BG107850A

BG107850A - Хуманизирани антитела, които разпознават бета амилоиден пептид

Info

Publication number: BG107850A
Application number: BG107850A
Authority: BG
Inventors: Guriq Basi; Jose Saldanha; Ted Yednock
Original assignee: Neuralab Limited; Wyeth
Priority date: 2000-12-06
Filing date: 2003-05-27
Publication date: 2004-02-27
Also published as: HRP20030547A8; GEP20084339B; AU2592102A; WO2002046237A2; SK8502003A3; IL156030A0; UY27062A1; NO20032549L; HUP0302589A3; AU2002225921B8; CN101081867A; EP2045267A2; EP1358213B1; MXPA03005048A; PL211761B1; KR100996936B1; NZ526813A; JP5059541B2; JP2008099694A; EA200300637A1

Description

Свързани заявки

Тази заявка претендира за предимство пред придружаваща-нерешена заявка U.S. Serial No. 60/251,892 (представена на 6 декември 2000 г.), озаглавена “Хуманизирани антитела, които разпознават бета-амилоиден пептид”. Цялото съдържание на горецитираната заявка е включено тук чрез цитат.

Предшествуващо състояние на техниката

Болестта на Alzheimer (AD) е прогресиращо заболяване, което води до сенилна деменция. Виж общо Selkoe, TINS 16:403 (1993); Hardy et al., WO 92/13096; Selkoe; J.NeuropathoI.Exp.Neurol. 53:438 (1994); Duff et al., Nature 373:476 (1995); Games et al., Nature 373:523 (1995). Общо разглеждано, заболяването попада в две категории: късно начало, което се появява в напреднала възраст (65+ години) и ранно начало, което се развива преди сенилния период, т.е. между 35 и 60 години. При двата типа заболяване, патологията е еднаква, но измененията имат тенденция да са потежки и разпространени в случаите с начало в по-ранна възраст. Заболяването се характеризира с най-малко два типа лезии в мозъка, неврофибриларни възли и сенилни плаки. Неврофибриларните възли са вътреклетъчни отлагания на свързан с микротубули tau протеин, състоящи се от два филамента завити един около друг в чифтове. Сенилни плаки (т.е. амилоидни плаки) са области с дезорганизиран невропил с напречен размер до 150 pm с извънклетъчни амилоидни отлагания в центъра, които са видими при микроскопски анализ на срези от мозъчна тъкан. Натрупването на амилоидни плаки в мозъка също е свързано със синдрома на Down и други когнитивни заболявания.

Главната съставка на плаките е пептид наречен Αβ или βамилоиден пептид. Αβ пептид е един 4-kDa вътрешен фрагмент от 39-43 аминокиселини на по-голям трансмембранен гликопротеин, наречен амилоид прекурсорен протеин (АРР). В резултат на протеолитично процесиране на АРР с различни секретазни ензими, Αβ първично е намерен в къса форма, 40 аминокиселини дължина и дълга форма, в границите на 42-43 аминокиселини дължина. Част от хидрофобния трансмембранен домен на АРР се открива на карбоксилния край на Αβ и може да определя способността на Αβ да агрегира в плаки, по-специално в случая на дългата форма. Натрупването на плаки в мозъка може да доведе до невронална клетъчна смърт. Физикалните симптоми свързани с този тип невронално израждане характеризират болестта на Alzheimer.

Няколко мутации в АРР белтъка са корелирани с наличието на болест на Alzheimer. Виж, например Goate et al., Nature 349:704 (1991) (валин⁷¹⁷ в изолевцин); Chartier Harlan et al., Nature 353:844 (1991)) (валин⁷¹⁷ в глицин); Murrell et al., Science 254:94 (1991) (валин⁷¹⁷ във фенилаланин); Mullan et al., Nature Genet. 1:345 (1992) (една двойна мутация променяща лизин -метионин в аспаргин⁵⁹⁵-левцин⁵⁹⁶). Предполага се, че такива мутации предизвикват болест на Alzheimer, чрез повишено или променено процесиране на АРР в Αβ, по-специално процесиране на АРР в повишени количества от дългата форма на Αβ (т.е. Αβ1-42 и Αβ143). Мутации в други гени, като пресенилните гени, PS1 и PS2 се предполага, че засягат индиректно процесирането на АРР за получаване на повишени количества от дългата форма Αβ (виж Hardy, TINS 20:154 (1997)).

Успешно са използвани модели на мишки за определяне значението на амилоидните плаки при болестта на Alzheimer (Games et al., по-горе, Johnson-Wood et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94:1550 (1997)). По-специално, когато PDAPP трансгенни мишки (които експресират една мутантна форма на човешки АРР и развиват болест на Alzheimer в ранна възраст), са инжектирани с дългата форма на Αβ, те проявяват както забавяне прогресирането на Alzheimer така и повишение на титрите на антитела спрямо Αβ пептид (Schenk et al., Nature 400, 173 (1999)). Наблюденията обсъдени по-горе показват, че Αβ, по-специално неговата дълга форма, е причинен елемент за болестта на Alzheimer.

McMichael, EP 526,511 предлага въвеждане на хомеопатни дозировки (по-малки или равни на 10'² mg/дневно) от Αβ на пациенти с предварително установена AD (болест на Alzheimer). При човека, например средно с около 5 литра плазма, дори горната граница на тази дозировка може да се очаква, че ще създаде концентрация от не повече от 2 pg/ml. Нормалната концентрация на Αβ в човешка плазма обикновено е в границите на 50-200 pg/ml (Seubert et al., Nature 359:325 (1992)). Тъй като предлаганата в ЕР 526,511 дозировка едва би променила нивото на ендогенния циркулиращ Αβ и тъй като ЕР 526,511 не препоръчва употреба на адювант, като имуностимулант, изглежда неправдоподобно тя да има подобряващ терапевтичен резултат.

Съответно на това, съществува необходимост от нови терапии и реагенти за лечение болестта на Alzheimer, по-специално, терапии и реагенти способни да упражнят терапевтично подобрение във физиологични (например, нетоксични) дози.

Техническа същност на изобретението

Настоящето изобретение предлага нови имунологични реагенти, по-специално, терапевтични антитяло реагенти за профилактика и лечение на амилоидогенно заболяване (например, болест на Alzheimer). Изобретението се основава, поне отчасти на идентифициране и характеризиране на две моноклонални антитела, които се свързват специфично с Αβ пептид и са ефективни за намаление натрупванията на плаки и/или намаление на невритната дистрофия, свързана с амилоидогенни нарушения. Структурен и функционален анализ на тази антитела води до дизайна на различни хуманизирани антитела за профилактична и/или терапевтична употреба. В частност, изобретението характеризира хуманизиране на различни области на тези антитела и съответно предоставя хуманизиран имуноглобулин или антитяло вериги, интактни хуманизирани имуноглобулини или антитела и функционални имуноглобулин или антитяло фрагменти, поспециално, антиген свързващи фрагменти на характеризираните антитела.

Представени са също полипептиди, съдържащи определящи комплементарността области на характеризираните моноклонални антитела, каквито са полинуклеотидни реагенти, вектори и гостоприемници, подходящи за кодиране на споменатите полипептиди.

Представено е използване за лечение на амилоидогенни заболявания или нарушения (например,болест на Alzheimer) като фармацевтични препарати и китове за употреба в такива приложения.

Характеризирани са също методи за идентифициране на остатъци в характеризираните моноклонални антитела, които са важни за истинската имунологична функция и за идентифициране остатъци, които са податливи към замени в дизайна на хуманизирани антитела, притежаващи подобрени свързващи афинитети и/или редуцирана имуногенност, когато се използват като терапевтични реагенти.

i

Кратко описание на фигурите

Фигура 1 изобразява едно подреждане на аминокиселинните последователности в леката верига на мишо 3D6, хуманизирано 3D6, Kabat ID 109230 и зародишева линия А19 антитела. CD областите са посочени със стрелки. Плътните наклонени показват редки миши остатъци. Плътните показват пакетиращи (VH+VL) остатъци. Плътно изпълването показва признати/CDR взаимодействащи остатъци. Звездички показват остатъци подбрани за обратна мутация в хуманизирана 3D6, версия

1.

Фигура 2 представя подравняване на аминокиселинни последователности на тежката верига на мишо 3D6, хуманизирано 3D6, Kabat ID 045919 и зародишева линия VH3-23 антитела. Анотацията е същата както за Фигура 1.

Фигура 3 представя графично Αβ свързващите свойства на 3D6, химерно 3D6 и 10D5. Фигура ЗА е графика изобразяваща свързване на 10D5 с химерно 3D6 (РК1614), сравнено с мишо 3D6. Фигура ЗВ е графика изобразяваща конкуриране на биотинилирано 3D6 в сравнение с небелязано 3D6, РК1614 и 10D5, за свързване на Αβ.

Фигура 4 представя модел за хомология на 3D6 VH и VL, показващ α-въглеродна основна верига. VH е показана като пунктирана линия и VL е показана като плътна линия. CDR области са показани във форма на панделка.

Фигура 5 изобразява графично Αβ свързващите свойства на химерно 3D6 и хуманизирано 3D6. Фигура 5А представя ELISA резултати, измерващи свързването на хуманизирано 3D6v1 и химерно 3D6 с агрегиран Αβ. Фигура 5В представя ELISA резултати, измерващи свързването на хуманизирано 3D6v1 и хуманизирано 3D6v2 с агрегиран Αβ.

Фигура 6 е графично количествено определяне на свързването на хуманизирано 3D6 и химерно 3D6, с Αβ плаки от мозъчни срези на PDAPP мишки.

Фигура 7 е графика, представяща резултати от проба за конкурентно свързване, при която е тестирана способността на хуманизирани 3D6 версии 1 и 2, химерно 3D6, мишо 3D6 и 10D5 да конкурират с мишо 3D6, за свързване с Αβ.

Фигура 8 представя графично една ex vivo проба за фагоцитоза, тестираща способността на хуманизирано 3D6v2, химерно 3D6 и човешки IgG да медиират поемането на Αβ от микроглиялни клетки.

Фигура 9 представя подравняване на 10D5 VL и 3D6 VL аминокиселинни последователности. Плътните букви показват остатъци, които съвпадат точно с 10D5.

Фигура 10 представя подравняване на 10D5 VH и 3D6 VH аминокиселинни последователности. Плътните букви указват остатъци, които съвпадат точно с 10D5.

Подробно описание на изобретението

Настоящето изобретение характеризира нови имунологични реагенти и методи за профилактика или лечение болест на Alzheimer или други амилоидогенни заболявания. Изобретението се основава, поне отчасти, на характеризирането на два моноклонални имуноглобулини, 3D6 и 10D5, които са ефективни при свързване на бета амилоиден протеин (Αβ) (например, свързване на разтворим и/или агрегиран Αβ), като медиират фагоцитоза (например, на агрегиран Αβ), редуцират натрупванията на плаки и/или намаляват невритната дистрофия (например, у пациент). Освен това изобретението се основава на определяне и структурно характеризиране на първичната и вторична структура на променливи леки и тежки вериги на тези имуноглобулини и идентифицирането на остатъци, важни за активността и имуногенността.

Имуноглобулините са характеризирани, което включва една променлива лека и/или променлива тежка верига на предпочитаните моноклонални имуноглобулини, описани тук. Предпочитани имуноглобулини, например, терапевтични имуноглобулини, са характеризирани, което включва една хуманизирана променлива лека и/или хуманизирана променлива тежка верига. Предпочитана променлива лека и/или променлива тежка вериги, включва една определяща комплементарността област (CDR) от моноклоналния имуноглобулин, например донорен имуноглобулин) и променливи области на рамката за четене, главно от един човешки акцепторен имуноглобулин. Фразата “главно от човешки акцепторен имуноглобулин” означава, че голямата част от ключовите остатъци на рамката са от човешка акцепторна последователност, което обаче позволява, заместване на остатъците в известни позиции с остатъци подбрани за подобряване активността на хуманизиран имуноглобулин (например, променя активността така, че тя поблизко наподобява активността на донорния имуноглобулин), или подбрани да понижават имуногенността на хуманизирания имуноглобулин.

В едно изпълнение, изобретението характеризира лека или тежка верига на хуманизиран имуноглобулин, което включва 3D6 променлива област на определящите комплементарността области (CDRs) (т.е.вкпючва една, две или три CDRs от последователността на променливата област на леката верига, представена в SEQ ID N0:4), и включва една променлива област на рамката, която е главно от човешка акцепторна имуноглобулинова лека или тежка последователност, като се осигурява, че най-малко един остатък от остатъка на рамката е обратно мутиран до съответен миши остатък, където споменатата обратна мутация не засяга съществено способността на веригата да насочва Αβ свързването.

В друго изпълнение, изобретението характеризира хуманизирана имуноглобулинова лека или тежка верига, която включва 3D6 променлива област на определящите комплементарността области (CDRs) (например, една, две или три CDRs от последователността на лековерижната променлива област, представена като SEQ ID NO: 2 и/или включва една, две или три CDRs от последователността на тежковерижната променлива област, представена като SEQ ID NO: 4), и включва една променлива област на рамката, главно от човешки акцепторен имуноглобулин леко- или тежковерижна последователност, като се осигурява, че най-малко един остатък на рамката е заменен със съответен аминокиселинен остатък от мишата 3D6 последователност на леко или тежковерижната променлива област, където остатъкът на рамката е подбран от групата състояща се от (а) един остатък, който свързва не-ковалентно антиген директно; (Ь) един остатък съседен на една CDR; (с) един CDRвзаимодействуващ остатък (например, идентифициран чрез моделиране на лека или тежка верига върху решената структура на хомоложна известна имуноглобулинова верига); и (d) остатък участвуващ на границата на VL-VH.

В друго изпълнение, изобретението характеризира хуманизирана имуноглобулинова лека или тежка верига, която включва 3D6 променливи области CDRs и променливи области на рамката от човешка акцепторна имуноглобулинова лека или тежковерижна последователност, като се осигурява, че най-малко един остатък на рамката е заменен със съответен аминокиселинен остатък от мишата 3D6 последователност на леко или тежковерижната променлива област, където остатъкът на рамката е остатък способен да засяга конформацията на лековерижната променлива област или функция, както е идентифицирано с анализ на един три-димензионален модел на променливата област, например остатък, способен да взаимодейства с антиген, остатък проксимален на антиген свързващо място, остатък способен да взаимодейства с една CDR, остатък, съседен на една CDR, остатък в рамките на 6А на един CDR остатък, един признат остатък, един остатък на спомагателна зона, един междуверижен пакетиращ остатък, един необичаен остатък или остатък на место на гликозилиране върху повърхността на структурния модел.

В друго изпълнение, изобретението характеризира хуманизирана иммуноглобулинова лека верига, която включва 3D6 променливи области CDRs (например, от 3D6 последователност на лековерижната променлива област, представена като SEQ ID N0:2) и включва една човешка акцепторна имуноглобулинова променлива област на рамката, като се осигурява, че поне един остатък на рамката, подбран от група състояща се от L1, L2, L36 и L46 (Kabat конвенция за номериране), е заменен със съответен аминокиселинен остатък от мишата 3D6 последователност на лековерижната променлива област. В друго изпълнение, изобретението характеризира хуманизирана имуноглобулинова тежка верига, която включва 3D6 променливи области CDRs (например, от 3D6 последователността на тежковерижната променлива област, представена като SEQ ID N0: 4) и включва една променлива област на рамката на човешки акцепторен имуноглобулин, като се осигурява, че поне един остатък на рамката, подбран от групата състояща се от Н49, Н93 и Н94 (Kabat конвенция за номериране) е заменен със съответен аминокиселинен остатък от мишата 3D6 последователност на тежковерижната променлива област.

Предпочитани леки вериги включват kappa II области на рамката на подвида kappa II (Kabat конвенция), например области на рамката от акцепторния имуноглобулин Kabat ID 019230, Kabat 005131, Kabat ID 005058, Kabat ID 005057, Kabat ID 005059, Kabat ID U21040 и Kabat ID U41645. Предпочитани тежки вериги включват области на рамката на подвид III (Kabat конвенция), например области на рамката от акцепторния имуноглобулин Kabat ID 045919, Kabat ID 000459, Kabat ID 000553, Kabat ID 000386 и Kabat ID M23691.

В друго изпълнение, изобретението характеризира хуманизирана имуноглобулинова лека или тежка верига, която включва 10D5 променлива област на определящи комплементарността области (CDRs) (т.е. включва една, две или три CDRs от последователността на лековерижната променлива област, представена като SEQ ID N0:14 или включва една, две или три CDRs от последователността на тежковерижната променлива област, представена като SEQ ID N0:16) и включва една променлива област на рамката, главно от последователността на човешка акцепторна имуноглобулинова лека или тежка верига, като се осигурява, че поне един остатък от остатъка на рамката е обратно мутиран със съответен миши остатък, където споменатата обратна мутация не засяга съществено способността на веригата да насочва Αβ свързване.

В друго изпълнение, изобретението характеризира хуманизирана имуноглобулинова лека или тежка верига, която включва 10D5 променливи регионални определящи комплементарността o6nac™(CDRs) (например, включва една, две или три CDRs от последователността на лековерижната променлива област, представена като SEQ ID N0:14 и/или включва една, две или три CDRs от последователността на тежковерижната променлива област, представена като SEQ ID N0:16) и включва една променлива област на рамката, главно от последователност на човешка имуноглобулинова леко или тежковерижна променлива верига, като се осигурява, че поне един остатък на рамката е заменен със съответен аминокиселинен остатък от мишата 3D6 последователност на леко или тежковерижна променлива област, където остатъкът на рамката е подбра от група състояща се от (а) остатък, който свързва не-ковелентно антиген директно; (Ь) остатък съседен на една CDR; (с) CDR-взаимодействащ остатък (например, идентифициран чрез моделиране на леката или тежката верига на решената структура на една хомоложна имуноглобулинова верига); и (d) остатък участвуващ на границата между VL-VH.

В друго изпълнение, изобретението характеризира една хуманизирана имуноглобулинова лека или тежка верига, която включва 10D5 променливи области CDRs и променливи области на рамката от последователност на човешка акцепторна имуноглобулинова лека или тежка верига, като се осигурява, че поне един остатък на рамката е заменен със съответен аминокиселинен остатък от миша 10D5 последователност на леко или тежковерижна променлива област, където остатъкът на рамката е остатък способен да засяга конформация или функция на лековерижната променлива област, както е идентифицирано с анализ на тридимензионален модел на променливата област, например, остатък способен да взаимодейства с CDR, остатък съседен на CDR, остатък в рамките на 6А на един CDR остатък, един признат остатък, един остатък на спомагателна зона, един вътреверижен пакетиращ остатък, необичаен остатък или остатък на гликозилиращо място по повърхността на структурния модел.

В друго изпълнение, изобретението характеризира, в допълнение на замените описани по-горе, една замяна на най-малко един рядък човешки остатък на рамката. Например, един рядък остатък маже да бъде заменен с аминокиселинен остатък, който е общ за последователности на човешка променлива област в тази позиция. По избор, един рядък остатък може да бъде заменен със съответен аминокиселинен остатък от една хомоложна последователност на променлива област на зародишева линия (например, рядък лековерижен остатък на рамката може да бъде заменен със съответен остатък на зародишева линия от една А1, А17, А18, А2 или А19 имуноглобулинова последователност на зародишева линия или рядък тежковерижен остатък на рамката може да бъде заменен със съответен остатък на зародишева линия от VH3-48, VH3-23, VH3-7, VH-3-21 или VH3-11 имуноглобулинова последователност на зародишева линия.

В друго изпълнение, изобретението характеризира хуманизиран имуноглобулин, който включва една лека и една тежка верига, както е описано по-горе, или антиген-свързващ фрагмент на споменатия имуноглобулин. В едно примерно изпълнение, хуманизираният имуноглобулин свързва (например, свързва специфично) бета амилоиден протеин (Αβ) със свързващ афинитет от най-малко 10⁷ Μ'¹, 10⁸ М'¹ или 10⁹ М'¹. В друго изпълнение, имуноглобулинът или антиген свързващият фрагмент включва една тежка верига, притежаваща изотип γ1. В друго изпълнение, имуноглобулинът или антиген свързващият фрагмент се свързва (например, специфично се свързва) за двата - разтворим бета амилоиден пептид (Αβ) и агрегиран Αβ. В друго изпълнение, имуноглобулинът или антиген свързващият фрагмент медиира фагоцитоза (например, индуцира фагоцитоза) на бета амилоиден пептид (Αβ). В друго изпълнение, имуноглобулинът или антиген свързващият фрагмент преминава кръвно-мозъчната бариера на даден индивид. В друго изпълнение, имуноглобулинът или антиген свързващият фрагмент редуцира натрупвания от бета амилоиден пептид (Αβ) и невритна дистрофия у даден индивид.

В друго изпълнение, изобретението характеризира химерни имуноглобулини, които включват 3D6 променливи области (например, последователности на променливата област представени като SEQ ID N0:2 или SEQ ID N0:4). В друго изпълнение, изобретението характеризира имуноглобулин или негов антиген-свързващ фрагмент, включително една променлива тежковерижна област, както е представена в SEQ ID N0:8 и една променлива лековерижна област както е представена в SEQ ID N0:5. В друго изпълнение, изобретението характеризира имуноглобулин или негов антиген-свързващ фрагмент, включително една променлива тежковерижна област, както е представена в SEQ ID N0:12 и една променлива лековерижна област, както е представена в SEQ ID N0:11. В друго изпълнение, изобретението характеризира химерни имуноглобулини, които включват 10D5 променливи области (например, последователностите на променлива област представени като SEQ ID N0:14 или SEQ ID N0:16). В друго изпълнение, имуноглобулинът или неговият антиген-свързващ фрагмент освен това включва константни области от lgG1.

Имуноглобулините описани тук, са особено подходящи за употреба в терапевтични методи, предвидени за профилактика или лечение на амилоидогенни болести. В едно изпълнение, изобретението характеризира метод за профилактика или лечение на амилоидогенно заболяване (например, болест на Alzheimer), характеризиращ се с това, че се въвежда на пациент ефективна дозировка от хуманизиран имуноглобулин, както е описано тук. В друго изпълнение, изобретението характеризира фармацевтични препарати, които включват хуманизиран имуноглобулин, както е описано тук и фармацевтичен носител. Също са характеризирани изолирани молекули нуклеинова киселина, вектори и клетки гостоприемници, за получаване на имуноглобулини или имуноглобулинови фрагменти или вериги описани тук, както и методи за получаване на споменатите имуноглобулини, имуноглобулинови фрагменти или имуноглобулинови вериги.

Освен това настоящето изобретение характеризира метод за идентифициране на 3D6 или 10D5 остатъци, податливи на заместване, когато се произвежда един хуманизиран 3D6 или 10D5 имуноглобулин, съответно. Например, метод за идентифициране остатъци на променлива област на рамката, податливи на замяна, включва моделиране на три-димензионална структура на 3D6 или 10D5 променлива област на една решена хомоложна имуноглобулинова структура и анализиране на споменатия модел за остатъци, способни за засягат 3D6 или 10D5 конформация или -ж функция на имуноглобулин променливата област, като са идентифицирани остатъци податливи на замяна. Изобретението освен това характеризира употреба на последователността на променлива област, представена като SEQ ID N0:2 или SEQ ID N0:4, или някаква нейна част, при получаване на тридимензионален образ на 3D6 имуноглобулин, 3D6 имуноглобулинова верига или домен от нея. Също е характеризирана употреба на последователност на променлива област, представена като SEQ ID N0:14 или SEQ ID N0:16, или някаква част от нея, при получаване на три-димензионален образ на 10D5 имуноглобулин, 10D5 имуноглобулинова верига или домен от нея.

ф

Преди да се описва изобретението, може да бъде полезно за едно негово разбиране, да се представят дефиниции на някои термини използвани по-нататък.

Терминът “имуноглобулин” или “антитяло” (използван тук взаимозаменяемо) се отнася за антиген-свързващ белтък, притежаващ една основна четири-полипептид верижна структура, състояща се от две тежки и две леки вериги, споменатите вериги бидейки стабилизирани, например, чрез междуверижни дисулфидни връзки, които имат способността да свързват специфично антиген. И двете - тежки и леки вериги са нагънати в домени. Терминът “домен” се отнася за глобуларна област на тежко или лековерижен полипептид, съдържащ пептидни бримки (например, съдържащ 3 до 4 пептидни бримки) стабилизирана, например, чрез β-нагънат лист и/или междуверижна дисулфидна връзка. Домените по-нататък се обозначават тук като “ константен” или “променлив”, въз основа на относителната липса на промяна в последователността в рамките на домените на различни класове членове, в случая на “константен” домен, или значителната промяна в домените на различни класове членове, в случая на “променлив” домен. “Константни” домени на леката верига се отнасят за взаимозаменяеми “константни области © на лека верига”, “константни домени на лека верига”, “CL” области или “CL” домени). “Константни” домени на тежката верига се отнасят за взаимозаменяеми “константни области на тежка верига”, “константни домени на тежка верига”, “CL” области или “CL” домени). “Променливи” домени на леката верига се отнасят за взаимозаменяеми “променливи области на лека верига”, “променливи домени на лека верига”, “VL” области или “VL” домени). “Променливи” домени на леката верига се отнасят за взаимозаменяеми “константни области на тежка верига”, “константни домени на тежка верига”, “СН” области или “СН” домени).

Терминът “област” се отнася за част или порция от V антитяло веригата и включва константни или променливи домени както тук е дефинирано, както и по-дискретни части или порции на споменатите домени. Например, променливи домени или области на лека верига включват “определящи комплементарността области” или “CDRs” разпръснати помежду “области на рамката” или “FRs”, както е дефинирано тук.

Имуноглобулини или антитела могат да съществуват в мономерна или полимерна форма. Терминът “антиген-свързващ фрагмент” се отнася за полипептиден фрагмент на имуноглобулин или антитяло, който свързва антиген или конкурира с интактно антитяло (т.е. с интактно антитяло, от което те са производни) за свързване с антиген (т.е. специфично свързване). Терминът “конформация” се отнася за терциерна структура на протеин или полипептид (например едно антитяло, антитяло верига, негов домен или област). Например, фразата “конформация на лека (или тежка) верига” се отнася за терциерна структура на променлива област на лека (или тежка) верига и фразата “конформация на антитяло” или “конформация на антитяло фрагмент” се отнася за терциерна структура на антитяло или негов фрагмент.

“Специфично свързване” на антитяло означава, че антитялото проявява значителен афинитет към антигена или предпочитан епитоп и предпочитано, не проявява значима кръстосана активност. “Значително” или предпочитано свързване включва свързване с един афинитет най-малко от порядъка на 10⁶, 10⁷, 10⁸, 10⁹М'¹ или 10¹°Μ'¹. Афинитети по-големи от 10⁷М'¹, предпочитано по-големи от Ί0⁸ М’¹ са по-предпочитани. Стойности междинни на тези представени тук, също се предвиждат от обсега на настоящето изобретение и един предпочитан свързващ афинитет може да бъде показан като порядък от афинитети, например 10⁶ до 10¹°М’¹, предпочитано 10⁷ до Ю¹⁰ М'¹, по-предпочитано 10⁸ до Ю¹⁰ М’¹. Антитяло, което “не проявява значима кръстосана активност” е такова, което няма да се свързва забележимо с нежелана единица (например, нежелана белтькоподобна единица). Например, антитяло, което специфично се свързва с Αβ, значително свързва Αβ, но няма да реагира значимо с не-Αβ белтъци или пептиди (например, не-Αβ белтъци или пептиди включени в плаки). Антитяло специфично за предпочитан епитоп, например няма да реагира значимо кръстосано с далечни епитопи на същия белтък или пептид. Специфично свързване може да бъде определено съгласно всеки признат способ в тази област, за определяне на такова свързване. Предпочитано, специфично свързване е определяно съгласно Scatchard анализ и/или тестове за конкурентно свързване.

Свързващи фрагменти са получени с рекомбинантни ДНК техники, или ензимно, или химично разцепване на интакгни имуноглобулини. Свързващи фрагменти включват Fab, Fab’, F(ab’)2, Fabc, Fv, единични вериги и едноверижни антитела. Приема се, че други освен “биспецифични” или “бифункционапни” имуноглобулини или антитела, имуноглобулин или антитяло имат идентични всяко от неговите свързващи места. Едно “биспецифично” или “бифункционално антитяло” е изкуствено хибридно антитяло, притежаващо два различни тежко/лековерижни чифта и две различни свързващи места. Биспецифични антитела могат да бъдат получени с различни методи, включително фузия на хибридоми или свързване на Fab’ фрагменти. Виж, например, Songsivilai &Lachmann, Clin.Exp.lmmunol. 79:315-321 (1990); Kostelny et al., J.Immunol. 148, 1547-1553 (1992).

Терминът “хуманизиран имуноглобулин” или “хуманизирано антитяло” се отнася за имуноглобулин или антитяло, който включва най-малко една хуманизирана имуноглобулинова или антитяло

верига (т е. най-малко една хуманизирана лека или тежка верига).

Терминът “хуманизирана имуноглобулинова “хуманизирана антитяло верига” (т.е. една имуноглобулинова лека верига” или верига” или “хуманизирана хуманизирана имуноглобулинова тежка верига”), се отнася за имуноглобулинова или антитяло верига (т.е. лека или тежка верига, съответно), притежаваща променлива област, която включва променлива област на рамката, главно от човешки имуноглобулин или антитяло и определящи комплементарността области (CDRs) (например, поне една CDR, предпочитано две CDRs, по-предпочитано три CDRs) главно от не-човешки имуноглобулин или антитяло и освен това включва константни области (например, поне една константна област или част от нея, в случая с лека верига , и предпочитано три константни области в случая с тежка верига). Терминът “хуманизирана променлива област” (например, “хуманизирана лековерижна променлива област” или “хуманизирана тежковерижна променлива област”) се отнася за променлива област, която включва една променлива област на рамката, главно от човешки имуноглобулин или антитяло и определящи комплементарността области (CDRs), главно от не-човешки имуноглобулин или антитяло.

Фразата “главно от човешки имуноглобулин или антитяло” © или “главно човешки” означава, че когато се подравни с човешка имуноглобулин и антитяло аминокиселинна последователност за сравнение, областта споделя най-малко 80-90%, предпочитано 9095%, по-предпочитано 95-99% идентичност (т.е. локална идентичност на последователността) с човешката рамка или последователност на постоянна област, разрешавайки, например консервативни замени, замени на консензус последователности, замени на зародишева линия, обратни мутации и подобни. Въвеждането на консервативни замени, замени на консензус последователности, замени на зародишева линя, обратни мутации и подобни, често се определя като “оптимизация” на хуманизирано © антитяло или верига. Фразата “главно от не-човешки имуноглобулин или антитяло” или “главно не-човешки” означава наличие на имуноглобулин или антитяло последователност най-малко 80-95%, предпочитано 90-95%, по-предпочитано, 96%, 97%, 98% или 99% идентична с такава на не-човешки организъм, например, не-човешки бозайник.

Съответно на това, всички области или остатъци на хуманизиран имуноглобулин или антитяло, или на хуманизирана имуноглобулинова или антитяло верига, възможно с изключение на CDRs, са съществено идентични със съответните области или остатъци на една или повече природни човешки имуноглобулинови последователности. Терминът “съответстваща област” или “съответстващ остатък” се отнася за област или остатък на една втора аминокиселина или нуклеотидна последователност, която заема същата (т.е. еквивалентна) позиция, както област или остатък на една първа аминокиселинна или нуклеотидна последователност, когато първата и втората последователности са оптимално подравнени за сравнение.

Термините “хуманизиран имуноглобулин” или “хуманизирано антитяло” не са предвидени да обхващат химерни имуноглобулини или антитела, както е дефинирано по-долу. Въпреки че хуманизирани имуноглобулини и антитела са химерни в тяхната конструкция (т.е. включват области от повече от един вид белтък), те включват допълнителни характеристики (т.е. променливи области съдържащи донорни CDR остатъци и акцепторни остатъци на рамката), които не се намират в химерни имуноглобулини или антитела, както е дефинирано тук.

Терминът “значителна идентичност” означава, че две полипептидни последователности, когато са оптимално подравнени, както с програмата GAP или BESTFIT, използвайки зададен

интервал на теглата, споделят най-малко 50-60% идентичност на последователността, последователността, последователността, предпочитано 60-70% идентичност на по-предпочитано 70-80% идентичност на по-предпочитано най-малко 80-90% идентичност на последователността и още по-предпочитано най малко 90-95% идентичност на последователността, и още по предпочитано най-малко 95% идентичност на последователността или повече (например 99% идентичност на последователността или повече). Терминът “съществена идентичност” означава, че две полипептидни последователности, когато са оптимално подравнени, както с програмите GAP или BESTIFT, използвайки зададен интервал на теглата, споделят най-малко 80-90% идентичност на последователността, предпочитано 90-95% идентичност на последователността и по-предпочитано най-малко 95% идентичност на последователността или повече (например, 99% идентичност на последователността или повече). За сравнение на последователността, обикновено една последователност служи като референтна последователност, с която се сравняват тестираните последователности. Когато се използва алгоритъм за сравнение на последователности, тест и референтната последователности се въвеждат в компютер, след това се обозначават координати, ако е необходимо, и се обозначават параметрите на програма за алгоритъм на последователности. Алгоритъмът за сравнение на последователности след това изчислява процента идентичност на последователността за тест последователността(тите) спрямо референтната последователност, въз основа на обозначени параметри на програмата. Термините “идентичност на последователност” и “идентичност на последователност” се използват тук взаимозаменяемо.

Оптимално подравняване на последователности за сравнение може да бъде проведено, например, с локалния алгоритъм за хомология на Smith & Waterman, Adv.Appl.Math. 2:482 (1981), c алгоритъма за хомология на подравняване на Needleman & Wunsch, J. Mol.Biol. 48:443 (1970), чрез метода за търсене на сходство на Pearson & Lipman, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:2444 (1988), чрез компютеризирани изпълнения на тези алгоритми (GAP, BESTFIT, FASTA и TFASTA в Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wl), или чрез визуална проверка (виж общо Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology). Един пример на алгоритъм, който е подходящ за определяне процента идентичност на последователността и сходство на последователността, е BLAST алгоритъма, който е описан в Altschul et al., J.Mol.Biol. 215:403 (1990). Софтуерът за провеждане на BLAST анализи е общо достъпен чрез Националния център за биотехнологична информация (National Center for Biotechnology Information) (общо достъпен чрез National Institutes of Health NCBI internet server). Обикновено, зададени параметри на програмата могат да бъдат използвани за провеждане сравнение на последователности, въпреки че могат да бъдат използвани също изработени по поръчка параметри. За аминокиселинни последователности, BLAST програмата използва като зададени дължина на дума (W) 3, очакване (Е) 10 и BLOSUM62 матрикс за отбелязване (виж Henikoff & Henikoff, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:10915(1989)).

Предпочитано, позиции на остатъци, които не са идентични, се диференцират с консервативни аминокиселинни замени. С цел класификация на аминокиселинни замени като консервативни или не-консерватиивни, аминокиселини са групирани както следва: Грула I (хидрофобни странични вериги): leu, met, ala, val, leu, ile; Група II (неутрални хидрофилни странични вериги): cys, ser, thr, Група III (киселинни странични вериги): asp, glu; Грула IV (базични странични вериги): asn, gin, his, lys, arg; Група V (остатъци повлияващи ориентацията на веригата): gly, pro; и Група VI (ароматни странични вериги): trp, tyr, phe. Консервативни замени включват замени между аминокиселини в същия клас. Неконсервативни замени представляват обмен на член от един от тези класове за член на друг.

Предпочитано, хуманизирани имуноглобулини или антитела свързват антиген с афинитет, който е в рамките на един фактор от три, четири или пет от този, на съответно не-човешко антитяло. Например, ако не-човешко антитяло има свързващ афинитет 10⁹ М'¹, хуманизирани антитела ще имат свързващ афинитет наймалко 3 х 10⁹М'¹, 4 х 10⁹М'¹ или 10⁹М'¹. Когато се описват свързващите свойства на една имуноглобулинова или антитяло верига, веригата може да бъде описана въз основа на нейната способност да “насочва свързване на антиген (например, Αβ). Една верига се казва, че “насочва свързване на антиген” когато тя дава на интактен имуноглобулин или антитяло (или техен антиген-свързващ фрагмент) специфично свързващо свойство или свързващ афинитет. Една мутация (например, обратна мутация) се казва, че съществено повлиява способността на една тежка или лека верига да насочва свързване на антиген ако тя засяга (например, понижава) свързващата активност на интактен имуноглобулин или антитяло (или техен антиген-свързващ фрагмент), съдържащи споменатата верига с най-малко един порядък от големина сравнима с тази на антитялото (или негов антиген-свързващ фрагмент), съдържащо еквивалентна верига, която не притежава споменатата мутация. Една мутация “не засяга съществено (например, понижава) способността на една верига да насочва свързването на антиген” ако тя засяга (например, понижава) свързващия афинитет на инактен имуноглобулин или антитяло (или техен антиген-свързващ фрагмент), съдържащи споменатата верига с един фактор от две, три или четири на този на антитялото (или негов антиген-свързващ фрагмент), съдържащ еквивалентна верига не притежаваща споменатата мутация.

Терминът “химерен имуноглобулин” или антитяло се отнася за имуноглобулин или антитяло, чиито леки или тежки вериги произхождат от различни видове. Могат да бъдат конструирани химерни имуноглобулини или антитела, например чрез генно инженерство, от имуноглобулинови генни сегменти, принадлежащи на различни видове.

