SK288209B6 - Humanizované protilátky, ktoré spoznajú beta-amyloidový peptid, izolovaná nukleová kyselina, ktorá ich kóduje, vektor, izolovaná hostiteľská bunka, farmaceutická kompozícia s ich obsahom a spôsob ich prípravy - Google Patents

Humanizované protilátky, ktoré spoznajú beta-amyloidový peptid, izolovaná nukleová kyselina, ktorá ich kóduje, vektor, izolovaná hostiteľská bunka, farmaceutická kompozícia s ich obsahom a spôsob ich prípravy Download PDF

Info

Publication number
SK288209B6
SK288209B6 SK850-2003A SK8502003A SK288209B6 SK 288209 B6 SK288209 B6 SK 288209B6 SK 8502003 A SK8502003 A SK 8502003A SK 288209 B6 SK288209 B6 SK 288209B6
Authority
SK
Slovakia
Prior art keywords
antibody
antibodies
immunoglobulin
residues
human
Prior art date
Application number
SK850-2003A
Other languages
English (en)
Other versions
SK8502003A3 (en
Inventor
Guriq Basi
Jose Saldanha
Original Assignee
Janssen Alzheimer Immunotherapy
Wyeth Llc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=22953834&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=SK288209(B6) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Janssen Alzheimer Immunotherapy, Wyeth Llc filed Critical Janssen Alzheimer Immunotherapy
Publication of SK8502003A3 publication Critical patent/SK8502003A3/sk
Publication of SK288209B6 publication Critical patent/SK288209B6/sk

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/1703—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • A61K38/1709—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/193—Colony stimulating factors [CSF]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0007—Nervous system antigens; Prions
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • A61P25/16—Anti-Parkinson drugs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4711—Alzheimer's disease; Amyloid plaque core protein
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/53—DNA (RNA) vaccination
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55505—Inorganic adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55566—Emulsions, e.g. Freund's adjuvant, MF59
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55572—Lipopolysaccharides; Lipid A; Monophosphoryl lipid A
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55577—Saponins; Quil A; QS21; ISCOMS
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/567—Framework region [FR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/77—Internalization into the cell
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Psychology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Marine Sciences & Fisheries (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Psychiatry (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

Opísaný je humanizovaný imunoglobulín, ktorý sa špecificky viaže na beta-amyloidový peptid (A?), a jeho časť viažuca antigén. Sú určené na prípravu liečiva na prevenciu alebo liečenie amyloidogénneho ochorenia, najmä Alzheimerovej choroby.

Description

Oblasť techniky
Predložený vynález sa týka látok a spôsobov liečenia ochorení súvisiacich s amyloidovými depozitmi Αβ v mozgu pacienta.
Doterajší stav techniky
Alzheimerova choroba (AD) je progresívna choroba, ktorá vyústi do senilnej demencie. Pozri všeobecne SELKOE, TINS 16: 403 (1993); Hardy a kol., WO 92/13069; Selkoe, J. Neuropathol. Exp. Neurol. 53: 438 (1994); Duff a kol., Náture 373: 476 (1995); Games a kol., Náture 373: 523 (1995). V podstate táto choroba patrí do dvoch kategórií: s oneskoreným nástupom, ktorá sa vyskytuje v staršom veku (65 rokov a viac), a so včasným nástupom, ktorá sa vyvinie podstatne skôr pred obdobím senility, t. j. vo veku medzi 35 a 60 rokov. Pri oboch typoch ochorenia je patológia rovnaká, ale abnormality bývajú ťažšie a rozsiahlejšie v prípadoch, ktoré začínajú v skoršom veku. Chorobu charakterizujú prinajmenšom dva typy lézií v mozgu, neurofibrilárne spletence a senilné plaky. Neurofibrilárne spletence sú intraceluláme ložiská mikrotubúl súvisiace s tau-proteínom pozostávajúce z dvoch vlákien navzájom spletených v pároch. Senilné plaky (t. j. amyloidné plaky) sú oblasti neorganizovanej siete vlákien (neuropilu) do veľkosti v priemere až 150 pm s extracelulámymi ložiskami amyloidu v strede, ktoré sú viditeľné mikroskopickou analýzou rezov mozgového tkaniva. Akumulácia amyloidových plakov v mozgu sa tiež vyskytuje pri Downovom syndróme a pri iných kognitívnych poruchách.
Hlavnou zložkou plakov je peptid označovaný ako Αβ alebo β-amyloidový peptid. Αβ peptid je 4 kDa interný fragment aminokyselín 39 - 43 väčšieho transmembránového glykoproteínu pomenovaného proteín s názvom amyloidový prekurzorový proteín (APP). Ako dôsledok proteolytického pôsobenia rozličných enzýmov sekretázy na APP sa AP spočiatku nachádza v krátkej forme, s dĺžkou 40 aminokyselín, a v dlhej forme s dĺžkou v rozsahu 42 - 43 aminokyselín. Časť hydrofóbnej transmembránovej domény APP sa nachádza na karboxylovom konci Αβ a môže vysvetľovať schopnosť Αβ zhlukovať sa do plakov, najmä v prípade dlhej formy. Akumulácia amyloidových plakov v mozgu nakoniec vedie k smrti nervových buniek. Fyzické symptómy spojené s týmto typom nervovej degenerácie charakterizujú Alzheimerovu chorobu.
Niektoré mutácie v APP proteíne sa dávali do súvisu s prítomnosťou Alzheimerovej choroby. Pozri napr. Goate a kol., Náture 349: 704 (1991) (valín717 za izoleucín); Chartier Harlan a kol., Náture 353: 844 (1991) (valín717 za glycín); Murrell a kol., Science 254: 97 (1991) (valín717 za fenylalanín); Mullan a kol., Náture Genet. 1: 345 (1992) (dvojitá mutácia meniaca lyzín595-metionín596 za asparagín595-leucín596). Predpokladá sa, že takéto mutácie spôsobujú Alzheimerovu chorobu zvýšením alebo zmenou premeny APP na Αβ, najmä premenou APP na vyššie množstvá dlhej formy Αβ (t. j. Αβ-42 a Αβ-43). Predpokladá sa, že mutácie v iných génoch, ako sú presenilínové gény, PSI a PS2, nepriamo ovplyvňujú premenu APP tak, že sa zvyšujú množstvá dlhej formy Αβ (pozri Hardy, TINS2W. 154 (1997)).
Na určenie významu amyloidných plakov pri Alzheimerovej choroby sa úspešne použili myšie modely (Games a kol., pozri vyššie, Johnson-Wood a kol., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 1550 (1997)). Najmä v prípade, keď sa PDAPP transgenickým myšiam (ktoré exprimujú mutantnú formu ľudského APP a vyvinie sa u nich Alzheimerova choroba v mladom veku) vstrekne dlhá forma Αβ, prejavujú spomalenie progresie Alzheimera a zvyšujú titre protilátok na Αβ peptid (Schenk a kol., Náture 400, 173 (1999)). Vyššie diskutované pozorovania naznačujú, že Αβ, najmä v jeho dlhej forme, je príčinným faktorom Alzheimerovej choroby.
McMichael v EP 526 511 navrhuje podávanie homeopatických dávok (menších než alebo rovných 10'2 mg/deň) Αβ pacientom so stanovenou diagnózou AD. U bežného človeka s asi 5 litrami plazmy sa očakáva, že dokonca aj horný limit tejto dávky vytvorí koncentráciu nie väčšiu než 2 pg/ml. Normálna koncentrácia Αβ v ľudskej plazme je bežne v rozsahu 50 - 200 pg/ml (Seubert a kol., Náture 359: 325 (1992)). Pretože dávka navrhnutá v EP 526 511 by sotva zmenila hladinu endogénne cirkulujúceho Αβ a pretože EP 526 511 neodporúča použiť adjuvant ako imunostimulant, zdá sa nepravdepodobným, že by to malo nejaký terapeutický účinok.
Existuje preto potreba nových terapií a Činidiel na liečenie Alzheimerovej choroby, najmä terapií a činidiel, ktoré môžu mať terapeutický účinok vo fyziologických (napr. netoxických) dávkach.
Podstata vynálezu
Tento vynález predstavuje nové imunologické činidlá, najmä terapeutické protilátkové činidlá na prevenciu a liečbu amyloidogénnej choroby (napr. Alzheimerovej choroby). Vynález vychádza aspoň sčasti z identifikácie a charakterizácie dvoch monoklonálnych protilátok, ktoré sa špecificky viažu na Αβ peptid a sú účinné pri znížení množstva plakov a/alebo pri zmiernení neuritickej dystrofie spojenej s amyloidogénnymi poruchami. Štruktúrna a funkčná analýza týchto protilátok vedie k návrhu rozličných humanizovaných protilátok na profylaktické a/alebo terapeutické použitie. Vynález predstavuje najmä humanizáciu variabilných oblastí týchto protilátok, a preto poskytuje humanizovaný imunoglobulín alebo reťazce protilátok, neporušené humanizované imunoglobulíny alebo protilátky a funkčný imunoglobulín alebo fragmenty protilátok, najmä fragmenty viažuce antigén, opisovaných protilátok.
Opisujú sa tiež polypeptidy obsahujúce komplementaritu určujúce oblasti opisovaných monoklonálnych protilátok, ako sú polynukleotidové činidlá, vektory a hostitelia vhodní na zakódovanie uvedených polypeptidov.
Opisujú sa metódy liečby amyloidogénnych ochorení alebo porúch (napr. Alzheimerovej choroby), ako sú farmaceutické prípravky a súpravy na použitie v takýchto aplikáciách.
Vynález tiež predstavuje metódy identifikácie zvyškov v opisovaných monoklonálnych protilátkach, ktoré sú dôležité pre vhodnú imunologickú funkciu, a na identifikáciu zvyškov, ktoré sú vhodné na substitúciu pri konštrukcii humanizovaných protilátok majúcich zlepšenú schopnosť väzby a/alebo zníženú imunogénnosť, keď sa používajú ako terapeutické činidlá.
Podrobný opis vynálezu
Tento vynález predstavuje nové imunologické činidlá a metódy prevencie a liečby Alzheimerovej choroby alebo iných amyloidogénnych ochorení. Vynález je založený aspoň sčasti na charakterizácii monoklonálneho imunoglobulínu, 3D6, účinného pri väzbe beta-amyloidového proteínu (Αβ) (napr. väzbe rozpustného a/alebo agregovaného Αβ), sprostredkovaní fagocytózy (napr. agregovaného Αβ), znížení množstva plakov a/alebo pri zmiernení neuritickej dystrofie (napr. u pacienta). Vynález je ďalej založený na určení a štrukturálnej charakterizácii primárnej a sekundárnej štruktúry variabilných ľahkých a ťažkých reťazcov tohto imunoglobulínu a identifikácii zvyškov dôležitých pre aktivitu a imunogénnosť.
