同質體爲r 1。 1 0 3 .如申請專利範圍第9 8項之免疫球蛋白或抗 原結合片段，其係結合至集結之/5澱粉樣蛋白肽（A沒） 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -19 - (請先閲讀背面之注意事項再Θ本頁) Η ,ιτ 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1255272 A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍 2〇 1 0 4 ·如申請專利範圍第9 8項之免疫球蛋白或抗 原結合片段，其傳介/3澱粉樣蛋白肽（A Θ )之吞職作用 〇 1 0 5 ·如申請專利範圍第9 8項之免疫球蛋白或抗 原結合片段，其可穿越在個體中之血液-腦障壁。 1 0 6 ·如申請專利範圍第9 8項之免疫球蛋白或抗
原結合片段，其減少個體中之/5澱粉樣蛋白肽（A /?)的 負載量。 107 · —種擬人化免疫球蛋白，其包含一擬人化重 鏈和一擬人化輕鏈，其中 (a )該擬人化輕鏈含有①三種互補決定區（ i CDR1 ，CDR2和CDR3)，其具有來自於定名爲 SEQ ID N〇：14之老鼠10D5免疫球蛋白輕
經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 鏈可變結構區之相對應互補決定區的胺基酸序列，及②一 來自人類輕鏈可變區框構序列的可變區框構，其先決條件 爲：至少有一選自由標準殘質，游標殘質，裝塡殘質和稀 有殘質組成之群體的框構殘質被存在於老鼠1 〇 D 5免疫 球蛋白輕鏈可變區框構之相等位置中的相同胺基酸殘質所 佔據；且 (b )該擬人化重鏈含有①三種互補決定區（ CDR1 ，CDR2和CDR3)，其具有來自於定名爲 SEQ ID NO: 16之老鼠l〇D5免疫球蛋白重 鏈可變結構區之相對應互補決定區的胺基酸序列，及②一 來自人類重鏈可變區框構序列的可變區框構’其先決條件 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -20 * 1255272 A8 B8 C8 D8 夂、申請專利範圍21 爲··至少有一選自由標準殘質，游標殘質，裝塡殘質和稀 有殘質所組成之第二群的框構殘質係被存在於老鼠 1 〇 D 5免疫球蛋白重鏈可變區框構之相等位置中的相同 胺基酸殘質所佔據； 其中該擬人化免疫球蛋白係以至少1 0 _ 7 Μ之結合親 和力特異結合至/3澱粉樣蛋白肽（、、A々〃），其中該 1 0D 5免疫球蛋白具有該帶有定名爲S EQ ID NO:14之可變結構區的輕鏈，及該帶有定名爲SEQ ID N〇：16之可變結構區的重鏈。 1 0 8 ·如申請專利範圍第1 0 7項之擬人化免疫球 蛋白，其中該人類輕鏈可變區框構係來自k輕鏈可變區。 1 0 9 ·如申請專利範圍第1 0 7項之擬人化免疫球 蛋白，其中該人類重鏈可變區框構係來自I g G重鏈可變 區。 1 1 0 .如申請專利範圍第1 0 7項之擬人化免疫球 蛋白，其中該擬人化輕鏈含有與相對應之老鼠1 〇 D 5輕 鏈的互補決定區相一致的互補決定區，而該擬人化重鏈含 有與相對應之老鼠1 0 D 5重鏈的互補決定區相一致的互 補決定區。 111·一種擬人化免疫球蛋白，其含有如SEQ ID NO : 1 4所提出之1 0D5可變輕鏈序列的互補 決定區（CDR1，CDR2和CDR3)。 1 1 2 ·—種擬人化免疫球蛋白，其含有如SEQ I D N〇：1 6所提出之1 0 D 5可變重鏈序列的互補 (請先閲讀背面之注意事項再本頁) Η 訂
經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（ 210X297公釐） -21 - 1255272 A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍22 決定區（CDR1，CDR2 和 CDR3)。 1 1 3 · —種特異結合0澱粉樣蛋白肽（AA)之擬 人化免疫球蛋白，或其抗原-結合片段，其含有一包含相 當於來自老鼠1 0D5抗體之CDRs的互補決定區（ CDRs)的可變區。 1 1 4 · 一種嵌合型免疫球蛋白，其包含大體上如 S E Q I D N〇：14 或 SEQ ID N 0 ： 1 6 中所提出之可變區序列，並包含來自人類免疫球蛋白之恆 定區序列。 1 1 5 · —種用於預防或治療患者體內之產生澱粉樣 變性之疾病的藥學組成物，其包含一有效劑量之如申請專 利範圍第9 8 - 1 1 3項中之任一項的擬人化免疫球蛋白 〇 1 1 6 . —種用於預防或治療患者體內之阿茲海默氏 症的藥學組成物，其包含一有效劑量之如申請專利範圍第 9 8 - 1 1 3項中之任一項的擬人化免疫球蛋白。 1 1 7 .如申請專利範圍第1 1 6項之藥學組成物， 其中該擬人化免疫球蛋白之有效劑量爲1毫克/公斤體重 〇 1 1 8 .如申請專利範圍第1 1 6項之藥學組成物， 其中該擬人化免疫球蛋白之有效劑量爲10毫克/公斤體 重。 1 1 9 . 一種製藥組成物，其含有如申請專利範圍第 9 8 - 1 1 3項中之任一項的免疫球蛋白，及一製藥載體 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） -22 - (請先閲«背面之注意事項再填寫本頁) 、1T
