NO339290B1 - Humanisert immunoglobulin som spesifikt binder beta-amyloid peptid (Aβ) eller antigenbindende fragment derav - Google Patents
Humanisert immunoglobulin som spesifikt binder beta-amyloid peptid (Aβ) eller antigenbindende fragment derav Download PDFInfo
- Publication number
- NO339290B1 NO339290B1 NO20032549A NO20032549A NO339290B1 NO 339290 B1 NO339290 B1 NO 339290B1 NO 20032549 A NO20032549 A NO 20032549A NO 20032549 A NO20032549 A NO 20032549A NO 339290 B1 NO339290 B1 NO 339290B1
- Authority
- NO
- Norway
- Prior art keywords
- antibody
- antigen
- immunoglobulin
- antibodies
- kabat
- Prior art date
Links
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 title claims description 160
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 title claims description 159
- 230000027455 binding Effects 0.000 title claims description 120
- 239000000427 antigen Substances 0.000 title claims description 85
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 title claims description 85
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 title claims description 85
- DZHSAHHDTRWUTF-SIQRNXPUSA-N amyloid-beta polypeptide 42 Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)[C@@H](C)CC)C(C)C)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC=1N=CNC=1)NC(=O)[C@H](CC=1N=CNC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1N=CNC=1)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O)C(C)C)C(C)C)C1=CC=CC=C1 DZHSAHHDTRWUTF-SIQRNXPUSA-N 0.000 title claims description 69
- 239000012634 fragment Substances 0.000 title claims description 63
- 108010047041 Complementarity Determining Regions Proteins 0.000 claims description 87
- 208000024827 Alzheimer disease Diseases 0.000 claims description 55
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 55
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 49
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 30
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 claims description 27
- 206010057249 Phagocytosis Diseases 0.000 claims description 26
- 230000008782 phagocytosis Effects 0.000 claims description 26
- 102000009091 Amyloidogenic Proteins Human genes 0.000 claims description 23
- 108010048112 Amyloidogenic Proteins Proteins 0.000 claims description 23
- 230000003942 amyloidogenic effect Effects 0.000 claims description 23
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 23
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 18
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 16
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 16
- NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 1-methylethyl 11-methoxy-3,7,11-trimethyl-2,4-dodecadienoate Chemical compound COC(C)(C)CCCC(C)CC=CC(C)=CC(=O)OC(C)C NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 13
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 12
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 12
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 12
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 claims description 12
- 230000037396 body weight Effects 0.000 claims description 8
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims description 8
- 230000008499 blood brain barrier function Effects 0.000 claims description 7
- 210000001218 blood-brain barrier Anatomy 0.000 claims description 7
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 4
- 102000006496 Immunoglobulin Heavy Chains Human genes 0.000 claims description 3
- 108010019476 Immunoglobulin Heavy Chains Proteins 0.000 claims description 3
- 102000013463 Immunoglobulin Light Chains Human genes 0.000 claims description 3
- 108010065825 Immunoglobulin Light Chains Proteins 0.000 claims description 3
- 101000998953 Homo sapiens Immunoglobulin heavy variable 1-2 Proteins 0.000 claims 1
- 101001008255 Homo sapiens Immunoglobulin kappa variable 1D-8 Proteins 0.000 claims 1
- 101001047628 Homo sapiens Immunoglobulin kappa variable 2-29 Proteins 0.000 claims 1
- 101001008321 Homo sapiens Immunoglobulin kappa variable 2D-26 Proteins 0.000 claims 1
- 101001047619 Homo sapiens Immunoglobulin kappa variable 3-20 Proteins 0.000 claims 1
- 101001008263 Homo sapiens Immunoglobulin kappa variable 3D-15 Proteins 0.000 claims 1
- 102100036887 Immunoglobulin heavy variable 1-2 Human genes 0.000 claims 1
- 102100022949 Immunoglobulin kappa variable 2-29 Human genes 0.000 claims 1
- PPCZVWHJWJFTFN-ZLUOBGJFSA-N Ser-Ser-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O PPCZVWHJWJFTFN-ZLUOBGJFSA-N 0.000 claims 1
- QNJYPWZACBACER-KKUMJFAQSA-N Tyr-Asp-His Chemical compound C1=CC(=CC=C1C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)N[C@@H](CC2=CN=CN2)C(=O)O)N)O QNJYPWZACBACER-KKUMJFAQSA-N 0.000 claims 1
- ZPFLBLFITJCBTP-QWRGUYRKSA-N Tyr-Ser-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(O)=O ZPFLBLFITJCBTP-QWRGUYRKSA-N 0.000 claims 1
- 108010068265 aspartyltyrosine Proteins 0.000 claims 1
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 118
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 112
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 111
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 85
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 64
- 238000000034 method Methods 0.000 description 60
- 101710137189 Amyloid-beta A4 protein Proteins 0.000 description 50
- 101710151993 Amyloid-beta precursor protein Proteins 0.000 description 50
- 102100022704 Amyloid-beta precursor protein Human genes 0.000 description 50
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 50
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 50
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 49
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 39
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 36
- 208000037259 Amyloid Plaque Diseases 0.000 description 34
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 34
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 33
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 33
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 33
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 31
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 30
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 28
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 27
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 27
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 26
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 25
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 25
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 24
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 23
- 230000004044 response Effects 0.000 description 23
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 22
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 22
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 22
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 21
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 21
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 20
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 19
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 19
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 18
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 17
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 15
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 15
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 14
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 14
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 14
- 230000002025 microglial effect Effects 0.000 description 14
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 14
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 14
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 13
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 13
- 210000001320 hippocampus Anatomy 0.000 description 12
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 12
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 12
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 12
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 12
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 12
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 12
- ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N Guanidine Chemical compound NC(N)=N ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 11
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 11
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 11
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 11
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 11
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 11
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 11
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 11
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 11
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 10
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 10
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 10
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 10
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 10
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 10
- 239000003656 tris buffered saline Substances 0.000 description 10
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 9
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 9
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 9
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 9
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 9
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 9
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 9
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 9
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 9
- 108010090849 Amyloid beta-Peptides Proteins 0.000 description 8
- 102000013455 Amyloid beta-Peptides Human genes 0.000 description 8
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 8
- 238000004422 calculation algorithm Methods 0.000 description 8
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 description 8
- 208000010877 cognitive disease Diseases 0.000 description 8
- 238000012875 competitive assay Methods 0.000 description 8
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 8
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 8
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 7
- 108010064539 amyloid beta-protein (1-42) Proteins 0.000 description 7
- 210000001638 cerebellum Anatomy 0.000 description 7
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 7
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 7
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 7
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 7
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 7
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 7
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 7
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 7
- 102000009109 Fc receptors Human genes 0.000 description 6
- 108010087819 Fc receptors Proteins 0.000 description 6
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 6
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 6
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 6
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 6
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 6
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 6
- 230000008859 change Effects 0.000 description 6
- 238000005094 computer simulation Methods 0.000 description 6
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 6
- 229960004198 guanidine Drugs 0.000 description 6
- 230000036541 health Effects 0.000 description 6
- 239000000463 material Substances 0.000 description 6
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 6
- 210000001539 phagocyte Anatomy 0.000 description 6
- 239000000047 product Substances 0.000 description 6
- 201000010374 Down Syndrome Diseases 0.000 description 5
- 241000283073 Equus caballus Species 0.000 description 5
- 101710193519 Glial fibrillary acidic protein Proteins 0.000 description 5
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 5
- CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N N-methyl-guanidine Natural products CNC(N)=N CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 5
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 5
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 5
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 5
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 5
- SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N dimethylaminoamidine Natural products CN(C)C(N)=N SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 5
- 210000005046 glial fibrillary acidic protein Anatomy 0.000 description 5
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 5
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 5
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 5
- 238000011160 research Methods 0.000 description 5
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 5
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 5
- 238000011830 transgenic mouse model Methods 0.000 description 5
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 4
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 4
- 208000028698 Cognitive impairment Diseases 0.000 description 4
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 4
- 102100039289 Glial fibrillary acidic protein Human genes 0.000 description 4
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 4
- 102000012745 Immunoglobulin Subunits Human genes 0.000 description 4
- 108010079585 Immunoglobulin Subunits Proteins 0.000 description 4
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 4
- SEQKRHFRPICQDD-UHFFFAOYSA-N N-tris(hydroxymethyl)methylglycine Chemical compound OCC(CO)(CO)[NH2+]CC([O-])=O SEQKRHFRPICQDD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 4
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 4
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 4
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 4
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 4
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 4
- 210000005013 brain tissue Anatomy 0.000 description 4
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 4
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 4
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 4
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 4
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 4
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 4
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 4
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 4
- 230000000971 hippocampal effect Effects 0.000 description 4
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 4
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 4
- 238000011503 in vivo imaging Methods 0.000 description 4
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 4
- 238000007917 intracranial administration Methods 0.000 description 4
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 4
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 4
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 4
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 4
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 4
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 4
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 4
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 4
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 4
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 4
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 4
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 4
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 4
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 4
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 3
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 3
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 206010061818 Disease progression Diseases 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000012981 Hank's balanced salt solution Substances 0.000 description 3
- 101000823051 Homo sapiens Amyloid-beta precursor protein Proteins 0.000 description 3
- 108700005091 Immunoglobulin Genes Proteins 0.000 description 3
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 3
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 3
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 3
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 3
- DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N Propylene glycol Chemical compound CC(O)CO DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 3
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 3
- 206010044688 Trisomy 21 Diseases 0.000 description 3
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 3
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 3
- 230000003941 amyloidogenesis Effects 0.000 description 3
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 3
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- 230000001588 bifunctional effect Effects 0.000 description 3
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 3
- 239000003636 conditioned culture medium Substances 0.000 description 3
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 description 3
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 3
- 230000005750 disease progression Effects 0.000 description 3
- 230000006870 function Effects 0.000 description 3
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 3
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000010191 image analysis Methods 0.000 description 3
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 3
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 3
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 3
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 3
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 3
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 3
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 3
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 3
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 3
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 3
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 3
- 238000012856 packing Methods 0.000 description 3
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 3
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 3
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 3
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 3
- 239000000902 placebo Substances 0.000 description 3
- 229940068196 placebo Drugs 0.000 description 3
- 229920000747 poly(lactic acid) Polymers 0.000 description 3
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 3
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 3
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 3
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 3
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 3
- 238000003118 sandwich ELISA Methods 0.000 description 3
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 3
- 241000894007 species Species 0.000 description 3
- 239000000829 suppository Substances 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- 102000013498 tau Proteins Human genes 0.000 description 3
- 108010026424 tau Proteins Proteins 0.000 description 3
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 3
- 238000011269 treatment regimen Methods 0.000 description 3
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 3
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 3
- 206010069754 Acquired gene mutation Diseases 0.000 description 2
- 102100034112 Alkyldihydroxyacetonephosphate synthase, peroxisomal Human genes 0.000 description 2
- 208000000044 Amnesia Diseases 0.000 description 2
- 102000002659 Amyloid Precursor Protein Secretases Human genes 0.000 description 2
- 108010043324 Amyloid Precursor Protein Secretases Proteins 0.000 description 2
- 240000003291 Armoracia rusticana Species 0.000 description 2
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 description 2
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 2
- 206010012289 Dementia Diseases 0.000 description 2
- 238000009007 Diagnostic Kit Methods 0.000 description 2
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 2
- 108700028146 Genetic Enhancer Elements Proteins 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- 101000799143 Homo sapiens Alkyldihydroxyacetonephosphate synthase, peroxisomal Proteins 0.000 description 2
- 101001046686 Homo sapiens Integrin alpha-M Proteins 0.000 description 2
- 101000935040 Homo sapiens Integrin beta-2 Proteins 0.000 description 2
- 102100022338 Integrin alpha-M Human genes 0.000 description 2
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 2
- 101000962498 Macropis fulvipes Macropin Proteins 0.000 description 2
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 2
- 208000026139 Memory disease Diseases 0.000 description 2
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 2
- 241000276498 Pollachius virens Species 0.000 description 2
- 229920000954 Polyglycolide Polymers 0.000 description 2
- 108010050254 Presenilins Proteins 0.000 description 2
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 2
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 2
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 2
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 2
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 2
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 2
- 102000019355 Synuclein Human genes 0.000 description 2
- 108050006783 Synuclein Proteins 0.000 description 2
- UZMAPBJVXOGOFT-UHFFFAOYSA-N Syringetin Natural products COC1=C(O)C(OC)=CC(C2=C(C(=O)C3=C(O)C=C(O)C=C3O2)O)=C1 UZMAPBJVXOGOFT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000005867 T cell response Effects 0.000 description 2
- 101000980463 Treponema pallidum (strain Nichols) Chaperonin GroEL Proteins 0.000 description 2
- 239000007997 Tricine buffer Substances 0.000 description 2
- 238000005411 Van der Waals force Methods 0.000 description 2
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 2
- 230000004931 aggregating effect Effects 0.000 description 2
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical class N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000000848 angular dependent Auger electron spectroscopy Methods 0.000 description 2
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 2
- 239000012131 assay buffer Substances 0.000 description 2
- 210000001130 astrocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 2
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 2
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 2
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 2
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 2
- 210000001175 cerebrospinal fluid Anatomy 0.000 description 2
- 238000011260 co-administration Methods 0.000 description 2
- 230000003920 cognitive function Effects 0.000 description 2
- 230000009137 competitive binding Effects 0.000 description 2
- 230000006957 competitive inhibition Effects 0.000 description 2
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 2
- KCFYHBSOLOXZIF-UHFFFAOYSA-N dihydrochrysin Natural products COC1=C(O)C(OC)=CC(C2OC3=CC(O)=CC(O)=C3C(=O)C2)=C1 KCFYHBSOLOXZIF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000005110 dorsal hippocampus Anatomy 0.000 description 2
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- 238000013401 experimental design Methods 0.000 description 2
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 2
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- 102000046783 human APP Human genes 0.000 description 2
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 2
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 2
- 238000002991 immunohistochemical analysis Methods 0.000 description 2
- 230000002055 immunohistochemical effect Effects 0.000 description 2
- 238000003364 immunohistochemistry Methods 0.000 description 2
- 239000003022 immunostimulating agent Substances 0.000 description 2
- 239000007943 implant Substances 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 2
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 2
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 2
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 2
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 2
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 2
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 2
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 2
- HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L magnesium stearate Chemical compound [Mg+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 2
- 230000006984 memory degeneration Effects 0.000 description 2
- 208000023060 memory loss Diseases 0.000 description 2
- 244000000010 microbial pathogen Species 0.000 description 2
- 210000000274 microglia Anatomy 0.000 description 2
- 208000027061 mild cognitive impairment Diseases 0.000 description 2
- 238000000302 molecular modelling Methods 0.000 description 2
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 2
- 210000002682 neurofibrillary tangle Anatomy 0.000 description 2
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 2
- 235000019198 oils Nutrition 0.000 description 2
- 210000000287 oocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000000242 pagocytic effect Effects 0.000 description 2
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 2
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 2
- 102000013415 peroxidase activity proteins Human genes 0.000 description 2
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 2
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 2
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 230000007505 plaque formation Effects 0.000 description 2
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 2
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 2
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 2
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 2
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 description 2
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 2
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 2
- 239000013074 reference sample Substances 0.000 description 2
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 210000003625 skull Anatomy 0.000 description 2
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 2
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000037439 somatic mutation Effects 0.000 description 2
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 238000012916 structural analysis Methods 0.000 description 2
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 238000002198 surface plasmon resonance spectroscopy Methods 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 238000011285 therapeutic regimen Methods 0.000 description 2
- RTKIYNMVFMVABJ-UHFFFAOYSA-L thimerosal Chemical compound [Na+].CC[Hg]SC1=CC=CC=C1C([O-])=O RTKIYNMVFMVABJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 229940033663 thimerosal Drugs 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 2
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 2
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 2
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 2
- BCHIXGBGRHLSBE-UHFFFAOYSA-N (4-methyl-2-oxochromen-7-yl) dihydrogen phosphate Chemical compound C1=C(OP(O)(O)=O)C=CC2=C1OC(=O)C=C2C BCHIXGBGRHLSBE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine Chemical compound CC1=C(N)C(C)=CC(C=2C=C(C)C(N)=C(C)C=2)=C1 UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HSTOKWSFWGCZMH-UHFFFAOYSA-N 3,3'-diaminobenzidine Chemical compound C1=C(N)C(N)=CC=C1C1=CC=C(N)C(N)=C1 HSTOKWSFWGCZMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OSJPPGNTCRNQQC-UWTATZPHSA-N 3-phospho-D-glyceric acid Chemical compound OC(=O)[C@H](O)COP(O)(O)=O OSJPPGNTCRNQQC-UWTATZPHSA-N 0.000 description 1
- FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 4',6-Diamino-2-phenylindol Chemical compound C1=CC(C(=N)N)=CC=C1C1=CC2=CC=C(C(N)=N)C=C2N1 FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 102000007698 Alcohol dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- 108010021809 Alcohol dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- 241000710929 Alphavirus Species 0.000 description 1
- 102000001049 Amyloid Human genes 0.000 description 1
- 108010094108 Amyloid Proteins 0.000 description 1
- 101800001718 Amyloid-beta protein Proteins 0.000 description 1
- 208000031295 Animal disease Diseases 0.000 description 1
- 108010032595 Antibody Binding Sites Proteins 0.000 description 1
- 108010060159 Apolipoprotein E4 Proteins 0.000 description 1
- 108010039627 Aprotinin Proteins 0.000 description 1
- 201000001320 Atherosclerosis Diseases 0.000 description 1
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 description 1
- 230000007466 Aβ secretion Effects 0.000 description 1
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 1
- 231100000699 Bacterial toxin Toxicity 0.000 description 1
- 102000000119 Beta-lactoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 241000701822 Bovine papillomavirus Species 0.000 description 1
- 101100454807 Caenorhabditis elegans lgg-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100454808 Caenorhabditis elegans lgg-2 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100217502 Caenorhabditis elegans lgg-3 gene Proteins 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 241000700198 Cavia Species 0.000 description 1
- 229920001661 Chitosan Polymers 0.000 description 1
- 102000009016 Cholera Toxin Human genes 0.000 description 1
- 108010049048 Cholera Toxin Proteins 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 241000557626 Corvus corax Species 0.000 description 1
- 208000020406 Creutzfeldt Jacob disease Diseases 0.000 description 1
- 208000003407 Creutzfeldt-Jakob Syndrome Diseases 0.000 description 1
- 208000010859 Creutzfeldt-Jakob disease Diseases 0.000 description 1
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 1
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 1
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 1
- 102000007260 Deoxyribonuclease I Human genes 0.000 description 1
- 108010008532 Deoxyribonuclease I Proteins 0.000 description 1
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 description 1
- 108090000204 Dipeptidase 1 Proteins 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000588921 Enterobacteriaceae Species 0.000 description 1
- YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N Epihygromycin Natural products OC1C(O)C(C(=O)C)OC1OC(C(=C1)O)=CC=C1C=C(C)C(=O)NC1C(O)C(O)C2OCOC2C1O YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000283074 Equus asinus Species 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 description 1
- 206010015548 Euthanasia Diseases 0.000 description 1
- 241000700662 Fowlpox virus Species 0.000 description 1
- 201000011240 Frontotemporal dementia Diseases 0.000 description 1
- 108700007698 Genetic Terminator Regions Proteins 0.000 description 1
- 102000053171 Glial Fibrillary Acidic Human genes 0.000 description 1
- 206010018341 Gliosis Diseases 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- AEMRFAOFKBGASW-UHFFFAOYSA-N Glycolic acid Polymers OCC(O)=O AEMRFAOFKBGASW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000989913 Gunnera petaloidea Species 0.000 description 1
- 229920000209 Hexadimethrine bromide Polymers 0.000 description 1
- 101100268553 Homo sapiens APP gene Proteins 0.000 description 1
- 101000617536 Homo sapiens Presenilin-1 Proteins 0.000 description 1
- 101000617546 Homo sapiens Presenilin-2 Proteins 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- 208000023105 Huntington disease Diseases 0.000 description 1
- 208000035150 Hypercholesterolemia Diseases 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 206010065042 Immune reconstitution inflammatory syndrome Diseases 0.000 description 1
- 102000009786 Immunoglobulin Constant Regions Human genes 0.000 description 1
- 108010009817 Immunoglobulin Constant Regions Proteins 0.000 description 1
- 108010067060 Immunoglobulin Variable Region Proteins 0.000 description 1
- 102000017727 Immunoglobulin Variable Region Human genes 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 108010060630 Lactoglobulins Proteins 0.000 description 1
- GDBQQVLCIARPGH-UHFFFAOYSA-N Leupeptin Natural products CC(C)CC(NC(C)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(C=O)CCCN=C(N)N GDBQQVLCIARPGH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000829100 Macaca mulatta polyomavirus 1 Species 0.000 description 1
- 108010030317 Macrophage-1 Antigen Proteins 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 125000000729 N-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 108091061960 Naked DNA Proteins 0.000 description 1
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 229910021586 Nickel(II) chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- SNIOPGDIGTZGOP-UHFFFAOYSA-N Nitroglycerin Chemical compound [O-][N+](=O)OCC(O[N+]([O-])=O)CO[N+]([O-])=O SNIOPGDIGTZGOP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001631646 Papillomaviridae Species 0.000 description 1
- 208000018737 Parkinson disease Diseases 0.000 description 1
- 235000019483 Peanut oil Nutrition 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 1
- 101000612288 Pinus strobus Putative oxygen-evolving enhancer protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 108010039918 Polylysine Proteins 0.000 description 1
- 241000183024 Populus tremula Species 0.000 description 1
- 208000032236 Predisposition to disease Diseases 0.000 description 1
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 1
- 108091000054 Prion Proteins 0.000 description 1
- 102000029797 Prion Human genes 0.000 description 1
- 208000024777 Prion disease Diseases 0.000 description 1
- 108010067787 Proteoglycans Proteins 0.000 description 1
- 102000016611 Proteoglycans Human genes 0.000 description 1
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 description 1
- 108020005067 RNA Splice Sites Proteins 0.000 description 1
- 241000235070 Saccharomyces Species 0.000 description 1
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 description 1
- 241000710961 Semliki Forest virus Species 0.000 description 1
- 206010039966 Senile dementia Diseases 0.000 description 1
- 241000607720 Serratia Species 0.000 description 1
- XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N Silicon Chemical compound [Si] XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000710960 Sindbis virus Species 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 1
- 102100023935 Transmembrane glycoprotein NMB Human genes 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 description 1
- 235000012545 Vaccinium macrocarpon Nutrition 0.000 description 1
- 244000291414 Vaccinium oxycoccus Species 0.000 description 1
- 235000002118 Vaccinium oxycoccus Nutrition 0.000 description 1
- 241000710959 Venezuelan equine encephalitis virus Species 0.000 description 1
- 241000711975 Vesicular stomatitis virus Species 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 230000001594 aberrant effect Effects 0.000 description 1
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 1
- QPMSXSBEVQLBIL-CZRHPSIPSA-N ac1mix0p Chemical compound C1=CC=C2N(C[C@H](C)CN(C)C)C3=CC(OC)=CC=C3SC2=C1.O([C@H]1[C@]2(OC)C=CC34C[C@@H]2[C@](C)(O)CCC)C2=C5[C@]41CCN(C)[C@@H]3CC5=CC=C2O QPMSXSBEVQLBIL-CZRHPSIPSA-N 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 230000000240 adjuvant effect Effects 0.000 description 1
- 238000012382 advanced drug delivery Methods 0.000 description 1
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N alpha-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N 0.000 description 1
- VREFGVBLTWBCJP-UHFFFAOYSA-N alprazolam Chemical compound C12=CC(Cl)=CC=C2N2C(C)=NN=C2CN=C1C1=CC=CC=C1 VREFGVBLTWBCJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012870 ammonium sulfate precipitation Methods 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 1
- 102000025171 antigen binding proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091000831 antigen binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000030741 antigen processing and presentation Effects 0.000 description 1
- 101150031224 app gene Proteins 0.000 description 1
- 229960004405 aprotinin Drugs 0.000 description 1
- 239000012062 aqueous buffer Substances 0.000 description 1
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 1
- 239000012911 assay medium Substances 0.000 description 1
- 208000037875 astrocytosis Diseases 0.000 description 1
- 230000007341 astrogliosis Effects 0.000 description 1
- 108010030694 avidin-horseradish peroxidase complex Proteins 0.000 description 1
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 1
- 239000000688 bacterial toxin Substances 0.000 description 1
- 108010058966 bacteriophage T7 induced DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 1
- 208000013404 behavioral symptom Diseases 0.000 description 1
- 230000003542 behavioural effect Effects 0.000 description 1
- 102000006635 beta-lactamase Human genes 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N beta-maltose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N 0.000 description 1
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000036765 blood level Effects 0.000 description 1
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 1
- 244000309464 bull Species 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 229910002091 carbon monoxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 210000003710 cerebral cortex Anatomy 0.000 description 1
- 238000010382 chemical cross-linking Methods 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 230000006999 cognitive decline Effects 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 230000024203 complement activation Effects 0.000 description 1
- 238000004624 confocal microscopy Methods 0.000 description 1
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 235000004634 cranberry Nutrition 0.000 description 1
- 239000002577 cryoprotective agent Substances 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 210000005220 cytoplasmic tail Anatomy 0.000 description 1
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000006735 deficit Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000000779 depleting effect Effects 0.000 description 1
- 230000006866 deterioration Effects 0.000 description 1
- 229960000633 dextran sulfate Drugs 0.000 description 1
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 229940042399 direct acting antivirals protease inhibitors Drugs 0.000 description 1
- 235000019820 disodium diphosphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 230000006334 disulfide bridging Effects 0.000 description 1
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 1
- 238000005553 drilling Methods 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 1
- 210000001671 embryonic stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 1
- 238000013213 extrapolation Methods 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 231100000221 frame shift mutation induction Toxicity 0.000 description 1
- 230000037433 frameshift Effects 0.000 description 1
- 238000010230 functional analysis Methods 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- 230000002496 gastric effect Effects 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000001476 gene delivery Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 150000002334 glycols Chemical class 0.000 description 1
- 230000002414 glycolytic effect Effects 0.000 description 1
- 244000144993 groups of animals Species 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 230000035876 healing Effects 0.000 description 1
- 239000001307 helium Substances 0.000 description 1
- 229910052734 helium Inorganic materials 0.000 description 1
- SWQJXJOGLNCZEY-UHFFFAOYSA-N helium atom Chemical compound [He] SWQJXJOGLNCZEY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 229960002885 histidine Drugs 0.000 description 1
- 230000001744 histochemical effect Effects 0.000 description 1
- 210000004124 hock Anatomy 0.000 description 1
- 230000001632 homeopathic effect Effects 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 125000001165 hydrophobic group Chemical group 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 1
- 239000000677 immunologic agent Substances 0.000 description 1
- 229940124541 immunological agent Drugs 0.000 description 1
- 229960001438 immunostimulant agent Drugs 0.000 description 1
- 230000003308 immunostimulating effect Effects 0.000 description 1
- 238000000099 in vitro assay Methods 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 210000004969 inflammatory cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N iniprol Chemical compound C([C@H]1C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@H]2CSSC[C@H]3C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@H](C(N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CC=4C=CC=CC=4)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC2=O)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC=2C=CC=CC=2)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H]2N(CCC2)C(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N3)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@H](C(=O)N1)C(C)C)[C@@H](C)O)[C@@H](C)CC)=O)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N 0.000 description 1
- 239000003999 initiator Substances 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 238000001361 intraarterial administration Methods 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000001788 irregular Effects 0.000 description 1
- 230000007794 irritation Effects 0.000 description 1
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- GDBQQVLCIARPGH-ULQDDVLXSA-N leupeptin Chemical compound CC(C)C[C@H](NC(C)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](C=O)CCCN=C(N)N GDBQQVLCIARPGH-ULQDDVLXSA-N 0.000 description 1
- 108010052968 leupeptin Proteins 0.000 description 1
- 238000001638 lipofection Methods 0.000 description 1
- 239000006193 liquid solution Substances 0.000 description 1
- 239000006194 liquid suspension Substances 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000001589 lymphoproliferative effect Effects 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- ZLNQQNXFFQJAID-UHFFFAOYSA-L magnesium carbonate Chemical compound [Mg+2].[O-]C([O-])=O ZLNQQNXFFQJAID-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000001095 magnesium carbonate Substances 0.000 description 1
- 229910000021 magnesium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019359 magnesium stearate Nutrition 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000005075 mammary gland Anatomy 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 238000002483 medication Methods 0.000 description 1
- 206010027175 memory impairment Diseases 0.000 description 1
- 230000003340 mental effect Effects 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 210000001872 metatarsal bone Anatomy 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 230000007388 microgliosis Effects 0.000 description 1
- 238000001000 micrograph Methods 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 239000011859 microparticle Substances 0.000 description 1
- 238000007431 microscopic evaluation Methods 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 1
- 239000002480 mineral oil Substances 0.000 description 1
- 235000010446 mineral oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000003226 mitogen Substances 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000012120 mounting media Substances 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 1
- 230000001537 neural effect Effects 0.000 description 1
- 210000002241 neurite Anatomy 0.000 description 1
- 230000016273 neuron death Effects 0.000 description 1
- 230000007171 neuropathology Effects 0.000 description 1
- 210000004179 neuropil Anatomy 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- QMMRZOWCJAIUJA-UHFFFAOYSA-L nickel dichloride Chemical compound Cl[Ni]Cl QMMRZOWCJAIUJA-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 239000006174 pH buffer Substances 0.000 description 1
- 239000005022 packaging material Substances 0.000 description 1
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 1
- 230000005298 paramagnetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 239000000312 peanut oil Substances 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000010412 perfusion Effects 0.000 description 1
- 208000008494 pericarditis Diseases 0.000 description 1
- 239000003208 petroleum Substances 0.000 description 1
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 1
- 230000035790 physiological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 239000006187 pill Substances 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 229920003229 poly(methyl methacrylate) Polymers 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 229920001515 polyalkylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 229920000656 polylysine Polymers 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 208000022256 primary systemic amyloidosis Diseases 0.000 description 1
- 230000037452 priming Effects 0.000 description 1
- 238000007639 printing Methods 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 208000037821 progressive disease Diseases 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 1
- 230000002685 pulmonary effect Effects 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 1
- 238000012770 revaccination Methods 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- CVHZOJJKTDOEJC-UHFFFAOYSA-N saccharin Chemical compound C1=CC=C2C(=O)NS(=O)(=O)C2=C1 CVHZOJJKTDOEJC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012723 sample buffer Substances 0.000 description 1
- 231100000241 scar Toxicity 0.000 description 1
- 238000013391 scatchard analysis Methods 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 208000008864 scrapie Diseases 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 229910052710 silicon Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010703 silicon Substances 0.000 description 1
- 238000002603 single-photon emission computed tomography Methods 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000003549 soybean oil Substances 0.000 description 1
- 235000012424 soybean oil Nutrition 0.000 description 1
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 1
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000004988 splenocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 235000011149 sulphuric acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 238000011477 surgical intervention Methods 0.000 description 1
- 230000009897 systematic effect Effects 0.000 description 1
- 238000007910 systemic administration Methods 0.000 description 1
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 1
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 1
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 1
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 1
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 1
- 230000004797 therapeutic response Effects 0.000 description 1
- 238000009210 therapy by ultrasound Methods 0.000 description 1
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 1
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 1
- 238000011200 topical administration Methods 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 231100000027 toxicology Toxicity 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 1
- 230000037317 transdermal delivery Effects 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 108091007466 transmembrane glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 1
- 150000003626 triacylglycerols Chemical class 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N triton Chemical compound [3H+] GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N 0.000 description 1
- 208000001072 type 2 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 230000008728 vascular permeability Effects 0.000 description 1
- 235000013311 vegetables Nutrition 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 1
- 238000011179 visual inspection Methods 0.000 description 1
- 238000009736 wetting Methods 0.000 description 1
- 239000000080 wetting agent Substances 0.000 description 1
- 238000002424 x-ray crystallography Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/1703—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- A61K38/1709—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- A61K38/193—Colony stimulating factors [CSF]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/0005—Vertebrate antigens
- A61K39/0007—Nervous system antigens; Prions
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
- A61P25/16—Anti-Parkinson drugs
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
- A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
- C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
- C07K14/4711—Alzheimer's disease; Amyloid plaque core protein
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/53—DNA (RNA) vaccination
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
- A61K2039/55505—Inorganic adjuvants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
- A61K2039/55511—Organic adjuvants
- A61K2039/55566—Emulsions, e.g. Freund's adjuvant, MF59
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
- A61K2039/55511—Organic adjuvants
- A61K2039/55572—Lipopolysaccharides; Lipid A; Monophosphoryl lipid A
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
- A61K2039/55511—Organic adjuvants
- A61K2039/55577—Saponins; Quil A; QS21; ISCOMS
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
- C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
- C07K2317/567—Framework region [FR]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/77—Internalization into the cell
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
Description
Foreliggende oppfinnelse vedrører et humanisert immunoglobulin som spesifikt binder beta-amyloid peptid (A[3), eller antigenbindende fragment derav.
Oppfinnelsen vedrører også et antigenbindende fragment.
Oppfinnelsen vedrører også et farmasøytisk preparat som omfatter immunoglobulinet eller det antigenbindende fragment.
Oppfinnelsen vedrører også anvendelse av det humaniserte immunoglobulinet eller det antigenbindende fragment for fremstilling av medikament for å forebygge eller behandle en amyloidogen sykdom.
Oppfinnelsen vedrører også et isolert nukleinsyremolekyl som koder for immunoglobulinet eller det antigenbindende fragment.
Oppfinnelsen vedrører også en vektor som omfatter
nukleinsyremolekylet.
Alzheimers sykdom (AD) er en progressiv sykdom som resulterer i senil demens. Se generelt Selkoe, TINS 16:403 (1993); Hardy et al., WO 92/13069; Selkoe, J. Neuropathol. Exp. Neurol. 53:438 (1994); Duff et al., Nature 373:476
(1995); Games et al., Nature 373:523 (1995). Bredt angitt faller sykdommen i to kategorier: Sen begynnelse, som skjer i alderdommen (65 + år) og tidlig begynnelse, som utvikles godt før den senile periode, dvs. mellom 35 og 60 år.
I begge typer av sykdom er patologien lik, men abnormalitetene har en tendens
til å være mer alvorlige og omfattende i tilfeller ved begynnelse i tidligere alder. Sykdommen erkarakterisert vedminst to typer av lesjoner i hjernen, nevrofibrillære floker og senilt plaque. Nevrofibrillære floker er intracellulære avsetninger av mikrotubulus-assosiert tau-protein bestående av to filamenter tvunnet rundt hverandre i par. Senilt plaque (dvs. amyloid plaque) er områder av uorganisert neuropil opptil 150 nm tvers over med ekstracellulære amyloide avsetninger ved senteret som er synlige ved mikroskopisk analyse av snitt av hjernevev. Akkumulering av amyloid plaque i hjernen er også forbundet med Downs syndrom og andre kognitive lidelser.
Den vesentlige bestanddel av plaque er et peptid betegnet Ap eller p-amyloid-peptid. Ap-peptid er et 4-kDa indre fragment av 39-43 aminosyrer av et større transmembran-glykoprotein betegnet protein betegnet amyloid-forløper protein (APP). Som et resultat av proteolytisk prosessering av APP ved forskjellige sekretase-enzymer, er Ap primært funnet i både en kortform, 40 aminosyrer i lengde og en lang form, i området fra 42-43 aminosyrer i lengde. Del av det hydrofobe transmembran-domene av APP er funnet ved karboksy-enden av Ap og kan svare for evnen til Ap til å aggregere til plaque, spesielt i tilfellet av den lange form. Akkumulering av amyloid plaque i hjernen fører til slutt til neuronal celledød. De fysiske symptomer forbundet med denne type av neural svekking karakteriserer Alzheimers sykdom.
Mange mutasjoner innen APP-protein er samsvarte med tilstedeværelse av Alzheimers sykdom. Se f.eks. Goate et al., Nature 349:704) (1991) (valin<717>til isoleucin); Chartier Harlan et al. Nature 353:844 (1991)) (valin<717>til glycin); Murrell et al., Science 254:97 (1991) (valin<717>til fenylalanin); Mullan et al., Nature Genet. 1:345 (1992) (en dobbel mutasjon som endrer lysin59<5->metionin5<96>til asparagin59<5->leucin5<96>). Slike mutasjoner er antatt å forårsake Alzheimers sykdom ved øket eller endret prosessering av APP til Ap, spesielt prosessering av APP til økede mengder av den lange form av Ap (dvs. Api-42 og Api-43). Mutasjoner i andre gener, så som presenilin-gener, PS1 og PS2, er antatt indirekte å påvirke prosessering av APP til å danne økede mengder av lang form Ap (se Hardy, Tl NS 20: 154 (1997)).
Musemodeller har vært anvendt med hell for å bestemme betydningen av amyloid plaque ved Alzheimers (Games et al., supra, Johnson-Wood et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 94:1550 (1997)). Spesielt, når PDAPP transgene mus (som uttrykker en mutant form av human APP og utvikler Alzheimers sykdom i ung alder) blir injisert med den lange form av Ap, oppviser de både en reduksjon i progresjonen av Alzheimers og en økning i antistoff-titere til Ap-peptid (Schenk et al., Nature 400, 173 (1999)). Observasjonene beskrevet ovenfor indikerer at Ap, spesielt i dens lange form, er et forårsakende element ved Alzheimers sykdom.
McMichael, EP 526,511, foreslår administrering av homeopatiske doser (mindre enn eller lik 10-<2>mg/dag) av Ap til pasienter med preetablert AD. For et typisk menneske med ca. 5 liter plasma, ville selv den øvre grensen for denne dosen være forventet å gi en konsentrasjon på ikke mer enn 2 pg/ml. Den normale konsentrasjon av Ap i humant plasma er typisk i området 50-200 pg/ml (Seubert et al., Nature 359:325 (1992)). Fordi dosen foreslått i EP 526,511 knapt ville endre nivået av endogent sirkulerende Ap og fordi EP 526,511 ikke anbefaler anvendelse av et adjuvans, som en immunostimulant, synes det usannsynlig at noen som helst terapeutisk fordel ville resultere.