“Антиген” е единица (например протеинова единица или пептид), за която се свързва специфично антитялото.

Терминът “епитоп” или “антигенен детерминант” се отнася за място върху даден антиген, за което специфично се свързва един имуноглобулин или антитяло (или техен антиген свързващ фрагмент). Епитопи могат да се образуват от съседни аминокиселини или не-съседни аминокиселини в съседство с терциерно нагъване на един белтък. Епитопи получени от съседни аминокиселини обикновено се задържат при излагане на денатуриращи разтворители, докато епитопи образувани от терциерно нагъване обикновено се загубват при третиране с денатуриращи разтворители. Един епитоп обикновено включва наймалко 3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14 или 15 аминокиселини в уникална пространствена конформация. Методи за определяне пространствената конформация на епитопи включват, например, рентгенова кристалография и 2-димензионален ядрено-магнитен резонанс. Виж, например Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol.66, G.E.Morris, Ed. (1996).

Антитела, които разпознават един и същ епитоп могат да бъдат идентифицирани с проста имунопроба, показваща способността на едно антитяло да блокира свързването на друго антитяло с прицелен антиген, т.е. тест за конкурентно свързване. Конкурентно свързване е определяно в проба, в която тестираният имуноглобулин инхибира специфично свързване на референтно антитяло с общ антиген, като Αβ. Известни са многобройни типове проби за конкурентно свързване, например: твърдофазен директен или индиректен радиоимунотест (RIA), твърдофазен директен или индиректен ензимен имунотест (ΕΙΑ), сандвичов конкурентен тест (виж, Stahli et al., Methods in Enzymology 9:242 (1983)); твърдофазен директен биотин-авидин EIA (виж Kirkland et al., J.Immunol. 137:3614 (1986)); твърдофазен директен белязан тест, твърдофазен директен белязан сандвичов тест (виж Harlow and Lane,: Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (1988)); твърдофазен директен белязан RIA използвайки 1-125 белязане (виж Morel et al., Mol.Immunol. 25(1):7 (1988)); твърдофазен директен биотин-авидин EIA (Cheung et al., Virology 176:546 (1990)); и директен белязан RIA. (Moldenhauer et al., Scand.J.Immunol. 32:77 (1990)). Обикновено, такъв тест включва употреба на пречистен антиген свързан за твърда повърхност или клетки, носещи и двата - един небелязан тест имуноглобулин и един белязан референтен имуноглобулин. Конкурентно инхибиране е измервано чрез определяне количеството на белега, свързан към твърдата повърхност или клетки в присъствие на тестиран имуноглобулин. Обикновено тестираният имуноглобулин се намира в излишък. Обикновено, когато едно конкурентно антитяло се намира в излишък, то ще инхибира специфично свързване на референтно антитяло с общ антиген най-малко с 50-55%, 55-60%, 60-65%, 65-70%, 70-75% или повече.

Един епитоп се разпознава също от имунологични клетки, например, В клетки и/или Т клетки. Клетъчно разпознаване на епитоп може да бъде определено с in vitro тестове, които измерват антиген-зависима пролиферация, определена с включване на Н³тимидин, секреция на цитокин, антитяло секреция или антигензависимо убиване (цитотоксичен Т лимфоцитен тест).

Примерни епитопи или антигенни детерминанти могат да бъдат открити в човешки амилоиден прекурсорен протеин (АРР), но предпочитано се откриват в Αβ пептид на АРР. Съществуват множествени изоформи на АРР, например АРР⁶⁹⁵ АРР⁷⁵¹ и АРР⁷⁷⁰. Аминокиселини в АРР са с отбелязани номера, съответно на последователността на АРР⁷⁷⁰ изоформата (виж например, GenBank Accession No. Р05067, представена също като SEQ ID NO: 38). Αβ (също тук означен като бета амилоиден пептид и А-бета) пептид е един ~4-kDa вътрешен фрагмент от 39-43 аминокиселини на АРР (Αβ39, Αβ40, Αβ41, Αβ42 и Αβ43). Αβ40 например се състои от остатъци 672-711 на АРР и Αβ42 се състои от остатъци 673-713 на АРР. В резултат на протеолитично процесиране на АРР с различни секретазни ензими in vivo или in situ, Αβ се открива и в двете - една “къса форма с 40 аминокиселини дължина и една “дълга форма” в границите на 42-43 аминокиселини дължина. Предпочитани епитопи или антигенни детерминанти, както тук е описано, са локализирани в N-края на Αβ пептида и включват остатъци в рамките на аминокиселини 1-10 на Αβ, предпочитано от остатъци 1-3, 1-4, 1-5, 16, 1-7 или 3-7 на Αβ42. Допълнителни обозначени епитопи или антигенни детерминанти включват остатъци 2-4, 5,6,7 или 8 на Αβ, остатъци 3-5, 6,7,8 или 9 на Αβ или остатъци 4-7, 8, 9 или 10 на Αβ42.

Терминът “амилоидогенно заболяване” включва всяко заболяване свързано с (или предизвикано) от образуване или отлагане на неразтворими амилоидни фибрили. Примерни амилоидогенни заболявания включват, но не се ограничават до системни амилоидози, болест на Alzheimer, развито начало на диабет, болест на Parkinson, болест на Huntington, фронтотемпорална деменция, прион-свързани трансмисивни спонгиоформени енцефалопатии (kuru и болест на Creutzfeld-Jacob у хора и scrapie и BSE у овце и телета, съответно). Различни амилоидогенни заболявания са определени или характеризирани по природата на полипептидния компонент на фибрилните отлагания. Например, у индивиди или пациенти с болест на Alzheimer, β-амилоиден протеин (например, див тип, вариант или скъсен βамилоиден протеин) е характеризиращият полипептиден компонент на амилоидното отлагане. Съответно, болестта на Alzheimer е пример на “заболяване характеризиращо се с отлагания на Αβ” или “заболяване свързано с отлагания на Αβ”, например в мозъка на индивид или пациент. Термините “β-амилоиден протеин”, “β амилоиден пептид”, “β-амилоид”, “Αβ” и “Αβ пептид” тук са използвани взаимозаменяемо.

Терминът “ефективна доза” или “ефективна дозировка” е определен като количеството достатъчно да постигне или поне частично да постигне желан ефект. Терминът “терапевтично ефективна доза” е дефиниран като количеството достатъчно да излекува или поне частично да спре развитието на болестта и нейните усложнения у пациент страдащ от заболяването. Количества ефективни за тази употреба зависят от тежестта на инфекцията и общото състояние на имунната система на пациента.

Терминът “пациент” включва човек и други индивиди бозайници, които получават профилактично или терапевтично лечение.

“Разтворим” или “дисоцииран” Αβ се отнася за неагрегиращ или дизагрегиран Αβ полипептид. “Неразтворим” Αβ се отнася за агрегиращ Αβ полипептид, например Αβ се задържа свързан чрез не-ковалентни връзки. Αβ (например, Αβ42) се счита, че агрегира, поне отчасти, което се дължи на наличието на хидрофобни остатъци при С-края на пептида (част от трансмембранния домен на АРР). Един метод за получаване на разтворим Αβ е да се разтвори лиофилизиран пептид в чист DMSO чрез ултразвук. Полученият разтвор се центрофугира за отстраняване на неразтворени частици..

I. Имунологични и терапевтични реагенти

Имунологични и терапевтични реагенти на изобретението включват или се състоят от имуногени или антитела, или техни функционални или антиген-свързващи фрагменти, както тук е определено. Основната структурна единица на антитялото е известно, че съдържа един тетрамер от субединици. Всеки тетрамер е изграден от два идентични чифта полипептидни вериги, всеки чифт притежава една “лека” (около 25kDa) и една “тежка” верига (около 50-70kDa). Амино-крайната част на всяка верига включва една променлива област от около 100 до 110 или повече аминокиселини, първично отговорни за антигенното разпознаване. Карбокси-крайната част на всяка верига определя една константна област, първично отговорна за ефекторната функция.

Леките вериги са класифицирани като kappa или lambda и са около 230 остатъка дължина. Тежки вериги са класифицирани като gamma (γ), mu (μ), alpha (α), delta (δ) или epsilon (ε) и са около 450-600 остатъка дължина, и определят изотипа на антитялото като IgG, IgM, IgA, IgD и IgE , съответно. Тежки и леки вериги са нагънати на домени. Терминът “домен” се отнася за глобуларна област на белтък, например, имуноглобулин или антитяло. Имуноглобулинови или антитяло домени включват например, 3 или четири пептидни бримки, стабилизирани чрез β-нагъване и една междуверижна дисулфидна връзка. Интактни леки вериги имат например, два домена (V_L и C_L) и интактни тежки вериги имат например, четири или пет домена (Vh, С_н1, С_н2 и С_н3).

В леките и тежки вериги, променливите и константни области са свързани чрез една “J” област от около 12 или повече аминокиселини, с тежката верига включваща също една “D” област от около 10 или повече аминокиселини, (виж общо, Fundamental Immunology (Paul, W., ed., 2^nd ed. Raven Press, N.Y. (1989), Ch. 7, включена чрез цитат в нейната цялост за всякакви цели).

Променливите области на всеки лек/тежък верижен чифт образуват антитяло свързващото място. С изключение при бифункционални или биспецифични антитела, двете свързващи места са еднакви. Веригите показват същата обща структура на относително консервирани области на рамката (FR), свързани чрез три хиперпроменливи области, също наречени области определящи комплементарността или CDRs. Природно-срещащи се вериги или рекомбинантно създадени вериги могат да бъдат експресирани с една лидерна последователност, която е отстранена при клетъчното процесиране за получаване на зрялата верига. Зрели вериги могат също да бъдат получени рекомбинантно, притежаващи една неприродно срещаща се лидерна последователност, например, за повишаване секрецията или за промяна процесирането на дадена верига, която е от интерес.

CDRs на двете зрели вериги от всеки чифт са подравнени с областите на рамката, като се дава възможност за свързване със специфичен епитоп. От N-края до С-края, леки и тежки вериги съдържат домените FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CFR3 и FR4. “FR4” също се определя като D/J област на променливата тежка верига и J областта на променливата лека верига. Обозначението на аминокиселини към всеки домен е в съответствие с дефинициите на Kabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1987 и 1991). Алтернативна структурна дефиниция е предложена от Chothia et al., J.Mol.Biol. 196:901 (1987); Nature 342:878 (1989); и J.Mol.Biol. 186:651 (1989) (оттук нататък колективно цитирана като “Clothia et at.” и включена чрез цитат в нейната цялост за всякакви цели).

А. Αβ Антитела

Терапевтични агенти на изобретението включват антитела, които специфично свързват Αβ или друг компонент на амилоидните плаки. Такива антитела могат да бъдат моноклонални или поликлонални. Някои такива антитела се свързват специфично с агрегираната форма на Αβ без да се свързват с разтворимата форма. Някои се свързват с разтворимата форма без да се свързват с агрегираната форма. Някои се свързват и с двете - агрегирана и разтворима форми. Някои такива антитела се свързват с природно срещаща се къса форма на Αβ (т.е., Αβ39, 40 или 41) без да се свързват с природно срещаща се дълга форма на Αβ (т.е., Αβ42 и Αβ43). Някои антитела се свързват с дълга форма на Αβ без да се свързват с къса форма. Някои антитела се свързват с Αβ без да се свързват с пълноверижен амилоид прекурсорен протеин. Антитела използвани в терапевтични методи, предпочитано имат една интактна константна област или поне достатъчно от константната област, за да взаимодейства с един Fc рецептор. Човешки изотип lgG1 е предпочитан, тъй като той има най-висок афинитет от човешките изотипове за FcRI рецептор по фагоцитни клетки. Също могат да бъдат използване биспецифични Fab фрагменти, при което едното рамо на антитялото има специфичност за Αβ и другото за Fc рецептор. Предпочитани антитела се свързват с Αβ със свързващ афинитет по-голям от (или равен на) около 10⁶, 10⁷, 10⁸, 10⁹ или 1О¹⁰ М‘¹ (включително афинитети междинни на тези стойности).

Поликлонални серуми обикновено съдържат смесени популации антитела, свързващи се с няколко епитопи по дължината на Αβ. Обаче, поликлонални серуми могат да бъдат специфични за даден сегмент на Αβ, като Αβ1-1Ο. Моноклонални антитела се свързват със специфичен епитоп в Αβ, който може да бъде конформационен или не-конформационен епитоп. Профилактична и терапевтична ефикасност на антитела може да бъде тестирана като се използват процедури на трансгенен животински модел, описани в Примери. Предпочитани моноклонални антитела се свързват с епитоп в диапазона на остатъци 1-10 на Αβ (с първия N краен остатък на природен Αβ обозначен 1). Някои предпочитани моноклонални антитела се свързват с епитоп между аминокиселини 1-5 и някои с епитоп между 5-10. Някои предпочитани антитела се свързват с епитопи между аминокиселини 1-3, 1-4, 1-5, 1-6, 1-7 или

3-7. Някои предпочитани антитела се свързват с епитоп започващ при остатъци 1-3 и завършващ при остатъци 7-11 на Αβ. По-малко предпочитани антитела включват такива свързващи се за епитопи с остатъци 10-15, 15-20, 25-30, 10-20, 20, 30, или 10-25 на Αβ. Препоръчва се такива антитела да бъдат скринирани за активност преди употреба на мишите модели описани в Примери. Например, намерено е, че някои антитела за епитопи между остатъци 10-18, 1624,18-21 и 33-42 нямат активност (например, нямат способността да редуцират натрупването на плаки и/или да разнасят невритната патология свързана с болестта на Alzheimer). В някои методи, са използвани множествени моноклонални антитела, притежаващи свързващи специфичности за различни епитопи. Такива антитела могат да бъдат въведени последователно или едновременно. Антитела срещу амилоидни компоненти, различни от Αβ също могат да бъдат използвани (например, въведени или въведени като придружаващи). Например, антитела могат да бъдат насочени срещу амилоида свързан с белтъка синуклеин.

Когато се казва, че едно антитяло се свързва с епитоп между специфични остатъци, като Αβ 1-5 например, се счита, че антитялото специфично се свързва с полипептид, съдържащ специфични остатъци (т.е. Αβ 1-5 в този пример). Такова антитяло не контактува обезателно с всеки остатък в Αβ 1-5. Нито всяка единична аминокиселинна замяна или делеция в Αβ1-5 обезателно значимо засяга свързваща активност. Специфичност на епитопа на една антитяло може да бъде определена, например, чрез образуване на фагов дисплей библиотека, в която различни членове проявяват различни въздействия на Αβ. След това фагов дисплей библиотеката е селекционирана за членове специфично свързващи се с тестирано антитяло. Изолирано е семейство от последователности. Обикновено, такова семейство съдържа обща сърцевинна последователност и различни дължини фланкиращи последователности в различни членове. Най-късата сърцевинна последователност проявяваща специфично свързване с антитялото, определя епитопа свързан с антитялото. Антитела могат също да бъдат тестирани за специфичност на епитоп в конкурентен тест с антитяло, чиято специфичност на епитопа е предварително определена. Например, антитела, които конкурират с 3D6 антитяло за свързване с Αβ, се свързват за същия или сходен епитоп като 3D6, т.е. в диапазона на остатъци Αβ 1-5. Подобно антитела, които конкурират с 10D5 антитяло се свързват със същия или сходен епитоп, т.е. в диапазона на участъци Αβ 3-7. Скриниране на антитела за специфичност на епитоп е полезно предсказване за терапевтична ефикасност. Например, антитяло определено, че се свързва с епитоп в диапазона на остатъци 1-7 на Αβ е възможно да бъде ефективно за профилактика и лечение на болест на Alzheimer, съгласно методологиите на настоящето изобретение.

Моноклонални или поликлонални антитела, които специфично се свързват с предпочитан сегмент на Αβ, без да се свързват с други области на Αβ, имат известен брой предимства пред моноклонални антитела, свързващи се с други области или поликлонални серуми с инатктен Αβ. Първо, за равни по маса дозировки, дозировки на антитела, които специфично се свързват с предпочитани сегменти, съдържат по-висока моларна дозировка на антитела, ефективни за очистване на амилоидни плаки. Второ, антитела, които специфично свързват предпочитани сегменти, могат да индуцират очистващ отговор срещу амилоидни отлагания, без да индуцират очистващ отговор срещу интактен АРР полипептид, при което се редуцират потенциалните странични ефекти.

1. Получаване на не-човешки антитела

Настоящето изобретение характеризира не-човешки антитела, например, антитела притежаващи специфичност за предпочитани Αβ епитопи на изобретението. Такива антитела могат да бъдат използвани при комбиниране на различни терапевтични препарати на изобретението или, предпочитано, предоставят определящи комплементарността области за получаване на хуманизирани и химерни антитела (описани подробно по-долу). Получаване на не-човешки моноклонални антитела, например, миши, от морски свинчета, бозайници, заек или плъх, може да се изпълни като се имунизира животно с Αβ. Могат също да бъдат използвани по-дълъг пептид, включващ Αβ или имуногенен фрагмент на Αβ или анти-идиотипни антитела на антитяло срещу Αβ. Виж, Harlow & Lane, по-горе, включена чрез цитат за всякакви цели). Такъв имуноген може да бъде получен от природен източник, чрез пептидна синтеза или чрез рекомбинантна експресия. По избор, имуноген може да бъде въведен слет или направен в комплекс с белтък насител, както е описано по-долу. По избор, имуногенът може да бъде въведен с адювант. Терминът “адювант” се отнася за съединение, което когато се въвежда заедно с антиген повишава имунния отговор спрямо антигена, но когато се въвежда самостоятелно не генерира имунен отговор спрямо антигена. Адюванти могат да повишат имунния отговор по няколко механизма, включително лимфоцитно възстановяване, стимулиране на В и/или Т клетки и стимулиране на макрофаги. Могат да бъдат използвани няколко типа адювант, както е описано по-долу. Пълен адювант на Freund, последван от непълен адювант, е предпочитан за имунизиране на лабораторни животни.

Обикновено се използват зайци или морски свинчета за получаване на поликлонални антитела. Примерен препарат за поликлонални антитела, например, за пасивна протекция, може да бъде направен както следва. 125 не-трансгенни мишки са имунизирани със 100 цд Αβ1-42 плюс CFA/IFA и са евтанизирани след 4-5 месеца. Взима се кръв от имунизирани мишки. Отделя се IgG от другите кръвни компоненти. Антитяло специфично за имуногена може частично да се пречисти с афинитетна хроматография. Получава се средно около 0.5-1mg имуногенспецифично антитяло от мишка, което прави общо 60-120 mg.

Обикновно се използват мишки за получаване на моноклонални антитела. Моноклонални антитела могат да бъдат получени срещу фрагмент, чрез инжектиране на фрагмента или подълга форма на Αβ на мишка, изготвяне на хибридоми и скрининг на хибридоми за антитяло, което специфично се свързва с Αβ. По избор, антитела са скринирани за свързване със специфична област или желан фрагмент на Αβ, без да се свързват за други неприпокриващи фрагменти на Αβ. Последният скрининг може да бъде изпълнен чрез определяне свързването на едно антитяло с една колекция от делетирани мутанти на Αβ пептид и определяне кои делетирани мутанти се свързват с антитялото. Свързване може да се определя, например чрез Western blot или ELISA. Най-малкият фрагмент, който показва свързване с антитяло определя епитопа на антитялото. По избор, специфичност на епитоп може да бъде определена с конкурентен тест, в който тестирано и референтно антитяло се конкурират за свързване с Αβ. Ако тестираното и референтното антитяло се конкурират, тогава те се свързват със същия епитоп или епитопи, достатъчно близки, така че свързването на едно антитяло интерферира със свързване на друго. Предпочитаният изотип за такива антитела е мишия изотип tgG2a или еквивалентен изотип в други видове. Миши изотип lgG2a е еквивалентният на човешки изотип lgG1.

2. Химерни и хуманизирани антитела

Настоящето изобретение характеризира също химерни и/или хуманизирани антитела (т.е. химерни и/или хуманизирани имуноглобулини), специфични за бета амилоиден пептид. Химерни и/или хуманизирани антитела имат същата или сходна свързваща специфичност и афинитет както едно мишо или друго не-човешко антитяло, което предоставя изходен материал за конструиране на химерно или хуманизирано антитяло.

А. Получаване на химерни антитела

Терминът “химерно антитяло” се отнася за антитяло, чиито гени за лека и тежка верига са конструирани, обикновено с генно инженерство, от сегменти на имуноглобулинов ген, принадлежащи на различни видове. Например, променливите (V) сегменти на гените от едно мишо моноклонално антитяло могат да бъдат свързани с човешки константни (С) сегменти, като lgG1 и lgG4. Предпочитан е човешки lgG1. Типично химерно антитяло е хибриден протеин, състоящ се от V или антиген-свързващия домен от мишо антитяло и С или ефекторен домен от човешко антитяло.

В. Получаване на хуманизирани антитела

Терминът “хуманизирано антитяло” се отнася за антитяло съдържащо най-малко една верига, включваща остатъци на променлива област на рамката, главно от човешка антитяло верига (обозначена като акцепторен имуноглобулин или антитяло) и наймалко една определяща комплементарността област, предимно от мишо антитяло (обозначена като донорен имуноглобулин или антитяло). Виж, Queen et al., PrOc.Natl.Acad.Sci.USA 86:10029-10033 (1989), US 5,530, 101, US 5,585,089, US 5,693,761, US 5,693,762, Selick et al., WO 90/07861 и Winter, US 5,225,539 (включени чрез цитат в тяхната цялост за всякакви цели). Константната област(и), ако е налице, също са главно или изцяло от човешки имуноглобулин.

Замяната на миши CDRs в човешки променлив домен на рамката най-често води до задържане на тяхната коректна пространствена ориентация, ако човешкият променлив домен на рамката приеме същата или сходна конформация на мишата променлива рамка, от която произхождат CDRs. Това се постига като се получават човешки променливи домени от човешки антитела, чиито последователности на рамката проявяват висока степен на идентичност на последователността с миши променливи домени на рамката, от която произхождат CDRs. Тежко и лековерижните променливи области на рамката могат да произхождат от същите или други последователности на човешко антитяло. Последователностите на човешкото антитяло могат да бъдат последователностите на природно срещащи се човешки антитела или могат да бъдат консензус последователности на няколко човешки антитела. Виж, Kettleborough et al., Protein Engineering 4: 773 (1991); Kolbinger et al., Protein Engineering 6:971 (1993) и Carter et al., WO 92/22653.

След като са идентифицирани определящите комплементарността области на мишия донорен имуноглобулин и съответни човешки акцепторни имуноглобулини, следващата стъпка е да се определи кои, ако има такива, остатъци от тези компоненти трябва да бъдат заменени за оптимизиране свойствата на полученото хуманизирано антитяло. Общо, замяна на човешки аминокиселинни остатъци с миши, трябва да бъде минимализирана, тъй като въвеждане на миши остатъци повишава риска антитялото да предизвиква човешко-анти-мишо-антитяло (НАМА) отговор у хора. Методи утвърдени в тази област за определяне на имунния отговор, могат да бъдат изпълнени за мониториране НАМА отговор у даден пациент или по време на клинично изпитване. На пациенти с въведени хуманизирани антитела може да бъде направено определяне имуногеността в началото и по време на въвеждане на споменатата терапия. Измерван е НАМА отговора, например, чрез откриване на антитела спрямо хуманизиран терапевтичен агент, в серумни проби от пациент, като се използва метод известен в тази област, включително плазмон резонанс технология (BIACORE) и/или твърдофазен ELISA анализ.

Подбрани са някои аминокиселини от остатъци на човешка променлива област на рамката, за замяна въз основа на тяхното възможно влияние върху CDR конформацията и/или свързването с антиген. He-природната съседна позиция на миши CDR области с човешка променлива област на рамката може да доведе до неприродни конформационни ограничения, които ако не са коригирани чрез замяна на някои аминокиселинни остатъци, водят до загуба на свързваща активност.

Подборът на аминокиселинни остатъци за замяна е определен, отчасти, чрез компютерно моделиране. Компютерен хардуер и софтуер са описани тук за получаване на тридимензионални образи на имуноглобулинови молекули. Общо, получени са молекулни модели започвайки от решени структури за имуноглобулинови вериги или техни домени. Веригите, които трябва да бъдат моделирани са сравнени за сходство на аминокиселинна последователност, с вериги или домени на решени тридимензионални структури и веригите или домените, показващи найголямо сходство на последователността е/са подбрани като изходни моменти за конструиране на молекулния модел. Вериги или домени споделящи най-малко 50% идентичност на последователността, са подбрани за моделиране, предпочитано тези споделящи най-малко 60%, 70%, 80%, 90% идентичност на последователността или повече са подбрани за моделиране. Решените изходни структури са модифицирани да позволяват различаване между действителни аминокиселини в имуноглобулинови вериги или домени, които се моделират и тези в изходната структура. След това модифицираните структури са обединени в сложен имуноглобулин. Накрая, моделът е усъвършенстван с енергетично минимализиране и чрез верифициране, че всички атоми са в рамките на съответни разстояния един от друг и че дължините на връзките и ъглите са в рамките на приемл иви химични граници.

Подборът на аминокиселиинни остатъци за замяна може също да бъде определен, отчасти, чрез изследване характеристиките на аминокиселините в определени локализации, или емпирично наблюдение на ефектите от замяна или мугагенеза на определени аминокиселини. Например, когато една аминокиселина различава между остатък на променлива област на рамката и подбран остатък на човешка променлива област на рамката, човешката аминокиселина на рамката обикновено трябва да бъде заменена с еквивалентна аминокиселина на рамката от мишото антитяло, когато има основание да се очаква, че аминокиселината:

(1) не-ковалентно свързва директно антиген, (2) е съседна на една CDR област, (3) взаимодейства по друг начин с една CDR област (например, е в диапазона около 3-6 А на една CDR област, определен с компютерно моделиране), или (4) участва в VL-VH границата.

Остатъци, които “не-ковалентно свързват директно антиген” включват аминокиселини в позиции в области на рамката, които са имали добра вероятност за директно взаимодействие с аминокиселини на антигена, съгласно установени химични сили, например, чрез водородно свързване, Van der Waals сили, хидрофобни взаимодействия и подобни.

CDR и области на рамката са, както е дефинирано от Kabat et al., или Chothia et al., по-горе. Когато остатъци на рамката, както е дефинирано от Kabat et al., по-горе, съставляват остатъци на структурна бримка, както е определено от Chothia et al., по-горе, аминокиселините присъствуващи в мишото антитяло, могат да бъдат подбрани за замяна в хуманизираното антитяло. Остатъци, които са “съседни на CDR област” включват аминокиселинни остатъци в позиции непосредствено съседни до една или повече от CDRs в първичната последователност на веригата на хуманизиран имуноглобулин, например, в позиции в непосредствено съседство с една CDR, както е определено от Kabat et а!.. или една CDR както е определено от Cbothia (виж, например Chothia and Lesk JMB 196:901 (1987)). Тези аминокиселини е особено възможно да взаимодействат с аминокиселини в CDRs и ако са избрани от акцептора, да нарушат донорните CDRs и да редуцират афинитета. Освен това, съседни аминокиселини могат да взаимодействат директно с антигена (Amit et al., Science, 233:747 (1986), която е включена тук чрез цитат) и подбирайки тези аминокиселини от донора, може да бъде желателно да се запазят всички контакти на антигена, които осигуряват афинитет в оригиналното антитяло.

Остатъци, които “по друг начин взаимодействат с CDR област” включват тези, които са определени от анализ на вторичната структура, че са в пространствена ориентация достатъчна да повлиява една CDR област. В едно изпълнение, остатъци, които “по друг начин взаимодействат с CDR област” са идентифицирани като е анализиран три-димензионален модел на донорния имуноглобулин (например, компютерно-създаден модел). Един три-димензионален модел, обикновено на оригиналното донорно антитяло, показва, че някои аминокиселини извън CDRs са близки до CDRs и има добра вероятност да взаимодействат с аминокиселини в CDRs, чрез свързване с водородни връзки, Van der Waals сили, хидрофобни взаимодействия и т.н. В тези аминокиселинни позиции, донорната имуноглобулинова аминокиселина може да бъде подбрана, пред аминокиселината на акцепторния имуноглобулин. Аминокиселини, съгласно този критерий ще имат общо един атом на странична верига, в рамките на около 3 енгстръома единици (А) на някой атом в CDRs и трябва да съдържат един атом, който може да взаимодейства с CDR атоми, съгласно установени химични сили, като тези изброени по-горе.

В случая на атоми, които могат да образуват водородна връзка, ЗА е измерен между техните ядра, но за атоми, които не образуват връзка, ЗА е измерено между техните Van der Waals повърхности. Така, в последния случай, ядрата трябва да бъдат в рамките на 6А (ЗА плюс сумата на Van der Waals радиуси) за атомите, които ще се разглеждат, че са способни на взаимодействие. В много случаи ядрата ще бъдат от 4 или 5 до 6А отделени. При определяне дали една аминокиселина може да реагира с CDRs, предпочита се да не се разглеждат последните 8 аминокиселини на тежковерижна CDR 2 като част от CDRs, тъй като от гледна точка на структура, тези 8 аминокиселини имат поведение повече като част от рамката.

Аминокиселини, които са способни на взаимодействие с аминокиселини в CDRs , могат да бъдат идентифицирани и по друг начин. Достъпната в разтвор област от повърхността на всяка аминокиселина от рамката е изчислена по два начина: (1) в интактно антитяло, и (2) в една хипотетична молекула, състояща се от антитялото с неговите отстранени CDRs. Една значителна разлика между тези номера от около 10 квадратни енгстрьома или повече показва , че достъп на аминокиселина на рамката към разтворителя е поне отчасти блокиран от CDRs и следователно, че аминокиселината прави контакт с CDRs. Достъпната за разтворителя област от повърхността на аминокиселината може да бъде изчислена въз основа на три-димензионален модел на антитяло, като се използват алгоритми известни в тази област (например, Connolly, J.AppLCryst 16:548 (1983) и Lee and Richards, J.Mol.Biol. 55:379 (1971), двете включени тук чрез цитат). Аминокиселини на рамката могат също понякога да взаимодействат c CDRs индиректно, чрез засягане конформацията на друга аминокиселина на рамката, която от своя страна контактува с CDRs.

Аминокиселините в няколко позиции на рамката е известно, че са способни да взаимодействат с CDRs в много антитела (Chothia and Lesk, по-горе, Chothia et al., по-горе и Tramontano et al., J.Mol.Biol. 215:175 (1990), всичките включени тук чрез цитат). Особено, аминокиселините в позиции 2, 48, 64 и 71 на леката верига и 26-30, 71 и 94 на тежката верига (номериране съгласно Kabat) са известни, че са способни да взаимодействат с CDRs в много антитела. Аминокиселините в позиции 35 в леката верига и 93 и 103 в тежката верига, също е възможно да взаимодействат с CDRs. Всички тези изброени позиции, избор на донорната аминокиселина пред акцепторната аминокиселина (когато те се различават) е предпочитан да бъде в хуманизирания имуноглобулин. От друга страна, някои остатъци способни да взаимодействат с CDR област, като първите 5 аминокиселини на леката верига, могат понякога да бъдат избрани от акцепторен имуноглобулин, без да се загубва афинитета в хуманизирания имуноглобулин.

Остатъци, които участвуват в VL-VH допирното място” или “пакетиращи остатъци” включват тези остатъци на допирното място между VL и VH, както е определено, например от Novotny and Haber, Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 82:4592-66 (1985) или Chothia et al., no-rope. Общо, необичайни пакетиращи остатъци трябва да бъдат задържани в хуманизираното антитяло ако те се различават от тези в човешките рамки.

Общо, една или повече от аминокиселините, изпълняваща горните критерии е заменена. В някои изпълнения, всички или повечето от аминокиселините отговарящи на горните критерии са заменени. Понякога, има известна неяснота за това дали дадена аминокиселина отговаря на горните критерии и са получени алтернативен вариант имуноглобулини, един от които има тази специална зам\яна, другият от които няма. Алтернативен вариант имуноглобулини така получени, могат да бъдат тестирани в който и да е от тестовете описани тук, за желана активност и подбрания предпочитан имуноглобулин.

Обикновено CDR областите в хуманизирани антитела са съществено идентични и по-често, идентични със съответните CDR области на донорното антитяло. Въпреки че не винаги е желателно, понякога е възможно да се направят една или повече консервативни аминокиселинни замени на CDR остатъци, без забележимо да се повлияе свързващия афинитет на получения хуманизиран имуноглобулин. Чрез консервативни замени са предвидени комбинации като gly, ala; val, ile, leu; asp, glu; asn, gin; ser, thr; lys, arg; и phe, tyr.

Допълнителни кандидати за замяна са акцепторни аминокиселини на човешката рамка, които са необичайни или “редки” за човешки имуноглобулин в тази позиция. Тези аминокиселини могат да бъдат заменени с аминокиселини от еквивалентните позиции на по-типични човешки имуноглобулини. Например, може да бъде желана замяна когато аминокиселината в областта на човешката рамка на акцепторен имуноглобулин е рядка за тази позиция и съответната аминокиселина в донорния имуноглобулин е обичайна за тази позиция в последователности на човешки имуноглобулин; или когато аминокиселината в акцепторния имуноглобулин е рядка за тази позиция и съответната аминокиселина в донорния имуноглобулин също е рядка, в сравнение с други човешки последователности. Тези критерии помагат да се осигури, че една атипична аминокиселина в човешката рамка не нарушава структурата на антитялото. Освен това, чрез замяна на необичайна човешка акцепторна аминокиселина с аминокиселина от донорното антитяло, което изглежда е типично за човешки антитела, хуманизираното антитяло може да стане по-малко имуногенно.

Терминът “рядка”, както тук е използван, показва аминокиселина появяваща се в тази позиция в по-малко от около 20%, но обикновено по-малко от около 10% от последователности в една представителна проба от последователности и терминът “обичаен”, както тук е използван, показва аминокиселина появяваща се в повече от 25%, обикновено повече от 50% от последователностите в една представителна проба. Например, всички последователности на леко и тежковерижна променлива област са съответно групирани в “подгрупи” от последователности, които са специално хомоложни една на друга и имат същите аминокиселини в известни критични позиции (Kabat et al., по-горе). Когато се решава дали една аминокиселина в човешка акцепторна последователност е “рядка” или “обичайна” измежду човешки последователности, често ще бъде предпочитано да се разглеждат само тези човешки последователности в същата подгрупа както акцепторната последователност.

Допълнителни кандидати за замяна са аминокиселини на акцепторна човешка рамка, които биха били идентифицирани като част от CDR област с алтернативната дефиниция предложена от Chothia et al., по-горе. Допълнителни кандидати за замяна са аминокиселини на акцепторна човешка рамка, които могат да бъдат идентифицирани като част от CDR област според АЬМ и/или контактни дефиниции. По-специално, CDR1 в променливата тежка верига е дефинирана като включваща остатъци 26-32.

Допълнителни кандидати за замяна са остатъци на акцепторна рамка, които съответстват на рядък или необичаен остатък на донорна рамка. Редки и необичайни остатъци на донорната рамка, са тези които са редки или необичайни (както тук е дефинирано) за миши антитела в тази позиция. За миши антитела подгрупата може да бъде определена, съгласно Kabat и да бъдат идентифицирани позиции на остатъци, които се различават от консензусните. Тези специфични за донора различия могат да насочват за точкови или соматични мутации в мишата последователност, които повишават активността. Необичайни остатъци, които са предсказани че засягат свързването, са запазени, докато остатъци предсказани, че не са важни за свързване, могат да бъдат заменени.

Допълнителни кандидати за замяна са остатъци от незародишева линия, появяващи се в област на акцелторна рамка. Например, когато верига на акцепторно антитяло (т.е. верига на човешко антитяло, споделяща значителна идентичност на последователността с донорната антитяло верига), е подравнена с една антитяло верига на зародишева линия (подобно споделяща значителна идентичност на последователността с донорната верига), остатъци, които не съвпадат между акцепторната верига на рамката и верига на рамката на зародишевата линия, могат да бъдат заменени със съответни остатъци от последователността на зародишевата линия.

Други освен специфичните аминокиселинни замени обсъдени по-горе, рамковите области на хуманизирани имуноглобулини обикновено са съществено идентични, и пообичайно, идентични с рамковите области на човешките антитела от които те произхождат. Разбира се, много от аминокиселините на рамковата област имат малък или не директен принос за специфичността или афинитета на едно антитяло. Така, много индивидуални консервативни замени на рамковите остатъци могат да бъдат толерирани, без забележима промяна на специфичността или афинитета на получения хуманизиран имуноглобулин. Така, в едно изпълнение, променливата област на рамката на хуманизиран имуноглобулин, споделя най-малко 85% идентичност на последователността спрямо последователност на човешка променлива област на рамката или консензус на такива последователности. В друго изпълнение, променливата област на рамката на хуманизиран имуноглобулин споделя най-малко 90%, предпочитано 95%, по-предпочитано 96%, 97%, 98% или 99% идентичност на последователността спрямо последователност на променливата област на рамката или консензус на такива последователности. Общо, обаче, такива замени не са желателни.

Хуманизирани антитела предпочитано проявяват специфичен свързващ афинитет за антиген от най-малко 10⁷, 10⁸, 10⁹ или Ю¹⁰ М'¹. Обикновено горната граница на свързващ афинитет на хуманизирани антитела за антиген е в рамките на един фактор от три, четири или пет от този на донорния имуноглобулин. Често долната граница на свързващия афинитет също е в рамките на един фактор от три, четири или пет от този на донорния имуноглобулин. Алтернативно, свързващият афинитет може да бъде сравнен с този на хуманизирано антитяло не притежаващо замени (например, антитяло притежаващо донорни CDRs и акцепторни FRs, но без FR замени). В такива случаи, свързването на оптимизираното антитяло (със замени) е предпочитано най-малко дву- до три-кратно поголямо, или три- до четирикратно по-голямо от това на антитяло без замествания. За да се направи сравнение, може да бъде определена активността на различни антитела, например, с BIACORE (т.е. повърхностен плазмон резонанс като се използват белязани реагенти) или конкурентни свързващи тестове.