Predstavujú sa tu imunoglobulíny, ktoré obsahujú variabilný ľahký a/alebo variabilný ťažký reťazec opísaných výhodných monoklonálnych imunoglobulínov. Predstavujú sa tu výhodné imunoglobulíny, napr. terapeutické imunoglobulíny, ktoré obsahujú humanizovaný variabilný ľahký a/alebo humanizovaný variabilný ťažký reťazec. Výhodné variabilné ľahké a/alebo variabilné ťažké reťazce obsahujú komplementaritu určujúcu oblasť (CDR) z monoklonálneho imunoglobulínu (napr. donomý imunoglobulín) a variabilné rámcové oblasti v zásade z ľudského akceptomého imunoglobulínu. Výraz v zásade z ľudského akceptomého imunoglobulínu znamená, že väčšina zvyškov alebo kľúčové zvyšky rámcovej oblasti sú z ľudskej akceptomej sekvencie, ktorá však umožňuje substitúciu zvyškov v určitých polohách zvolených tak, aby sa zlepšila aktivita humanizovaného imunoglobulínu (napr. zlepšila aktivita tak, že lepšie napodobňuje aktivitu donomého imunoglobulínu), alebo zvolených tak, aby znižovali imunogénnosť humanizovaného imunoglobulínu.
V jednom praktickom uskutočnení predstavuje vynález ľahký alebo ťažký reťazec humanizovaného imunoglobulínu, ktorý obsahuje 3D6 variabilnú oblasť komplementaritu určujúcich oblastí (CDR) (t. j. obsahuje jednu, dve alebo tri CDR zo sekvencie variabilnej oblasti ľahkého reťazca uvedenej ako SEQ ID NO: 2 alebo obsahuje jednu, dve alebo tri CDR zo sekvencie variabilnej oblasti ťažkého reťazca uvedenej ako SEQ ID NO: 4) a obsahuje variabilnú rámcovú oblasť v zásade zo sekvencie ľahkého alebo ťažkého reťazca ľudského akceptomého imunoglobulínu za predpokladu, že aspoň jeden zvyšok z rámcovej oblasti je spätne zmutovaný na zodpovedajúci myší zvyšok, pričom uvedená spätná mutácia v zásade neovplyvňuje schopnosť reťazca smerovať väzbu Αβ.
V inom praktickom uskutočnení predstavuje vynález ľahký alebo ťažký reťazec humanizovaného imunoglobulínu, ktorý obsahuje 3D6 variabilnú oblasť komplementaritu určujúcich oblastí (CDR) (t. j. obsahuje jednu, dve alebo tri CDR zo sekvencie variabilnej oblasti ľahkého reťazca uvedenej ako SEQ ID NO: 2 a/alebo obsahuje jednu, dve alebo tri CDR zo sekvencie variabilnej oblasti ťažkého reťazca uvedenej ako SEQ ID NO:4) a obsahuje variabilnú rámcovú oblasť v zásade zo sekvencie ľahkého alebo ťažkého reťazca ľudského akceptomého imunoglobulínu za predpokladu, že aspoň jeden zvyšok z rámcovej oblasti je substituovaný zodpovedajúcim aminokyselinovým zvyškom z myšej 3D6 sekvencie variabilnej oblasti ľahkého alebo ťažkého reťazca, pričom zvyšok rámcovej oblasti je vybratý zo skupiny pozostávajúcej (a) zo zvyšku, ktorý nekovalentne viaže priamo antigén; (b) zo zvyšku susediaceho s CDR; (c) z CDR-interagujúceho zvyšku (napr. identifikovaného modelovaním ľahkého alebo ťažkého reťazca na vyriešenej štruktúre homológneho známeho imunoglobulínového reťazca); a (d) zo zvyšku nachádzajúceho sa na rozhraní VL-VH.
V inom praktickom uskutočnení predstavuje vynález ľahký alebo ťažký reťazec humanizovaného imunoglobulínu, ktorý obsahuje 3D6 variabilnú oblasť CDR a variabilné rámcové oblasti zo sekvencie ľahkého alebo ťažkého reťazca ľudského akceptomého imunoglobulínu za predpokladu, že aspoň jeden zvyšok z rámcovej oblasti je substituovaný zodpovedajúcim aminokyselinovým zvyškom z myšej 3D6 sekvencie variabilnej oblasti ľahkého alebo ťažkého reťazca, pričom zvyšok rámcovej oblasti je zvyškom schopným ovplyvňovať konformáciu alebo fúnkciu variabilnej oblasti ľahkého reťazca, ktorá sa identifikuje analýzou trojrozmerného modelu variabilnej oblasti, napríklad zvyškom schopným interakcie s antigénom, zvyškom blízkym k väzbovému miestu antigénu, zvyškom spôsobilým interakcie s CDR, zvyškom susediacim s CDR, zvyškom do vzdialenosti 6 Á od CDR zvyšku, kánonickým zvyškom, zvyškom vernierovej zóny, medzireťazcovým zvyškom, neobvyklým zvyškom alebo zvyškom glykozylačného miesta na povrchu štruktúrneho modelu.
V inom praktickom uskutočnení predstavuje vynález ľahký reťazec humanizovaného imunoglobulínu, ktorý obsahuje CDR 3D6 variabilnej oblasti (napr. z 3D6 sekvencie variabilnej oblasti ľahkého reťazca uvedenej ako SEQ ID NO: 2) a obsahuje variabilnú rámcovú oblasť ľudského akceptomého imunoglobulínu za predpokladu, že aspoň jeden zvyšok z rámcovej oblasti vybratý zo skupiny pozostávajúcej z Ll, L2, L36 a L46 (Kabatovo číslovanie) je substituovaný zodpovedajúcim aminokyselinovým zvyškom z myšej 3D6 sekvencie variabilnej oblasti ľahkého reťazca. V inom praktickom uskutočnení predstavuje vynález ťažký reťazec humanizovaného imunoglobulínu, ktorý obsahuje CDR 3D6 variabilnej oblasti (napr. z 3D6 sekvencie variabilnej oblasti ťažkého reťazca uvedenej ako SEQ ID NO: 4) a obsahuje variabilnú rámcovú oblasť ľudského akceptomého imunoglobulínu za predpokladu, že aspoň jeden zvyšok z rámcovej oblasti vybratý zo skupiny pozostávajúcej z H49, H93 a H94 (Kabatovo číslovanie) je substituovaný zodpovedajúcim aminokyselinovým zvyškom z myšej 3D6 sekvencie variabilnej oblasti ľahkého reťazca.
Výhodné ľahké reťazce obsahujú rámcové oblasti kapa II podtypu kapa II (Kabatova konvencia), napríklad rámcové oblasti z akceptomého imunoglobulínu Kabat ID 019230, Kabat ID005131, Kabat ID 005058, Kabat ID 005057, Kabat ID 005059, Kabat ID U21040 a Kabat ID U41645. Výhodné ťažké reťazce obsahujú rámcové oblasti podtypu III (Kabatova konvencia), napríklad rámcové oblasti z akceptomého imunoglobulínu Kabat ID 045919, Kabat ID 000459, Kabat ID 000553, Kabat ID 000386 a Kabat ID M23691.
V inom praktickom uskutočnení vynález predstavuje, okrem opísaných substitúcií, substitúciu aspoň jedného zriedkavého zvyšku ľudskej rámcovej oblasti. Zriedkavý zvyšok sa môže napríklad substituovať aminokyselinovým zvyškom, ktorý je obvyklý pre ľudské sekvencie variabilného reťazca v tejto polohe. Zriedkavý zvyšok sa môže tiež substituovať zodpovedajúcim aminokyselinovým zvyškom z homológnej zárodočnej sekvencie variabilného reťazca (napr. zriedkavý zvyšok rámcovej oblasti ľahkého reťazca sa môže substituovať zodpovedajúcim zárodočným zvyškom z Al, A17, A18, A2 alebo A19 zárodočnej imunoglobulínovej sekvencie alebo sa môže zriedkavý zvyšok rámcovej oblasti ťažkého reťazca substituovať zodpovedajúcim zárodočným zvyškom z VH3-48, VH3-23, VH3-7, VH3-21 alebo VH3-11 zárodočnej imunoglobulínovej sekvencie).
V inom praktickom uskutočnení predstavuje vynález humanizovaný imunoglobulín, ktorý obsahuje ľahký reťazec a ťažký reťazec, ako je opísané vyššie, alebo fragment viažuci antigén uvedeného imunoglobulínu. Vo vzorovom praktickom uskutočnení sa humanizovaný imunoglobulín viaže (napr. špecificky viaže) na beta-amyloidový peptid (Αβ) s väzbovou afinitou aspoň ΙΟ7 M'1, 108 M'1 alebo ΙΟ9 M'1. V inom praktickom uskutočnení imunoglobulín alebo fragment viažuci antigén obsahuje ťažký reťazec s izotypom γΐ. V inom praktickom uskutočnení imunoglobulín alebo fragment viažuci antigén sa viaže (napr. špecificky viaže) na rozpustný beta-amyloidový peptid (Αβ) a agregovaný Αβ. V inom praktickom uskutočnení imunoglobulín alebo fragment viažuci antigén sprostredkuje fagocytózu (napr. indukuje fagocytózu) beta-amyloidového peptidu (Αβ). V ešte ďalšom praktickom uskutočnení imunoglobulín alebo fragment viažuci antigén prechádza u pacienta cez hematoencefalitickú bariéru. V ešte ďalšom praktickom uskutočnení znižuje imunoglobulín alebo fragment viažuci antigén tvorbu beta-amyloidového peptidu (Αβ) a neuritickú dystrofiu u pacienta.
V inom praktickom uskutočnení prestavuje vynález chimérické imunoglobulíny, ktoré obsahujú 3D6 variabilné oblasti (napr. sekvencie variabilných oblastí uvedených ako SEQ ID NO: 2 alebo SEQ ID NO: 4). V ešte ďalšom praktickom uskutočnení predstavuje vynález imunoglobulín alebo jeho fragment viažuci antigén, ktorý obsahuje variabilnú oblasť ťažkého reťazca uvedenú ako SEQ ID NO: 8 a variabilnú oblasť ťažkého reťazca uvedenú ako SEQ ID NO: 5. V ešte ďalšom praktickom uskutočnení predstavuje vynález imunoglobulín alebo jeho fragment viažuci antigén, ktorý obsahuje variabilnú oblasť ťažkého reťazca uvedenú ako SEQ ID NO: 12 a variabilnú oblasť ľahkého reťazca uvedenú ako SEQ ID NO: 11. V ešte inom praktickom uskutočnení imunoglobulín alebo jeho fragment viažuci antigén ďalej obsahuje konštantné oblasti z IgGl.