Følgelig eksisterer det et behov for nye terapier og reagenser for behandling av Alzheimers sykdom, spesielt terapier og reagenser som kan bevirke terapeutisk fordel i fysiologiske (f.eks. ikke-toksiske) doser.
Foreliggende oppfinnelse omfatter nye immunologiske reagenser, spesielt terapeutiske antistoff-reagenser for forebygging og behandling av amyloidogen sykdom (f.eks. Alzheimers sykdom). Oppfinnelsen er basert, i det minste delvis, på identifikasjon og karakterisering av et monoklonalt antistoff 3D6 som spesifikt binder til Ap-peptid og er effektivt for reduksjon av plaque-byrde og/eller reduksjon av neurittisk dystrofi forbundet med amyloidogene lidelser. Strukturell og funksjonell analyse av dette antistoffet fører til utforming av forskjellige humaniserte antistoffer for profylaktisk og/eller terapeutisk anvendelse. Spesielt omfatter oppfinnelsen humanisering av de variable regioner av dette antistoffer og tilveiebringer følgelig humaniserte immunoglobulin- eller antistoff-kjeder, intakte humaniserte immunoglobuliner eller antistoffer og funksjonelle immunoglobulin- eller antistoffragmenter, spesielt antigenbindende fragmenter, av de aktuelle antistoffet.
Polynukleotid-reagenser og vektorer egnet for å kode for de humaniserte antistoffene er også beskrevet.
Anvendelse av de humaniserte antistoffene for fremstilling av et medikament for behandling av amyloidogene sykdommer eller lidelser (f.eks. Alzheimers sykdom) er beskrevet, og også farmasøytiske preparater for anvendelse i slike applikasjoner.
Kort beskrivelse av tegningene
Figur 1 viser en oppstilling av aminosyresekvensene i lettkjeden av mus 3D6, humanisert 3D6, Kabat ID 109230 og kimlinje A19 antistoffer. CDR-regioner er angitt med piler. Fet kursiv indikerer sjeldne murine rester. Fet indikerer pakkende (VH + VL) rester. Fast fyll indikerer kanoniske/CDR-interagerende rester. Stjerner indikerer rester valgt for tilbakemutasjon i humanisert 3D6, versjon 1. Figur 2 viser en oppstilling av aminosyresekvensene i tungkjeden av mus 3D6, humanisert 3D6, Kabat ID 045919 og kimlinje VH3-23 antistoffer. Annotasjonen er lik som for Figur 1. Figur 3 viser grafisk Ap-bindingsegenskapene til 3D6, kimær 3D6 og 10D5. Figur 3A er en kurve som viser binding av Ap til kimær 3D6 (PK1614) sammenlignet med murin 3D6. Figur 3B er en kurve som viser konkurranse av biotinylert 3D6 versus umerket 3D6, PK1614 og 10D5 for binding til Ap. Figur 4 viser en homologi-modell av 3D6 VH og VL, som viser oc-karbon-ryggrad-spor. VH er vist som en stiplet linje og VL er vist som en fast linje. CDR-regioner er angitt i bånd-form. Figur 5 viser grafisk Ap-bindingsegenskapene til kimær 3D6 og humanisert 3D6. Figur 5A viser ELISA-resultater som måler binding av humanisert 3D6v1 og kimær 3D6 til aggregert Ap. Figur 5B viser ELISA-resultater som måler bindingen av humanisert 3D6v1 og humanisert 3D6v2 til aggregert Ap. Figur 6 er en kurve som kvantifiserer bindingen av humanisert 3D6 og kimær 3D6 til Ap plaque fra hjerne-seksjoner av PDAPP-mus. Figur 7 er en kurve som viser resultater av et kompetitivt bindingsforsøk som tester evnen til humanisert 3D6 versjoner 1 og 2, kimær 3D6, murin 3D6 og 10D5 til å konkurrere med murin 3D6 for binding til Ap. Figur 8 viser grafisk et ex vivo fagocytose-forsøk som tester evnen til humanisert 3D6v2, kimær 3D6 og human IgG til å mediere opptak av Ap av mikrogliale celler. Figur 9 viser en oppstilling av 10D5 VL og 3D6 VL aminosyresekvenser. Fet indikerer rester som nøyaktig motsvarer 10D5. Figur 10 viser en oppstilling av 10D5 VH og 3D6 VH aminosyresekvenser. Fet indikerer rester som nøyaktig motsvarer 10D5.
Foreliggende oppfinnelse omfatter nye immunologiske reagenser og metoder for forhindring eller behandling av Alzheimers sykdom eller andre amyloidogene sykdommer. Oppfinnelsen er basert, i det minste delvis, på karakterisering av det monoklonale immunoglobulinet, 3D6, som er effektiv til binding av beta-amyloidprotein (Ap) (f.eks. binding av oppløselig og/eller aggregert Ap), mediering av fagocytose (f.eks. av aggregert Ap), reduksjon av plaque-byrde og/eller reduksjon av neurittisk dystrofi (f.eks. i en pasient). Oppfinnelsen er videre basert på bestemmelse og strukturell karakterisering av den primære og sekundære struktur av de variable lette og tunge kjeder av dette immunoglobulinet og identifikasjon av rester som er viktige for aktivitet og immunogenisitet.
Immunoglobulinene, f.eks. terapeutiske immunoglobuliner ifølge oppfinnelsen omfatter en humanisert variabel lett- og/eller humanisert variabel tungkjede som angitt i krav 1. De variable lett- og variable tung-kjeder omfatter en komplementaritetsbestemmende region (CDR) fra det monoklonale immunoglobulin (f.eks. donor-immunoglobulin) og variable rammeverk-regioner hovedsakelig fra et humant akseptor-immunoglobulin. Uttrykket "hovedsakelig fra et humant akseptor-immunoglobulin" betyr at hoveddelen eller nøkkel-rammeverk-rester er fra den humane akseptor-sekvens, men som imidlertid tillater substitusjon av rester i visse posisjoner med rester valgt for å forbedre aktivitet til det humaniserte immunoglobulin (f.eks. endrer aktivitet slik at den nærmere ligner aktiviteten til donor-immunoglobulin) eller valgt for å redusere immunogenisiteten av det humaniserte immunoglobulin.
Den humaniserte immunoglobulin lettkjeden omfatter 3D6 variabel region CDRer (f.eks. fra 3D6 lettkjede variabel region-sekvensen angitt som SEKV ID NR:2) og omfatter en human akseptor immunoglobulin variabel rammeverk-region, forutsatt at rammeverk-rester |_2, L36 og L46 (Kabat nummereringskonvensjon) er substituert med den tilsvarende aminosyrerest fra mus 3D6 lettkjede variabel region-sekvensen. Den humaniserte immunoglobulin tungkjeden omfatter 3D6 variabel region CDRer (f.eks. fra 3D6 tungkjede variabel region-sekvensen angitt som SEKV ID NR:4) og omfatter en human akseptor immunoglobulin variabel rammeverk-region, forutsatt at rammeverk-rester H49, H93 og H94 (Kabat nummereringskonvensjon) er erstattet med den tilsvarende aminosyrerest fra mus 3D6 tungkjede variabel region-sekvensen.
Lett-kjede rammeverk-regioner er valgt fra akseptor immunoglobulin Kabat ID 019230, Kabat ID 005131, Kabat ID 005058, Kabat ID 005057, Kabat ID 005059, Kabat ID U21040 og Kabat ID U41645. Tung-kjede rammeverk- regioner er valgt fra akseptor immunoglobulin Kabat ID 045919, Kabat ID 000459, Kabat ID 000553, Kabat ID 000386 og Kabat ID M23691.
Sjeldne tungkjede rammeverkrester H74, H77 og H89 er erstattet med en tilsvarende kimlinje rest fra en VH3-23 kimlinje immunoglobulin-sekvens.
Oppfinnelsen omfatter et humanisert immunoglobulin som omfatter en lettkjede og en tungkjede, som beskrevet ovenfor eller et antigenbindende fragment av nevnte immunoglobulin. I en eksempelvis utførelsesform binder det humaniserte immunoglobulin (f.eks. binder spesifikt) til beta-amyloidpeptid (Ap) med en bindingsaffinitet på minst 10<7>M"<1>, 10<8>M"<1>eller 10<9>M"<1>. I en annen utførelsesform omfatter immunoglobulin- eller antigen-bindingsfragmentet en tungkjede som har isotype y1. I en annen utførelsesform binder immunoglobulin-eller antigen-bindingsfragmentet (f.eks. binder spesifikt) til både oppløselig beta-amyloidpeptid (Ap) og aggregert Ap. I en annen utførelsesform medierer immunoglobulin- eller antigen-bindings-fragmentet fagocytose (f.eks. fremkaller fagocytose) av beta-amyloidpeptid (Ap). I enda en annen utførelsesform krysser immunoglobulin- eller antigen-bindingsfragmentet blod-hjerne-barrieren hos et individ. I enda en annen utførelsesform reduserer immunoglobulin- eller antigen-bindingsfragmentet både beta-amyloidpeptid- (Ap) byrden og neurittisk dystrofi hos et individ.
Immunoglobulinene beskrevet her er spesielt egnet for anvendelse for forhindring eller behandling av amyloidogene sykdommer. Immunoglobulinene kan anvendes for forhindring eller behandling av en amyloidogen sykdom (f.eks. Alzheimers sykdom) ved administrering til pasienten av en effektiv dose av et humanisert immunoglobulin som beskrevet her. Oppfinnelsen omfatter farmasøytiske preparater som omfatter et humanisert immunoglobulin som beskrevet her og en farmasøytisk bærer. Også omfattet er isolerte nukleinsyremolekyler og vektorer for å produsere immunoglobulinene eller immunoglobulin-fragmentene eller kjedene beskrevet her.
Før beskrivelse av oppfinnelsen, kan det være nyttig for forståelse derav å angi definisjoner av visse betegnelser som blir anvendt nedenfor.
Betegnelsen "immunoglobulin" eller "antistoff (anvendt om hverandre her) angir et antigenbindende protein som har en basisk fire-polypeptid kjede-struktur bestående av to tunge og to lette kjeder, hvor nevnte kjeder er stabilisert ved for eksempel interkjede disulfid-bindinger, som har evnen til spesifikt å binde antigen. Både tunge og lette kjeder er foldet i domener. Betegnelsen "domene" angir en globulær region av et tung- eller lettkjede polypeptid omfattende peptid-løkker (f.eks. omfattende 3 til 4 peptidløkker) stabilisert, for eksempel ved p-foldede "sheet" og/eller intrakjede disulfidbinding. Domener er videre referert til her som "konstante" eller "variable", basert på den relative mangel på sekvens-variasjon innen domenene av forskjellige klasse-medlemmer i tilfellet av et "konstant" domene eller den betydelige variasjon innen domenene av forskjellige klasse-medlemmer i tilfellet av et "variabelt" domene. "Konstante" domener på lettkjeden er referert til om hverandre som "lettkjede konstante regioner"', "lettkjede konstante domener", "CL" regioner eller "CL" domener). "Konstante" domener på tungkjeden er referert til om hverandre som "tungkjede konstante regioner", "tungkjede konstante domener", "CH" regioner eller "CH" domener). "Variable" domener på lettkjeden er referert til om hverandre som "lettkjede variable regioner", "lettkjede variable domener", "VL" regioner eller "VL" domener). "Variable" domener på tungkjeden er referert til om hverandre som "tungkjede konstante regioner", "tungkjede konstante domener, "CH" regioner eller "CH" domener).
Betegnelsen "region" angir en del eller porsjon av en antistoff-kjede og omfatter konstante eller variable domener som definert her, så vel som mer adskilte deler eller porsjoner av nevnte domener. For eksempel omfatter lettkjede variable domener eller regioner "komplementaritetsbestemmende regioner" eller "CDR" innblandet blant "rammeverk-regioner" eller "FR", som definert her.
Immunoglobuliner eller antistoffer kan eksistere i monomer eller polymer form. Betegnelsen "antigenbindende fragment" angir et polypeptidfragment av et immunoglobulin eller antistoff som binder antigen eller konkurrerer med intakt antistoff (dvs. med det intakte antistoff fra hvilket det ble avledet) for antigen binding (dvs. spesifikk binding). Betegnelsen "konformasjon" angir den tertiære struktur av et protein eller polypeptid (f.eks. et antistoff, antistoffkjede, domene eller region derav). For eksempel angir uttrykket "lett (eller tung) kjede konformasjon" den tertiære struktur av en lett (eller tung) kjede variabel region og uttrykket "antistoff-konformasjon" eller "antistoffragment-konformasjon" angir den tertiære struktur av et antistoff eller fragment derav.
"Spesifikk binding" av et antistoff betyr at antistoffet oppviser merkbar affinitet for antigen eller en foretrukket epitop og oppviser fortrinnsvis ikke betydelig kryssreaktivitet. "Merkbar" eller foretrukket binding omfatter binding med en affinitet på minst10<6>,10<7>,10<8>, 109M"<1>eller1010M_<1>. Affiniteter større enn 107M_1, fortrinnsvis større enn 10<8>M_<1>er mer foretrukket. Verdier mellom de angitt her er også ment å være innenfor omfanget av foreliggende oppfinnelse og en foretrukket bindingsaffinitet kan være angitt som et område av affiniteter, for eksempel 10<6>til1010M_<1>, fortrinnsvis 10<7>til 10<1>0M_<1>, mer foretrukket 10<8>til 10<10>M_<1>. Et antistoff som "ikke oppviser betydelig kryssreaktivitet" er et som ikke i særlig grad binder til en uønsket enhet (f.eks. en uønsket proteinholdig enhet). For eksempel vil et antistoff som spesifikt binder til Ap merkbart binde Ap, men vil ikke betydelig reagere med ikke-Ap-proteiner eller peptider (f.eks. ikke-Ap-proteiner eller peptider omfattet i plaque). Et antistoff spesifikt for en foretrukket epitop vil for eksempel ikke betydelig kryssreagere med fjerne epitoper på samme protein eller peptid. Spesifikk binding kan bestemmes i henhold til hvilke som helst kjente metoder på området for å bestemme slik binding. Fortrinnsvis blir spesifikk binding bestemt i henhold til Scatchard-analyse og/eller kompetitive bindingsforsøk.
Bindingsfragmenter blir produsert ved rekombinante DNA-teknikker eller ved enzymatisk eller kjemisk spaltning av intakte immunoglobuliner. Bindingsfragmenter omfatter Fab, Fab', F(ab')2, Fabc, Fv, enkle kjeder og enkel-kjede-antistoffer. Bortsett fra "bispesifikke" eller "bifunksjonelle" immunoglobuliner eller antistoffer, er et immunoglobulin eller antistoff forstått å ha hvert av dets bindingsseter identiske. Et "bispesifikt" eller "bifunksjonelt antistoff' er et kunstig hybrid-antistoff som har to forskjellige tung/lettkjede par og to forskjellige bindingsseter. Bispesifikke antistoffer kan produseres ved en rekke metoder omfattende fusjon av hybridomer eller linking av Fab' fragmenter. Se f.eks. Songsivilai & Lachmann, Clin. Exp. Immunol. 79:315-321 (1990); Kostelny et al., J. Immunol. 148, 1547-1553 (1992).
Betegnelsen "humanisert immunoglobulin" eller "humanisert antistoff' angir et immunoglobulin eller antistoff som omfatter minst én humanisert immunoglobulin- eller antistoff-kjede (dvs. minst én humanisert lett- eller tungkjede). Betegnelsen "humanisert immunoglobulinkjede" eller "humanisert antistoffkjede" (dvs. en "humanisert immunoglobulin-lettkjede" eller "humanisert immunoglobulin-tungkjede") angir en immunoglobulin- eller antistoff-kjede (dvs. henholdsvis lett- eller tungkjede) som har en variabel region som omfatter en variabel rammeverk-region hovedsakelig fra et humant immunoglobulin eller antistoff og komplementaritetsbestemmende regioner (CDR) (f.eks. minst én CDR, fortrinnsvis to CDR, mer foretrukket tre CDR) hovedsakelig fra et ikke-humant immunoglobulin eller antistoff og omfatter videre konstante regioner (f.eks. minst én konstant region eller del derav, i tilfellet av en lettkjede og fortrinnsvis tre konstante regioner i tilfellet av en tungkjede). Betegnelsen "humanisert variabel region" (f.eks. "humanisert lettkjede variabel region" eller "humanisert tungkjede variabel region") angir en variabel region som omfatter en variabel rammeverkregion hovedsakelig fra et humant immunoglobulin eller antistoff og komplementaritetsbestemmende regioner (CDR) hovedsakelig fra et ikke-humant immunoglobulin eller antistoff.
Uttrykket "hovedsakelig fra et humant immunoglobulin eller antistoff" eller "hovedsakelig humant" betyr at, når oppstilt mot en human immunoglobulin- eller antistoff-aminosekvens for sammenligningsformål, har regionen minst 80-90%, fortrinnsvis 90-95%, mer foretrukket 95-99% identitet (dvs. lokal sekvensidentitet) med den humane rammeverk- eller konstante region-sekvens, med tillatelse av for eksempel konservative substitusjoner, konsensus-sekvens-substitusjoner, kimlinje-substitusjoner, tilbakemutasjoner og lignende. Innføring av konservative substitusjoner, konsensus-sekvens-substitusjoner, kimlinje-substitusjoner, tilbakemutasjoner og lignende, er ofte referert til som "optimalisering" av et humanisert antistoff eller kjede. Uttrykket "hovedsakelig fra et ikke-humant immunoglobulin eller antistoff" eller "hovedsakelig ikke-humant" betyr et som har en immunoglobulin- eller antistoff-sekvens minst 80-95%, fortrinnsvis 90-95%, mer foretrukket, 96%, 97%, 98% eller 99% identisk med den til en ikke-human organisme, f.eks. et ikke-humant pattedyr.
Følgelig er alle regioner eller rester i et humanisert immunoglobulin eller antistoff eller i en humanisert immunoglobulin- eller antistoff-kjede, bortsett fra muligens CDR, hovedsakelig identisk med de tilsvarende regioner eller rester i én eller flere native humane immunoglobulin-sekvenser. Betegnelsen "tilsvarende region" eller "tilsvarende rest" angir en region eller rest på en andre aminosyre- eller nukleotid-sekvens som okkuperer samme (dvs. ekvivalent) posisjon som en region eller rest på en første aminosyre- eller nukleotid-sekvens, når de første og andre sekvenser er optimalt oppstilt for sammenligningsformål.
Betegnelsene "humanisert immunoglobulin" eller "humanisert antistoff' er ikke ment å omfatte kimære immunoglobuliner eller antistoffer, som definert nedenfor. Selv om humaniserte immunoglobuliner eller antistoffer er kimære i deres konstruksjon (dvs. omfatter regioner fra mer enn én type protein), omfatter de ytterligere trekk (dvs. variable regioner omfattende donor CDR-rester og akseptor-rammeverk-rester) som ikke finnes i kimære immunoglobuliner eller antistoffer, som definert her.
Betegnelsen "betydelig identitet" betyr at to polypeptidsekvenser, når optimalt oppstilt, så som med programmene GAP eller BESTFIT ved anvendelse av default gap vekter, har minst 50-60% sekvensidentitet, fortrinnsvis 60-70% sekvensidentitet, mer foretrukket 70-80% sekvensidentitet, mer foretrukket minst 80-90% identitet, enda mer foretrukket minst 90-95% identitet og enda mer foretrukket minst 95% sekvensidentitet eller mer (f.eks. 99% sekvensidentitet eller mer). Betegnelsen "vesentlig identitet" betyr at to polypeptidsekvenser, når optimalt oppstilt, så som med programmene GAP eller BESTFIT ved anvendelse av default gap vekter, har minst 80-90% sekvensidentitet, fortrinnsvis 90-95% sekvensidentitet og mer foretrukket minst 95% sekvensidentitet eller mer (f.eks. 99% sekvensidentitet eller mer). For sekvens-sammenligning virker typisk én sekvens som en referanse-sekvens, med hvilken test-sekvenser blir sammenlignet. Ved anvendelse av en sekvens-sammenligningsalgoritme blir test- og referanse-sekvenser matet til en computer, subsekvens koordinater blir angitt, hvis nødvendig og sekvensalgoritme program-parametere blir angitt. Sekvens-sammenlignings-algoritmen beregner deretter prosent sekvensidentitet for testsekvensen(e) i forhold til referansesekvensen, basert på de angitte program-parametere. Betegnelsene "sekvensidentitet" og "sekvensidentitet" blir anvendt om hverandre her.
Optimal oppstilling av sekvenser for sammenligning kan for eksempel utføres med den lokale homologi-algoritmen til Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981), med homologi-oppstillingsalgoritmen til Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970), ved søking etter similaritets-metoden til Pearson & Lipman, Proe. Nat' l. Acad. Sei. USA 85:2444 (1988), ved elektroniske implementeringer av disse algoritmer (GAP, BESTFIT, FASTA og TFASTA i Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wl) eller ved visuell inspeksjon (se generelt Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology). Ett eksempel på algoritme som er egnet for å bestemme prosent sekvensidentitet og sekvenssimilaritet er BLAST-algoritmen, som er beskrevet i Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403 (1990). Programvare for utføring av BLAST-analyser er offentlig tilgjengelige gjennom the National Center for Biotechnology Information (offentlig tilgjengelig gjennom the National Institutes of Health NCBI internet server). Typisk kan default program-parametere anvendes for å utføre sekvenssammenligningen, selv om tilpassede parametere også kan anvendes. For aminosyresekvenser anvender BLASTP-programmet som default en ordlengde (W) på 3, en forventet verdi (E) på 10 og BLOSUM62 scorings-matriks (se Henikoff & Henikoff, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 89:10915 (1989)).
Fortrinnsvis avviker restposisjoner som ikke er identiske ved konservative aminosyre-substitusjoner. For formål å klassifisere aminosyre-substitusjoner som konservative eller ikke-konservative, er aminosyrer gruppert som følger: Gruppe I (hydrofobe sidekjeder): leu, met, ala, val, leu, ile; Gruppe II (nøytrale hydrofile sidekjeder): cys, ser, thr; Gruppe III (sure sidekjeder): asp, glu; Gruppe IV (basiske sidekjeder): asn, gin, his, lys, arg; Gruppe V (rester som påvirker kjedeorientering): gly, pro; og Gruppe VI (aromatiske sidekjeder): trp, tyr, phe. Konservative substitusjoner involverer substitusjoner mellom aminosyrer i samme klasse. Ikke-konservative substitusjoner består i erstatning av et medlem av én av disse klasser med et medlem av en annen.
Fortrinnsvis binder humaniserte immunoglobuliner eller antistoffer antigen med en affinitet som er innen en faktor på tre, fire eller fem av den for det tilsvarende ikke-humane antistoff. Hvis for eksempel det ikke-humane antistoff har en bindingsaffinitet på 10<9>M_<1>, vil humaniserte antistoffer ha en bindingsaffinitet på minst 3 x 10<9>M"<1>, 4 x 10<9>M"<1>eller 10<9>M"<1>. Ved beskrivelse av bindingsegenskapene til en immunoglobulin- eller antistoff-kjede, kan kjeden beskrives basert på dens evne til "å styre antigen- (f.eks. Ap) binding". En kjede er angitt å "styre antigen-binding" når den overbringer til et intakt immunoglobulin eller antistoff (eller antigenbindende fragment derav) en spesifikk bindingsegenskap eller bindingsaffinitet. En mutasjon (f.eks. en tilbakemutasjon) er angitt vesentlig å påvirke evnen til en tung- eller lettkjede til å styre antigenbinding hvis den påvirker (f.eks. reduserer) bindingsaffiniteten til et intakt immunoglobulin eller antistoff (eller antigenbindende fragment derav) som omfatter nevnte kjede, med minst én størrelsesorden sammenlignet med den til antistoffet (eller antigenbindende fragment derav) som omfatter en ekvivalent kjede som mangler nevnte mutasjon. En mutasjon "påvirker ikke vesentlig (f.eks. reduserer) evnen til en kjede til å styre antigen-binding" hvis den påvirker (f.eks. reduserer) bindingsaffiniteten av et intakt immunoglobulin eller antistoff (eller antigen binding fragment derav) som omfatter nevnte kjede, med bare en faktor på to, tre eller fire av den til antistoffet (eller antigenbindende fragment derav) som omfatter en ekvivalent kjede som mangler nevnte mutasjon.
Betegnelsen "kimært immunoglobulin" eller antistoff angir et immunoglobulin eller antistoff hvis lett- og tung-kjeder er avledet fra forskjellige arter. Kimære immunoglobuliner eller antistoffer kan konstrueres, for eksempel ved genetisk konstruksjon, fra immunoglobulin gensegmenter som tilhører forskjellige arter.
Et "antigen" er en enhet (f.eks. en proteinholdig enhet eller peptid) til hvilket et antistoff spesifikt binder.
Betegnelsen "epitop" eller "antigen-determinant" angir et sete på et antigen til hvilket et immunoglobulin eller antistoff (eller antigenbindende fragment derav) spesifikt binder. Epitoper kan dannes både av påfølgende aminosyrer eller ikke-påfølgende aminosyrer sidestilt ved tertiær folding av et protein. Epitoper dannet av påfølgende aminosyrer blir typisk beholdt ved eksponering for denaturings-løsningsmidler mens epitoper dannet ved tertiær folding typisk blir tapt ved behandling med denaturerings-løsningsmidler. En epitop omfatter typisk minst 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 eller 15 aminosyrer i en unik romlig konformasjon. Metoder for bestemmelse av romlig konformasjon av epitoper omfatter for eksempel røntgenkrystallografi og 2-dimensjonal kjernemagnetisk resonans. Se f.eks. Epitope Mapping Protocols in Methodsin Molecular Biology, Vol. 66, G. E. Morris, Ed. (1996).
Antistoffer som gjenkjenner samme epitop kan identifiseres i en enkel immunoassay som viser evnen til ett antistoff til å blokkere binding av et annet antistoff til et mål-antigen, dvs. et kompetitivt bindingsforsøk. Kompetitiv binding blir bestemt i et forsøk hvor immunoglobulin som testes hemmer spesifikk binding av et referanse-antistoff til et felles antigen, så som Ap. En rekke typer av kompetitive bindingsforsøk er kjent, for eksempel: fastfase direkte eller indirekte radioimmunoassay (RIA), fastfase direkte eller indirekte enzym-immunoassay (EIA), sandwich kompetitivt forsøk (se Stahli et al., Methodsin Enzymology 9:242 (1983)); fastfase direkte biotin-avidin EIA (se Kirkland et al., J. Immunol. 137:3614 (1986)); fastfase direkte merket forsøk, fastfase direkte merket sandwich-forsøk (se Harlow og Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (1988)); fastfase direkte merke RIA ved anvendelse av 1-125 merke (se Morel et al., Mol. Immunol. 25(1):7 (1988)); fastfase direkte biotin-avidin EIA (Cheung et al., Virology 176:546 (1990)); og direkte merket RIA. (Moldenhauer et al., Scand. J. Immunol. 32:77 (1990)). Typisk involverer et slikt forsøk anvendelse av renset antigen bundet til en fast overflate eller celler som bærer en av disse, et umerket test-immunoglobulin og et merket referanse-immunoglobulin. Kompetitiv hemning blir målt ved å bestemme mengden av merke bundet til den faste overflaten eller cellene i nærvær av test-immunoglobulinet. Vanligvis er test-immunoglobulinet til stede i overskudd. Vanligvis, når et konkurrerende antistoff er til stede i overskudd, vil det hemme spesifikk binding av et referanse-antistoff til et felles antigen med minst 50-55%, 55-60%, 60-65%, 65-70% 70-75% eller mer.
En epitop blir også gjenkjent av immunologiske celler, for eksempel B-celler og/eller T-celler. Cellulær gjenkjennelse av en epitop kan bestemmes ved in vitro forsøk som måler antigen-avhengig proliferasjon, som bestemt ved<3>H-thymidin-innføring, ved cytokin-sekresjon, ved antistoff-sekresjon eller ved antigen-avhengig dreping (cytotoksisk T-lymfocytt forsøk).
Eksempler på epitoper eller antigene determinanter kan finnes innen humant amyloidforløper-protein (APP), men er fortrinnsvis funnet innen Ap-peptidet av APP. Multiple isoformer av APP eksisterer, for eksempel APP<695>APP75<1>og APP77<0>. Aminosyrer innen APP er gitt nummer i henhold til sekvensen av APP<770>isoform (se f.eks. GenBank aksesjonsnummer P05067 også angitt som SEKV ID NR:38). Ap- (også referert til her som beta-amyloid-peptid og A-beta) peptid er et~4 kDa indre fragment av 39-43 aminosyrer av APP (Ap39, Ap40, Ap41, Ap42 og Ap43). Ap40 består for eksempel av rester 672-711 av APP og Ap42 består av rester 673-713 av APP. Som et resultat av proteolytisk prosessering av APP med forskjellige sekretase-enzymer in vivo eller in situ, er Ap funnet i både en "kort form", 40 aminosyrer i lengde og en "lang form", i området fra 42-43 aminosyrer i lengde. Foretrukne epitoper eller antigene determinanter, som beskrevet her, er lokalisert innen N-terminus av Ap-peptid og omfatter rester innen aminosyrer 1-10 av Ap, fortrinnsvis fra restene 1-3, 1-4, 1-5, 1-6, 1-7 eller 3-7 av Ap42. Ytterligere refererte epitoper eller antigene determinanter omfatter rester 2-4, 5, 6, 7 eller 8 av Ap, rester 3-5, 6, 7, 8 eller 9 av Ap eller rester 4-7, 8, 9 eller 10 av Ap42.
Betegnelsen "amyloidogen sykdom" omfatter hvilken som helst sykdom forbundet med (eller forårsaket av) dannelse eller avsetning av uoppløselige amyloide fibriller. Eksempler på amyloidogene sykdommer omfatter, men er ikke begrenset til systemisk amyloidose, Alzheimers sykdom, voksen begynt diabetes, Parkinsons sykdom, Huntingtons sykdom, fronto-temporal demens og prion-relaterte overførbare spongiform encefalopatier (kum og Creutzfeldt-Jacob sykdom hos mennesker og skrapesyke og BSE hos henholdsvis sauer og kveg). Forskjellige amyloidogene sykdommer er definert ellerkarakterisert vedtypen av polypeptid-komponenten av de avleirede fibriller. For eksempel hos individer eller pasienter som har Alzheimers sykdom er p-amyloid-protein (f.eks. villtype, variant eller forkortet p-amyloid-protein) den karakteriserende polypeptid-komponent av amyloid-avleiringen. Følgelig er Alzheimers sykdom et eksempel på en "sykdomkarakterisert vedavsetninger av Ap" eller en "sykdom forbundet med avsetninger av Ap", f.eks. i hjernen til et individ eller pasient. Betegnelsene
"p-amyloid-protein", "p-amyloid-peptid", "p-amyloid", "Ap" og "Ap-peptid" blir anvendt om hverandre her.
Betegnelsen "effektiv dose" eller "effektiv dosering" er definert som en mengde tilstrekkelig til å oppnå eller i det minste delvis til å oppnå den ønskede effekt. Betegnelsen "terapeutisk effektiv dose" er definert som en mengde tilstrekkelig til å kurere eller i det minste delvis stanse sykdommen og dens komplikasjoner hos en pasient som allerede lider av sykdommen. Mengder effektive for denne anvendelse vil avhenge av alvorlighetsgraden av infeksjonen og den generelle tilstand til pasientens eget immunsystem.
Betegnelsen "pasient" omfatter humane og andre pattedyr-individer som mottar enten profylaktisk eller terapeutisk behandling.
"Oppløselig" eller "dissosiert" Ap angir ikke-aggregerende eller disaggregert Ap-polypeptid. "Uoppløselig" Ap angir aggregerende Ap-polypeptid, for eksempel Ap holdt sammen av ikke-kovalente bindinger. Ap (f.eks. Ap42) er antatt å aggregere, i det minste delvis, på grunn av tilstedeværelse av hydrofobe rester ved C-terminus av peptidet (del av transmembrandomenet av APP). Én metode for å produsere oppløselig Ap er å oppløse lyofilisert peptid i ren DMSO med ultralydbehandling. Den resulterende løsning blir sentrifugert for å fjerne eventuelle uoppløselige partikler.
I. Immunologiske og terapeutiske reagenser
Immunologiske og terapeutiske reagenser omfatter eller består av humaniserte antistoffer eller antigenbindende fragmenter derav, som definert her. Den basiske antistoff strukturelle enhet er kjent å omfatte en tetramer av subenheter. Hver tetramer er sammensatt av to identiske par av polypeptidkjeder, hvor hvert par har én "lett" (ca. 25 kDa) og én "tung" kjede (ca. 50-70 kDa). Den amino-terminale del av hver kjede omfatter en variabel region på ca. 100 til 110 eller fler aminosyrer primært ansvarlige for antigen-gjenkjennelse. Den karboksyterminale del av hver kjede definerer en konstant region primært ansvarlig for effektor-funksjon.
Lette kjeder er klassifisert som enten kappa eller lambda og er ca. 230 rester i lengde. Tunge kjeder er klassifisert som gamma (y), my (n), alfa (a), delta (6) eller epsilon (£), er ca. 450-600 rester i lengde og definerer antistoffets isotype som henholdsvis IgG, IgM, IgA, IgD og IgE. Både tunge og lette kjeder er foldet i domener. Betegnelsen "domene" angir en globulær region av et protein, for eksempel et immunoglobulin eller antistoff. Immunoglobulin- eller antistoff-domener omfatter for eksempel tre eller fire peptid-løkker stabilisert ved p-foldede "sheet" og en interkjede disulfid-binding. Intakte lette kjeder har for eksempel to domener (Vlog Cl) og intakte tunge kjeder har for eksempel fire eller fem domener (Vh, Ch1, Ch2 og Ch3).
I lette og tunge kjeder er de variable og konstante regioner forbundet med en "J" region på ca. 12 eller flere aminosyrer, idet tungkjeden også omfatter en "D" region på ca. 10 ytterligere aminosyrer. (Se generelt Fundamental Immunology (Paul, W., ed., 2. ed. Raven Press, N.Y. (1989), kap. 7).
De variable regioner av hvert lett/tungkjede-par danner antistoff-bindingssetet. Således har et intakt antistoff to bindingsseter. Bortsett fra i bifunksjonelle eller bispesifikke antistoffer, er de to bindingsseter samme. Kjedene viser alle samme generelle struktur av relativt konserverte rammeverk-regioner (FR) bundet av tre hypervariable regioner også betegnet komplementaritetsbestemmende regioner eller CDR. Naturlig forekommende kjeder eller rekombinant produserte kjeder kan uttrykkes med en ledersekvens som blir fjernet under cellulær prosessering for å produsere en moden kjede. Modne kjeder kan også rekombinant produseres som har en ikke-naturlig forekommende ledersekvens, for eksempel for å forbedre sekresjon eller endre prosessering av en spesiell kjede av interesse.
CDR av de to modne kjeder av hvert par blir oppstilt ved rammeverk-regioner, som muliggjør binding til en spesifikk epitop. Fra N-terminal til C-terminal, omfatter både lett- og tung-kjeder domenene FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 og FR4. "FR4" er også referert til på området som D/J-regionen av den variable tungkjede og J-regionen av den variable lettkjede. Tilordning av aminosyrer til hvert domene er i henhold til definisjonene ifølge Kabat, Sequenæs of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1987 og 1991). En alternative strukturell definisjon er foreslått av Chotia et al., J. Mol. Biol. 196:901 (1987); Nature 342:878 (1989); og J. Mol. Biol. 186:651 (1989) (nedenfor kollektivt referert til som "Chotia et al.").
2 . Humaniserte antistoffer
Foreliggende oppfinnelse vedrører humaniserte antistoffer humaniserte immunoglobuliner) spesifikke for beta-amyloidpeptid. Humaniserte antistoffer har samme eller lignende bindingsspesifisitet og affinitet som et mus- eller annet ikke-humant antistoff som gir utgangsmaterialet for konstruksjon av et humanisert antistoff.
A. Produksjon av humaniserte antistoffer
Betegnelsen "humanisert antistoff' angir et antistoff omfattende minst én kjede som omfatter variabel region rammeverk-rester hovedsakelig fra en human antistoff-kjede (referert til som akseptor-immunoglobulin eller -antistoff) og minst én komplementaritetsbestemmende region hovedsakelig fra et mus-antistoff, (referert til som donor-immunoglobulin eller -antistoff). Se, Queen et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 86:10029-10033 (1989), US 5,530,101, US 5,585,089, US 5,693,761, US 5,693,762, Selick et al., WO 90/07861 og Winter, US 5,225,539. Den (de) konstante region(er), hvis til stede, er også hovedsakelig eller fullstendig fra et humant immunoglobulin.
Substitusjon av mus-CDR til et humant variabelt domene-rammeverk er mest sannsynlig å resultere i bibehold av deres korrekte romlige orientering hvis det humane variable domene-rammeverk inntar samme eller lignende konformasjon som det mus-variable rammeverk som CDR stammet fra. Dette blir oppnådd ved å oppnå de humane variable domener fra humane antistoffer hvis rammeverk-sekvenser viser en høy grad av sekvensidentitet med de murine variable rammeverk-domener fra hvilke CDR ble avledet. Tung- og lettkjede variable rammeverk-regioner kan avledes fra samme eller forskjellige humane antistoff-sekvenser. De humane antistoff-sekvenser kan være sekvensene av naturlig forekommende humane antistoffer eller kan være konsensus-sekvenser av mange humane antistoffer. Se Kettleborough et al., Protein Engineering 4:773 (1991); Kolbinger et al., Protein Engineering 6:971
(1993) og Carter et al., WO 92/22653.