С. Получаване на хуманизирани 3D6 антитела

Предпочитано изпълнение на настоящето изобретение характеризира хуманизирано антитяло спрямо N-края на Αβ, в частност, за приложение в терапевтични и/или диагностични методологии, описани тук. Особено предпочитан изходен материал за получаване на хуманизирани антитела е 3D6. 3D6 е специфично за N-края на Αβ и е показано, че медиира фагоцитоза (например, индуцира фагоцитоза) на амилоидни плаки (виж Примери I-V). Клонирането и секвенирането на кДНК кодираща 3D6 променливи области на антитяло тежка и лека верига, е описано в Пример VI.

Подходящи човешки акцепторни антитяло последователности са идентифицирани с компютерни сравнения на аминокиселинните последователности на мишите променливи области с последователностите на известни човешки антитела. Сравнението е правено поотделно за тежки и леки вериги, но принципите са сходни за всяка. В частност, променливи домени от човешки антитела, чиито последователности на рамката проявяват висока степен идентичност на последователността с миши VL и VH области на рамката, са идентифицирани с проверка на Kabat Database, като се използва NCBI BLAST (общо достъпно чрез National Institute of Health NCBI internet server) със съответните миши последователности на рамката. В едно изпълнение, са подбрани акцепторни последователности, споделящи по-голяма от 50% идентичност на последователността с миши донорни последователности. Предпочитано са подбрани акцепторни антитяло последователности, които споделят идентичност 60%, 70%, 80%, 90% или повече.

Компютерно сравнение на 3D6 разкрива, че 3D6 леката верига показва най-голямата идентичност на последователността с човешки леки вериги от подтип kappa II и че 3D6 тежката верига показва най-голямата идентичност на последователността с човешки тежки вериги на подтип III, както е дефинирано от Kabat et al., по-горе. Така, леко и тежковерижни области на рамката предпочитано произхождат от човешки антитела на тези подтипове, или от консензус последователности на такива подтипове. Предпочитаните лековерижни човешки променливи области, показващи най-голяма идентичност на последователността със съответна област от 3D6, са от антитела, притежаващи Kabat ID Numbers 019230, 005131, 005058, 005057, 005059, U21040 и U41645, с 019230, който е по-предпочитан. Предпочитаните тежковерижни човешки променливи области, показващи най-голяма идентичност на последователността със съответната област от 3D6, са от антитела притежаващи Kabat ID Numbers 045919, 000459, 000553, 000386 и М23691, с 045919, който е по-предпочитан.

След това са подбрани остатъци за замяна, както следва. Когато една аминокиселина различава между 3D6 променливата област на рамката и еквивалентна човешка променлива област на рамката, човешката аминокиселина на рамката трябва обикновено да бъде заменена с еквивалентна миша аминокиселина, ако

основателно се очаква, че аминокиселината:

(1) не-ковалентно свързва антиген директно, (2) е съседна на една CDR област, е част от една CDR област според алтернативната дефиниция предложена от Chothia et al., по-горе, или с други думи реагира с една CDR област (например, е в рамките на около зЛ на една CDR област) (например, аминокиселини в позиции L2, Н49 и Н94 на 3D6), или (3) участва в VL-VH допирното място (например аминокиселини в позиции L36, L46 и Н93 на 3D6).

Компютерно моделиране на 3D6 антитяло тежковерижни променливи области и хуманизиране на 3D6 антитяло е описано в Пример VII. Накратко, създаден е три-димензионален модел въз основа на най-близките решени миши антитяло структури за тежки и леки вериги. За тази цел, антитяло обозначено 1CR9 (Protein Data bank (PDB) ID: 1CR9, Kanyo et al., J.Mol.Biol. 293:855 (1999)) e подбрано като матрица за моделиране на 3D6 леката верига, и едно антитяло обозначено IOPG (PDB ID: IOPG, Kodandapani et al.,

J.Biol.Chem. 270:2268 (1995)) е подбрано като матрица за моделиране на тежката верига. Моделът по-нататък е усъвършенстван чрез серия минимализиращи енергията етапи, за освобождаване от неблагоприятни атомни контакти и оптимизиране на електростатични и Van der Waals взаимодействия. Решената структура на 1qkz (PDB ID: IQKZ, Derrick et al., J.Mol.Biol. 293:81 (1999)) е подбрана като матрица за моделиране на CDR3 на тежката верига, тъй като 3D6 и 10PG не проявяват значима хомология на последователността в тази област, когато са подравнени за сравнителни цели.

Три-димензионална структурна информация е публично достъпна, например, от Research Collaboratory for Structural Bioinformatics’ Protein Data Bank (PDB). PDB е свободно достъпна чрез the World Wide Web internet и е описана от Berman et al. (2000) Nucleic Acids Research, 28:235. Компютерно моделиране позволява идентифициране на CDR-взаимодействащи остатъци. Компютерният модел на структурата на 3D6 може от своя страна да служи като изходна точка за предсказване три-димензионалната структура на антитяло, съдържащо 3D6 определящите комплементарността области, заменени в човешки рамкови структури. Могат да бъдат конструирани допълнителни модели, представящи структурата като са въведени следващи аминокиселинни замени.

Общо, желателна е замяна на една, повече или всички от аминокиселините отговарящи на горните критерии. Съответно на това, хуманизираните антитела на настоящето изобретение ще съдържат обикновено една замяна на човешки лековерижен остатък на рамката със съответен 3D6 остатък в най-малко 1,2 или 3, или по-често 4, от следните позиции: L1, L2, L36 и L46. Хуманизираните антитела обикновено също съдържт една замяна на човешки тежковерижен остатък на рамката със съответен 3D6 остатък в наймалко 1,2 и понякога 3, от следните позиции: Н49, Н93 и Н94.

Хуманизирани антитела могат също да съдържат една замяна на тежковерижен остатък на рамката със съответен остатък от зародишева линия в най-малко 1, 2 и понякога 3 от следните позиции Н74, Н77 и Н89.

Понякога, има известна неяснота за това дали дадена аминокиселина отговаря на горните условия и се правят алтернативни варианти имуноглобулини, един от които има тази специална замяна, другият я няма. В случаи където замяна с един миши остатък ще въведе остатък, който е рядък в човешки имуноглобулини в дадена позиция, желателно е да се тестира антитялото за активност със или без тази специална замяна. Ако активност (например, свързващ афинитет и/или свързваща специфичност) е приблизително същата със или без замяната, може да се предпочита антитялото без замяна, тъй като може да се очаква да предизвиква по-малък НАНА отговор, както тук е описано.

Други кандидати за замяна са аминокиселини на акцепторна човешка рамка, които са необичайни за човешки имуноглобулин в тази позиция. Тези аминокиселини могат да бъдат заменени с аминокиселини от еквивалентната позиция на потипични човешки имуноглобулини. По избор, аминокиселини от еквивалентни позиции в мишото 3D6, могат да бъдат въведени в човешки области на рамката, когато такива аминокиселини са типични за човешки имуноглобулин в еквивалентните позиции.

В допълнителни изпълнения, когато човешкият лековерижен акцепторен имуноглобулин на рамката е Kabat ID Number 019230, леката верига съдържа замени в най-малко 1, 2, 3, 4, 5 ,6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 или по-често 13 на следните позиции: L7, L10, L12, L15, L17, L39, L45, L63, L78, L83, L85, L100 или L104. В допълнителни изпълнения, когато човешкият тежковерижен рамков акцепторен имуноглобулин е Kabat ID Number 045919, тежката верига съдържа замени в най-малко 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12,

13, 14 или по-често 15 от следните позиции: НЗ, Н5, Н13, Н16, Н19, Н40, Н41, Н42, Н44, Н72, Н77, Н82А, Н83, Н84 или Н108. Тези позиции са заменени с аминокиселина от еквивалентната позиция на човешки имуноглобулин, притежаващ един по-типичен аминокиселинен остатък. Примери за подходящи аминокиселини, които да заместват са представени във Фигури 1 е 2.

Други кандидати за замяна са остатъци на зародишева линия, появяващи се в една област на рамката. Компютерно сравнение на 3D6 с известни последователности на зародишева линия, разкрива, че тежки вериги проявяващи най-висока степен идентичност на последователността, включват последователности на променлива област на зародишева линия VH3-48, VH3-23, VH37, VH3-21 и VH3-11, с VH3-23 която е най-предпочитана. Подравняване на Kabat ID 045919 с VH3-23 разкрива, че остатъци Н74, Н77 и/или Н89 могат да бъдат подбрани за замяна със съответни остатъци на зародишева линия (например, остатъци Н74, Н77 и/или Н89 когато се сравняват Kabat ID 045919 и VH3-23). Подобно, последователности на зародишева линия, притежаващи най-високата степен на идентичност с 3D6 лека верига, включват А1, А17, А18, А2 и А19, с А19 най-предпочитана. Остатъци, които не се съвпадат между подбрана лековерижна акцепторна рамка и една от тези последователности на зародишева линия, могат да бъдат подбрани за замяна със съответен остатък на зародишева линия.

Таблица I обобщава анализа на последователностите на 3D6 VH и VL области. Допълнителни миши и човешки структури, които могат да бъдат използвани за компютерно моделиране на 3D6 антитяло и допълнителни човешки антитела, са представени, както и последователности на зародишева линия, които могат да бъдат използвани при подбор на аминокиселини и замени. Редки миши остатъци също са представени в Таблица I. Редки миши остатъци са идентифицирани чрез сравнение донорните VL и/или VH последователности с последователностите на други членове на подгрупата, към която принадлежат донорните VL и/или VH последователности (съгласно Kabat) и идентифицирайки позициите на остатъците, които се различават от консензусните. Тези донорни специфични разлики, могат да означават соматични мутации, които повишават активността. Необичайни или редки остатъци, близки до мястото на свързване, е възможно да контактуват с антигена, което прави желателно задържането на мишия остатък. Обаче, ако необичаен миши остатък не е важен за свързването, предпочита се употреба на съответен акцепторен остатък, тъй като мишият остатък може да създаде имуногенни неоепитопи в хуманизираното антитяло. В положение, където един необичаен остатък в донорната последователност е в действителност общ остатък в съответната акцепторна последователност, предпочитаният остатък е ясно акцепторният остатък.

Таблица 1: Обобщение на последователност на 3D6 У-област

Верига Тежка Лека

	-------- · ......... .........
миша подгрупа (Kabat seq ED#)	ПЮ (002688)	П (005840-005844,005851-005853, 005857,005863)
I миши хомолози (Kabat/Genbank)	002727/163.1’CL 002711/H35-C6’CL 002733/8-l-12-5-3-l(A2-l)'CL 002715/ASWA2'CL 020669/#14'CL	005840/1210.7 005843/42.4b.l22’CL 005842/BXW-14OL 005841/42.7B3.2’CL 005851/36-60CRI-
редки аминокиселини (% честота на поява в клас)	N40 (0233%) D42 (0.699%)	Yl(.035%) 115 (3.3%) D27 (0.867%)-CDRl 178(0.677%) L85 (0.625%) W89 (0.815%)-CDR3

1 1		K106A (0.295%)
човешка подгрупа	Ш (000488-000491,000503,000624)	II (005046)
Chothia признати CDR групирания [pdb пример]	Hl: class 1 [2fbj] H2: class 3 [ligc]	LI: class 4 [lnnf] L2: classl [llmk] L3: class 1 [ltet]
Най-близки решени миши структури	PDB ID: 1OPG Kodandapani et aL, supra; (72% 2A)	PDB ID: 1CR9; Kanyo et al., supra; (94%, 2A) PDB ID: 1NLD; Davies et al., Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallog. 53:186 (1997); (98%,2.8A)
Най-близки решени човешки структури	1VH (68%, nmr) 443560 (65%, IgG, λ myeloma, 1.8A) KOLZ2FB4H (60%, myeloma, 3A)	1LVE (57%, LEN) 1B6DA (54%; B-J dimer, 2.8A); 1VGEL (54%, autoAb)
Germline query (Hu) results (top 4)	VH3-48 (4512283/BAA75032.1) VH3-23 (4512287/BAA75046.1) VH3-7 (4512300/BAA75056.1) VH3-21 (4512287ZBAA75047.1) VH3-11 (4152300/BAA75053.1)	Al(x63402) A17 (x63403) A18 (X63396) A2 (m31952) A19(x63397)

*тежка верига и лека верига от същото антитяло (0-81, Hirabayashi et al. NAR 20:2601)

Kabat ID последователности, цитирани тук, са общо достъпни, например, от Northwestern University Biomedical Engineering Department’s Kabat Database of Sequences of Proteins of Immunological Interest. Три-димензионална структурна информация за антитела, описана тук е публично достъпна, например, от Reserch Collaboratory for Structural Bioinformatics’ Protein Data Bank (PDB). PDB е свободно достъпна чрез World Wide Web internet и е описана от Berman et al. (2000) Nucleic Acids Research, p235-242. Гении последователности на зародишева линия, цитирани тук, са публично достъпни, например от National Center for Biotechnology Information (NCBI) database of sequences в колекции от Igh, Ig kappa и Ig lambda V гени на зародишева линия (като отдел на National Library of Medicine (NLM) при National Institute of Health (NIH). Търсене на хомология на NCBI “lg Germline Genes” database е предоставено от IgG BLAST™.

В предпочитано изпълнение, едно хуманизирано антитяло на настоящето изобретение съдържа (i) една лека верига, включваща променлив домен, съдържащ миши 3D6 VL CDRs и човешка акцепторна рамка, рамката притежава най-малко един, предпочитано два, три или четири остатъка, подбрани от групата състояща се от L1, L2, L36 и L46 заместени със съответен 3D6 остатък и (ii) тежка верига съдържаща 3D6 VH CDRs и една човешка акцепторна рамка, рамката притежава най-малко един, предпочитано два или три остатъка, подбрани от група състояща се от Н49, Н93 и Н94, заменени със съответен 3D6 остатък и по избор поне един, предпочитано два или три остатъка, подбрани от групата състояща се от Н74, Н77 и Н89, е заместен със съответен човешки остатък на зародишева линия.

В по-предпочитано изпълнение едно хуманизирано антитяло на настоящето изобретение съдържа (i) една лека верига включваща променлив домен съдържащ миши 3D6 VL CDRs и човешка акцепторна рамка, рамката притежава остатък 1 заменен с tyr (Y), остатък 2 заменен с val (V), остатък 36 заменен с leu (L) и/или остатък 46 заменен с arg (R ), и (ii) една тежка верига включваща 3D6 VH CDRs и една човешка акцепторна рамка, рамката притежава остатък 49, заменен с ala(A), остатък 93 заменен с val (V) и/или остатък 94 заменен с arg (R) и по избор, притежаваща остатък 74 заменен със ser (S), остатък 77 заменен с thr (Т) и/или остатък 89 заменен с val (V).

В особено предпочитаано изпълнение, хуманизирано антитяло на настоящето изобретение има структурни особености, както тук е описано и освен това има поне една (предпочитано две, три, четири или всички) от следните активности: (1) свързва агрегиран Αβ1-42 (например, както е определен с ELISA); (2) свързва

Αβ в плаки (например, оцветяване на AD и/или PDAPP плаки); (3) свързва Αβ с дву- до трикратно по-висока свързващ афинитет в сравнение с химерно 3D6 (например, 3D6 притежаващ миши CDRs и човешки акцепторен FRs); (4) медиира фагоцитоза на Αβ (например, в ex vivo тест за фагоцитоза, както тук е описано); и (5) преминава кръвно-мозъчната бариера (например, демонстрира краткосрочна мозъчна локализация, например в PDAPP животински модел, както тук е описано).

В друго изпълнение, хуманизирано антитяло на настоящето изобретение има структурни особености, както тук е описано, свързва Αβ по начин или с афинитет достатъчен да предизвика поне един от следните in vivo ефекти: (1) редуцира натрупване на Αβ плаки; (2) предотвратява образуване на плаки; (3) редуцира нива на разтворим Αβ; (4) редуцира невритната патология свързана с амилоидно нарушение; (5) намалява или подобрява поне един физиологичен симптом, свързан с амилоидогенно нарушение и/или (6) подобрява когнитивна функция.

В друго изпълнение, хуманизирано антитяло на настоящето изобретение има структурни особености както тук е описано и специфично се свързва с епитоп съдържащ остатъци 1-5 или 3-7 на Αβ.

3. Човешки антитела

Човешки антитела са предоставени с различни техники, описани по-долу. Някои човешки антитела са подбрани чрез експерименти за конкурентно свързване или с други думи, да имат същата специфичност на епитопа както дадено мишо антитяло, като едно от мишите монокпонални антитела описано тук. Човешки антитела могат също да бъдат подбрани за специфичност на даден епитоп, като се използва само фрагмент на Αβ като имуноген, и/или чрез подбор на антитела срещу една колекция от делетирани мутанти на Αβ. Човешки антитела, предпочитано имат човешки lgG1 изотип специфичност.

а. Триома методология

Основният подход и един примерен клетъчно фузионен участник, SPAZ-4, за употреба в този подход, са описани от Oestberg et al., Hybridoma 2:361 (1983); Oestberg, US Patent No. 4,634,664; и Engleman et al., US Patent 4,634,666 (всяка от които е включена чрез цитат в нейната цялост за всякакви цели). Антитяло-продуциращи клетъчни линии, получени по този метод се наричат триоми, тъй като те са низходящи от три клетки; две човешки и една миша. Начално, миша миеломна линия е слета с човешки В-лимфоцит, за получаване не-антитяло-продуцираща ксеногенна хибридна клетка, като SPAZ-4 клетъчната линия, описана от Oestberg, по-горе. След това ксеногенна клетка е слета с имунизиран човешки В-лимфоцит, за получаване антитяло-продуцираща триома клетъчна линия. Открито е, че триомите произвеждат антитела, по-стабилни от ординерните хибридоми, получени от човешки клетки.

Имунизираните В-лимфоцити са получени от кръвта, далака, лимфни възли или костен мозък на човешки донор. Ако са желани антитела срещу специфичен антиген или епитоп, предпочита се да се използва този антиген или негов епитоп за имунизация. Имунизацията може да бъде in vivo или in vitro. За in vivo имунизация, В-клетки обикновено са изолирани от човек, имунизиран с Αβ, негов фрагмент, по-голям полипептид съдържащ Αβ или фрагмент, или едно анти-идиотипно антитяло на антитяло срещу Αβ. В някои методи, В-клетки са изолирани от същия пациент, на който накрая ще бъде въведена антитяло терапия. За in vitro имунизация, В-клетки обикновено се излагат на антиген за период от 7-14 дни в среда като RPMI-1640 (виж Engleman, по-горе), допълнена с 10% човешка плазма.

Имунизираните В-лимфоцити са слети с ксеногенна хибридна клетка като SPAZ-4 съгласно добре известни методи. Например, клетките са третирани с 40-50% полиетилен гликол с мол.тегло 1000-4000, на около 37°С за около 5-10 минути. Клетките са отделени от средата за фузия и са развивани в среда, която е селективна за желаните хибриди (например, НАТ или АН). Идентифицирани са клонове секретиращи антитела, притежаващи изискваната свързваща специфичност, чрез тестиране триома културелната среда за способност да свързва Αβ или негов фрагмент. Триоми произвеждащи човешки антитела, притежаващи желаната специфичност, са субкпонираии с техниката за лимитиращо разреждане и са развивани in vitro в среда за култивиране. Получени триома клетъчни линии след това са тестирани за способност да свързват Αβ или негов фрагмент.

Въпреки че триомите са генетично стабилни, те не произвеждат антитела в много високи нива. Експресионни нива могат да бъдат повишени чрез клониране на антитяло гени от триомата в един или повече експресионни вектори и трансформиране вектора в стандартни клетъчни линии от бозайник, бактерии или дрожди.

Ь. Трансгенни не-човешки бозайници

Човешки антитела срещу Αβ могат също да бъдат произведени от не-човешки трансгенни бозайници, притежаващи трансгени кодиращи най-малко един сегмент от човешки имуноглобулинов локус. Обикновено, ендогенният имуноглобулинов локус на такива трансгенни бозайници е функционално инактивиран. Предпочитано, сегментът на човешки имуноглобулинов локус включва непрередени последователности на тежко и лековерижни компоненти. Инактивирането на ендогенни имуноглобулинови гени и въвеждането на екзогенни имуноглобулинови гени, може да бъде

постигнато чрез прицелна хомоложна рекомбинация, или чрез въвеждане на УАС хромозоми. Трансгенните бозайници, получени от този процес са способни на функционално пренареждане на последователностите на имуноглобулинови компоненти и експресиране на един репертоар от антитела от различни изотипове, кодирани от човешки имуноглобулинови гени, без да се експресират ендогенни имуноглобулинови гени. Получаването и свойствата на бозайници, притежаващи тези свойства са описани подробно от, например Lonberg et al., WO93/12227 (1993); US 5,877,397, US 5,874,299, US 5,814, 318, US 5,789,650, US 5,770,429, US 5,661,016, US 5,633,425, US 5,625,126, US 5,569,825, US 5,545,806, Nature 148:1547 (1994), Nature Biotechnology 14:826 (1996), Kucherlapati, WO 91/10741 (1991) (всяка от които, е включена чрез цитат в нейната цялост, за всякакви цели). Трансгенни мишки са особено подходящи. Анти-Αβ антитела са получени чрез имунизиране трансгенен не-човешки бозайник, какъвто е описан от Lonberg или Kucherlapati, по-горе, с Αβ или негов фрагмент. Моноклонални антитела са получени чрез, например фузия на В-клетки от такива бозайници с подходящи миеломни клетъчни линии, като се използва конвенционална KohlerMilstein технология. Предоставени са също човешки поликлонални антитела във формата на серум от хора, имунизирани с имуногенен агент. По избор, такива поликлонални антитела могат да бъдат концентрирани с афинитетно пречистване, като се използва Αβ или друг амилоиден пептид като афинитетен реагент.

с. Фагов дисплей методи

Следващ подход за получаване човешки анти-Αβ антитела е да се скринира ДНК библиотека от човешки В-клетки, съгласно общия протокол очертан от Huse et al., Science 246:1275-1281 (1989). Както е описано за триома методологията, такива В-клетки могат да бъдат получени от човек имунизиран с Αβ, фрагменти, по-дълги полипептиди съдържащи Αβ или фрагменти или анти-идиотипни антитела. По избор, такива В-клетки са получени от пациент, който в крайна сметка ще получи антитяло третиране. Подбрани са антитела свързващи Αβ или негов фрагмент. След това последователности кодиращи такива антитела (или свързващи фрагменти) са клонирани и амплифицирани. Протоколът описан от Huse е станал по-ефективен в комбинация с фагов-дисплей технология. Виж, например, Dower et al., WO 91/17271, McCafferty et al., WO 92/01047, Herzig et al., US 5,877,218, Winter et al., US ® 5,871,907, Winter et al., US 5,858,657, Holliger et al., US 5,837,242,

Johnson et al., US 5,733,743 и Hoogenboom et al., US 5,565,332 (всяка от които е включена чрез цитат в нейната цялост за всякакви цели). В тези методи са получени библиотеки от фаги, в които членове проявяват различни антитела по тяхната външна повърхност. Антитела обикновено са изявяват като Fv или Fab фрагменти. Фагово изявени антитела със желана специфичност са подбрани с афинитетно обогатяване спрямо Αβ пептид или негов фрагмент.

В една разновидност на фагов-дисплей метода, могат да 0 бъдат получени човешки антитела, притежаващи свързващата активност на подбрано мишо антитяло. Виж, Winter, WO92/20791. При този метод, се използва тежко или лековерижната променлива област на подбрано мишо антитяло, като изходен материал. Ако, например лековерижна променлива област е подбрана като изходен материал, се конструира фагова библиотека, в която членове проявяват същата лековерижна променлива област (т.е. мишия изходен материал) и различна тежковерижна променлива област. Тежковерижните променливи области са получени от библиотека на прередени човешки тежковерижни променливи области. Подбран е фаг, показващ силно специфично свързване за Αβ (например, най58 малко 10⁸ и предпочитано най-малко 10⁹ М’¹). Човешката тежковерижна променлива област от този фаг след това служи като изходен материал за конструиране на следваща фагова библиотека. В тази библиотека, всеки фаг проявява същата тежковерижна променлива област (т.е. областта идентифицирана от първата дисплей библиотека) и различна лековерижна променлива област. Лековерижните променливи области са получени от библиотека на прередени човешки променливи лековерижни области. Отново, подбран е фаг, показващ силно специфично свързване с Αβ. Тези фаги проявяват променливи области на напълно човешки анти-Αβ © антитела. Тези антитела обикновено имат същата или сходна специфичност на епитопа както мишия изходен материал.

4. Получаване на променливи области

След като концептуално са подбрани компонентите на CDR и рамката на хуманизирани имуноглобулини, различни методи са на разположение за произвеждане на такива имуноглобулини. Поради дегенерацията на кода, разнообразие от последователности на нуклеинови киселини ще кодира всяка имуноглобулинова аминокиселинна последователност. Желаните последователности на нуклеинови киселини могат да бъдат получени чрез de novo © твърдо-фазова ДНК синтеза или с PCR мутагенеза на по-рано получен вариант на желания полинуклеотид.

Олигонуклеотид-медиирана мутагенеза е предпочиитан метод за получаване заменени, делетирани или инсерционни варианти на прицелен полипептид ДНК. Виж, Adelman et al., DNA 2:183(1983). Накратко, ДНК на прицелния полипептид е променена чрез хибридизация на олигонуклеотид, кодиращ желаната мутация на едноверижна ДНК матрица. След хибридизация, ДНК полимераза е използвана за синтеза на цялата втора комплементарна верига на матрицата, която включва олигонуклеотидния праймер и кодира подбрана промяна в ДНК на прицелния полипептид.

5. Подбор на константни области

Променливите сегменти на антитела получени както е описано по-горе (например, тежко и лековерижни променливи области на химерни, хуманизирани или човешки антитела), обикновено са свързани с най-малко една част от константна област на имуноглобулин (Fc), обикновено тази на човешки имуноглобулин. ДНК последователности на човешка константна област могат да бъдат изолирани в съответствие с добре известни процедури от различни човешки клетки, но предпочитано обезсмъртени В-клетки (виж Kabat et al., по-горе и Liu et al., W087/02671) (всяка от които е включена чрез цитат в нейната цялост за всякакви цели). Обикновено, антитялото съдържа лековерижна и тежковерижна константни области. Тежковерижната константна област обикновено включва СН1, висяща, СН2, СНЗ и СН4 области. Антителата описани тук включват антитела, притежаващи всички типове константни области, включително IgM, IgG, IgD, IgA и IgE и всеки изотип, включително lgG1, lgG2, lgG3 и lgG4. Изборът на константна област зависи отчасти, дали е желан антитяло-зависим комплемент и/или клетъчно медиирана токсичност. Например, изотипове lgG1 и lgG3 имат активност на комплемента и изотипове lgG2 и lgG4 нямат. Когато се желае антитялото (например хуманизирано антитяло) да проявява цитотоксична активност, константният домен обикновено е комплемент фиксиращ константен домен и класът обикновено е lgG1. Когато не е желателна такава цитотоксична активност, константният домен може да бъде lgG2 клас. Избор на изотип може също да повлиява проникването на антитяло в мозъка. Предпочитан е човешки изотип lgG1. Лековерижни константни области могат да бъдат lambda или kappa.

Хуманизираното антитяло може да включва последователности от повече от един клас или изотип. Антитела могат да бъдат експресирани като тетрамери, съдържащи две леки и две тежки вериги, като отделни тежки вериги, леки вериги, като Fab, Fab’ F(ab’)2 и Fv или като едновериижни антитела, в които тежко и лековерижни променливи домени са свързани чрез един спейсер.

6. Експресия на рекомбинантни антитела

Химерни, хуманизирани и човешки антитела обикновено се получават чрез рекомбинантна експресия. Нуклеинови киселини кодиращи хуманизирани леко и тежковерижни променливи области, по избор свързани с константни области, са вмъкнати в експресионни вектори. Леките и тежките вериги могат да бъдат клонирани в същите или различни експресионни вектори. ДНК сегментите, кодиращи имуноглобулинови вериги, са оперативно свързани с контролни последователности в експресионен векгор(и), което осигурява експресията на имуноглобулинови полипептиди. Експресия на контролни последователности включва, но не се ограничава до промотори (например, природно-свързани или хетероложни промотори), сигнални последователности, енхенсерни елементи и завършващи транскрипцията последователности. Предпочитано, контролиращите експресията последователности са еукариотни промоторни системи във вектори, способни да трансформират или трансфектират еукариотни клетки гостоприемници. След като векторът е включен в подходящ гостоприемник, гостоприемникът е подържан в подходящи условия за високо ниво на експресия на нуклеотидните последователности и събирането и пречистването на кръстосано реагиращи антитела.

Тези експресионни вектори обикновено са реплицируеми в организмите гостоприемници като епизоми или като интегрална част от хромозомната ДНК на гостоприемника. Обикновено, експресионни вектори съдържат селекционни маркери (например, ампицилинрезистентност, хигромицин-резистентност, тетрациклин резистентност или неомицин резистентност ), които да позволяват откриване на тези клетки, които са трансформирани с желани ДНК последователности (виж, например Itakura et al., US Patent 4,704,362).

E.coli е един прокариотен гостоприемник, особено полезен за клониране полинуклеотидите (например ДНК последователности) на настоящето изобретение. Други микробни гостоприемници, подходящи за употреба включват бацили, като Bacillus subtilus и други ентеробактерии като Salmonella, Serratia и различни Pseudomonas видове. В тези прокариотни гостоприемници, може също да се направят експресионни вектори, които обикновено да съдържат контролни последователности на експресията, съвместими с клетката гостоприемник (например, едно начало на репликация). В допълнение, могат да присъстват всякакъв брой от едно разнообразие от добре известни промотори, като лактозна промоторна система, триптофан (trp) промоторна система, беталактазна промоторна система или промоторна система от фаг lambda. Промоторите обикновено контролират експресията, по избор с една последователност оператор и имат последователности за място на свързване на рибозоми и подобни, за иницииране и завършване транскрипция и транслация.

Други микроорганизми, като дрожди, също са полезни за експресия. Saccharomyces е предпочитан дрождев гостоприемник, с подходящи вектори, притежаващи контролиращи експресията последователности (например, промотори), едно начало на репликация, завършващи последователности и подобни, както се желае. Типични промотори включват 3-фосфоглицерат киназа и други гликолитични ензими. Индуцируеми дрождеви промотори включват, между другите, промотори от алкохол дехидрогеназа, изоцитохром С и ензими отговорни за усвояване на малтоза и галактоза.

В допълнение към микроорганизмите, клетъчни култури от тъкани на бозайници, могат също да бъдат използвани да експресират и произвеждат полипептидите на настоящето изобретение (например, полинуклеотиди кодиращи имуноглобулини или техни фрагменти). Виж, Winnacker, From Genes to Clones, VCH Publishers, N.Y., N.Y. (1987). Еукариотни клетки са предпочитани, тъй като известен брой подходящи клетъчни линии гостоприемници, способни на скриниране на хетероложни белтъци (например, интакгни имуноглобулини), са създадени в тази област и включват СНО клетъчни линии, различни Cos клетъчни линии, HeLa клетки, предпочитано, миеломни клетъчни линии или трансформирани Вклетки или хибридоми. Предпочитано, клетките са не-човешки. Експресионни вектори за тези клетки могат да включват контролиращи експресията последователности, като едно начало на репликация, един промотор и един енхенсер (Queen et al., ImmunoI.Rev. 89:49 (1986)), и необходими процесиращи информационни места, като рибозомни свързващи места, РНК снаждащи места, полиаденилиращи места и транскрипционни завършващи последователности. Предпочитани контролиращи експресията последователности са промотори, произхождащи от имуноглобулинови гени, SV40, аденовирус, bovine papilloma virus, cytomegalovirus и подобни. Виж, Co et al., J.lmmunol. 148:1149 (1992).

По избор, антитяло-кодиращи последователности могат да бъдат включени в трансгени, за вмъкване в генома на трансгенно животно и последваща експресия в млякото на трансгенното животно (виж, например Deboer et al., US 5.741,957, Rosen, US 5,304,489 и Meade et al., US 5,849,992). Подходящи трансгени включват кодиращи последователности за леки и/или тежки вериги в оперативна връзка с промотор и енхенсер от специфичен ген на млечна жлеза, като казеин или бета лактоглобулин.

Векторите съдържащи полинуклеотидните последователности, които са от интерес (например, кодиращите последователности на леки и тежки вериги и контролиращи експресията последователности), могат да бъдат пренесени в клетката гостоприемник с добре известни методи, които варират в зависимост от типа клетъчен гостоприемник. Например, калциев хлорид трансфекция е обичайно използвана за прокариотни клетки, докато калциев фосфат третиране, електропорация, липофекция, биолистикс или трансфекция на базата на вируси, могат да бъдат използвани за други клетъчни гостоприемници. (Виж, общо Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Press, 2^nd ed., 1989) (включена чрез цитат в нейната цялост за всякакви цели). Други методи използвани за трансфиромиране клетки от бозайници, включват употреба на полибрен, фузия на протопласти, липозоми, електропорация и микроинжектиране (виж общо, Sambrook et al., по-горе). За произвеждане на трансгенни животни, трансгени могат да бъдат инжектирани в оплодени ооцити или могат да бъдат включени в генома на ембрионални стволови клетки и ядрата на такива клетки да бъдат пренесени в лишени от ядра ооцити.

Когато тежки и леки вериги са клонирани на отделни експресионни вектори, векторите са ко-трансфектирани за получаване експресия и асемблиране на интакгни имуноглобулини. Веднъж експресирани, целите антитела, техни димери, индивидуални леки и тежки вериги или други имуноглобулинови форми на настоящето изобретение, могат да бъдат пречистени, съгласно стандартни процедури известни в тази област, включително утаяване с амониев сулфат, афинитетни колони, колонна хроматография, HPLC пречистване, гелна електрофореза и подобни (виж, общо Scopes, Protein Purification (Springer-Verlag, N.Y., (1982)). Съществено чисти имуноглобулини най-малко около 90 до 95% хомогенност са предпочитани и 98 до 99% или повече хомогенност са най-предпочитани за фармацевтична употреба.

7. Антитяло фрагменти

В обсега на настоящето изобретение са планирани също антитяло фрагменти. В едно изпълнение, са предоставени фрагменти от не-човешки, химерни и/или човешки антитела. В друго изпълнение са предоставени фрагменти на хуманизирани антитела. С Обикновено тези фрагменти проявяват специфично свързване за антиген с афинитет най-малко 10⁷ и по-предпочитано 10⁸ или 10⁹ М’¹. Хуманизираани антитяло фрагменти включват отделни тежки вериги, леки вериги Fab, Fab’ F(ab’)2, Fabc и Fv. Фрагменти са получени чрез рекомбинантни ДНК техники или ензимно или химично разделяне на интактни имуноглобулини.

8. Тестиране на антитела за терапевтична ефикасност върху животински модели

Групи от 7-9 месечни PDAPP мишки са инжектирани с 0.5 mg в PBS от поликлонално анти-Αβ или специфично анти-Αβ © моноклонално антитела. Всички антитяло препарати са пречистени за да имат ниски нива на ендотоксин. Моноклонални антитела могат да бъдат получени срещу фрагмент, чрез инжектиране фрагментът или по-дълга форма на Αβ у мишка, изготвяйки хибридоми и скриниране на хибридомите за антитяло, което специфично се свързва с желан фрагмент от Αβ, без да се свързва с други неприпокриващи се фрагменти на Αβ.

Мишки са инжектирани интраперитонеално като е необходим един период от 4 месеца за подържане циркулираща антитяло концентрация, измерена чрез ELISA титър, по-голям от

1/1000, определен с ELISA спрямо Αβ42 или други имуногени. Титрите са мониторирани и мишките са евтаназирани в края на 6-ия месец от инжектирането. Хистохимично, Αβ нива и токсикология са правени след смъртта. Десет мишки са използвани за една група.

9. Скрининг на антитела за очистваща активност

Изобретението предоставя също методи за скрининг на антитела за активност при очистване на амилоидно отлагане или някакъв друг антиген, или свързана биологична единица, за която е желана очистваща активност. За да се скринира за активност срещу амилоидно отлагане, тъканна проба от мозък на пациент с болест на Alzheimer или животински модел, с характерна патология за Alzheimer, е поставяна в контакт с фагоцитни клетки, носещи Fc рецептор, като микроглийни клетки и антитялото, което се тестира в среда in vitro. Фагоцитните клетки могат да бъдат първична култура или клетъчна линия, като BV-2, С8-В4 или ТНР-1. В някои методи, компонентите са комбинирани върху микроскопско стъкло за улеснение на микроскопския мониторинг. В някои методи, се извършват паралелно множество реакции в ямки на микротитрационна платка. В такъв формат, отделно миниатюрно стъкло за микроскопиране може да бъде поставено в отделните ямки или може да бъде използван не микроскопски формат на отчитане, като ELISA на Αβ. Предпочитано, се правят серии от измервания на количеството амилоидно отлагане в in vitro реакционна смес, започвайки от изходната стойност преди започване на реакцията и една или повече тестирани стойности по време на реакцията. Антиген може да бъде открит с оцветяване, например с флуоресцентно белязано антитяло срещу Αβ или друг компонент на амилоидните плаки. Антитялото използвано за оцветяване може да бъде или да не бъде същото антитяло, което се тестира за очистваща активност. Намаление спрямо основната линия по време на реакция на амилоидните отлагания, показва, че тестираното антитяло има очистваща активност. Такива антитела е възможно да бъдат полезни за профилактика или лечение болестта на Alzheimer и други амилоидни заболявания.