Opísané imunoglobulíny sú predovšetkým vhodné na použitie v liečebných metódach zameraných na prevenciu a liečbu amyloidogénnych ochorení. V jednom praktickom uskutočnení predstavuje vynález spôsob prevencie a liečby amyloidogénneho ochorenia (napr. Alzheimerovej choroby), ktorý zahŕňa podanie účinnej dávky humanizovaného imunoglobulínu pacientovi opísaným spôsobom. V inom praktickom uskutočnení predstavuje vynález farmaceutické prípravky, ktoré obsahujú opísaný humanizovaný imunoglobulín a farmaceutický nosič. Tiež sa tu opisujú izolované molekuly nukleových kyselín, vektory a hostiteľské bunky na prípravu imunoglobulínov alebo tu opísaných imunoglobulínových fragmentov alebo reťazcov, ako aj metódy na prípravu uvedených imunoglobulínov, imunoglobulínových fragmentov alebo imunoglobulínových reťazcov.
Tento vynález ďalej predstavuje spôsob identifikácie zvyškov 3D6 vhodných na substitúciu pri príprave humanizovaného 3D6imunoglobulínu. Napríklad spôsob identifikácie zvyškov variabilnej rámcovej oblasti vhodnej na substitúciu zahŕňa modelovanie trojrozmernej štruktúry variabilnej oblasti 3D6 na vyriešenej štruktúre homológneho imunoglobulínu a analýzu uvedeného modelu na zvyšky schopné ovplyvňovať kon4
SK 288209 Β6 formáciu alebo funkciu 3D6 variabilných oblastí imunoglobulínu tak, že sa identifikujú zvyšky vhodné na substitúciu. Vynález ďalej predstavuje použitie sekvencie variabilnej oblasti uvedenej ako SEQ ID NO: 2 alebo SEQ ID NO: 4 alebo jej nejakej časti v príprave trojrozmerného obrazu 3D6 imunoglobulínu, 3D6 imunoglobulínového reťazca alebo jeho domény.
Pred opisom tohto vynálezu môže byť na jeho pochopenie užitočné uviesť definície určitých výrazov, ktoré sa budú v ďalšom používať.
Výraz imunoglobulin alebo protilátka (ktoré sa tu používajú zameniteľné) označuje proteín viažuci antigén, ktorý má základnú štvorpolypeptidovú reťazcovú štruktúru pozostávajúcu z dvoch ťažkých a z dvoch ľahkých reťazcov, pričom uvedené reťazce sú stabilizované napríklad medzireťazcovými disulfidickými väzbami, ktoré majú schopnosť špecificky viazať antigén. Ťažké aj ľahké reťazce sú poskladané do domén. Výraz doména označuje globulámu oblasť ťažkého alebo ľahkého reťazca polypeptidu obsahujúcu peptidové slučky (napr. obsahujúcu 3 až 4 peptidové slučky) stabilizované napríklad ako β-skladaný list alebo medzireťazcovou disulfidickou väzbou. Domény sú ďalej označované ako konštantné a variabilné, čo je založené na relatívne malej premenlivosti sekvencií v doménach rozličných prvkov triedy v prípade konštantnej domény alebo významnej premenlivosti v doménach rozličných prvkov triedy v prípade variabilnej domény. Konštantné domény na ľahkom reťazci sa označujú zameniteľné ako konštantné oblasti ľahkého reťazca, konštantné domény ľahkého reťazca, CL oblasti alebo CL domény. Konštantné domény na ťažkom reťazci sa označujú zameniteľné ako konštantné oblasti ťažkého reťazca, konštantné domény ťažkého reťazca, CH oblasti alebo CH domény. Variabilné oblasti na ľahkom reťazci sa označujú zameniteľné ako variabilné oblasti ľahkého reťazca, variabilné domény ľahkého reťazca, VL oblasti alebo VL domény. Variabilné oblasti na ťažkom reťazci sa označujú zameniteľné ako variabilné oblasti ťažkého reťazca, variabilné domény ťažkého reťazca, CH oblasti alebo CH domény.
Výraz oblasť označuje časť alebo diel reťazca protilátky a obsahuje tu definované konštantné a variabilné domény, ako aj samostatné diely a časti uvedených domén. Napríklad variabilné domény alebo oblasti ľahkého reťazca obsahujú komplementaritu určujúce oblasti alebo CDR povkladané medzi definovanými rámcovými oblasťami alebo FR.
Imunoglobulíny alebo protilátky môžu existovať v monomémej alebo v polymérnej forme. Výraz fragment viažuci antigén označuje polypeptidový fragment imunoglobulínu alebo protilátky, ktorý viaže antigén alebo konkuruje intaktnej protilátke (t. j. intaktnej protilátke, z ktorej boli odvodené) pri väzbe antigénu (t. j. špecifickej väzbe). Výraz konformácia označuje terciámu štruktúru proteínu alebo polypeptidu (napr. protilátky, protilátkového reťazca, jej domény alebo oblasti). Napríklad spojenie konformácia ľahkého (alebo ťažkého) reťazca označuje terciámu štruktúru variabilnej oblasti ľahkého (alebo ťažkého) reťazca a spojenie konformácia protilátky alebo konformácia fragmentu protilátky označuje terciámu štruktúru protilátky alebo jej fragmentu.
Špecifická väzba protilátky znamená, že protilátka prejavuje zjavnú afinitu k antigénu alebo preferovanému epitopu a výhodne neprejavuje významnú krížovú reaktivitu. Zjavná alebo preferovaná väzba je väzba s afinitou aspoň ΙΟ6, ΙΟ7, ΙΟ8, 109 M'1 alebo 1010 M’1. Afinity väčšie ako 107 M'1, výhodne väčšie ako 108 M' *, sú výhodnejšie. Hodnoty medzi týmito hodnotami tiež patria do oblasti tohto vynálezu a výhodná väzbová afinita sa môže vyjadriť ako rozsah afinít, napríklad 106 až 1010 M'1, výhodne 107 až 1010 M'1, výhodnejšie 108 až 1010 M'1. Protilátka, ktorá neprejavuje významnú krížovú reaktivitu, je taká, ktorá sa nebude zjavne viazať na nežiaducu entitu (napr. na nežiaducu bielkovinnú entitu). Napríklad protilátka, ktorá sa špecificky viaže na Αβ, sa bude zjavne viazať na Αβ, ale nebude významne reagovať s ne-Αβ proteínmi alebo peptidmi (napr. s ne-Αβ proteínmi alebo peptidmi nachádzajúcimi sa v plakoch). Protilátka špecifická na preferovaný epitop nebude napríklad krížovo reagovať so vzdialenými epitopmi na rovnakom proteíne alebo peptide. Špecifická väzba sa môže stanoviť akýmkoľvek spôsobom uznávaným odborníkmi v problematike na stanovenie takejto väzby. Špecifická väzba sa výhodne stanovuje Scatchardovou analýzou a/alebo kompetičnými väzbovými skúškami.
Štiepením intaktných imunoglobulínov. Väzbové fragmenty zahŕňajú Fab, Fab', F(ab')2, Fabc, Fv, jednoduché reťazce a protilátky s jednoduchým reťazcom. Pod iným ako bišpecifickým alebo bifunkčným imunoglobulínom alebo protilátkou sa rozumie imunoglobulin alebo protilátka, ktorá má všetky jej väzbové miesta identické. Bišpecifická alebo bifunkčná protilátka je umelá hybridná protilátka, ktorá má dva rozličné páry ťažkého/ľahkého reťazca a dve rozličné väzbové miesta. Bišpecifické protilátky sa môžu pripraviť rôznymi metódami zahŕňajúcimi fuziu hybridómov alebo prepojenie Fab' fragmentov. Pozri napr. Songsivilai a Lachmann, Clin. Exp. Immunol. 79: 315-321 (1990); Kostelny a kol. J. Immunol. 148, 1547- 1553 (1992).
Výraz humanizovaný imunoglobulin alebo humanizovaná protilátka označuje imunoglobulin alebo protilátku, ktorá obsahuje aspoň jeden reťazec imunoglobulínu alebo protilátky (t. j. aspoň jeden humanizovaný ľahký alebo ťažký reťazec). Výraz humanizovaný reťazec imunoglobulínu alebo humanizovaný reťazec protilátky (t. j. ľahký reťazec humanizovaného imunoglobulínu alebo ťažký reťazec humanizovaného imunoglobulínu) označujú reťazec imunoglobulínu alebo protilátky (t. j. ľahký resp. ťažký reťazec), ktorá má variabilnú oblasť, ktorá obsahuje variabilnú rámcovú oblasť v zásade z ľudského imunoglobulínu alebo protilátky a
SK 288209 Β6 komplementaritu určujúce oblasti (CDR) (napr. aspoň jednu CDR, výhodne dve CDR, výhodnejšie tri CDR) v zásade z neľudského imunoglobulínu alebo protilátky, a ďalej obsahuje konštantné oblasti (napr. aspoň jednu konštantnú oblasť alebo jej časť v prípade ľahkého reťazca, a výhodne tri konštantné oblasti v prípade ťažkého reťazca). Výraz humanizovaná variabilná oblasť (napr. humanizovaná variabilná oblasť ľahkého reťazca alebo humanizovaná variabilná oblasť ťažkého reťazca) označuje variabilnú oblasť, ktorá obsahuje variabilnú rámcovú oblasť v zásade z ľudského imunoglobulínu alebo protilátky a komplementaritu určujúce oblasti (CDR) v zásade z neľudského imunoglobulínu alebo protilátky.
Spojenie v zásade z ľudského imunoglobulínu alebo protilátky alebo v zásade ľudský znamená, že keď sa sekvencia zorientuje na porovnanie s amino sekvenciou ľudského imunoglobulínu alebo protilátky, táto oblasť vykazuje aspoň 80 - 90 %, výhodne 90 - 95 %, výhodnejšie 95 - 99 % identitu (t. j. lokálnu identitu sekvencie) so sekvenciou ľudskej rámcovej oblasti alebo konštantnej oblasti, čo dovoľuje napríklad konzervatívne substitúcie, substitúcie konsenzuálnej sekvencie, substitúcie zárodočnej línie, spätné mutácie a podobne. Zavedenie konzervatívnych substitúcií, substitúcií konsenzuálnych sekvencií, substitúcií zárodočných línií, spätných mutácií a podobne sa často označuje ako optimalizácia humanizovanej protilátky alebo reťazca. Spojenie v zásade z neľudského imunoglobulínu alebo protilátky alebo v zásade neľudského znamená, že sekvencia imunoglobulínu alebo protilátky je aspoň na 80 - 95 %, výhodne na 90 - 95 %, výhodnejšie na 96 %, 97 %, 98 % alebo 99 % identická zo sekvenciou neľudského organizmu, napr. iného cicavca ako človeka.