Etter å ha identifisert de komplementaritetsbestemmende regioner av det murine donor-immunoglobulin og passende humane akseptor-immunoglobuliner, er neste trinn å bestemme hvilke, hvis noen, rester fra disse komponenter bør substitueres for å optimalisere egenskapene til det resulterende humaniserte antistoff. Generelt bør substitusjon av humane aminosyrerester med murine være minimalisert, fordi innføring av murine rester øker risiko for at antistoffet fremkaller en human-anti-mus-antistoff- (HAMA) respons hos mennesker. Metoder kjent på området for bestemmelse av immunrespons kan utføres for å overvåke en HAMA-respons hos en spesiell pasient eller under kliniske forsøk. Pasienter administrert humaniserte antistoffer kan gis en immunogenisitetsbedømmelse ved begynnelsen og gjennom hele administreringen av nevnte terapi. HAMA-respons blir målt, for eksempel ved detektering av antistoffer til det humaniserte terapeutiske reagens, i serumprøver fra pasienten ved anvendelse av en metode kjent på området, omfattende overflate-plasmon-resonans-teknologi (BIACORE) og/eller fastfase ELISA-analyse.
Visse aminosyrer fra de humane variabel region rammeverk-rester blir valgt for substitusjon basert på deres mulige innvirkning på CDR-konformasjon og/eller binding til antigen. Den unaturlig juxtaposisjon av murine CDR-regioner i human variabel rammeverk-region kan resultere i unaturlige konformasjonelle begrensninger, som, hvis ikke korrigert ved substitusjon av visse aminosyrerester, fører til tap av bindingsaffinitet.
Seleksjon av aminosyrerester for substitusjon blir bestemt til dels ved datamodellering. Computer hardware og software er beskrevet her for å produsere tredimensjonale bilder av immunoglobulin-molekyler. Generelt blir molekylære modeller produsert ved å starte fra kjente strukturer for immunoglobulin-kjeder eller domener derav. Kjedene som skal modelleres blir sammenlignet for aminosyresekvens-similaritet med kjeder eller domener av kjente tredimensjonale strukturer og kjedene eller domenene som viser den største sekvens-similaritet blir valgt som utgangspunkt for konstruksjon av den molekylære modell. Kjeder eller domener som har minst 50% sekvensidentitet blir valgt for modellering og fortrinnsvis blir de som har minst 60%, 70%, 80%, 90% sekvensidentitet eller mer valgt for modellering. De løste utgangs-strukturer blir modifisert for å ta hensyn til forskjeller mellom de aktuelle aminosyrer i immunoglobulinkjeder eller domener som blir modellert og de i utgangs-strukturen. De modifiserte strukturer blir deretter satt sammen til et sammensatt immunoglobulin. Til slutt blir modellen forbedret ved energi-minimalisering og ved verifisering av at alle atomer er innenfor passende avstander fra hverandre og at bindingslengder og -vinkler er innen kjemisk akseptable grenser.
Valg av aminosyrerester for substitusjon kan også til dels bestemmes ved undersøkelse av karakteristikaene av aminosyrene ved spesielle lokasjoner eller empirisk observasjon av virkningene av substitusjon eller mutagenese av spesielle aminosyrer. Når for eksempel en aminosyre avviker mellom en murin variabel region rammeverkrest og en valgt human variabel region rammeverk-rest, bør den humane rammeverk-aminosyre vanligvis substitueres med den ekvivalente rammeverk-aminosyre fra mus-antistoffet når det er rimelig forventet at aminosyren:
(1) ikke-kovalent binder antigen direkte,
(2) er tilstøtende en CDR-region,
(3) på annen måte interagerer med en CDR-region (f.eks. er innen ca. 3-6 Å av en CDR-region som bestemt ved datamodellering) eller
(4) deltar i VL-VH-grenseflaten.
Rester som "ikke-kovalent binder antigen direkte" omfatter aminosyrer i posisjoner i rammeverk-regioner som har god sannsynlighet for direkte å interagere med aminosyrer på antigenet i henhold til etablerte kjemiske krefter, for eksempel ved hydrogen-binding, Van der Waals krefter, hydrofobe interaksjoner og lignende.
CDR- og rammeverk-regioner er som definert av Kabat et al. eller Chotia et al., ovenfor. Når rammeverk-rester, som definert av Kabat et al., ovenfor, utgjør strukturelle løkkerester som definert av Chotia et al., ovenfor, kan aminosyrene til stede i mus-antistoffet velges for substitusjon til det humaniserte antistoff. Rester som er "tilstøtende en CDR-region" omfatter aminosyrerester i posisjoner umiddelbart tilstøtende én eller flere av CDR i den primære sekvens av den humaniserte immunoglobulin-kjede, for eksempel i posisjoner umiddelbart tilstøtende en CDR som definert av Kabat eller en CDR som definert av Chotia (Se f.eks. Chotia og Lesk JMB 196:901 (1987)). Disse aminosyrer er spesielt sannsynlige å interagere med aminosyrene i CDR og, hvis valgt fra akseptaren, å deformere donor-CDR og redusere affinitet. Videre kan tilstøtende aminosyrer interagere direkte med antigenet (Amit et al., Science, 233:747 (1986)) og valg av disse aminosyrer fra donoren kan være ønskelig for å beholde alle antigen-kontakter som gir affinitet i det opprinnelige antistoff.
Rester som "på annen måte interagerer med en CDR-region" omfatter de som blir funnet ved sekundær strukturell analyse å være i en romlig orientering tilstrekkelig til å påvirke en CDR-region. I én utførelsesform er rester som "på annen måte interagerer med en CDR-region" identifisert ved å analysere en tredimensjonal modell av donor-immunoglobulinet (f.eks. en data-utformet modell). En tredimensjonal modell, typisk for det opprinnelige donor-antistoff, viser at visse aminosyrer utenfor CDR er nær CDR og har god sannsynlighet for å interagere med aminosyrer i CDR ved hydrogen-binding, Van der Waals krefter, hydrofobe interaksjoner, etc. Ved de aminosyre-posisjoner kan donor-immunoglobulin-aminosyren heller enn akseptor-immunoglobulin-aminosyren velges. Aminosyrer i henhold til dette kriterium vil generelt ha et sidekjede-atom innen ca. 3 Ångstrøm-enheter (Å) av noe atom i CDR og må inneholde et atom som kan interagere med CDR-atomer i henhold til etablerte kjemiske krefter, så som de listet opp ovenfor.
I tilfellet av atomer som kan danne en hydrogen-binding, blir 3 Å målt mellom deres kjerner, men for atomer som ikke danner en binding, blir 3 Å målt mellom deres Van der Waals overflater. Således må, i det sistnevnte tilfelle, kjernene være innenfor ca. 6 Å (3 Å pluss summen av Van der Waals radier) for atomene som skal betraktes å være i stand til interaksjon. I mange tilfeller vil kjernene være fra 4 eller 5 til 6 Å fra hverandre. For bestemmelse av hvorvidt en aminosyre kan interagere med CDR, er det foretrukket ikke å betrakte de siste 8 aminosyrer av tungkjede CDR 2 som del av CDR, fordi fra et strukturelt synspunkt, vil disse 8 aminosyrer oppføre seg mer som del av rammeverket.
Aminosyrer som kan interagere med aminosyrer i CDR kan identifiseres på enda en annen måte. Løsningsmiddeltilgjengelig overflateareal på hver rammeverk-aminosyre blir beregnet på to måter: (1) i det intakte antistoff og (2) i et hypotetisk molekyl bestående av antistoffet med dets CDR fjernet. En betydelig forskjell mellom disse tall på ca. 10 kvadrat Ångstrøm eller mer viser at tilgang av rammeverk-aminosyre til løsningsmiddel er minst delvis blokkert av CDR og derfor at aminosyren får kontakt med CDR. Løsningsmiddel-tilgjengelig overflateareale på en aminosyre kan beregnes basert på en tredimensjonal modell av et antistoff, ved anvendelse av algoritmer kjent på området (f.eks. Connolly, J. Appl. Cryst. 16:548 (1983) og Lee og Richards, J. Mol. Biol. 55:379
(1971)). Rammeverk-aminosyrer kan også av og til interagere med CDR indirekte, ved å påvirke konformasjonen av en annen rammeverk-aminosyre som så kontakter CDR.
Aminosyrene i mange posisjoner i rammeverket er kjent å være i stand til å interagere med CDR i mange antistoffer (Chotia og Lesk, ovenfor, Chotia et al., ovenfor og Tramontano et al., J. Mol. Biol. 215:175 (1990)). Spesielt er aminosyrene i posisjoner 2, 48, 64 og 71 av lettkjeden og 26-30, 71 og 94 av tungkjeden (nummerering i henhold til Kabat) kjent å være i stand til å interagere med CDR i mange antistoffer. Aminosyrene i posisjoner 35 i lettkjeden og 93 og 103 i tungkjeden er også sannsynlige å interagere med CDR. I alle disse nummererte posisjoner, er valg av donor-aminosyre fremfor akseptor-aminosyre (når de avviker) for å være i det humaniserte immunoglobulin foretrukket. På den annen side kan visse rester som er i stand til å interagere med CDR-regionen, så som de første 5 aminosyrer av lettkjeden, noen ganger være valgt fra akseptor-immunoglobulin uten tap av affinitet i det humaniserte immunoglobulin.
Rester som "deltar i VL-VH-grenseflate" eller "pakkende rester" omfatter de rester ved grenseflaten mellom VL og VH som definert, for eksempel av Novotny og Haber, Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 82:4592-66 (1985) eller Chotia et al, ovenfor. Generelt bør uvanlige pakkende rester beholdes i det humaniserte antistoff hvis de skiller seg fra de i de humane rammeverk.
Generelt blir én eller flere av aminosyrene som oppfyller kriteriene ovenfor substituert. I noen utførelsesformer blir alle eller mesteparten av aminosyrene som oppfyller kriteriene ovenfor substituert. Av og til er det noe usikkerhet om hvorvidt en spesiell aminosyre møter kriteriene ovenfor og alternative variant-immunoglobuliner blir produsert, hvorav én har den spesielle substitusjon, og den andre ikke. Alternative variant-immunoglobuliner således produsert kan testes i hvilket som helst av forsøkene beskrevet her for den ønskede aktivitet og det foretrukne immunoglobulin velges.
Vanligvis er CDR-regioner i humaniserte antistoffer hovedsakelig identiske og mer vanlig, identiske med de tilsvarende CDR-regioner av donor-antistoffet. Selv om det ikke vanligvis er ønskelig, er det noen ganger mulig å gjøre én eller flere konservative aminosyre-substitusjoner i CDR-rester uten merkbart å påvirke bindingsaffiniteten av det resulterende humaniserte immunoglobulin. Med konservative substitusjoner er ment kombinasjoner så som gly, ala; val, ile, leu; asp, glu; asn, gin; ser, thr; lys, arg; og phe, tyr.
Ytterligere kandidater for substitusjon er akseptor humane rammeverk-aminosyrer som er uvanlige eller "sjeldne" for et humant immunoglobulin i den posisjon. Disse aminosyrer kan erstattes med aminosyrer fra den ekvivalente posisjon av musedonor antistoff eller fra de ekvivalente posisjoner av mer typiske humane immunoglobuliner. For eksempel kan substitusjon være ønskelig når aminosyren i en human rammeverk-region av akseptor-immunoglobulin er sjelden for den posisjon og den tilsvarende aminosyre i donor-immunoglobulinet er vanlig i den posisjon i humane immunoglobulin-sekvenser; eller når aminosyren i akseptor-immunoglobulinet er sjelden for den posisjon og den tilsvarende aminosyre i donor-immunoglobulinet også er sjelden, i forhold til andre humane sekvenser. Disse kriterier hjelper til å sikre at en atypisk aminosyre i det humane rammeverk ikke ødelegger antistoffstrukturen. Videre, ved å erstatte en uvanlig human akseptor-aminosyre med en aminosyre fra donor-antistoffet som er typisk for humane antistoffer, kan det humaniserte antistoff gjøres mindre immunogent.
Betegnelsen "sjelden", som anvendt her, indikerer en aminosyre som forekommer i den posisjon i mindre enn ca. 20%, men vanligvis mindre enn ca. 10% av sekvenser i en representativ prøve av sekvenser og betegnelsen "vanlig", som anvendt her, indikerer en aminosyre som forekommer i mer enn ca. 25%, men vanligvis mer enn ca. 50% av sekvenser i en representativ prøve. For eksempel er alle humane lett- og tungkjede variable region-sekvenser gruppert i "subgrupper" av sekvenser som er spesielt homologe med hverandre og har samme aminosyrer i visse kritiske posisjoner (Kabat et al., ovenfor). Ved bestemmelse av hvorvidt en aminosyre i en human akseptor-sekvens er "sjelden" eller "vanlig" blant humane sekvenser, vil det ofte være foretrukket å betrakte bare de humane sekvenser i samme subgruppe som akseptor-sekvensen.
Ytterligere kandidater for substitusjon er akseptor humane rammeverk-aminosyrer som ville identifiseres som del av en CDR-region under den alternative definisjon foreslått av Chotia et al.,ovenfor. Ytterligere kandidater for substitusjon er akseptor humane rammeverk-aminosyrer som ville identifiseres som del av en CDR-region under AbM og/eller kontakt-definisjoner. Spesielt er CDR1 i den variable tungkjede definert å omfatte rester 26-32.
Ytterligere kandidater for substitusjon er akseptor-rammeverk-rester som svarer til en sjelden eller uvanlig donor-rammeverk-rest. Sjeldne eller uvanlige donor-rammeverk-rester er de som er sjeldne eller uvanlige (som definert her) for murine antistoffer i den posisjon. For murine antistoffer kan subgruppen bestemmes i henhold til Kabat og rest-posisjoner identifiseres som skiller seg fra konsensus. Disse donor-spesifikke forskjeller kan indikere somatiske mutasjoner i den murine sekvens som forbedrer aktivitet. Uvanlige rester som er forutsagt å påvirke binding blir beholdt, mens rester forutsagt å være uvesentlige for binding kan substitueres.
Ytterligere kandidater for substitusjon er ikke-kimlinje-rester som forekommer i en akseptor-rammeverk-region. Når for eksempel en akseptor-antistoffkjede (dvs. en human antistoffkjede som har betydelig sekvensidentitet med donor-antistoffkjeden) blir oppstilt med en kimlinje antistoffkjede (som likeledes har betydelig sekvensidentitet med donorkjeden), kan rester som ikke samsvarer mellom akseptor-kjederammeverk og kimlinje-kjede-rammeverk substitueres med tilsvarende rester fra kimlinje-sekvensen.
Bortsett fra de spesifikke aminosyre-substitusjoner beskrevet ovenfor, er rammeverk-regioner av humaniserte immunoglobuliner vanligvis hovedsakelig identiske og mer vanlig, identiske med rammeverk-regioner i de humane antistoffer fra hvilke de ble avledet. Selvfølgelig gir mange av aminosyrene i rammeverk-regionen lite eller intet direkte bidrag til spesifisiteten eller affiniteten av et antistoff. Således kan mange individuelle konservative substitusjoner av rammeverk-rester tolereres uten merkbar forandring av spesifisiteten eller affiniteten av det resulterende humaniserte immunoglobulin. Således, i én utførelsesform har den variable rammeverk-region av det humaniserte immunoglobulin minst 85% sekvensidentitet med en human variabel rammeverk-region-sekvens eller konsensus av slike sekvenser. I en annen utførelsesform har den variable rammeverk-region av det humaniserte immunoglobulin minst 90%, fortrinnsvis 95%, mer foretrukket 96%, 97%, 98% eller 99% sekvensidentitet med en human variabel rammeverk-region-sekvens eller konsensus av slike sekvenser. Generelt er imidlertid slike substitusjoner uønskede.
De humaniserte antistoffer oppviser fortrinnsvis en spesifikk bindingsaffinitet for antigen på minst IO<7>, 10<8>, 10<9>eller IO<10>M_<1>. Vanligvis er den øvre grensen for bindingsaffinitet av de humaniserte antistoffer for antigen innen en faktor på tre, fire eller fem av den til donor-immunoglobulinet. Ofte er den lavere grense for bindingsaffinitet også innen en faktor på tre, fire eller fem av den til donor-immunoglobulinet. Alternativt kan bindingsaffiniteten sammenlignes med den til et humanisert antistoff som ikke har noen substitusjoner (f.eks. et antistoff som har donor-CDR og akseptor-FR, men ingen FR-substitusjoner). I slike tilfeller er bindingen av det optimaliserte antistoff (med substitusjoner) fortrinnsvis minst to til tre ganger større eller tre til fire ganger større, enn den til det usubstituerte antistoff. For å gjøre sammenligninger, kan aktiviteten til de forskjellige antistoffer bestemmes, for eksempel ved BIACORE (dvs. overflate plasmon-resonans ved anvendelse av umerkede reagenser) eller kompetitive bindingsforsøk.
B. Produksjon av humaniserte 3D6- antistoffer
Oppfinnelsen omfatter et humanisert antistoff til N-terminusen av Ap for anvendelse ved de terapeutiske og/eller diagnostiske metoder beskrevet her. Utgangsmaterialet for produksjon av humaniserte antistoffer er 3D6. 3D6 er spesifikk for N-terminusen av Ap og er vist å mediere fagocytose (f.eks. fremkalle fagocytose) av amyloid plaque (se Eksempler I-V). Kloning og sekvensering av cDNA som koder for 3D6-antistoff tung- og lettkjede variable regioner er beskrevet i Eksempel VI.
Egnede humane akseptor-antistoff-sekvenser blir identifisert ved datamaskin-sammenligninger av aminosyresekvensene av mus variable regioner med sekvensene av kjente humane antistoffer. Sammenligningen blir utført separat for tung- og lett-kjeder, men prinsippene er lignende for begge. Spesielt ble variable domener fra humane antistoffer hvis rammeverk-sekvenser viser en høy grad av sekvensidentitet med de murine VL- og VH-rammeverk-regioner identifisert ved spørring i Kabat Database ved anvendelse av NCBI BLAST (offentlig tilgjengelig gjennom the National Institutes of Health NCBI internet-server) med de respektive murine rammeverk-sekvenser. I én utførelsesform blir akseptor-sekvenser som har mer enn 50% sekvensidentitet med murine donor-sekvenser valgt. Fortrinnsvis blir akseptor-antistoff-sekvenser som har 60%, 70%, 80%, 90% eller mer valgt.
En datamaskin-sammenligning av 3D6 viste at 3D6-lettkjede viser den største sekvensidentitet med humane lettkjeder av undertypen kappa II og at 3D6-tungkjede viser størst sekvensidentitet med humane tung-kjeder av undertype III, som definert av Kabat et al., ovenfor. Således blir lette og tunge humane rammeverk-regioner fortrinnsvis utledet fra humane antistoffer av disse undertyper eller fra konsensus-sekvenser av slike undertyper. De foretrukne lettkjede humane variable regioner som viser størst sekvensidentitet med den tilsvarende region fra 3D6 er fra antistoffer som har Kabat ID-nummer 019230, 005131, 005058, 005057, 005059, U21040 og U41645, idet 019230 er mer foretrukket. De foretrukne tungkjede humane variable regioner som viser størst sekvensidentitet med den tilsvarende region fra 3D6 er fra antistoffer som har Kabat ID nummer 045919, 000459, 000553, 000386 og M23691, idet 045919 er mer foretrukket.
Rester blir deretter valgt for substitusjon, som følger. Når en aminosyre avviker mellom en 3D6 variabel rammeverk-region og en ekvivalent human variabel rammeverk-region, bør den humane rammeverk-aminosyre vanligvis substitueres med den ekvivalente mus-aminosyre hvis det er rimelig forventet at aminosyren:
(1) ikke-kovalent binder antigen direkte,
(2) er tilstøtende en CDR-region, er del av en CDR-region under den alternative definisjon foreslått av Chotia et al., ovenfor eller på annen måte interagerer med en CDR-region (f.eks. er innen ca. 3Å av en CDR-region) (f.eks. aminosyrer i posisjoner L2, H49 og H94 av 3D6) eller (3) deltar i VL-VH-grenseflate (f.eks. aminosyrer i posisjoner L36, L46 og H93 av 3D6).
Datamodellering av 3D6-antistoff tung- og lettkjede variable regioner og humanisering av 3D6-antistoff er beskrevet i Eksempel VII. Kort angitt ble en tredimensjonal modell dannet basert på de nærmeste løste murine antistoff-strukturer for tung- og lett-kjeder. For dette formål ble et antistoff betegnet 1CR9 (Protein Data Bank (PDB) ID: 1CR9, Kanyo et al., J. Mol. Biol. 293:855
(1999)) valgt som templat for modellering av 3D6-lettkjede og et antistoff betegnet 10PG (PDB ID: 10PG, Kodandapani et al., J. Biol. Chem. 270:2268
(1995)) ble valgt som templat for modellering av tungkjeden. Modellen ble videre forbedret ved en serie av energi-minimaliseringstrinn for å befri ufordelaktige atom-kontakter og optimalisere elektrostatiske og van der Waals interaksjoner. Den løste struktur av 1qkz (PDB ID: 1QKZ, Derrick et al., J. Mol. Biol. 293:81 (1999)) ble valgt som templat for modellering av CDR3 av tungkjeden ettersom 3D6 og 10PG ikke viser betydelig sekvenshomologi i denne region når oppstilt for sammenligningsformål.
Tredimensjonal strukturell informasjon for antistoffene beskrevet her er offentlig tilgjengelig, for eksempel fra Research Collaboratory for Structural Bioinformatics' Protein Data Bank (PDB). PDB er fritt tilgjengelig via World Wde Web internet og er beskrevet av Berman et al. (2000) Nukleic Acids Research, 28:235. Datamodellering tillater identifikasjon av CDR-interagerende rester. Datamodellen med strukturen til 3D6 kan på sin side tjene som et utgangspunkt for å forutsi den tredimensjonale struktur av et antistoff inneholdende de 3D6 komplementaritetsbestemmende regioner substituert i humane rammeverk-strukturer. Ytterligere modeller kan konstrueres som representerer strukturen ettersom ytterligere aminosyre-substitusjoner blir innført.
Generelt er substitusjon av én, de fleste eller alle aminosyrene som oppfyller kriteriene ovenfor ønskelig. Følgelig vil de humaniserte antistoffer ifølge foreliggende oppfinnelse inneholde en substitusjon av en human lettkjede rammeverk-rest med en tilsvarende 3D6-rest i posisjoner: L2, L36 og L46. De humaniserte antistoffer inneholder også en substitusjon av en human tungkjede rammeverk-rest med en tilsvarende 3D6-rest i de følgende posisjoner: H49, H93 og H94. Humaniserte antistoffer kan også inneholde en substitusjon av en tungkjede rammeverk-rest med en tilsvarende kimlinje-rest i de følgende posisjoner: H74, H77 og H89.
Noen ganger er det imidlertid noe tvetydighet når det gjelder hvorvidt en spesiell aminosyre møter kriteriene ovenfor og alternative variant-immunoglobuliner blir produsert, hvorav én har den spesielle substitusjon, og den andre ikke. I tilfeller hvor substitusjon med en murin rest ville innføre en rest som er sjelden i humane immunoglobuliner i en spesiell posisjon, kan det være ønskelig å teste antistoffet for aktivitet med eller uten den spesielle substitusjon. Hvis aktivitet (f.eks. bindingsaffinitet og/eller bindingsspesifisitet) er omtrent den samme med eller uten substitusjonen, kan antistoffet uten substitusjon være foretrukket, ettersom det ville være forventet å fremkalle mindre av en HAHA-respons, som beskrevet her.
Andre kandidater for substitusjon er akseptor humane rammeverk-aminosyrer som er uvanlige for et humant immunoglobulin i den posisjon. Disse aminosyrer kan være substituert med aminosyrer fra den ekvivalente posisjon av mer typiske humane immunoglobuliner. Alternativt kan aminosyrer fra ekvivalente posisjoner i mus 3D6 innføres i de humane rammeverk-regioner når slike aminosyrer er typiske for humant immunoglobulin i de ekvivalente posisjoner.
Eksempler på passende aminosyrer for substitusjon er vist i Figurer 1 og 2.
Andre kandidater for substitusjon er ikke-kimlinje-rester som forekommer
i en rammeverk-region. En datamaskin-sammenligning av 3D6 med kjente kimlinje-sekvenser viste at tungkjeder som viser den største grad av sekvensidentitet omfatter kimlinje variabel region-sekvenser VH3-48, VH3-23, VH3-7, VH3-21 og VH3-11, idet VH3-23 er mer foretrukket. Oppstilling av Kabat ID 045919 med VH3-23 avslører at rester H74, H77 og/eller H89 kan velges for substitusjon med tilsvarende kimlinje-rester (f.eks. rester H74, H77 og/eller H89 ved sammenligning av Kabat ID 045919 og VH3-23). Likeledes omfatter kimlinje-sekvenser som har den største grad av identitet med 3D6-lettkjeden A1, A17, A18, A2 og A19, idet A19 er mest foretrukket. Rester som ikke samsvarer
mellom et valgt lettkjede akseptor-rammeverk og én av disse kimlinje-sekvenser kan velges for substitusjon med den tilsvarende kimlinje-rest.
Tabell 1 oppsummerer sekvensanalyse av 3D6 VH- og VL-regioner. Ytterligere mus- og humane strukturer som kan anvendes for datamodellering av 3D6-antistoff og ytterligere humane antistoffer er angitt så vel som kimlinje-sekvenser som kan anvendes for seleksjon av aminosyre-substitusjoner. Sjeldne muse-rester er også angitt i Tabell 1. Sjeldne muserester blir identifisert ved å sammenligne donor VL- og/eller VH-sekvenser med sekvensene til andre medlemmer av subgruppen til hvilken donor VL- og/eller VH-sekvenser tilhører (i henhold til Kabat) og identifisere rest-posisjoner som skiller seg fra konsensus. Disse donor-spesifikke forskjeller kan indikere somatiske mutasjoner som forbedrer aktivitet. Uvanlige eller sjeldne rester nær bindingssetet kan muligens kontakte antigenet, hvilket gjør det ønskelig å beholde museresten. Hvis imidlertid den uvanlige muse-rest ikke er viktig for binding, er anvendelse av den tilsvarende akseptor-rest foretrukket, ettersom muse-resten kan skape immunogene neoepitoper i det humaniserte antistoff. I situasjonen hvor en uvanlig rest i donor-sekvensen faktisk er vanlige rester i den tilsvarende akseptor sekvens, er den foretrukne rest klart akseptor-resten.
Kabat ID-sekvenser referert her er offentlig tilgjengelige, for eksempel fra Northwestern University Biomedical Engineering Departmenfs Kabat Database of Sequences of Proteins of Immunological Interest. Tredimensjonal strukturell informasjon for antistoffer beskrevet her er offentlig tilgjengelig, for eksempel fra Research Collaboratory for Structural Bioinformatics' Protein Data Bank (PDB). PDB er fritt tilgjengelig via World Wide Web internet og er beskrevet av Berman et al. (2000) Nucleic Acids Research, s.235-242. Kimlinje-gensekvenser referert her er offentlig tilgjengelige, for eksempel fra the National Center for Biotechnology Information (NCBI) database av sekvenser i samlinger av Igh, lg kappa og lg lambda kimlinje V-gener (som en divisjon av the National Library of Medicine (NLM) at the National Institutes of Health (NIH)). Homologi-søk av NCBI "lg Germline Genes" database er utført med IgG BLAST™.
Det humaniserte antistoffet ifølge foreliggende oppfinnelse (i) en lettkjede omfattende et variabelt domene omfattende murin 3D6 VL CDR og et humant akseptor-rammeverk, hvor rammeverket har rester L2, L36 og L46 substituert med den tilsvarende 3D6 rest og (ii) en tungkjede omfattende 3D6 VH CDR og et humant akseptor-rammeverk, hvor rammeverket har rester H49, H93 og H94 substituert med den tilsvarende 3D6 rest og H74, H77 og H89 er substituert med en tilsvarende human kimlinje-rest.
Det humaniserte antistoffet ifølge foreliggende oppfinnelse (i) en lettkjede omfattende et variabelt domene omfattende murin 3D6 VL CDR og et humant akseptor-rammeverk, hvor rammeverket som har rest 2 substituert med val (V), rest 36 substituert med leu (L) og rest 46 substituert med arg (R) og (ii) en tungkjede omfattende 3D6 VH CDR og et humant akseptor-rammeverk, hvor rammeverket har rest 49 substituert med ala (A), rest 93 substituert med val (V) og rest 94 substituert med arg (R) og har rest 74 substituert med ser (S), rest 77 substituert med thr (T) og/eller rest 89 substituert med val (V).
I en spesielt foretrukket utførelsesform har et humanisert antistoff ifølge foreliggende oppfinnelse strukturelle trekk, som beskrevet her og har minst én (fortrinnsvis to, tre, fire eller alle) av de følgende aktiviteter: (1) binder aggregert A01-42 (f.eks. som bestemt ved ELISA); (2) binder Ap i plaque (f.eks. merking av AD og/eller PDAPP plaque); (3) binder Ap med to til tre ganger høyere bindingsaffinitet sammenlignet med kimær 3D6 (f.eks. 3D6 som har murin CDR og human akseptor FR); (4) medierer fagocytose av Ap (f.eks. i et ex vivo fagocytose-forsøk, som beskrevet her); og (5) krysser blod-hjerne-barrieren (f.eks. demonstrerer korttids hjerne-lokalisering, for eksempel i en PDAPP dyremodell, som beskrevet her).
I en annen utførelsesform har et humanisert antistoff ifølge foreliggende oppfinnelse strukturelle trekk som beskrevet her, binder Ap på en måte eller med en affinitet tilstrekkelig til å fremkalle minst én av de følgende in vivo effekter: (1) redusere Ap plaque-byrde; (2) forhindre plaque-dannelse; (3) redusere nivåer av oppløselig Ap; (4) redusere neurittisk patologi forbundet med en amyloidogen lidelse; (5) minske eller forbedre minst ett fysiologisk symptom forbundet med en amyloidogen lidelse; og/eller (6) forbedre kognitiv funksjon.
I en annen utførelsesform har et humanisert antistoff ifølge foreliggende oppfinnelse strukturelle trekk som beskrevet her og spesifikt binder til en epitop omfattende rester 1-5 eller 3-7 av Ap.
3 . Produksjon av variable regioner
Etter konseptuelt å ha valgt CDR og rammeverk-komponenter av humaniserte immunoglobuliner, er en rekke metoder tilgjengelig for å produsere slike immunoglobuliner. På grunn av degenereringen av koden, vil en rekke nukleinsyresekvenser kode for hver immunoglobulin-aminosyresekvens. De ønskede nukleinsyresekvenser kan produseres ved de novo fastfase DNA-syntese eller ved PCR-mutagenese av en tidligere fremstilt variant av det ønskede polynukleotid. Oligonukleotid-mediert mutagenese er en foretrukket metode for fremstilling av substitusjons-, delesjons- og insersjons-varianter av mål-polypeptid DNA. Se Adelman et al., DNA 2:183 (1983). Kort angitt blir mål-polypeptid DNA endret ved hybridisering av et oligonukleotid som koder for den ønskede mutasjon til en enkeltrådet DNA-templat. Etter hybridisering blir en DNA-polymerase anvendt for å syntetisere en hel andre komplementær tråd av templaten som innfører oligonukleotid-primer og koder for den valgte endring i mål-polypeptid DNA.
4 . Seleksjon av konstante regioner
De variable segmenter av antistoffer produsert som beskrevet ovenfor (tung- og lettkjede variable regionene av humaniserte antistoffer) blir typisk bundet til minst en del av en immunoglobulin konstant region (Fc), typisk den til et humant immunoglobulin. Human konstant region DNA-sekvenser kan isoleres i henhold til velkjente prosedyrer fra en rekke humane celler, men fortrinnsvis immortaliserte B-celler (se Kabat et al., ovenfor og Liu et al., W087/02671). Vanligvis vil antistoffet inneholde både lettkjede og tungkjede konstante regioner. Tungkjede konstant region omfatter vanligvis CH1-, hengsel-, CH2-, CH3- og CH4-regioner. Antistoffene beskrevet her omfatter antistoffer som har alle typer av konstante regioner, omfattende IgM, IgG, IgD, IgA og IgE og hvilken som helst isotype, omfattende IgGI, lgG2, lgG3 og lgG4. Valget av konstant region avhenger til dels av hvorvidt antistoff-avhengig komplement og/eller cellulær mediert toksisitet er ønsket. For eksempel har isotoper lgG1 og lgG3 komplement-aktivitet og isotyper lgG2 og lgG4 ikke. Når det er ønsket at antistoffet (f.eks. humanisert antistoff) oppviser cytotoksisk aktivitet, er det konstante domene vanligvis et komplement fikserende konstant domene og klassen er typisk IgGI Når slik cytotoksisk aktivitet ikke er ønskelig, kan det konstante domenet være av lgG2-klassen. Valg av isotype kan også påvirke passasje av antistoff inn i hjernen. Human isotype IgGI er foretrukket. Lettkjede konstante regioner kan være lambda eller kappa. Det humaniserte antistoff kan omfatte sekvenser fra mer enn én klasse eller isotype. Antistoffer kan uttrykkes som tetramerer inneholdende to lette og to tunge kjeder, som separate tung-kjeder, lett-kjeder, som Fab, Fab' F(ab')2 og Fv eller som enkelkjede antistoffer hvor tung- og lettkjede variable domener er bundet gjennom en spacer.
5 . Ekspresjon av rekombinante antistoffer
Humaniserte antistoffer blir typisk produsert ved rekombinant ekspresjon. Nukleinsyrer som koder for humaniserte lett- og tungkjede variable regioner, eventuelt bundet til konstante regioner, blir innsatt i ekspresjonsvektorer. De lette og tunge kjeder kan klones i samme eller forskjellige ekspresjonsvektorer. DNA-segmentene som koder for immunoglobulin-kjeder er operabelt bundet til kontrollsekvenser i ekspresjonsvektoren(e) som sikrer ekspresjonen av immunoglobulin-polypeptider. Ekspresjonskontroll-sekvenser omfatter, men er ikke begrenset til, promotere (f.eks. naturlig assosierte eller heterologe promotere), signalsekvenser, enhancer-elementer og transkripsjons-termineringssekvenser. Fortrinnsvis er ekspresjons-kontrollsekvenser eukariote promoter-systemer i vektorer som er i stand til å transformere eller transfektere eukariote vertsceller. Når vektoren er innført i den passende vert, blir verten holdt under betingelser egnet for høynivå ekspresjon av nukleotidsekvensene og oppsamling og rensning av de kryssreagerende antistoffer.
Disse ekspresjonsvektorer er typisk replikerbare i vertsorganismene enten som episomer eller som en integral del av vertskromosomal DNA. Vanligvis inneholder ekspresjonsvektorer seleksjonsmarkører (f.eks. ampicillin-resistens, hygromycin-resistens, tetracyklin-resistens eller neomycin-resistens) for å tillate deteksjon av celler transformert med de ønskede DNA-sekvenser (se f.eks. Itakura et al., US-patent 4,704,362).
E. coli er én prokaryot vert spesielt anvendelig for kloning av polynukleotidene (f.eks. DNA-sekvenser) ifølge foreliggende oppfinnelse. Andre mikrobielle verter egnet for anvendelse omfatter basiller, så som Bacillus subtilus og andre enterobacteriaceae, så som Salmonella, Serratia og forskjellige Pseudomonas arter. I disse prokaryote verter kan man også lage ekspresjonsvektorer, som typisk vil inneholde ekspresjonskontroll-sekvenser kompatible med vertscellen (f.eks. et replikasjonsorigo). I tillegg vil hvilket som helst antall av en rekke velkjente promotere være til stede, så som laktose-promoter-system, et tryptofan- (trp) promoter-system, et beta-laktamase-promoter-system eller et promoter-system fra fag lambda. Promoterene vil typisk kontrollere ekspresjon, eventuelt med en operator-sekvens og har ribosom-bindingssete-sekvenser og lignende, for initiering og fullføring av transkripsjon og translasjon.
Andre mikrober, så som gjær, er også anvendelige for ekspresjon. Saccharomyces er en foretrukket gjærvert, med egnede vektorer som har ekspresjonskontroll-sekvenser (f.eks. promotere), replikasjonsorigo, terminerings-sekvenser og lignende som ønsket. Typiske promotere omfatter 3-fosfoglycerat-kinase og andre glykolytiske enzymer. Induserbare gjær- promotere omfatter, blant andre, promotere fra alkohol-dehydrogenase, isocytochrome C og enzymer ansvarlig for maltose- og galaktose-anvendelse.
I tillegg til mikroorganismer kan pattedyrvev-cellekultur også anvendes for å uttrykke og produsere polypeptidene ifølge foreliggende oppfinnelse (f.eks. polynukleotider som koder for immunoglobuliner eller fragmenter derav). Se Winnacker, From Genes to Clones, VCH Publishers, N.Y., N.Y. (1987). Eukariote celler er faktisk foretrukket, fordi flere egnede vertscellelinjer som er i stand til å utskille heterologe proteiner (f.eks. intakte immunoglobuliner) er utviklet på området og omfatter CHO-cellelinjer, forskjellige Cos-cellelinjer, HeLa-celler, fortrinnsvis myelom-cellelinjer eller transformerte B-celler eller hybridomer. Fortrinnsvis er cellene er ikke-humane. Ekspresjonsvektorer for disse celler kan omfatte ekspresjonskontroll-sekvenser, så som et replikasjonsorigo, en promoter og en enhancer (Queen et al., Immunol. Rev. 89:49 (1986)) og nødvendige prosesserings-informasjonsseter, så som ribosom-bindingsseter, RNA spleiseseter, polyadenyleringsseter og transkripsjonene terminator-sekvenser. Foretrukne ekspresjonskontroll-sekvenser er promotere avledet fra immunoglobulin-gener, SV40, adenovirus, bovine papilloma-virus, cytomegalovirus og lignende. Se Co et al., J. Immunol. 148:1149 (1992).