Аналогични методи могат да бъдат използвани за скриниране на антитела за активност при очистване на други типове биологични единици. Тестът може да бъде използван за откриване очистваща активност срещу всякакъв вид биологична единица. Обикновено, биологичната единица има някаква роля при човешко или животинско заболяване. Биологичната единица може да бъде © предоставена като тъканна проба или в изолирана форма. Ако е предоставена като тъканна проба, тъканната проба предпочитано е нефиксирана, за да позволява пряк достъп до компонентите на тъканната проба и да се избегне нарушение на конформацията на компонентите свързани с фиксиране. Примери на тъканни проби, които могат да бъдат изследвани в този тест, включват ракова тъкан, преканцерозна тъкан, тъкан съдържаща доброкачествен растеж като брадавици, бенки, тъкани инфектирани с патогенни микроорганизми, тъкани инфилтрирани с възпалителни клетки, тъкани носещи патологични матрикси между клетки (например, фибринозн перикардит), тъкан носеща анормални антигени, като © ръбцова тъкан. Примери за изолирани биологични единици, които могат да бъдат използвани включват Αβ, вирусни антигени или вируси, протеогликани, антигени на други патогенни микроорганизми, туморни антигени и адхезионни молекули. Такива антигени могат да бъдат получени от природни източници, рекомбинантна експресия или химична синтеза, измежду други начини. Тъканната проба или изолирана биологична единица е поставяна в контакт с фагоцитни клетки носещи Fc рецептори, като моноцити или микроглийни клетки и антитялото, което се тестира в една среда. Антитялото може да бъде насочено срещу биологичната единица, която се тестира или срещу антиген свързан с тази единица. В последния случай, задачата е да се тестира дали биологичната единица е заради друго фагоцитирана с антигена. Обикновено, въпреки че не е необходимо, антитялото и биологичната единица (понякога със свързан антиген), са контактували помежду се преди добавянето на фагоцитни клетки. След това е мониторирана концентрацията на биологичната единица и/или свързания антиген оставащи в средата, ако са налице. Намаление количеството или концентрацията на антигена или на свързаната биологична единица в средата, показва, че антитялото има очистващ отговор срещу антигена и/или свързана биологична единица във връзка с фагоцитни клетки (виж, например Пример IV).

В. Нуклеинова киселина кодираща имунологични или терапевтични агенти

Имунни отговори срещу амилоидни отлагания могат също да бъдат индуцирани чрез въвеждане на нуклеинови киселини, кодиращи антитела и вериги на техни компоненти, използвани за пасивна имунизация. Такива нуклеинови киселини могат да бъдат ДНК или РНК. Сегмент от нуклеинова киселина, кодиращ имуноген, обикновено е свързан с регулаторни елементи, като промотор и енхенсер, което позволява експресия на ДНК сегмент в предвидените прицелни клетки на пациент. За експресия в кръвни клетки, както е желателно за индуциране на имунен отговор, промоторни и енхенсерни елементи от леко или тежковерижни на имуноглобулинови гени или CMV главен междинен ранен промотор и енхенсер, са подходящи за директна експресия. Свързаните регулаторни елементи и кодиращи последователности често са кпонирани в един вектор. За въвеждане на двойноверижни антитела, двете вериги могат да бъдат клонирани в същия или отделни вектори.

Известен брой вирусни векторни системи са на разположение, включително ретровирусни системи (виж например, Lowrie and Tumin, Cur. Opin.Genet.Develop. 3:102-109 (1993)); аденовирусни вектори (виж например, Bett et al., J. Virol. 67:5911 (1993)); адено-свързани вирусни вектори (виж например, Zhou et al., J.Expl. Med. 179:1867 (1994)), вирусни вектори от pox семейството, включително vaccinia вирус и птичи шарков вирус, вирусни вектори от alpha virus genus като такива произхождащи от Sindbis и Semliki Forest вируси (виж например, Dubensky et al., J.Virol. 70:508 (1996)), вируси на венецуелски конски енцефалит (виж, Johnston et al., US 5,643,576) и рабдовируси, като вируса на везикуларния стоматит (виж, Rose, WO 96/34625| и папилома вируси (Ohne et al., Human Gene Thereapy 6:325 (1995); Woo et al., WO 94/12629 и Xiao & Brandsma, Nucleic Acids Res., 24,2630-2622 (1996)).

ДНК кодираща имуноген, или вектор съдържащ същия, може да бъде пакетирана в липозоми. Подходящи липиди и сродни аналози са описани от Eppstein et al., US 5,208,036, Feigner et al., US 5,264,618, Rose, US 5,279,833 и Epand et al., US 5,283,185. Вектори и ДНК кодиращи имуноген, могат също да бъдат абсорбирани на или свързани със зърнести носители, примери на които включват полиметил метакрилатни полимери и полиактиди и поли(лактид-когликолиди) виж, McGee et al., J.Micro Encap. (1996).

Вектори за генна терапия или голи полинуклеотиди (например ДНК), могат да бъдат предоставени in vivo чрез въвеждане на пациент, обикновено чрез системно въвеждане (например, интравенозно, интраперитонеално, назално, стомашно, интрадермално, интрамускулно, подкожно или интракраниална инфузия) или топично приложение (виж например, Anderson et al., US 5,399,346). Терминът “гол полинуклеотид” се отнася за полинуклеотид, който не е комплексно свързан с колоидни материали. Голи нуклеотиди понякога са клонирани в плазмиден вектор. Такива вектори могат по-нататък да включват улесняващи агенти като bupivacine (Attardo et al., US 5,593,970). ДНК може също да бъде въведена като се използва генна пушка. Виж, Xiao & Brandsma, по-горе. ДНК кодираща имуноген е преципитирана върху повърхността на микроскопични метални зърна. Микропрожектилите са ускорявани с ударна вълна или разширяващ се газ хелий и проникват в тъканта на дълбочина от няколко клетъчни слоя. Например, подходящ е The Accel™ Gene Delivery Device, ® произведен от Agacetus, Inc. Middleton Wl. По избор, гола ДНК може да преминава през кожата в кръвния поток просто чрез нанасяне на ДНК върху кожата с химично или механично дразнене (виж Howell et al., WO 95/05853).

В следващ вариант, вектори кодиращи имуногени могат да бъдат предоставени на клетки ex vivo, такива клетки експлантирани от отделен пациент (например, лимфоцити, аспирати от костен мозък, тъканна биопсия) или универсални донорни хемопоетични стволови клетки, могат да бъдат последвани от реимплантация на клетките у пациент, обикновено след подбор на клетки, които са включени във вектора.

©

II. Профилактични и терапевтични методи

Настоящето изобретение е насочено inter alia за лечение болест на Alzheimer и други амилоидогенни заболявания, чрез въвеждане на терапевтични имунологични реагенти (например хуманизирани имуноглобулини) срещу специфични епитопи в Αβ, на пациент при условия, които създават благоприятен терапевтичен отговор у пациент (например, индукция на фагоцитоза на Αβ, намаляване натрупванията на плаки, инхибиране образуването на плаки, намаляване на невритната дистрофия, подобряване на когнитивната функция и/или възстановяване, лечение или профилактика на когнитивен упадък) у пациент, например, за профилактика или лечение на амилоидогенно заболяване. Изобретението също е насочено към приложение на представените имунологични реагенти (например, хуманизирани имуноглобулини) за производство на лекарство за лечение или профилактика на амилоидогенно заболяване.

Терминът “третиране” както тук е използван, е дефиниран като приложението или въвеждането на терапевтичен агент у пациент, или приложение или въвеждане на терапевтичен агент на изолирана тъкан или клетъчна линия от пациент, който има заболяване, симптом на заболяване или предразположение към заболяване, с цел да лекува, оздравява, облекчава, подобрява, променя, облекчава, подобрява или повлиява заболяването, симптомите на заболяването или предразположението към заболяване.

В един аспект, изобретението предоставя методи за профилактика или лечение на заболяване свързано с амилоидни отлагания на Αβ в мозъка на пациент. Такива болести включват болест на Alzheimer, синдром на Down и когнитивно нарушение. Последното може да се появи със или без други характеристики на амилоидогенно заболяване. Някои методи на изобретението са последвани от въвеждане на ефективна дозировка от антитяло, което специфично се свързва с компонент на амилоидно отлагане у пациента. Такива методи са особено полезни за профилактика и лечение болестта на Alzheimer у пациенти хора. Примерни методи включват въвеждане на ефективна дозировка от антитяло, което се свързва с Αβ. Предпочитани методи включват въвеждане на ефективна дозировка от антитяло, което специфично се свързва с епитоп между остатъци 1-10 на Αβ, например антитела, които специфично се свързват с епитоп между остатъци 1-3 на Αβ, антитела, които специфично се свързват с епитоп между остатъци 14 на Αβ, антитела, които специфично се свързват с епитоп между остатъци 1-5 на Αβ, антитела, които специфично се свързват с епитоп между остатъци 1-6 на Αβ, антиела, които специфично се свързват с епитоп между остатъци 1-7 на Αβ или антитела, които специфично се свързват с епитоп между остатъци 3-7 на Αβ. В друг аспект, изобретението характеризира въвеждане на антитела, които се свързват с епитоп съдържащ един свободен N-терминален остатък на Αβ. В друг аспект, изобретението характеризира въвеждане на антитела, които се свързват с епитоп между остатъци 1-10 на Αβ, където остатък 1 и/или остатък 7 на Αβ е аспаргинова киселина. В друг аспект, изобретението характеризира въвеждане на антитела, които специфично се свързват с Αβ пептид, без да се свързват с пълноразмерен амилоиден прекурсорен протеин (АРР). В друг аспект, изотипът на антитялото е човешки lgG1.

В друг аспект, изобретението характеризира въвеждане на антитела, които се свързват с амилоидно отлагане у пациент и предизвикват очистващ отговор срещу амилоидно отлагане. Например, такъв очистващ отговор може да бъде предизвикан от Fc рецептор медиирана фагоцитоза.

Терапевтични агенти на изобретението обикновено са съществено чисти от нежелани примеси. Това означава, че един агент обикновено е най-малко с около 50% т/т (тегло/тегло) чистота, както и съществено свободен от интерфериращи белтъци и примеси. Понякога агентите са с най-малко около 80% т/т и попредпочитано с най-малко 90% или около 95% т/t чистота. Обаче, прилагайки конвенционални техники за белтъчно пречистване, могат да бъдат получени хомогенни пептиди с най-малко 99% т/т.

Методите могат да бъдат прилагани както на безсимптомни пациенти така и на такива показващи текущо симптоми на заболяване. Антителата използвани в тези методи могат да бъдат човешки, хуманизирани, химерни или не-човешки антитела или техни фрагменти (например, антиген свързващи фрагменти) и могат да бъдат монолонални или поликлонални, както тук е описано. В друг аспект, изобретението характеризира въвеждане на антитела, получени от човек, имунизиран с Αβ пептид, който човек може да бъде пациент, който да бъде лекуван с антитяло.

В друг аспект, изобретението характеризира въвеждане на антитяло с фармацевтичен носител като лекарствен състав. По избор, антитялото може да бъде въведено на пациент, чрез въвеждане на полинуклеотид, кодиращ най-малко една антитяло верига. Полинуклеотидът е експресиран да произвежда антитяло верига у пациент. По избор, полинуклеотидът кодира тежки или леки вериги на антитялото. Полинуклеотидът е експресиран да произвежда тежките и леките вериги у пациента. В примерни изпълнения, пациентът е мониториран за ниво на въведено антитяло в кръвта на пациента.

Така изобретението задоволява една дълготрайна нужда от терапевтични режими за профилактика или подобрение невропатологията и у някои пациенти, когнитивното нарушение, свързано с болестта на Alzheimer.

©

А. Пациенти податливи на лечение

Пациенти податливи на лечение включват индивиди в риск от заболяване, но не проявяващи симптоми, както и пациенти проявяващи понастоящем симптоми. В случая на болестта на Alzheimer, в действителност всеки е в риск от болест на Alzheimer, ако той или тя живее достатъчно дълго. Следователно, представените методи могат да бъдат прилагани профилактично на цялата популация, без да има нужда от някакво определяне на риска за дадения пациент. Представените методи са особено полезни за индивиди, които знаят за генетичен риск от болест на

Alzheimer. Такива индивиди включват тези, които имат роднини с това заболяване и такива, чиито риск е определен с анализ на генетични или биохимични маркери. Генетични маркери за риск от болест на Alzheimer включват мутации в АРР гена, по-специално мутации в позиция 717 и позиции 670 и 671, определени като Hardy и шведски мутации съответно (виж, Hardy по-горе). Други маркери за риск са мутации в пресенилните гени, PS1 и PS2 и АроЕ4, фамилна анамнеза за AD, хиперхолестеролемия или атеросклероза. Индивиди страдащи понастоящем от болест на Alzheimer могат да бъдат разпознати по характерна деменция, както и по наличието на рискови фактори, описани по-горе. В допълнение, има на разположение известен брой диагностични тестове за идентифициране на индивиди, които имат AD. Такива включват измерване на CSF tau (tau в ликвора) и нива на Αβ42. Повишени tau и понижени Αβ42 нива, означават наличие на AD. Индивиди страдащи от болест на Alzheimer могат също да бъдат диагностицирани с ADRDA критерии, както е обсъдено в раздела Примери.

При асимптомни пациенти, лечението може да започне на всяка възраст (например, 10, 20, 30). Обикновено обаче, не е необходимо да се започне лечение преди пациентът да навърши 40, 50, 60 или 70 години. Лечението обикновено включва множествени дозировки за известен период от време. Лечението може да бъде контролирано чрез измерване нивата на антитела във времето. В случаите с отговор, е индицирана бустерна дозировка. В случая на пациенти с потенциален синдром на Down, лечението може да започне преди раждането, чрез въвеждане на терапевтичен агент на майката или наскоро след раждане.

В. Лечебни режими и дозировки

В профилактични приложения, фармацевтични препарати или медикаменти са въведени на пациент предразположен на, или с други думи в риск от болест на Alzheimer, в количество достатъчно да елиминира или намали риска, да намали тежестта или забави началото на заболяването, включително биохимични, хистологични и/или поведенчески симптоми на заболяването, неговите усложнения и междинни патологични фенотипове, проявени при развитието на болестта. В терапевтични приложения, препарати или медикаменти са въвеждани на пациент, суспектен или страдащ от такова заболяване, в количество достатъчно да излекува, или поне частично да спре, симптомите на заболяването (биохимични, хистологични и/или поведенчески), включително техните усложнения и междинни патологични фенотипове при развитието на болестта.

В някои методи, въвеждане на агент намалява или елиминира миокогнитивно нарушение у пациенти, които не са развили още характерна патология за Alzheimer. Количество адекватно да изпълни терапевтично или профилактично лечение, е дефинирано като терапевтично- или профилактично-ефективна доза. При двата - профилактичен и терапевтичен режими, агентите обикновено се въвеждат в няколко дозировки, докато се постигне задоволителен имунен отговор. Терминът “имунен отговор” или “имунологичен отговор” включва развитието на хуморален (антитяло медииран) и/или клетъчен (медииран с антиген-специфични Т клетки или техни секреторни продукти) отговор, насочен срещу антиген у даден реципиент. Такъв отговор може да бъде активен отговор, т.е. индуциран чрез въвждане на имуноген, или пасивен отговор, т.е. индуциран чрез въвеждане на имуноглобулин или антитяло или праймирани Т-клетки.

“Имуногенен агент” или “имуноген” е способен да индуцира имунологичен отговор срещу себе си при въвеждане у бозайник, по избор в комбинация с адювант. Обикновено, имунният отговор е контролиран и са давани повтарящи се дозировки ако имунният отговор започне да отслабва.

Ефективни дози от препаратите на настоящето изобретение, за лечение на горе описаните състояния, варират в зависимост от много различни фактори, включително начини на въвеждане, прицелно място, физиологично състояние на пациента, дали пациентът е човек или животно, други въвеждани медикаменти и дали третирането е профилактично или терапевтично. Обикновено пациентът е човек, но могат да бъдат третирани и не-човешки бозайници, включително трансгенни бозайници. Лечебните дозировки е необходимо да бъдат титрирани за оптимизиране на безопасността и ефикасността.

За пасивна имунизация с антитяло, дозировката е в границите от около 0.0001 до 100 mg/kg и по-често от 0.01 до 5 mg/kg телесно тегло на приемника. За примерни дозировки могат да бъдат 1 mg/kg телесно тегло или 10 mg/kg телесно тегло или в границите на 1-10 mg/kg, предпочитано най-малко 1 mg/kg. На отделни индивиди могат да бъдат въвеждани такива дозировки ежедневно, на редуващи се дни, седмично или съгласно всякаква друга схема, определена с емпиричен анализ. Примерно третиране включва въвеждане в множествени дозировки за продължителен период, например, най-малко шест месеца. Допълнителни примерни режими на третиране включват въвеждане веднъж на всеки две седмици или един път месечно, или един път на 3 до 6 месеца. Примерни схеми на дозировка включват 1-10 mg/kg или 15 mg/kg на последователни дни, 30 mg/kg на редуващи се дни или 60 mg/kg седмично. В някои методи, се въвеждат едновременно две или повече моноклонални антитела с различни свързващи специфичности, при който случай дозировката на всяко въведено антитяло попада в указаните граници.

Антитяло се въвежда обикновено на множествени сеанси. Интервалите между единичните дозировки могат да бъдат седмични, месечни или годишни. Интервалите могат също да бъдат неравномерни, както е указано от измерване на кръвните нива на антитяло срещу Αβ у пациента. В някои методи, дозировката е нагласена за постигане плазмена антитяло концентрация от 1-1000 pg/ml в някои методи 25-300 pg/ml. По избор, антитяло може да бъде въведено като комбинация с продължително освобождаване, в който случай се изисква по-нарядко въвеждане. Дозировката и честотата варират в зависимост от полу-живота на антитялото у пациента. Общо, човешките антитела имат най-дълъг полу-живот, последвани от хуманизирани антитела, химерни антитела и нечовешки антитела.

Дозировката и честотата на въвеждане могат да варират в зависимост от това дали третирането е профилактично или терапевтично. В профилактични приложения, препарати съдържащи настоящите антитела или техен коктейл, се въвеждат на пациент, който не е още в болестно състояние, за повишаване резистентността на пациента. Такова количество е дефинирано като “профилактична ефективна доза”. При тази употреба, точните количества отново зависят от здравословното състояние на пациента и общото имунно състояние, но общо са в границите от 0.1 до 25 mg за доза, по-специално 0.5 до 2.5 mg за доза. Относително ниска дозировка е въведена на относително не чести интервали за един дълъг период от време. Някои пациенти продължават да получават лечение за остатъка от техния живот.

При терапевтични приложения, понякога се изисква относително висока дозировка (например от около 1 до 200 mg антитяло за доза, с дозировки от 5 до 25 mg, по-обичайно използвани) на относително по кратки интервали, докато се намали или спре прогресирането на заболяването, предпочитано докато пациентът покаже частично или пълно подобрение на симптомите на заболяването. Следователно, патентът може да бъде въвеждан при профилактичен режим.

Дозите за нуклеинови киселини кодиращи антитела са в границите от около 10 ng до 1д, 100 пд до 100тд, 1 цд до 10 тд или 30-300 цд ДНК на пациент. Дозите за инфекциозни вирусни вектори варират от 10-100 или повече вириони за доза.

Терапевтични агенти могат да бъдат въвеждани парентерално, топично, интравенозно, орално, подкожно, интраартериално, интракраниално, интраперитонеално, интраназално или интрамускулно за профилактично и/или терапевтично третиране. Най-обичайният начин за въвеждане на имуногенен агент е подкожния, въпреки че други начини могат също да бъдат ефективни. Следващият най-обичаен начин е итрамускулното инжектиране. Този начин на инжектиране най-често се извършва в мускулите на ръката или крака. В някои методи, агенти са инжектирани директно в дадена тъкан, където са натрупани отлагания, например интракраниално инжектиране. Интрамускулно инжектиране или интравенозна инфузия са предпочитани за въвеждане на антитяло. В някои методи, определени терапевтични антитела са инжектирани директно в черепа. В някои методи, антитела са въведени като състав с продължително освобождаване или устройство, като Medipad™ устройство.

Агенти на изобретението могат по избор да бъдат въвеждани в комбинация с други агенти, които са поне отчасти ефективни при лечение на амилоидогенно заболяване. В случая с болестта на Alzheimer и синдрома на Down, при които отлаганията се появяват в мозъка, агенти на изобретението могат също да бъдат въведени в комбинация с други агенти, които повишават преминаването на агентите на изобретението през кръвномозъчната бариера.

С. Фармацевтични препарати

Агенти на изобретението често са въвеждани като фармацевтични препарати, съдържащи активен терапевтичен агент, т.е. едно разнообразие от други фармацевтично приемливи компоненти. Виж, Remington’s Pharmaceutical Science (15^th ed., Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania (1980)). Предпочитаните форми зависят от предвидения начин на въвеждане и терапевтично приложение. Препаратите могат също да включват, в зависимост от желаната комбинация, фармацевтично приемливи, не-токсични носители или разредители, които са определени като вехикулуми, обичайно използвани за комбиниране на фармацевтични препарати за въвеждане на животни или човек. Разредителят е подбран така, че да не повлиява биологичната активност на комбинацията. Примери на такива разредители са дестилирана вода, физиологичен фосфатно-буфериран разтвор, разтвори на Ringer, декстрозен разтвор, Hank’s разтвор. В допълнение, фармацевтичният препарат или комбинация, може също да включва други носители, адюванти или не-токсични, не-терапевтични, не-имуногенни стабилизатори и подобни.

Фармацевтични препарати могат също да включват големи, бавно метаболизиращи се макромолекули, като белтъци полизахариди като хитозан, полимлечни киселини, полигликолови киселини и кополимери (като latex functionalized sepharose™, агароза, целулоза и подобни), полимерни аминокиселини, аминокиселинни кополимери и липидни агрегати (като маслени капки или липозоми). В допълнение, тези носители могат да функционират като имуностимулиращи агенти (т.е. адюванти).

За парентерално въвеждане, агенти на изобретението могат да бъдат въвеждани като инжектируеми дозировки на разтвор, или суспензия на субстанцията във физиологично приемлив разредител с фармацевтичен носител, който може да бъде стерилна течност като водни масла, физиологичен разтвор, глицерол или етанол. В допълнение, спомагателни вещества, като овлажняващи или емулгиращи агенти, повърхностно активни вещества, pH буфериращи вещества и подобни могат да присъстват в препаратите. Други компоненти на фармацевтичните препарати са петролеум, от животински, растителен или синтетичен произход, например, фъстъчено масло, соево масло и минерално масло. Общо, гликоли като пропилен гликол или полиетилен гликол, са предпочитани течни носители, по-специално за инжектируеми разтвори. Антитела могат да бъдат въведени във формата на депо инжекции или имплант препарат, който може да бъде комбиниран по такъв начин, че да позволява продължително освобождаване на активната съставка. Един примерен състав съдържа моноклонално антитяло 5 mg/ml, комбинирано във воден буфер, състоящ се от 50 тМ L-хистидин, 150 mM NaCI, pH нагласено на 6.0 с HCI.

Обикновено, препарати са изготвени като инжектируеми, като течни разтвори или суспензии; могат също да бъдат изготвени твърди форми, подходящи за разтваряне във, или суспендиране във, течни вехикулуми, преди инжектиране. Препаратът може също да бъде емулгиран или инкапсулиран в липозоми или микро частици като полилакгид, полигликолид или кополимер за повишаване ефекта на адюванта, както е обсъдено по-горе (виж, Langer, Sceince 249:1527 (1990) и Hanes, Advanced Drug Delivery Reviews 28:97 (1997)). Агенти на това изобретение могат да бъдат въвеждани във формата на депо инжекция или имплант препарат, които могат да бъдат формулирани по такъв начин, че да позволяват продължително или пулсово освобождаване на активната съставка.

Допълнителни комбинации, подходящи за други начини на въвеждане включват орални, интраназални и белодробни комбинации, супозитории и трансдермални приложения. За супозитории, свързващи вещества и носители включват, например, полиалкилен гликоли или триглицериди; като супозиториите могат да бъдат получени от смеси съдържащи активната съставка в рамките на 0.5% до 10%, предпочитано 1%-2%. Орални комбинации включват ексципиенти, като фармацевтично качество манитол, лактоза, нишесте, магнезиев стеарат, натриев захарин, целулоза и магнезиев карбонат. Тези препарати имат формата на разтвори, суспензии, таблетки, пилюли, капсули, комбинации с продължително освобождаване или прахове и съдържат 10%-95% от активната съставка, предпочитано 25%-70%.

Топично приложение може да има за резултат трансдермално или интрадермално освобождаване. Топично въвеждане може да бъде улеснено чрез придружаващо въвеждане на агента с холера токсин или детоксикирани производни, или техни субединици, или други сходни бактериални токсини (Виж, Glenn et al., Nature 391, 851 (1998)). Придружаващо въвеждане може да бъде постигнато като се използват компонентите като смес или като свързани молекули, получени с химично кръстосано свързване или експресия на слет белтък.

По избор, трансдермално доставяне може да бъде постигнато като се използва кожен път или се използват трансферозоми (Paul et al., Eur.J.Immunol. 25:3521 (1995); Cevc et al., Biochem. Biophys. Acta 1368:201-15 (1998)).

III. Мониториране курса на третиране

Изобретението предоставя методи за мониториране третирането у пациент, страдащ от, или предразположен към болест на Alzheimer т.е., за мониториране курса на третиране, приложен на пациент. Методите могат да бъдат използвани за контрол на терапевтичното третиране на пациенти със симптоматика и за профилактично третиране на асимптомни пациенти. В частност, методите са полезни за контролиране на пасивна имунизация (например, измерване нивото на въведеното антитяло).

Някои методи включват определяне на изходна стойност, например на антитяло ниво или профил у пациент, преди въвеждане на дозировка от агент и сравнение на това със стойност за профил или ниво след третиране. Значително повишение (т.е. по-голямо от обичайната граница на експерименталната грешка при повторни измервания на същата проба, изразено като стандартно отклонение от средната стойност на такива измервания), стойността на нивото или профила, сигнализира положителен резултат от третиране (т.е. че въвеждането на агента е постигнало желания отговор). Ако стойността за имунния отговор не се променя значимо, или намалява, това показва отрицателен резултат от третирането.

При други методи, се определя една контролна стойност (т.е. средна стойност и стандартно отклонение) за нивото или профила за контролна популация. Обикновено отделните индивиди в контролната популация не са получавали предварително лечение. Измерените стойности за нивото или профила на даден пациент, след въвеждане на терапевтичен агент, след това са сравнени с контролната стойност. Значително повишение в сравнение с контролата (например, по-голямо от едно стандартно отклонение от средната стойност) говори за положителен или задоволителен резултат от лечението. Липсата на значително повишение или понижение, говори за отрицателен или недостатъчен резултат от лечението. Въвеждане на агент обикновено продължава докато нивото е повишено спрямо контролната стойност. Както преди, достигането на плато спрямо контролните стойности, е индикатор, че въвеждането на лечение може да бъде прекъснато или намалено по отношение на дозировка и/или честота.

При други методи, контролна стойност за нивото или профила (например средна стойност и стандартно отклонение) е определена от контролна популация на индивиди, които са имали лечение с терапевтичен агент и чийто нива или профили са достигнали плато в отговор на лечението. Измерени стойности за нива или профили у един пациент са сравнени с контролната стойност. Ако измереното ниво у пациента не е значимо различно (например, повече от едно стандартно отклонение) от контролната ф стойност, лечението може да бъде прекъснато. Ако нивото у пациента е значимо под контролната стойност, продължаване въвеждането на агента е потвърдено. Ако нивото у пациента се запазва под контролната стойност, тогава е индицирана промяна на третирането.

При други методи, пациент, който не получава понастоящем третиране, но е имал предишен курс на третиране, е мониториран за нива на антитела или профили, за определяне дали се изисква подновяване на третирането. Измереното ниво или профил у пациента, може да бъде сравнено със стойността достигната преди това у пациента след предишен курс на третиране. Значително © понижение спрямо предишното измерване (т.е. по-голямо от обичайната граница на грешката при повторни измервания на същата проба) е индикация, че лечението може да бъде възобновено. По избор, стойността измерена у даден пациент може да бъде сравнена с контролна стойност (средна стойност плюс стандартно отклонение), определена в популация от пациенти, след като са претърпели курс на лечение. По избор измерената стойност у даден пациент, може да бъде сравнена с контролна стойност у популации от профилактично третирани пациенти, които остават без симптоми на заболяване, или популации от терапевтично третирани пациенти, които показват подобрение на характеристиките на заболяването. Във всички тези случаи, значително понижение спрямо контролното ниво (т.е. повече от едно стандартно отклонение) е индикатор, че лечението трябва да бъде възобновено за пациента.

Тъканната проба за анализ обикновено е кръв, плазма, серум, мукозна течност или ликвор от пациента. Пробата е анализирана, например, за нива или профили на антитела срещу Αβ пептид, например нива или профили на хуманизирани антитела. ELISA методи за откриване антитела, специфични срещу Αβ са описани в раздела Примери. При някои методи, нивото или профилът на въведеното антитяло е определено, като е използвана очистваща проба, например, в in vitro проба за фагцитоза, както тук е описано. При тези методи, тъканна проба от пациент, който се тестира, е поставена в контакт с амилоидни отлагания (например от една PDAPP мишка) и фагоцитни клетки, носещи Fc рецептори. След това е контролирано последващото очистване на амилоидното отлагане. Наличието и степента на очистващ отговор, е индикация за наличие и ниво на антитела, ефективно да очиства Αβ в тъканна проба на пациент, който е тестиран.

Антитяло профилът последван от пасивна имунизация, обикновено показва един непосредствен максимум на антитяло концентрацията, последван от експоненциално намаление. Без последваща дозировка, намалението приближава нивата преди третиране за един период от дни до месеци, в зависимост от полуживота на въведеното антитяло. Например, полу-животът на някои човешки антитела е от порядъка на 20 дни.

При някои методи, е правено изходно измерване на антитялото срещу Αβ у пациент преди въвеждане, второ измерване е правено наскоро след това за определяне максимума на антитяло нивото, и едно или повече последващи измервания са правени на интервали, за мониториране понижението на антитяло нивата. Когато нивото на антитяло е намалено до изходното или един предварително определен процент от максимума по-малък от изходното ниво (например 50%, 25% или 10%), тогава се въвежда следваща дозировка от антитяло. При някои методи, максимумът или последващи измерени нива по-малки от изходното, са сравнени с референтни нива, предварително определени, за създаване на благоприятен профилактичен или терапевтичен режим на третиране при други пациенти. Ако измереното антитяло ниво е значително по-ниско от референтното ниво (например, по-малко от средната стойност минус едно стандартно отклонение на референтната стойност у популация от пациенти, които са с подобрение от третирането), тогава е индицирано въвеждане на допълнителна дозировка антитяло.

Допълнителни методи включват мониториране, по време на курса на третиране, всеки признат в тази област физиологичен сиимптом (например, физикален или ментален симптом), рутинно използван от изследователи или лекари, за диагностициране или мониториране на амилоидогенни заболявания (например, болест на Alzheimer). Например, може да се мониторира когнитивно нарушение. Последното е симптом за болест на Alzheimer и синдром на Down, но може също да се появи без други характеристики на едно от тези заболявания. Например, когнитивно нарушение може да бъде мониторирано чрез определяне един показател на пациента на Mini-Mental State Exam (Мини-ментално изследване на състоянието), в съответствие с установената практика по време курса на третиране.

С. Китове

Изобретението освен това предоставя китове за изпълнение на мониториращите методи, описани по-горе.

Обикновено, такива китове съдържат един агент, който специфично се свързва с антитела срещу Αβ. Китът може да включва също един белег. За откриване на антитела срещу Αβ, белегът обикновено е във формата на белязани анти-идиотипни антитела. За откриване на антитела, агентът може да бъде доставен предварително свързан за твърда фаза, като ямки на микротитрационна платка. Китовете обикновено съдържат указания за употреба на кита. Етикетировката може да включва схема или друг съответен режим, корелиращ нивата на измерения белег с нивата на антитела срещу Αβ. Терминът маркиране се отнася до всякакъв писмен или регистриран материал, който е приложен, или придружава кита по всяко време на производство, транспорт, продажба или употреба. Например, терминът маркировка обхваща рекламни листовки и брошури, опаковъчни материали, инструкции, аудио или видеокасети, компютерни дискове, както и надписи, отпечатани директно върху китовете.

Изобретението предоставя също диагностични китове, например, изследователски, за откриване и/или диагностични китове (например, за изпълнение на in vivo образи). Такива китове обикновено съдържат едно антитяло за свързване с епитоп на Αβ, предпочитано с остатъци 1-10. Предпочитано, антитялото е белязано или един вторичен бележещ реагент е включен в кита. Предпочитано, китът е маркиран с инструкции за изпълнение на предвиденото приложение, например, за изпълнение на in vivo проба за изображения. Примерни антитела са тези описани тук.

D. In vivo образи

Изобретението предоставя методи за in vivo образи на амилоидни отлагания у пациент. Такива методи са полезни за диагностициране или потвърждаване диагнозата за болест на Alzheimer, или предразположение към нея. Например, методите могат да бъдат приложени на пациент, който има симптоми и деменция. Ако пациентът има абнормни амилоидни отлагания, тогава пациентът вероятно страда от болест на Alzheimer. Методите могат също да бъдат използвани при асимптомни пациенти. Наличието на абнормни отлагания на амилоид показва предразположение за бъдещо симптоматично заболяване. Методите са също полезни за мониториране прогресирането на болестта и/или отговорът на лечение при пациенти, които предварително са диагностицирани с болест на Alzheimer.

Методите се основават на въвеждане на реагент, като антитяло, което се свързва с Αβ на пациента и след това на откриване агента, след като се е свързал. Предпочитани антитела се свързват с Αβ отлагания у пациент, без да се свързват с пълноразмерен АРР полипептид. Антитела свързващи се с епитоп на Αβ между аминокиселини 1-10 са особено предпочитани. В някои методи антитялото се свързва с епитоп между аминокиселини 7-10 на Αβ. Такива антитела обикновено се свързват без да индуцират съществен очистващ отговор. В други методи, антитялото се свързва с епитоп между аминокиселини 1-7 на Αβ. Такива антитела обикновено се свързват и индуцират очистващ ефект срещу Αβ. Обаче, очистващия ефект може да бъде избегнат като се използват антитяло фрагменти, които нямат пълноразмерна константна област, като Fabs. В някои методи, едно и също антитяло може да служи като лечебен или диагностичен реагент. Общо, антитела свързващи се с епитопи С-крайни на остатък 10 на Αβ, не показват толкова силен сигнал, както антитела свързващи се с епитопи между остатъци 1-10, вероятно поради това, че С-крайните епитопи са недостъпни в амилоидни отлагания. Съответно на това, такива антитела са по-малко предпочитани.

Диагностични реагенти могат да бъдат въведени с интравенозна инжекция в тялото на пациента или директно в мозъка чрез интракраниална инжекция или чрез пробиване на отвор през черепа. Дозировката на реагента трябва да бъде в същите граници както за методите на лечение. Обикновено, реагентът е белязан, въпреки че при някои методи, първичният реагент с афинитет за Αβ е небелязан и вторичен бележещ агент се използва за свързване с първичния реагент. Изборът на белег зависи от начина на откриване. Например, флуоресцентен белег е подходящ за оптично доказване. Употреба на парамагнитни белези е подходяща за томографско доказване, без хирургична интервенция. Радиоактивно белязане може също да бъде доказано с РЕТ или SPECT.

Диагнозата се поставя чрез сравнение броя, големината и/или интензитета на белязаните места, спрямо съответните изходни стойности. Изходните стойности могат да представляват средните нива у популация на неболедуващи индивиди. Изходни стойности могат също да представляват предишни нива, определени у същия пациент. Например, изходни стойности могат да бъдат определени у пациент преди начало на третиране и измерени стойности след това, да бъдат сравнени с изходните стойности. Намаление на стойностите по отношение на изходните показва положителен отговор на третирането.

Настоящето изобретение ще бъде по-пълно описано чрез следните не-ограничаващи примери.

ПРИМЕРИ

Пример I.: Терапевтична ефикасност на анти-Αβ антитела: mAb 2НЗ, mAb 10D5, mAb 266, mAb 21F12 и PAB1-42

Този пример тестира капацитета на различни моноклонални и поликлонални антитела срещу Αβ, да инхибират натрупване на Αβ в мозъка на хетерозиготни трансгенни мишки.

А. Дизайна на проучването

Шестдесет мъжки и женски, хетерозиготни PDAPP трансгенни мишки, на възраст 8.5 до 10.5 месеца, са получени от Charles River Laboratory. Мишките са разпределени в шест групи за третиране с различни антитела срещу Αβ. Животните са разпределени да съвпадат по пол, възраст, произход и източник на животните, в групи възможно най-близко. Таблица 2 представя експерименталния дизайн.