Všetky oblasti alebo zvyšky humanizovaného imunoglobulínu alebo protilátky, alebo reťazca humanizovaného imunoglobulínu, alebo protilátky, s možnou výnimkou CDR, sú teda v zásade identické s zodpovedajúcimi oblasťami alebo zvyškami jednej alebo viacerých natívnych ľudských imunoglobulínových sekvencií. Výraz zodpovedajúca oblasť alebo zodpovedajúci zvyšok označuje oblasť alebo zvyšok na druhej sekvencií aminokyselín alebo nukleotidov, ktorá obsadzuje rovnakú (t. j. ekvivalentnú) polohu ako oblasť alebo zvyšok na prvej sekvencií aminokyselín alebo nukleotidov, keď sa prvá a druhá sekvencia optimálne orientujú proti sebe na účely porovnania.
Výrazy humanizovaný imunoglobulín alebo humanizovaná protilátka nie sú určené na to, aby zahŕňali chimérické imunoglobulíny alebo protilátky, ako sú definované nižšie. Hoci humanizované imunoglobulíny alebo protilátky sú chimérické svojou konštrukciou (t. j. obsahujú oblasti proteínu z viac ako jedného druhu), obsahujú dodatočné znaky (t. j. variabilné oblasti obsahujúce donomé CDR zvyšky a zvyšky akceptomých rámcových oblastí), ktoré sa nenachádzajú v definovaných chimérických imunoglobulínoch alebo protilátkach.
Výraz významná identita znamená, že dve sekvencie polypeptidov, keď sa optimálne porovnajú, ako napríklad programami GAP alebo BESTFIT pomocou bežných gap váh, vykazujú aspoň 50 - 60 % identitu sekvencií, výhodne 60 - 70 % identitu sekvencií, výhodnejšie 70 - 80 % identitu sekvencií, výhodnejšie aspoň 80 - 90 % identitu, ešte výhodnejšie aspoň 90 - 95 % identitu a ešte výhodnejšie aspoň 95 % identitu sekvencií alebo viac (napr. 99 % identitu sekvencií alebo viac). Výraz značná identita znamená, že dve sekvencie polypeptidov, keď sa optimálne porovnajú, ako napríklad programami GAP alebo BESTFIT pomocou bežných gap váh, vykazujú aspoň 80 - 90 % identitu sekvencií, výhodne 90 - 95 % identitu sekvencií a výhodnejšie aspoň 95 % identitu sekvencií alebo viac (napr. 99 % identitu sekvencií alebo viac). Pri porovnaní sekvencií vystupuje jedna sekvencia ako referenčná sekvencia, s ktorou sa skúšané sekvencie porovnávajú. Pri použití algoritmu porovnávania sekvencií sa skúšaná a referenčná sekvencia vloží do počítača, ak je treba, vytvoria sa súradnice podsekvencií a vytvoria sa parametre programu sekvenčného algoritmu. Algoritmus porovnania sekvencií potom vypočíta identitu sekvencií v percentách pre skúšanú sekvenciu (sekvencie) voči referenčnej sekvencií založenú na vytvorených parametroch programu. Výrazy významná identita sekvencií a značná identita sekvencií sa tu používajú zameniteľné.
Optimálne zorientovanie sekvencií pre porovnanie sa môže vykonať napr. algoritmom lokálnej homológie od Smitha a Watermana, Adv. Appl. Math. 2: 482 (1981), algoritmom na homológne zorientovanie od Needlemana a Wunscha, J. Mol. Biol. 48: 443 (1970), metódou hľadania podobnosti od Pearsona a Lipmana, Pro. Natl. Acad. Sci. USA 85: 2444 (1988), počítačovými implementáciami týchto algoritmov (GAP, BESTFIT, FASTA a TFASTA vo Wisconsin Genetics Software Package, Genetic Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI) alebo vizuálnym ohodnotením (pozri vo všeobecnosti Ausubel a kol., Current Protocols in Molecular Biology). Jedným z príkladom algoritmov, ktorý je vhodný na stanovenie percentuálnej identity sekvencií a podobnosti sekvencií, je algoritmus BLAST, ktorý je opísaný v Altschul a kol., J. Mol. Biol. 215: 403 (1990). Softvér na vykonanie BLAST analýz je verejne dostupný cez National Center for Biotechnology Information (Národné centrum pre biotechnologické informácie) (verejne dostupné cez intemetový server NCBI Národného inštitútu zdravia). Na porovnanie sekvencií sa môžu spravidla použiť obvyklé parametre programu, aj keď je tiež možné použiť upravené parametre. Pre sekvencie aminokyselín používa BLAST program ako obvyklé parametre dĺžku slova (W) 3, očakávanie (expectation, E) 10 a bodovaciu maticu BLOSUM62 (pozri Henikoff a Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915 (1989)).
Polohy zvyškov, ktoré nie sú identické, sa výhodne líšia v konzervatívnych substitúciách aminokyselín.
Na účely klasifikácie substitúcií aminokyselín konzervatívnych aj nekonzervatívnych, sa aminokyseliny zaraďujú do skupín nasledujúcim spôsobom: skupina I (hydrofóbne bočné reťazce): leu, met, ala, val, leu, ile; skupina II (neutrálne hydrofilné bočné reťazce): cys, ser, thr; skupina III (kyslé bočné reťazce): asp, glu; skupina IV (zásadité bočné reťazce): asn, gin, his, lys, arg; skupina V (zvyšky ovplyvňujúce orientáciu reťazca): gly, pro; a skupina VI (aromatické bočné reťazce) trp, tyr, phe. Konzervatívne substitúcie zahŕňajú substitúcie medzi aminokyselinami z tej istej triedy. Nekonzervatívne substitúcie znamenajú výmenu prvku jednej z týchto tried za prvok inej triedy.
Humanizované imunoglobulíny alebo protilátky viažu výhodne antigén s afinitou, ktorá je trikrát, štyrikrát alebo päťkrát vyššia ako afinita zodpovedajúcej neľudskej protilátky. Keď má napríklad neľudská protilátka afinitu väzby 109 M'1, humanizované protilátky budú mať afinitu väzby aspoň 3 x 109 M'1, 4 x 109 M'1, alebo 109 M'1. Pri opise väzbových vlastností reťazca imunoglobulínu alebo protilátky sa tento reťazec môže opísať na základe jeho schopnosti smerovať väzbu antigénu (napr. Αβ). Hovorí sa, že reťazec smeruje väzbu antigénu, keď udeľuje intaktnému imunoglobulínu alebo protilátke (alebo jej fragmentu viažucemu antigén) špecifické väzbové vlastnosti alebo afinitu väzby. Hovorí sa, že mutácia (napr. spätná mutácia) podstatne ovplyvní schopnosť ťažkého alebo ľahkého reťazca smerovať väzbu antigénu, ak ovplyvní (napr. zníži) afinitu väzby intaktného imunoglobulínu alebo protilátky (alebo jej fragmentu viažuceho antigén), obsahujúcich uvedený reťazec, aspoň o jeden rád v porovnani s protilátkou (alebo jej fragmentom viažucim antigén), ktorá obsahuje ekvivalentný reťazec bez uvedenej spätnej mutácie. Mutácia podstatne neovplyvní (napr. nezníži) schopnosť reťazca smerovať väzbu antigénu, ak ovplyvní (napr. zníži) afinitu väzby intaktného imunoglobulínu alebo protilátky (alebo jej fragmentu viažuceho antigén), obsahujúcich uvedený reťazec, len dvakrát, trikrát alebo štyrikrát v porovnaní s protilátkou (alebo jej fragmentom viažucim antigén) obsahujúcou ekvivalentný reťazec bez uvedenej spätnej mutácie.
Výraz chimérický imunoglobulín alebo protilátka označuje imunoglobulín alebo protilátku, ktorých ľahké a ťažké reťazce sú odvodené z iných živočíšnych druhov. Chimérické imunoglobulíny alebo protilátky sa môžu vytvoriť napríklad genetickým inžinierstvom z imunoglobulínových génových segmentov patriacich iným živočíšnym druhom.
Antigén je entita (napr. proteínová entita alebo peptid), na ktorý sa protilátka špecificky viaže.
Výraz epitop alebo antigénový determinant označuje miesto na antigéne, na ktoré sa imunoglobulín alebo protilátka (alebo jej fragment viažuci antigén) špecificky viaže. Epitopy môžu byť tvorené susediacimi aminokyselinami alebo nesusediacimi aminokyselinami privedenými do blízkosti terciámou konformáciou proteínu. Epitopy tvorené susediacimi aminokyselinami sa spravidla zachovajú pri pôsobení denaturujúcich rozpúšťadiel, kým epitopy tvorené terciámou konformáciou sa spravidla stratia pri pôsobení denaturujúcim rozpúšťadlom. Epitopy spravidla obsahujú aspoň 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 alebo 15 aminokyselín v unikátnej priestorovej konformácii. K metódam určenia priestorovej konformácie epitopov patrí napríklad rôntgenová kryštalografia a dvojrozmerná jadrová magnetická rezonancia. Pozri napr. Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, tn. 66, red. G. E. Morris (1996).
Protilátky, ktoré spoznajú rovnaký epitop, sa môžu identifikovať jednoduchou imunologickou skúškou ukazujúcou schopnosť jednej protilátky blokovať väzbu inej protilátky na terčový antigén, t. j. kompetičnou väzbovou skúškou. Kompetičná väzba sa stanovuje skúškou, pri ktorej skúšaný imunoglobulín inhibuje špecifickú väzbu referenčnej protilátky na bežný antigén, ako je Αβ. Je známy rad druhov kompetičných väzbových skúšok, napríklad: priama alebo nepriama rádioimunologická skúška v tuhej fáze (RIA), priama alebo nepriama enzýmová imunologická skúška v tuhej fáze (EIA), sendvičová kompetičná skúška (pozri Stahli a kol., Methods in Enzymology 9: 242 (1983)); priama biotín-avidín EIA v tuhej fáze (pozri Kirkland a kol., J. Immunol. 137: 3614 (1986)); priamo značkovaná skúška v tuhej fáze, priamo značkovaná sendvičová skúška v tuhej fáze (pozri Harlow a Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (1988)); priamo značkovaná RIA v tuhej fáze s použitím 1-125 značkovania (pozri Morel a kol., Mol. Immunol. 25 (1): 7 (1988)); priama biotín-avidín EIA v tuhej fáze (Cheung a kol., Virology 176: 546 (1990)); a priamo značkovaná RIA (Moldenhauer a kol., Scand. J. Immunol. 32: 77 (1990)).