Alternativt kan antistoff-kodende sekvensener innføres i transgener for innføring i genomet til et transgent dyr og påfølgende ekspresjon i melken til det transgene dyr (se f.eks. Deboer et al., US 5,741,957, Rosen, US 5,304,489 og Meade et al., US 5,849,992). Egnede transgener omfatter kodende sekvensener for lett- og/eller tung-kjeder i operabel binding med en promoter og enhancer fra et brystkjertel-spesifikt gen, så som kasein eller beta-laktoglobulin.
Vektorene inneholdende polynukleotidsekvensene av interesse (f.eks. tung- og lettkjede som koder for sekvenser og ekspresjonskontroll-sekvenser) kan overføres til vertscellen ved velkjente metoder, som varierer avhengig av typen cellulær vert. For eksempel er kalsiumklorid-transfeksjon vanlig anvendt for prokaryote celler, mens kalsiumfosfat-behandling, elektroporering, lipofeksjon, biolistisk eller viral-basert transfeksjon kan anvendes for andre cellulære verter. (Se generelt Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Press, 2. ed., 1989). Andre metoder anvendt for å transformere pattedyrceller omfatter anvendelse av polybren, protoplast-fusjon, liposomer, elektroporering og mikroinjeksjon (se generelt, Sambrook et al., ovenfor). For produksjon av transgene dyr, kan transgener mikroinjiseres i befruktede oocytter eller kan innføres i genomet til embryoniske stamceller og kjerner av slike celler overføres til oocytter hvor kjernen er fjernet.
Når tung- og lett-kjeder er klonet på separate ekspresjonsvektorer, blir vektorene co-transfektert for å oppnå ekspresjon og sammensetning av intakte immunoglobuliner. Når de er uttrykt kan hele antistoffer, deres dimerer, individuelle lett- og tung-kjeder eller andre immunoglobulin-former ifølge foreliggende oppfinnelse, renses i henhold til standard prosedyrer på området, omfattende ammoniumsulfat-utfelling, affinitets-kolonner, kolonnekromatografi, HPLC-rensning, gelelektroforese og lignende (se generelt Scopes, Protein Purification (Springer-Verlag, N.Y., (1982)). Hovedsakelig rene immunoglobuliner med minst ca. 90 til 95% homogenitet er foretrukket og 98 til 99% eller mer homogenitet er mest foretrukket for farmasøytiske anvendelser.
6 . Antistoffragmenter
Også omfattet innenfor omfanget av foreliggende oppfinnelse er antistoffragmenter. Fragmenter av humaniserte antistoffer er tilveiebragt. Typisk viser disse fragmenter spesifikk binding til antigen med en affinitet på minst 107 og mer typisk 108 eller 109M_1. Humaniserte antistoffragmenter omfatter separate tung-kjeder, lett-kjeder Fab, Fab' F(ab')2, Fabc og Fv. Fragmenter blir produsert ved rekombinante DNA-teknikker eller ved enzymatisk eller kjemisk separering av intakte immunoglobuliner.
7 . Testing av antistoffer for terapeutisk effektivitet i dyremodeller
Grupper av 7-9 måneder gamle PDAPP-mus blir hver injisert med 0,5 mg i PBS av polyklonale anti-Ap eller spesifikke anti-Ap monoklonale antistoffer. Alle antistoff-preparater blir renset for å ha lave endotoksin-nivåer. Monoklonaler kan fremstilles mot et fragment ved injeksjon av fragmentet eller lenger form av Ap i en mus, preparering av hybridomer og screening av hybridomene for et antistoff som spesifikt binder til et ønsket fragment av Ap uten å binde til andre ikke-overlappende fragmenter av Ap.
Mus blir injisert intraperitonealt etter behov over en 4 måneders periode for å opprettholde sirkulasjons-antistoffkonsentrasjon målt ved ELISA titer på over 1/1000 definert ved ELISA til A042 eller annet immunogen. Titere blir overvåket og musene blir avlivet etter 6 måneder med injeksjoner. Histokjemi, Ap-nivåer og toksikologi blir utført post mortem. Ti mus blir anvendt pr. gruppe.
8 . Screening av antistoffer for utskillingsaktivitet
For å screene for aktivitet mot en amyloid avleiring, blir en vevprøve fra hjernen til en pasient med Alzheimers sykdom eller en dyremodell som har karakteristisk Alzheimers patologi, bragt i kontakt med fagocyttiske celler som bærer en Fc-reseptor, så som mikrogliale celler og antistoffet under test i et medium in vitro. De fagocyttiske celler kan være en primær kultur eller en cellelinje, så som BV-2, C8-B4 eller THP-1. Ved noen metoder samles komponentene på et mikroskop objektglass for å lette mikroskopisk overvåkning. Ved noen metoder blir multiple reaksjoner utført parallelt i brønnene av en mikrotiter-skål. | et slikt format kan et separat miniatyr mikroskop-objektglass være montert i de separate brønner eller et ikke-mikroskopisk deteksjonsformat, så som ELISA-deteksjon av Ap kan anvendes. Fortrinnsvis blir en serie av målinger av mengden av amyloid-avleiring utført i in vitro reaksjonsblandingen, ved å starte fra en baselinje-verdi før reaksjonen har begynt og én eller flere test-verdier under reaksjonen. Antigenet kan detekteres ved å merke, for eksempel med et fluorescerende merket antistoff til Ap eller annen komponent av amyloid plaque. Antistoffet anvendt for merking kan, men trenger ikke være samme som antistoffet som tester for utskillingsaktivitet. En reduksjon i forhold til baselinje under reaksjonen av amyloid-avleiringer indikerer at antistoffet under test har utskillings-aktivitet. Slike antistoffer er sannsynlige å være anvendelige for forhindring eller behandling av Alzheimers og andre amyloidogene sykdommer.
Analoge metoder kan anvendes for screening av antistoffer for aktivitet for utskilling av andre typer av biologiske enheter. Forsøket kan anvendes for å detektere utskillings-aktivitet mot praktisk talt hvilken som helst type biologisk enhet. Typisk har den biologiske enhet en rolle ved human eller dyresykdom. Den biologiske enhet kan være som en vevsprøve eller i isolert form. Hvis gitt som en vevsprøve, er vevsprøven fortrinnsvis ufiksert for å tillate lett tilgang til komponenter av vevsprøven og for å unngå å forstyrre konformasjon av komponentene forbundet med fiksering. Eksempler på vevsprøver som kan testes i dette forsøket omfatter cancerøst vev, precancerøst vev, vev inneholdende godartet vekst så som vorter eller føflekker, vev infisert med patogene mikroorganismer, vev infiltrert med inflammatoriske celler, vev som bærer patologiske matrikser mellom celler (f.eks. fibrinøs perikarditt), vev som bærer avvikende antigener og arrvev. Eksempler på isolerte biologiske enheter som kan anvendes omfatter Ap, virale antigener eller virus, proteoglykaner, antigener av andre patogene mikroorganismer, tumor-antigener og adhesjonsmolekyler. Slike antigener kan oppnås fra naturlige kilder, rekombinant ekspresjon eller kjemisk syntese, blant andre metoder. Vevsprøven eller den isolerte biologiske enhet blir bragt i kontakt med fagocyttiske celler som bærer Fc-reseptorer, så som monocytter eller mikroglial-celler og et antistoff som skal testes i et medium. Antistoffet kan være rettet mot den biologiske enhet under test eller mot et antigen forbundet med enheten. I den sistnevnte situasjon er målet å teste hvorvidt den biologiske enhet blir vikarierende fagocyttert med antigenet. Vanligvis, selv om ikke nødvendigvis, blir antistoffet og den biologiske enhet (noen ganger med et assosiert antigen), bragt i kontakt med hverandre før tilsetning av de fagocyttiske celler. Konsentrasjonen av den biologiske enhet og/eller det assosierte antigen gjenværende i mediet, hvis til stede, blir deretter overvåket. En reduksjon i mengden eller konsentrasjonen av antigen eller den assosierte biologiske enhet i mediet indikerer at antistoffet har en utskillende respons mot antigenet og/eller den assosierte biologiske enhet sammen med de fagocyttiske celler (se f.eks. Eksempel IV).
B. Nukleinsyre som koder for immunologiske og terapeutiske midler
Immunresponser mot amyloid-avsetninger kan også fremkalles ved administrering av nukleinsyrer som koder for antistoffer og deres komponent-kjeder anvendt for passiv immunisering. Slike nukleinsyrer kan være DNA eller RNA. Et nukleinsyresegment som koder for et immunogen blir typisk bundet til regulatoriske elementer, så som en promoter og enhancer, som tillater ekspresjon av DNA-segmentet i de tilsiktede målceller til en pasient. For ekspresjon i blodceller, som er ønskelig for induksjon av en immunrespons, er promoter- og enhancer-elementer fra lett- eller tungkjede immunoglobulin-gener eller CMV stor intermediær tidlig promoter og enhancer, egnet for å styre ekspresjon. De bundede regulatoriske elementer og kodende sekvenser blir ofte klonet inn i en vektor. For administrering av dobbelkjede antistoffer kan de to kjeder klones i samme eller separate vektorer.
Flere virale vektorsystemer er tilgjengelige omfattende retrovirale systemer ( se f.eks. Lawrie og Tumin, Cur. Opin. Genet. Develop. 3:102-109
(1993) ); adenovirale vektorer (se f.eks. Bett et al., J. Virol. 67:5911 (1993)); adeno-assosierte virusvektorer (se f.eks. Zhou et al., J. Exp. Med. 179:1867
(1994) ), virale vektorer fra pox-familien omfattende vaccinia virus og fugle-pox-virus, virale vektorer fra alfa-virus-slekten så som de avledet fra Sindbis og Semliki Forest Virus ( se f.eks. Dubensky et al., J. Virol. 70:508 (1996)), venezuelansk ekvint encefalitt virus (se Johnston et al., US 5,643,576) og rhabdovirus, så som vesikulær stomatitt virus (se Rose, WO 96/34625) og papillomavirus (Ohe et al., Human Gene Therapy 6:325 (1995); Woo et al., WO 94/12629 og Xiao & Brandsma, Nucleic Acids. Res. 24, 2630-2622 (1996)).
DNA som koder for et immunogen eller en vektor inneholdende samme, kan pakkes i liposomer. Egnede lipider og relaterte analoger er beskrevet av Eppstein et al., US 5,208,036, Felgner et al., US 5,264,618, Rose, US 5,279,833 og Epand et al., US 5,283,185. Vektorer og DNA som koder for et immunogen kan også være adsorbert til eller forbundet med partikkelformede bærere, idet eksempler på slike omfatter polymetylmetakrylat-polymerer og polylaktider og poly(laktid-co-glykolider), se, f.eks. McGee et al., J. Micro Encap. (1996).
Genterapi-vektorer eller nakne polypeptider (f.eks. DNA) kan leveres in vivo ved administrering til en individuell pasient, typisk ved systemisk administrering (f.eks. intravenøs, intraperitoneal, nasal, gastrisk, intradermal, intramuskulær, subdermal eller intrakraniell infusjon) eller topisk påføring (se f.eks. Anderson et al., US 5,399,346). Betegnelsen "nakent polynukleotid" angir et polynukleotid ikke kompleksert med kolloidale materialer. Nakne polynukleotider blir noen ganger klonet i en plasmid vektor. Slike vektorer kan videre omfatte hjelpemidler så som bupivacin (Attardo et al., US 5,593,970). DNA kan også administreres ved anvendelse av en genpistol. Se Xiao & Brandsma, ovenfor. DNA som koder for et immunogen blir utfelt på overflaten av mikroskopiske metallkuler. Mikroprosjektilene blir akselerert med en sjokkbølge eller ekspanderende heliumgass og penetrerer vev til en dybde av mange cellelag. For eksempel er Accel™ gen-leveringsanordning fremstilt av Agacetus, Inc. Middleton Wl egnet. Alternativt kan nakent DNA føres gjennom huden inn i blodstrømmen enkelt ved å plassere DNA på hud med kjemisk eller mekanisk irritasjon (se Howell et al., WO 95/05853).
I en ytterligere variasjon kan vektorer som koder for immunogener leveres til celler ex vivo, så som celler eksplantert fra en individuell pasient (f.eks. lymfocytter, benmargaspirater, vevbiopsi) eller universelle donor hematopoetiske stamceller, fulgt av reimplantasjon av cellene i en pasient, vanligvis etter seleksjon av celler som har opptatt vektoren.
II. Profylaktiske og terapeutiske anvendelser
Foreliggende oppfinnelse er rettet bl.a. mot behandling av Alzheimers og andre amyloidogene sykdommer ved administrering av de humaniserte immunoglobuliner til spesifikke epitoper i Ap til en pasient under betingelser som genererer en fordelaktig terapeutisk respons hos en pasient (f.eks. induksjon av fagocytose av Ap, reduksjon av plaque-byrde, hemning av plaque-dannelse, reduksjon av neurittisk dystrofi, forbedring av kognitiv funksjon og/eller reversing, behandling eller forhindring av kognitiv reduksjon) hos pasienten, for eksempel for forebygging eller behandling av en amyloidogen sykdom. Oppfinnelsen er også rettet mot anvendelse av de humaniserte immunoglobuliner for fremstilling av et medikament for behandling eller forebygging av en amyloidogen sykdom.
Betegnelsen "behandling" som anvendt her, er definert som påføring eller administrering av et terapeutisk middel til en pasient eller påføring eller administrering av et terapeutisk middel til et isolert vev eller cellelinje fra en pasient, som har en sykdom, symptom på sykdom eller predisponering for en sykdom, med formålet å kurere, hele, lindre, lette, endre, helbrede, bedre, forbedre eller påvirke sykdommen, symptomene på sykdom eller predisponering for sykdom.
I ett aspekt tilveiebringer oppfinnelsen anvendelse av de humaniserte immunoglobuliner for fremstilling av et medikament for forhindring eller behandling av en sykdom forbundet med amyloid-avsetninger av Ap i hjernen til en pasient. Slike sykdommer omfatter Alzheimers sykdom, Downs syndrom og kognitiv svekkelse. Den sistnevnte kan forekomme med eller uten andre karakteristika av en amyloidogen sykdom. Noen ganger administreres en effektiv dose av et antistoff som spesifikt binder til en komponent av en amyloid-avleiring hos pasienten. Dette er spesielt for forhindring eller behandling av Alzheimers sykdom i humane pasienter. Eksempler medfører administrering av en effektiv dose av et antistoff som binder til Ap. Foretrukket administreres en effektiv dose av et antistoff som spesifikt binder til en epitop innen rester 1-10 av Ap, for eksempel antistoffer som spesifikt binder til en epitop innen rester 1-5 av Ap, antistoffer som spesifikt binder til en epitop innen rester 1-6 av Ap, antistoffer som spesifikt binder til en epitop innen rester 1-7 av Ap eller antistoffer som spesifikt binder til en epitop innen rester 3-7 av Ap. Antistoffer som binder til en epitop omfattende en fri N-terminal rest av Ap kan administreres. Antistoffer som binder til en epitop innen rester 1-10 av AQ>hvor rest 1 og/eller rest 7 av Ap er asparaginsyre kan administreres. Antistoffer som spesifikt binder til Ap-peptid uten binding til full-lengde amyloid-forløper-protein (APP) kan administreres. I et annet aspekt er isotypen av antistoffet human IgGI.
Antistoffer som binder til en amyloid-avleiring hos pasienten og fremkaller en utskillende respons mot amyloid-avleiringen kan administreres. For eksempel kan en slik utskillingsrespons utføres ved Fc-reseptor-mediert fagocytose.
Terapeutiske agenser ifølge foreliggende oppfinnelse er typisk hovedsakelig rene for uønsket forurensning. Dette betyr at et middel har typisk minst ca. 50% vekt/vekt renhet, så vel som at det er hovedsakelig fritt for innvirkende proteiner og forurensninger. Noen ganger har agensene minst ca. 80% vekt/vekt og, mer foretrukket minst 90 eller ca. 95% vekt/vekt renhet. Imidlertid kan ved anvendelse av konvensjonelle proteinrensningsteknikker, homogene peptider på minst 99% vekt/vekt oppnås.
De humaniserte immunoglobulinene kan anvendes både for asymptomatiske pasienter og for de som viser symptomer på sykdom. Antistoffene kan være humaniserte antistoffer eller fragmenter derav (f.eks. antigen-bindingsfragmenter) som beskrevet her.
Et antistoff kan administreres med en farmasøytisk bærer som et farmasøytisk preparat. Alternativt kan antistoffet administreres til en pasient ved administrering av et polynukleotid som koder for minst én antistoff-kjede. Polynukleotidet blir uttrykt for å produsere antistoff-kjeden hos pasienten. Eventuelt koder polynukleotidet for tung- og lett-kjeder av antistoffet. Polynukleotidet blir uttrykt for å produsere tung- og lett-kjedene hos pasienten. I eksempelvise utførelsesformer blir pasienten overvåket for nivået av administrert antistoff i blodet til pasienten.
Oppfinnelsen oppfyller således et langvarig behov for terapeutiske regimer for forhindring eller forbedring av neuropatologi og, hos noen pasienter, kognitiv svekkelse forbundet med Alzheimers sykdom.
A. Pasienter mottagelige for behandling
Pasienter mottagelige for behandling omfatter individer med risiko for sykdom men som ikke viser symptomer, så vel som pasienter som viser symptomer. I tilfellet av Alzheimers sykdom har praktisk talt alle risiko for å lide av Alzheimers sykdom hvis han eller hun lever lenge nok. Derfor kan foreliggende immunoglobuliner anvendes profylaktisk for den generelle populasjon uten behov for noen vurdering av risikoen for den aktuelle pasient. Foreliggende immunoglobuliner er spesielt anvendelige for individer som har en kjent genetisk risiko for Alzheimers sykdom. Slike individer omfatter de som har slektninger som har opplevet denne sykdommen og de hvis risiko blir bestemt ved analyse av genetiske eller biokjemiske markører. Genetiske markører for risiko for Alzheimers sykdom omfatter mutasjoner i APP-gen, spesielt mutasjoner i posisjon 717 og posisjoner 670 og 671 referert til som henholdsvis Hardy- og Swedish-mutasjoner (se Hardy, ovenfor). Andre markører for risiko er mutasjoner i presenilin-gener, PS1 og PS2 og ApoE4, familiehistorie av AD, hyperkolesterolemi eller aterosklerose. Individer som lider av Alzheimers sykdom kan gjenkjennes fra karakteristisk demens, så vel som tilstedeværelse av risikofaktorer beskrevet ovenfor. I tillegg er flere diagnostiske tester tilgjengelige for å identifisere individer som har AD. Disse omfatter måling av CSF tau og A042 nivåer. Forhøyede tau- og reduserte A042-nivåer betyr tilstedeværelsen av AD. Individer som lider av Alzheimers sykdom kan også diagnostiseres ved ADRDA-kriterier som beskrevet i eksempeldelen.
Hos asymptomatiske pasienter kan behandling begynne ved hvilken som helst alder (f.eks. 10, 20, 30). Vanligvis er det imidlertid ikke nødvendig å begynne behandling før en pasient blir 40, 50, 60 eller 70. Behandling medfører typisk multiple doser over et tidsrom. Behandling kan overvåkes ved undersøkelse av antistoff-nivåer over tid. Hvis responsen faller, er en revaksineringsdose indikert. I tilfellet av potensielle Downs syndrom pasienter, kan behandling begynne før fødselen ved administrering av det terapeutiske middel til moren eller kort etter fødselen.
B. Behandlingsregimer og doser
Ved profylaktiske anvendelser blir farmasøytiske preparater eller medikamenter administrert til en pasient mottagelig for eller på annen måte med risiko for, Alzheimers sykdom i en mengde tilstrekkelig til å fjerne eller redusere risikoen, minske alvorlighetsgraden eller forsinke begynnelsen av sykdommen, omfattende biokjemiske, histologiske og/eller adferdsmessige symptomer på sykdommen, dens komplikasjoner og intermediære patologiske fenotyper som presenteres under utvikling av sykdommen. Ved terapeutiske anvendelser blir preparater eller medikamenter administrert til en pasient mistenkt for eller som allerede lider av en slik sykdom, i en mengde tilstrekkelig til å kurere eller minst delvis stanse, symptomene på sykdommen (biokjemisk, histologisk og/eller adferdsmessig), omfattende dens komplikasjoner og intermediære patologiske fenotyper ved utvikling av sykdommen.
Ved noen anvendelser reduserer eller eliminerer administrering av agens myokognitiv svekkelse hos pasienter som ennu ikke har utviklet karakteristisk Alzheimers patologi. En mengde tilstrekkelig til å oppnå terapeutisk eller profylaktisk behandling er definert som en terapeutisk eller profylaktisk effektiv dose. I både profylaktiske og terapeutiske regimer, blir agenser vanligvis administrert i mange doser inntil en tilstrekkelig immunrespons er oppnådd. Betegnelsen "immunrespons" eller "immunologisk respons" omfatter utvikling av humoral (antistoff-mediert) og/eller cellulær (mediert av antigen-spesifikke T-celler eller deres sekresjonsprodukter) respons rettet mot et antigen hos en mottagerpasient. En slik respons kan være en aktiv respons, dvs. fremkalt ved administrering av immunogen eller en passive respons, dvs. fremkalt ved administrering av immunoglobulin eller antistoff eller primede T-celler.
Et "immunogent agens" eller "immunogen" kan fremkalle en immunologisk respons mot seg selv ved administrering til et pattedyr, eventuelt sammen med et adjuvans. Typisk blir immunresponsen overvåket og gjentatte doser blir gitt hvis immunresponsen begynner å bli svakere.
Effektive doser av preparatene ifølge foreliggende oppfinnelse for behandling av de ovenfor beskrevne lidelser varierer avhengig av mange forskjellige faktorer, omfattende administreringsmetode, målsete, fysiologisk tilstand til pasienten, hvorvidt pasienten er et menneske eller et dyr, andre medikamenter administrert og hvorvidt behandling er profylaktisk eller terapeutisk. Vanligvis er pasienten et menneske, men ikke-humane pattedyr omfattende transgene pattedyr kan også behandles. Behandlingsdoser må titreres for å optimalisere sikkerhet og effektivitet.
For passiv immunisering med et antistoff er dosen i området fra ca. 0,0001 til 100 mg/kg og mer vanlig 0,01 til 5 mg/kg, av vertens kroppsvekt. For eksempel kan doser være 1 mg/kg kroppsvekt eller 10 mg/kg kroppsvekt eller innen området 1-10 mg/kg, fortrinnsvis minst 1 mg/kg. Pasienter kan administreres slike doser daglig, annenhver dag, ukentlig eller i henhold til hvilket som helst annet skjema bestemt ved empirisk analyse. Eksempler på behandling medfører administrering i multiple doser over en forlenget periode, for eksempel på minst seks måneder. Ytterligere eksempler på behandlingsregimer medfører administrering én gang hver to uker eller én gang pr. måned eller én gang hver 3 til 6 måneder. Eksempler på doseregimer omfatter 1-10 mg/kg eller 15 mg/kg på påfølgende dager, 30 mg/kg annenhver dag eller 60 mg/kg ukentlig. Ved noen metoder blir to eller flere monoklonale antistoffer med forskjellige bindingsspesifisiteter administrert samtidig, i hvilket tilfelle dosen av hvert antistoff administrert faller innenfor områdene angitt.
Antistoff blir vanligvis administrert ved flere anledninger. Intervaller mellom enkelte doser kan være ukentlig, månedlig eller årlig. Intervaller kan også være ujevne som indikert ved å måle blodnivåer av antistoff for Ap hos pasienten. Ved noen metoder blir dosen regulert for å oppnå en plasma antistoff-konsentrasjon på 1-1000ug/ml og ved noen metoder 25-300 ug/ml. Alternativt kan antistoff administreres som et preparat med forsinket frigjøring, i hvilket tilfelle mindre hyppig administrering er nødvendig. Dose og hyppighet varierer avhengig av halveringstiden av antistoffet hos pasienten. Generelt viser humane antistoffer lengst halveringstid, fulgt av humaniserte antistoffer, kimære antistoffer og ikke-humane antistoffer.
Dosen og administreringshyppigheten kan variere avhengig av hvorvidt behandlingen er profylaktisk eller terapeutisk. Ved profylaktiske anvendelser blir preparater inneholdende foreliggende antistoffer eller en cocktail derav, administrert til en pasient som ikke allerede har sykdommen for å forbedre pasientens resistens. En slik mengde er definert å være en "profylaktisk effektiv dose." Ved denne anvendelsen avhenger de nøyaktige mengder igjen av pasientens helsetilstand og generelle immunitet, men er generelt i området fra 0,1 til 25 mg pr. dose, spesielt 0,5 til 2,5 mg pr. dose. En relativt lav dose blir administrert med relativt lite hyppige intervaller over en lang tidsperiode. Noen pasienter fortsetter å motta behandling resten av sine liv.
Ved terapeutiske anvendelser er en relativt høy dose (f.eks. fra ca. 1 til 200 mg antistoff pr. dose, idet doser på fra 5 til 25 mg er mer vanlig anvendt) med relativt korte intervaller noen ganger nødvendig inntil progresjon av sykdommen blir redusert eller avsluttet og fortrinnsvis inntil pasienten viser delvis eller fullstendig forbedring av symptomer på sykdom. Deretter kan pasienten administreres et profylaktisk regime.
Doser for nukleinsyrer som koder for antistoffer er i området fra ca. 10 ng til 1 g, 100 ng til 100 mg, 1^g til 10 mg eller 30-300^g DNA pr. pasient. Doser for infeksiøse virale vektorer varierer fra 10-100 eller flere, virioner pr. dose.
Terapeutiske midler kan administreres ved parenterale, topiske, intravenøse, orale, subkutane, intraarterielle, intrakranielle, intraperitoneale, intranasale eller intramuskulære metoder for profylaktisk og/eller terapeutisk behandling. Den mest typiske administreringsvei for et immunogent agens er subkutan selv om andre ruter kan være like effektive. Nest mest vanlige rute er intramuskulær injeksjon. Denne type av injeksjon blir mest typisk utført i arm-eller legg-muskler. Ved noen metoder blir agenser injisert direkte i et spesielt vev hvor avsetninger har akkumulert, for eksempel intrakraniell injeksjon. Intramuskulær injeksjon eller intravenøs infusjon er foretrukket for administrering av antistoff. Ved noen metoder blir spesielle terapeutiske antistoffer injisert direkte i kraniet. Ved noen metoder blir antistoffer administrert som et preparat eller anordning med forsinket frigjøring, så som en Medipad™ anordning.
Agenser ifølge foreliggende oppfinnelse kan eventuelt administreres i kombinasjon med andre midler som i det minste er delvis effektive ved behandling av amyloidogen sykdom. I tilfellet av Alzheimers og Downs syndrom, hvor amyloid-avsetninger skjer i hjernen kan agenser ifølge foreliggende oppfinnelse også administreres sammen med andre midler som øker passasjen av agensene ifølge foreliggende oppfinnelse gjennom blod-hjerne-barrieren.
C. Farmasøytiske preparater
Agenser ifølge foreliggende oppfinnelse blir ofte administrert som farmasøytiske preparater omfattende et aktivt terapeutisk agens og en rekke andre farmasøytisk akseptable komponenter. Se Remington' s Pharmaceutical Science (15. ed., Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania (1980)). Den foretrukne form avhenger av den tilsiktede administreringsmetode og terapeutiske anvendelse. Preparatene kan også omfatte, avhengig av preparatet ønsket, farmasøytisk akseptable, ikke-toksiske bærere eller fortynningsmidler, som er definert som konstituenter vanlig anvendt for å formulere farmasøytiske preparater for administrering til dyr eller mennesker. Fortynningsmidlet blir valgt slik at det ikke påvirker den biologiske aktiviteten til kombinasjonen. Eksempler på slike fortynningsmidler er destillert vann, fysiologisk fosfat-bufret saltvann, Ringer's løsninger, dekstrose-løsning og Hank's løsning. I tillegg kan det farmasøytiske preparatet eller formuleringen også omfatte andre bærere, adjuvantia eller ikke-toksiske, ikke-terapeutiske, ikke-immunogene stabiliseringsmidler og lignende.
Farmasøytiske preparater kan også omfatte store, langsomt metaboliserte makromolekyler så som proteiner, polysakkarider så som chitosan, polymelkesyrer, polyglykolsyrer og kopolymerer (så som lateks-funksjonalisert sepharose<f>™), agarose, cellulose og lignende), polymere aminosyrer, aminosyre-kopolymerer og lipid-aggregater (så som små oljedråper eller liposomer). I tillegg kan disse bærere fungere som immunostimulerende agenser (dvs. adjuvantia).
For parenteral administrering kan midler ifølge foreliggende oppfinnelse administreres som injiserbare doser av en løsning eller suspensjon av substansen i et fysiologisk akseptabelt fortynningsmiddel med en farmasøytisk bærer som kan være en steril væske så som vann, oljer, saltvann, glycerol eller etanol. I tillegg kan hjelpesubstanser, så som fukte- eller emulgeringsmidler, overflateaktive midler, pH buffersubstanser og lignende være til stede i preparatene. Andre komponenter av farmasøytiske preparater er de av petroleum, animalsk, vegetabilsk eller syntetisk opprinnelse, for eksempel jordnøttolje, soyabønneolje og mineralolje. Generelt er glykoler så som propylenglykol eller polyetylenglykol foretrukne flytende bærere, spesielt for injiserbare løsninger. Antistoffer kan administreres i form av en depot-injeksjon eller implantat-preparat, som kan formuleres på en slik måte at det tillater forsinket frigjøring av den aktive bestanddel. Et eksempel på preparat omfatter monoklonalt antistoff med 5 mg/ml, formulert i vandig buffer bestående av 50 mM L-histidin, 150 mM NaCI, regulert til pH 6,0 med HCI.
Typisk blir preparatene fremstilt som injiserbare produkter, enten som flytende løsninger eller suspensjoner; og faste former egnet for løsning eller suspensjon i flytende konstituenter før injeksjon kan også fremstilles. Preparatet kan også være emulgert eller innkapslet i liposomer eller mikro-partikler så som polylaktid, polyglykolid eller kopolymer for forbedret adjuvans- effekt, som beskrevet ovenfor (se Langer, Science 249: 1527 (1990) og Hanes, Advanced Drug Delivery Reviews 28:97 (1997)). Midlene ifølge foreliggende oppfinnelse kan administreres i form av en depot-injeksjon eller implantat-preparat, som kan formuleres på en slik måte at den tillater forlenget eller pulsvis frigjøring av den aktive bestanddel.
Ytterligere preparater egnet for andre administreringsmetoder omfatter orale, intranasale og pulmonale preparater, suppositorier og transdermale anordninger. For suppositorier omfatter bindemidler og bærere for eksempel polyalkylenglykoler eller triglycerider; slike suppositorier kan dannes fra blandinger inneholdende den aktive bestanddel i området 0,5% til 10%, fortrinnsvis 1%-2%. Orale preparater omfatter tilsetningsmidler, så som farmasøytiske kvaliteter av mannitol, laktose, stivelse, magnesiumstearat, natrium-sakkarin, cellulose og magnesiumkarbonat. Disse preparater er i form av løsninger, suspensjoner, tabletter, piller, kapsler, forsinket frigjørings-preparater eller pulvere og inneholder 10%-95% av aktiv bestanddel, fortrinnsvis 25%-70%.
Topisk påføring kan resultere i transdermal eller intradermal levering. Topisk administrering kan lettes ved samadministrering av midlet med kolera-toksin eller detoksifiserte derivater eller subenheter derav eller andre lignende bakterielle toksiner (Se Glenn et al., Nature 391, 851 (1998)). Samadministrering kan oppnås ved anvendelse av komponentene som en blanding eller som bundede molekyler oppnådd ved kjemisk kryssbinding eller ekspresjon som et fusjonsprotein.
Alternativt kan transdermal levering oppnås ved anvendelse av en hud-bane eller ved anvendelse av transferosomer (Paul et al., Eur. J. Immunol. 25:3521 (1995); Cevc et al., Biochem. Biophys. Acta 1368:201-15 (1998)).
III. Overvåkning av behandlingsforløp
De humaniserte antistoffene ifølge oppfinnelsen kan anvendes for overvåkning av behandling av en pasient som lider av eller er mottagelig for Alzheimers, dvs. for overvåkning av et behandlingsforløp administrert til en pasient. Metodene kan anvendes for å overvåke både terapeutisk behandling for symptomatiske pasienter og profylaktisk behandling for asymptomatiske pasienter. Spesielt er metodene anvendelige for overvåkning av passiv immunisering (f.eks. måling av nivå av administrert antistoff).
Noen metoder medfører bestemmelse av en baselinje-verdi, for eksempel av et antistoff-nivå eller -profil hos en pasient, før administrering av en dose av agenset og sammenligne dette med en verdi for profilen eller nivået etter behandling. En betydelig økning (dvs. større enn den typiske margin for eksperimentelle feil i gjentatte målinger av samme prøve, uttrykt som standard avvik fra gjennomsnittet av slike målinger) i verdi av nivået eller profilen signaliserer et positivt behandlingsresultat (dvs. at administrering av midlet har oppnådd en ønsket respons). Hvis verdien for immunrespons ikke forandres betydelig eller reduseres, er et negativt behandlingsresultat indikert.
Ved andre metoder blir en kontrollverdi (dvs. gjennomsnitt og standard avvik) for nivå eller profil bestemt for en kontrollpopulasjon. Typisk har individer i kontrollpopulasjonen ikke mottatt tidligere behandling. Målte verdier for nivået eller profilen hos en pasient etter administrering av et terapeutisk middel blir deretter sammenlignet med kontrollverdien. En betydelig økning i forhold til kontrollverdien (f.eks. større enn standard avvik fra gjennomsnittet) signaliserer et positivt eller tilstrekkelig behandlingsresultat. Mangel på betydelig økning eller en reduksjon signaliserer et negativt eller utilstrekkelig behandlingsresultat. Administrering av agens blir generelt fortsatt mens nivået øker i forhold til kontrollverdien. Som før er oppnåelse av et platå i forhold til kontrollverdier en indikator for at administrering av behandling kan avbrytes eller reduseres i dose og/eller hyppighet.
Ved andre metoder blir en kontrollverdi av nivå eller profil (f.eks. gjennomsnitt og standard avvik) bestemt fra en kontrollpopulasjon av individer som har gjennomgått behandling med et terapeutisk agens og hvis nivåer eller profiler har nådd platå som respons på behandling. Målte verdier av nivåer eller profiler hos en pasient blir sammenlignet med kontrollverdien. Hvis det målte nivået hos en pasient ikke er betydelig forskjellig (f.eks. mer enn ett standard avvik) fra kontrollverdien, kan behandling avbrytes. Hvis nivået hos en pasient er betydelig under kontrollverdien, er fortsatt administrering av agenset berettiget. Hvis nivået hos pasienten vedvarer under kontrollverdien, kan da en forandring i behandling være indikert.
Ved andre metoder blir en pasient som ikke nå mottar behandling, men har gjennomgått et tidligere behandlingsforløp overvåket for antistoff-nivåer eller -profiler for å bestemme hvorvidt en gjenopptagelse av behandling er nødvendig. Det målte nivået eller profilen til pasienten kan sammenlignes med en verdi tidligere oppnådd hos pasienten etter et tidligere behandlingsforløp. En betydelig reduksjon i forhold til tidligere måling (dvs. større enn en typisk margin forfeil i repeterte målinger av samme prøve) er en indikasjon på at behandling kan gjenopptas. Alternativt kan verdien målt hos en pasient sammenlignes med en kontrollverdi (gjennomsnitt pluss standard avvik) bestemt i en populasjon av pasienter som gjennomgår et behandlingsforløp. Alternativt kan den målte verdien hos en pasient sammenlignes med en kontrollverdi i populasjoner av profylaktisk behandlede pasienter som forblir fri for symptomer på sykdom eller populasjoner av terapeutisk behandlede pasienter som viser forbedring av sykdomskarakteristika. I alle disse tilfeller er en betydelig reduksjon i forhold til kontrollnivået (dvs. mer enn standard avvik) en indikator for at behandling bør gjenopptas hos en pasient.
Vevsprøven foranalyse er typisk blod, plasma, serum, mukøs væske eller cerebrospinalvæske fra pasienten. Prøven blir analysert, for eksempel for nivåer eller profiler av antistoffer for Ap-peptid, f.eks. nivåer eller profiler av humaniserte antistoffer. ELISA-metoder for detektering av antistoffer spesifikke for Ap er beskrevet i eksempeldelen. Ved noen metoder blir nivået eller profilen av et administrert antistoff bestemt ved anvendelse av et utskillingsforsøk, for eksempel i et in vitro fagocytose-forsøk, som beskrevet her. Ved slike metoder blir en vevsprøve fra en pasient som testes bragt i kontakt med amyloid-avsetninger (f.eks. fra en PDAPP-mus) og fagocyttiske celler som bærer Fc-reseptorer. Påfølgende utskilling av den amyloide avleiring blir deretter overvåket. Eksistens og grad av utskillingsrespons gir en indikasjon på eksistens og nivå av antistoffer effektive til å utskille Ap i vevsprøven til pasienten som testes.
Antistoff-profilen etter passiv immunisering viser typisk en umiddelbar topp i antistoff-konsentrasjon fulgt av en eksponensiell svekking. Uten en ytterligere dose når svekkingen førbehandlings-nivåer innen en periode på dager til måneder avhengig av halveringstiden av antistoffet administrert. For eksempel er halveringstiden for noen humane antistoffer i størrelsesorden 20 dager.
Ved noen metoder blir en baselinje-måling av antistoff for Ap hos pasienten gjort før administrering, en andre måling blir gjort snart deretter for å bestemme topp-antistoffnivå og én eller flere ytterligere målinger blir gjort med intervaller for å overvåke svekking av antistoff-nivåer. Når nivået av antistoff er redusert til baselinje eller en forutbestemt prosentdel av toppen minus baselinje (T.eks. 50%, 25% eller 10%), blir administrering av en ytterligere dose av antistoff utført. Ved noen metoder, blir topp eller påfølgende målte nivåer minus bakgrunn sammenlignet med referanse-nivåer tidligere bestemt å utgjøre en fordelaktig profylaktisk eller terapeutisk behandlingsregime i andre pasienter. Hvis det målte antistoff-nivået er betydelig mindre enn et referanse nivå (f.eks. mindre enn gjennomsnittet minus ett standard avvik av referanseverdien i populasjon av pasienter som har nytte av behandling) er administrering av en ytterligere dose av antistoff indikert.