Таблица 2. Експриментален дизайн

Третирана Група	№	третиране антитяло	антитяло специфичност	антитяло ИЗОТИП
1	9	няма (само PBS)	NA^b	ΝΑ
2	10	поликлонално	Αβ1-42	смесен
3	0	mAb^d2H3	Αβ1-12	lgG1
4	8	mAb10D5	Αβ3-7	IgGl
5	6	mAb 266	Αβ13-28	lgG1
6	8	mAb21F12	Αβ33-42	lgG2a

a. Брой мишки в група при завършване на експеримента. Всички групи започват с 10 животни в група.

b. ΝΑ: не приложимо

c. миши поликпонален:анти-агрегиран Αβ42

d. mAb: монокпонапно антитяло

Както е показано на Таблица 2, антителата включват четири миши Αβ-специфични моноклонални антитела, 2НЗ (насочено срещу Αβ остатъци 1-12), 10D5 (насочено срещу Αβ остатъци 3-7), 266 (насочено срещу Αβ остатъци 13-28 и се свързва с разтворим, но не с агрегиран ΑΝ1792), 21F12 (насочено срещу Αβ остатъци 33-42). Пета група е третирана с Αβ-специфична поликлонална антитяло фракция (предизвикана чрез имунизация с агрегиран ΑΝ1792).

Отрицателната контролна група е получавала разтворителя, PBS, самостоятелно без антитяло.

В. Мониториране курса на третиране

Моноклоналните антитела са инжектирани в доза от около 10 mg/kg (като се приема, че мишките са с тегло 50 д). Антитяло титри са мониторирани за 28 седмици третиране. Инжекции са правени интраперитонеално всеки седем дни, средно да се подържат анти-Αβ титри над 1000. Въпреки че са измерени по-ниски титри за mAb 266, тъй като то не се свързва добре с агрегирания AN1792, използван като захващащ антиген в пробата, същата схема на дозиране е запазена за тази група. Групата получаваща моноклонално антитяло 2НЗ е прекъсната в рамките на първите три седмици, тъй като антитялото е изчиствано твърде бързо in vivo.

За определяне на антитяло титри, направено е кръвопускане на една подгрупа от три случайно подбрани мишки от всяка група, непосредствено преди всяка интраперитонеална инокулация, общо 30 кръвопускания. Антитяло титри са измерени като ΑβΙ-42-свързване на антитяло, като е използвана сандвичова ELISA с пластмасови много-ямкови платки, покрити с Αβ1-42 както подробно е описано в Общи материали и методи. Средни титри за всяко кръвопускане са представени в Таблица 3 за поликлонално антитяло и моноклонални 10D5 и 21F12.

Таблица 3:

седмици 21F12	21F12	седмици 10D5	10D5	седмици пали	папи
0.15	500	0.15	3000	0.15	1600
0.5	800	0.5	14000	0.5	4000
1	2500	1	5000	1	4500
1.5	1800	1.1	5000	1.5	3000
2	1400	1.2	1300	2	1300
3	6000	2	3000	3	1600
3.5	550	3	4000	3.5	650
4	1600	3.5	500	4	1300
5	925	4	2400	5	450
6	3300	5	925	6	2100
7	4000	6	1700	7	1300
8	1400	7	1600	8	2300

9	1900	8	4000	9	700
10	1700	9	1800	10	600
11	1600	10	1800	11	600
12	1000	11	2300	12	1000
13	1500	12	2100	13	900
14	1300	13	2800	14	1900
15	1000 .	14	1900 ·	15	1200
16	1700	15	2700	16	700
17	1700	16	1300	17	2100
18	5000	17	2200	18	1800
19	900	18	2200	19	1800
20	300	19	2500	20	1200
22	1750	20	980	22	1000
23	1600	22	2000	23	1200
24	1000	23	1000	24	675
25	1100	24	850	25	850
26	2250	25	600	26	1600
27 28	1400	26 27 28	1100 ; 1450	27 28	1900

Титри са средно около 1000 за този период от време за препарата от поликлонално антитяло и малко над това ниво за 100D5- и 21П2-третирани животни.

Третирането е продължено за един шест-месечен период общо за 196 дни. Животните са евтаназирани една седмица след последната доза.

С. Αβ и АРР нива в мозъка

След около шест месеца третиране с различни препарати от анти-Αβ антитела, мозъците са извадени от животните след перфузия с физиологичен разтвор. Една хемисфера е обработена за имунохистохимичен анализ и втората е използвана за количествено определяне на Αβ и АРР нива. За измерване концентрациите на различни форми бета амилоиден пептид и амилоид прекурсорен протеин (АРР), хемисферите са сецирани и са направени хомогенати от хипокампална, кортикална и церебеларна области в 5М гуанидин. Те са разредени серийно и е определено количествено нивото на амилоиден пептид или АРР чрез сравняване със серии от разреждания на стандарти от Αβ пептид или АРР с известни концентрации в ELISA формат.

Нивата на общия Αβ и на Αβ1-42, измерени с ELISA в хомогенати от мозъчна кора и хипокамп и нивото на общия Αβ в церебелума, са представени в Таблици 4, 5 и 6, съответно. Медианната концентрация на общия Αβ за контролната група, инокулирана с PBS, е 3.6-кратно по-висока в хипокампа, в сравнение с мозъчната кора (медиана 63,389 ng/g хипокампална тъкан, сравнена с 17,818 ng/g за мозъчната кора). Медианното ниво в церебелума на контролната група (30.6 ng/g тъкан) е повече от 2,000-кратно по-ниско от това в хипокампа. Тези нива са сходни с тези по-рано съобщени за хетерозиготни PDAPP тарнсгенни мишки на тази възраст (Johnson-Wood et al., по-горе).

За мозъчната кора, една третирана група има медианно Αβ ниво, измерено като Αβ1-42, което значимо се различава от това на контролната група (р<0.05), тези животни са получавали поликлоналното анти-Αβ антитяло, както е показано в Таблица 4. Медианното ниво на Αβ1-42 е редуцирано с 65%, в сравнение с контролата за тази третирана група. Медианните нива на Αβ1-42 също са значимо намалени с 55%, в сравнение с контролните в допълнителна третирана група, които животни са дозирани с mAb 10D5 (р=0.0433).

Таблица 4

	¹ ----- S	Αβ42	ELISA value	12621+/-5738	4454+/-3347	6943+/-3351	7489+/-6921	11005+/-6324
о	Total Αβ	ELISA value	16150+/-7456^e	5912+/-4492	9695+/-6929	9204+/-9293	12481+/-7082
Мозъчна кора	Медиани	$ αχ <	% Change	NA	-65	-55	-39
P value	NA	0.0071	0.0433	0.1255	8 o o
ELISA value	13802	4892	6214	co co	13578
Total Αβ	% Change 1	NA	Ю <	-56	-49	ό
1 P value⁰	Si	0.0055	0.1019	0.1255	0.2898
«£·«> Й £	17818	6160	7915	9144	15158
		Ch	o ·—<	oo	Ю	OO
Третирана Група		PBS	Polyclonal anti- Αβ42	mAb 10D5	SO SO <4	СЧ t—< u. T-M i

c. Mann Whitney анализ

d. ΝΑ: не приложим

e. Стндартно отклонение

В хипокампа, медианният процент намаление на общия Αβ, свързан с третиране с поликлонално анти-Αβ антитяло (50%, р=0.0055), не е толкова голям както този наблюдаван в мозъчната кора (65%) (Таблица 5). Обаче, абсолютният размер на намалението е почти 3-кратно по-голямо в хипокампа отколкото в мозъчната кора, едно чисто намаление от 31,683 ng/g тъкан в хипокампа, спрямо 11,658 ng/g тъкан в мозъчната кора. Когато е измерено като ниво на по-амилоидогенната форма на Αβ, Αβ1-42, в сравнение с тоталния Αβ, намалението постигнато с поликлонално антитяло е значимо (р=0.0025). Медианните нива в групи третирани с mAbs 10D5 и 266 са намалени с 33% и 21%, съответно.

Ю

93а

	3 cCl	ELISA value	52801+/-14701	24853+/-18262	36465+/-17146	32919+/-25372	50305+/-23927
Хипокамп	Means	ι Total Αβ	ELISA value	υ OO o cn cn rH ΐ тЧ «Λ cn 00 «Λ	30058+/-22454	44581+/-18632	36419+/-27304	57327+/-28927
Medians	Αβ42	% промяна		-50	cn m I	4—4 S’	СЧ τ·Μ 1
P стойност		0.0025	0.0543	0660*0	0.8099
ELISA стойност	54429	27127	36290	43034	47961
Total Αβ	% промяна		-50	40 S’	-23	os
P value® 1	1	0.0055	0.0675	0660*0	00 £ r~· o
ELISA value^b	63389	31706	46779	48689	51563
ss z		<3?	о V-4	00	M3	00
Treatment Group		PBS	Polyclonal anti-Ap42	un Q o 1	Ю Ю n	mAb 21F12

Общ Αβ е измерен също в церебелума (Таблица 6). Групите дозирани с поликлоналното анти-Αβ и 266 антитяло показват значителни понижения в нивата на общия Αβ (43% и 46%, р=0.0033 и р=0.0184, съответно) и групата третирана с 10D5 има близко значимо намаление (29%, р=0.0675).

Таблица 6

ЦЕРЕБЕЛУМ

Третирана Група	№	Медиани	Средни
			Общ Αβ		Общ Αβ
		ELISA	Р	%	ELISA стойност
		стойност**	стойност⁰	промяна
PBS	9	30.64	NA^d	ΝΑ	40.00+/-31.89®
Поликлонално
8ΗΤπ-Αβ42	10	17.61	0.0033	-43	18.15+/-4.36
mAb10D5	8	21.68	0.0675	-29	27.29+/-19.43
mAb 266	6	16.59	0.0184	-46	19.59+/-6.59
mAb21F12	8	29.80	>0.9999	-3	32.88+/-9.90

a. Брой животни в група на края на експеримента

b. ng/g тъкан

c. Mann Whitney анализ

d. ΝΑ: не приложим

e. Стандартно отклонение

АРР концентрация също е определена с ELISA в мозъчната кора и церебелума от антитяло-третирани и контролни, PBSтретирани мишки. Използвани са два различни АРР теста. Първият, обозначен като ΑΡΡ-α/FL, разпознава и двата - АРР-алфа (а, секретираната форма на АРР, която е разцепена в Αβ последователността) и пълноразмерни форми (FL) на АРР, докато вторият разпознава само АРР-a. За разлика от свързаното с третиране намаление на Αβ в една подгрупа от третираните групи, нивата на АРР в действителност са непроменени във всички третирани, в сравнение с контролните животни. Тези резултати показват, че имунизациите с Αβ антитела изчерпват Αβ без да се изчерпва АРР.

В обобщение, Αβ нивата са значимо понижени в мозъчната кора, хипокампа и церебелума у животни третирани с поликлонално антитяло, предизвикано срещу ΑΝ1792. В по-слаба степен моноклонални антитела срещу амино терминалната област на Αβ142, специално аминокиселини 1-16 и 13-28 също показват значими ефекти от третиране.

D. Хистохимични анализи:

Морфологията на Αβ-имунореактивни плаки в подгрупи от мозъци на мишки в PBS, поликлонална Αβ42, 21F12, 266 и 10D5 третирани групи, е сравнена качествено с такава от предишни изследвания, при които са проследени стандартни имунизационни процедури с Αβ42.

Най-голямото изменение на степента и вида амилоидни плаки се проявява у животни, имунизирани с поликлонално Αβ42 антитяло. Намалението на амилоидното натрупване, нарушената морфология на плаката и клетъчно-свързана Αβ имунореакгивност, силно наподобяват ефекти, предизвикани от стандартна процедура на имунизиране. Тези наблюдения подкрепят ELISA резултатите, при които се постигат значими намаления на общия Αβ и Αβ42 чрез въвеждане на поликлонално Αβ42 антитяло.

В сходни качествени оценки, амилоидни плаки в 10D5 групата също са редуцирани по брой и вид, с известни данни за клетъчно-свързана Αβ имунореакгивност. В сравнение с контролнотретирани животни, поликлоналната lg фракция срещу Αβ и едно от моноклоналните антитела (10D5) намаляват натрупванията на плаки с 93% и 81%, съответно (р<0.005). 21F12 изглежда има относително по-умерен ефект върху натрупвания на плаки. Микрографии на мозъка след третиране с ρΑ6ΑβΜ2 показват дифузни отлагания и отсъствие на много от по-големите компактни плаки в рАЬАр-|_42 третираната група в сравнение с контролно третираните животни.

Е. ЛимФопролиФеративни отговори

Αβ-зависима лимфопролиферация е измервана като са използвани клетки от далак, събрани осем дни след последната антитяло инфузия. Пресно събрани клетки, 10⁵ за ямка, са култивирани за 5 дни в присъствието на Αβ1-4Ο в концентрация 5μΜ за стимулация. Като положително контрола, допълнителни клетки са култивирани с Т-клетьчен митоген, РНА и като отрицателна контрола, клетките са култивирани без добавен пептид.

Спленоцити от възрастни PDAPP мишки, пасивно имунизирани с различни анти-Αβ антитела, са стимулирани in vitro с AN1792 и са измерени пролиферативни и цитокинови отговори. Целта на тези тестове е да се определи дали пасивната имунизация улеснява антигенното преставяне и така праймира Т-клетъчни отговори, специфични за AN1792. Не са наблюдавани AN1792специфични пролиферативни или цитокинови отговори у мишки пасивно имунизирани с анти-Αβ антитела.

Пример II. Терапевтична ефикасност на анти-Αβ антитела: mAb 2НЗ, mAb 10D5, mAb 266, mAb 21F12, mAb 3D6. mAb 16C11 и pAb Αβ1-42

Във второ проучване, третиране с 10D5 е повторено и са тестирани две допълнителни анти-Αβ антитела, моноклонални 3D6 (Αβ1-5) и 16С11 (Αβ33-42). Контролни групи са получавали PBS или без връзка изотип-съвпадащо антитяло (ТМ2а). Мишките са били по възрастни (на възраст 11.5-12 месеца, хеторозиготни) в сравнение с предишно проучване, но експерименталният модел е бил същият. Отново, след шест месеца третиране, 10D5 редуцира натрупване на плаки повече от 80% в сравнение с PBS или изотип-съвпадащи антитяло контроли (р=0.003). Едно от другите антитела срещу Αβ, 3D6 е еднакво ефективно, като предизвиква 86% намаление (р=0.003). За разлика, третото антитяло срещу пептида, 16С11, няма някакъв ефект върху натрупване на плаки. Сходни данни са получени с Αβ42 ELISA измервания.

Тези резултати показват, че антитяло отговор срещу Αβ пептид, в отсъствие на Т-клетьчен имунитет, е достатъчен да понижава амилоидно отлагане в PDAPP мишки, но не всички антиΑβ антитела са еднакво ефикасни. Антитела насочени срещу епитопи, съдържащи аминокиселини 1-5 или 3-7 на Αβ са особено ефикасни. Обобщавайки, може да бъде демонстрирано, че пасивно въвеждане на антитела срещу Αβ (т.е. пасивна имунизация) редуцира степента на отлагане на плаки у модел на мишки за болест на Alzheimer.

Пример III. Мониториране на антитяло свързване в ЦНС

Този пример демонстрира, че когато се подържат умерени серумни концентрации (25-70pg/ml), антителата получават достъп до ЦНС (централна нервна система) в нива достатъчни да декорират β-амилоидни плаки.

За определяне дали антитела срещу Αβ могат да действат директно в ЦНС, мозъци са взети от перфузирани с физиологичен разтвор мишки на края на Пример II, изследвани са за наличието на периферно-въведени антитела. Нефиксирани криостатни мозъчни срези са изложени на флуоресцентен реагент срещу миши имуноглобулин (козе анти-мишо lgG-СуЗ). Плаки в мозъци на 10D5 и 3D6 групи са силно декорирани с антитяло, докато няма оцветяване в 16С11 групата. За да се разкрие изцяло степента на отлагане на плаки, серийни срези от всеки мозък най-напред са имунореагирали с анти-Αβ антитяло и след това с вторичен реагент. 10D5 и 3D6 след периферно въвеждане, получават достъп до повечето плаки в ЦНС. Натрупването на плаки е силно редуцирано в тези третирани групи, в сравнение с 16С11 групата. Навлизането на антитяло в ЦНС не се дължи на абнормно изтичане през кръвномозъчната бариера, тъй като няма повишение в съдовия пермеабилитет, според измерване с Evans Blue в PDAPP мишки. В допълнение, концентрацията на антитяло в мозъчния паренхим на възрастни PDAPP мишки, е същата както у не-трансгенните мишки, представлявайки 0.1% от антитяло концентрацията в серума (независимо от изотипа).

Тези данни показват, че периферно въведени антитела могат да навлязат в ЦНС, където те могат директно да предизвикат амилоидно очистване. Възможно е 16С11 също да има достъп до плаките, но не може да се свърже.

Пример IV. Ex vivo скрининг тест за активност на антитяло срещу амилоидни отлагания

За изпитване ефекта на антитела върху очистване на плаки, ние установихме един ex vivo тест, при който първични микроглиялни клетки са култивирани с нефиксирани криостатни срези от PDAPP мишка или човешки AD мозъци. Микроглиялни клетки са получени от мозъчна кора на новородени DBA/2N мишки (1-3 дневни). Мозъчната кора механично е дисоциирана в HBSS(Hank’s Balanced Salt Solution, Sigma) c 50 pg/ml ДНК-аза I (Sigma). Дисоциираните клетки са филтрувани със ΙΟΟμΠΊ клетъчна цедка (Falcon) и са центрофугирани на 1000 об.мин. за 5 минути. Утайката е ресуспендирана в хранителна среда (DMEM с високо съдържание на глюкоза, 10% FBS, 25 ng/ml rmGM-CSF), и клетките са посяти при плътност 2 мозъка за Т-75 пластмасови съдчета за култивиране. След 7-9 дни, съдчетата са завъртани с орбитална клатачна машина при 200 об./мин. за 2 часа на 37°С. Клетъчната суспензия е центрофугирана на 1000 об.мин. и е ресуспендирана в средата за тестиране.

Криостатни срези 10-μΓΠ от PDAPP миши или човешки AD мозъци (post mortem < 3 часа), разтопени са поставени върху покрити с поли-лизин кръгли покривни стъкла и са поставени в ямки на 24-ямкови платки за тъканно култивиране. Покривните стъкла са измити два пъти със среда за тестиране, състояща се от H-SFM (Hybridoma-serum free medium - хибридома-безсерумна среда, Gibco BRL) с 1% FBS , глугамин, пеницилин/стрептомицин и 5ng/ml rmGMCSF (R&D). Добавени са контролни или анти-Αβ антитела при 2х концентрация (5pg/ml крайна) за един час. След това микроглиялните клетки са пресети при плътност 0.8 х 10⁶ клетки/ml среда за тестиране. Културите са подържани в инкубатор с влажност (37°С, 5% СО₂) за 24 часа или повече. На края на инкубацията, културите са фиксирани с 4% параформалдехид и са пермеабилизирани с 0.1% Тритон-Х-100. Срезите са оцветени с биотинилирано 3D6, последвано от стрептавидин/СуЗ канюгат (Jackson ImmunoResearch). Екзогенните микроглиялни клетки са визуализирани с ядрено багрило (DAPI). Културите са наблюдавани с инвертен флуоресцентен микроскоп (Nikon, ТЕ300) и са правени микрофотографии със SPOT дигитална камера, като е използван SPOT софтуер (Diagnostic instruments). За Western blot анализ, културите са екстрахирани в 8М урея, разредени са 1:1 в редуциращ трицин сампл буфер и са нанесени на 16% трицин гел (Novex). След пренос на immobilon, блотовете са излагани на 5 pg/ml от ρθ6Αβ42, последвани от HRP-конюгирано анти-мишо антитяло, и са проявени с ECL (Amersham).

100

Когато тестът е правен с PDAPP мозъчни срези в присъствието на 16С11 (едно от антителата срещу Αβ, което не е ефикасно in vivo), β-амилоидните плаки се запазват интактни и не е наблюдавана фагоцитоза. За разлика от това, когато съседни срези са култивмирани в присъствието на 10D5, амилоидните отлагания нашироко изчезват и микроглиялните клетки показват многобройни фагоцитни мехурчета, съдържащи Αβ. Идентични резултати са наблюдавани с AD мозъчни срези; 10D5 индуцират фагоцитоза на AD плаки, докато 16С11 е неефективно. В допълнение, тестът предоставя сравними резултати, когато се изпълнява с миши или човешки микроглиялни клетки и с миши, заешки или от бозайници антитела срещу Αβ.

Таблица 7 сравнява Αβ свързване спрямо фагоцитоза за няколко различни антитяло свързващи специфичности. Може да се наблюдава, че антитела свързващи се с епитопи в аминокиселини 1-7, свързват и очистват амилоидни отлагания, докато антитела свързващи се с епитопи в аминокиселини 4-10, се свързват без да очистват амилоидни отлагания. Антитела свързващи се с епитопи Скрайни до остатък 10, нито се свързват, нито очистват амилоидни отлагания.

Таблица 7: Анализ на епитоп специфичност

Антитяло

	Епитоп	изотип	оцветяване	Фагоцитоза
N-коаен
mab
3D6	1-5	lgG2b	+	+
10D5	3-7	lgG1	+	+
22С8	3-7	lgG2a	+	+
6Е10	5-10	lgG1	+	-
14А8	4-10	плъши lgG1	+	-

101 аа 13-28

18G11	10-18	плъши1дв1	-	-
266	16-24	lgG1	-	-
22D12	18-21	lgG2b	-	-

C-краен
2G3	-10	lgG1	-	-
16С11	-40/-42	lgG1	-	-
21F12	А2	lgG2a	-	-
Имунен серум
Заешки (CFA)	1-6		+	+
Миши (CFA)	3-7		+	+
Миши (QS-21)	3-7		+	+
Маймунски(О8-21) 1-5		+	+
Миши (МАР1-7)			+	+

Таблица 8 представя резултати, получени с няколко антитела срещу Αβ, сравнявайки тяхната способност да индуцират фагоцитоза в ex vivo тест и да редуцират in vivo натрупвания на плаки в проучвания с пасивен пренос. Въпреки че 16С11 и 21F12 се свързват с агрегиран синтетичен Αβ пептид с висок афинитет, тези антитела бяха неспособни да реагират с β-амилоидни плаки в нефиксирани мозъчни срези, не могат да предизвикат фагоцитоза в ex vivo теста и не бяха ефикасни in vivo. 10D5, 3D6 и поликпоналното антитяло срещу Αβ бяха активни във всичките три измервания. Тези резултати показват, че ефикасност in vivo се дължи на директно антитяло медиирано очистване на плаките в ЦНС и че ex vivo тестът е предсказващ за in vivo ефикасност.

102

Таблица 8: Ex vivo тестът е предсказващ за in vivo ефикасност

Антитяло	Изотип	Склонност към	Свързване с	Ex vivo	in vivo
		агрегиран	β-амилоидни	ефикасност	ефикасност
		Αβ(ρΜ)	плаки
Моноклонални
3D6	lgG2b	470	+	+	+
10D5	lgG1	43	+	+	+
16С11	lgG1	90	-	-	-
21F12	lgG2a	500	-	-	-
ТМ2а	lgG1	-	-	-	-
Поликлонални
1-42	смесен	600	+	+	+
	Същата	проба е използвана за	тестиране	очистваща

активност на едно антитяло срещу фрагмент на синуклеин, обозначен като NAC. Показано е, че синуклеин е амилоидна плакасвързан протеин. Антитяло срещу NAC е поставяно в контакт с проба от мозъчна тъкан, съдържаща амилоидни плаки и микроглиялни клетки, както преди. Като контрола е използван заешки серум. Последващо мониториране показва, подчертано намаление на броя и големината на плаките, показателно за очистваща активност на антитялото.

С Конфокална микроскопия е използвана за потвърждаване, че Αβ е интернализиран по време на ex vivo теста. В присъствието на контролни антитела, екзогенните микроглиялни клетки остават в конфокална равнина над тъканта, няма фагоцитни мехурчета, съдържащи Αβ и плаките остават интактни в среза. В присъствието на 10D5, приблизително всичкия материал на плаките се съдържа в мехурчета в екзогенните микроглиялни клетки. За определяне съдбата на интернализирания пептид, 10D5 третирани култури са екстрахирани с 8М урея на различни периоди от време и са изследвани с Western blot анализ. При период от един час, когато

103 фагоцитоза се е появила, реакция с едно поликлонално антитяло срещу Αβ разкрива силна 4kD ивица (съответстваща на Αβ пептида). Αβ имунореактивност намалява след 1 ден и отсъства на третия ден. Така, антитяло-медиирана фагоцитоза на Αβ води до неговата деградация.

За да се определи дали фагоцитоза в ex vivo тест е Fcмедиирана, изготвени са F(ab’)2 фрагменти на анти-Αβ антитяло 3D6. Въпреки че F(ab’)2 фрагментите запазват напълно тяхната способност да реагират с плаки, те са неспособни да предизвикват фагоцитоза с микроглиялни клетки. В допълнение, фагоцитоза с цяло антитяло, може да бъде блокирана с реагент срещу миши Fc рецептори (анти-CD 16/32). Тези данни показват, че in vivo очистване на Αβ се проявява чрез Fc-рецептор медиирана фагоцитоза.

Пример V: Преминавана на антитела през кръвно-мозъчната бариера

Този пример определя концентрацията на антитяло предоставено на мозъка след интравенозна инжекция в периферна тъкан на нормални или PDAPP мишки. След третиране, PDAPP или контролни нормални мишки са перфузирани с 0.9% NaCI. Сецирани са мозъчни области (хипокамп или мозъчна кора) и бързо са замразени. Мозък е хомогенизиран в 0.1% тритон+протеазни инхибитори. Имуноглобулин е откриван в екстракти с ELISA. F(ab)’2 козе анти-миши IgG е покриван върху RIA платка като захващащ реагент. Серумът или мозъчните екстракти са инкубирани за един час. Изотиповете са откривани с анти-миши lgG1-HRP или lgG2aHRP или lgG2b-HRP (Caltag). Антитела, независимо от изотипа, присъстват в ЦНС в концентрация, която е 1:1000 от тази открита в кръвта. Например, когато концентрацията на lgG1 е три пъти тази на lgG2a в кръвта, има също три пъти lgG2a в мозъка, и двата бидейки в наличност 0.1% от съответните техни нива в кръвта. Този

104 резултат е наблюдаван в трансгенни и не-трансгенни мишки, което показва, че PDAPP нямат уникално пропусклива кръвно-мозъчна бариера.

Пример IV. Кпониране и секвениране на миши 3D6 променливи области

Клониращ и секвениращ анализ на 3D6 VH. Тежковерижната променлива VH област на 3D6 е клонирана с RT-PCR, като е използвана мРНК получена от хибридомни клетки по два независими метода. В първия, са използвани консензус праймери (зачатъци) за VH регионален лидерен пептид, обхващащ иницииращия транслацията кодон като 5* праймера (ДНК #38183829), и един g2b (ДНК#3832) специфичен 3’ праймер на константни области. Последователностите от PCR амплифициран продукт, както от множествени, независимо-производни клонове, бяха в пълно съответствие една с друга. Като следваща проверка върху последователността на 3D6 VH областта, резултатът е потвърден чрез секвениране на VH фрагмент, получен с 5’ RACE TR-PCR методология и 3’g2b специфичен праймер (ДНК#3832). Отново, последователността е производна от PCR продукта, като множествени, независимо-изолирани клонове. Двете последователности са в пълно съответствие една с друга, (с изключение на V81 замяна в лидерната област от 5’ RACE продукт), което показва, че последователностите са произлезли от мРНК, кодираща VH областта на 3D6. Нуклеотидът (SEQ ID N0:3) и аминокиселинна последователност (SEQ ID N0:4) на VH областта от 3D6 са представени в Таблица 9А и във Фигура 2, съответно.

105

Таблица 9А: Миша 3D6 VH нуклеотидна последователност

ATGAACTTCGGGCTCAGCTTGATTTTCCTTGTCCTTGTTTTAAAAGGTGTCCAGTGTGA AGTGAAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTAGTGAAGCCTGGAGCGTCTCTGAAACTCT ; CCTGTGCAGCCTCTGGATTCACTTTCAGTAACTATGGCATGTCTTGGGTTCGCCAGAAT TCAGACAAGAGGCTGGAGTGGGTTGCATCCATTAGGAGTGGTGGTGGTAGAACCTACTA TTCAGACAATGTAAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGAGAATGCCAAGAACACCCTGT ACCTGCAAATGAGTAGTCTGAAGTCTGAGGACACGGCCTTGTATTATTGTGTCAGATAT GATCACTATAGTGGTAGCTCCGACTACTGGGGCCAGGGCACCACT (SEQ ID N0:3) *Лидерният пептид е подчертан.

Клониране и анализ на последователността на 3D6 VL. Лековерижната променлива VL област на 3D6 е клонирана по аналогичен начин както VH областта. В първото изпитване, е планирана поредица от консензус праймери за амплификация на миши VL области както следва: 5’ праймери (ДНК #3806-3816) са планирани да хибридизират с VL областта, обхващаща иницииращия транслацията кодон и един 3* праймер (ДНК#3817), който е специфичен за мишата Ск област след V-J свързващата област. Анализ на ДНК последователност на PCR фрагмента, както и независимо-производни клонове, изолирани като е използвана тази поредица от консензус лековерижни праймери, разкрива, че получената кДНК е производна от един не-функционален пререден сигнал, тъй като последователността е съдържала една мутация на преместване на рамката между V-J връзката.

Във второ изпитване, 5’RACE е използван за клониране на втора VL кодираща кДНК. Анализ на ДНК последователност на този продукт (консензус 11) показва, че той е кодирал една функционална мРНК. Така, може да се заключи, че последователността кодира коректна 3D6 лековерижна мРНК. Нуклеотидът (SEQ ID N0:1) и

106 аминокиселинна последователност (SEQ ID N0:2) на VL областта на 3D6 са представени в Таблица 9В и Фигура 1, съответно.

Таблица 9В: Миша 3D6 VL нуклеотидна последователност

ATGATGAGTCCTGCCCAGTTCCTGTTTCTGTTAGTGCTCTGGATTCGGGflAACCAACGG i TTATGTTGTGATGACCCAGACTCCACTCACTTTGTCGGTTACCATTGGACAACCAGCCT

CCATCTCTTGCAAGTCAAGTCAGAGCCTCTTAGATAGTGATGGAAAGACATATTTGAAT TGGTTGTTACAGAGGCCAGGCCAGTCTCCAAAGCGCCTAATCTATCTGGTGTCTAAACT GGACTCTGGAGTCCCTGACAGGTTCACTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTTACACTGA AAATCAGCAGAATAGAGGCTGAGGATTTGGGACTTTATTATTGCTGGCAAGGTACACAT TTTCCTCGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAA (SEQ ID NO: 1) *Лидерният пептид е подчертан

Праймери използвани за кпонирането на 3D6 VL кДНК са представени в Таблица 10.

Таблица 10

DNA	размер	Coding Strand?	DNA Sequence	Comments
3806	40	Yes	ACT. AST. CGA. CAT. GAA. GTT. GCC. TGT. TA G.GCT.GTT.GGT.GCT.G (SEQ ID N0:39)	миши kappa променлив i primer 1 4KV PRIMER 1, MRC set; Ir A+T = 50.00 [20]; % C+G = 50.00 [20] Davis, Botstein, Roth темпер.топене C. 72.90

107

3807	39	Yes	ACT. AGT. CGA. CAT. GGA. GWC. AGA. CAC. AC r.CCT.GYT.ATG.GGT (SEQ ID N0:40)	i миши kappa променлив primer 2 4KV PRIMER 2, MRC set % A+T = 46.15 [18]; % C+G = 48.72 [19] Davis,Botstein,Roth темпер.топене C. 72.05
3808	40	Yes	ACT. AGT. CGA. CAT. GAG. TGT. GCT. CAC. TC A.GGT.CCT.GGS.GTT.G (SEQ ID N0:41)	миши kappa променлив primer 3 MKV PRIMER 3, MRC set; It A+T = 45.00 [18] ; % C+G = 52.50 [21] Davis, Botstein, Roth темпер.топене C. 73.93
3809	43	Yes	ACT. AGT. CGA. CAT. GAG. GRC. CCC. TGC. TC A.GWT.TYT.TGG.MWT.CTT.G (SEQ ID N0:42)	миши kappa променлив primer 4 4KV PRIMER 4, MRC set; fc A+T = 41.86 [18]; % C+G « 46.51 [20] Davis,Botstein,Roth темпер.топене C. 72.34
3810	40	Yes	ACT. AGT. CGA. CAT. GGA. TTT. WCA. GGT. GC A.GAT.TWT.CAG.CTT.C (SEQ ID N0:43)	миши kappa променлив primer 5 MKV PRIMER 5, MRC set St A+T = 52.50 [21]; % C+G = 42.50 [17] Davis,Botstein,Roth темпер.топене C. 69.83
3811	37	Yes	ACT. AGT. CGA. CAT-GAG. GTK. CYY. TGY. TS A.GYT.YCT.GRG.G (SEQ ID N0:44)	миши kappa променлив primer 6 NKV PRIMER 6, MRC set; St A+T = 37.84 [14]; % C+G = 40.54 [15] Davis, Botstein, Roth темпер.топене C. 68.01
3812	41	Yes	ACT. AGT. CGA. CAT. GGG. CWT. CAA. GAT. GG A.GTC.ACA.KWY.YCW.GG (SEQ ID N0:45)	миши kappa променлив primer 7 MKV PRIMER 7, MRC set; St A+T 39.02 [16] ; % C+G = 46.34 [19] Davis, Botstein, Roth темпер.топене c. 71.70
3813	41	Yes	ACT .AST .CGA. CAT .GTG .GGG.AYC. TKT. TT Y.CMM.TTT.TTC.AAT.TG (SEQ ID N0:46)	миши kappa променлив primer 8 MKV PRIMER 8, MRC set; % A+T = 53.66 [22] ; % C+G = 34.15 [14] Davis,Botstein,Roth темпер.топене ^c* ^66,70

108

3814	35	Yes	ACT. AGT. CGA. CAT. GOT. RTC. CWC . AS C. TC A.GTT.CCT.TG (SEQ ID N0:47)	миши kappa променлив > primer 9 HKV PRIMER 9, MRC set . 5r A+T » 45.71 [16] ; % C+G = 45.71 [16] Davis,Botstein,Roth темпер.топене · C. 69.36
3815	37	Yes	ACT .AGT. CGA. CAT .GTA. TAT. ATG . TTT. GT T.GTC.TAT.TTC.T (SEQ ID NOϊ 48)	i миши kappa променлив primer 10 MKV PRIMER 10, MRC set; i A+T = 70.27 [26]; * C+G = 29.73 [11] Davis,Botstein,Roth темпер.топене C. 63.58
3816	38	Yes	ACT.AGT.CGA.CAT.GGA.AGC.CCC.AGC.TC A.GCT.TCT.CTT.CC (SEQ ID NOs49)	, миши kappa променлив , primer 11 MKV PRIMER 11, MRC set; % A+T = 44.74 [17]; % C+G = 55.26 [21] Davis.Botstein,Roth темпер.топене C. 74.40
3817	27	No	SGA. TCC. CGG. GTG. GAT. GGT. GGG . AAC3. AT 3 (SEQ ID N0:50)	миша kappa лека верига reverse primer, aa 116122; Ck constant region primer, MRC set+Smal site; % A+T = 47.06 [8]; % C+G = 52.94 [9] Davis, Botstein, Roth 1 темпер.топене C. 57.19
3818	37	Yes	ACT. AGT. CGA. CAT. GAA. ATG. CAG . CTG. GG T.CAT.STT.CTT.C (SEQ ID N0:51)	миши тежък променлив primer 1 MHV primer 1, MRC set;
3819	36	Yes	ACT. AST. CGA. CAT. GGG. ATG. GAG . CTR. TA r.CAT.SYT.CTT (SEQ ID N0:52)	миши тежък променлив primer 2 HHV primer 2, MRC set;
3820	37	Yes	ACT. AGT. CGA. CAT. GAA. GWT. GTG. GTT. AA A.CTG.GGT.TTT.T (SEQ ID N0:53)	миши тежък променлив primer 3 MHV primer 3, MRC set;
3821	35	Yes	ACT. AGT. CGA. CAT. GRA. CTT. TGG. GYT. CA G.CTT.GRT.TT (SEQ ID N0:54)	миши тежък променлив primer 4 MHV primer 4, MRC set;
3822	40	Yes	ACT. AGT. CGA. CAT. GGA. CTC. CAG. GOT. CA A.TTT.AGT.TTT.CCT.T (SEQ ID N0:55)	миши тежък променлив > primer 5 KHV primer 5, MRC set; ,-Л“

109

3823	37	Yes	ACT. AGT. CGA. CAT. GGC. TGT. CYT. RGS .GC T.RCT.CTT.CTG.C (SEQ ID N0:56)	миши тежък променлив primer 6 MHV primer 6, MRC set;
3824	36	Yes	ACT .AGT. CGA. CAT.GGR. ATG. GAG. CKG .GR Г.СТТ.ТМТ.СТТ (SEQ ID N0:57)	миши тежък променлив primer 7 MHV primer 7, MRC set;
3825	33	Yes	ACT. AGT. CGA. CAT. GAG. AGT. GCT. GA.T.TC T.TTT.GTG (SEQ ID N0:58)	миши тежък променлив primer 8 4HV primer 8, MRC set;
3826	40	Yes	ACT. AGT. CGA. CAT. GGM. TTG. GGT . GTG . GA M.CTT.GCT.ATT.CCT.G (SEQ ID (TO: 59)	миши тежък променлив primer 9 MHV primer 9, MRC set;
3827	37	Yes	ACT. AGT. CGA. CAT. GGG. CAG. ACT. TAC. AT T.CTC.ATT.CCT.G (SEQ ID N0:60)	миши тежък променлив primer 10 MHV primer 10, MRC set;
3828	38	Yes	ACT. AGT. CGA. CAT. GGA. TTT. TGG . GCT. GA T.TTT.TTT.TAT.TG (SEQ ID N0:61)	миши тежък променлив primer 11 MHV primer 11, MRC set;
3829	37	Yes	ACT. AGT. CGA. CAT. GAT. GGT. GTT .AAG.TC T.TCT.GTA.CCT.G (SEQ ID N0:62)	миши тежък променлив primer 12 MHV primer 12, MRC set;
3832	27	No	GGA.TCC. CGG. GAG. TGG. ATA. GAC. tGA.TG G (SEQ ID N0:63)	mouse IgG2b heavy chain reverse primer a.a position 119-124, MRC set;

От N-края до С-края, леки и тежки вериги съдържат домените FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 и FR4. Обозначението на аминокиселини към всеки домен е в съответствие с конвенцията за номериране на Kabat et al., по-горе.