Takáto skúška obvykle zahŕňa použitie prečisteného antigénu naviazaného na pevný povrch alebo buniek nesúcich buď neoznačený skúšaný imunoglobulín, alebo označený referenčný imunoglobulín. Kompetičná inhibícia sa meria stanovením množstva označenej väzby k tuhému povrchu alebo na bunky v prítomnosti skúšaného imunoglobulínu. Skúšaný imunoglobulín je obyčajne prítomný v prebytku. Keď je konkurenčná protilátka prítomná v prebytku, bude obvykle inhibovať špecifickú väzbu referenčnej protilátky k bežnému antigénu aspoň na 50 - 55 %, 55 - 60 %, 60 - 65 %, 65 - 70 %, 70 - 75 % alebo viac.
Epitop tiež spoznajú imunologické bunky, napríklad B-bunky a/alebo T-bunky. Bunkové spoznanie epitopu sa môže stanoviť skúškami in vitro, ktorými sa meria rozmnožovanie buniek závislom na antigéne, ako je pripojenie 3H-tymidínu, sekrécia cytokínov, sekrécia protilátok alebo usmrcovanie závislé na antigéne (cytotoxická T-lymfocytová skúška).
Príklady epitopov alebo antigénových determinantov je možné nájsť v ľudskom amyloidovom prekurzorovom proteíne (APP), ale výhodne sa nachádzajú v Αβ peptide APP. Existuje viacero izoforiem APP, naprí7 klad APP695, APP751 a APP770. Aminokyselinám v APP sú priradené čísla podľa sekvencie APP770 izoformy (pozri napr. GenBank prístupové číslo P05067, tiež uvedená ako SEQ ID NO: 38). Αβ peptid (označovaný tiež ako beta-amyloidový peptid a A-beta peptid) je ~ 4-kDa interný fragment 39 - 43 aminokyselín APP (Αβ39, Αβ40, Αβ41, Αβ42 Αβ43). Napríklad Αβ40 pozostáva zo zvyškov APP 672 - 711 a Αβ42 pozostáva zo zvyškov APP 673 - 713. Ako výsledok pôsobenia rozličných sekretázových enzýmov na APP in vivo alebo in situ sa Αβ nachádza v krátkej forme s dĺžkou 40 aminokyselín aj v dlhej forme s dĺžkou v rozsahu 442 až 43 aminokyselín. Výhodné epitopy alebo antigénové determinanty, ako sú tu opísané, sú umiestnené na N-konci Αβ peptidu a obsahujú zvyšky aminokyselín Αβ 1 - 10, výhodne zvyšky Αβ 42 1 - 3, 1 - 4, 1 - 5, 1,6, 1 - 7, 3 - 7. Ďalšie spomínané epitopy alebo antigénové determinanty obsahujú zvyšky Αβ 2 - 4, 5, 6, 7 alebo 8, zvyšky Αβ 3 - 5, 6, 7, 8 alebo 9, alebo zvyšky Αβ 42 4 - 7, 8, 9 alebo 10.
Výraz amyloidogénne ochorenie zahŕňa ktorúkoľvek chorobu súvisiacu s (alebo spôsobenú) tvorbou alebo ukladaním nerozpustných amyloidných vlákien. K príkladom amyloidogénnych ochorení patria, ale neobmedzujú sa iba na ne, systemická amyloidóza, Alzheimerova choroba, diabetes dospelosti (2. typu), Parkinsonova choroba, Huntingtonova choroba, fronto-temporálna demencia a prenosné spongiformné encefalopatie spôsobené priónmi (kuru a Creutzfeldt-Jacobova choroba a ľudí, resp. scrapie a BSA u oviec a dobytka). Rozličné amyloidogénne ochorenia sú definované alebo charakterizované povahou ukladaných polypeptidových zložiek vlákien. Napríklad u subjektov alebo pacientov, ktorí majú Alzheimerovu chorobu, je charakteristickou polypeptidovou zložkou amyloidových depozitov β-amyloidový proteín (napr. nekultivovaný β-amyloidový proteín, β-amyloidový proteín iného typu alebo skrátený β-amyloidový proteín). Alzheimerova choroba je teda príkladom ochorenia charakterizovaného depozitmi Αβ alebo ochorenie súvisiace s depozitmi Αβ, napr. v mozgu subjektu alebo pacienta. Výrazy β-amyloidový proteín, β-amyloidový peptid, β-amyloid, Αβ a Αβ peptid sa tu používajú zameniteľné.
Výraz účinná dávka alebo účinné dávkovanie je definovaný ako množstvo dostačujúce na dosiahnutie alebo aspoň na čiastočné dosiahnutie požadovaného účinku. Výraz terapeuticky účinné množstvo je definovaný ako množstvo dostačujúce na liečbu alebo aspoň na čiastočné zastavenie choroby a jej komplikácií u pacienta, ktorý už trpí chorobou. Množstvá účinné na dosiahnutie tohto cieľa budú závisieť od závažnosti infekcie a celkového stavu imunitného systému pacienta.
Výraz pacient označuje človeka alebo iného cicavca, ktorí sa podrobujú buď profylaxii, alebo liečbe.
Rozpustný alebo disociovaný Αβ označuje Αβ polypeptid, ktorý sa nezhlukuje alebo vznikol rozložením agregátov. Nerozpustný Αβ označuje Αβ polypetid tvoriaci agregáty, napríklad Αβ držaný pohromade nekovalentnými väzbami. Predpokladá sa, že Αβ (napr. Αβ42) tvorí agregáty, aspoň sčasti, kvôli prítomnosti hydrofóbnych zvyškov na C-konci peptidu (časť transmembránovej domény APP). Jednou z metód prípravy rozpustného Αβ je rozpustenie lyofilizovaného peptidu v čistom DMSO so sonifikáciou. Získaný roztok sa odstredí, aby sa odstránili akékoľvek nerozpustné častice.
I. Imunologické a terapeutické činidlá
Imunologické a terapeutické činidlá tohto vynálezu, ako sú tu definované, zahŕňajú imungény a protilátky alebo pozostávajú z imunogénov a protilátok, ich funkčných alebo antigén viažucich fragmentov. Je známe, že základná štruktúrna jednotka protilátky obsahuje tetramér podjednotky. Každý tetramér je zložený z dvoch identických párov polypeptidových reťazcov, pričom každý pár má jeden ľahký reťazec (asi 25 kDa) a jeden ťažký reťazec (asi 50 - 70 kDa). Aminokoncová časť každého reťazca obsahuje variabilnú oblasť asi 100 až 110 alebo viac aminokyselín, ktoré sú primáme zodpovedné za spoznanie antigénu. Karboxy-koncová časť každého reťazca definuje konštantnú oblasť primáme zodpovednú za efektorovú funkciu.
Ľahké reťazce sú klasifikované buď ako kapa, alebo lambda a majú dĺžku asi 230 zvyškov. Ťažké reťazce sú klasifikované ako gama (γ), mí (μ), alfa (a), delta (δ) alebo epsilon (ε) a majú dĺžku asi 450 - 600 zvyškov a definujú izotyp protilátky ako IgG, IgM, IgA, IgD, resp. IgE. Ťažké aj ľahké reťazce sú poskladané do domén. Výraz doména označuje globulámu oblasť proteínu, napríklad imunoglobulínu alebo protilátky. Domény imunoglobulínu alebo protilátky obsahujú napríklad tri alebo štyri peptidové slučky stabilizované napríklad ako β-skladaná vrstva a medzireťazcovou disulfidickou väzbou. Intaktné ľahké reťazce majú napríklad dve domény (VL a CL) a intaktné ťažké reťazce majú napríklad štyri alebo päť domén (VH, Ch1, Ch2 a CH3).
V ľahkých a ťažkých reťazcoch sú variabilné a konštantné oblasti spojené J-oblasťou asi s 12 alebo viacerými aminokyselinami, pričom ťažký reťazec tiež obsahuje D-oblasť asi s 10 ďalšími aminokyselinami. (Pozri vo všeobecnosti Fundamental Immunology (red. W. Paul, 2. vyd., Raven Press, N. Y. (1989), kap. 7, ktorá je tu zaradená ako odkaz v jej celosti na všetky účely).
Variabilné oblasti každého ľahkého/ťažkého reťazca tvoria väzbové miesto protilátky. Intaktná protilátka má teda dve väzbové miesta. Okrem bifunkčných a bišpecifických protilátok sú tieto dve väzbové miesta rovnaké. Reťazce majú vcelku rovnakú všeobecnú štruktúru relatívne konzervatívnych rámcových oblastí (FR) spojených tromi hypervariabilnými oblasťami, tiež nazývanými komplementaritu určujúce oblasti alebo CDR. Prirodzene sa vyskytujúce reťazce alebo rekombinantne pripravené reťazce sa môžu exprimovať s líder sekvenciou, ktorá sa odstráni počas spracovania v bunke, čím sa získa dospelý reťazec. Dospelé reťazce sa
SK 288209 Β6 môžu tiež pripravovať rekombinantné s nie prirodzene sa vyskytujúcou líder sekvenciou, napríklad na zvýšenie sekrécie alebo zmenu spracovania určitého zaujímavého reťazca.
CDR dvoch dospelých reťazcov každého páru sú orientované rámcovými oblasťami umožňujúcimi väzbu na špecifický epitop. Od N-konca k C-koncu ľahký aj ťažký reťazec obsahujú domény FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 a FR4. FR4 sa tiež označuje v odborných prácach ako D/J oblasť variabilného ťažkého reťazca a J oblasť variabilného ľahkého reťazca. Priradenie aminokyselín každej doméne je v zhode s Kabátovou definíciou, Sequences of Proteins of Immunological Interest (Národný inštitút zdravia, Bethesda, MD, 1987 a 1991). Inú štruktúrnu definíciu navrhli Chothia a kol., J. Mol. Biol. 196: 901 (1987); Náture 342: 878 (1989); a J. Mol. Biol. 186: 6561 (1989) (v ďalšom súhrnne označované ako Chothia a kol. a sú tu zaradené ako odkaz v ich celosti na všetky účely).