Ytterligere metoder omfatter overvåkning, over behandlingsforløpet, av hvilket som helst fysiologisk symptom kjent på området (f.eks. fysisk eller mentalt symptom) rutinemessig anvendt av forskere eller leger for å diagnostisere eller overvåke amyloidogene sykdommer (f.eks. Alzheimers sykdom). For eksempel kan kognitiv svekkelse overvåkes. Sistnevnte er et symptom på Alzheimers sykdom og Downs syndrom, men kan også forekomme uten andre karakteristika for noen av disse sykdommer. For eksempel kan kognitiv svekkelse overvåkes ved å bestemme en pasients resultat ved Mini-Mental State Exam i henhold til konvensjonen gjennom hele behandlingsforløpet.
C. Sett
Sett for utføring av overvåknings-metodene beskrevet ovenfor er beskrevet. Typisk inneholder slike sett et middel som spesifikt binder til antistoffer for Ap. Settet kan også omfatte et merke. For deteksjon av antistoffer for Ap, er merket typisk i form av merkede anti-idiotypiske antistoffer. For deteksjon av antistoffer kan midlet leveres forhåndsbundet til en fastfase, så som til brønnene av en mikrotiter skål. Settene inneholder også typisk merking som gir retningslinjer for anvendelse av settene. Merkingen kan også omfatte et diagram eller annet korresponderende regime som korrelerer nivåer av målt merking med nivåer av antistoffer for Ap. Betegnelsen merking angir hvilket som helst skrevet eller nedtegnet materiale som er vedlagt eller på annen måte medfølger et sett på hvilket som helst tidspunkt under dets fremstilling, transport, salg eller anvendelse. For eksempel omfatter betegnelsen merking reklamemateriale og brosjyrer, pakke-materialer, instruksjoner, audio eller video-kassetter, datamedier, så vel som trykning direkte på settet.
Diagnostiske sett, for eksempel forsknings-, deteksjons- og/eller diagnostiske sett (f.eks. for utførelse av in vivo avbildning) er beskrevet. Slike sett inneholder typisk et antistoff for binding til en epitop av Ap, fortrinnsvis innen rester 1 -10. Fortrinnsvis er antistoffet merket eller et sekundært merkingsreagens er omfattet i settet. Fortrinnsvis er settet merket med instruksjoner for utføring av den tilsiktede anvendelse, for eksempel for utføring av et in vivo avbildningsforsøk. Eksempler på antistoffer er de beskrevet her.
D. In vivo avbildning
Ved anvendelse av immunoglobulinene ifølge oppfinnelsen kan in vivo avbildning av amyloide avsetninger hos en pasient gjennomføres. Denne avbildning er anvendelig for å diagnostisere eller bekrefter diagnose av Alzheimers sykdom eller mottagelighet for den. For eksempel kan denne avbildning anvendes for en pasient som presenterer symptomer på demens. Hvis pasienten har unormale amyloid-avsetninger, da lider pasienten sannsynligvis av Alzheimers sykdom. Avbildningen kan også anvendes for asymptomatiske pasienter. Tilstedeværelse av unormale avsetninger av amyloid indikerer mottagelighet for fremtidig symptomatisk sykdom. Avbildning er også anvendelige for overvåkning av sykdomsprogresjon og/eller respons på behandling for pasienter som tidligere er diagnostisert med Alzheimers sykdom.
Avbildningen utføres ved administrering av et reagens, så som antistoff som binder til Ap, til pasienten og deretter detektering av midlet etter at det er bundet. Foretrukne antistoffer binder til Ap-avsetninger hos en pasient uten å binde til full-lengde APP-polypeptid. Antistoffer som binder til en epitop av Ap innen aminosyrer 1-10 er spesielt foretrukket. Ved noen metoder binder antistoffet til en epitop innen aminosyrer 7-10 av Ap. Slike antistoffer binder typisk uten å fremkalle en vesentlig utskillingsrespons. Ved andre metoder binder antistoffet til en epitop innen aminosyrer 1-7 av Ap. Slike antistoffer binder typisk og fremkaller en utskillingsrespons på Ap. Imidlertid kan utskillingsrespons unngås ved anvendelse av antistoffragmenter som mangler en full-lengde konstant region, så som Fab. Ved noen metoder kan samme antistoff tjene som både et behandlende og diagnostisk reagens. Generelt oppviser antistoffer som binder til epitoper C-terminale til rest 10 av Ap ikke så sterkt signal som antistoffer som binder til epitoper innen rester 1-10, antagelig fordi de C-terminale epitoper er utilgjengelige i amyloid-avsetninger. Følgelig er slike antistoffer mindre foretrukket.
Diagnostiske reagenser kan administreres ved intravenøs injeksjon i kroppen til pasienten eller direkte i hjernen ved intrakraniell injeksjon eller ved å bore et hull gjennom hodeskallen. Dosen av reagens bør være innen samme områder som for behandlingsmetoder. Typisk er reagenset merket, selv om ved noen metoder, det primære reagens med affinitet for Ap er umerket og et sekundært merkingsmiddel blir anvendt for å binde til det primære reagens. Valget av merke avhenger av deteksjonsmetoden. For eksempel er et fluorescerende merke egnet for optisk deteksjon. Anvendelse av paramagnetiske merker er egnet for tomografisk deteksjon uten kirurgisk intervensjon. Radioaktive merker kan også detekteres ved anvendelse av PET eller SPECT.
Diagnose blir utført ved å sammenligne antall, størrelse og/eller intensitet av merkede loci, med tilsvarende baselinjeverdier. Baselinjeverdier kan representere gjennomsnittsnivåer i en populasjon av friske individer. Baselinjeverdier kan også representere tidligere nivåer bestemt for samme pasient. For eksempel kan baselinjeverdier bestemmes hos en pasient før begynnelse av behandling og målte verdier deretter sammenlignes med baselinjeverdier. En reduksjon i verdier i forhold til baselinje indikerer en positiv respons på behandling.
Foreliggende oppfinnelse vil bli mer fullstendig beskrevet av de følgende eksempler.
EKSEMPLER
Eksempler I til VI og X til XI er kun angitt for informasjon.
Eksempel I. : Terapeutisk effektivitet av Anti- AB- antistoffer: mAb 2H3.mAb 10D5.mAb 266.mAb 21F12 og pAb AB1- 42
Dette eksemplet tester kapasiteten av forskjellige monoklonale og polyklonale antistoffer for Ap til å hemme akkumulering av Ap i hjernen av heterozygote transgene mus.
A. Studieutforming
Seksti heterozygote PDAPP transgene hann- og hunn-mus, 8,5 til 10,5 måneder gamle ble anskaffet fra Charles River Laboratory. Musene ble sortert i seks grupper som skal behandles med forskjellige antistoffer rettet mot Ap. Dyrene ble fordelt for å overensstemme med kjønn, alder, opphav og kilde for dyrene innen gruppene så nær som mulig. Tabell 2 viser den eksperimentelle utforming.
Som vist i Tabell 2 omfattet antistoffene fire murine Ap-spesifikke monoklonale antistoffer, 2H3 (rettet mo Ap rester 1-12), 10D5 (rettet mot Ap rester 3-7), 266 (rettet mot Ap rester 13-28 og binder til oppløselig, men ikke til aggregert AN1792), 21F12 (rettet mot til Ap rester 33-42). En femte gruppe ble behandlet med en Ap-spesifikk polyklonal antistoff-fraksjon (fremkalt ved immunisering med aggregert AN 1792). Den negative kontrollgruppen mottok fortynningsmidlet, PBS, alene uten antistoff.
B. Overvåkning av behandlingsforløp
De monoklonale antistoffene ble injisert i en dose på ca. 10 mg/kg (idet det antas at musen veiet 50 g). Antistoff-titere ble overvåket over de 28 uker med behandling. Injeksjoner ble administrert intraperitonealt hver syv dager i gjennomsnitt for å opprettholde anti-Ap titere over 1000. Selv om lavere titere ble målt for mAb 266 siden det ikke binder godt til aggregert AN 1792 anvendt som oppfangings-antigen i forsøket, ble samme doseringsskjema holdt for denne gruppen. Gruppen som mottok monoklonalt antistoff 2H3 ble avbrutt innen de første tre uker siden antistoffet ble utskilt for raskt in vivo.
For bestemmelse av antistoff-titere, ble blod tappet fra en undergruppe av tre tilfeldig valgte mus fra hver gruppe like før hver intraperitoneale inokulering, totalt 30 blodprøver. Antistoff-titere ble målt som Api-42-bindende antistoff ved anvendelse av sandwich ELISA med plast multi-brønn plater belagt med Api-42 som beskrevet i detalj under Generelle materialer og metoder. Gjennomsnittstitere for hver blodprøve er angitt i Tabell 3 for det polyklonale antistoff og de monoklonale 10D5 og 21F12.
Titere var i gjennomsnitt ca. 1000 over denne tidsperioden for det polyklonale antistoff-preparat og var litt over dette nivå for 10D5- og 21F12-behandlede dyr.
Behandling ble fortsatt over en seks måneders periode totalt 196 dager. Dyrene ble avlivet én uke etter den endelige dose.
C. AP- og APP- nivåer i hjernen:
Etter ca. seks måneders behandling med de forskjellige anti-Ap antistoff-preparater ble hjernene fjernet fra dyrene etter saltvannsperfusjon. Én hemisfære ble preparert for immunohistokjemisk analyse og den andre ble anvendt for kvantifisering av Ap- og APP-nivåer. For å måle konsentrasjonene av forskjellige former av beta-amyloid-peptid og amyloid-forløper-protein (APP), ble hemisfærene dissekert og homogenater av hippocampus-, cortex- og cerebellum-regioner ble preparert i 5M guanidin. Disse ble serielt fortynnet og nivået av amyloid-peptid eller APP ble kvantifisert ved sammenligning med en serie av fortynninger av standarder av Ap-peptid eller APP med kjente konsentrasjoner i et ELISA-format.
Nivåene av total Ap og Api-42 målt ved ELISA i homogenatene av cortex og hippocampus og nivået av total Ap i cerebellum er vist i henholdsvis Tabeller 4, 5 og 6. Median konsentrasjon av total Ap for kontrollgruppen, inokulert med PBS, var 3,6-ganger høyere i hippocampus enn i cortex (median på 63,389 ng/g hippocampusvev sammenlignet med 17,818 ng/g for cortex). Median-nivå i cerebellum for kontrollgruppen (30,6 ng/g vev) var mer enn 2000 ganger lavere enn i hippocampus. Disse nivåer er lignende de tidligere angitt for heterozygote PDAPP transgene mus med denne alder (Johnson-Wood et al., ovenfor).
For cortex hadde én behandlingsgruppe et median Ap-nivå, målt som Api-42, som avvek betydelig fra det til kontrollgruppen (p < 0,05), de dyr som mottok det polyklonale anti-Ap antistoff som vist i Tabell 4. Median-nivå av Api-42 ble redusert med 65%, sammenlignet med kontrollen for denne behandlings-gruppen. Mediannivåer av Api-42 var også betydelig redusert med 55% sammenlignet med kontrollen i én ytterligere behandlingsgruppe, de dyr dosert med mAb 10D5 (p = 0,0433).
I hippocampus var median prosent reduksjon av total Ap forbundet med behandling med polyklonalt anti-Ap antistoff (50%, p = 0,0055) ikke så stor som den observert i cortex (65%) (Tabell 5). Imidlertid var den absolutte størrelse av reduksjonen nesten 3 ganger større i hippocampus enn i cortex, en netto reduksjon på 31,683 ng/g vev i hippocampus mot 11,658 ng/g vev i cortex. Når målt som nivået av den mer amyloidogene form av Ap, Api-42, istedenfor total Ap, var reduksjonen oppnådd med det polyklonale antistoff betydelig (p = 0,0025). Median-nivåer i grupper behandlet med mAbs 10D5 og 266 ble redusert med henholdsvis 33% og 21%.
Total Ap ble også målt i cerebellum (Tabell 6). Gruppene dosert med polyklonalt anti-Ap og 266 antistoff viste betydelige reduksjoner av nivåene av total Ap (henholdsvis 43% og 46%, p = 0,0033 og p = 0,0184) og gruppen behandlet med 10D5 hadde en nær betydelig reduksjon (29%, p = 0,0675).
APP-konsentrasjon ble også bestemt ved ELISA i cortex og cerebellum fra antistoff-behandlede og kontroll, PBS-behandlede mus. To forskjellige APP- forsøk ble anvendt. Det første, betegnet APP-a/FL, gjenkjenner både APP-alfa (a, den utskilte form av APP som blir spaltet i Ap-sekvensen) og full-lengde former (FL) av APP, mens det andre gjenkjenner bare APP-a. I motsetning til behandlings-assosiert reduksjon av Ap i en undergruppe av behandlingsgrupper, var nivåene av APP praktisk talt uendret hos alle behandlede sammenlignet med kontrolldyrene. Disse resultater indikerer at immuniseringer med Ap-antistoffer utarmer Ap uten å utarme APP.
Som oppsummering ble Ap-nivåer betydelig redusert i cortex, hippocampus og cerebellum i dyr behandlet med det polyklonale antistoff mot AN1792. I mindre grad viste monoklonale antistoffer for den aminoterminale region av Api-42, spesifikt aminosyrer 1-16 og 13-28 også betydelige behandlingseffekter.
D. Histokiemiske analyser:
Morfologien av Ap-immunoreaktivt plaque i subsett av hjerner fra mus i PBS, polyklonalt A&42, 21F12, 266 og 10D5 behandlingsgruppene ble kvalitativt sammenlignet med den for tidligere undersøkelser hvor standard immuniserings-prosedyrer med Ap42 ble fulgt.
Den største endring i både utbredelse og fremtreden av amyloid plaque skjedde i dyrene immunisert med det polyklonale Ap42-antistoff. Reduksjonen av amyloid belastning, erodert plaque morfologi og celle-assosiert Ap immunoreaktivitet lignet meget effekter produsert ved standard immuniserings-prosedyre. Disse observasjoner støtter ELISA-resultatene hvor betydelige reduksjoner i både total Ap og Ap42 ble oppnådd ved administrering av det polyklonale Ap42-antistoff.
Ved lignende kvalitative bedømmelser ble amyloid plaque i 10D5-gruppen også redusert i antall og fremtreden, med noe bevis for celle-assosiert Ap-immunoreaktivitet. I forhold til kontroll-behandlede dyr, reduserte den polyklonale lg-fraksjon mot Ap og ett av de monoklonale antistoffene (10D5) plaque-byrden med henholdsvis 93% og 81% (p<0,005). 21F12 syntes å ha en relativt beskjeden effekt på plaque-byrden. Mikrografier av hjerne etter behandling med pAbAp-i-42viser diffuse avsetninger og fravær av mange av de større kompakte plaque i den pAbAp-i-42behandlede gruppe i forhold til kontroll-behandlede dyr.
E. Lvmfoproliferative responser
Ap-avhengig lymfoproliferasjon ble målt ved anvendelse av miltceller høstet åtte dager etter den endelige antistoff-infusjon. Nylig høstede celler, 10<5>pr. brønn, ble dyrket i 5 dager i nærvær av Api-40 i en konsentrasjon på 5 \ iM for stimulering. Som en positiv kontroll ble ytterligere celler dyrket med T-celle mitogen, PHA og, som en negativ kontroll, ble celler dyrket uten tilsatt peptid.
Splenocytter fra gamle PDAPP-mus passivt immunisert med forskjellige anti-Ap-antistoffer ble stimulert in vitro med AN1792 og proliferative og cytokin-responser ble målt. Formålet med disse forsøk var å bestemme om passiv immunisering lettet antigen-presentasjon og således priming av T-celle-responser spesifikke for AN1792. Ingen AN 1792-spesifikke proliferative eller cytokin-responser ble observert hos mus passivt immunisert med anti-Ap-antistoffer.
Eksempel II: Terapeutisk effektivitet av anti- AB antistoffer: mAb 2H3, mAb 10D5, mAb 266, mAb 21F12, mAb 3D6, mAb 16C11 og pAb AB1- 42
I en andre undersøkelse ble behandling med 10D5 gjentatt og to ytterligere anti-Ap-antistoffer ble testet, monoklonalene 3D6 (Ap1-5) og 16C11 (Ap33-42). Kontrollgrupper mottok enten PBS eller et irrelevant isotype-matchet antistoff (TM2a). Musene var eldre (11,5-12 måneder gamle heterozygoter) enn i den tidligere studien, ellers var den eksperimentelle utforming den samme. Igjen, etter seks måneders behandling, reduserte 10D5 plaque-byrden med mer enn 80% i forhold til PBS eller isotype-matchede antistoff-kontroller (p=0,003). Ett av de andre antistoffer mot Ap, 3D6, var like effektivt, og ga en 86% reduksjon (p=0,003). I motsetning hadde det tredje antistoff mot peptidet, 16C11, ingen som helst effekt på plaque-byrden. Lignende funn ble oppnådd ved Ap42 ELISA-målinger.
Disse resultater demonstrerer at en antistoffrespons mot Ap-peptid, i fravær av T-celle-immunitet, er tilstrekkelig til å redusere amyloid-avsetning i PDAPP-mus, men at ikke alle anti-Ap-antistoffer er like effektive. Antistoffer rettet mot epitoper omfattende aminosyrer 1 -5 eller 3-7 av Ap er spesielt effektive. Som oppsummering kan det demonstreres at passivt administrerte antistoffer mot Ap
(dvs. passiv immunisering) reduserer graden av plaque-avsetning i en musemodell av Alzheimers sykdom.
Eksempel III: Overvåkning av antistoffbinding i CNS
Dette eksemplet demonstrerer at når de ble holdt i beskjedne serum-konsentrasjoner (25-70 ug/ml), fikk antistoffene tilgang til CNS i nivåer tilstrekkelige til å merke p-amyloid plaque.
For å bestemme hvorvidt antistoffer mot Ap kunne virke direkte innen CNS, ble hjerner tatt fra saltvann-perfuserte mus ved slutten av Eksempel II, undersøkt for tilstedeværelse av de perifert administrerte antistoffer. Ufikserte kryostat hjernesnitt ble eksponert for et fluorescerende reagens mot mus-immunoglobulin (geit anti-mus lgG-Cy3). Plaque i hjernene av 10D5- og 3D6-grupper ble sterkt farget med antistoff, mens det ikke var noen farging i 16C11-gruppen. For å avsløre den fulle utstrekning av plaque-avsetning, ble serielle snitt av hver hjerne først immunoreagert med et anti-Ap antistoff og deretter med det sekundære reagens. 10D5 og 3D6, etter perifer administrering, fikk tilgang til de fleste plaque innen CNS. Plaque-byrden ble sterkt redusert i disse behandlingsgrupper sammenlignet med 16C11-gruppen. Antistoff-inntrenging i CNS var ikke på grunn av unormal lekkasje av blod-hjerne-barrieren siden det ikke var noen økning i vaskulær permeabilitet som målt ved Evans Blue i PDAPP-mus. I tillegg var konsentrasjonen av antistoff i hjerne- parenkym til eldre PDAPP-mus samme som i ikke-transgene mus, og representerte 0,1% av antistoff-konsentrasjon i serum (uansett isotype).
Disse data indikerer at perifert administrerte antistoffer kan komme inn i CNS hvor de direkte kan utløse amyloid-utskilling. Det er sannsynlig at 16C11 også hadde tilgang til plaque, men var ikke i stand til å binde.
Eksempel IV: Ex vivo screeningsforsøk for aktivitet til et antistoff mot amvloid- avsetninger
For å undersøke effekten av antistoffer på plaque-utskilling etablerte vi et
ex vivo forsøk hvor primære mikroglial-celler ble dyrket med ufikserte kryostat-snitt av enten PDAPP-mus- eller humane AD hjerner. Mikroglial-celler ble oppnådd fra de cerebral cortexer av neonat DBA/2N mus (1-3 dager). Cortexene ble mekanisk
dissosiert i HBSS" (Hanks' balanserte saltløsning, Sigma) med 50 ug/ml DNase I (Sigma). De dissosierte celler ble filtrert med en 100 um celle-strainer (Falcon) og sentrifugert ved 1000 rpm i 5 minutter. Pelleten ble resuspendert i vekstmedium (høyglukose DMEM, 10%FBS, 25ng/ml rmGM-CSF) og cellene ble platet ut med en densitet på 2 hjerner pr. T-75 plast kulturkolbe. Etter 7-9 dager ble kolbene rotert på en orbital-shaker ved 200 rpm i 2 timer ved 37°C. Cellesuspensjonen ble sentrifugert ved 1000 rpm og resuspendert i forsøksmediet. 10 um kryostat-snitt av PDAPP-mus- eller humane AD-hjerner (post-mortem intervall < 3 timer) ble tint montert på poly-lysin-belagte runde glass dekkglass og plassert i brønner av 24-brønn vevkulturplater. Dekkglassene ble vasket to ganger med forsøksmedium bestående av H-SFM (Hybridom-serumfritt medium, Gibco BRL) med 1% FBS, glutamin, penicillin/streptomycin og 5 ng/ml rmGM-CSF (R&D). Kontroll eller anti-Ap-antistoffer ble tilsatt med en 2x konsentrasjon (5 ug/ml endelig) i 1 time. Mikroglial-cellene ble deretter podet med en densitet på 0,8x 10<6>celler/ml forsøksmedium. Kulturene ble holdt i en fuktet inkubator (37°C, 5%C02) i 24 timer eller mer. Ved slutten av inkuberingen ble kulturene fiksert med 4% paraformaldehyd og permeabilisert med 0,1% Triton-X100. Snittene ble merket med biotinylet r3D6 fulgt av et streptavidin / Cy3 konjugat (Jackson ImmunoResearch). De eksogene mikroglialceller ble visualisert med et nukleært merke (DAPI). Kulturene ble observert med et invertert fluorescerende mikroskop (Nikon, TE300) og fotomikrografier ble tatt med et SPOT digitalt kamera ved anvendelse av SPOT programvare (Diagnostic Instruments). For Western blot analyse ble kulturene ekstrahert i 8M urinstoff, fortynnet 1:1 i reduserende tricin-prøvebuffer og lastet på en 16% tricingel (Novex). Etter overføring på immobilon, ble blottene eksponert for 5 ug/ml av pabAp42 fulgt av et HRP-konjugert anti-mus antistoff og utviklet med ECL (Amersham).
Når forsøket ble utført med PDAPP-hjernesnitt i nærvær av 16C11 (ett av antistoffene mot Ap som ikke var effektivt in vivo), forble p-amyloid plaque intakt og ingen fagocytose ble observert. I motsetning, når tilstøtende snitt ble dyrket i nærvær av 10D5, var de amyloide avsetninger for en stor del forsvunnet og mikroglialcellene viste en rekke fagocyttiske vesikler inneholdende Ap. Identiske resultater ble oppnådd med AD-hjernesnitt; 10D5 fremkalte fagocytose av AD plaque, mens 16C11 var ineffektivt. I tillegg ga forsøket sammenlignbare resultater når utført med enten mus- eller humane mikroglialceller og med mus-, kanin- eller primat-antistoffer mot Ap.
Tabell 7 sammenligner Ap-binding mot fagocytose for mange forskjellige antistoff bindingsspesifisiteter. Det kan sees at antistoffer som binder til epitoper innen aa 1-7 både binder og utskiller amyloid-avsetninger, mens antistoffer som binder til epitoper innen aminosyrer 4-10 binder uten utskilling av amyloid-avsetninger. Antistoffer som binder til epitoper C-terminale for rest 10 hverken binder eller utskiller amyloid-avsetninger.
Tabell 8 viser resultater oppnådd med mange antistoffer mot Ap, sammenligning av deres evne til å fremkalle fagocytose i ex vivo forsøk og å redusere in vivo plaque-byrde i passive overføringsundersøkelser. Selv om 16C11 og 21F12 bandt til aggregert syntetisk Ap-peptid med høy villighet, var disse antistoffer ikke i stand til å reagere med p-amyloid plaque i ufikserte hjernesnitt, kunne ikke utløse fagocytose i ex vivo forsøk og var ikke effektive in vivo. 10D5, 3D6 og det polyklonale antistoff mot Ap var aktive ved alle tre undersøkelser. Disse resultater viser at effektivitet in vivo skyldes direkte antistoff-mediert utskilling av plaque innen CNS og at ex vivo forsøk er prediktive for in vivo effektivitet.
Samme forsøk er anvendt for å teste utskillingsaktivitet til et antistoff mot et fragment av synuclein referert til som NAC. Synuclein er vist å være et amyloid plaque-assosiert protein. Et antistoff for NAC ble bragt i kontakt med en hjernevevprøve inneholdende amyloid plaque og mikroglialceller, som før. Kanin-serum ble anvendt som en kontroll. Påfølgende overvåkning viste en markert reduksjon i antall og størrelse av plaque indikativ for utskillingsaktivitet til antistoffet.
Konfokal mikroskopi ble anvendt for å bekrefte at Ap ble internalisert under forløpet av ex wVo-forsøket. I nærvær av kontroll-antistoffer, forble de eksogene mikroglialceller i et konfokalt plan over vevet, det var ingen fagocyttiske vesikler inneholdende Ap og plaque forble intakt i snittet. I nærvær av 10D5 var nesten alt plaque-materiale inneholdt i vesikler i de eksogene mikroglial-celler. For å bestemme skjebnen til det internaliserte peptid ble 10D5-behandlede kulturer ekstrahert med 8M urinstoff på forskjellige tidspunkter og undersøkt ved Western blot analyse. Etter én time, når ingen fagocytose ennu hadde skjedd, avslørte reaksjon med et polyklonalt antistoff mot Ap et sterkt 4 kD bånd (svarende til Ap-peptid). Ap immunoreaktivitet ble redusert på dag 1 og var fraværende etter dag 3. Således fører antistoff-mediert fagocytose av Ap til dets nedbrytning.
For å bestemme om fagocytose i ex wVo-forsøket var Fc-mediert, ble F(ab')2 fragmenter av anti-Afc antistoff 3D6 fremstilt. Selv om F(ab')2-fragmenter beholdt deres fulle evne til å reagere med plaque, var de ikke i stand til å utløse fagocytose av mikroglialceller. I tillegg kunne fagocytose med det hele antistoff blokkeres med et reagens mot murine Fc-reseptorer (anti-CD 16/32). Disse data indikerer at in vivo utskilling av Ap skjer gjennom Fc-reseptor-mediert fagocytose.
Eksempel V: Passasje av antistoffer gjennom blod- hjerne- barrieren
Dette eksemplet bestemmer konsentrasjonen av antistoff levert til hjernen etter intravenøs injeksjon i et perifert vev til enten normale eller PDAPP-mus. Etter behandlingen ble PDAPP- eller kontroll normale mus perfusert med 0,9% NaCI. Hjerneregioner (hippocampus eller cortex) ble dissekert og raskt frosset. Hjernen ble homogenisert i 0,1% triton + proteaseinhibitorer. Immunoglobulin ble detektert i ekstraktene ved ELISA. F(ab)'2 geit anti-mus IgG ble belagt på en RIA-plate som oppfangingsreagens. Serum eller hjerne-ekstrakter ble inkubert i 1 time. Isotypene ble detektert med anti-mus lgG1-HRP eller lgG2a-HRP eller lgG2b-HRP (Caltag). Antistoffer, uansett isotype, var til stede i CNS i en konsentrasjon som er 1:1000 av den funnet i blodet. Når for eksempel konsentrasjonen av IgGI var tre ganger den av lgG2a i blodet, var den tre ganger lgG2a i hjernen også, idet begge var til stede med 0,1% av deres respektive nivåer i blodet. Dette resultat ble observert både for transgene og ikke-transgene mus hvilket indikerer at PDAPP ikke har en unik lekkasje i blod-hjerne-barrieren.
Eksempel VI. Kloning og sekvensering av mus 3D6 variable regioner
Kloning og sekvensanalyse av 3D6 VH. Tungkjede variabel VH region av 3D6 ble klonet ved RT-PCR ved anvendelse av mRNA fremstilt fra hybridom-celler ved to uavhengige metoder. Ved den første ble konsensus primere anvendt for VH region leder-peptid omfattende translasjons-initieringskodon som 5'-primeren (DNA #3818-3829) og en g2b (DNA #3832) konstante regioner spesifikk 3'-primer. Sekvensene fra det PCR amplifiserte produkt, så vel som fra multiple, uavhengig avledede kloner, var i fullstendig overensstemmelse med hverandre. Som en ytterligere kontroll av sekvensen av 3D6 VH region, ble resultatet bekreftet ved sekvensering av et VH-fragment oppnådd ved 5' RACE RT-PCR metodikk og den 3' g2b spesifikke primer (DNA #3832). Igjen ble sekvensen avledet fra PCR-produktet, så vel som multiple, uavhengig isolerte kloner. Begge sekvenser er i fullstendig overensstemmelse med hverandre, (med unntak av V8l-substitusjon i leder-regionen av 5' RACE-produktet), hvilket indikerer at sekvensene er avledet fra mRNA som koder for VH-regionen av 3D6. Nukleotid- (SEKV ID NR:3) og aminosyre-sekvensen (SEKV ID NR:4) av VH-regionen av 3D6 er angitt i henholdsvis Tabell 9A og i Figur 2.
Kloning og sekvensanalyse av 3D6 VL. Lettkjede variabel VL-region av 3D6 ble klonet på analog måte som VH-regionen. I det første forsøk ble et konsensus primer-sett utformet for amplifisering av murine VL-regioner som følger: 5'-primere (DNA #3806-3816) ble utformet for å hybridisere til VL-regionen omfattende translasjons-initieringskodon og en 3'-primer (DNA#3817) var spesifikk for den murine Ck-region nedstrøms for den V-J sammenbindende region. DNA-sekvensanalyse av PCR-fragmentet, så vel som uavhengig avledede kloner isolert ved anvendelse av dette konsensus lettkjede primer-sett, viste at det oppnådde cDNA var avledet fra et ikke-funksjonelt rearrangert bud ettersom sekvensen inneholdt en rammeskift mutasjon mellom V-J region- tilknytningen.
I et andre forsøk ble 5'RACE anvendt for å klone et andre VL-kodende cDNA. DNA-sekvensanalyse av dette produktet (konsensus 11) viste at det kodet for funksjonell mRNA. Således kan det konkluderes med at sekvensen koder for den korrekte 3D6 lettkjede mRNA. Nukleotid- (SEKV ID NR:1) og aminosyre-sekvens (SEKV ID NR:2) av VL-regionen av 3D6 er angitt i henholdsvis Tabell 9B og i Figur 1.
Fra N-terminal til C-terminal, omfatter både lett- og tung-kjeder domenene FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 og FR4. Angivelsen av aminosyrer til hvert domene er i henhold til nummereringskonvensjonen til Kabat et al., ovenfor.
Ekspresjon av kimært 3D6 antistoff: De variable tung- og lettkjede regioner ble rekonstruert til å kode for spleise donorsekvenser nedstrøms for de respektive
VDJ- eller VJ-tilknytningene og klonet inn i pattedyr ekspresjonsvektor pCMV-hy1 for tungkjeden og pCMV-hic1 for lettkjeden. Disse vektorer koder for humane y1 og Ck konstante regioner som exoniske fragmenter nedstrøms for den innsatte variable region-kasett. Etter sekvens-verifisering, ble tungkjede og lettkjede ekspresjonsvektorene co-transfektert inn i COS-celler. To forskjellige tungkjede-kloner (H2,2 & H3,2) ble uavhengig co-transfektert med 3 forskjellige kimære lettkjede-kloner (L3, L4, &L10) for å bekrefte reproduserbarhet av resultatet. En kimær 21,6 antistoff-transfeksjon ble utført som en positiv kontroll for vektorene. Kondisjonert media ble oppsamlet 48 timer etter transfeksjon og undersøkt ved Western blot analyse for antistoff-produksjon eller ELISA for Ap-binding.
De multiple transfektantene uttrykte alle tungkjede + lettkjede kombinasjoner som blir gjenkjent av et geit anti-human IgG (H+L) antistoff ved Western blot.
Direkte binding av 3D6 og kimær 3D6 (PK1614) antistoffer til Ap ble testet ved ELISA-analyse. Kimær 3D6 ble funnet å binde til Ap med høy villighet, lignende den demonstrert med 3D6 (Figur 3A). Videre viste et ELISA-basert kompetitivt hemningsforsøk at kimært 3D6 og murint 3D6 antistoff konkurrerte likt med biotinylert-3D6-binding til Ap (Figur 3B). Det kimære antistoffet viste bindingsegenskaper som ikke kunne skilles fra 3D6 referanseprøven.
Videre var både 3D6 og PK1614 effektive for utskilling av Ap-plaque. Ex wVo-forsøket demonstrerer at ettersom konsentrasjonen av antistoff øker, reduseres mengden av Ap på lignende måte for både murine og kimære 3D6 antistoffer. Således kan det konkluderes med at sekvensene koder for henholdsvis funksjonell 3D6 tungkjede og lettkjede.
Eksempel VII. 3D6 humanisering
Homologi/ molekylær modellering. For å identifisere nøkkel strukturelle rammeverkrester i murint 3D6 antistoff, ble en tredimensjonal modell dannet basert på de nærmeste murine antistoffer for tung- og lett-kjedene. For dette formål ble et antistoff betegnet 1CR9 valgt som templat for modellering av 3D6 lettkjede (PDB ID: 1CR9, Kanyo et al., ovenfor) og et antistoff betegnet 10PG ble valgt som templat for modellering av tungkjeden. (PDB ID: 10PG Kodandapani et al., ovenfor). (Se også Tabell 1.) Aminosyresekvensoppstilling av 3D6 med lettkjeden og tungkjeden av disse antistoffer viste at, med unntak av CDR3 av tungkjeden, hadde 1CR9 og 10PG antistoffer betydelig sekvenshomologi med 3D6. I tillegg faller CDR-løkkene av de valgte antistoffer inn i samme kanoniske Chotia strukturelle klasser som CDR-løkkene av 3D6, igjen bortsett fra CDR3 av tungkjeden. Derfor ble 1CR9 og 10PG initielt valgt som antistoffer med løst struktur for homologi-modellering av 3D6.
En første omgang homologimodell av 3D6 variabel region basert på antistoffene angitt ovenfor ble konstruert ved anvendelse av Look & SegMod Modules GeneMine (v3.5) programvarepakke. Denne programvaren ble kjøpt under en evigvarende lisens fra Molecular Applications Group (Palo Alto, CA). Denne programvarepakke, skapt av Dr. Michael Levitt og Chris Lee, letter fremgangsmåten for molekylær modellering ved automatisering av trinnene involvert i strukturell modellering av en primær sekvens på en templat av kjent struktur basert på sekvenshomologi. Ved å arbeide på en Silicon Graphics IRIS arbeidsstasjon i et UNIX-miljø, blir den modellerte struktur automatisk forbedret ved en serie av energi-minimaliseringstrinn for å avhjelpe ufordelaktige atom-kontakter og optimalisere elektrostatiske og van der Waals interaksjoner.
En ytterligere forbedret modell ble konstruert ved anvendelse av modelleringskapasiteten til Quanta®. Et søk i PDB database med CDR3 av tungkjeden av 3D6 identifiserte 1qkz som mest homolog og som har identisk antall av rester som 3D6. Således ble CDR3 av tungkjeden av 3D6 modellert ved anvendelse av krystallstrukturen av 1qkz som templat, a-karbon-ryggrad-sporet for 3D6 modell er vist i Figur 4. VH-domenet er vist som en stiplet linje og VL-domenet er vist som en fast linje og CDR-løkker er angitt i båndform.
Seleksjon av humane akseptor antistoff- sekvenser. Egnede humane akseptor antistoff-sekvenser ble identifisert ved data-sammenligninger av aminosyresekvensene av mus variable regioner med sekvensene av kjente humane antistoffer. Sammenligningen ble utført separat for 3D6 tung- og lett-kjeder. Spesielt ble variable domener fra humane antistoffer hvis rammeverk-sekvenser viste en høy grad av sekvensidentitet med murine VL- og VH-rammeverk-regioner identifisert ved søk i Kabat Database ved anvendelse av NCBI BLAST (offentlig tilgjengelig gjennom National Institutes of Health NCBI internet-server) med de respektive murine rammeverk-sekvenser.
To kandidat-sekvenser ble valgt som akseptor-sekvenser basert på de følgende kriterier: (1) homologi med den aktuelle sekvens; (2) har kanoniske CDR-strukturer med donor-sekvensen; og (3) ikke inneholdende noen sjeldne aminosyrerester i rammeverk-regionene. Den valgte akseptor-sekvens for VL er Kabat ID Nummer (KABID) 019230 (Genbank aksesjonsnummer S40342) og for VH er KABID 045919 (Genbank aksesjonsnummer AF115110). Første versjoner av humanisert 3D6 antistoff anvender disse valgte akseptor antistoff-sekvenser.
Substitusjon av aminosyrerester. Som angitt ovenfor omfatter de humaniserte antistoffer ifølge foreliggende oppfinnelse variable rammeverk-regioner hovedsakelig fra et humant immunoglobulin (akseptor-immunoglobulin) og komplementaritetsbestemmende regioner hovedsakelig fra mus-immunoglobulin (donor-immunoglobulin) betegnet 3D6. Etter å ha identifisert de komplementaritetsbestemmende regioner av 3D6 og passende humane akseptor-immunoglobuliner, var neste trinn å bestemme hvilke, hvis noen, rester av disse komponenter skal substitueres for å optimalisere egenskapene til det resulterende humaniserte antistoff. Kriteriene beskrevet ovenfor ble anvendt for å velge rester for substitusjon.