110

Експресия на химерно 3D6 антитяло: Променливите тежко и лековерижни области са прередени да кодират снаждащи донорни последователности след съответните VDJ или VJ свръзки и клонирани в експресионен вектор pCMV-hy1 от бозайник за тежката верига и pCMV-hKl за леката верига. Тези вектори кодират човешка γ1 и Ск константни области като екзонни фрагменти след вмъкнатата касета на променливата област. След верификация на последователността, тежковерижните и лековерижни експресионни вектори са ко-трансфектирани в COS клетки. Два различни тежковерижни клона (Н2.2 & Н3.2) независимо са ко-тренсфекгирани с 3 различни химерни лековерижни клона (L3, L4, & L10) за потвърждаване репродуцируемостта на резултата. Проведена е трансфекция на химерно 21.6 антитяло като положителна контрола за векторите. Събирана е кондиционирана среда 48 часа след трансфекцията и е тестирана с western blot анализ за продукция на антитела или ELISA за Αβ свързване.

Множествените трансфекганти, всички експресират тежковерижни + лековерижни комбинации, които са разпознати с козе анти-човешки IgG (H+L) антитяло на western blot.

Директно свързване на 3D6 и химерни 3D6 (РК 1614) антитела срещу Αβ е тестирано с ELISA анализ. Намерено е, че 3D6 се свързва с Αβ с висок афинитет, сходен на този демонстриран от 3D6 (Фигура ЗА). Освен това, ELISA на базата на тест за конкурентно инхибиране разкрива, че химерното 3D6 и мишото 3D6 антитяло конкурират еднакво с биотинилирано-306 свързване с Αβ (Фигура ЗВ). Химерното антитяло проявява свързващи свойства, неразличими от 3D6 референтната проба.

ill

Таблица 11.

Концентрация (pg/ml)	3D6	РК1614	IgGl
0.037		119.3
0.11	118.6	118.9
0.33	99.7	71.25
1	98.63	84.53	134.4
Освен това,	3D6 и	РК1614 са	били ефективни при

очистване на Αβ плаки. Ex vivo тестът демонстрира, че когато нараства концентрацията на антитяло, количеството Αβ намалява по © сходен начин за двете - мишо и химерно 3D6 антитела. Така, може да се заключи, че последователностите кодират функционални 3D6 тежка верига и леки вериги, съответно.

Пример VII. 3D6 хуманизиране

Хомология/Молекулно моделиране. За идентифициране ключови структурни остатъци на рамката в мишото 3D6 антитяло, е създаден три-димензионален модел въз основа на най-близките миши антитела за тежките и леките вериги. За тази цел е подбрано едно антитяло, обозначено 1CR9 като матрица за моделиране 3D6 леката верига (PDB ID: 1CR9, Капуо et al., по-горе) и е подбрано © антитяло обозначено 1OPG като матрица за моделиране на тежката верига. (PDB ID: 1OPG Kodandapani et al., по-горе). (Виж също Таблица 1). Подравняване на аминокиселинни последователности на 3D6 с лека верига и тежка верига на тези антитела, разкрива, че с изключение на CDR3 на тежката верига, 1CR9 и 1OPG антителата споделят значителна хомология на последователността с 3D6. В допълнение, CDR бримките на подбраните антитела попадат в същите признати Chothia структурни класове както CDR бримките на 3D6, отново очаквайки CDR3 на тежката верига. Следователно,

112

1CR9 и 10PG начално са подбрани като антитела на решена структура за моделиране хомология на 3D6.

Пръв допуснат модел за хомология на 3D6 променлива област се основава на антителата, отбелязани по-горе, е конструиран като се използва the Look & SegMod Modules GeneMine 9v3.5) софтуерен пакет. Този софтуер е закупен под постоянен лиценз от Molecular Applications Group (Palo Alto, СА). Този софтуерен пакет, оторизиран от Drs. Michael Levitt и Chris Lee, улеснява процеса на молекулно моделиране чрез автоматизиране 0 на етапите, включени в структурното моделиране на първична последователност върху една матрица с известна структура, на базата на хомология на последователността. Работейки на Silicon Graphics IRIS workstation в UNIX среда, моделираната структура автоматично е усъвършенствана чрез серии от минимализиращи енергията етапи, за облекчаване на неблагоприятни атомни контакти и оптимизиране електростатични и van der Waals взаимодействия.

Следващ усъвършенства модел е изграден като е използвана моделиращата способност на Qanta®. Един въпрос на PDB база данните с CDR3 на тежката верига на 3D6, е © идентифицирал 1qkz като най-хомоложен и притежаващ идентификационен номер на остатъците както 3D6. Така, CDR3 на тежката верига на 3D6 е моделирана като е използвана кристална структура на 1qkz като матрица. α-Въглеродната основна верига на 3D6 модела е представена на Фиггура 4. VH доменът е представен като пунктирана линия и VL доменът е представен като плътна линия, CDR бримките са показани в панделковидна форма.

Подбор на човешки акцепторни антитяло последователности. Подходящи човешки акцепторни антитяло последователности са идентифицирани с компютерно сравнение на

113 аминокиселинните последователности на мишите променливи области, с последователностите на известни човешки антитела. Сравнението е направено отделно за 3D6 тежката и леката вериги. В частност, променливи домени от човешки антитела, чиито последователности на рамката проявяват висока степен идентичност на последователността с мишите VL и VH области на рамката, са идентифицирани с помощта на Kabat база данни като е използвана NCBI BLAST (публично достъпна чрез the National Institute of Health NCBI internet server) със съответните миши последователности на рамката.

Подбрани са две кандидат последователности като акцепторни последователности, въз основа на следните критерии: (1) хомология с последователността на обекта; (2) споделяне на признати CDR структури с донорната последователност; и (3) не съдържат никакви редки аминокиселинни остатъци в областите на рамката. Подбраната акцепторна последователност за VL е Kabat ID Number (KABID) 019230 (Genbank Accession No. S40342) и за VH e KABID 045919 (Genbank Accession No. AF115110). Първи версии на хуманизирано 3D6 антитяло използват тези подбрани акцепторни антитяло последователности.

Замяна на аминокиселинни остатъци. Както е отбелязано по-горе, хуманизираните антитела на изобретението включват променливи области на рамката, главно от човешки имуноглобулин (акцепторен имуноглобулин) и определящи комплементарността области, главно от миши имуноглобулин (донорен имуноглобулин) наречен 3D6. След като са идентифицирани определящите комплементарността области на 3D6 и подходящи човешки акцепторни имуноглобулини, следващият етап беше да се определи кои, ако има такива, остатъци от тези компоненти да се заместят, за да се оптимизират свойствата на полученото хуманизирано

114 антитяло. Критериите описани по-горе са използвани за подбор на остатъци за замяна.

Фигури 1 и 2 изобразяват подравняване на оригинални миши 3D6 VL и VH, съответно, със съответна версия 1 на хуманизираната последователност, съответната човешка акцепторна последователност на рамката и накрая човешката последователност на зародишева линия V област , показваща найголяма хомология с човешката акцепторна последователност на рамката. Засенчените остатъци показват признатите (плътно изпълнени), спомагателни (пунктирано подчертани), опаковащи (задебелено) и редки аминокиселини (плътно наклонени) и са указани на фигурата. Звездичките показват остатъци обратно мутирани с миши остатъци в човешка акцепторна последователност на рамката и CDR области са показани подчертани отгоре. Обобщение на промените включени във версия 1 на хуманизирани 3D6 VH и VL е представено в Таблица 12.

115

Таблица 12. Обобщение на промени в хуманизпрано 3D6.V1

Промени	VL (112остатъци)	VH (119остатъци)
Ни->Ми:рамка	4/112	3/119 \1 признат, 1 опаковащ)
CDR1	6/16	3/5
CDR2	4/7	7/14
CDR3	5/8	4/10
Hu->Mu	19/112(17%)	17/119(14%)
Ми->Ни:рамка	13/112	14/119
Обратни мутации	1.12V която е призната	4. S49A спомагат./под
Бележки	позиция	CDRs.
	2. Y36L който е опаковащ	5. A93V който е опаковащ
	остатък и също лежи	и признат зонален
	под CDRs	остатък
	3. L46R който е опаковащ	6. K94R който е признат
	остатък и лежи под	остатък
	CDRs
Акцептор бележки	7. KABID 019230/Genbank	11. KABID0459191/Genbank
	Acc#S40342	Acc#AF1151110
	8. Hu к LC подгрупа II	12. Hu НС подгрупа III
	9. CDRs от съща призната	13. CDRs от съща призната
	структурна група като	структурна група като
	донор	донор
	(m3D6)	(m3D6)
	L1 = клас 4	Н1= клас 1
	L2 = клас 1	Н2 = клас 3
	L3 = клас 1	14. Разпознава капсула-
	10. Неизвестна специфичност ларен полизахарид
		на Neisseria
		meningitidis
Акцепторна заро-
дишева линия	15. VH3-23	16. АЗ&А19

Таблици 13 и 14 представят Kabat номериращи ключове за различни леки и тежки вериги, съответно.

116

Таблица 13: Ключ за Kabat номериране за лека верига

	mouse			A19-
КАВ	3D6	HUM	КАВП)	Germ-
	# TYPE VL	3D6VL	019230	line Comment

	1	1 FR1	Y	Y	D	D Рядък миши, може да контактува
						CDR
	2	2	V	V	I	I Признат/CDR контакт
	3	3	V	V	V	V
©	4	4	M	M	M	Μ
5	5	. T	T	T	Τ
	6	6	Q	Q	Q	Q
	7	7	T	s	s	s
	8	8	P	P	P	P
	9	9	L	L	L	L
	10	10	T	s	S	s
	11	II	L	L	L	L
	12	12	S	P	P	P
	13	13	V	V	V	V
	14	14	T	T	T	T
	15	15	I	P	P	P
	16	16	G	G	G	G
	17	17	Q	E	E	E
	18	18	P	P	P	P
	19	19	A	A	A	A
©	20	20	S	S	S	S
	21	21	I	I	I	I
	22	22	S	s	s	s
	23	23	C	c	c	c

117

24	24 CDR1	K	K	R	R
25	25	s	s	S	S
26	26	s	s	S	s
27	27	Q	Q	Q	Q
27А	28	s	s	s	s
27В	29	L	L	L	L
27С	30	L	L	L	L
27D	31	D	D	H	H
27Е	32	S	S	S	S
28	33	D	D	N	N
29	34	G	G	G	G
30	35	K	K	Y	Y
31	36	T	T	N	N
32	37	Y	Y	Y	Y
33	38	L	L	L	L
34	39	N	N	D	D

35	40	FR2	W	w	w	W
36	41		L	L	Y	Y Пакетиращ остатък
37	42		L	L	L	L
38	43		Q	Q	Q	Q
39	44		R	K	K	K
40	45		P	P	P	P
41	46		G	G	G	G
42	⁴7		Q	Q	Q	Q
43	48		S	s	S	S
44	49		P	P	P	P
45	50		K	Q	Q	Q
46	51		R	R	L	L Пакетиращ остатък
47	52		L	L	L	L
48	53		I	I	I	I
49	54		Y	Y	Y	Y
50	55	CDR2	L	L	L	L
51	56		V	V	G	G
52	57		S	S	S	S
53	58		K	K	N	N
54	59		L	L	R	R
55	60		D	D	A	A
56	61		S	S	S	S

118

57	62	FR3	G	G	G	G
	58	63		V	V	V	V
	59	64		Р	Р	Р	Р
	60	65		D	D	D	D
	61	66		R	R	R	R
	62	67		F	F	F	F
	63	68		Т	S	S	S
	64	69		G	G	G	G
	65	70		S	S	S	S
	66	71		G	G	G	G
	67	72		S	S	S	S
	68	73		G	G	G	G
	69	74		Т	Т	Т	Т
	70	75		D	D	D	D
	71	76		F	F	F	F
	72	77		Т	Т	Т	Т
	73	78		L	L	L	L
	74	79		К	К	К	К
	75	80		I	I	I	I
	76	81		S	S	S	S
	77	82		R	R	R	R
	78	83		I	V	V	V
	79	84		Е	Е	Е	Е
	80	85		А	А	А	А
	81	86		Е	Е	Е	Е
	82	87		D	D	D	D
	83	88		L	V	V	V
	84	89		G	G	G	G
	85	90		L	V	V	V
86	91		Y	Y	Y	Y
	87	92		Y	Y	Y	Y
	88	93		С	С	С	С
	89	94	CDR3	W	W	М	м
	90	95		Q	Q	Q	Q
	91	96		G	G	А	А
	92	97		Т	Т	L	L
	93	98		Н	Н	Q	Q
	94	99		F	F	т	т
	95	100		Р	Р	Р	Р
	96	101		R	R	R
	97	102		Т	Т	Т

119

98	103 FR4	F	F	F
99	104	G	G	G
100	105	G	Q	Q
101	106	G	G	G
102	107	T	T	T
103	108	K	K	K
104	109	L	V	V
105	110	E	E	E
106	111	I	I	I
106А	112	K	K	K

120

Таблица 14. Ключ за Kabat номериране за тежка верига

Mouse
КАВ			3D6	ИТ1М	КАШП VH3-23
#	#	TYPE	VH	3D6VH 045919	Germ- _Заб_влвжка
						line
1	1	FR1	Е	Е	Е	Е
2	2		V	V	V	V
3	3		К	Q	Q	Q
4	4		L	L	L	L
5	5		V	L	L	L
6	6		Е	Е	Е	Е
7	7		S	S	S	S
8	8		G	G	G	G
9	9		G	G	G	G
10	10		G	G	G	G
11	11		L	L	L	L
12	12		V	V	V	V
13	13		К	Q	Q	Q
14	14		Р	Р	Р	Р
15	15		G	G	G	G
16	16		А	G	G	G
17	17		S	S	S	S
18	18		L	L	L	L
19	19		К	R -	R	R
20	20		L	L	L	L
21	21		S	S	S	S
22	22		С	С	с	С
23	23		А	А	А	А
24	24		А	А	А	А
25	25		S	S	S	S
26	26		G	G	G	G
27	27		F	F	F	F
28	28		Т	Т	Т	Т
29	29		F	F	F	F
30	30		S	S	S	S
31	31	CDR1	N	N	S	S
32	32		Y	Y	Y	Y
33	33		G	G	А	А
34	34.		М	М	V	М
35	35		S	S	S	S

121

36	36	FR2	W	W	W	w
37	37		V	V	V	V
38	38		R	R	R	R
39	39		Q	Q	Q	Q
40	40		N	A	A	А Рядък миши, замяна w/Hum
41	41		S	P	P	P
42	42		D	G	G	G
43	43		K	K	K	K
44	44		R	G	G	G Рядък миши, замяна w/Hum
45	45		L	L	L	L
46	46		E	E	E	E
47	47		W	W	W	W
48	48		V	V	V	V
49	49		A	A	S	S CDR контакт/прикриване
50	50	CDR2	S	S	A	A
51	51		I	I	I	I
52	52		R	R	S	S
52А	53		S	S	G	G
53	54		G	G	S	S
54	55		G	G	G	G
55	56		G	G	G	G
56	57		R	R	S	S
57	58		T	T	T	T
58	59		Y	Y	Y	Y
59	60		Y	Y	Y	Y
60	61		S	S	A	A
61	62		D	D	D	D
62	63		N	N	S	S
63	64		V	V	V	V
64	65		K	K	K	K
65	66		G	G	G	G

122

бб	67	FR3	R	R	R	R
67	68		F	F	F	F
68	69		T	T	T	T
69	70		I	I	I	I
70	71		S	S	S	S
71	72		R	R	R	R
72	73		E	D	D	D
73	74		N	N	N	N
74	75	*	A	A	A	S
75	76		K	K	K	K
76	77		N	N	N	N
77	78		T	S	S	T
78	79		L	L	L	L
79	80		Y	Y	Y	Y
80	81		L	L	L	L
81	82		Q	Q	Q	Q
82	83		M	M	M’	M
82А	84		s	N	N	N
82В	85		s	S	S	S
82С	86		L	L	L	L
83	87		K	R	R	R
84	88		s	A	A	A
85	89		E	E	E	E
86	90		D	D	D	D
87	91		T	T	T	T
88	92		A	A	A	A
89	93		L	L	L	V
90	94		Y	Y	Y	Y
91	95		Y	Y	Y	Y
92	96		C	C	C	C
93	97		V	V	A	А пакетиращ остатък, използване миил
94	98		R	R	K	К Признат, използване миши
95	99	CDR3	Y	Y	D
96	100		D	D	N
97	101		H	H	Y
98	102		Y	Y	D
99	103		S	s	F
100	104		G	G	W
100А	105		S	S	S
100В	106		S	s	G
100C	107		-	-	T
100D	108		-	-	F
101	109		D	D	D
102	110		Y	Y	Y

123

103	111 FR4	W	W
104	112	G	G
105	113	Q	Q
106	114	G	G
107	115	Т	Т
108	116	Т	L
109	117	V	V
110	118	т	Т
111	119	V	V
112	120	S	S
113	121	S	S
Хуманизираните	антитела

W

G

Q

G

T

L

V

T

V

S

S предпочитано проявяват специфичен свързващ афинитет за Αβ най-малко 10⁷, 10⁸, 10⁹ или Ю¹⁰ М’¹. Обикновено горната граница за свързващия афинитет на

хуманизирани антитела за Αβ е в рамките на един фактор три, четири или пет от този на 3D6 (т.е. ~10⁹ М¹). Често долната граница на свързващ афинитет също е в рамките на един фактор от три, четири или пет от този на 3D6.

Монтиране и експресия на хуманизирано 3D6 VH и VL, Версия 1

Накратко, за всяка V област, са синтезирани 4 големи едноверижни припокриващи се олигонуклеотиди. В допълнение, 4 къси PCR праймери са синтезирани за всяка V област за да улесни по-нататък монтирането на дадената V област. ДНК

последователностите на нуклеотидите използвани за тази цел са представени в Таблица 15.

Таблица 15: ДНК олигонуклеотиди

DNA#	Размер	Coding?	Последователност	Забележки
4060	136	Yes	tccgc aagct tgccg ccacc ATGGA CATGC GCGTG CCCGC CCAGC TGCTG GGCCT GCTGA TGCTG TGGGT GTCCG GCTCC TCCGG CTACG TGGTG ATGAC CCAGT CCCCC CTGTC CCTGC CCGTG ACCCC CGGCG A (SEQ ID N0:17)	hum3D6VL-A
4061	131	No	CTGGG GGGAC TGGCC GGGCT TCTGC AGCAG CCAGT TCAGG TAGGT CTTGC CGTCG GAGTC CAGCA GGGAC TGGGA GGACT TGCAG GAGAT GGAGG CGGGC TCGCC GGGGG TCACG GGCAG GGACA GGGGG G (SEQ ID N0:18)	hum3D6VL-B

124

4062	146	Yes	ACCTG AACTG GCTGC TGCAG AAGCC CGGCC AGTCC CCCCA GCGCC TGATC TACCT GGTGT CCAAG CTGGA CTCCG GCGTG CCCGA CCGCT TCTCC GGCTC CGGCT CCGGC ACCGA CTTCA CCCTG AAGAT CTCCC GCGTG GAGGC C (SEQ ID N0:19)	hum3D6VL-C
4063	142	No	aattc tagga tccac tcacg CTTGA TCTCC ACCTT GGTGC CCTGG CCGAA GGTGC GGGGG AAGTG GGTGC CCTGC CAGCA GTAGT ACACG CCCAC GTCCT CGGCC TCCAC GCGGG AGATC TTCAG GGTGA AGTCG GTGCC GG (SEQ ID N0:20)	hum 3D6 VL-D
4064	16	No	CTGGG GGGAC TGGCC G· (SEQ ID NO: 21)	hum 3D6 VL A+B back %A+T = 18.75(3]; % C+G = 81.2(13] Davis, Botstein,Roth Melting Temp Q 66.96
4065	22	Yes	ACCTG AACTG GCTGC TGCAG AA (SEQ ID N0:22)	hum 3D6 VL C+D forward % A+T = 45.45 [10]; % C+G = 54.55 [12] Davis,Botstein,Roth Melting Temp C. 64.54
4066	138	Yes	acaga aagct tgccg ccacc ATGGA GTTTG GGCTG AGCTG GCTTT. TTCTT GTGGC TATTT TAAAA GGTGT CCAGT GTGAG GTGCA GCTGC TGGAG TCCGG CGGCG GCCTG GTGCA GCCCG GCGGC TCCCT GCGCC TGT (SEQ ID N0:23)	hum3D6VH-A
4067	135	No	GCCGC CGGAG CGGAT GGAGG CCACC CACTC CAGGC CCTTG CCGGG GGCCT GGCGC ACCCA GGACA TGCCG TAGTT GGAGA AGGTG AAGCC GGAGG CGGCG CAGGA CAGGC GCAGG GAGCC GCCGG GCTGC ACCAG (SEQ ID N0:24)	hum3D6VH-B
4068	142	Yes	CTGGA GTGGG TGGCC TCCAT CCGCT CCGGC GGCGG CCGCA CCTAC TACTC CGACA ACGTG AAGGG CCGCT TCACC ATCTC CCGCG ACAAC GCCAA GAACT CCCTG TACCT GCAGA TGAAC TCCCT GCGCG CCGAG GACAC CG (SEQ ID N0:25)	hum3D6VH-C

125

4069	144	No	ctgca aggat ccact caccG GAGGA CACGG TCACC AGGGT GCCCT GGCCC CAGTA GTCGG AGGAG CCGGA GTAGT GGTCG TAGCG CACGC AGTAG TACAG GGCGG TGTCC TCGGC GCGCA GGGAG TTCAT CTGCA GGTAC AGGG (SEQ ID N0:26)	hum3D6VH-D
4070	16	No	GCCGC CGGAG CGGAT G (SEQ ID N0:27)	hum3D6VHA+B back % A+T = 18.75 [3]; % C+G = 8125(13] Davis,Bo tstein,Roth Melting Temp C. 66.96
4071	20	Yes	CTGGA GTGGG TGGCC TCCAT (SEQ ID N028)	hum3D6VHC+D forward % A+T = 35.00 [7]; % C+G = 65.00 [13] Davis,Botstein,Roth Melting Temp C 66.55
4072	19	Yes	tcc gca age ttg ccg cca c (SEQ ID N0:29)	Hum3D6VLA+B Forward % A+T = 31.58 [6]; % C+G = 68.42(13] Davis,Botstein,Roth Melting Temp C. 66.64
4073	29	No	aat tet agg ate cac tea cgC TTG ATC TC (SEQ ID N030)	Hum3D6VLC+D Back % A+T = 55.17(16]; % C+G = 44.83 [13] Davis,Botstein,Roth Melting Temp C. 66.04
4074	23	Yes	aca gaa age ttg ccg cca ccA TG (SEQ ID N0:31)	Hum3D6VHA+B Forward % A+T = 43.48 [10]; % C+G = 56.52 [13] Davis,Bots tern,Roth Melting Temp C. 66.33
4075	22	No	etg caa gga tec act cac eGG A (SEQ ID N0:32)	Hum3D6VHC+D Back % A+T = 40.91 [9]; % C+G = 59.09[13] Davis,Botstein,Roth Melting Temp C. 66.40

126

Хуманизираната лека верига е монтирана като е използвана PCR. ДНК секвениращ анализ на повече от две дузини клонове, разкрива пръснати точкови мутации и делеции в протежение на VL областта, с оглед очакваната последователност. Анализ на последователностите е показал, че клон 2.3 е отговорен да поправи 2 близко разположени единични нуклеотидни делеции в амино-терминалната област. Така, място насочена мутагенеза е проведена на клон pCRShum3D6v12.3, използвайки олигонуклеотиди за въвеждане двата делетирани нуклеотиди и поправка на точковите мутации е потвърдена с анализ на ДНК последователност, и VL инсертьт е клониран в лековерижния експресионен вектор pCMV-cK.

Монтиране на хуманизирана VH, използвайки методи основани на PCR, има за резултат клонове с големи делеции в 5’ половината на последователността. Последващи усилия да се оптимизират PCR условията имаха частичен ефект. Клоновете монтирани чрез оптимизирани PCR условия, все още имат 10-20 nt делеции в областта картирана до припокриването на А+В фрагментите. Затова е използвана сменяща се стратегия за VH монтиране, използвайки ДНК полимераза (Т4, Klenow и секвеназа) медиирано отчасти покриващо се удължаване, последвано от Т4 ДНК лигаза, за да свърже ковалентно отчасти покриващи се краища. Анализ на ДНК последователност на подгрупа от клоновете получени от VH монтиране, използвайки последния подход, разкрива пръснати точкови мутации и делеции между клоновете. Анализ на повече от две дузини клонове разкрива по същество същия характер, както е илюстриран за клоновете. Сходните резултати, наблюдавани след първото монтиране на VH и VL клонове, показва грешките на ДНК последователността, наблюдавани в резултат от грешки на автоматизиран синтетайзер,

127 по време на синтезата на дългите ДНКи, използвани за монтирането.

Хуманизиран VH клон 2.7 е подбран за място-насочена мугагенеза-медиирана поправка на три нуклеотидни делеции, който е наблюдавано, че се съдържат.

Пример XIII: Характеризиране на хуманизирано 3D6v2 антитяло

Втора версия на хуманизирано 3D6 е създадена, която притежава всяка от замените указани за версия 1, с изключение за D-»Y замяната при остатък 1. Замяна при този остатък е правена във версия 1, тъй като остатъкът е идентифициран като CDR взаимодействащ остатък. Обаче, замяна е делетирала един остатък, който е рядък за човешки имуноглобулини в тази позиция. Така, създадена е версия без замяната. Освен това, остатъци от незародишева линия в тежковерижните области на рамката, са били заменени с остатъци на зародишева линия, а имено, Н74 =S, Н77 = Т и Н89 = V. Kabat номериране за версия 2 леки и тежки вериги, е същото както това представено в Таблици 13 и 14, съответно, с изключение, че остатък 1 на версия 2 леката верига е asp (D), остатък 74 на тежката верига е ser (S), остатък 77 на тежката верига е thr (Т) и остатък 89 на тежката верига е val (V). Нуклеотидната последователност на хуманизирана 3D6 версия 1 лека и тежка вериги, са представени като SEQ ID NOs: 34 и 36, съответно. Нуклеотидната последователност на хуманизирано 3D6 версия 2 лека и тежка вериги са представени като SEQ ID NOs: 35 и 37, съответно.

Пример IX: Функционално тестиране на хуманизирани 3D6 антитела

Свързване на хуманизирано 3D6v1 с агрегиран Αβ. Функционално тестиране на хуманизирано 3D6v1 е проведено като е използвана кондиционирана среда от преходно трансфекгирани

128

COS клетки. Клетките са трансфектирани с изцяло химерно антитяло, смес от химерна тежка верига + хуманизирана лека верига или химерна лека верига + хуманизирана тежка верига и накрая, изцяло хуманизирано антитяло. Кондиционираната среда е тестирана за свързване с агрегиран Αβ1-42 с ELISA тест. Хуманизираното антитяло показва добра активност в рамките на експерименталната грешка и проявява свързващи свойства, неразличими от химерната 3D6 референтна проба. Резултатите са представени в Таблица 16.

Таблица 16

ng/ml	Chimeric	huVH/ ChVL	ChVH/ HuVL	HuVH/ HuVL
690			0.867
600				0.895
260	0.83
230			0.774
200				0.81
190		0.811
87	0.675 ·
77			0.594
67				0.689
63		0.648
29	0.45
25			0.381
22				0.496
21		0.438
9.6	0251
8.5			0.198
7.4				0278
7		0232
32	0.129
23		0.124

За сравняване свързващите афинитети на хуманизирани 3D6v1 и 3D6v2 антитела, е проведен ELISA анализ, използвайки агрегиран Αβ като антиген. Резултатите показват, че и двете - 3D6v1 (H1L1) и 3D6v2 (H2L2) имат приблизително идентични Αβ свързващи свойства (Фигура 5).

129

Заместващ NET (rNET) анализ на h3D6v2. rNET епитоп картиращ тест предоставя информация за приноса на индивидуалните остатъци в епитопа, за общата свързваща активност на антитялото. rNET анализ използва синтезирани системни единично заместени пептидни аналози. Свързване на антитяло, което се тестира е определено срещу природен пептид (природен антиген) и срещу 19 алтернативни “единично заместени” пептиди, всеки пептид е заместен в първа позиция с една от 19 неприродни аминокиселини за тази позиция. Правен е профил отразяващ ефекта на замяна в тази позиция с различни не-природни остатъци. Подобно са създадени профили в последователни позиции по дължината на антигенния пептид. Комбинираният профил, или картата на епитопа, (отразяващ замяна във всяка позиция с всички 19 не-природни остатъци), може да бъде сравнен с карта подобно създадена за второ антитяло. Съществено сходни или идентични карти показват, че антителата, които са сравнявани имат еднаква или сходна специфичност на епитопа.

Този анализ е направен за 3D6 и хуманизирано 3D6, версия

2. Антителата са тестирани за свързване срещу природния Αβ пептид DEAFRHDSGY (SEQ ID N0:33). Остатъци 1-8 системно са замествани с всеки от 19 не-природни остатъци за тази позиция. Карти са направени съответно за 3D6 и h3D6v2. Резултатите са представени в таблична форма в Таблица 17.

130

Таблица 17: Αβ: заместване на Net епитоп (rNET) картиране на wt3D6 и хуманизирано 3D6

Замяна	Wildtype 3D6 [OD]	Humanized 3D6 [OD]	Замяна	\| Wildtype 1 3D6 [OD]	Humanized 3D6 [OD]
Residue 1 = А	0.464	0.643	Residue 5 = A	0.275	0.435
С	0.450	0.628	C	0.359	0.635
D	0.577	0.692	D	0.080	0.163
Е	0.576	0.700	E	0.115	0.187
F	0.034	0.062	F	0.439	0.569
G	0.569	0.738	G	0.485	0.679
Н	0.054	0.117	H	0.577	0.680
I	0.048	0.118	I	0.510	0.671
к	0.033	0.057	K	0.573	0.693
L	0.073	0.148	L	0.517	0.691
М	0.039	0.072	M	0.418	0.611
N	0.587	0.757	N	0.476	0.655
Р	0.069	0.144	P	0.093	0.198
Q	0.441	0.689	Q	0.388	0.565
R	0.056	0.155	R	0.613	0.702
S	0.569	0.762	S	0.487	0.633
т	0.450	0.702	T	0.530	0.639
V	0.057	0.190	V	0.493	0.562
W	0.031	0.070	w	0.393	0.461
Y	0.341	0.498	Y	0.278	0.230
Residue 2 = А	0.548	0.698	Residue 6 = A	0.587	0.707
С	0.553	0.694	C	0.585	0.703
< D	0.119	0.222	D	0.584	0.701
Е	0.563	0.702	E	0.579	0.702
F	0.577	0.717	F	0.586	0.704
G	0.527	0.720	G	0.592	0.709
Н	0.534	0.741	H	0.596	0.688
I	0.522	0.722	I	0.602	0.708
к	0.548	0.722	K	0.585	0.691
L	0.482	0.705	L	0.584	0.688
М	0.535	0.705	M	0.583	0.687
N	0.525	0.735	N	0.580	0.686
Р	0.445	0.707	P	0.587	0.705
Q	0.567	0.756	Q	0.570	0.695
R	0.562	0.719	R	0.576	0.686

131

S	0.587	0.705	S	0.573	0.689
т	0.552	0.712	Т	0.573	0.700
V	0.550	0.702	V	0.588	0.715
W	0.553	0.701	W	0.576	0.696
Y	0.547	0.704	Y	0.595	0.708
Residue 3 = А	0.038	0.061	Residue 7 = А	0.580	0.688
С	0.222	0.410	С	0.559	0.676
D	0.019	0.027	D	0.573	0.681
Е	0.542	0.689	Е	0.565	0.677
F	0.034	0.060	F	0.546	0.668
G	0.016	0.019	G	0.562	0.679
Н	0.016	0.020	И	0.557	. 0.675
I	0.019	0.024	I	0.552	0.681
к	0.053	0.090	к	0.565	0.685
L	0.019	0.026	L	0.566	0.701
М	0.019	0.027	м	0.562	0.697
N	0.024	0.032	N	0.573	0.688
Р	0.017	0.020	Р	0.582	0.678
Q	0.153	0.406	Q	0.563	0.679
R	0.015	0.023	R	0.551	0.677
S	0.016	0.021	S	0.563	0.674
т	0.015	0.019	Т	0.560	0.685
V	0.016	0.021	V	0.563	0.687
W	0.149	0.304	W	0.547	0.685
Y	0.016	0.020	Y	0.560	0.682
Residue 4 = А	0.016	0.020	Residue 8 = А	0.573	0.687
С	0.020	0.023	С	0.583	0.700
D	0.017	0.020	D	0.586	0.697
Е	0.016	0.021	Е	0.601	0.701
F	0.557	0.703	F	0.586	0.687
G	0.016	0.020	G	0.569	0.681
Н	0.470	0.723	Н	0.559	0.683
I	0.119	0.360	I	0.568	0.686
к	0.015	0.018	к	0.557	0.698
L	0.559	0.716	L	0.570	0.686
М	0.549	0.725	М	0.571	0.693
N	0.085	0.089	N	0.573	0.700
Р	0.030	0.056	Р	0.574	0.694
Q	0.065	0.110	Q	0.590	0.703
R	0.016	0.019	R	0.589	0.699
S	0.026	0.031	S	0.599	0.719
т	0.016	0.021	т	0.586	0.689
V	0.213	0.494	V	0.578	0.688
W	0.291	0.568	W	0.567	0.687
Y	0.529	0.730	Y	0.574	0.680

Профилите са действително идентични за 3D6 и h3D6v2, когато се разглеждат заместванията във всяка позиция (т.е. стойностите флуюуират по идентичен начин, когато се сравняват

132 данните в колона 1 (3D6) спрямо колона 2 (h3D6v2). Тези данни демонстрират, че специфичността на h3D6v2 е запазена, тъй като h3D6v2 rNET епитоп картата е наистина идентична с m3D6, като се използва Αβ остатъци 1-4 и 5-8.

Имунохистохимия на PDAPP мозъчни срези демонстрира специфичност на h3D6v1 антитяло. Хуманизирано 3D6v1 антитяло разпознава Αβ в изготвени на криостат мозъчни срези от PDAPP мишки. Хуманизирани 3D6v1 и РК1614 се свързват с PDAPP плаки по същия доза отговор начин, измерен по количеството флуоресценция (определена количествено в пиксели) за предметно стъкло, спрямо количеството антитяло използвано да оцвети тъканта (Фигура 6). Използвани са идентични анти-човешки вторични антитела в този експеримент. Изготвянето на срези, оцветяване и процедурите за образи са описани по-рано. В идентични експерименти, анализът на образи на h3D6v2 оцветяване на PDAPP и AD мозъчни срези разкрива, че h3D6v2 разпознава Αβ плаки по сходен начин за 3D6v1 (например, силно декорирани плаки).

Анализ на конкурентно свързване на h3D6. Способността на h3D6 антитела v1 и v2 да конкурира с мишо 3D6 е измерена с ELISA като е използвано биотинилирано 3D6 антитяло. Анализ на конкурентно свързване разкрива, че h3D6v1, h3D6v2 и химерно РК1614 могат всичките да конкурират с m3D6 за свързване на Αβ (Фигура 7). h3D6v1 и h3D6v2 са идентични в тяхната способност да конкурират с 3D6 за Αβ. 10D5 антитялото е използвано като отрицателна контрола, тъй като има различен свързващ епитоп в сравнение с 3D6. BIAcore анализ също разкрива висок афинитет на h3D6v1 и h3D6v2 за Αβ (Таблица 18).