A. Αβ protilátky
Terapeutické činidlá tohto vynálezu zahŕňajú protilátky, ktoré sa špecificky viažu na Αβ alebo inú súčasť amyloidných plakov. Takéto protilátky môžu byť monoklonálne alebo polyklonálne. Niektoré takéto protilátky sa špecificky viažu na agregovanú formu Αβ bez väzby na rozpustnú formu. Niektoré sa špecificky viažu rozpustnú formu bez väzby na agregovanú formu. Niektoré sa viažu na agregovanú aj rozpustnú formu. Niektoré takéto protilátky sa viažu na prirodzene sa vyskytujúcu krátku formu Αβ (t. j. Αβ39, 40 alebo 41) bez väzby na prirodzene sa vyskytujúcu dlhú formu Αβ (t. j. Αβ42 a Αβ43). Niektoré protilátky sa viažu na dlhú formu Αβ bez väzby na krátku formu. Niektoré protilátky sa viažu na Αβ bez väzby na amyloidový prekurzorový protein úplnej dĺžky. Protilátky používané v liečebných metódach majú výhodne intaktnú konštantnú oblasť alebo aspoň dostatočnú časť konštantnej oblasti, aby interagovala s Fc receptorom. Výhodný je ľudský izotyp IgGl, pretože má najvyššiu afinitu z ľudských izotypov na FcRI receptor na fagocytámych bunkách. Môžu sa tiež použiť bišpecifické Fab fragmenty, v ktorých jedno rameno protilátky má špecificitu na Αβ a druhé na Fc receptor. Výhodné protilátky sa viažu na Αβ s väzbovou afinitou väčšou než (alebo rovnou) asi 10®, 107, 108, 109 alebo 1010 M'1 (zahrňujúc aj afinity medzi týmito hodnotami).
Polyklonálne séra obvykle obsahujú zmiešané populácie protilátok viažucich sa na niekoľko epitopov pozdĺž Αβ. Polyklonálne séra však môžu byť špecifické na určitý segment Αβ, ako je Αβί - 10. Monoklonálne protilátky sa viažu na špecifický epitop v Αβ, ktorým môže byť konformačný alebo nekonformačný epitop. Profylaktická a terapeutická účinnosť protilátok sa môže skúšať pomocou transgenických zvieracích modelov opísaných v príkladoch. Výhodné monoklonálne protilátky sa viažu na epitop v rámci zvyškov 1 - 10 Αβ (s prvým N-koncovým zvyškom prirodzeného Αβ označeným 1). Niektoré výhodné monoklonálne protilátky sa viažu na epitop v rámci aminokyselín 1 - 5 a niektoré na epitop v rámci 5-10. Niektoré výhodné protilátky sa viažu na epitopy v rámci aminokyselín 1 - 3, 1 - 4, 1 - 5, 1 - 6, 1 - 7 alebo 3-7. Niektoré výhodné protilátky sa viažu na epitop začínajúc pri zvyškoch Αβ 1 - 3 a končiac pri zvyškoch Αβ 7 - 11. K menej výhodným protilátkam patria tie, ktoré sa viažu na epitop so zvyškami Αβ 10 - 15, 15 - 20, 25 - 30, 10 - 20, 20, 30 alebo 10 - 25. Odporúča sa, aby sa takéto protilátky pred použitím preverili z hľadiska aktivity na myších modeloch opísaných v príkladoch. Napríklad sa zistilo, že určité protilátky k epitopom v rámci zvyškov 10 - 18, 16-24, 18-21 a 33 - 42 majú nedostatok aktivity (napr. nedostatok aktivity pri znižovaní množstva plakov a/alebo pri zmiernení neuritickej patológie spojenej s Alzheimerovou chorobou). V niektorých metódach sa používa viacero monoklonálnych protilátok, ktoré majú špecifickú väzbovosť k rozličným epitopom. Takéto protilátky sa môžu podávať po sebe alebo súčasne. Môžu sa tiež použiť protilátky k amyloidovým zložkám iným ako Αβ (napr. ako podávané alebo zároveň podávané). Protilátky sa napríklad môžu smerovať na protein synukleín spojený s amyloidom.
Keď sa povie, že protilátka sa viaže na epitop v rámci špecifických zvyškov, ako sú napríklad Αβ 1 - 5, znamená to, že protilátka sa špecificky viaže na polypeptid obsahujúci tieto špecifikované zvyšky (t. j. v tomto príklade Αβ 1 - 5). Takáto protilátka sa nemusí nevyhnutne spojiť s každým zvyškom v rámci Αβ 1 - 5. Takisto každá jednotlivá substitúcia alebo delécia v Αβ 1 - 5 nevyhnutne významne neovplyvní väzbovú afinitu. Epitopová špecifická protilátky sa môže stanoviť napríklad vytvorením knižnice fágov, kde rozličné prvky ukazujú rozličné subsekvencie Αβ. Potom sa vyberie knižnica fágov pre prvky špecificky sa viažuce na skúšanú protilátku. Vyčlení sa skupina sekvencii. Takáto skupina obvykle obsahuje spoločnú centrálnu sekvenciu a obklopujúce sekvencie premenlivej dĺžky u rozličných prvkov. Najkratšia centrálna sekvencia vykazujúca špecifickú väzbu k protilátke definuje epitop viazaný s protilátkou. Protilátky sa tiež môžu skúšať na epitopovú špecificitu v kompetičnej skúške s protilátkou, ktorej epitopová špecificita sa už stanovila. Napríklad protilátky, ktoré konkurujú 3D6 protilátke pri väzbe na Αβ, sa viažu na rovnaký alebo podobný epitop ako 3D6, t. j. v rámci Αβ zvyškov 1 - 5. Podobne protilátky, ktoré konkurujú protilátke 10D5, sa viažu na rovnaký alebo podobný epitop, t. j. v rámci Αβ zvyškov 3-7. Vyčlenené protilátky pre epitopovú špecificitu sú užitočnou indíciou terapeutickej účinnosti. Napríklad protilátka, pre ktorú sa zistilo, že sa viaže na epitop v rámci Αβ zvyškov 1 - 7, bude pravdepodobne účinná v prevencii a liečbe Alzheimerovej choroby podľa metodológií tohto vynálezu.
Monoklonálne alebo polyklonálne protilátky, ktoré sa špecificky viažu na preferovaný segment Αβ bez
SK 288209 Β6 väzby na iné oblasti Αβ, majú rad výhod v porovnaní s monoklonálnymi protilátkami viažucimi sa na iné oblasti alebo s polyklonálnymi sérami na intaktný Αβ. Po prvé, pre dávky rovnakej hmotnosti obsahujú dávky protilátok, ktoré sa špecificky viažu na preferované segmenty, vyššie moláme dávky protilátok účinných v odstraňovaní amyloidových plakov. Po druhé, protilátky viažuce sa špecificky na preferovaný segment, môžu vyvolať odozvu odstraňovania amyloidových ložísk bez vyvolania odozvy odstraňovania intaktného APP polypeptidu, čím sa znížia možné vedľajšie účinky.
1. Príprava neľudských protilátok
Tento vynález predstavuje neľudské protilátky, napríklad protilátky, ktoré majú špecifickú na preferované epitopy Αβ podľa tohto vynálezu. Takéto protilátky sa môžu použiť pri výrobe rozličných terapeutických prípravkov tohto vynálezu alebo výhodne poskytujú komplementaritu určujúce oblasti na prípravu humanizovaných alebo chimérických protilátok (podrobne opísanú nižšie). Príprava neľudských monoklonálnych protilátok, napr. myší, morčiat, primátov, králikov alebo potkanov, sa môže napríklad uskutočniť imunizáciou zvierat s Αβ. Môže sa tiež použiť dlhší polypeptíd obsahujúci Αβ alebo imunogénny fragment Αβ alebo anti-idiotypové protilátky k protilátkam k Αβ. Pozri Harlow a Lane vyššie, zaradené tu ako odkaz na všetky účely. Takýto imunogén sa môže získať z prírodných zdrojov, syntézou peptidu alebo rekombinantou expresiou. Imunogén sa prípadne môže podávať spojený alebo ináč komplexne viazaný s nosným proteínom, ako sa opisuje nižšie. Imunogén sa môže prípadne podávať s adjuvantom. Výraz adjuvant označuje zlúčeninu, ktorá v prípade, že sa podáva v kombinácii s antigénom, zvyšuje imunitnú odozvu na antigén, ale keď sa podáva samotná, nevyvolá imunitnú odozvu k antigénu. Adjuvant môže zvýšiť imunitnú odozvu niekoľkými mechanizmami, ku ktorým patrí mobilizácia lymfocytov, stimulácia B- buniek a T-buniek a stimulácia makrofágov. Môže sa použiť niekoľko typov adjuvantov, ako sa opisuje nižšie. Na imunizáciu laboratórnych zvierat je výhodný kompletný Freundov adjuvant nasledovaný nekompletným adjuvantom.
Na prípravu polyklonálnych protilátok sa obvykle používajú králiky alebo morčatá. Ukážková príprava polyklonálnych protilátok, napr. na pasívnu ochranu, sa môže uskutočniť nasledujúcim spôsobom. 125 netransgenických myší sa imunizuje 100 pg Αβί - 42 a adjuvantom CFA/IFA a utratia sa vo veku 4-5 mesiacoch. Z imunizovaných myší sa odoberie krv. Protilátky špecifické pre imunogén sa môžu čiastočne prečistiť afmitnou chromatografiou. V priemere na jednu myš sa získa asi 0,5 - 1 mg protilátky špecifickej pre imunogén, čo poskytne celkove 60-120 mg.
Na prípravu monoklonálnych protilátok sa obvykle používajú myši. Monoklonálne protilátky sa môžu pripraviť proti fragmentu vstreknutím tohto fragmentu alebo dlhšej formy Αβ do myši, prípravou hybridómov a skríningom hybridómov na protilátku, ktorá špecificky viaže Αβ. Protilátky sa prípadne vytriedia podľa väzby na špecifickú oblasť alebo požadovaný fragment Αβ bez väzby na iné neprekrývajúce sa fragmenty Αβ. Posledne menovaný skríning sa môže vykonať stanovením väzby protilátky na súbor delečných mutantov peptidu Αβ a určením, ktoré delečné mutanty sa viažu na protilátku. Väzba sa môže zhodnotiť napríklad Western blot skúškou alebo metódou ELISA. Najmenší fragment, ktorý prejaví špecifickú väzbu na protilátku, definuje epitop protilátky. Špecifická epitopu sa môže prípadne stanoviť kompetičnou skúškou, v ktorej skúšaná a referenčná protilátka si konkurujú vo väzbe s Αβ. Ak si skúšaná a referenčná protilátka konkurujú, potom sa môžu viazať na rovnaký epitop alebo na dostatočne blízke epitopy tak, že väzba jednej protilátky interferuje s väzbou inej. Výhodným izotypom pre takéto protilátky je myší izotyp IgG2 alebo ekvivalentný izotyp iného živočíšneho druhu. Myší izotyp IgG2 je ekvivalentom ľudského izotypu IgGl.
2. Chimérické alebo humanizované protilátky
Tento vynález tiež predstavuje chimérické a/alebo humanizované protilátky (t. j. chimérické a/alebo humanizované imunoglobulíny) špecifické pre beta-amyloidový peptid. Chimérické a/alebo humanizované protilátky majú rovnakú alebo podobnú väzbovú Špecifickú a afinitu ako myšia alebo iná neľudská protilátka, ktorá je východiskovým materiálom na skonštruovanie chimérickej alebo humanizovanej protilátky.