Figurer 1 og 2 viser oppstillinger av henholdsvis den opprinnelige murine 3D6 VL og VH, med den respektive versjon 1 av den humaniserte sekvens, den tilsvarende humane rammeverk-akseptorsekvens og endelig den humane kimlinje
V-regionsekvens som viser høyest homologi med den humane rammeverk-akseptorsekvens. De skraverte rester indikerer kanoniske (fast fyll), vernier (prikket linje), pakkende (fet) og sjeldne aminosyrer (fet kursiv) og er angitt på figuren. Stjernene indikerer rester tilbakemutert til murine rester i den humane akseptor-rammeverksekvens og CDR-regioner er vist overstreket. En oppsummering av endringene innført i versjon 1 av humanisert 3D6 VH og VL er presentert i Tabell 12.
Tabeller 13 og 14 angir Kabat nummereringsnøkler for henholdsvis de forskjellige lett- og tung-kjeder.
De humaniserte antistoffer viser fortrinnsvis en spesifikk bindingsaffinitet for Ap på minst IO<7>,108, 10<9>eller 10<10>M"<1>. Vanligvis er den øvre grensen for bindingsaffinitet av de humaniserte antistoffer for Ap innen en faktor på tre, fire eller fem av den til 3D6 (dvs.~10<9>M"<1>). Ofte er også den lavere grense for bindingsaffinitet innen en faktor på tre, fire eller fem av den til 3D6.
Sammensetning og ekspresjon av humanisert 3D6 VH og VL, Versjon 1 Kort angitt, for hver V-region, ble 4 store enkeltrådete overlappende oligonukleotider syntetisert. I tillegg ble 4 korte PCR-primere syntetisert for hver V-region for ytterligere å lette sammensetning av den spesielle V-region. DNA-sekvensene av oligonukleotidene anvendt for dette formål er vist i Tabell 15.
Den humaniserte lettkjede ble sammensatt ved anvendelse av PCR. DNA-sekvensanalyse av mer enn to dusin kloner avslørte spredte punktmutasjoner og delesjoner gjennom hele VL-regionen med hensyn til den forventede sekvens. Analyse av sekvensene viste at klon 2.3 var mottagelig for reparasjon av 2 nær spaced enkle nukleotid-delesjoner i den aminoterminale region. Således ble setedirigert mutagenese utført på klon pCRShum3D6v12.3 ved anvendelse av oligonukleotider for å innføre de 2 deleterte nukleotider og reparasjon av punktmutasjonene ble bekreftet ved DNA-sekvensanalyse og VL-insersjonen ble klonet inn i lettkjede ekspresjonsvektor pCMV-cK.
Sammensetning av humanisert VH ved anvendelse av PCR-baserte metoder resulterte i kloner med store delesjoner i 5' halvparten av sekvensen. Ytterligere anstrengelser for å optimalisere PCR-betingelsene møtte delvis suksess. Klonene sammensatt ved optimaliserte PCR-betingelser hadde fortsatt 10-20 nt delesjoner i regionen som karlegger overlapping av A+B fragmenter. Følgelig ble en alternativ strategi anvendt for VH-sammensetning ved anvendelse av DNA-polymerase- (T4, Klenow og Sequenase) mediert overlapping-utvidelse, fulgt av T4 DNA ligase for kovalent å samle de overlappende ender. DNA-sekvensanalyse av et subsett av klonene som er et resultat av VH-konstruksjonen ved anvendelse av den sistnevnte metode avslørte spredte punktmutasjoner og delesjoner blant klonene. Analyse av over to dusin kloner avslørte i det vesentlige samme mønster som illustrert for klonene. De lignende resultater observert etter første omgang sammensetning av VH- og VL-kloner indikerer at DNA-sekvensfeil var et resultat av automatisert syntetisator-feil under syntesen av de lange DNA anvendt for konstruksjonen.
Humanisert VH-klon 2.7 ble valgt for setedirigert mutagenese-mediert reparasjon av de 3 nukleotid-delesjoner den ble observert å inneholde.
Eksempel XIII: Karakterisering av humanisert 3D6v2- antistoff
En andre versjon av humanisert 3D6 ble dannet som har hver av substitusjonene angitt for versjon 1, bortsett fra D-> Y substitusjonen ved rest 1. Substitusjon ved denne rest ble utført i versjon 1 fordi resten ble identifisert som en CDR-interagerende rest. Imidlertid deleterte substitusjonen en rest som var sjelden for humane immunoglobuliner i den posisjon. Således ble en versjon dannet uten substitusjonen. Videre ble ikke-kimlinje rester i tungkjede rammeverkregioner substituert med kimlinje rester, nemlig H74 = S, H77 = T og H89 = V. Kabat-nummerering for versjon 2 lett- og tung-kjeder, er like som de vist i henholdsvis Tabeller 13 og 14, bortsett fra at rest 1 av versjon 2 lettkjede er asp
(D), rest 74 av tungkjeden er ser (S), rest 77 av tungkjeden er thr (T) og rest 89 av tungkjeden er val (V). Nukleotidsekvensen av humanisert 3D6 versjon 1 lett- og
tung-kjeder er angitt som henholdsvis SEKV ID NR: 34 og 36. Nukleotidsekvensen av humaniserte 3D6 versjon 2 lett- og tung-kjeder er angitt som henholdsvis SEKV ID NR: 35 og 37.
Eksempel IX: Funksjonell testing av humaniserte 3D6- antistoffer
Binding av humanisert 3D6v1 til aggregert Ap. Funksjonell testing av humanisert 3D6v1 ble utført ved anvendelse av kondisjonert media fra transient transfekterte COS-celler. Cellene ble transfektert med fullstendig kimært antistoff, en blanding av enten kimær tungkjede + humanisert lettkjede eller kimær lettkjede + humanisert tungkjede og til slutt, fullstendig humanisert antistoff. De kondisjonerte medier ble testet for binding til aggregert Api-42 ved ELISA-forsøk. Det humaniserte antistoff viste god aktivitet innen eksperimentell feil og viste bindingsegenskaper som ikke kunne skilles fra den kimære 3D6-referanseprøve. Resultatene er vist i Tabell 16.
For å sammenligne bindingsaffiniteter av humaniserte 3D6v1- og 3D6v2-antistoffer, ble ELISA-analyse utført ved anvendelse av aggregert Ap som antigen. Resultatene viser at både 3D6v1 (H1L1) og 3D6v2 (H2L2) har nesten identiske Ap-bindingsegenskaper (Figur 5).
Erstatning NET( rNET) analyse av h3D6v2. rNET epitopkart-forsøk tilveiebringer informasjon om bidraget av individuelle rester innen epitopen til den totale bindingsaktivitet til antistoffet. rNET analyse anvender syntetiserte systematiske enkle substituerte peptidanaloger. Binding av et antistoff som testes blir bestemt mot nativt peptid (nativt antigen) og mot 19 alternative "enkel-substituerte" peptider, hvor hvert peptid er substituert i en første posisjon med én av 19 ikke-native aminosyrer for den posisjon. En profil blir dannet som reflekterer effekten av substitusjon i den posisjon med de forskjellige ikke-native rester. Profiler blir likeledes dannet ved suksessive posisjoner langs det antigene peptid. Den samlede profil eller epitopkart, (som reflekterer substitusjon i hver posisjon med alle 19 ikke-native rester) kan deretter sammenlignes med et kart tilsvarende dannet for et andre antistoff. Hovedsakelig lignende eller identiske kart indikerer at antistoffer som blir sammenlignet har samme eller lignende epitop-spesifisitet.
Denne analyse ble utført med 3D6 og humanisert 3D6, versjon 2. Antistoffer ble testet for binding mot det native Ap-peptid DAEFRHDSGY (SEKV ID NR:33). Rester 1-8 ble systematisk substituert med hver av de 19 ikke-native rester for den posisjon. Kart ble følgelig dannet for 3D6 og h3D6v2. Resultatene er presentert i tabellform i Tabell 17.
Bemerkelsesverdig er profilene praktisk talt identiske for 3D6 og h3D6v2 når man ser på substitusjonene i hver posisjon (dvs. verdiene fluktuerer på en identisk måte ved sammenligning av dataene i kolonne 1 (3D6) mot kolonne 2 (h3D6v2). Disse data demonstrerer at spesifisiteten av h3D6v2 er bevart, ettersom h3D6v2 rNET epitop-kartet er praktisk talt identisk med m3D6 ved anvendelse av både Ap-rester 1-4 og 5-8.
Immunohistokjemi på PDAPP hjernesnitt demonstrerer spesifisitet av h3D6v1- antistoff. Humanisert 3D6v1 antistoff gjenkjente Ap i kryostat-fremstilte hjernesnitt fra PDAPP-mus. Humanisert 3D6v1 og PK1614 bandt begge til PDAPP plaque på samme doserespons-måte, som målt ved mengden av fluorescens (kvantifisert i pixler) pr. slide mot mengden av antistoff anvendt for å merke vevet (Figur 6). Identiske anti-humane sekundære antistoffer ble anvendt i dette forsøket. Seksjonering, merking og avbildnings-prosedyrer er tidligere beskrevet. I identisk forsøk viste bildeanalyse av h3D6v2-merking på PDAPP og AD hjernesnitt at h3D6v2 gjenkjenner Ap-plaque på lignende måte som 3D6v1 (f.eks. sterkt farget plaque).
Kompetitiv bindingsanalyse av h3D6. Evnen til h3D6 antistoffer v1 og v2 til å konkurrere med murin 3D6 ble målt ved ELISA ved anvendelse av et biotinylert 3D6 antistoff. Kompetitiv bindingsanalyse viste at h3D6v1, h3D6v2 og kimær PK1614 alle kan konkurrere med m3D6 for å binde Ap (Figur 7). h3D6v1 og h3D6v2 var identiske i deres evne til å konkurrere med 3D6 for Ap. 10D5 antistoff ble anvendt som en negativ kontroll, ettersom det har en forskjellig bindingsepitop enn 3D6. BIAcore analyse avslørte også høy affinitet av h3D6v1 og h3D6v2 for Ap (Tabell 18).
Sammenlignet med 3D6, som har en Kd på 0,88 nM, hadde både h3D6v1 og h3D6v2 ca. 2 til 3 ganger mindre bindingsaffinitet, målt ved 2,06 nM og 2,24 nM for henholdsvis h3D6v1 og h3D6v2. ELISA kompetitivt bindingsforsøk avslørte en omtrent 6 ganger mindre bindingsaffinitet for h3D6v1 og h3D6v2. Typisk taper humaniserte antistoffer ca. 3-4 ganger bindingsaffinitet sammenlignet med deres murine motstykker. Derfor er et tap av ca. 3 ganger (gjennomsnitt av ELISA- og BIAcore-resultater) for h3D6v1 og h3D6v2 innenfor det aksepterte område.
Ex vivo forsøk ved anvendelse av h3D6v2- antistoff. Evnen til h3D6v2 til å stimulere mikroglialceller ble testet gjennom et ex vivo fagocytose-forsøk (Figur 8). h3D6v2 var like effektiv som kimær 3D6 til å fremkalle fagocytose av Ap-aggregater fra PDAPP-musehjernevev. igG ble anvendt som en negativ kontroll i dette forsøket fordi det ikke er i stand til å binde-Ap og derfor ikke kan fremkalle fagocytose.
In vivo hjerne- lokalisering av h3D6.<125>l merket h3D6v2, m3D6 og antistoff DAE13 ble hver IV-injisert i 14 individuelle PDAPP-mus i separate forsøk. Musene ble avlivet etter dag 7 og perfusert for videre analyse. Deres hjerne-regioner ble dissekert og målt for<125>l aktivitet i spesifikke hjerne-regioner. Radioaktivt merket aktivitet i hjernen ble sammenlignet med aktivitet i serumprøver. Resultater er angitt i Tabeller 19 og 20, for henholdsvis serum- og hjerneregioner.
Dataene viser at h3D6v2 lokaliserte til hjernen og ble spesielt konsentrert i hippocampus-regionen hvor Ap er kjent for å aggregere. Hjerne-tellinger for m3D6 og DAE13 var sammenlignbare med h3D6v2. Alle tre antistoffer var i stand til å krysse blod-barrieren som demonstrert av Ap-plaque-binding in vivo.
Eksempel X. Kloning og sekvensering av mus 10D5 variable regioner
Kloning og sekvensanalyse av 10D5 VH. VH- og VL-regionene av 10D5 fra hybridomceller ble klonet ved RT-PCR ved anvendelse av 5' RACE-prosedyrer. Nukleotidsekvensen (SEKV ID NR:13) og utledet aminosyre-sekvens (SEKV ID NR: 14) avledet fra to uavhengige cDNA kloner som koder for det antatte 10D5 VL domene, er angitt i Tabell 21 og Figur 9. Nukleotidsekvensen (SEKV ID NR: 15) og utledet aminosyresekvens (SEKV ID NR:16) avledet fra to uavhengige cDNA kloner som koder for det antatte 10D5 VH-domene, er angitt i Tabell 22 og Figur
10. 10D5 VL- og VH-sekvenser møtte kriteriene for funksjonelle V-regioner så lenge de inneholder en påfølgende ORF fra initiatoren metionin til C-regionen og har konserverte rester karakteristiske for immunoglobulin V-regiongener.
Eksempel XI. Forebygging og behandling av humane individer
Et enkel-dose fase I forsøk blir utført for å bestemme sikkerhet for mennesker. Et terapeutisk middel blir administrert i økende doser til forskjellige pasienter ved å starte fra ca. 0,01 nivået av antatt effektivitet og øke med en faktor på tre inntil et nivå av ca. 10 ganger den effektive musedose blir oppnådd.
Et fase II forsøk blir utført for å bestemme terapeutisk effektivitet. Pasienter med tidlig til middels Alzheimers sykdom definert ved anvendelse av Alzheimers sykdom og relaterte lidelser assosiasjons- (ADRDA) kriterier for sannsynlig AD blir valgt. Egnede pasienter scorer i 12-26 området av Mini-Mental State Exam (MMSE). Andre seleksjonskriterier er at pasienter er sannsynlige å overleve varigheten av undersøkelsen og ikke har kompliserende faktorer så som anvendelse av ledsagende medikamenter som kan innvirke. Baselinje-bedømmelser av pasientfunksjon blir gjort ved anvendelse av klassiske psykometriske mål, så som MMSE og ADAS, som er en omfattende skala for evaluating av pasienter med Alzheimers sykdomsstatus og funksjon. Disse psykometriske skalaer gir et mål for progresjon av Alzheimers tilstand. Egnede kvalitative livsskalaer kan også anvendes for å overvåke behandling. Sykdomsprogresjon kan også overvåkes ved MRI. Blod-profiler fra pasienter kan også overvåkes ved forsøk med immunogen-spesifikke antistoffer og T-celle-responser.
Etter baselinje-målinger, begynner pasienter å motta behandling. De blir tilfeldig fordelt og behandlet med enten terapeutisk middel eller placebo på en blind måte. Pasienter blir overvåket minst hver seks måneder. Effektivitet blir bestemt ved en betydelig reduksjon i progresjon av en behandlingsgruppe i forhold til en placebo gruppe.
Et andre fase II forsøk blir utført for å bedømme omdannelse av pasienter fra ikke-Alzheimers sykdom tidlig hukommelsestap, noen ganger referert til som alders-assosiert hukommelsessvikt (AAMI) eller mild kognitiv svekkelse (MCI), til sannsynlig Alzheimers sykdom som definert ved ADRDA-kriterier. Pasienter med høy risiko for utvikling av Alzheimers sykdom blir valgt fra en ikke-klinisk populasjon ved screening av referanse-populasjoner for tidlige tegn på hukommelsestap eller andre vanskeligheter forbundet med pre-Alzheimer's symptomatologi, en familiehistorie av Alzheimers sykdom, genetiske risikofaktorer, alder, kjønn og andre trekk funnet å forutsi høy-risiko for Alzheimers sykdom. Baselinje-resultaterfor egnede mål omfattende MMSE og ADAS sammen med andre mål utformet for å bedømme en mer normal populasjon blir oppsamlet. Disse pasientpopulasjoner blir delt opp i egnede grupper med placebo-sammenligning mot doserings-alternativer av midlet. Disse pasientpopulasjoner blir fulgt med intervaller på ca. seks måneder og resultatet for hver pasient er hvorvidt eller ikke han eller hun utvikler sannsynlig Alzheimers sykdom som definert ved ADRDA-kriterier ved slutten av observasjonen.
Generelle materialer og metoder
A. Fremstilling av polyklonale og monoklonale AB- antistoffer
Det anti-Ap polyklonale antistoff ble fremstilt fra blod oppsamlet fra to grupper dyr. Den første gruppen besto av 100 Swiss Webster hunnmus, 6 til 8 uker gamle. De ble immunisert på dager 0, 15 og 29 med 100 ug AN1792 kombinert med CFA/IFA. En fjerde injeksjon ble gitt på dag 36 med halvparten av dosen av AN 1792. Blodet ble tappet fra dyrene etter avlivning på dag 42, serum ble fremstilt og sera ble samlet for å gi totalt 64 ml. Den andre gruppen besto av 24 hunnmus isogene med PDAPP-mus, men ikke-transgene for humant APP-gen, 6 til 9 uker gamle. De ble immunisert på dager 0, 14, 28 og 56 med 100ug AN 1792 kombinert med CFA/IFA. Disse dyrene ble også tappet for blod etter avlivning på dag 63, serum ble fremstilt og samlet til totalt 14 ml. De to porsjoner av sera ble samlet. Antistoff-fraksjonen ble renset ved anvendelse av to sekvensielle runder av utfelling med 50% mettet ammoniumsulfat. Det endelige presipitat ble dialysert mot PBS og testet for endotoksin. Nivået av endotoksin var mindre enn 1 EU/mg.
Anti-Ap monoklonale antistoffer ble fremstilt fra ascites-væske. Væsken ble først delipidert ved tilsetning av konsentrert natrium-dekstran-sulfat til is-kald ascitesvæske ved omrøring på is for å nå en endelig konsentrasjon på 0,238%. Konsentrert CaCb ble deretter tilsatt med omrøring for å nå en endelig konsentrasjon på 64 mM. Denne løsningen ble sentrifugert ved 10,000 x g og pelleten ble kastet. Supernatanten ble omrørt på is med et likt volum av mettet ammoniumsulfat tilsatt dråpevis. Løsningen ble sentrifugert igjen ved 10,000 x g og supernatanten ble kastet. Pelleten ble resuspendert og dialysert mot 20 mM Tris-HCI, 0,4 M NaCI, pH 7,5. Denne fraksjon ble påført på en Pharmacia FPLC Sepharose Q kolonne og eluert med en revers gradient fra 0,4 M til 0,275 M NaCI i 20 mM Tris-HCI, pH 7,5.
Antistofftoppen ble identifisert ved absorbans ved 280 nm og passende fraksjoner ble samlet. Det rensede antistoff-preparat blekarakterisert vedå måle proteinkonsentrasjonen ved anvendelse av BCA-metoden og renheten ved anvendelse av SDS-PAGE. Samlingen ble også testet for endotoksin. Nivået av endotoksin var mindre enn 1 EU/mg titere, titere mindre enn 100 ble skjønnsmessig tildelt en titerverdi på 25.
B. Måling av antistoff- titere
Mus ble tappet blod av ved å gjøre et lite snitt i halevenen og oppsamle ca. 200 \ i\ blod i et mikrofugerør. Marsvin ble tappet blod av ved først å barbere bakre haseområde og deretter ved anvendelse av en 18 gauge nål å snitte metatarsal-venen og oppsamle blodet i mikrofugerør. Blod fikk størkne i én time ved romtemperatur (RT), ble virvlet, og deretter sentrifugert ved 14,000 x g i 10 min. for å separere koagelet fra serum. Serum ble deretter overført til et rent mikrofugerør og lagret ved 4°C inntil titrering.
Antistoff-titere ble målt ved ELISA. 96-brønn mikrotiterplater (Costar EIA-plater) ble belagt med 100 ul av en løsning inneholdende 10ug/ml av enten A042 eller SAPP eller andre antigener som angitt i hver av de individuelle rapporter i Well Coating Buffer (0,1 M natriumfosfat, pH 8,5, 0,1% natriumazid) og holdt natten over ved romtemperatur. Brønnene ble aspirert og sera ble satt til brønnene ved å starte med en 1/100 fortynning i Specimen Diluent (0,014 M natriumfosfat, pH 7,4, 0,15 M NaCI, 0,6% bovint serumalbumin, 0,05% thimerosal). Syv serie-fortynninger av prøvene ble utført direkte i platene i tre ganger trinn for å nå en endelig fortynning på 1/218,700. Fortynningene ble inkubert i de belagte plate-brønner i én time ved romtemperatur. Platene ble deretter vasket fire ganger med PBS inneholdende 0,05% Tween 20. Det andre antistoff, geit anti-mus lg konjugert til pepperrot-peroksydase (oppnådd fra Boehringer Mannheim), ble satt til brønnene som 100 ul av en 1/3000 fortynning i Specimen Diluent og inkubert i én time ved romtemperatur. Plater ble igjen vasket fire ganger i PBS, Tween 20. For å utvikle kromogenet ble 100 ul av Slow TMB (3,3',5,5'-tetrametyl-benzidin anskaffet fra Pierce Chemicals) satt til hver brønn og inkubert i 15 min. ved romtemperatur. Reaksjonen ble stanset ved tilsetning av 25 ul 2 M H2SO4. Fargeintensiteten ble deretter lest på Molecular Devices Vmaks ved (450 nm - 650 nm).
Titere ble definert som resiprokverdien av fortynningen av serum som gir en halv maksimal OD. Maksimal OD ble generelt tatt fra en innledende 1/100 fortynning, bortsett fra i tilfeller med meget høye titere, i hvilket tilfelle en høyere innledende fortynning var nødvendig for å etablere maksimal OD. Hvis 50% punktet falt mellom to fortynninger ble en lineær ekstrapolering utført for å beregne den endelige titer. For å beregne geometrisk middel av antistoff-titere, ble titere mindre enn 100 skjønnsmessig gitt en titer-verdi på 25.
C. Hiernevev- preparering
Etter eutanasi ble hjernene fjernet og én hemisfære ble preparert for immunohistokjemisk analyse, mens tre hjerneregioner (hippocampus, cortex og cerebellum) ble dissekert fra den andre hemisfære og anvendt for å måle konsentrasjonen av forskjellige Ap-proteiner og APP-former ved anvendelse av spesifikk ELISA (Johnson-Wood et al., ovenfor).
Vev bestemt for ELISA ble homogenisert i 10 volumer av iskald guanidin-buffer (5,0 M guanidin-HCI, 50 mM Tris-HCI, pH 8,0). Homogenatene ble blandet ved forsiktig agitering ved anvendelse av en Adams Nutator (Fisher) i tre til fire timer ved romtemperatur, og deretter lagret ved -20°C før kvantifisering av Ap og APP. Tidligere forsøk hadde vist at analyttene var stabile under denne lagringsbetingelse og at syntetisk Ap-protein (Bachem) kunne bli kvantitativt gjenvunnet når tilsatt til homogenater av kontrollhjernevev fra samme musekull (Johnson-Wood et al., ovenfor).
D. Måling av AB- nivåer
Hjernehomogenatene ble fortynnet 1:10 med iskald Casein Diluent (0,25% casein, PBS, 0,05% natriumazid, 20 ug/ml aprotinin, 5 mM EDTA pH 8,0, 10 ug/ml leupeptin) og deretter sentrifugert ved 16,000 x g i 20 min. ved 4°C. Syntetiske Ap-protein-standarder (1-42 aminosyrer) og APP-standarder ble fremstilt for å omfatte 0,5 M guanidin og 0,1% bovint serumalbumin (BSA) i det endelige preparat. Den "totale" Ap sandwich-ELISA anvender monoklonalt antistoff monoklonalt antistoff 266, spesifikt for aminosyrer 13-28 av Ap (Seubert et al., ovenfor), som oppfangingsantistoff og biotinylert monoklonalt antistoff 3D6, spesifikt for aminosyrer 1-5 av Ap (Johnson-Wood et al.,ovenfor), som rapportør-antistoff. 3D6 monoklonalt antistoff gjenkjenner ikke utskilt APP eller full-lengde APP, men detekterer bare Ap-arter med en amino-terminal asparaginsyre. Dette forsøket har en nedre grense for sensitivitet på -50 ng/ml (11 nM) og viser ingen kryss-reaktivitet til det endogene murine Ap-protein i konsentrasjoner opptil 1 ng/ml (Johnson-Wood et al., ovenfor).
Api-42 spesifikk sandwich ELISA anvender mAp 21F12, spesifikk for aminosyrer 33-42 av Ap (Johnson-Wood, et al. ovenfor), som oppfangings-antistoff. Biotinylert mAp 3D6 er også rapportør-antistoff i dette forsøket som har en nedre grense for sensitivitet på ca. 125ug/ml (28^M, Johnson-Wood et al., ovenfor). For Ap ELISA ble 100^l av enten mAp 266 (med 10^g/ml) eller mAp 21F12 med (5ug/ml) belagt i brønnene av 96-brønn immunoassay-plater (Costar) med inkubering natten over ved romtemperatur. Løsningen ble fjernet ved aspirering og brønnene ble blokkert ved tilsetning av 200 jxl av 0,25% humant serumalbumin i PBS-buffer i minst 1 time ved romtemperatur. Blokkeringsløsningen ble fjernet og platene ble lagret under tørking ved 4°C inntil anvendelse. Platene ble rehydrert med vaskebuffer [Tris-bufret saltvann (0,15 M NaCI, 0,01 M Tris-HCI, pH 7,5), pluss 0,05% Tween 20] før anvendelse. Prøvene og standardene ble tilsatt in triplo aliquoter av 100 ul pr. brønn og deretter inkubert natten over ved 4° C. Platene ble vasket minst tre ganger med vaskebuffer mellom hvert trinn av forsøket. Biotinylert mAp 3D6, fortynnet til 0,5 ug/ml i Casein Assay Buffer (0,25% casein, PBS, 0,05% Tween 20, pH 7,4) ble tilsatt og inkubert i brønnene i 1 time ved romtemperatur. Et avidin-pepperrot-peroksydase-konjugat, (Avidin-HRP oppnådd fra Vector, Burlingame, CA), fortynnet 1:4000 i Casein Assay Buffer, ble satt til brønnene i 1 time ved romtemperatur. Det kolorimetriske substrat, Slow TMB-ELISA (Pierce), ble tilsatt og fikk reagere i 15 minutter ved romtemperatur, hvoretter den enzymatiske reaksjon ble stanset ved tilsetning av 25 \ i\ 2N H2SO4. Reaksjonsproduktet ble kvantifisert ved anvendelse av en Molecular Devices Vmaks som måler forskjellen i absorbans ved 450 nm og 650 nm.
E. Måling av APP- nivåer
To forskjellige APP-forsøk ble anvendt. Det første, betegnet APP-a/FL, gjenkjenner både APP-alfa (a) og full-lengde (FL) former av APP. Det andre forsøk er spesifikt for APP-a. APP-a /FL forsøket gjenkjenner utskilt APP omfattende de første 12 aminosyrer av Ap. Siden rapportør-antistoffet (2H3) ikke er spesifikt for a-clip-setet, som forekommer mellom aminosyrer 612-613 av APP<695>(Esch et al., Science 248:1122-1124 (1990)); gjenkjenner dette forsøket også full-lengde APP (APP-FL). Preliminære forsøk ved anvendelse av immobiliserte APP-antistoffer til den cytoplasmatiske hale av APP-FL for å tappe hjernehomogenater for APP-FL indikerer at omtrent 30-40% av APP-a /FL APP er FL (data ikke vist). Oppfangings-antistoff for både APP-a/FL og APP-a forsøk er mAb 8E5, fremkalt mot aminosyrer 444 til 592 av APP<695->formen (Games et al., ovenfor). Rapportør mAb for AP P-a/F L-forsøket er mAb 2H3, spesifikt for aminosyrer 597-608 av APP<695>(Johnson-Wood et al., ovenfor) og rapportør-antistoffet for APP-a-forsøket er et biotinylert derivat av mAb 16H9, fremkalt mot aminosyrer 605 til 611 av APP. Den nedre grense for sensitivitet av APP-aFL-forsøket er ca. 11 ng/ml (150 pM) (Johnson-Wood et al.) og den for det APP-a-spesifikke forsøket er 22 ng/ml (0,3 nM). For begge APP-forsøk ble mAb 8E5 belagt på brønnene av 96-brønn EIA-plater som beskrevet ovenfor for mAb 266. Renset, rekombinant utskilt APP-a ble anvendt som referanse-standard for APP-a-forsøket og APP-a/FL-forsøket (Esch et al., ovenfor). Hjerne-homogenatprøver i 5 M guanidin ble fortynnet 1:10 i ELISA Specimen Diluent (0,014 M fosfatbuffer, pH 7,4, 0,6% bovint serumalbumin, 0,05% thimerosal, 0,5 M NaCI, 0,1% NP40). De ble deretter fortynnet 1:4 i Specimen Diluent inneholdende 0,5 M guanidin. Fortynnede homogenater ble deretter sentrifugert ved 16,000 x g i 15 sekunder ved romtemperatur. APP-standarder og prøver ble satt til platen i duplikate aliquoter og inkubert i 1,5 timer ved romtemperatur. Det biotinylerte rapportør-antistoff 2H3 eller 16H9 ble inkubert med prøver i 1 time ved romtemperatur. Streptavidin-alkalisk fosfatase (Boehringer Mannheim) fortynnet 1:1000 i Specimen Diluent, ble inkubert i brønnene i 1 time ved romtemperatur. Det fluorescerende substrat 4-metyl-umbelliferyl-fosfat ble tilsatt for en 30 min. romtemperatur inkubering og platene ble lest på et Cytofluortm 2350 fluorimeter (Millipore) ved 365 nm eksitasjon og 450 nm emisjon.
F. Immunohistokiemi
Hjerner ble fiksert i tre dager ved 40°C i 4% paraformaldehyd i PBS og deretter lagret fra én til syv dager ved 4°C i 1 % paraformaldehyd, PBS inntil seksjonering. 40 mikron tykke ring-snitt ble kuttet på en vibratom ved romtemperatur og lagret i kryoprotektant (30% glycerol, 30% etylenglykol i fosfatbuffer) ved -20°C før immunohistokjemisk prosessering. For hver hjerne ble seks seksjoner på nivået av dorsal hippocampus, hver separert med påfølgende 240 \ im intervaller, inkubert natten over med én av de følgende antistoffer: (1) biotinylert anti-Ap (mAb, 3D6, spesifikt for human Ap) fortynnet til en konsentrasjon på 2 ug/ml i PBS og 1% hesteserum; eller (2) biotinylert mAb spesifikt for human APP, 8E5, fortynnet til en konsentrasjon på 3 ug/ml i PBS og 1,0% hesteserum; eller (3) mAb spesifikt for glialt fibrillært surt protein (GFAP; Sigma Chemical Co.) fortynnet 1:500 med 0,25% Triton X-100 og 1% hesteserum, i Tris-bufret saltvann, pH 7,4 (TBS); eller (4) mAb spesifikt for CD11 b, MAC-1 antigen, (Chemicon International) fortynnet 1:100 med 0,25% Triton X-100 og 1% kaninserum i TBS; eller (5) mAb spesifikk for MHC II antigen, (Pharmingen) fortynnet 1:100 med 0,25% Triton X-100 og 1% kanin-serum i TBS; eller (6) rotte mAb spesifikt for CD 43 (Pharmingen) fortynnet 1:100 med 1% kaninserum i PBS eller (7) rotte mAb spesifikt for CD 45RA (Pharmingen) fortynnet 1:100 med 1% kaninserum i PBS; eller (8) rotte monoklonalt Ap spesifikt for CD 45RB (Pharmingen) fortynnet 1:100 med 1% kanin-serum i PBS; eller (9) rotte monoklonalt Ap spesifikt for CD 45 (Pharmingen) fortynnet 1:100 med 1% kaninserum i PBS; eller (10) biotinylert polyklonalt hamster Ap spesifikt for CD3e (Pharmingen) fortynnet 1:100 med 1% kanin serum i PBS eller (11) rotte mAb spesifikt for CD3 (Serotec) fortynnet 1:200 med 1% kaninserum i PBS; eller (12) en løsning av PBS som mangler et primært antistoff inneholdende 1% normalt hesteserum.
Snittene reagert med antistoff-løsninger listet opp i 1,2 og 6-12 ovenfor ble forbehandlet med 1,0% Triton X-100, 0,4% hydrogenperoksyd i PBS i 20 min. ved romtemperatur for å blokkere endogen peroksydase. De ble deretter inkubert natten over ved 4°C med primært antistoff. Snittene omsatt med 3D6 eller 8E5 eller CD3e mAbs ble deretter omsatt i én time ved romtemperatur med et pepperrot peroksydase-avidin-biotin-kompleks med sett komponenter "A" og "B" fortynnet 1:75 i PBS (Vector Elite Standard Set, Vector Labs, Burlingame, CA.). Snitt reagert med antistoffer spesifikke for CD 45RA, CD 45RB, CD 45, CD3 og PBS-løsning som mangler primært antistoff ble inkubert i 1 time ved romtemperatur med henholdsvis biotinylert anti-rotte IgG (Vektor) fortynnet 1:75 i PBS eller biotinylert anti-mus IgG (Vector) fortynnet 1:75 i PBS. Snittene ble deretter omsatt i én time ved romtemperatur med et pepperrot peroksydase-avidin-biotin-kompleks med sett-komponenter "A" og "B" fortynnet 1:75 i PBS (Vector Elite Standard Set, Vector Labs, Burlingame, CA.).
Snittene ble utviklet i 0,01% hydrogenperoksyd, 0,05% 3,3'-diaminobenzidin (DAB) ved romtemperatur. Snittene bestemt for inkubering med GFAP-, MAC-1- OG MHC ll-spesifikke antistoffer ble forbehandlet med 0,6% hydrogenperoksyd ved romtemperatur for å blokkere endogen peroksydase og deretter inkubert natten over med det primære antistoff ved 4°C. Snittene reagert med GFAP-antistoff ble inkubert i 1 time ved romtempeartur med biotinylert anti-mus IgG laget i hest (Vector Laboratories; Vectastain Elite ABC Set) fortynnet 1:200 med TBS. Snittene ble deretter omsatt i én time med et avidin-biotin-peroksydase-kompleks (Vector Laboratories; Vectastain Elite ABC Set) fortynnet 1:1000 med TBS. Snittene inkubert med MAC-1-eller MHC ll-spesifikt monoklonalt antistoff som det primære antistoff ble deretter omsatt i 1 time ved romtemperatur med biotinylert anti-rotte IgG laget i kanin fortynnet 1:200 med TBS, fulgt av inkubering i én time med avidin-biotin-peroksydase-kompleks fortynnet 1:1000 med TBS. Snittene inkubert med GFAP-, MAC-1- og MHC ll-spesifikke antistoffer ble deretter visualisert ved behandling ved romtempeartur med 0,05% DAB, 0,01% hydrogenperoksyd, 0,04% nikkelklorid, TBS i henholdsvis 4 og 11 min.
Immunomerkede snitt ble montert på glass-objektglass (VWR, Superfrost slides), lufttørket natten over, dyppet i Propar (Anatech) og overdekket med dekkglass ved anvendelse av Permount (Fisher) som monteringsmedium.
For å motmerke Ap-plaque ble et subsett av GFAP-positive snitt montert på Superfrost objektglass og inkubert i vandig 1% Tioflavin S (Sigma) i 7 min. etter immunohistokjemisk prosessering. Snittene ble deretter dehydratisert og klaret i Propar, og deretter overdekket med dekkglass montert med Permount.
G. Bildeanalyse
Et Videometric 150 Image Analysis System (Oncor, Inc., Gaithersburg, MD) bundet til et Nikon Microphot-FX mikroskop gjennom et CCD videokamera og en Sony Trinitron monitor ble anvendt for kvantifisering av de immunoreaktive objektglass. Bildet av snittet ble lagret i en videobuffer og en farge- og metnings-basert terskel ble bestemt for å velge og beregne det totale pixel-område okkupert av de immunomerkede strukturer. For hvert snitt ble hippocampus manuelt skissert og det totale pixel-område okkupert av hippocampus ble beregnet. Prosent amyloid-byrde ble målt som: (fraksjonen av hippocampus-området inneholdende Ap-avsetninger immunoreaktive med mAb 3D6) x 100. Tilsvarende ble prosent neurittisk byrde målt som: (fraksjonen av hippocampus-område inneholdende dystrofiske neuritter reaktive med monoklonalt antistoff 8E5) x100. C-lmaging System (Compix, Inc., Cranberry Township, PA) som opererer Simple 32 Software Application program ble knyttet til et Nikon Microphot-FX mikroskop gjennom et Optronics kamera og anvendt for å kvantifisere prosentdelen av retrospenial cortex okkupert av GFAP-positive astrocytter og MAC-1-og MHC II-positive mikroglia. Bildet av det immunoreagerte snitt ble lagret i en videobuffer og en monokrom-basert terskel ble bestemt for å velge og beregne det totale pixel-område okkupert av immunomerkede celler. For hvert snitt ble retrosplenial cortex (RSC) manuelt skissert og det totale pixel-område okkupert av RSC ble beregnet. Prosent astrocytose ble definert som: (fraksjonen av RSC okkupert av GFAP-reaktive astrocytter) X 100. Tilsvarende ble prosent mikrogliose definert som: (fraksjonen av RSC okkupert av MAC-1- eller MHC ll-reaktive mikroglia) X 100. For alle bildeanalyser ble seks snitt på nivået av dorsal hippocampus, hver separert ved påfølgende 240 nm intervaller, kvantifisert for hvert dyr. I alle tilfeller var behandlingsstatusen for dyrene ukjent for observatøren.
Fra det foregående vil det være klart at det tilveiebringes flere anvendelser. For eksempel kan et hvilket som helst av antistoffene til Ap beskrevet ovenfor anvendes ved behandling, forebygging eller diagnose av amyloidogen sykdom eller ved fremstilling av et medikament eller diagnostisk preparat for anvendelse ved denne.