經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 8 8 8 8 ABCD 1255272 六、申請專利範圍23 〇 1 2 0 •—種分離出的多肽，其包含一選自如下群體 之SEQ id N〇：14的片段：SEQ ID N〇：14之胺基酸24 — 39，SEQ ID N〇： 14 之胺基酸 55_61，及 SEQ ID N 〇 : 1 4 之胺基酸94—102。 121. —種分離出的多肽，其包含SEQ ID N0:14 之胺基酸 24 — 39，SEQ ID NO: 14 之胺基酸 55 — 61，及 SEQ ID N 0 : 14 之胺基酸94—102。 122. —種分離出的多肽，其包含一選自如下群體 之 SEQ ID NO: 16 的片段：SEQ I D N〇：16 之胺基酸 31 — 37，SEQ ID NO: 16 之胺基酸 52 — 67，及 SEQ ID N 0 : 1 6 之胺基酸100-112。 123 · —種分離出的多肽，其包含SEQ 1 D N〇：16 之胺基酸 31 — 37，SEQ ID NO: 16 之胺基酸 52 — 67，及 SEQ ID N 0 : 1 6 之胺基酸100—112。 124 · —種分離出之多肽，其包含SEQ I D N〇：1 4之胺基酸序列。 125 · —種分離出之多肽，其包含SEQ 1 D N〇：1 6之胺基酸序列。 126 . —種包含SEQ ID N〇：14之胺基 (請先聞囀背面之注意事項再本頁) 訂
經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -23 - 1255272 A8 B8 C8 D8 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 六、申請專利範圍 24 酸序列的多肽之變異體，該變異體含有至少一種保留性胺 基酸取代，其中該變異體保持該以至少1 0 _ 7 Μ之結合親 和力直接特異性地結合澱粉樣蛋白肽（A /9 )的能力。 127· —種包含SEQ ID NO :16之胺基 酸序列的多肽之變異體，該變異體含有至少一種保留性胺 基酸取代，其中該變異體保持該以至少1 〇 - 7 Μ之結合親 和力直接特異性地結合/3澱粉樣蛋白肽（A /5 )的能力。 128 . —種分離出之多肽，其包含SEQ ID N〇：1 4之胺基酸序列的殘質1 一 1 1 2，或包含 S E Q ID N〇：1 6之胺基酸序列的殘質1 一 12 3° 1 2 9 · —種分離出之核酸分子，其係編碼如申請專 利範圍第8 2 ，8 4，8 6 ，8 8和9 0項中之任一項之 輕鏈。 1 3 0 · —種分離出之核酸分子，其係編碼如申請專 利範圍第8 3，8 5，8 7和9 1項中之任一項之重鏈。 1 3 1 · —種分離出之核酸分子，其編碼如申請專利 範圍第1 2 1 — 1 2 8項中之任一項的多肽。 1 3 2 · —種分離出之核酸分子，其編碼如申請專利 範圍第9 8 — 1 1 4項中之任一項的免疫球蛋白。 133.—種分離出之核酸分子，其包含SEQ ID N〇：13或15之核苷酸序列。 1 3 4 · —種載體，其包含如申請專利範圍第1 2 9 一 1 3 3項中之任一項之核酸分子。 (請先閲脅背面之注意事項再 -- -ΓΓ填寫本頁) 訂
本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -24 - ABCD 1255272 v、申請專利範圍 25 1 3 5 _ —種宿主細胞’其包含如申請專利範圍第 1 2 9 - 1 3 3項中之任一項之核酸分子。 1 3 6 · —種製造抗體或其片段之方法，其包含在可 製造抗體或片段之條件下培養如申請專利範圍第丨3 5項 之宿主細胞，並將該抗體從宿主細胞或培養中分離出$。 1 3 7 · —種製造抗體或其片段（其包含選自如下群 體之 SEQ ID N 0:14 的片段：SEQ ID N〇：14之胺基酸24 — 39 ，SEQ id N〇： 14 之胺基酸 55 — 61 ，及 SEQ ID NO： 14 之胺基酸9 4 一 1 0 2 )的方法，該方法包含將含有編碼 該抗體或其片段之核酸分子的宿主細胞在能製造該抗體或 片段之條件下培養，並從宿主細胞或培養中分離出該抗體 或片段。 1 3 8 . —種製造抗體或其片段（其包含選自如下群 體之SEQ ID N〇：16的片段：SEQ ID N〇：16 之胺基酸 31 — 37，SEQ ID N 0 ： 16 之胺基酸 52 — 67，及 SEQ ID Ν Ο ： 1 6 之胺基酸1 0 0 - 1 1 2 )的方法，該方法包含將含有編 碼該抗體或其片段之核酸分子的宿主細胞在能製造該抗體 或片段之條件下培養，並從宿主細胞或培養中分離出該抗 體或片段。 1 3 9 · —種用於鑑定在擬人化1 0D5免疫球蛋白 可變框構區中需要接受取代之殘質的方法，其包含根據已 解析之免疫球蛋白構造來塑造1 0 D 5可變區的三-次元 請 先 聞 面 之 注 項
經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公嫠） -25 - 1255272 Α8 Β8 C8 D8 κ、申請專利範圍26 擒造，並分析該構造，以找出能影響1 0 D 5免疫球蛋白 耐變區構造或功能的殘質，如此可鑑定出需要接受取代之 殘質。 140 · —種產生l〇D5模型的方法，包括選擇與 ΐ請專利範圍第1 2 4或1 2 5項之多肽，最接近的已知 坑體結構，及構築1 〇 D 5免疫球蛋白之三-次元電腦影 像而產生一模型。 (請先閲-#背面之注意事項再^^本頁) 訂
經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家梯準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） -26 - 1255272, ’附件 3A:第:.9013-1麵
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