A. Príprava chimérických protilátok
Výraz chimérické protilátky označuje protilátku, ktorej gény ľahkého a ťažkého reťazca sa skonštruovali, obvykle genetickým inžinierstvom, zo segmentov génov imunoglobulínu patriacim rozličným živočíšnym druhom. Napríklad variabilné (V) segmenty génov z myšej monoklonálnej protilátky sa môžu pripojiť k ľudským konštantným (C) segmentom, ako sú IgGl a IgG4. Výhodný je ľudský izotyp IgGl. Obvyklou chimérickou protilátkou je teda hybridný proteín, ktorý pozostáva z V-domény alebo domény viažucej antigén z myšej protilátky a z C-domény alebo efektorovej domény ľudskej protilátky.
B. Príprava humanizovaných protilátok
Výraz humanizovaná protilátka označuje protilátku, ktorá obsahuje aspoň jeden reťazec obsahujúci zvyšky variabilnej rámcovej oblasti v zásade z reťazca ľudskej protilátky (označovanej ako akceptomý imunoglobulín alebo protilátka) a aspoň jednu komplementaritu určujúcu oblasť v zásade z myšej protilátky (ozna10 čovanej ako donorný imunoglobulín alebo protilátka). Pozri Queen a kol., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 10029 - 10033 (1989), US 5 530 101, US 5 585 089, US 5 693 761, US 5 693 762, Selick a kol., WO 90/07861 a Winter, US 5 225 539 (zaradené ako odkaz vo svojej celosti a na všetky účely). Konštantné oblasti, ak sú prítomné, sú tiež v zásade alebo úplne z ľudského imunoglobulínu.
Je najpravdepodobnejšie, že substitúcia CDR do rámcovej oblasti ľudskej variabilnej domény má za následok zachovanie jej správnej priestorovej orientácie, ak rámcová oblasť ľudskej variabilnej domény prijme rovnakú alebo podobnú konformáciu ako myšia variabilná rámcová oblasť, z ktorej CDR pochádzajú. Toto sa dosiahne získaním ľudských variabilných domén z ľudských protilátok, ktorých sekvencie rámcovej oblasti vykazujú vysoký stupeň identity sekvencii s doménami myšej variabilnej rámcovej oblasti, z ktorých sú CDR odvodené. Variabilné rámcové oblasti ťažkého a ľahkého reťazca sa môžu odvodiť z rovnakých alebo rozličných sekvencii ľudskej protilátky. Sekvencie ľudskej protilátky môžu byť sekvenciami prirodzene sa vyskytujúcich ľudských protilátok alebo to môžu byť konsenzuálne sekvencie niekoľkých ľudských protilátok. Pozri Kettleborough a kol., Protein Engineering 4: 773 (1991); Kolbinger a ko., Protein Engineering 6: 971 (1993) a Carter a kol., WO 92/22653.
Keď sa identifikujú komplementaritu určujúce oblasti myšieho donomého imunoglobulínu a vhodné akceptomé imunoglobulíny, ďalším krokom je stanovenie, ktoré zvyšky z týchto zložiek, ak vôbec nejaké, by sa mali substituovať, aby sa optimalizovali vlastnosti výslednej humanizovanej protilátky. Vo všeobecnosti by sa substitúcia ľudských aminokyselinových zvyškov myšími mala minimalizovať, pretože zavedenie myších zvyškov zvyšuje riziko, že protilátka vyvolá odozvu ľudskej protimyšej protilátky (HAMA) u ľudí. Na monitorovanie HAMA odozvy u určitého pacienta alebo počas klinických pokusov sa môžu použiť metódy stanovenia imunitnej odozvy, ktoré sú uznávané v tomto odbore. Pacienti, ktorí dostávajú humanizované protilátky, sa môžu vyhodnotiť z hľadiska imunogénnosti na začiatku a v priebehu poskytovania uvedenej liečby. HAMA odozva sa meria napríklad detekciou protilátok na humanizovanú terapeutickú látku vo vzorkách séra z pacientov pomocou metódy známej odborníkom v problematike, zahŕňajúc technológiu povrchovej plazmonovej rezonancie (BIACORE) a/alebo analýzu ELISA v tuhej fáze.
Na substitúciu sa vyberú určité aminokyseliny zo zvyškov ľudských variabilných rámcových oblastí na základe ich možného vplyvu na konformáciu CDR a/alebo väzbu antigénu. Neprirodzená poloha myších CDR oblastí v susedstve ľudskej variabilnej rámcovej oblasti môže viesť k neprirodzeným konformačným obmedzeniam, ktoré v prípade, že nie sú korigované substitúciou určitých aminokyselinových zvyškov, vedú k strate väzbovej afinity.
Výber aminokyselinových zvyškov na substitúciu sa určí sčasti počítačovým modelovaním. Opisuje sa tu počítačový hardvér a softvér na vytvorenie trojrozmerných obrazov molekúl imunoglobulínu. Molekulárne modely sa vo všeobecnosti vytvárajú tak, že sa vychádza z vyriešených štruktúr imunoglobulínových reťazcov alebo ich domén. Porovná sa podobnosť sekvencie aminokyselín reťazcov, ktoré sa majú modelovať, s reťazcami alebo doménami vyriešených trojrozmerných štruktúr, a reťazce alebo domény, ktoré prejavujú najväčšiu podobnosť sekvencii, sú zvolené ako východiskové body na konštrukciu molekulového modelu. Na modelovanie sa vyberú reťazce alebo domény, ktoré prejavujú aspoň 50 % identitu sekvencie, a výhodnejšie sa na modelovanie vyberú tie, ktoré prejavujú aspoň 60 %, 70 %, 80 %, 90 % identitu sekvencie a väčšiu. Vyriešené východiskové štruktúry sa modifikujú tak, aby umožňovali odlišnosti medzi skutočnými aminokyselinami v reťazcoch alebo doménach modelovaného imunoglobulínu a tými, ktoré sú vo východiskovej štruktúre. Z modifikovaných štruktúr sa potom poskladá kompozitný imunoglobulín. Nakoniec sa model vylepší minimalizáciou energie a overením, či všetky atómy sú vo vhodných vzdialenostiach od seba a či dĺžky väzieb a väzbové uhly sú v rámci chemicky akceptovateľných limitov.
Výber aminokyselinových zvyškov na substitúciu sa môže tiež sčasti určiť vyšetrením charakteristík aminokyselín v určitých polohách alebo empirickým pozorovaním účinkov substitúcie alebo mutagenézy určitých aminokyselín. Keď sa napríklad líši aminokyselina vo zvyšku myšej variabilnej rámcovej oblasti a zvyšku vybratej ľudskej variabilnej rámcovej oblasti, potom aminokyselina ľudskej rámcovej oblasti sa obyčajne musí substituovať ekvivalentnou aminokyselinou rámcovej oblasti z myšej protilátky, keď sa dôvodne očakáva, že aminokyselina:
(1) nekovalentne viaže antigén priamo, (2) susedí s CDR oblasťou, (3) interaguje inak s CDR oblasťou (napr. je vo vzdialenosti asi 3 - 6 Á od CDR oblasti, ako sa určí počítačovým modelovaním) alebo (4) sa nachádza na rozhraní VL-VH.
Zvyšky, ktoré nekovalentne viažu priamo antigén, zahŕňajú aminokyseliny v polohách rámcových oblastí, ktoré majú vysokú pravdepodobnosť priamo interagovať s aminokyselinami na antigéne pomocou existujúcich chemických síl, napríklad vodíkovej väzby, Van der Waalsových síl, hydrofóbnych interakcií a podobne.
CDR a rámcové oblasti sú definované podľa Kabat a kol. alebo Chothia a kol., pozri vyššie. Keď zvyšky rámcových oblastí, ako sú definované Kabatom a kol., tvoria zvyšky štruktúrnych slučiek, ako sú definované
SK 288209 Β6
Chothiom a kol., pozri vyššie, môžu sa aminokyseliny prítomné v myšej protilátke vybrať na substitúciu do humanizovanej protilátky. Zvyšky, ktoré susedia s CDR oblasťou, zahŕňajú zvyšky aminokyselín v polohách bezprostredne susediacich s jednou alebo viacerými CDR v primárnej sekvencii humanizovaného imunoglobulínového reťazca, napríklad v polohách bezprostredne susediacich s CDR definovaných Kabatom alebo CDR definovaných Chothiom (pozri napr. Chothia a Lesk, JMB 196: 901 (1987)). Tieto aminokyseliny sú obzvlášť ochotné interagovať s aminokyselinami v CDR a v prípade, že sa vyberú z akceptora, zdeformovať donomé CDR a znížiť afinitu. Okrem toho môžu susediace aminokyseliny interagovať priamo s antigénom (Amit a kol., Science, 233: 747 (1986), čo je tu zaradené ako odkaz) a voľba týchto aminokyselín z donora môže byť žiaduca z hľadiska udržania všetkých kontaktov antigénu, ktoré poskytujú afinitu u originálnej protilátky.
Zvyšky, ktoré inak interagujú s CDR oblasťou, zahŕňajú tie, u ktorých sa sekundárnou štruktúrnou analýzou určilo, že sú v priestorovej orientácii vhodnej na ovplyvňovanie CDR oblasti. V jednom praktickom uskutočnení sa zvyšky iné ako inak interagujúce s CDR oblasťou identifikujú analýzou trojrozmerného modelu donomého imunoglobulínu (napr. modelu vytvoreného počítačom). Trojrozmerný model, obvykle pôvodnej donomej protilátky, ukazuje, že určité aminokyseliny mimo CDR sú v blízkosti CDR a majú vysokú pravdepodobnosť interakcie s aminokyselinami v CDR vodíkovou väzbou, Van de Waalsovými silami, hydrofóbnou interakciou atď. V týchto polohách aminokyselín sa môže vybrať skôr aminokyselina donomého imunoglobulínu než aminokyselina akceptomého imunoglobulínu. Aminokyseliny podľa tohto kritéria budú mať vo všeobecnosti nejaký atóm bočného reťazca vo vzdialenosti do 3 angstrómových jednotiek (Á) od niektorého atómu v CDR a musia obsahovať atóm, ktorý by mohol interagovať s atómami CDR pomocou existujúcich chemických síl, aké sú uvedené vyššie.
V prípade atómov, ktoré môžu tvoriť vodíkovú väzbu, tieto 3 Á sa merajú medzi ich jadrami, ale pre atómy, ktoré netvoria väzbu, sa tieto 3 Á merajú medzi ich Van der Waalsovými povrchmi. V druhom prípade teda jadrá musia byť vo vzdialenosti asi do 6 Ä (3 Ä plus súčet Van de Waalsových polomerov) pre tie atómy, ktoré sa považujú za schopné interakcie. V mnohých prípadoch budú jadrá od seba vzdialené od 4 alebo 5 do 6 Á. Pri zisťovaní, či aminokyselina môže interagovať s CDR, je výhodné neuvažovať posledných 8 aminokyselín CDR2 ťažkého reťazca ako časť CDR, pretože z hľadiska štruktúry sa týchto 8 aminokyselín správa skôr ako časť rámcovej oblasti.