Claims (20)
1. Humanisert immunoglobulin som spesifikt binder beta-amyloid peptid (AB), eller antigenbindende fragment derav, hvor det humaniserte immunoglobulin eller antigenbindende fragment omfatter: (i) en lettkjede variabel region som omfatter
komplementaritetsbestemmende regioner (CDRer) og variabel lettkjede rammeverk-rester L2, L36 og L46 (Kabat nummereringskonvensjon) fra 3D6 immunoglobulin lettkjede variabel region sekvensen angitt som SEKV ID NR:2, hvor resten av lettkjede variabel regionen er fra en human akseptor immunoglobulin lettkjede valgt fra gruppen som består av Kabat ID 019230, Kabat ID 005131, Kabat ID 005058, Kabat ID 005057, Kabat ID 005059, Kabat ID U21040 og Kabat ID U41645; og (ii) en tungkjede variabel region som omfatter
komplementaritesbestemmende regioner (CDRer) og variabel region tungkjede rammeverk-rester H49, H93 og H94 (Kabat nummereringskonvensjon) fra 3D6 immunoglobulin tungkjede variabel region sekvensen angitt som SEKV ID NR:4 og variabel region tungkjede rammeverk-rester H74, H77 og H89 fra den humane kimlinjesekvensen VH3-23, hvor resten av tungkjede variabel regionen er fra en human akseptor immunoglobulin tungkjede valgt fra gruppen som består av Kabat ID 045919, Kabat ID 000459, Kabat ID 000553, Kabat ID 00386 og Kabat ID M23691.
2. Humanisert immunoglobulin eller antigenbindende fragment ifølge krav 1, hvor lettkjede CD Rene er vist som følger: lettkjede CDR1:
lettkjede CDR2:
og lettkjede CDR3:
3. Humanisert immunoglobulin eller antigenbindende fragment ifølge krav 1 eller 2, hvor tungkjede CDRene er vist som følger: tungkjede CDR1:
tungkjede CDR2: tungkjede CDR3: Tyr Asp His Tyr Ser Gly Ser Ser Asp Tyr (rester 99-108 i SEKV ID NR:4).
4. Humanisert immunoglobulin eller antigenbindende fragment ifølge hvilket som helst av de foregående krav, hvor den humane akseptor lettkjeden er Kabat ID 019230.
5. Humanisert immunoglobulin eller antigenbindende fragment ifølge hvilket som helst av de foregående krav, hvor den humane akseptor tungkjeden er Kabat ID 045919.
6. Humanisert immunoglobulin eller antigenbindende fragment ifølge hvilket som helst av de foregående krav, som (i) binder til både oppløselig beta-amyloid peptid (AB) og aggregert AB; (ii) medierer fagocytose av beta-amyloid peptid (AB); (iii) krysser blod-hjerne barrieren i et individ; eller (iv) reduserer beta-amyloid peptid (AB) byrden i et individ.
7. Humanisert immunoglobulin eller antigenbindende fragment ifølge hvilket som helst av de foregående krav, hvor tungkjede variabel region sekvensen er som angitt i rester ved 1-119 i SEKV ID NR:12.
8. Humanisert immunoglobulin eller antigenbindende fragment ifølge hvilket som helst av de foregående krav, hvor lettkjede variabel region sekvensen er som angitt ved rester 1-112 i SEKV ID NR:11.
9. Humanisert immunoglobulin eller antigenbindende fragment ifølge krav 1, hvor lettkjede variabel region sekvensen er som angitt ved rester 1-112 i SEKV ID NR:11 og tungekjede variabel region sekvensen er som angitt ved rester 1-119 i SEKV ID NR:12.
10. Humanisert immunoglobulin eller antigenbindende fragment ifølge hvilket som helst av de foregående krav, hvor det humaniserte immunoglobulin eller antigenbindende fragment har en konstant region avledet fra human IgGI eller human lgG4.
11. Antigenbindende fragment følge hvilket som helst av de foregående krav, hvor nevnte antigenbindende fragment er et Fab, et Fab', et Fabc, et Fv, et F(ab)'2 fragment eller et enkeltkjede antistoff.
12. Farmasøytisk preparat som omfatter immunoglobulinet eller det antigenbindende fragment ifølge krav 1-11 og en farmasøytisk bærer.
13. Humanisert immunoglobulin ifølge krav 1 -11 for anvendelse som et medikament.
14. Anvendelse av en effektiv dose av humanisert immunoglobulin eller antigenbindende fragment ifølge krav 1-11, for fremstilling av et medikament for å forebygge eller behandle en amyloidogen sykdom i en pasient.
15. Anvendelse ifølge krav 14, hvor den amyloidogene sykdom er Alzheimers sykdom.
16. Anvendelse ifølge krav 14 eller 15, hvor den effektive dosen er (i) fra 0,01 mg/kg kroppsvekt til 5 mg/kg kroppsvekt; (ii) omtrent 1 mg/kg kroppsvekt; (iii) 1 mg/kg til 10 mg/kg kroppsvekt; eller (iv) omtrent 10 mg/kg kroppsvekt.
17. Anvendelse ifølge krav 14-16, hvor immunoglobulinet er for administrering i multiple doser ved et doseintervall på omtrent to uker, omtrent en måned, 3 til 6 måneder eller omtrent 1 år.
18. Isolert nukleinsyremolekyl som koder for immunoglobulinet eller det antigenbindende fragment ifølge krav 1-11.
19. Isolert nukleinsyremolekyl ifølge krav 18, hvor nevnte nukleinsyremolekyl omfatter en nukleotidsekvens som angitt i SEKV ID NR:35 og SEKV ID NR:37.
20. Vektor som omfatter nukleinsyremolekylet ifølge krav 18 eller 19.
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US25189200P | 2000-12-06 | 2000-12-06 | |
PCT/US2001/046587 WO2002046237A2 (en) | 2000-12-06 | 2001-12-06 | Humanized antibodies that recognize beta amyloid peptide |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
NO20032549D0 NO20032549D0 (no) | 2003-06-05 |
NO20032549L NO20032549L (no) | 2003-08-05 |
NO339290B1 true NO339290B1 (no) | 2016-11-21 |
Family
ID=22953834
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
NO20032549A NO339290B1 (no) | 2000-12-06 | 2003-06-05 | Humanisert immunoglobulin som spesifikt binder beta-amyloid peptid (Aβ) eller antigenbindende fragment derav |
Country Status (39)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US7189819B2 (no) |
EP (2) | EP2045267A3 (no) |
JP (6) | JP4166569B2 (no) |
KR (2) | KR100996936B1 (no) |
CN (4) | CN101081868A (no) |
AR (1) | AR035402A1 (no) |
AT (1) | ATE414719T1 (no) |
AU (2) | AU2592102A (no) |
BG (1) | BG66292B1 (no) |
BR (1) | BR0115978A (no) |
CA (1) | CA2430772C (no) |
CY (1) | CY1108740T1 (no) |
CZ (1) | CZ20031601A3 (no) |
DE (1) | DE60136651D1 (no) |
DK (1) | DK1358213T3 (no) |
EA (2) | EA011450B1 (no) |
EC (1) | ECSP034685A (no) |
EE (1) | EE05309B1 (no) |
ES (1) | ES2317953T3 (no) |
GE (1) | GEP20084339B (no) |
HK (1) | HK1070904A1 (no) |
HR (1) | HRP20030547A8 (no) |
HU (1) | HU229681B1 (no) |
IL (2) | IL156030A0 (no) |
IS (1) | IS2620B (no) |
MX (1) | MXPA03005048A (no) |
MY (2) | MY163362A (no) |
NO (1) | NO339290B1 (no) |
NZ (3) | NZ526813A (no) |
PE (1) | PE20020574A1 (no) |
PL (1) | PL211761B1 (no) |
PT (1) | PT1358213E (no) |
SI (1) | SI1358213T1 (no) |
SK (1) | SK288209B6 (no) |
TW (1) | TWI255272B (no) |
UA (1) | UA87093C2 (no) |
UY (1) | UY27062A1 (no) |
WO (1) | WO2002046237A2 (no) |
ZA (1) | ZA200305169B (no) |
Families Citing this family (187)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US7964192B1 (en) | 1997-12-02 | 2011-06-21 | Janssen Alzheimer Immunotherapy | Prevention and treatment of amyloidgenic disease |
US6761888B1 (en) * | 2000-05-26 | 2004-07-13 | Neuralab Limited | Passive immunization treatment of Alzheimer's disease |
TWI239847B (en) | 1997-12-02 | 2005-09-21 | Elan Pharm Inc | N-terminal fragment of Abeta peptide and an adjuvant for preventing and treating amyloidogenic disease |
US7179892B2 (en) * | 2000-12-06 | 2007-02-20 | Neuralab Limited | Humanized antibodies that recognize beta amyloid peptide |
US6787523B1 (en) | 1997-12-02 | 2004-09-07 | Neuralab Limited | Prevention and treatment of amyloidogenic disease |
US6743427B1 (en) * | 1997-12-02 | 2004-06-01 | Neuralab Limited | Prevention and treatment of amyloidogenic disease |
US6913745B1 (en) * | 1997-12-02 | 2005-07-05 | Neuralab Limited | Passive immunization of Alzheimer's disease |
US7790856B2 (en) | 1998-04-07 | 2010-09-07 | Janssen Alzheimer Immunotherapy | Humanized antibodies that recognize beta amyloid peptide |
US20080050367A1 (en) * | 1998-04-07 | 2008-02-28 | Guriq Basi | Humanized antibodies that recognize beta amyloid peptide |
US20050059802A1 (en) * | 1998-04-07 | 2005-03-17 | Neuralab Ltd | Prevention and treatment of amyloidogenic disease |
US20030147882A1 (en) * | 1998-05-21 | 2003-08-07 | Alan Solomon | Methods for amyloid removal using anti-amyloid antibodies |
CZ306683B6 (cs) | 2000-02-24 | 2017-05-03 | Washington University | Léčivo pro prevenci nebo léčení preklinické nebo klinické Alzheimerovy nemoci |
US7700751B2 (en) | 2000-12-06 | 2010-04-20 | Janssen Alzheimer Immunotherapy | Humanized antibodies that recognize β-amyloid peptide |
PE20020574A1 (es) * | 2000-12-06 | 2002-07-02 | Wyeth Corp | Anticuerpos humanizados que reconocen el peptido amiloideo beta |
WO2002088307A2 (en) | 2001-04-30 | 2002-11-07 | Eli Lilly And Company | Humanized antibodies |
EP1385545B1 (en) * | 2001-04-30 | 2009-01-07 | Eli Lilly And Company | Humanized antibodies recognizing the beta-amyloid peptide |
DE60226036T9 (de) † | 2001-08-03 | 2016-09-29 | Medical & Biological Laboratories Co., Ltd. | ANTIKÖRPER, DER DAS GM1-GANGLIOSID-GEBUNDENE AMYLOID-b-PROTEIN ERKENNT, UND DNA, DIE FÜR DIESEN ANTIKÖRPER CODIERT |
CA2452104A1 (en) * | 2001-08-17 | 2003-02-27 | Eli Lilly And Company | Use of antibodies having high affinity for soluble ass to treat conditions and diseases related to ass |
US7771722B2 (en) | 2001-08-17 | 2010-08-10 | Eli Lilly And Company | Assay method for alzheimer's disease |
US7521053B2 (en) | 2001-10-11 | 2009-04-21 | Amgen Inc. | Angiopoietin-2 specific binding agents |
US7658924B2 (en) | 2001-10-11 | 2010-02-09 | Amgen Inc. | Angiopoietin-2 specific binding agents |
AR038568A1 (es) | 2002-02-20 | 2005-01-19 | Hoffmann La Roche | Anticuerpos anti-a beta y su uso |
MY139983A (en) * | 2002-03-12 | 2009-11-30 | Janssen Alzheimer Immunotherap | Humanized antibodies that recognize beta amyloid peptide |
GB2392792B (en) * | 2002-09-07 | 2004-12-15 | Matsushita Electric Ind Co Ltd | Improvements to television and radio programme control |
TW200509968A (en) * | 2002-11-01 | 2005-03-16 | Elan Pharm Inc | Prevention and treatment of synucleinopathic disease |
US8506959B2 (en) | 2002-11-01 | 2013-08-13 | Neotope Biosciences Limited | Prevention and treatment of synucleinopathic and amyloidogenic disease |
US9034337B2 (en) * | 2003-10-31 | 2015-05-19 | Prothena Biosciences Limited | Treatment and delay of outset of synucleinopathic and amyloidogenic disease |
US8697082B2 (en) * | 2002-11-01 | 2014-04-15 | Neotope Biosciences Limited | Prevention and treatment of synucleinopathic and amyloidogenic disease |
US20080014194A1 (en) * | 2003-10-31 | 2008-01-17 | Elan Pharmaceuticals, Inc. | Prevention and Treatment of Synucleinopathic and Amyloidogenic Disease |
GB0300571D0 (en) * | 2003-01-10 | 2003-02-12 | Imp College Innovations Ltd | Modification of feeding behaviour |
DE10303974A1 (de) | 2003-01-31 | 2004-08-05 | Abbott Gmbh & Co. Kg | Amyloid-β(1-42)-Oligomere, Verfahren zu deren Herstellung und deren Verwendung |
CN1745175A (zh) * | 2003-02-01 | 2006-03-08 | 神经实验室有限公司 | 自动免疫产生针对可溶性A-β的抗体 |
ES2344645T3 (es) | 2003-02-10 | 2010-09-02 | Applied Molecular Evolution, Inc. | Moleculas de union al abeta. |
KR20060054174A (ko) * | 2003-03-28 | 2006-05-22 | 센토코 인코포레이티드 | 항-아밀로이드 항체, 조성물, 방법 및 용도 |
US7732162B2 (en) | 2003-05-05 | 2010-06-08 | Probiodrug Ag | Inhibitors of glutaminyl cyclase for treating neurodegenerative diseases |
US7358331B2 (en) | 2003-05-19 | 2008-04-15 | Elan Pharmaceuticals, Inc. | Truncated fragments of alpha-synuclein in Lewy body disease |
EP1480041A1 (en) * | 2003-05-22 | 2004-11-24 | Innogenetics N.V. | Method for the prediction, diagnosis and differential diagnosis of Alzheimer's disease |
TWI306458B (en) * | 2003-05-30 | 2009-02-21 | Elan Pharma Int Ltd | Humanized antibodies that recognize beta amyloid peptide |
CN102276717B (zh) | 2003-10-27 | 2015-09-09 | 惠氏公司 | 使用羟磷灰石层析除去高分子量聚集体 |
US7674599B2 (en) | 2003-11-08 | 2010-03-09 | Elan Pharmaceuticals, Inc. | Methods of using antibodies to detect alpha-synuclein in fluid samples |
WO2005047324A2 (en) * | 2003-11-10 | 2005-05-26 | Schering Corp | ANTI-INTERLEUKIN ANTIBODY-10 |
UA93181C2 (ru) * | 2004-02-23 | 2011-01-25 | Эли Лилли Энд Компани | СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИТЕЛА K Ab ПЕПТИДУ |
US20050225165A1 (en) * | 2004-04-13 | 2005-10-13 | Naik Sanjeev M | Brake by-wire control system |
AT500483B1 (de) * | 2004-07-13 | 2006-01-15 | Mattner Frank Dr | Set zur vorbeugung oder behandlung der alzheimer'schen erkrankung |
US7807165B2 (en) * | 2004-07-30 | 2010-10-05 | Rinat Neuroscience Corp. | Antibodies directed against amyloid-beta peptide and methods using same |
MX2007001679A (es) | 2004-08-09 | 2007-05-23 | Elan Pharm Inc | Prevencion y tratamiento de la enfermedad sinucleinopatica y amiloidogenica. |
TWI374935B (en) * | 2004-08-27 | 2012-10-21 | Pfizer Ireland Pharmaceuticals | Production of α-abeta |
TWI384069B (zh) | 2004-08-27 | 2013-02-01 | Pfizer Ireland Pharmaceuticals | 多胜肽之製法 |
US7300773B2 (en) | 2004-08-27 | 2007-11-27 | Wyeth Research Ireland Limited | Production of TNFR-Ig |
ZA200703561B (en) * | 2004-10-05 | 2009-09-30 | Wyeth Corp | Methods and compositions for improving recombinant protein production |
AR052051A1 (es) * | 2004-12-15 | 2007-02-28 | Neuralab Ltd | Anticuerpos ab humanizados usados en mejorar la cognicion |
TW200635608A (en) * | 2004-12-15 | 2006-10-16 | Neuralab Ltd | Aβ antibodies for use in improving cognition |
US7625560B2 (en) * | 2004-12-15 | 2009-12-01 | Janssen Alzheimer Immunotherapy | Humanized antibodies that recognize beta amyloid peptide |
CA2589860A1 (en) | 2005-01-24 | 2006-08-03 | Amgen Inc. | Humanized anti-amyloid antibody |
GT200600031A (es) | 2005-01-28 | 2006-08-29 | Formulacion anticuerpo anti a beta | |
JP2008528638A (ja) * | 2005-01-28 | 2008-07-31 | ワイス | ポリペプチドの安定化液体処方 |
MY148086A (en) | 2005-04-29 | 2013-02-28 | Rinat Neuroscience Corp | Antibodies directed against amyloid-beta peptide and methods using same |
ES2402650T3 (es) * | 2005-06-17 | 2013-05-07 | Janssen Alzheimer Immunotherapy | Métodos de purificación de anticuerpos anti A beta |
WO2007062088A1 (en) * | 2005-11-22 | 2007-05-31 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Antibody treatment of alzheimer's and related diseases |
DK1954718T3 (en) | 2005-11-30 | 2014-12-15 | Abbvie Inc | Anti-A-globulomer antibodies antigenbindingsgrupper thereof, corresponding hybridomas, nucleic acids, vectors, host cells, methods for producing said antibodies, |
EP1976877B2 (en) | 2005-11-30 | 2016-10-05 | AbbVie Inc. | Monoclonal antibodies against amyloid beta protein and uses thereof |
MX358175B (es) * | 2005-12-12 | 2018-08-08 | Ac Immune Sa | Anticuerpos monoclonales especificos 1-42 beta con propiedades terapeuticas. |
TWI382990B (zh) | 2005-12-12 | 2013-01-21 | Hoffmann La Roche | 可變區域抗體之糖化 |
US8784810B2 (en) | 2006-04-18 | 2014-07-22 | Janssen Alzheimer Immunotherapy | Treatment of amyloidogenic diseases |
WO2009017467A1 (en) | 2007-07-27 | 2009-02-05 | Elan Pharma International Limited | Treatment of amyloidogenic diseases |
EP2035448A4 (en) * | 2006-06-01 | 2010-11-03 | Elan Pharm Inc | NEUROACTIVE FRAGMENTS OF APP |
WO2008011348A2 (en) * | 2006-07-14 | 2008-01-24 | Ac Immune S.A. | Humanized antibody against amyloid beta |
MX2009003542A (es) * | 2006-10-12 | 2009-04-15 | Wyeth Corp | Metodos y composiciones con opalescencia reducida. |
US8188046B2 (en) | 2006-10-16 | 2012-05-29 | University Of South Florida | Amyloid beta peptides and methods of use |
US8455626B2 (en) | 2006-11-30 | 2013-06-04 | Abbott Laboratories | Aβ conformer selective anti-aβ globulomer monoclonal antibodies |
KR101735257B1 (ko) | 2007-01-05 | 2017-05-12 | 유니버시티 오브 취리히 | 질환 특이적 결합 분자 및 표적을 제공하는 방법 |
IL199534A (en) | 2007-01-05 | 2013-01-31 | Univ Zuerich | An isolated human antibody capable of detecting a neoepitope in a disease-related protein, a polynucleotide encoding an antibody, a vector containing the polynucleotide, a host cell containing the polynucleotide or vector, a preparation containing the antibody and related methods and uses. |
ES2535641T3 (es) | 2007-01-18 | 2015-05-13 | Eli Lilly & Company | Amiloide beta Fab pegilado |
ES2570182T3 (es) | 2007-02-23 | 2016-05-17 | Prothena Biosciences Ltd | Prevención y tratamiento de la enfermedad sinucleinopática y amiloidogénica |
US8147833B2 (en) * | 2007-02-23 | 2012-04-03 | Neotope Biosciences Limited | Prevention and treatment of synucleinopathic and amyloidogenic disease |
EP2583978B1 (en) | 2007-02-23 | 2016-04-06 | Prothena Biosciences Limited | Prevention and treatment of synucleinopathic and amyloidogenic disease |
EP2486928A1 (en) | 2007-02-27 | 2012-08-15 | Abbott GmbH & Co. KG | Method for the treatment of amyloidoses |
NZ579310A (en) | 2007-03-01 | 2012-03-30 | Probiodrug Ag | Use of glutaminyl cyclase inhibitors for the treatment of mild cognitive impairment and diagnostic purposes thereof |
US7618944B2 (en) * | 2007-03-01 | 2009-11-17 | Intezyne Technologies, Inc. | Encapsulated amyloid-beta peptides |
JP2011526240A (ja) * | 2007-04-18 | 2011-10-06 | ヤンセン アルツハイマー イミュノセラピー | 脳アミロイド血管症の予防および治療 |
EP2142514B1 (en) | 2007-04-18 | 2014-12-24 | Probiodrug AG | Thiourea derivatives as glutaminyl cyclase inhibitors |
US8003097B2 (en) | 2007-04-18 | 2011-08-23 | Janssen Alzheimer Immunotherapy | Treatment of cerebral amyloid angiopathy |
US7931899B2 (en) | 2007-05-14 | 2011-04-26 | Medtronic, Inc | Humanized anti-amyloid beta antibodies |
US8323654B2 (en) * | 2007-05-14 | 2012-12-04 | Medtronic, Inc. | Anti-amyloid beta antibodies conjugated to sialic acid-containing molecules |
WO2008141321A1 (en) | 2007-05-14 | 2008-11-20 | Medtronic, Inc. | Methods and device to neutralize soluble toxic agents in the brain |
WO2008146854A1 (ja) * | 2007-05-28 | 2008-12-04 | National Institute Of Advanced Industrial Science And Technology | 抗モータリン抗体のパラトープ及びエピトープ |
JP5142265B2 (ja) * | 2007-05-28 | 2013-02-13 | 独立行政法人産業技術総合研究所 | 抗モータリン抗体のパラトープ及びエピトープ |
US8048420B2 (en) | 2007-06-12 | 2011-11-01 | Ac Immune S.A. | Monoclonal antibody |
EP2170389B1 (en) * | 2007-06-12 | 2014-10-29 | AC Immune S.A. | Humanized antibodies to amyloid beta |
US8613923B2 (en) | 2007-06-12 | 2013-12-24 | Ac Immune S.A. | Monoclonal antibody |
ES2466916T3 (es) | 2007-06-27 | 2014-06-11 | Admune Therapeutics Llc | Complejos de IL-15 e IL-15R alfa y usos de los mismos |
GB0718737D0 (en) * | 2007-09-25 | 2007-11-07 | Glaxo Group Ltd | Antibodies |
CA2701793C (en) | 2007-10-05 | 2017-04-25 | Genentech, Inc. | Use of anti-amyloid beta antibody in ocular diseases |
JO3076B1 (ar) | 2007-10-17 | 2017-03-15 | Janssen Alzheimer Immunotherap | نظم العلاج المناعي المعتمد على حالة apoe |
WO2009057664A1 (ja) | 2007-10-29 | 2009-05-07 | Mitsubishi Chemical Corporation | 抗体及びその利用 |
KR101377535B1 (ko) | 2007-11-16 | 2014-03-27 | 더 락커펠러 유니버시티 | 원섬유 형태의 베타아밀로이드 단백질에 대해 특이적인 항체 |
WO2009070648A2 (en) * | 2007-11-27 | 2009-06-04 | Medtronic, Inc. | Humanized anti-amyloid beta antibodies |
US9217024B2 (en) | 2007-12-18 | 2015-12-22 | Acumen Pharmaceuticals, Inc. | ADDL receptor polypeptides, polynucleotides and host cells for recombinant production |
EP2261254A3 (en) * | 2007-12-21 | 2011-04-13 | Amgen, Inc | Anti-amyloid antibodies and uses thereof |
AU2015249034B2 (en) * | 2007-12-28 | 2017-07-27 | Prothena Biosciences Limited | Treatment and prophylaxis of amyloidosis |
JO2913B1 (en) | 2008-02-20 | 2015-09-15 | امجين إنك, | Antibodies directed towards angiopoietin-1 and angiopoietin-2 proteins and their uses |
WO2009149189A2 (en) | 2008-06-03 | 2009-12-10 | Abbott Laboratories | Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof |
EP3338796A1 (en) | 2008-07-21 | 2018-06-27 | Probiodrug AG | Diagnostic antibody assay |
US9067981B1 (en) | 2008-10-30 | 2015-06-30 | Janssen Sciences Ireland Uc | Hybrid amyloid-beta antibodies |
WO2010051360A1 (en) * | 2008-10-31 | 2010-05-06 | Wyeth Llc | Purification of acidic proteins using ceramic hydroxyapatite chromatography |
EP2356154A4 (en) * | 2008-11-06 | 2012-12-19 | Alexion Pharma Inc | DEVELOPMENT OF REDUCED IMMUNOGENICITY ANTIBODIES AND METHODS OF MANUFACTURING THEREOF |
EP2949666B1 (en) | 2008-12-19 | 2018-12-19 | Biogen International Neuroscience GmbH | Human anti-alpha-synuclein antibodies |
US8614297B2 (en) * | 2008-12-22 | 2013-12-24 | Hoffmann-La Roche Inc. | Anti-idiotype antibody against an antibody against the amyloid β peptide |
BRPI1012676A2 (pt) | 2009-04-01 | 2016-04-05 | Genentech Inc | anticorpos anti-fcrh5 e imunoconjugados e métodos de uso |
FR2945538B1 (fr) * | 2009-05-12 | 2014-12-26 | Sanofi Aventis | Anticorps humanises specifiques de la forme protofibrillaire du peptide beta-amyloide. |
JP5883384B2 (ja) | 2009-08-13 | 2016-03-15 | ザ ジョンズ ホプキンス ユニバーシティー | 免疫機能を調節する方法 |
GB0914691D0 (en) * | 2009-08-21 | 2009-09-30 | Lonza Biologics Plc | Immunoglobulin variants |
CA2772488C (en) | 2009-09-11 | 2018-04-17 | Probiodrug Ag | Heterocyclic derivatives as inhibitors of glutaminyl cyclase |
MX2012003198A (es) | 2009-10-23 | 2012-06-12 | Millennium Pharm Inc | Moleculas de anticuerpo anti-gcc y composiciones y metodos relacionados. |
KR101531949B1 (ko) | 2009-12-11 | 2015-06-26 | 아라클론 바이오테크, 에스.엘. | 아밀로이드 베타 펩티드의 개선된 검출 방법 및 시약 |
PE20130527A1 (es) | 2010-03-03 | 2013-05-09 | Boehringer Ingelheim Int | Polipeptidos de union a a-beta biparatopicos |
US9181233B2 (en) | 2010-03-03 | 2015-11-10 | Probiodrug Ag | Inhibitors of glutaminyl cyclase |
US8269019B2 (en) | 2010-03-10 | 2012-09-18 | Probiodrug Ag | Inhibitors |
CA2796339C (en) | 2010-04-15 | 2020-03-31 | Abbott Laboratories | Amyloid-beta binding proteins |
EP2560953B1 (en) | 2010-04-21 | 2016-01-06 | Probiodrug AG | Inhibitors of glutaminyl cyclase |
CN103179981B (zh) | 2010-07-30 | 2017-02-08 | Ac免疫有限公司 | 安全和功能性的人源化抗β‑淀粉样蛋白抗体 |
LT2601298T (lt) | 2010-08-02 | 2017-03-10 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Pelė, kuri gamina rišančius baltymus, apimančius vl domenus |
EP3252072A3 (en) | 2010-08-03 | 2018-03-14 | AbbVie Inc. | Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof |
US9062101B2 (en) | 2010-08-14 | 2015-06-23 | AbbVie Deutschland GmbH & Co. KG | Amyloid-beta binding proteins |
WO2012027570A2 (en) | 2010-08-26 | 2012-03-01 | Abbott Laboratories | Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof |
SG10201405135RA (en) | 2011-02-25 | 2014-10-30 | Regeneron Pharma | Adam6 mice |
JP6050264B2 (ja) | 2011-03-16 | 2016-12-21 | プロビオドルグ エージー | グルタミニルシクラーゼの阻害剤としてのベンゾイミダゾール誘導体 |
EP2511296A1 (en) | 2011-04-12 | 2012-10-17 | Araclón Biotech, S. L. | Antibody, kit and method for determination of amyloid peptides |
PT2723379T (pt) | 2011-06-23 | 2018-11-14 | Univ Of Zuerich | Moléculas de ligação anti-alfa-sinucleína |
EP3865581A1 (en) | 2011-08-05 | 2021-08-18 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Humanized universal light chain mice |
JP2012034697A (ja) * | 2011-09-16 | 2012-02-23 | Janssen Alzheimer Immunotherapy | βアミロイドペプチドを認識するヒト化抗体 |
HRP20220253T1 (hr) | 2011-10-17 | 2022-04-29 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Miševi s ograničenim teškim lancem imunoglobulina |
SI3378535T1 (sl) * | 2011-10-28 | 2023-04-28 | Prothena Biosciences Limited | Humanizirana protitelesa, ki prepoznajo alfa-sinuklein |
RU2761639C2 (ru) | 2011-12-20 | 2021-12-13 | Регенерон Фармасьютикалз, Инк. | Мыши с гуманизированной легкой цепью |
JP2015508994A (ja) | 2011-12-30 | 2015-03-26 | アッヴィ・インコーポレイテッド | Il−13および/またはil−17に対する二重可変ドメイン免疫グロブリン |
MX356800B (es) * | 2012-04-05 | 2018-06-13 | Ac Immune Sa | Anticuerpo tau humanizado. |
SI2841575T1 (sl) | 2012-04-27 | 2019-11-29 | Millennium Pharm Inc | Molekule anti-GCC protitelesa in uporaba le-teh za preskušanje dovzetnosti za GCC-ciljno terapijo |
RS59890B1 (sr) | 2012-06-12 | 2020-03-31 | Regeneron Pharma | Humanizovane nehumane životinje sa ograničenim lokusima imunoglobulinskog teškog lanca |
WO2014007982A2 (en) * | 2012-07-03 | 2014-01-09 | Janssen Alzheimer Immunotherapy | C-terminal and central epitope a-beta antibodies |
UA118441C2 (uk) | 2012-10-08 | 2019-01-25 | Протена Біосаєнсиз Лімітед | Антитіло, що розпізнає альфа-синуклеїн |
EP2914625A2 (en) | 2012-11-01 | 2015-09-09 | AbbVie Inc. | Anti-vegf/dll4 dual variable domain immunoglobulins and uses thereof |
WO2014130690A1 (en) | 2013-02-20 | 2014-08-28 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Non-human animals with modified immunoglobulin heavy chain sequences |
US9062108B2 (en) | 2013-03-15 | 2015-06-23 | Abbvie Inc. | Dual specific binding proteins directed against IL-1 and/or IL-17 |
WO2014189973A2 (en) | 2013-05-20 | 2014-11-27 | Genentech, Inc. | Anti-transferrin receptor antibodies and methods of use |
AR096687A1 (es) | 2013-06-24 | 2016-01-27 | Genentech Inc | Anticuerpos anti-fcrh5 |
US9850302B2 (en) | 2013-07-12 | 2017-12-26 | Prothena Biosciences Limited | Antibodies that recognize IAPP |
WO2015004633A1 (en) | 2013-07-12 | 2015-01-15 | Neotope Biosciences Limited | Antibodies that recognize islet-amyloid polypeptide (iapp) |
PL3083689T3 (pl) | 2013-12-17 | 2020-10-19 | Genentech, Inc. | Przeciwciała anty-CD3 i sposoby ich zastosowania |
EP3116906A1 (en) | 2014-03-12 | 2017-01-18 | Prothena Biosciences Limited | Anti-laminin4 antibodies specific for lg1-3 |
EP3116907A1 (en) | 2014-03-12 | 2017-01-18 | Prothena Biosciences Limited | Anti-laminin4 antibodies specific for lg4-5 |
ES2762640T3 (es) | 2014-03-21 | 2020-05-25 | Regeneron Pharma | Proteínas VL de unión a antígeno que exhiben diferentes características de unión |
MX2016012274A (es) | 2014-03-21 | 2017-05-23 | Regeneron Pharma | Animales no humanos que producen proteinas de union de dominio simple. |
WO2015155694A1 (en) | 2014-04-08 | 2015-10-15 | Prothena Biosciences Limited | Blood-brain barrier shuttles containing antibodies recognizing alpha-synuclein |
WO2015165961A1 (en) | 2014-04-29 | 2015-11-05 | Affiris Ag | Treatment and prevention of alzheimer's disease (ad) |
US20160002343A1 (en) | 2014-06-11 | 2016-01-07 | Abbvie Inc. | Blood-brain barrier (bbb) penetrating dual specific binding proteins for treating brain and neurological diseases |
US11008403B2 (en) | 2014-11-19 | 2021-05-18 | Genentech, Inc. | Anti-transferrin receptor / anti-BACE1 multispecific antibodies and methods of use |
JP6779876B2 (ja) | 2014-11-19 | 2020-11-04 | ジェネンテック, インコーポレイテッド | 抗トランスフェリン受容体抗体及びその使用方法 |
MA41115A (fr) | 2014-12-02 | 2017-10-10 | Biogen Int Neuroscience Gmbh | Procédé de traitement de la maladie d'alzheimer |
JP2018502840A (ja) | 2014-12-10 | 2018-02-01 | ジェネンテック, インコーポレイテッド | 血液脳関門受容体抗体及び使用方法 |
US10093733B2 (en) | 2014-12-11 | 2018-10-09 | Abbvie Inc. | LRP-8 binding dual variable domain immunoglobulin proteins |
TWI781507B (zh) | 2015-01-28 | 2022-10-21 | 愛爾蘭商普羅佘納生物科技有限公司 | 抗甲狀腺素運送蛋白抗體 |
TWI711631B (zh) | 2015-01-28 | 2020-12-01 | 愛爾蘭商普羅佘納生物科技有限公司 | 抗甲狀腺素運送蛋白抗體 |
TWI786505B (zh) | 2015-01-28 | 2022-12-11 | 愛爾蘭商普羅佘納生物科技有限公司 | 抗甲狀腺素運送蛋白抗體 |
CA2979702A1 (en) | 2015-03-19 | 2016-09-22 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Non-human animals that select for light chain variable regions that bind antigen |
US20160314288A1 (en) * | 2015-04-22 | 2016-10-27 | Qualcomm Incorporated | Method and apparatus for write restricted storage |
TW201710286A (zh) | 2015-06-15 | 2017-03-16 | 艾伯維有限公司 | 抗vegf、pdgf及/或其受體之結合蛋白 |
EP4299073A3 (en) | 2015-06-16 | 2024-03-27 | F. Hoffmann-La Roche AG | Humanized and affinity matured antibodies to fcrh5 and methods of use |
EP4074730A1 (en) | 2015-06-24 | 2022-10-19 | F. Hoffmann-La Roche AG | Anti-transferrin receptor antibodies with tailored affinity |
NZ741067A (en) | 2015-10-02 | 2023-07-28 | Hoffmann La Roche | Bispecific anti-human cd20/human transferrin receptor antibodies and methods of use |
AR106189A1 (es) | 2015-10-02 | 2017-12-20 | Hoffmann La Roche | ANTICUERPOS BIESPECÍFICOS CONTRA EL A-b HUMANO Y EL RECEPTOR DE TRANSFERRINA HUMANO Y MÉTODOS DE USO |
JP7452829B2 (ja) * | 2015-11-09 | 2024-03-19 | ザ・ユニバーシティ・オブ・ブリティッシュ・コロンビア | アミロイドベータのエピトープおよびそれに対する抗体 |
EP3374379A4 (en) | 2015-11-09 | 2019-05-15 | The University Of British Columbia | N-TERMINAL EPITOPES IN BETA-AMYLOID AND CONFORMATIONALLY SELECTIVE ANTIBODIES THEREOF |
EP3374381A4 (en) * | 2015-11-09 | 2019-05-15 | The University Of British Columbia | EPITAOPES IN THE CENTRAL REGION OF BETA-AMYLOID AND RELATED CONFORMATIONAL ANTIBODIES |
AU2017259039A1 (en) | 2016-05-02 | 2018-10-11 | Prothena Biosciences Limited | Antibodies recognizing tau |
WO2017191560A1 (en) | 2016-05-02 | 2017-11-09 | Prothena Biosciences Limited | Antibodies recognizing tau |
WO2018007922A2 (en) | 2016-07-02 | 2018-01-11 | Prothena Biosciences Limited | Anti-transthyretin antibodies |
JP7017013B2 (ja) | 2016-07-02 | 2022-02-08 | プロセナ バイオサイエンシーズ リミテッド | 抗トランスサイレチン抗体 |
EP3478715A2 (en) | 2016-07-02 | 2019-05-08 | Prothena Biosciences Limited | Anti-transthyretin antibodies |
US20180125920A1 (en) | 2016-11-09 | 2018-05-10 | The University Of British Columbia | Methods for preventing and treating A-beta oligomer-associated and/or -induced diseases and conditions |
CA3073066A1 (en) | 2017-08-22 | 2019-02-28 | Biogen Ma Inc. | Pharmaceutical compositions containing anti-beta amyloid antibodies |
PL3461819T3 (pl) | 2017-09-29 | 2020-11-30 | Probiodrug Ag | Inhibitory cyklazy glutaminylowej |
CA3115071A1 (en) | 2018-10-04 | 2020-04-09 | University Of Rochester | Improvement of glymphatic delivery by manipulating plasma osmolarity |
WO2020132230A2 (en) | 2018-12-20 | 2020-06-25 | Genentech, Inc. | Modified antibody fcs and methods of use |
SG11202108414UA (en) | 2019-03-03 | 2021-08-30 | Prothena Biosciences Ltd | Antibodies recognizing tau |
EP4185612A1 (en) | 2020-07-23 | 2023-05-31 | Othair Prothena Limited | Anti-abeta antibodies |
TW202300517A (zh) | 2021-03-12 | 2023-01-01 | 美商美國禮來大藥廠 | 抗類澱粉β抗體及其用途 |
WO2022251048A1 (en) | 2021-05-24 | 2022-12-01 | Eli Lilly And Company | Anti-amyloid beta antibodies and uses thereof |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5585089A (en) * | 1988-12-28 | 1996-12-17 | Protein Design Labs, Inc. | Humanized immunoglobulins |
WO2000072880A2 (en) * | 1999-05-28 | 2000-12-07 | Neuralab Limited | Prevention and treatment of amyloidogenic disease |
Family Cites Families (191)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4704362A (en) | 1977-11-08 | 1987-11-03 | Genentech, Inc. | Recombinant cloning vehicle microbial polypeptide expression |
CH652145A5 (de) | 1982-01-22 | 1985-10-31 | Sandoz Ag | Verfahren zur in vitro-herstellung von hybridomen welche humane monoklonale antikoerper erzeugen. |
JPS58210302A (ja) * | 1982-05-31 | 1983-12-07 | Ngk Insulators Ltd | セラミツクロ−タ− |
GB8308235D0 (en) * | 1983-03-25 | 1983-05-05 | Celltech Ltd | Polypeptides |
US4816567A (en) * | 1983-04-08 | 1989-03-28 | Genentech, Inc. | Recombinant immunoglobin preparations |
US4634666A (en) | 1984-01-06 | 1987-01-06 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Human-murine hybridoma fusion partner |
US5208036A (en) | 1985-01-07 | 1993-05-04 | Syntex (U.S.A.) Inc. | N-(ω, (ω-1)-dialkyloxy)- and N-(ω, (ω-1)-dialkenyloxy)-alk-1-yl-N,N,N-tetrasubstituted ammonium lipids and uses therefor |
US4666829A (en) * | 1985-05-15 | 1987-05-19 | University Of California | Polypeptide marker for Alzheimer's disease and its use for diagnosis |
EP0247091B1 (en) | 1985-11-01 | 1993-09-29 | Xoma Corporation | Modular assembly of antibody genes, antibodies prepared thereby and use |
US5618920A (en) * | 1985-11-01 | 1997-04-08 | Xoma Corporation | Modular assembly of antibody genes, antibodies prepared thereby and use |