133

Таблица 18: Измервания на афинитета на Αβ антитела като се използва BIAcore технология

Антитяло	ka1 (1/Ms)	kd1 Vl/s)	Kd (nm)
Mu 3D6	4.06Е + 05	3.57E-04	0.88
Химерно 3D6	4.58Е+05	3.86-04	0.84
Hu 3D6v1	1.85Е+05	3.82E-04	2.06
Ни 3D6v2	1.70Е+05	3.78E-04	2.24

В сравнение с 3D6, което има Kd 0.88 пМ, двете h3D6v1 и h3D6v2 имат около 2 до 3 пъти по-малък свързващ афинитет, измерен при 2.06 пМ и 2.24пМ за h3D6v1 и h3D6v2, съответно. ELISA тестът за конкурентно свързване разкрива приблизително

6-кратно по-малък свързващ афинитет за h3D6v1 и h3D6v2. Обикновено хуманизирани антитела губят около 3-4 пъти от свързващия афинитет в сравнение с техните миши двойници. Следователно, една загуба от около 3 пъти (средно от ELISA и BIAcore резултати) за h3D6v1 и h3D6v2 е в рамките на приетия диапазон.

Ex vivo тест като се използва h3D6v2 антитяло. Способността на h3D6v2 да стимулира микроглиялни клетки е тестирана с ex vivo фагоцитоза тест (Фигура 8). h3D6v2 е било толкова ефективно колкото химерното 3D6 при индуциране фагоцитоза на Αβ агрегати от PDAPP миша мозъчна тъкан. Използван е IgG като отрицателна контрола в този експеримент, тъй като той е неспособен да свързва Αβ и следователно не може да индуцира фагоцитоза.

In vivo мозъчна локализация на h3D6.¹²⁵1 белязани h3D6v2, m3D6 и антитяло DAE13, са всяко IV-инжектирано у 14 отделни PDAPP мишки в отделни експерименти. Мишките са убити след ден 7 и са перфузирани за последващ анализ. Техните мозъчни области

134 са сецирани и е измерена ¹²⁵1 активност в специфични мозъчни области. Радиоактивното белязане в мозъка е сравнено с активността в серумни проби. Резултатите са представени в Таблици 19 и 20, съответно за серум и мозъчни области.

Таблица 19

m3D6	DAE13	HU3D6
30389.1	17463.9	40963.8
12171	13200.6	24202.2
34182	36284.7	12472.4
18678.9	421.3	33851.8
27241	19702	27187.3
26398.8	24855.8	29016.9
27924.8	29287.4	33830.7
12008.4	12733.1	26734.9
29487.8	27722.5	30144.5
25498.6	30460.7	35126.9
9652	23320.1	28414.8
24599.3	7119.1	16956.1
29240	28093.5	18190.7
11922.7	24659.7	25671.4
17443.1	26748.9

Таблица 20

m3D6	DAE13	Hu3D6(H2L2)
cere	cort	hipp	cere	cort	hipp	cere	cort	hipp
1991.9	1201.1	4024	1277.5	2522.9	5711.9	2424.6	3759.4	11622
238.9	746.1	2523	502.5	2123.5	6965.8	1509.8	2274.9	70182
645.9	603	1241.1	2325	3528.2	7801.6	500	2265.9	5316.3
1000	25082	46442	232.7	849.8	1891.9	2736.2	5703.7	10395.5
1266.9	3737.9	7975.8	891.6	2621	82452	11922	3188	10170
1422	2398.7	7731.1	1102.6	2087.5	7292.3	2269.4	3481.4	9621.6
1700.4	2154.4	7124.1	1650.6	3488.4	10284.8	1526.7	3028	8331.3
542.5	812.4	2456.8	712.9	2318.5	6643.3	1538.1	4194.1	11244.8
1309	3010.5	8693.5	1172.9	1953.6	7363	1245.7	1699.4	68312
13722	997.5	2425.4	1067.9	36972	12280.7	2708.8	2789	7887.4
778.6	1291.9	5654.4	19522	2120.7	6412.7	2251.3	3897.5	11121.5
1199.3	1683.4	4887.3	10052	1852.5	5121.4	1529.6	17722	7986.9
1021.8	3234.5	8036.2	961.5	3382.9	8473.1	644.1	1663.4	5056.5
742.1 1273.7	1056.7 1320.8	34052 4262.6	852.3 997.5	19432 3065.7	6717.4 10213.1	1516.4	1620.6	9888

135

Данните показват, че h3D6v2 е локализирано в мозъка и е особено концентрирано в хипокампалната област, където е известно, че Αβ агрегира. Импулсите в мозъка за m3D6 и DAE13 са сравними с h3D6v2. Всичките три антитела са способни да преминават кръвно-мозъчната бариера, както е демонстрирано чрез свързване с Αβ плака in vivo.

Пример X. Клониране и секвениране на миши 10D5 променливи области

Клониране и анализ на последователността на 10D5 VH. VH и VL области на 10D5 от хибридомни клетки са клонирани с RTPCR като са използвани 5’ RACE процедури. Нуклеотидната последователност (SEQ ID N0:13) и изведената аминокиселиинна последователност (SEQ ID N0:14), производна от два независими кДНК клона, кодираща предполагаемия 10D5 VL домен, са представени в Таблица 21 и Фигура 9. Нуклеотидната последователност (SEQ ID N0;15) и изведената аминокиселинна последователност (SEQ ID N0:16), производна от два независими КДНК клона, кодиращи предполагаем 10D5 VH домен, са представени в Таблица 22 и Фигура 10. 10D5 VL и VH последователностите отговарят на критериите за функционални V области дотолкова, доколкото те съдържат съседна ORF от инициатора метионин в С-областта и споделя консервирани остатъци, характерни за гените на имуноглобулин V областта.

136

Таблица 21: Миша 10D5 VL ДНК последователност

ATClAAGTTGCnTGTTAGGCTGTTGGTACTGATGTTCTGGATTCCTGCTTCCAGCAGTGA TGTTTTGATGACCCAAACTCCACTCTCCCTGCCTGTCAGTCTTGGAGATCAAGCCTCCA TCTCTTGCAGATCTAGTCAGAACATTATACATAGTAATGGAAACACCTATTTAGAATGG TACCTGCAGAAACCAGGCCAGTCTCCAAAGCTCCTGATCTACAAAGTTTCCAACCGATT TTCTGGGGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTCAAGA TCAAGAAAGTGGAGGCTGAGGATCTGGGAATTTATTACTGCTTTCAAGGTTCACATGTT CCGCTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGGAA (SEQ ID N0:13) * Лидерният пептид е подчертан

Таблица 22: Миша 10D5 VH ДНК последователност.

ATGGACAGGCTTACTTCCTCATTCCTGCTGCTGATTGTCCCTGCATATGTCCTGTCCCA _;GGCTACTCTGAAAGAGTCTGGCCCTGGAATATTGCAGTCCTCCCAGACCCTCAGTCTGA CTTGTTCTTTCTCTGGGTTTTCACTGAGCACTTCTGGTATGGGAGTGAGCTGGATTCGT CAGCCTTCAGGAAAGGGTCTGGAGTGGCTGGCACACATTTACTGGGATGATGACAAGCG CTATAACCCATCCCTGAAGAGCCGGCTCACAATCTCCAAGGATACCTCCAGAAAGCAGG TATTCCTCAAGATCACCAGTGTGGACCCTGCAGATACTGCCACATACTACTGTGTTCGA AGGCCCATTACTCCGGTACTAGTCGATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGT CACCGTCTCCTCA (SEQ ID N0:15) *Пидерният пептид е подчертан.

Пример XI. Профилактика и лечение на човешки индивиди

Проведено е изпитване на единична-доза фаза I за определяне безопасност при хора. Терапевтичен агент е въвеждан в нарастващи дозировки на различни пациенти, започвайки от около 0.01 от нивото на предполагаема ефикасност и нараствайки с един фактор от три докато се достигне ниво от около 10 пъти ефективната миша дозировка.

137

Фаза II на изпитването е проведена за определяне на терапевтична ефикасност. Пациенти с ранна до в средна възраст болест на Alzheimer са подбрани и определени като са използвани критериите на Асоциацията за болест на Alzheimer и сродни нарушения (Alzheimer’s disease and Related Disorders Association (ADRDA)) за възможна AD. Подходящи пациенти са оценени в 12-26 степен на Mini-Mental State Exam (MMSE) (Мини ментален тест за състояние). Други критерии за подбор са пациентите да е възможно да преживеят продължителността на изпитването и да няма усложнения, като приложение на придружаваща лекарствена терапия, която може да повлияе. Изходните определения на функцията на пациента са правени като са използвани класически психометрични измервания, като MMSE и ADAS, което е подробна скала за оценка на пациенти със статус и функция при болест на Alzheimer. Тези психометрични скали дават мярка за прогресирането на състоянието при Alzheimer. Подходящи скали за качество на живот могат също да бъдат използвани за контрол на третирането. Прогресиране на заболяването може също да бъде мониторирано с MRI. Могат също да бъдат мониторирани кръвните профили на пациентите, включително тестове за имуноген-специфични антитела и Т-кпетьчни отговори.

След изходните измервания, пациентите започват да получават третиране. Те са случайно разпределени и третирани с терапевтичен агент или плацебо по сляп начин. Пациентите са контролирани най-малко на всеки шест месеца. Ефикасността е определяна по значимо намаление прогресирането на третираната група в сравнение с плацебо групата.

Втора фаза II на изпитването е проведена за оценка превръщането на пациенти от не-Alzheimer заболяване с ранна загуба на памет, понякога определено като възрастово-свързано нарушение на паметта (AAMI) или леко когнитивно нарушение (MCI),

138 във вероятна болест на Alzheimer, както е определена с ADRDA критериите. Пациенти с висок риск за превръщане в болест на Alzheimer, са подбрани от не-клинична популация, чрез скрининг на референтни популации за ранни признаци за загуба на паметта или други затруднения свързани с npe-Alzheimer симптоматология, фамилна анамнеза за болест на Alzheimer, генетични рискови фактори, възраст, секс и други особености, намерени, че предсказват висок риск за болест на Alzheimer. Събрани са изходни резултати на подходящи метрични системи, включително MMSE и ADAS, заедно с други метрични системи, планирани да оценят една по-нормална популация. Тези популации от пациенти са разделени на подходящи групи с плацебо сравнение, срещу дозиращи алтернативи с агента. Тези популации от пациенти са проследявани на интервали от около шест месеца и крайната точка за всеки пациент е дали или не, той или тя се превръщат във възможна болест на Alzheimer, както е дефинирано с ADRDA критерии на края на наблюдението.

Общи материали и методи

А. Получаване на поликлонални и моноклонални Αβ антитела Анти-Αβ поликлоналното антитяло е получено от кръв, събрана от две групи животни. Първата група се състои от 100 женски Swiss Webster мишки, на възраст 6 до 8 седмици. Те са имунизирани на дни 0, 15 и 29 със ЮОцд от AN1792 комбиниран с CFA/IFA. Четвърта инжекция е приложена на ден 36 с % от дозата на AN1792. Животните са убити с обезкървяване на ден 42, получен е серум и серумите са обединени за получаване общо на 64 ml. Втората група се състои от 24 женски мишки изогенни с PDAPP мишки, но не-трансгенни за човешкия АРР ген, на възраст 6 до 9 седмици. Те са имунизирани на дни 0, 14, 28 и 56 със 100 цд от AN1792 комбиниран с CFA/IFA. Тези животни също са убити с

139 обезкървяване на ден 63, получен е серум и е обединен за общо 14 ml. Двете серии от серуми са обединени. Антитяло фракцията е пречистена като са използвани две последователни серии от утаяване с 50% наситен амониев сулфат. Крайният преципитат е диализиран срещу PBS и е тестиран за ендотоксин. Нивото на ендотоксин е било по-малко от 1EU/mg.

Получени са анти-Αβ моноклонапни антитела от асцитна течност. Течността най-напред е делипидирана чрез добавяне на концентриран разтвор на натриев декстран сулфат към леденостудена асцитна течност, при разбъркване на лед за получаване на крайна концентрация от 0.238%. След това е добавен концентриран СаС1₂ с разбъркване, за постигане крайна концентрация от 64 тМ. Този разтвор е центрофугиран на 10,000 х g и утайката е отстранена. Надстоящата течност е разбърквана на лед с равен обем наситен разтвор на амониев сулфат добавян на капки. Разтворът е центрофугиран отново на 10,000 х g и надстоящата течност е отстранена. Утайката е ресуспендирана и диализирана срещу 20 тМ Трис-HCI, 0.4 М NaCI, pH 7.5. Тази фракция е нанесена на Pharmacia FPLC Sepharose Q column и е елюирана с обратен градиент от 0.4 М до 0.275 М NaCI в 20 тМ Трис-HCI, pH С7.5.

Антитяло максимумът е идентифициран по абсорбция на 280 nm и са събрани подходящите фракции. Пречистеният антитяло препарат е характеризира чрез измерване белтъчната концентрация, като е използван ВСА метод и чистотата, като е използвана SDS-PAGE. Обединеното количество също е тестирано за ендотоксин. Нивото на ендотоксин е било по-малко от 1EU/mg. титри, титри по-малки от 100, условно са обозначени като стойност на титъра 25.

140

В. Измерване на антитяло титри

Правено е кръвопускане на мишки, чрез малка резка на опашната вена и събиране около 200 μΙ кръв в микроцентрофужна епруветка. Правено е кръвопускане на морски свинчета, след предварително обръсване на гърба в областта на задните крака, след това е използвана 18 размер игла за пробиване на метатарзалната вена и събиране на кръвта в микроцентрофужни епруветки. Кръвта е оставена да се съсири за един час на стайна температура (RT), разбъркана е на вортекс, след това е центрофугирана на 14,000 х g за 10 минути, за отделяне съсирека от серума. След това серумът е прехвърлен в чиста микроцентрофужна епруветка и е съхраняван на 4°С докато бъде титриран.

Антитяло титрите са измерени с ELISA. 95-ямкови микротитрационни платки (Copstar EIA платки) са покрити със 100 μΙ разтвор, съдържащ 10 pg/ml от Αβ42 или от SAPP, или други антигени, както е отбелязано във всеки от индивидуалните доклади в Well Coating Buffer (0.1 М натриев фосфат, pH 8.5, 0.1% натриев азид) и са държани за една нощ на RT. Ямките са аспирирани и са добавени серуми в ямките започвайки при 1/100 разреждане в Specimen разредител (0.14 М натриев фосфат, pH 7.4, 0.15 М NaCI, 0.6% говежди серум албумин, 0.05% тимеросал). Направени са седем серийни разреждания на пробите директно в платките в трикратни етапи, за постигане крайно разреждане от 1/218,700. Разрежданията са инкубирани в покритите ямки на платките за един час на RT. След това платките са измити четири пъти с PBS, сдържащ 0.05% Jween 20. Второто антитяло, едно козе анти-мишо lg конюгирано с пероксидаза от хрян (получена от Boehringer Mannhaim), е добавено към ямките като 100 μΙ от 1/3000 разреждане в Specimen разредител и е инкубирано за един час на RT. Платките отново са измити четири пъти с PBS, Tween 20. За развитие на

141 хромогена, 100μΙ от Slow ТМВ (3,3’,5,5-тетраметил бензидин получен от Pierce Chemicals) е добавен към всяка ямка и е инкубиран за 15 минути на RT. Реакцията е прекъсната чрез добавка на 25 μΙ 2М H₂SO₄. След това интензитета на оцветяването е отчетен на Molecular Devices Vmax на (450 nm- 650 nm).

Титрите са дефинирани като реципрочната стойност на разреждането на серума, давайки % от максимума на OD. Максимум OD е общо взет от едно начално разреждане 1/100, с изключение на случаите с много високи титри, в какъвто случай е необходимо по-високо начално разреждане, за определяне максималната OD. Ако 50% пункт попада между две разреждания, правена е линейна екстраполация за изчисляване на крайния титър. За изчисляване на геометричните средни антитяло титри, титри по-малки от 100, условно са обозначени като титър стойност 25.

С. Обработка на мозъчна тъкан

След евтаназия, мозъците са извадени и една хемисфера е обработена за имунохистохимичен анализ, докато три мозъчни области (хипокамп, мозъчна кора и малък мозък) са сецирани от другата хемисфера и са използвани за измерване концентрацията на различни Αβ белтъци и АРР форми, като са използвани специфични ELISAs (Johnson-Wood et al., по-горе).

Тъканите определени за ELISAs са хомогенизирани в 10 обема ледено-студен гуанидинов буфер (0.5 М гуанидин-HCI, 50 тМ Трис-HCI, pH 8.0). Хомогенатите са смесени при леко разклащане като е използван Adams Nutator (Fisher) за три до четири часа на RT, след това са съхранявани на -20°С, преди количественото определяне на Αβ и АРР. Предварителни експерименти са показали, че пробите за анализ са стабилни при тези условия на съхранение и че синтетичният Αβ протеин (Bachem) може количествено да бъде възстановен, когато се прибави в

142 хомогенатите на контролната мозъчна тъкан от миши котила (Johnson-Wood et al., по-горе).

D. Измерване на Αβ нива

Мозъчните хомогенати са разредени 1:10 в ледено студен казеинов разредител (0.25% казеин, PBS, 0.05% натриев азид, 20 pg/ml апротинин, 5mM EDTA pH 8.0, 10 pg/mi леупептин) и след това са центрофугирани на 16,000 х g за 20 минути на 4°С. Синтетичните Αβ протеинови стандарти (1-42 аминокиселини) и АРР стандарти са изготвени да включват 0.5 М гуанидин и 0.1% говежди серум албумин (BSA) в крайния състав. “Тоталната” Αβ сандвичова ELISA използва моноклонално антитяло 266, специфично за аминокиселини 13-28 на Αβ (Seubert et al., по-горе), като захващащо антитяло и биотинилирано моноклонално антитяло 3D6, специфично за аминокиселини 1-5 на Αβ (Johnson-Wood et al., по-горе), като репортерно антитяло. 3D6 монокпоналното антитяло не разпознава секретиран АРР или пълноразмерен АРР, но открива само Αβ видове с амино-крайна аспаргинова киселина. Този тест има пониска граница на чувствителност от ~50 ng/ml (11 пМ) и не показва кръстосана реактивност спрямо ендогенен миши Αβ протеин в концентрации до 1 ng/ml (Johnson-Wood et al., по-горе).

Αβ1-42 специфчната сандвичова ELISA използва mAb 21F12, специфично за аминокиселини 33-42 на Αβ (Johnson-Webb et al., по-горе), като захващащото антитяло. Биотинилирано mAp 3D6 също е репортентото антитяло в тази проба, която има по-ниска граница на чувствителност от около 125 pg/ml (28 μΜ, Johnson-Wood et al., по-горе). За Αβ ELISAs, 100 μΙ от mAb 266 (при 10pg/ml) или mAb 21F12 при (5 pg/ml) е покрито в ямките на 96-ямкови имунотест платки (Costar), с инкубация за една нощ на RT. Разтворът е отстранен с аспириране и ямките са блокирани чрез добавка на 200 μΙ 0.25% човешки серум албумин в PBS буфер за най-малко

143 един час на RT. Блокиращият разтвор е отстранен и платките са съхранявани изсушени на 4°С докато бъдат употребявани. Платките са рехидратирани с буфер за измиване [Трис-буфериран физиологичен разтвор (0.15 М NaCI, 0.01 М Трис-HCI, pH 7.5), плюс 0.05% Tween 20] преди употреба. Пробите и стандартите са добавени в тройни порции от 100 μΙ на ямка и след това са инкубирани за една нощ на 4°С. Платките са измити най-малко три пъти с буфер за измиване между всеки етап на теста. Биотинилирното ΓηΑβ 3D6, разредено до 0.5 pg/ml в казеинов буфер за тестиране (0.25% казеин, PBS, 0.05% Tween 20, pH 7.4), е добавено и инкубирано в ямките за 1 час на RT. Авидин-хрян пероксидаза конюгат (Avidin-HRP получен от Vector, Burlingame, СА), разреден 1:4000 в казеинов буфер за тестиране, е добавен към ямките за 1 час на RT. Колориметричният субстрат, Slow ТМВWLISA (Pierce), е добавен и оставен да реагира за 15 минути на RT, след което ензимната реакция е прекъсвана чрез добавка на 25 μΙ 2Ν H2SO4. Реакционният продукт е определен количествено с Molecular Devices Vmax, като е измервана разликата в абсорбцията на 450 nm и 650 nm.

Е. Измерване на АРР нива

Използвани са два различни АРР теста. Първият, обозначен като ΑΡΡ-α/FL, разпознава АРР-алфа (а) и пълноразмерни (FL) форми на АРР. Вторият тест е специфичен за APP-a. APP-a/FL тестът разпознава секретиран АРР, включително първите 12 аминокиселини на Αβ. Репортерното антитяло (2НЗ) не е специфично за a-закачващото-място, появяващо се между аминокиселини 612-613 на АРР⁶⁹⁵ (Esch et al., Science 248:1122-1124 (1990)); този тест разпознава също пълноразмерен АРР (APP-FL). Предварителни експерименти, използвайки имобилизирани АРР антитела спрямо цитоплазмената опашка на АРР-FL за изчерпване

144 на мозъчни хомогенати от АРР-FL, насочват, че приблизително 3040% от ΑΡΡ-α/FL АРР е FL (данните не са представени). Захващащото антитяло за APP-a/FL и АРР-a тестовете е mAb 8Е5, предизвикано срещу аминокиселини 444 до 592 на АРР⁶⁹⁵ форма (Games et al., по-горе). Репортерното mAb за ΑΡΡ-α/FL теста е mAb 2НЗ, специфично за аминокиселини 597-608 на АРР⁶⁹⁵ (JohnsonWood et al., по-горе) и репортерното антитяло за АРР-а теста е биотинилирано производно на mAb 16Н9, предизвикано спрямо аминокиселини 605 до 611 на АРР. По-ниската граница на чувствителност на APP-aFL теста е около 11 ng/ml (150 рМ) (Johnson-Wood et al.) и това на АРР-а специфичения тест е 22 ng/ml (0.3 пМ). За двата АРР теста, mAb 8Е5 е покрито върху ямки на 96ямкова EIA платки, както е описано по-горе за mAb 266. Използван е пречистен, рекомбинант секретиран АРР-а като референтен стандарт за АРР-а теста и ΑΡΡ-α/FL теста (Esch et al., по-горе). Пробите от мозъчни хомогенати в 5М гуанидин са разреждани 1:10 в ELISA Specimen разредител (0.014 М фосфатен буфер, pH 7.4, 0.6% говежди серум албумин, 0.05% тимеросал, 0.5М NaCl, 0.1% NP40). След това те са разредени 1:4 в Specimen разредител съдържащ 0.5 М гуанидин. След това разредените хомогенати са центрофугирани на 16,000 х g за 15 секунди на RT. АРР стандартите и пробите са добавени към платката в двойни порции и са инкубирани за 1.5 часа на RT. Биотинилираното репортерно антитяло 2НЗ или 16Н9 е инкубирано с пробите за 1 час на RT. Стрептавидин-алкална фосфатаза (Boehringer Mannheim), разредена 1:1000 в specimen разредител, е инкубирана в ямките за 1 час на RT. Флуоресцентният субстрат 4-метил-умбелиферилфосфат е добавен за 30-минутна инкубация на стайна температура и платките са отчетени на Cytofluor tm 2350 fluorimeter (Millipore) на 365 nm екстинкция и 450 nm емисия.

145

F. Имунохистохимия

Мозъци са фиксирани за три дни на 4°С в 4% параформалдехид в PBS и след това са съхранявани един до седем дни на 4°С в 1% параформалдехид, PBS докато бъдат нарязани на срези. Правени са коронарни срези с дебелина 40 микрона на вибратом на RT и са съхранявани в криопротектор (30% глицерол, 30% етилен гликол във фосфатен буфер) на -20°С преди имунохистохимична обработка. За всеки мозък, шест срези на нивото на дорзалния хипокамп, всеки отделен на 240 pm интервали, са инкубирани за една нощ с едно от следните антитела: (1) биотинилирано анти-Αβ (mAb, 3D6, специфични за човешки Αβ), разредено до концентрация 2pg/ml в PBS и 1% конски серум; или (2) биотинилирано mAb, специфично за човешки АРР, 8Е5, разредено до концентрация 3 pg/ml в PBS и 0.1% конски серум; или (3) тАЬ специфично за глиялен фибриларен кисел протеин (GFAP; Sigma Chemical Co.) разредено 1:500 с 0.25% Тритон-Х-100 и 1% конски серум, в Трис-буфериран физиологичен разтвор, pH 7.4 (TBS); или (4) mAb специфично за CD11b, МАС-1 антиген, (Chemicon International) разредено 1:100 с 0.25% Тритон-Х-100 и 1% заешки серум в TBS; или (5) mAb специфично за МНС II антиген, (Pharmingern) разредено 1:100 с 0.25% Тритон-Х-100 и 1% заешки серум в TBS; или (6) плъшо mAb, специфично за CD 43 (Pharmingen) разредено 1:100 с 1% заешки серум в PBS или (7) плъшо mAb специфично за CD 45RA (Pharmingen) разредено 1:100 с 1% заешки серум в PBS; или (8) плъшо моноклонално Αβ специфично за CD 45RB (Pharmingen) разредено 1:100 с 1% заешки серум в PBS; или (9) плъшо моноклонално Αβ специфично за CD 45 (Pharmingen) разредено 1:100 с 1% заешки серум в PBS; или (10) биотинилирано поликлонално Αβ от хамстер, специфично за CD3e (Pharmingen), разредено 1:100 с 1% заешки серум в PBS или (11) плъшо mAb специфично за CD3 (Serotec), разредено 1:200 с 1% заешки серум в

146

PBS; или c (12) разтвор на PBS, в който липсва първично антитяло, съдържащ нормален конски серум.

Срези реагирали с антитяло разтвори, изброени в 1,2 и 6-12 по-горе, са претретирани с 1.0% Тритон-Х-100, 0.4% водороден пероксид в PBS за 20 минути на RT, за блокиране на ендогенна пероксидаза. След това те са инкубирани за една нощ на 4°С с първично антитяло. Срези реагирали с 3D6 или 8Е5 или CD3 mAbs след това са реагирали за един час на RT с хрян пероксидазаавидин-биотин-комплекс с кит компоненти “А” и “В, разреден 1:75 в £ PBS (Vector Elite Standard Kit, Vector Labs, Burlingame, СА). Срези реагирали c антитела, специфични за CD 45RA, CD 45RB, CD 45, CD3 и PBS разтворът, свободен от първично антитяло, са инкубирани за един час на RT с биотинилиран анти-плъши IgG (Vector), разреден 1:75 в PBS или биотинилиран анти-миши IgG (Vector), разреден 1:75 в PBS, съответно. След това срезите са реагирали за един час на RT с хрян-пероксидаза-авидин-биотинкомплекс с кит компоненти “А” и “В”, разредени 1:75 в PBS (Vector Elite Standard Kit, Vector Labs, Burlingame, CA).

Срези са проявени в 0.01% водороден пероксид, 0.05% 3,3’диаминобензидин (DAB) на RT. Срези предвидени за инкубация с © GFAP-MAC-1-AND МНС ll-специфични антитела са претретирани с 0.6% водороден пероксид на RT за блокиране на ендогенна пероксидаза, след това са инкубирани за една нощ с първично антитяло на 4°С. Срези реагирали с GFAP антитялото са инкубирани за 1 час на RT с биотинилирано анти-мишо IgG, изготвено в кон (Vector Laboratories; Vectastain Elite ABC Kit), разредено T.200 c TBS. След това срезите са реагирали за един час с авидин-биотинпероксидаза комплекс (Vector Laboratories; Vectastain Elite ABC Kit), разреден 1:1000 c TBS. Срези инкубирани c МАС-1-или MHC llспецифично моноклонално антитяло като първично антитяло, последователно са реагирали за 1 час на RT с биотинилирано анти

147 плъшо IgG, изготвено у заек, разредено 1:200 с TBS, последвано от инкубация за един час с авидин-биотин-пероксидаза комплекс, разреден 1:1000 с TBS. Срези инкубирани с GFAP-, МАС-1 и МАС llспецифични антитела след това са визуализирани чрез третиране на RT с 0.05% DAB, 0.01% водороден пероксид, 0.04% никелов хлорид, TBS за 4 и 11 минути, съответно.

Имунобелязани срези са монтирани на предметни стъкла (VWR, Superfrost slides), изсушени са на въздух за една нощ, потопени са в Propar (Anatech) и са покрити отгоре с покривни стъкла като е използван Permount (Fisher) като монтираща среда.

За контрастно оцветяване на Αβ плаки, една серия от GFAP-положителни срези са монтирани на Superfrost стъкла и са инкубирани във воден 1% Thioflavin S (Sigma) за 7 минути, след имунохистохимична обработка. След това срезите са дехидратирани и просветлени в Ргораг, след това са покрити с покривни стъкла монтирани с Permount.

G. Анализ на образи

Videometric 150 Image Analysis System (Oncor, Inc. Gaithersburg, MD), свързан c Nikon Microphot-FX микроскоп чрез CCD видео камера и Sony Trinitron монитор, е използван за количествена оценка на имунореактивните стъкла. Образът на среза е съхраняван в един видео буфер и е определян праг на базата на цвят- и насищане, за подбор и изчисление на общата пиксел площ, заета от имунобелязаните структури. За всеки срез, хипокампът е ръчно очертан и общата пиксел площ, заета от хипокампа е изчислена. Процентът амилоидни натрупвания е измерван като: (фракцията от хипокампалната площ, съдържаща Αβ отлагания, имунореакгивни с mAb 3D6) х 100. Подобно на това, процентът невритни натрупвания е измерен като: (фракцията от хипокампалната площ, съдържаща дистрофични неврити,

148 реактивни с моноклонално антитяло 8Е5) х 100. C-lmaging System (Compix, Inc., Cranberry Towndhip, PA), оперираща the Simple 32 Software Application Program е свързана c Nikon Microphot-FX микроскоп, чрез Optronics камера и е използвана за количествено определяне процента от retrosplenial cortex зает от GFAPположителни астроцити и МАС-1- и МНС ll-положителна микроглия. Образът на имунореагиралия срез е съхраняван във видео буфер и е определян монохром-базиран праг за подбор и изчисление на общата пиксел площ, заета от имунобелязани клетки. За всеки срез, retrosplenial cortex (RSC) е очертавана ръчно и общата пиксел площ, заета от RSC е изчислена. Процентът астроцитоза е определен като: (фракцията RSC заета от GFAP-реактивни астроцити) х 100. Подобно, процентът микроглиоза е определен като: (фракцията RSC заета от МАС-1- или МНС ll-реакгивна микроглия) х 100. За всички анализи на образи, шест срези на нивото на дорзалния хипокамп, всеки отделен чрез последователни 240 цгп интервали, са количествено определени за всяко животно. Във всички случаи, статусът на третиране на животните е неизвестен за наблюдателя.

Въпреки че горното изобретение е описано подробно с цел яснота и разбиране, ще стане видимо, че някои модификации могат да бъдат практикувани в обсега на приложените претенции. Всички публикации и патентни документи, цитирани тук, също текстът появяващ се във фигурите и изброяване на последователностите, тук са включени чрез цитат в тяхната цялост, за всякакви цели, в същата степен, както ако всеки е индивидуално отбелязан.

От горното ще бъде очевидно, че изобретението предоставя известен брой приложения. Например, изобретението предоставя за употреба всяко от антителата срещу Αβ, описани погоре при третиране, профилактика или диагноза на амилоидогенно заболяване, или при производство на лекарствен препарат или диагностичен състав за употреба при същото.

Claims

ПАТЕНТНИ ПРЕТЕНЦИИ

1. Хуманизирана имуноглобулинова лека верига, съдържаща (i) променлива област на определящи комплементарността области (CDRs) от последователност на 3D6 имуноглобулиновата лековерижна променлива област, представена като SEQ ID N0:2, и (ii) променлива област на рамката от лековерижна последователност на човешки акцепторен имуноглобулин, като се осигурява, че най-малко един остатък на рамката е заменен със съответния аминокиселинен остатък от последователност на мишата 3D6 лековерижна променлива област, където остатъкът на рамката е подбран от група състояща се от:

(a) остатък, който не-ковелентно свързва антиген директно;

(b) остатък съседен на една CDR;

(c) CDR-взаимодействащ остатък; и (d) Остатък участващ в VI-VH границата
2. Хуманизирана имуноглобулинова тежка верига съдържаща (i) променлива област на определящи комплементарността области (CDRs) от последователност на 3D6 имуноглобулиновата тежковерижна променлива област, представена като SEQ ID N0:4, и (ii) променлива област на рамката от човешки акцепторен имуноглобулин тежка верига, като се осигурява, че най-малко един остатък на рамката е заменен със съответния аминокиселинен остатък от последователност на мишата 3D6 лековерижна променлива област, където остатъкът на рамката е подбран от група състояща се от:

(a) остатък, който не-ковалентно свързва антиген директно;

(b) остатък съседен на една CDR;

(c) CDR-взаимодействащ остатък; и (d) остатък участващ в VI-VH допирната границата

150
3. Лека верига съгласно претенция1, където CDR-взаимодействащ остатък е идентифициран чрез моделиране 3D6 леката верига въз основа на решената структура на 1CR9.
4. Лека верига съгласно претенция 1, където CDR-взаимодействащ остатък е идентифициран чрез моделиране 3D6 леката верига въз основа на решената структура на 1NLD.
5. Тежка верига съгласно претенция 2, където CDRвзаимодействащ остатък е идентифициран чрез моделиране на 3D6 тежката верига въз основа на решената структура на 1OPG.
6. Хуманизирана имуноглобилинова лека верига съдържаща (i) променлива област на определящи комплементарността области (CDRs) от последователност на 3D6 имуноглобулиновата лековерижна променлива област, представена като SEQ ID N0:2, и (Н) променлива област на рамката от лековерижна последователност на човешки акцепторен имуноглобулин, като се осигурява, че най-малко един остатък на рамката е заменен със съответния аминокиселинен остатък от последователност на лековерижната променлива област на мишото 3D6, където остатък на рамката, е остатък способен да повлиява конформация или функция на лековерижна променлива област, както е идентифицирано чрез анализ на три-димензионален модел на 3D6 имуноглобулинова лековерижна променлива област.
7. Хуманизирана имуноглобилинова тежка верига съдържаща (i) променлива област на определящи комплементарността области (CDRs) от последователност на 3D6 имуноглобулиновата тежковерижна променлива област, представена като SEQ ID N0:4, и

151 (it) променлива област на рамката от човешки акцепторен имуноглобулин тежка верига, като се осигурява, че най-малко един остатък на рамката е заменен със съответния аминокиселинен остатък от последователност на тежковерижната променлива област на мишото 3D6, където остатък на рамката е остатък способен да повлиява конформация или функция на тежковерижната променлива област, както е идентифицирано чрез анализ на тридимензионален модел на 3D6 имуноглобулинова тежковерижна променлива област.
8. Лека верига съгласно претенция 6, където остатък на рамката е подбран от група състояща се от остатък, способен да взаимодейства с антиген, остатък проксимален на антиген свързващото място, остатък, способен да взаимодейства с CDR, остатък съседен на GDR, остатък в рамките на 6 А на един CDR остатък, признат остатък, остатък на спомагателна зона, междуверижен пакетиращ остатък, рядък остатък, остатък при гликозилиращо място по повърхността на структурния модел
9. Тежка верига съгласно претенция 7, където остатък на рамката е ** подбран от група състояща се от остатък, способен да взаимодейства с антиген, остатък проксимален на антиген свързващото място, остатък способен да взаимодейства с един CDR, остатък съседен на CDR, остатък в рамките на 6 А на CDR остатък, признат остатък, остатък на спомагателна зона, междуверижен пакетиращ остатък, необичаен остатък, остатък при гликозилиращо място по повърхността на структурния модел.

152
10. Лека верига съгласно претенция 6 или 8, където остатък на рамката е идентифициран чрез моделиране на 3D6 леката верига, въз основа на решената структура на 1CR9.
11. Лека верига съгласно претенция 6 или 8, където остатък на рамката е идентифициран чрез моделиране на 3D6 леката верига, въз основа на решената структура на 1NLD.
12. Тежка верига съгласно претенция 7 или 9, където остатък на рамката е идентифициран чрез моделиране на 3D6 тежката верига, въз основа на решената структура на 1OPG.
13. Хуманизирана имуноглобулинова лека верига включваща (i) променлива област на определящи комплементарността области (CDRs) от последователност на 3D6 имуноглобулиновата лековерижна променлива област, представена като SEQ ID N0:2, и (н) променлива област на рамката от човешки акцепторен имуноглобулин лека верига, като се осигурява, че най-малко един остатък на рамката, подбран от група състояща се от L1, L2, L36 и L46 (Rabat конвенция за номериране), е заменен със съответния аминокиселинен остатък от последователност на мишото 3D6 лековерижна променлива област.
14. Хуманизирана имуноглобулинова тежка верига включваща (i) променлива област на определящи комплементарността области (CDRs) от последователност на 3D6 тежковерижната променлива област, представена като SEQ ID N0:4, и (П) променливи области на рамката от човешки акцепторен имуноглобулин тежка верига, като се осигурява, че най-малко един остатък на рамката, подбран от група състояща се от Н49, Н93 и L94 (Rabat конверниця за номериране), е заменен със съответния

153 аминокиселинен остатък от последователност на мишото 3D6 тежковерижна променливата област.
15. Лека верига съгласно претенции 1, 3, 4, 6, 8, 10, 11 и 13, където човешката акцепторна лека верига е от подтип kappa 11 (Kabat конвенция).
16. Тежка верига, съгласно претенции 2, 5, 7, 9, 12 и 14, където човешката акцепторна тежка верига е от подтип 111 (Kabat конвенция).
17. Лека верига съгласно претенция 15, където човешката акцепторна лека верига е подбрана от група състояща се от Kabat ID 019230, Kabat ID 005131, Kabat ID 005058, Kabat ID 005057, Kabat ID 005059, Kabat ID U21040 и Kabat U41645.
18. Лека верига съгласно претенция 15, където човешката акцепторна лека верига е Kabat IF 019230.
19. Тежка верига съгласно претенция 16, където човешката акцепторна тежка верига е подбрана от група състояща се от Kabat ID 045919, Kabat ID 000459, Kabat ID 000553, Kabat ID 000386 и Kabat ID M23691.
20. Тежка верига съгласно претенция 16, където човешката акцепторна тежка верига е Kabat ID 045919.
21. Лека верига съгласно претенции 1, 3, 4, 6, 8, 10, 11, 13, 15, 17 и 18, където най-малко един рядък остатък на човешка рамка е заменен с аминокиселинен остатък, който е общ за човешки променливи лековерижни последователности в тази позиция.