US4713366A (en) | 1985-12-04 | 1987-12-15 | The Ohio State University Research Foundation | Antigenic modification of polypeptides |
US5096706A (en) * | 1986-03-25 | 1992-03-17 | National Research Development Corporation | Antigen-based treatment for adiposity |
US5225539A (en) * | 1986-03-27 | 1993-07-06 | Medical Research Council | Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies |
US6548640B1 (en) * | 1986-03-27 | 2003-04-15 | Btg International Limited | Altered antibodies |
US5278049A (en) | 1986-06-03 | 1994-01-11 | Incyte Pharmaceuticals, Inc. | Recombinant molecule encoding human protease nexin |
US5231170A (en) * | 1986-08-27 | 1993-07-27 | Paul Averback | Antibodies to dense microspheres |
US5187153A (en) * | 1986-11-17 | 1993-02-16 | Scios Nova Inc. | Methods of treatment using Alzheimer's amyloid polypeptide derivatives |
US5220013A (en) * | 1986-11-17 | 1993-06-15 | Scios Nova Inc. | DNA sequence useful for the detection of Alzheimer's disease |
US5389677B1 (en) * | 1986-12-23 | 1997-07-15 | Tristrata Inc | Method of treating wrinkles using glycalic acid |
EP0832981A1 (en) | 1987-02-17 | 1998-04-01 | Pharming B.V. | DNA sequences to target proteins to the mammary gland for efficient secretion |
US4912206A (en) * | 1987-02-26 | 1990-03-27 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | CDNA clone encoding brain amyloid of alzheimer's disease |
DE3883899T3 (de) * | 1987-03-18 | 1999-04-22 | Sb2 Inc | Geänderte antikörper. |
US4883666A (en) | 1987-04-29 | 1989-11-28 | Massachusetts Institute Of Technology | Controlled drug delivery system for treatment of neural disorders |
US5258498A (en) | 1987-05-21 | 1993-11-02 | Creative Biomolecules, Inc. | Polypeptide linkers for production of biosynthetic proteins |
US5057540A (en) | 1987-05-29 | 1991-10-15 | Cambridge Biotech Corporation | Saponin adjuvant |
US5583112A (en) | 1987-05-29 | 1996-12-10 | Cambridge Biotech Corporation | Saponin-antigen conjugates and the use thereof |
US5245015A (en) | 1991-04-26 | 1993-09-14 | Tanox Biosystems, Inc. | Monoclonal antibodies which neutralize HIV-1 through reaction with a conformational epitope in vitro |
US5645820A (en) * | 1987-06-24 | 1997-07-08 | Autoimmune, Inc. | Treatment of autoimmune diseases by aerosol administration of autoantigens |
US5849298A (en) | 1987-06-24 | 1998-12-15 | Autoimmune Inc. | Treatment of multiple sclerosis by oral administration of bovine myelin |
US5869054A (en) * | 1987-06-24 | 1999-02-09 | Autoimmune Inc. | Treatment of multiple sclerosis by oral administration of autoantigens |
US5571499A (en) | 1987-06-24 | 1996-11-05 | Autoimmune, Inc. | Treatment of autoimmune diseases by aerosol administration of autoantigens |
US5571500A (en) | 1987-06-24 | 1996-11-05 | Autoimmune, Inc. | Treatment of autoimmune diseases through administration by inhalation of autoantigens |
US5641474A (en) * | 1987-06-24 | 1997-06-24 | Autoimmune, Inc. | Prevention of autoimmune diseases by aerosol administration of autoantigens |
US5004697A (en) * | 1987-08-17 | 1991-04-02 | Univ. Of Ca | Cationized antibodies for delivery through the blood-brain barrier |
US5677425A (en) | 1987-09-04 | 1997-10-14 | Celltech Therapeutics Limited | Recombinant antibody |
US5231000A (en) * | 1987-10-08 | 1993-07-27 | The Mclean Hospital | Antibodies to A4 amyloid peptide |
US5089603A (en) * | 1989-06-21 | 1992-02-18 | Tanox Biosystems, Inc. | Antigenic epitopes present on membrane-bound but not secreted iga |
US5576184A (en) | 1988-09-06 | 1996-11-19 | Xoma Corporation | Production of chimeric mouse-human antibodies with specificity to human tumor antigens |
IL162181A (en) | 1988-12-28 | 2006-04-10 | Pdl Biopharma Inc | A method of producing humanized immunoglubulin, and polynucleotides encoding the same |
US5227159A (en) * | 1989-01-31 | 1993-07-13 | Miller Richard A | Anti-idiotype antibodies reactive with shared idiotopes expressed by B cell lymphomas and autoantibodies |
US5399346A (en) | 1989-06-14 | 1995-03-21 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Gene therapy |
US5633076A (en) | 1989-12-01 | 1997-05-27 | Pharming Bv | Method of producing a transgenic bovine or transgenic bovine embryo |
US5859205A (en) * | 1989-12-21 | 1999-01-12 | Celltech Limited | Humanised antibodies |
GB8928874D0 (en) * | 1989-12-21 | 1990-02-28 | Celltech Ltd | Humanised antibodies |
CA2050918A1 (en) | 1990-01-12 | 1991-07-13 | Raju Kucherlapati | Generation of xenogeneic antibodies |
US5279833A (en) | 1990-04-04 | 1994-01-18 | Yale University | Liposomal transfection of nucleic acids into animal cells |
US5264618A (en) | 1990-04-19 | 1993-11-23 | Vical, Inc. | Cationic lipids for intracellular delivery of biologically active molecules |
EP0527823A1 (en) | 1990-04-24 | 1993-02-24 | The Regents Of The University Of California | Purification, detection and methods of use of protease nexin-2 |
DE69126304T2 (de) | 1990-04-27 | 1997-09-04 | John Mcmichael | Verfahren und zusammensetzung zur behandlung von erkrankungen des zns hervorgerufen durch abnormales beta-amyloid-protein |
US5753624A (en) | 1990-04-27 | 1998-05-19 | Milkhaus Laboratory, Inc. | Materials and methods for treatment of plaquing disease |
US5427908A (en) | 1990-05-01 | 1995-06-27 | Affymax Technologies N.V. | Recombinant library screening methods |
US5593970A (en) | 1990-06-11 | 1997-01-14 | Biochem Pharma Inc. | Heterocyclic anthracycline analogs |
AU646877B2 (en) * | 1990-06-15 | 1994-03-10 | Scios Nova Inc. | Transgenic non-human mammal displaying the amyloid-forming pathology of alzheimer's disease |
ES2139598T3 (es) | 1990-07-10 | 2000-02-16 | Medical Res Council | Procedimientos para la produccion de miembros de parejas de union especifica. |
GB9015198D0 (en) | 1990-07-10 | 1990-08-29 | Brien Caroline J O | Binding substance |
US5780587A (en) * | 1990-08-24 | 1998-07-14 | President And Fellows Of Harvard College | Compounds and methods for inhibiting β-protein filament formation and neurotoxicity |
US5633425A (en) | 1990-08-29 | 1997-05-27 | Genpharm International, Inc. | Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies |
US5770429A (en) | 1990-08-29 | 1998-06-23 | Genpharm International, Inc. | Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies |
US5814318A (en) | 1990-08-29 | 1998-09-29 | Genpharm International Inc. | Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies |
US5789650A (en) | 1990-08-29 | 1998-08-04 | Genpharm International, Inc. | Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies |
US5661016A (en) | 1990-08-29 | 1997-08-26 | Genpharm International Inc. | Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes |
US5625126A (en) | 1990-08-29 | 1997-04-29 | Genpharm International, Inc. | Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies |
ES2108048T3 (es) | 1990-08-29 | 1997-12-16 | Genpharm Int | Produccion y utilizacion de animales inferiores transgenicos capaces de producir anticuerpos heterologos. |
US5874299A (en) | 1990-08-29 | 1999-02-23 | Genpharm International, Inc. | Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies |
US5877397A (en) | 1990-08-29 | 1999-03-02 | Genpharm International Inc. | Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes |
US5545806A (en) | 1990-08-29 | 1996-08-13 | Genpharm International, Inc. | Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies |
US5702906A (en) | 1990-09-25 | 1997-12-30 | Genentech, Inc. | Antibodies to neurotrophic factor-4 (NT-4) |
ES2335720T3 (es) | 1991-01-21 | 2010-03-31 | Elan Pharmaceuticals, Inc. | Ensayo y modelo para la enfermedad de alzheimer. |
US5192753A (en) * | 1991-04-23 | 1993-03-09 | Mcgeer Patrick L | Anti-rheumatoid arthritic drugs in the treatment of dementia |
US5858657A (en) | 1992-05-15 | 1999-01-12 | Medical Research Council | Methods for producing members of specific binding pairs |
DE69230142T2 (de) | 1991-05-15 | 2000-03-09 | Cambridge Antibody Tech | Verfahren zur herstellung von spezifischen bindungspaargliedern |
WO1994004679A1 (en) * | 1991-06-14 | 1994-03-03 | Genentech, Inc. | Method for making humanized antibodies |
EP0590058B1 (en) | 1991-06-14 | 2003-11-26 | Genentech, Inc. | HUMANIZED Heregulin ANTIBODy |
US5434050A (en) | 1991-08-13 | 1995-07-18 | Regents Of The University Of Minnesota | Labelled β-amyloid peptide and methods of screening for Alzheimer's disease |
US5283185A (en) | 1991-08-28 | 1994-02-01 | University Of Tennessee Research Corporation | Method for delivering nucleic acids into cells |
ES2136092T3 (es) | 1991-09-23 | 1999-11-16 | Medical Res Council | Procedimientos para la produccion de anticuerpos humanizados. |
US5837268A (en) | 1991-10-16 | 1998-11-17 | University Of Saskatchewan | GnRH-leukotoxin chimeras |
EP0746609A4 (en) | 1991-12-17 | 1997-12-17 | Genpharm Int | NON-HUMAN TRANSGENIC ANIMALS CAPABLE OF PRODUCING HETEROLOGOUS ANTIBODIES |
US5679348A (en) | 1992-02-03 | 1997-10-21 | Cedars-Sinai Medical Center | Immunotherapy for recurrent HSV infections |
AU685047B2 (en) * | 1992-02-11 | 1998-01-15 | Henry M. Jackson Foundation For The Advancement Of Military Medicine | Dual carrier immunogenic construct |
US5714350A (en) * | 1992-03-09 | 1998-02-03 | Protein Design Labs, Inc. | Increasing antibody affinity by altering glycosylation in the immunoglobulin variable region |
US5733743A (en) | 1992-03-24 | 1998-03-31 | Cambridge Antibody Technology Limited | Methods for producing members of specific binding pairs |
US5441870A (en) * | 1992-04-15 | 1995-08-15 | Athena Neurosciences, Inc. | Methods for monitoring cellular processing of β-amyloid precursor protein |
US5604102A (en) * | 1992-04-15 | 1997-02-18 | Athena Neurosciences, Inc. | Methods of screening for β-amyloid peptide production inhibitors |
US5851787A (en) | 1992-04-20 | 1998-12-22 | The General Hospital Corporation | Nucleic acid encoding amyloid precursor-like protein and uses thereof |
EP0640094A1 (en) | 1992-04-24 | 1995-03-01 | The Board Of Regents, The University Of Texas System | Recombinant production of immunoglobulin-like domains in prokaryotic cells |
CA2138137C (en) * | 1992-06-18 | 2004-11-09 | R. John Collier | Diphtheria toxin vaccines |
US5837672A (en) | 1992-07-10 | 1998-11-17 | Athena Neurosciences, Inc. | Methods and compositions for the detection of soluble β-amyloid peptide |
US5766846A (en) * | 1992-07-10 | 1998-06-16 | Athena Neurosciences | Methods of screening for compounds which inhibit soluble β-amyloid peptide production |
BR9306984A (pt) | 1992-08-27 | 1999-01-12 | Deakin Res Ltd | Análogo de antígeno de peptídeo de um antígeno de peptídeo nativo vacina anticorpo processo para vacinar um hospedeiro necessitando deste tratamento estojo diagnóstico processos para preparar um análogo de um antiígeno de um antígeno de peptídeo nativo para preparar uma vacina para analisar uma amostra para um antígeno de peptídeo nativo e para analisar uma amostra para um anticorpo |
US5958883A (en) | 1992-09-23 | 1999-09-28 | Board Of Regents Of The University Of Washington Office Of Technology | Animal models of human amyloidoses |
US5605811A (en) * | 1992-10-26 | 1997-02-25 | Athena Neurosciences, Inc. | Methods and compositions for monitoring cellular processing of beta-amyloid precursor protein |
US6210671B1 (en) * | 1992-12-01 | 2001-04-03 | Protein Design Labs, Inc. | Humanized antibodies reactive with L-selectin |
WO1994012629A1 (en) | 1992-12-02 | 1994-06-09 | Baylor College Of Medicine | Episomal vectors for gene therapy |
EP0672142B1 (en) | 1992-12-04 | 2001-02-28 | Medical Research Council | Multivalent and multispecific binding proteins, their manufacture and use |
EP0683234B2 (en) * | 1993-01-25 | 2007-06-06 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | Antibody against beta-amyloid or their derivative and use thereof |
US5955317A (en) * | 1993-01-25 | 1999-09-21 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | Antibodies to β-amyloids or their derivatives and use thereof |
DE614989T1 (de) | 1993-02-17 | 1995-09-28 | Morphosys Proteinoptimierung | Verfahren für in vivo Selektion von Ligandenbindende Proteine. |
AU692152B2 (en) * | 1993-03-17 | 1998-06-04 | Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services, The | Immunogenic chimeras comprising nucleic acid sequences encoding endoplasmic reticulum signal sequence peptides and at least one other peptide, and their uses in vaccines and disease treatments |
EP0689454B2 (en) * | 1993-03-23 | 2005-02-23 | SMITHKLINE BEECHAM BIOLOGICALS s.a. | Vaccine compositions containing 3-o deacylated monophosphoryl lipid a |
IT1270939B (it) | 1993-05-11 | 1997-05-26 | Angeletti P Ist Richerche Bio | Procedimento per la preparazione di immunogeni e reagenti diagnostici,e immunogeni e reagenti diagnostici cosi' ottenibili. |
US5464823A (en) | 1993-07-20 | 1995-11-07 | The Regents Of The University Of California | Mammalian antibiotic peptides |
WO1995005853A1 (en) | 1993-08-26 | 1995-03-02 | The Regents Of The University Of California | Method, compositions and devices for administration of naked polynucleotides which encode biologically active peptides |
US5652334A (en) | 1993-09-08 | 1997-07-29 | City Of Hope | Method for design of substances that enhance memory and improve the quality of life |
US5385887A (en) * | 1993-09-10 | 1995-01-31 | Genetics Institute, Inc. | Formulations for delivery of osteogenic proteins |
ES2318848T3 (es) * | 1993-09-14 | 2009-05-01 | Pharmexa Inc. | Peptidos que se unen a pan dr para potenciar la respuesta inmunitaria. |
US5470951A (en) | 1993-09-29 | 1995-11-28 | City Of Hope | Peptides for antagonizing the effects of amyloid βprotein |
US5858981A (en) * | 1993-09-30 | 1999-01-12 | University Of Pennsylvania | Method of inhibiting phagocytosis |
JP3504963B2 (ja) * | 1993-10-22 | 2004-03-08 | 智靖 羅 | 抗ヒト高親和性IgE受容体モノクローナル抗体に係るアミノ酸配列をコードするDNA断片 |
US5744368A (en) * | 1993-11-04 | 1998-04-28 | Research Foundation Of State University Of New York | Methods for the detection of soluble amyloid β-protein (βAP) or soluble transthyretin (TTR) |
US5827690A (en) | 1993-12-20 | 1998-10-27 | Genzyme Transgenics Corporatiion | Transgenic production of antibodies in milk |
US5434170A (en) * | 1993-12-23 | 1995-07-18 | Andrulis Pharmaceuticals Corp. | Method for treating neurocognitive disorders |
US5877218A (en) | 1994-01-10 | 1999-03-02 | Teva Pharmaceutical Industries, Ltd. | Compositions containing and methods of using 1-aminoindan and derivatives thereof and process for preparing optically active 1-aminoindan derivatives |
US5877399A (en) * | 1994-01-27 | 1999-03-02 | Johns Hopkins University | Transgenic mice expressing APP-Swedish mutation develop progressive neurologic disease |
JPH09511388A (ja) * | 1994-01-27 | 1997-11-18 | リージェンツ オブ ザ ユニバーシティー オブ ミネソタ | 進行性神経疾患を持つヒト以外のトランスジェニック哺乳類 |
EP0802797A1 (en) * | 1994-02-03 | 1997-10-29 | The Picower Institute For Medical Research | Compositions and methods for advanced glycosylation endproduct-mediated modulation of amyloidosis |
CA2122573A1 (en) * | 1994-04-13 | 1995-10-14 | John M. Pratt | Dynamic electronic mail facility for applications executing in an integrated operating environment |
US6372716B1 (en) * | 1994-04-26 | 2002-04-16 | Genetics Institute, Inc. | Formulations for factor IX |
US5505947A (en) | 1994-05-27 | 1996-04-09 | The University Of North Carolina At Chapel Hill | Attenuating mutations in Venezuelan Equine Encephalitis virus |
US5622701A (en) * | 1994-06-14 | 1997-04-22 | Protein Design Labs, Inc. | Cross-reacting monoclonal antibodies specific for E- and P-selectin |
US6417178B1 (en) * | 1994-07-19 | 2002-07-09 | University Of Pittsburgh | Amyloid binding nitrogen-linked compounds for the antemortem diagnosis of alzheimer's disease, in vivo imaging and prevention of amyloid deposits |
US6114133A (en) | 1994-11-14 | 2000-09-05 | Elan Pharmaceuticals, Inc. | Methods for aiding in the diagnosis of Alzheimer's disease by measuring amyloid-β peptide (x-≧41) |
US5589154A (en) | 1994-11-22 | 1996-12-31 | Rutgers, The State University Of New Jersey | Methods for the prevention or treatment of vascular hemorrhaging and Alzheimer's disease |
US5688651A (en) | 1994-12-16 | 1997-11-18 | Ramot University Authority For Applied Research And Development Ltd. | Prevention of protein aggregation |
AU695129B2 (en) * | 1995-02-06 | 1998-08-06 | Genetics Institute, Llc | Formulations for IL-12 |
US5786180A (en) * | 1995-02-14 | 1998-07-28 | Bayer Corporation | Monoclonal antibody 369.2B specific for β A4 peptide |
US5624937A (en) * | 1995-03-02 | 1997-04-29 | Eli Lilly And Company | Chemical compounds as inhibitors of amyloid beta protein production |
US5817626A (en) | 1995-03-14 | 1998-10-06 | Praecis Pharmaceuticals Incorporated | Modulators of beta-amyloid peptide aggregation |
US5854215A (en) | 1995-03-14 | 1998-12-29 | Praecis Pharmaceuticals Incorporated | Modulators of β-amyloid peptide aggregation |
WO1996028471A1 (en) | 1995-03-14 | 1996-09-19 | Praecis Pharmaceuticals Incorporated | Modulators of amyloid aggregation |
US6303567B1 (en) | 1995-03-14 | 2001-10-16 | Praecis Pharmaceuticals, Inc . | Modulators of β-amyloid peptide aggregation comprising D-amino acids |
US5869046A (en) * | 1995-04-14 | 1999-02-09 | Genentech, Inc. | Altered polypeptides with increased half-life |
US6121022A (en) | 1995-04-14 | 2000-09-19 | Genentech, Inc. | Altered polypeptides with increased half-life |
US7153510B1 (en) | 1995-05-04 | 2006-12-26 | Yale University | Recombinant vesiculoviruses and their uses |
PT750907E (pt) | 1995-06-30 | 2002-08-30 | American Cyanamid Co | Formulacoes de vacinas estaveis para administracao parenterica metodo para a sua utilizacao e processo para a sua preparacao |
US5824322A (en) | 1995-08-21 | 1998-10-20 | Cytrx Corporation | Compositions and methods for growth promotion |
BR9610580A (pt) | 1995-09-14 | 2000-10-24 | Univ California | Anticorpos especìficos para prpse nativos |
US5731284A (en) * | 1995-09-28 | 1998-03-24 | Amgen Inc. | Method for treating Alzheimer's disease using glial line-derived neurotrophic factor (GDNF) protein product |
US5985242A (en) | 1995-10-27 | 1999-11-16 | Praecis Pharmaceuticals, Inc. | Modulators of β-amyloid peptide aggregation comprising D-amino acids |
US5750361A (en) * | 1995-11-02 | 1998-05-12 | The Regents Of The University Of California | Formation and use of prion protein (PRP) complexes |
WO1997021728A1 (en) | 1995-12-12 | 1997-06-19 | Karolinska Innovations Ab | PEPTIDE BINDING THE KLVFF-SEQUENCE OF AMYLOID $g(b) |
US5770700A (en) * | 1996-01-25 | 1998-06-23 | Genetics Institute, Inc. | Liquid factor IX formulations |
EP0787764B1 (en) * | 1996-02-03 | 2003-04-09 | Mitsubishi Gas Chemical Company, Inc. | Oxygen-absorbing resin composition and packing material, multi-layered packing material, package and packing method using the same |
US6150091A (en) | 1996-03-06 | 2000-11-21 | Baylor College Of Medicine | Direct molecular diagnosis of Friedreich ataxia |
US6284533B1 (en) | 1996-05-01 | 2001-09-04 | Avant Immunotherapeutics, Inc. | Plasmid-based vaccine for treating atherosclerosis |
TW373320B (en) * | 1996-05-27 | 1999-11-01 | United Microelectronics Corporaiton | Structure and production method of capacitor of dynamic RAM |
US6057367A (en) * | 1996-08-30 | 2000-05-02 | Duke University | Manipulating nitrosative stress to kill pathologic microbes, pathologic helminths and pathologically proliferating cells or to upregulate nitrosative stress defenses |
US6022859A (en) | 1996-11-15 | 2000-02-08 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Inhibitors of β-amyloid toxicity |
US20030068316A1 (en) * | 1997-02-05 | 2003-04-10 | Klein William L. | Anti-ADDL antibodies and uses thereof |
US6218506B1 (en) * | 1997-02-05 | 2001-04-17 | Northwestern University | Amyloid β protein (globular assembly and uses thereof) |
US6277375B1 (en) * | 1997-03-03 | 2001-08-21 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Immunoglobulin-like domains with increased half-lives |
US5798102A (en) | 1997-03-04 | 1998-08-25 | Milkhaus Laboratory, Inc. | Treatment of cardiomyopathy |
US20020086847A1 (en) * | 1997-04-09 | 2002-07-04 | Mindset Biopharmaceuticals (Usa) | Recombinant antibodies specific for beta-amyloid ends, DNA encoding and methods of use thereof |
US8173127B2 (en) * | 1997-04-09 | 2012-05-08 | Intellect Neurosciences, Inc. | Specific antibodies to amyloid beta peptide, pharmaceutical compositions and methods of use thereof |
US6787319B2 (en) * | 1997-04-16 | 2004-09-07 | American Home Products Corp. | β-amyloid peptide-binding proteins and polynucleotides encoding the same |
AU7690898A (en) * | 1997-05-20 | 1998-12-11 | Ottawa Civic Hospital Loeb Research Institute | Vectors and methods for immunization or therapeutic protocols |
US6175057B1 (en) * | 1997-10-08 | 2001-01-16 | The Regents Of The University Of California | Transgenic mouse model of alzheimer's disease and cerebral amyloid angiopathy |
US6743427B1 (en) * | 1997-12-02 | 2004-06-01 | Neuralab Limited | Prevention and treatment of amyloidogenic disease |
US6913745B1 (en) * | 1997-12-02 | 2005-07-05 | Neuralab Limited | Passive immunization of Alzheimer's disease |
US20080050367A1 (en) * | 1998-04-07 | 2008-02-28 | Guriq Basi | Humanized antibodies that recognize beta amyloid peptide |
US6787523B1 (en) * | 1997-12-02 | 2004-09-07 | Neuralab Limited | Prevention and treatment of amyloidogenic disease |
US6750324B1 (en) * | 1997-12-02 | 2004-06-15 | Neuralab Limited | Humanized and chimeric N-terminal amyloid beta-antibodies |
US6710226B1 (en) * | 1997-12-02 | 2004-03-23 | Neuralab Limited | Transgenic mouse assay to determine the effect of Aβ antibodies and Aβ Fragments on alzheimer's disease characteristics |
TWI239847B (en) * | 1997-12-02 | 2005-09-21 | Elan Pharm Inc | N-terminal fragment of Abeta peptide and an adjuvant for preventing and treating amyloidogenic disease |
US7179892B2 (en) * | 2000-12-06 | 2007-02-20 | Neuralab Limited | Humanized antibodies that recognize beta amyloid peptide |
US6528624B1 (en) * | 1998-04-02 | 2003-03-04 | Genentech, Inc. | Polypeptide variants |
US6194551B1 (en) * | 1998-04-02 | 2001-02-27 | Genentech, Inc. | Polypeptide variants |
US20050059802A1 (en) * | 1998-04-07 | 2005-03-17 | Neuralab Ltd | Prevention and treatment of amyloidogenic disease |
US20050059591A1 (en) * | 1998-04-07 | 2005-03-17 | Neuralab Limited | Prevention and treatment of amyloidogenic disease |
JP2002512776A (ja) * | 1998-04-28 | 2002-05-08 | スミスクライン・ビーチャム・コーポレイション | 免疫原性の低下したモノクローナル抗体 |
US20030147882A1 (en) * | 1998-05-21 | 2003-08-07 | Alan Solomon | Methods for amyloid removal using anti-amyloid antibodies |
US6727349B1 (en) * | 1998-07-23 | 2004-04-27 | Millennium Pharmaceuticals, Inc. | Recombinant anti-CCR2 antibodies and methods of use therefor |
CA2354862A1 (en) * | 1998-10-19 | 2000-04-27 | Yeda Research And Development Co. Ltd. | Treatment of systemic lupus erythematosus by down-regulating the autoimmune response to autoantigens |
US6441870B1 (en) * | 1998-12-22 | 2002-08-27 | Gateway, Inc. | Automatic gamma correction for multiple video sources |
US6582945B1 (en) * | 1999-06-16 | 2003-06-24 | Boston Biomedical Research Institute | Immunological control of β-amyloid levels in vivo |
US6264335B1 (en) * | 1999-06-25 | 2001-07-24 | James C. Bass, Sr. | Light-reflective marking clip |
US6756378B2 (en) * | 1999-06-30 | 2004-06-29 | Pharmacopeia Drug Discovery, Inc. | VLA-4 inhibitor compounds |
US6294171B2 (en) * | 1999-09-14 | 2001-09-25 | Milkhaus Laboratory, Inc. | Methods for treating disease states comprising administration of low levels of antibodies |
US20020094335A1 (en) * | 1999-11-29 | 2002-07-18 | Robert Chalifour | Vaccine for the prevention and treatment of alzheimer's and amyloid related diseases |
US6399314B1 (en) * | 1999-12-29 | 2002-06-04 | American Cyanamid Company | Methods of detection of amyloidogenic proteins |
CZ306683B6 (cs) * | 2000-02-24 | 2017-05-03 | Washington University | Léčivo pro prevenci nebo léčení preklinické nebo klinické Alzheimerovy nemoci |
DE60108111T2 (de) * | 2000-05-22 | 2005-12-08 | New York University | Synthetische immunogene jedoch nicht amyloidogene peptide, die homolog zu amyloid beta sind und deren verwendung zur induktion einer immunantwort gegen amyloid beta und amyloidaggregate |
US20020009445A1 (en) * | 2000-07-12 | 2002-01-24 | Yansheng Du | Human beta-amyloid antibody and use thereof for treatment of alzheimer's disease |
US20030092145A1 (en) * | 2000-08-24 | 2003-05-15 | Vic Jira | Viral vaccine composition, process, and methods of use |
PE20020574A1 (es) * | 2000-12-06 | 2002-07-02 | Wyeth Corp | Anticuerpos humanizados que reconocen el peptido amiloideo beta |
EP1385545B1 (en) * | 2001-04-30 | 2009-01-07 | Eli Lilly And Company | Humanized antibodies recognizing the beta-amyloid peptide |
WO2002088307A2 (en) * | 2001-04-30 | 2002-11-07 | Eli Lilly And Company | Humanized antibodies |
US6906169B2 (en) * | 2001-05-25 | 2005-06-14 | United Biomedical, Inc. | Immunogenic peptide composition comprising measles virus Fprotein Thelper cell epitope (MUFThl-16) and N-terminus of β-amyloid peptide |
US6733547B2 (en) * | 2001-12-10 | 2004-05-11 | Delphi Technologies, Inc. | Method of making a paste composition for lead acid battery |
MY139983A (en) * | 2002-03-12 | 2009-11-30 | Janssen Alzheimer Immunotherap | Humanized antibodies that recognize beta amyloid peptide |
TWI306458B (en) * | 2003-05-30 | 2009-02-21 | Elan Pharma Int Ltd | Humanized antibodies that recognize beta amyloid peptide |
-
2001
- 2001-12-05 PE PE2001001222A patent/PE20020574A1/es not_active Application Discontinuation
- 2001-12-05 TW TW090130135A patent/TWI255272B/zh not_active IP Right Cessation
- 2001-12-06 NZ NZ526813A patent/NZ526813A/en not_active IP Right Cessation
- 2001-12-06 KR KR1020037007583A patent/KR100996936B1/ko not_active IP Right Cessation
- 2001-12-06 JP JP2002547973A patent/JP4166569B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2001-12-06 UY UY27062A patent/UY27062A1/es not_active IP Right Cessation
- 2001-12-06 PL PL366341A patent/PL211761B1/pl unknown
- 2001-12-06 IL IL15603001A patent/IL156030A0/xx unknown
- 2001-12-06 SI SI200130891T patent/SI1358213T1/sl unknown
- 2001-12-06 AU AU2592102A patent/AU2592102A/xx active Pending
- 2001-12-06 AT AT01995364T patent/ATE414719T1/de active
- 2001-12-06 NZ NZ546621A patent/NZ546621A/en not_active IP Right Cessation
- 2001-12-06 MY MYPI20015573A patent/MY163362A/en unknown
- 2001-12-06 AR ARP010105674A patent/AR035402A1/es not_active Application Discontinuation
- 2001-12-06 CN CNA2006101432845A patent/CN101081868A/zh active Pending
- 2001-12-06 EA EA200602015A patent/EA011450B1/ru not_active IP Right Cessation
- 2001-12-06 KR KR1020067025722A patent/KR20070004139A/ko not_active Application Discontinuation
- 2001-12-06 SK SK850-2003A patent/SK288209B6/sk not_active IP Right Cessation
- 2001-12-06 EP EP08075843A patent/EP2045267A3/en not_active Ceased
- 2001-12-06 EP EP01995364A patent/EP1358213B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2001-12-06 EA EA200300637A patent/EA010469B1/ru not_active IP Right Cessation
- 2001-12-06 CN CNA200610143285XA patent/CN101081869A/zh active Pending
- 2001-12-06 MX MXPA03005048A patent/MXPA03005048A/es active IP Right Grant
- 2001-12-06 HU HU0302589A patent/HU229681B1/hu not_active IP Right Cessation
- 2001-12-06 CN CNA2006101432830A patent/CN101081867A/zh active Pending
- 2001-12-06 DE DE60136651T patent/DE60136651D1/de not_active Expired - Lifetime
- 2001-12-06 DK DK01995364T patent/DK1358213T3/da active
- 2001-12-06 US US10/010,942 patent/US7189819B2/en not_active Expired - Lifetime
- 2001-12-06 MY MYPI20063882A patent/MY162171A/en unknown
- 2001-12-06 AU AU2002225921A patent/AU2002225921B8/en not_active Ceased
- 2001-12-06 ES ES01995364T patent/ES2317953T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2001-12-06 EE EEP200300264A patent/EE05309B1/xx not_active IP Right Cessation
- 2001-12-06 CN CNB018201709A patent/CN100448893C/zh not_active Expired - Fee Related
- 2001-12-06 CZ CZ20031601A patent/CZ20031601A3/cs unknown
- 2001-12-06 GE GEAP20015236A patent/GEP20084339B/en unknown
- 2001-12-06 UA UA2003076268A patent/UA87093C2/ru unknown
- 2001-12-06 PT PT01995364T patent/PT1358213E/pt unknown
- 2001-12-06 BR BR0115978-0A patent/BR0115978A/pt not_active IP Right Cessation
- 2001-12-06 CA CA2430772A patent/CA2430772C/en not_active Expired - Fee Related
- 2001-12-06 WO PCT/US2001/046587 patent/WO2002046237A2/en active Application Filing
-
2002
- 2002-08-30 US US10/232,030 patent/US7582733B2/en not_active Expired - Lifetime
-
2003
- 2003-05-21 IL IL156030A patent/IL156030A/en not_active IP Right Cessation
- 2003-05-27 BG BG107850A patent/BG66292B1/en unknown
- 2003-06-05 NO NO20032549A patent/NO339290B1/no not_active IP Right Cessation
- 2003-06-16 IS IS6848A patent/IS2620B/is unknown
- 2003-07-03 ZA ZA200305169A patent/ZA200305169B/xx unknown
- 2003-07-04 EC EC2003004685A patent/ECSP034685A/es unknown
- 2003-07-04 HR HR20030547A patent/HRP20030547A8/xx not_active Application Discontinuation
-
2005
- 2005-04-27 HK HK05103587.8A patent/HK1070904A1/xx not_active IP Right Cessation
-
2006
- 2006-04-18 NZ NZ546620A patent/NZ546620A/en not_active IP Right Cessation
-
2007
- 2007-10-17 JP JP2007270634A patent/JP5059541B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2007-10-17 JP JP2007270630A patent/JP2008073051A/ja active Pending
- 2007-10-17 JP JP2007270628A patent/JP2008099694A/ja active Pending
-
2009
- 2009-02-09 CY CY20091100149T patent/CY1108740T1/el unknown
- 2009-04-07 JP JP2009093370A patent/JP4944149B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
2012
- 2012-04-25 JP JP2012100412A patent/JP2012147797A/ja not_active Withdrawn
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5585089A (en) * | 1988-12-28 | 1996-12-17 | Protein Design Labs, Inc. | Humanized immunoglobulins |
WO2000072880A2 (en) * | 1999-05-28 | 2000-12-07 | Neuralab Limited | Prevention and treatment of amyloidogenic disease |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
BARD, F. et al, Peripherally administered antibodies against amyloid ß-peptide enter the central nervous system and reduce pathology in a mouse model of Alzheimer disease, Nature medicine, august 2000, Vol. 6, Nr. 8, side 916-919, Dated: 01.01.0001 * |
JOHNSON-WOOD, K. et al, Amyloid precursor protein processing and Aß42 deposition in a transgenic mouse model of Alzheimer disease, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, februar 1997, Vol. 94, side 1550-1555, Dated: 01.01.0001 * |
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
NO339290B1 (no) | Humanisert immunoglobulin som spesifikt binder beta-amyloid peptid (Aβ) eller antigenbindende fragment derav | |
EP1613347B1 (en) | Humanized antibodies that recognize beta amyloid peptide | |
AU2008242648B2 (en) | Prevention and treatment of cerebral amyloid angiopathy | |
US8003097B2 (en) | Treatment of cerebral amyloid angiopathy | |
JP5580504B2 (ja) | アミロイド形成疾患の予防および処置 | |
AU2002225921A1 (en) | Humanized antibodies that recognize beta amyloid peptide | |
EP1554311A2 (en) | Humanized antibodies that recognize beta amyloid peptide | |
AU2007231640B2 (en) | Humanized antibodies that recognize beta amyloid peptide | |
JP2012034697A (ja) | βアミロイドペプチドを認識するヒト化抗体 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM1K | Lapsed by not paying the annual fees |