154
22. Лека верига съгласно претенции 1, 3, 4, 6, 8, 10, 11, 13, 15, 17 и 18, където най-малко един рядък остатък на човешка рамка е заменен със съответен аминокиселинен остатък от променлива лековерижна последователност на зародишева линия.
23. Лека верига съгласно претенция 22, където променливата лековерижна последователност на зародишева линия е подбрана от група състояща се от А1, А17, А18, А2 и А19.
24. Тежка верига съгласно претенции 2, 5, 7, 9, 12, 14, 16, 19 и 20, където най-малко един рядък остатък на човешка рамка е заменен с аминокиселинен остатък, който е общ за човешки променливи тежковерижни последователности в тази позиция.
25. Тежка верига съгласно претенции 2, 5, 7, 9, 12, 14, 16, 19 и 20, където най-малко един рядък остатък на човешка рамка е заменен със съответен аминокиселинен остатък от променлива тежковерижна последователност на зародишева линия.
26. Тежка верига съгласно претенция 25, където променлива тежковерижна последователност на зародишева линия е подбрана от групата състояща се от VH3-48, VH3-23, VH3-7, VH321 nVH3-11.
27. Тежка верига съгласно претенция 25, където променливата тежковерижна последователност на зародишева линия е VH3-23.
28. Лека верига съгласно претенции 21-23, където рядък остатък на рамката е подбран въз основа на поява в тази позиция в помалко от 10% на последователности на човешка лековерижна

155 променлива област, в подгрупата на лековерижната променлива област, и общият остатък е подбран въз основа на поява в тази позиция в повече от 50% на последователности в подгрупата на лековерижната променлива област.
29. Лека верига съгласно претенции 24-26, където рядък остатък на рамката е подбран въз основа на поява в тази позиция в помалко от 10% на последователности на човешка тежковерижна променлива област, в подгрупата на тежковерижната променлива област, и общият остатък е подбран въз основа на поява в тази позиция в повече от 50% на последователности в подгрупата на тежковерижната променлива област.
30. Лека верига съдържаща определящи комплементарността области (CDRs) и остатъци на променлива област на рамката L1, L2, L36 и L46 (Kabat конвенция за номериране) от лека верига на моноклоналното антитяло 3D6, кьдето остатъкът от леката верига е от човешки имуноглобулин.
31. Тежка верига съдържаща определящи комплементарността области (CDRs) и остатъци на променлива област на рамката Н49, Н93 и Н94 (Kabat конвенция за номериране) от тежка верига на моноклоналното антитяло 3D6, където остатъкът от тежката верига е от човешки имуноглобулин.
32. Хуманизиран имуноглобулин, съдържащ леката верига от всяка една от претенции 1, 3, 4, 6, 8, 10, 11, 13, 15, 17 и 18, и тежката верига, съгласно всяка една от претенции 2, 5, 7, 9, 12,14,16, 19 и 20, или антиген свързващ фрагмент на споменатия имуноглобулин.

156
33. Имуноглобулин или антиген свързващ фрагмент, съгласно претенция 32, който специфично се свързва с бета амилоиден пептид (Αβ), със свързващ афинитет най-малко 10⁷ М¹.
34. Имуноглобулин или антиген свързващ фрагмент, съгласно претенция 32, който специфично се свързва с бета амилоиден пептид (Αβ) със свързващ афинитет най-малко 10® М'¹.
35. Имуноглобулин или антиген свързващ фрагмент, съгласно претенция 32, който специфично се свързва с бета амилоиден пептид (Αβ) със свързващ афинитет най-малко 10⁹ М’¹.
36. Имуноглобулин или антиген свързващ фрагмент, съгласно претенция 32, кьдето тежковерижният изотип е γ1.
37. Имуноглобулин или антиген свързващ фрагмент, съгласно претенция 32, който специфично се свързва с бета амилоиден пептид (Αβ) и агрегиран Αβ.
38. Имуноглобулин, съгласно претенция 37, където разтворимият бета амилоиден пептид (Αβ) е дизагрегиран Αβ.
39. Имуноглобулин или антиген свързващ фрагмент, съгласно претенция 32, който медиира фагоцитоза на бета амилоиден пептид (Αβ).
40. Имуноглобулин или антиген свързващ фрагмент, съгласно претенция 32, който преминава кръвно-мозъчната бариера у даден индивид.

157
41. Имуноглобулин или антиген свързващ фрагмент, съгласно претенция 32, който редуцира натрупвания на бета амилоиден пептид (Αβ) и невритна дистрофия у даден индивид.
42. Хуманизиран имуноглобулин съдържащ хуманизирана тежка верига и хуманизирана лека верига, където (a) хуманизираната тежка верига съдържа три определящи комплементарността области (CDR1, CDR2 и CDR3), притежаващи аминокиселинни последователности от съответните определящи комплементарността области на имуноглобулин лековерижен променлив домен на мишото 3D6, обозначен като SEQ ID N0:2 и една променлива област на рамката от последователност на човешка лековерижна променлива област на рамката, като се осигурява, че наймалко една позиция, подбрана от една първа група, състояща се от L1, L2, L36 и L46 (Kabat конвенция за номериране), е заета от същия аминокиселинен остатък, който присъства в еквивалентна позиция на имуноглобулинова лековерижна променлива област на рамката на мишото 3D6; и (b) Хуманизирана тежка верига съдържаща три определящи комплементарността области (CDR1, CDR2 и CDR3), притежаващи аминокиселинни последователности от съответните определящи комплементарността области на тежковерижен променлив домен на миши 3D6 имуноглобулин, обозначен SEQ ID N0:4, и една променлива област на рамката от последователност на човешка тежковерижна променлива област на рамката, като се осигурява, че най-малко една позиция, подбрана от една втора група, състояща се от Н49, Н93 и Н94 (Kabat конвенция

158 за номериране), е заета от същия аминокиселинен остатък, присъстващ в еквивалентната позиция на тежковерижна променлива област на рамката на мишия 3D6 имуноглобулин;

където хуманизираният иминоглобулин специфично се свързва с бета амилоиден пептид (Αβ), със свързващ афинитет от най-малко 10⁷ М'¹, където 3D6 имуноглобулин има леката верига с един променлив домен, обозначен SEQ ID N0:2 и тежката верига с променлив домен обозначен SEQ ID N0:4.
43. Хуманизиран имуноглобулин съгласно претенция 42, където човешка лековерижна променлива област на рамката е от kappa лековерижна променлива област.
44. Хуманизиран имуноглобулин съгласно претенция 42, където човешка тежковерижна променлива област на рамката е от lgG1 тежковерижна променлива област.
45. Хуманизиран имуноглобулин съгласно претенция 42, където хуманизираната лековерижна променлива област на рамката е от лека верига подбрана от групата състояща се от Kabat ID 019230, Kabat 005131, Kabat ID 005058, Kabat ID 005057, Kabat ID 005059, Kabat ID U21040 и Kabat ID U41645.
46. Хуманизиран имуноглобулин съгласно претенция 42, където хуманизираната тежковерижна променлива област на рамката е от тежка верига подбрана от групата състояща се от Kabat ID 045919, Kabat ID 000459, Kabat ID 000553, Kabat ID 000386 и Kabat ID M 23691.

159
47. Хуманизиран имуноглобулин съгласно претенция 42, където хуманизираната лековерижна променлива област на рамката е идентична с последователност на Kabat ID 019230 лековерижната променлива област на рамката, с изключение за позициите от първата група и тежковерижната променлива област на рамката е идентична с последователност на Kabat ID 045919 тежковерижната променлива област на рамката, с изключение за позициите от втората група
48. Хуманизиран имуноглобулин съгласно претенция 42, където хуманизираната лека верига съдържа определящи комплементарността области, които са идентични със съответните определящи комплементарността области на мишата 3D6 тежка верига, и хуманизираната тежка верига съдържа определящи комплементарността области, които са идентични със съответните определящи комплементарността области на мишата 3D6 тежка верига.
49. Хуманизирано антитяло, съдържащо определящи комплементарността области (CDR1, CDR2 и CDR3) на 3D6 променлива лековерижна последователност, представена като SEQ ID N0:2.
50. Хуманизирано антитяло съдържащо определящи комплементарността области (CDR1, CDR2 и CDR3) на 3D6 променливата тежковерижна последователност, представена като SEQ ID N0:4.
51. Хуманизирано антитяло, или негов антиген-свързващ фрагмент, което специфично се свързва с бета амилоиден пептид (Αβ), съдържащо променлива област, включваща определящи

160 комплементарността области (CDRs), съответстващи на CDRs от мишото 3D6 антитяло.
52. Хуманизирано антитяло, което свързва бета амилоиден пептид (Αβ) с афинитет най-малко 10⁷ М’¹ включващо:

(a) един лековерижен променлив домен, съдържащ аминокиселинни остатъци на миша 3D6 определяща комплементарността област (CDR) и аминокиселинни остатъци на човешка VL подгрупа II променлив домен на област на рамката (FR); и (b) тежковерижен променлив домен, съдържащ аминокиселинни остатъци на миша 3D6 определяща комплементарността област (CDR) и аминокиселинни остатъци на човешка VH подгрупа III променлив домен на област на рамката (FR).
53. Химерен имуноглобулин, съдържащ променлива област на определящи комплементарността области (CDRs) от последователности на променлива област на 3D6 имуноглобулин, представен като SEQ ID N0:2 или SEQ ID N0:4, и променливи области на рамката от човешки акцепторен имуноглобулин.
54. Имуноглобулин или негов антиген-свързващ фрагмент, съдържащ една променлива тежковерижна област, както е представена в SEQ ID N0:8 и една променлива лековерижна област както е представена в SEQ ID N0:5.
55. Имуноглобулин или негов антиген-свързващ фрагмент, съдържащ една променлива тежковерижна област, както е

161 представена в SEQ ID N0:12 и една лековерижна област, както е представена в SEQ ID N0:11.
56. Имуноглобулин, съдържащ една променлива тежковерижна област, представена в SEQ ID:8, една променлива лековерижна област, представена в SEQ ID N0:5 и константни области от lgG1.
57. Имуноглобулин, съдържащ променлива тежковерижна област както е представена в SEQ ID N0:12, една лековерижна област както е представена в SEQ ID N0:11 и константни области от lgG1.
58. Използване на хуманизиран имуноглобулин за получаване на медикамент, за профилактика и лечение на амилоидогенно заболяване у пациент, включващо въвеждане на пациент на ефективна дозировка от хуманизиран имуноглобулин, съгласно претенции 32-52.
59. Използване на хуманизиран имуноглобулин за получаване на медикамент за профилактика или лечение на болест на Alzheimer у пациент, включващо въвеждане на пациент на ефективна дозировка от хуманизиран имуноглобулин, претенции 32-52.
60. Използване съгласно претенция 59, където ефективната дозировка на хуманизиран имуноглобулин е 1 mg/kg телесно тегло.
61. Използване съгласно претенция 59, където ефективната дозировка на хуманизиран имуноглобулин е 10 mg/kg телесно тегло.

162
62. Фармацевтичен състав съдържащ имуноглобулин, съгласно претенции 32-52 и един фармацевтичен носител.
63. Изолиран полипептид, съдържащ фрагмент от SEQ ID N0:2, подбран от групата състояща се от аминокиселини 24-39 от SEQ ID N0:2, аминокиселини 55-61 от SEQ ID N0:2 и аминокиселини 94-102 на SEQ ID N0:2.
64. Изолиран полипептид, съдържащ аминокиселини 24-39 от SEQ ID N0:2, аминокиселини 55-61 от SEQ ID N0:2 и аминокиселини 94-102 от SEQ ID N0:2.
65. Изолиран полипептид, съдържащ фрагмент от SEQ ID N0:4, подбран от групата състояща се от аминокиселини 31-35 от SEQ ID N0:4, аминокиселини 50-66 от SEQ ID N0:4 и аминокиселини 99-107 otSEQ ID N0:4.
66. Изолиран полипептид, съдържащ аминокиселини 31-35 от SEQ ID N0:4, аминокиселини 50-66 от SEQ ID N0:4 и аминокиселини 99-107 от SEQ ID N0:4.
67. Изолиран полипептид, съдържащ аминокиселинна последователност на SEQ ID N0:2.
68. Изолиран полипептид съдържащ аминокиселинна последователност на SEQ ID N0:4.
69. Вариант на полипептид, съдържащ аминокиселинната последователност на SEQ ID N0:2, споменатият вариант съдържащ най-малко една консервативна аминокиселинна

163 замяна, където вариантът запазва способността директно специфично да се свързва с бета амилоиден пептид (Αβ) със свързващ афинитет най-малко 10⁷ М*¹.
70. Вариант на полипептид, съдържащ аминокиселинната последователност на SEQ ID N0:4, споменатият вариант съдържащ най-малко една консервативна аминокиселинна замяна, където вариантът запазва способността специфично да свързва бета амилоиден пептид (Αβ) със свързващ афинитет най-малко 10⁷ М’¹.
71. Изолиран полипептид, съдържащ остатъци 1-112 на аминокиселинната последователност на SEQ ID N0:2 или съдържащ остатъци 1-119 на аминокиселинната последователност на SEQ ID N0:4.
72. Изолирана молекула нуклеинова киселина, кодираща леката верига съгласно всяка една от претенции 1, 3, 4, 6, 8, 10, 11, 13, 15,17 и 18.
73. Изолирана молекула нуклеинова киселина, кодираща тежката верига съгласно всяка една от претенции 2, 5, 7, 9, 12, 14, 16, 19 и 20.
74. Изолирана молекула нуклеинова киселина, кодираща полипептид съгласно претенции 64-71.
75. Изолирана молекула аминокиселина, кодираща имуноглобулин съгласно претенции 32-57.

164
76. Изолирана молекула нуклеинова киселина, съдържаща нуклеотидната последователност на SEQ ID N0:1 или 3.
77. Вектор съдържащ молекула нуклеинова киселина, съгласно претенции 72-76.
78. Клетка гостоприемник, съдържаща молекула нуклеинова киселина съгласно претенции 72-76.
79. Метод за получаване на антитяло или негов фрагмент, характеризиращ се с това, че се култивира клетка гостоприемник съгласно претенция 45 в условия, при които антитялото или фрагментът се получават и изолиране на споменатото антитяло от клетката гостоприемник или култура.
80. Метод за получаване антитяло или негов фрагмент, споменатият метод характеризиращ се с това, че се култивира клетка гостоприемник, която експресира молекула нуклеинова киселина, кодираща споменатото антитяло или фрагмент в условия, при които антитялото или фрагментът се получават и изолиране на споменатото антитяло или фрагмента от клетка гостоприемник в култура, където споменатото антитяло или фрагмент съдържа аминокиселини 24-39 на SEQ ID N0:2, аминокиселини 55-61 на SEQ ID N0:2 и аминокиселини 94-102 на SEQ ID N0:2.
81. Метод за получаване антитяло или негов фрагмент, споменатият метод характеризиращ се с това, че се култивира клетка гостоприемник, която експресира молекула нуклеинова киселина, кодираща споменатото антитяло или фрагмент в условия, при които антитялото или фрагментът се получават и изолиране споменатото антитяло от клетката гостоприемник или култура,

165 където споменатото антитяло или фрагментът съдържа аминокиселини 31-35 на SEQ ID N0:4, аминокиселини 50-66 на SEQ ID N0:4 и аминокиселини 99-112 на SEQ ID N0:4.
82. Метод за идентифициране остатъци податливи на замяна в променлива област на рамката на хуманизиран 3D6 имуноглобулин, характеризиращ се с това, че се моделира тридимензионалната структура на 3D6 променливата област, въз основа на решена имуноглобулинова структура и анализиране споменатия модел за остатъци, способни да повлияят конформация или функция на 3D6 имуноглобулин променливата област, така че са идентифицирани тези остатъци, които са податливи на замяна.
83. Приложение на последователност на променливата област, представена като SEQ ID N0:2 или SEQ ID N0:4 или която и да е част от нея, при получаване на три-димензионален образ на 3D6 имуноглобулин, 3D6 им и ногл обул и нова верига или домен от нея.
84. Хуманизирана имуноглобулинова лека верига съдържаща (i) променлива област на определящи комплементарността области (CDRs) от последователност на 10D5 имуноглобулиновата лековерижна променлива област, представена като SEQ ID N0:14 и (ii) променлива област на рамката от лековерижна последователност на човешки акцепторен имуноглобулин, като се осигурява, че най-малко един остатък от рамката е заменен със съответния аминокиселинен остатък от последователност на мишата 10D5 лековерижна променилва област, където остатъкът на рамката е подбран от групата състояща се от:

(a) остатък, който не-ковалентно свързва антиген директно;

(b) остатък съседен на една CDR;

166 (c) CDR-взаимодействащ остатък; и (d) остатък участващ в VL-VH границата.
85. Хуманизирана имуноглобулинова тежка верига съдържаща (i) променлива област на определящите комплементарността области (CDRs) от последователност на 10D5 имуноглобулинова тежковерижна променлива област, представена като SEQ ID N0:16, и (ii) променлива област на рамката от човешка акцепторна имуноглобулинова тежка верига, като се осигурява, че най-малко един остатък на рамката е заменен със съответния аминокиселинен остатък от последователност на мишата 10D5 тежковерижна променлива област, където остатъкът на рамката е подбран от групата състояща се от:

(a) остатък, който не-ковалентно свързва антиген директно;

(b) остатък съседен на една CDR;

(c) CDR-взаимодействащ остатък; и (d) остатък участващ в VL-VH границата.
86. Лека верига съгласно претенция 84, където CDR- взаимодействащ остатък е идентифициран чрез моделиране 10D5 леката верига, въз основа решената структура на миша имуноглобулинова лека верига, която споделя най-малко 70% идентичност на последователността с 10D5 леката верига.
87. Лека верига съгласно претенция 84, където CDRвзаимодействащ остатък е идентифициран чрез моделиране на 10D5 леката верига, въз основа на решената структура на миша имуноглобулинова лека верига, която споделя най-малко 80% идентичност на последователността с 10D5 леката верига.

167
88. Лека верига съгласно претенция 84, където CDRвзаимодействащ остатък е идентифициран чрез моделиране на 10D5 леката верига, въз основа на решената структура на миша имуноглобулинова лека верига, която споделя най-малко 90% идентичност на последователността с 10D5 леката верига.
89. Тежка верига съгласно претенция 85, където CDRвзаимодействащ остатък е идентифициран чрез моделиране на 10D5 тежката верига, въз основа на решената структура на миша имуноглобулинова тежка верига, която споделя най-малко 70% идентичност на последователността с 10D5 тежката верига.
90. Тежка верига съгласно претенция 85, където CDRвзаимодействащ остатък е идентифициран чрез моделиране на 10D5 тежка верига, въз основа на решената структура на миша имуноглобулинова тежка верига, която споделя най-малко 80% идентичност на последователността с 10D5 тежката верига.
91. Тежка верига съгласно претенция 85, където CDRвзаимодействащ остатък е идентифициран чрез моделиране на 10D5 тежка верига, въз основа на решената структура на миша имуноглобулинова тежка верига, която споделя най-малко 90% идентичност на последователността с 10D5 тежката верига.
92. Хумманизирана имуноглобулинова лека верига съдържаща (i) променлива област на определящи комплементарността области (CDRs) от последователност на 10D5 имуноглобулинова лековерижна променлива област, представена като SEQ ID N0:14, и (ii) променлива област на рамката от последователност на човешка акцепторна имуноглобулинова лека верига, като се Осигурява, че най-малко един остатък на рамката е заменен със

168 съответния аминокиселинен остатък от последователност на мишата 10D5 лековерижна променлива област, където остатъкът на рамката е остатък способен да повлиява конформация или функция на лековерижна променлива област, идентифициран с анализ на три-димензионален модел на 10D5 имуноглобулинова лековерижна променлива област.
93. Хуманизирана имуноглобулинова тежковерижна верига, съдържаща (i) променлива област на определящи комплементарността области (CDRs) от последователност на 10D5 имуноглобулинова тежковерижна променлива област, представена като SEQ ID N0:16, и (ii) променлива област на рамката от човешка акцепторна имуноглобулинова тежка верига, като се осигурява, че най-малко един остатък на рамката е заменен със съответния аминокиселинен остатък, от последователност на мишата 10D5 тежковерижна променлива област, където остатъкът на рамката е способен да повлияе конформация или функция на тежковерижна променлива област, както е идентифициран чрез анализ на три-димензионален модел на 10D5 имуноглобулинова тежковерижна променлива област.
94. Лека верига съгласно претенция 92, където остатъкът на рамката е подбра от групата състояща се от остатък, способен да взаимодейства с антиген, остатък проксимален на антиген свързващо място, остатък способен да взаимодейства с една CDR, остатък съседен на една CDR, остатък в рамките на 6 А на един CDR остатък, признат остатък, остатък на спомагателна зона, междуверижен пакетиращ остатък, рядък остатък и остатък на гликозилиращо място по повърхността на структурния модел.

169
95. Тежка верига съгласно претенция 93, където остатъкът на рамката е подбран от групата състояща се от остатък, способен да взаимодейства с антиген, остатък проксимален на антиген свързващо място, остатък способен да взаимодейства с една CDR, остатък съседен на една CDR, остатък в рамките на 6 А на един CDR остатък, признат остатък, остатък на спомагателна зона, междуверижен пакетиращ остатък, необичаен остатък и остатък на гликолизиращо място по повърхността на структурния модел.
96. Лека верига съгласно претенция 92 или 94, където остатъкът на рамката е идентифициран чрез моделиране на 10D5 леката верига, въз основа на решената структура на миша имуноглобулинова лека верига, която споделя най-малко 70% идентичност на последователността с 10D5 леката верига.
97. Лека верига съгласно претенция 92 или 94, където остатъкът на рамката е идентифициран чрез моделиране на 10D5 леката верига, въз основа на решената структура на миша имуноглобулинова лека верига, която споделя най-малко 80% идентичност на последователността с 10D5 леката верига.
98. Лека верига съгласно претенция 92 или 94, където остатъкът на рамката е идентифициран чрез моделиране на 10D5 леката верига, въз основа на решената структура на миша имуноглобулинова лека верига, която споделя най-малко 90% идентичност на последователността с 10D5 леката верига.
99. Тежка верига съгласно претенция 93 или 95, където остатъкът на рамката е идентифициран чрез моделиране на 10D5 тежката верига, въз основа на решената структура на миша

170 имуноглобулинова тежка верига, която споделя най-малко 70% идентичност на последователността с 10D5 тежката верига.
100. Тежка верига съгласно претенция 93 или 95, където остатъкът на рамката е идентифициран чрез моделиране на 10D5 тежката верига, въз основа на решената структура на миша имуноглобулинова тежка верига, която споделя най-малко 80% идентичност на последователността с 10D5 тежката верига.
101. Тежка верига съгласно претенция 93 или 95, където остатъкът на рамката е идентифициран чрез моделиране на 10D5 тежката верига, въз основа на решената структура на миша имуноглобулинова тежка верига, която споделя най-малко 90% идентичност на последователността с 10D5 тежката верига.
102. Лека верига съгласно всяка една от претенции 84, 86-88, 92, 94 и 96-98, където най-малко един рядък остатък на човешка рамка е заменен с аминокиселинен остатък, който е общ за последователности на човешка променлива лека верига в тази позиция.
103. Лека верига съгласно всяка една от претенции 84, 86-88, 92, 94 и 96-98, където най-малко един рядък остатък на човешка рамка е заменен със съответен аминокиселинен остатък от променлива лековерижна последователност на зародишева линия.
104. Лека верига съгласно претенция 103, където променлива лековерижна последователност на зародишева линия е тази на имуноглобулин, споделящ най-малко 70% идентичност на

171 последователността с променливата лековерижна последователност.
105. Лека верига съгласно претенция 103, където променливата лековерижна последователност на зародишева линия е тази, на имуноглобулин, споделящ най-малко 80% идентичност на последователността с променливата лековерижна последователност.
106. Лека верига съгласно претенция 103, където променливата лековерижна последователност на зародишева линия е тази, на имуноглобулин, споделящ най-малко 90% идентичност на последователността с променливата лековерижна последователност.
107. Тежка верига съгласно всяка една от претенции 85, 89-91, 93 и 99-101, където най-малко един рядък остатък на човешка рамка е заменен с аминокиселинен остатък, който е общ за човешки променливи лековерижни последователности в тази позиция.
108. Тежка верига съгласно всяка една от претенции 85, 89-91, 93 и 99-101, където най-малко един рядък остатък на човешка рамка е заменен със съответен аминокиселинен остатък от променлива тежковерижна последователност на зародишева линия.
109. Тежка верига съгласно претенция 108, където променлива тежковерижна последователност на зародишева линия е тази на, или е споделяща най-малко 70% идентичност с променливата тежковерижна последователност на SEQ ID ΝΟ.Ί6.

172
110. Тежка верига съгласно претенция 108, където променлива тежковерижна последователност на зародишева линия е тази на, или е споделяща най-малко 80% идентичност с променлива тежковерижна последователност на идентичност на последователност по. 16.
111. Тежка верига съгласно претенция 108, където променлива тежковерижна последователност на зародишева линия е тази на, или е споделяща най-малко 90% идентичност с

С променливата тежковерижна последователност на идентичност на последователността по. 16.
112. Лека верига съгласно претенции 102-106, където редкият остатък на рамката е подбран въз основа на поява в тази позиция в по-малко от 10% от последователности на човешка лековерижна променлива област, в подгрупа на лековерижната променлива област и общият остатък е подбран въз основа на поява в тази позиция в повече от 50% от последователности на лековерижната променлива област на подгрупата.

©
113. Лека верига съгласно претенции 107-111, където редкият остатък на рамката е подбран въз основа на поява в тази позиция в по-малко от 10% от последователности на човешка тежковерижна променлива област, в тежковерижна променлива област на подгрупа, и общият остатък е подбран въз основа на поява в тази позиция в повече от 50% от последователности в подгрупа на тежковерижна променлива област.
114. Хуманизиран имуноглобулин съдържащ леката верига, съгласно всяка една от претенции 84, 86-88, 92, 94 и 96-98 и

173 тежката верига съгласно всяка една от претенции 85, 89-91 и 93 и 99-101, или антиген-свързващ фрагмент на споменатия имуноглобулин.
115. Имуноглобулин или антиген свързващ фрагмент, съгласно претенция 114, който специфично се свързва с бета амилоиден пептид (Αβ) със свързващ афинитет най-малко 10’⁷ М.
116. Имуноглобулин или антиген свързващ фрагмент, съгласно претенция 114, който специфично се свързва с бета амилоиден пептид (Αβ) със свързващ афинитет най-малко 10^-8 М.
117. Имуноглобулин или антиген свързващ фрагмент, съгласно претенция 114, който специфично се свързва с бета амилоиден пептид (Αβ) със свързващ афинитет най-малко 10'⁹ М.
118. Имуноглобулин или антиген свързващ фрагмент, съгласно претенция 114, където тежковерижният изотип е γ1.
119. Имуноглобулин или антиген свързващ фрагмент, съгласно претенция 114, който се свързва с агрегиран бета амилоиден пептид (Αβ).
120. Имуноглобулин или антиген свързващ фрагмент, съгласно претенция 114, който медиира фагоцитоза на бета амилоиден пептид (Αβ).
121. Имуноглобулин или антиген свързващ фрагмент, съгласно претенция 114, който преминава кръвно-мозъчната бариера на индивида.

174
122. Имуноглобулин или антиген свързващ фрагмент, съгласно претенция 114, който редуцира бета амилоиден пептид (Αβ) натрупване на плаки у даден индивид.
123. Хуманизиран имуноглобулин, съдържащ хуманизирана тежка верига и хуманизирана лека верига, където (a) хуманизирана лека верига, съдържаща три определящи комплементарността области (CDR1, CDR2 и CDR3), притежаващи аминокиселинни последователности от съответни определящи комплементарността области на миши 10D5 имуноглобулин лековерижен променлив домен, обозначен SEQ ID N0:14 и една променлива област на рамката от последователност на човешка лековерижна променлива област на рамката, като се осигурява, че наймалко един остатък на рамката, подбран от групата състояща се от признат остатък, спомагателен остатък, пакетиращ остатък и един рядък остатък, е зает от същия аминокиселинен остатък, присъстващ в еквивалентна позиция на мишата 10D5 имуноглобулинова лековерижна променлива област на рамката; и (b) хуманизирана тежка верига съдържа три определящи комплементарността области (CDR1, CDR2 и CDR3), притежаваща аминокиселинни последователности от съответни определящи комплементарността области на мишия 10D5 имуноглобулинов тежковерижен променлив домен , обозначен SEQ ID N0:16, и една променлива област на рамката от последователност на човешка тежковерижна променлива област на рамката, като се осигурява, че наймалко един остатък на рамката, подбран от втора група състояща се от признат остатък, спомагателен остатък,

175 пакетиращ остатък и рядък остатък, е зает от същия аминокиселинен остатък, присъстващ в еквивалентна позиция на мишата 10D5 имуноглобулинова тежковерижна променлива област на рамката;

където хуманизираният имуноглобулин специфично се свързва с бета амилоиден пептид (Αβ”), със свързващ афинитет най-малко 10'⁷ М, където 10D5 имуноглобулинът има леката верига с променлив домен обозначен SEQ ID N0:14 и тежката верига с променлив домен обозначен SEQ ID N0:16.

С
124. Хуманизиран имуноглобулин съгласно претенция 123, където човешка лековерижна променлива област на рамката е от kappa лековерижна променлива област.
125. Хуманизиран имуноглобулин съгласно претенция 123, където човешка тежковерижна променлива област на рамката е от lgG1 тежковерижна променлива област.
126. Хуманизиран имуноглобулин съгласно претенция 123, където лековерижната променлива област на рамката е от човешка имуноглобулинова лека верига, притежаваща най-малко 70% идентичност на последователността с последователност на лека верига на 10D5 имуноглобулин.
127. Хуманизиран имуноглобулин съгласно претенция 123, където тежковерижната променлива област на рамката е от човешка имуноглобулинова тежка верига, притежаваща най-малко 70% идентичност на последователността с последователност на тежка верига на 10D5 имуноглобулин.

176
128. Хуманизиран имуноглобулин съгласно претенция 123, където хуманизирана лека верига включва определящи комплементарността области, които са идентични със съответни определящи комплементарността области на мишата 10D5 тежка верига, и хуманизираната тежка верига включва определящи комплементарността области, които са идентични със съответни определящи комплементарността области на мишата 10D5 тежка верига.
129. Хуманизирано антитяло съдържащо определящите комплементарността области (CDR1, CDR2 и CDR3) на 10D5 променлива лековерижна последователност, представена като SEQ ID N0:14.
130. Хуманизирано антитяло съдържащо определящите комплементарността области (CDR1, CDR2 и CDR3) на 10D5 променлива лековерижна последователност, представена като SEQ ID N0:16.
131. Хуманизирано антитяло, или негов антиген-свързващ фрагмент, което специфично се свързва с бета амилоиден пептид (Αβ), съдържащо променлива област, включваща определящи комплементарността области (CDRs), съответстващи на CDRs от мишото 10D5 антитяло.
132. Химерен имноглобулин, съдържащ последователност на променлива област, главно както е представен в SEQ ID N0:14 или SEQ ID N0:16, и последователности на константна област от човешки имуноглобулин.

\ΊΊ
133. Използване на хуманизиран имуноглобулин за профилактика или лечение на амилоидогенно заболяване у пациент, включващо въвеждане у пациент на ефективна дозировка хуманизиран имуноглобулин съгласно претенции 114-131.
134. Използване на хуманизиран имуноглобулин за профилактика или лечение на болест на Alzheimer у пациент, включващо въвеждане у пациент на ефективна дозировка на хуманизиран имуноглобулин съгласно претенции 114-131.
135. Използване, съгласно претенция 134, където ефективната дозировка на имуноглобулин е 1 mg/kg телесно тегло.
136. Използване, съгласно претенция 134, където ефективната дозировка на хуманизиран имуноглобулин е 10 mg/kg телесно тегло.
137. Фармацевтичен състав съдържащ имуноглобулин, съгласно претенции 114-131 и фармацевтичев носител.
138. Изолиран полипептид, съдържащ фрагмент от SEQ ID N0:2, подбран от групата състояща се от аминокиселини 24-39 на SEQ ID N0:2, аминокиселини 55-61 на SEQ ID N0:2 и аминокиселини 94-102 на SEQ ID N0:2.
139. Изолиран полипептид съдържащ аминокиселини 24-39 на SEQ ID N0:2 и аминокиселини 94-102 на SEQ ID N0:2.
140. Изолиран полипептид, съдържащ фрагмент от SEQ ID N0:4, подбран от група състояща се от аминокиселини 31-37 на SEQ

178

ID N0:4, аминокиселини 52-67 на SEQ ID N0:4 и аминокиселини 100-112 на SEQ ID N0:4.
141. Изолиран полипептид, съдържащ аминокиселини 31-37 на SEQ ID N0:4, аминокиселини 52-67 на SEQ ID N0:4 и аминокиселини 100-112 на SEQ ID N0:4.
142. Изолиран полипептид, съдържащ аминокиселинната последователност на SEQ ID N0:14.
143. Изолиран полипептид, съдържащ аминокиселинната последователност Ha SEQ ID N0:16.
144. Вариант на полипептид, съдържащ аминокиселинната последователност на SEQ ID N0:14, споменатият вариант, съдържащ най-малко една консервативна аминокиселинна замяна, където вариантът запазва способността специфично да свързва бета амилоиден пептид (Αβ) със свързващ афинитет най-малко 10'⁷ М.
145. Вариант на полипептид, съдържащ аминокиселинната последователност на SEQ ID N0:16, споменатият вариант, съдържащ най-малко една консервативна аминокиселинна замяна, където вариантът запазва способността директно специфично да се свързва с бета амилоиден пептид (Αβ) със свързващ афинитет най-малко 10~⁷ М.
146. Изолиран полипептид, съдържащ остатъци 1-112 на аминокиселинната последователност от SEQ ID N0:14 или съдържащ остатъци 1-123 на аминокиселинната последователност от SEQ ID N0:16.

179
147. Изолирана молекула нуклеинова киселина, кодираща леката верига, съгласно претенции 84, 86-88, 92, 94 и 96-98.
148. Изолирана молекула нуклеинова киселина, кодираща тежката верига, съгласно претенции 85, 89-91, 93 и 99-101.
149. Изолирана молекула нуклеинова киселина, кодираща полипептид, съгласно претенции 139-146.
150. Изолирана молекула нуклеинова киселина, кодираща имуноглобулин, съгласно претенции 114-132.
151. Изолирана молекула нуклеинова киселина, съдържаща нуклеотидната последователност от SEQ ID N0:13 или 15.
152. Вектор, съдържаш молекула нуклеинова киселина, съгласно претенции 147-151.
153. Клетка гостоприемник, съдържаща молекула нуклеинова киселина, съгласно претенции 147-151.
154. Метод за получаване на антитяло, или негов фрагмент, характеризиращ се с това, че се култивира клетка гостоприемник, съгласно претенция 153, в такива условия, че антитялото или фрагментът се получава и се изолира споменатото антитяло от клетката гостоприемник или културата.
155. Метод за получаване на антитяло, или негов фрагмент, споменатият метод характеризиращ се с това, че се култивира клетка гостоприемник, която експресира молекула нуклеинова киселина, кодираща споменатото антитяло или фрагмент в

180 условия такива, че се получава антитялото или фрагмента и се изолира споменатото антитяло от клетката гостоприемник или култура, където споменатото или фрагмент включва аминокиселини 24-39 на SEQ ID N0:2, аминокиселини 55-61 на SEQ ID N0:2 и аминокиселини 94-102 на SEQ ID N0:2.
156. Метод за получаване на антитяло, или негов фрагмент, споменатият метод се характеризира с това, че се култивира клетка гостоприемник, която експресира молекула нуклеинова киселина, кодираща споменатото антитяло или фрагмент в условия, такива че се получава антитялото или фрагмента и се изолира споменатото антитяло от клетката гостоприемник или култура, където споменатото антитяло или фрагмент съдържа аминокиселини 31-37 от SEQ ID N0:4, аминокиселини 52-67 от SEQ ID N0:4 и аминокиселини 100-112 от SEQ ID N0:4.
157. Метод за идентифициране остатъци податливи на замяна в променлива област на рамката на хуманизиран 10D5 имуноглобулин, характеризиращ се с това, че се моделира тридимензионална структура на 10D5 променлива област, въз основа на решена имуноглобулинова структура и анализиране на споменатия модел за остатъци, способни да повлияват конформация или функция на 10D5 имуноглобулин променлива област, така че са идентифициране остатъци податливи на замяна.
158. Използване последователност на променлива област, представена като SEQ ID N0:14 или SEQ ID N0:16, или част от нея, при създаване три-димензионален образ на 10D5 имуноглобулин, 10D5 имуноглобулинова верига или домен от нея.