Aminokyseliny, ktoré sú schopné interagovať s aminokyselinami v CDR, sa môžu identifikovať aj iným spôsobom. Plocha povrchu prístupná pre rozpúšťadlo každej aminokyseliny rámcovej oblasti sa vypočíta dvoma spôsobmi: (1) v intaktnej protilátke a (2) v hypotetickej molekule tvorenej protilátkou s odstránenými CDR. Významný rozdiel asi 10 štvorcových angstrômov alebo viac medzi týmito číslami ukazuje, že prístup aminokyselín rámcovej oblasti k rozpúšťadlu je aspoň sčasti blokovaný CDR, čo znamená, že táto aminokyselina je v kontakte s CDR. Plocha povrchu aminokyseliny prístupná pre rozpúšťadlo sa môže vypočítať na základe trojrozmerného modelu protilátky, pričom sa použije algoritmus známy v problematike (napr. Connolly, J. Appl. Cryst. 16: 548 (1983) a Lee a Richards, J. Mol. Biol. 55: 379 (1971), obidva sú tu zaradené ako odkaz). Aminokyseliny rámcovej oblasti môžu tiež niekedy interagovať s CDR nepriamo ovplyvňovaním konformácie inej aminokyseliny rámcovej oblasti, ktorá je následne v kontakte s CDR.
Je známe, že aminokyseliny v niekoľkých polohách v rámcovej oblasti sú schopné interakcie s CDR v mnohých protilátkach (Chothia a Lesk, pozri vyššie, Chothia a kol., pozri vyššie, a Tramontano a kol., J. Mol. Biol. 215: 175 (1990), všetky sú tu zaradené ako odkaz). Je predovšetkým známe, že aminokyseliny v polohách 2, 48, 64 a 71 ľahkého reťazca a 26 - 30, 71 a 94 ťažkého reťazca (číslovanie podľa Kabata) sú schopné interagovať s CDR v mnohých protilátkach. Aminokyseliny v polohách 35 v ľahkom reťazci a 93 a 103 v ťažkom reťazci tiež pravdepodobne interagujú s CDR. Pri všetkých týchto číslovaných polohách je výhodnejší výber donomej aminokyseliny než akceptomej aminokyseliny (keď sa líšia) v humanizovanom imunoglobulíne. Na druhej strane určité zvyšky schopné interagovať s CDR oblasťou, ako je prvých 5 aminokyselín ľahkého reťazca, sa môže niekedy vybrať z akceptomého imunoglobulínu bez straty afinity v humanizovanom imunoglobulíne.
Zvyšky, ktoré sa nachádzajú na rozhraní VL-VH alebo skladacie zvyšky, zahŕňajú tie zvyšky na rozhraní medzi VL a VH, ktoré definuje napríklad Novotny a Haber, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 4592 - 66 (1985) alebo Chothia a kol., pozri vyššie. Nezvyklé skladacie zvyšky by sa mali vo všeobecnosti v humanizovanej protilátke zachovať, ak sa líšia od zvyškov v ľudských rámcových oblastiach.
Vo všeobecnosti sa substituuje jedna alebo dve aminokyseliny spĺňajúce uvedené kritériá. V niektorých praktických uskutočneniach sa substituujú všetky alebo väčšina aminokyselín spĺňajúcich uvedené kritériá. Niekedy je nejasné, či určitá aminokyselina spĺňa uvedené kritériá, a pripravia sa iné varianty imunoglobulínov, z ktorých jeden má túto substitúciu a druhý ju nemá. Takto pripravené varianty imunoglobulínov sa môžu skúšať ktoroukoľvek z opísaných skúšok na požadovanú aktivitu a môžu sa vyselektovať výhodné imunoglobulíny.
CDR oblasti v humanizovaných protilátkach sú obyčajne v zásade identické a bežnejšie identické so zodpovedajúcimi CDR oblasťami donomej protilátky. Hoci to nie je obyčajne žiaduce, je niekedy možné urobiť jednu alebo viac konzervatívnych substitúcií aminokyselín CDR zvyškov bez očividného ovplyvnenia väzbovej aktivity výsledného humanizovaného imunoglobulínu. Konzervatívnymi substitúciami sa myslia kombinácie, ako sú gly, ala; val, íle, leu; asp, glu; asn, gin; ser, thr, lys, arg; a phe, tyr.
Ďalšími kandidátmi na substitúciu sú aminokyseliny akceptomej ľudskej rámcovej oblasti, ktoré sú nezvyklé alebo zriedkavé pre ľudský imunoglobulín v tejto polohe. Tieto aminokyseliny sa môžu substituovať aminokyselinami z ekvivalentných polôh myšej donomej protilátky alebo z ekvivalentných polôh obvyklejších ľudských imunoglobulínov. Substitúcia môže byť napríklad žiaduca, keď aminokyselina v ľudskej rámcovej oblasti akceptomého imunoglobulínu je zriedkavá pre túto polohu a zodpovedajúca aminokyselina v donomom imunoglobulíne je bežná pre túto polohu v sekvencii ľudského imunoglobulínu; alebo keď aminokyselina akceptomého imunoglobulínu je zriedkavá pre túto polohu a zodpovedajúca aminokyselina v donornom imunoglobulíne je tiež zriedkavá v porovnaní s inými ľudskými sekvenciami. Tieto kritériá pomáhajú zaistiť, že atypická aminokyselina v ľudskej rámcovej oblasti nenaruší štruktúru protilátky. Navyše nahradením nezvyklej ľudskej aminokyseliny aminokyselinou z donomej protilátky, ktorá je náhodou typická pre ľudské protilátky, sa môže humanizovaná protilátka stať menej imunogénnou.
Výraz zriedkavá, ako sa tu používa, označuje aminokyselinu vyskytujúcu sa v tejto polohe v menej než asi 20 %, ale obvykle v menej než asi 10 % sekvencii v reprezentatívnej vzorke sekvencii, a výraz bežná, ako sa tu používa, označuje aminokyselinu vyskytujúcu sa vo viac než asi 25 %, ale obvykle vo viac než asi 50 % sekvencii v reprezentatívnej vzorke. Všetky ľudské sekvencie variabilnej oblasti ľahkého, prípadne ťažkého reťazca sa roztriedia do podskupín sekvencii, ktoré sú navzájom obzvlášť homológne a majú rovnaké aminokyseliny v určitých kritických polohách (Kabat a kol., pozri vyššie). Pri rozhodovaní, či aminokyselina v ľudskej akceptomej sekvencii je zriedkavá alebo bežná medzi ľudskými sekvenciami, bude často výhodné pokladať za akceptomú sekvenciu len ľudské sekvencie v tej istej podskupine.
Ďalšími kandidátmi na substitúciu sú aminokyseliny akceptomej ľudskej rámcovej oblasti, ktoré by sa identifikovali ako časť CDR oblasti podľa alternatívnej definície navrhnutej Chothiom a kol., pozri vyššie. Ďalšími kandidátmi na substitúciu sú aminokyseliny akceptomej ľudskej rámcovej oblasti, ktorá by sa identifikovala ako časť CDR oblasti podľa AbM definície a/alebo kontaktnej definície. Je pozoruhodné, že CDR1 vo variabilnom ťažkom reťazci je definovaná tak, že obsahuje zvyšky 26 - 32.
Ďalšími kandidátmi na substitúciu sú zvyšky akceptomej rámcovej oblasti, ktoré zodpovedajú zriedkavému alebo nezvyklému zvyšku donomej rámcovej oblasti. Zriedkavé alebo nezvyklé zvyšky donomej rámcovej oblasti sú tie, ktoré sú zriedkavé alebo nezvyklé (ako je tu definované) pre myšie protilátky v tejto polohe. Pre myšie protilátky sa podskupina môže určiť podľa Kabata a identifikovaných polôh zvyškov, ktoré sa líšia od konsenzu. Tieto rozdiely špecifické pre donor môžu poukazovať na somatické mutácie v myšej sekvencii, ktoré zvyšujú aktivitu. Zachovajú sa nezvyklé zvyšky, o ktorých sa predpokladá, že ovplyvňujú afinitu väzby, kým zvyšky, o ktorých sa predpokladá, že nie sú dôležité pre väzbu, sa môžu substituovať.
Ďalšími kandidátmi na substitúciu sú nezárodočné zvyšky vyskytujúce sa v akceptomej rámcovej oblasti. Keď napríklad reťazec akceptomej protilátky (t. j. reťazec ľudskej protilátky, ktorý má významnú identitu sekvencie s reťazcom donomej protilátky) sa porovná s reťazcom zárodočnej protilátky (ktorá má podobne významnú identitu sekvencie s donomým reťazcom), zvyšky, ktoré sa nezhodujú medzi rámcovou oblasťou akceptomého reťazca a rámcovou oblasťou zárodočného reťazca, sa môžu substituovať zodpovedajúcimi zvyškami zo zárodočnej sekvencie.
Čo sa týka iných ako špecifických substitúcií aminokyselín už diskutovaných, rámcové oblasti humanizovaných imunoglobulínov sú obvykle v zásade identické, obvyklejšie identické s rámcovými oblasťami ľudských protilátok, z ktorých boli odvodené. Samozrejme, mnohé z aminokyselín v rámcovej oblasti priamo prispievajú málo alebo vôbec neprispievajú k špecificite alebo afinite protilátky. Mnoho individuálnych konzervatívnych substitúcií zvyškov rámcovej oblasti sa tak môže tolerovať bez zjavnej zmeny špecificity alebo afinity výsledného humanizovaného imunoglobulínu. V jednom praktickom uskutočnení teda variabilná rámcová oblasť humanizovaného imunoglobulínu má aspoň 85 % identitu sekvencie so sekvenciou ľudskej variabilnej rámcovej oblasti alebo sa takéto sekvencie zhodujú, v inom praktickom uskutočnení má variabilná rámcová oblasť humanizovaného imunoglobulínu aspoň 90 %, výhodne 95 %, výhodnejšie 96 %, 97 %, 98 % alebo 99 % identitu sekvencii so sekvenciou ľudskej variabilnej rámcovej oblasti alebo sa také sekvencie zhodujú. Vo všeobecnosti sú však také substitúcie nežiaduce.
Humanizované protilátky výhodne prejavujú špecifickú väzbovú afinitu na antigén aspoň ΙΟ7, ΙΟ8, 109 alebo 1010 M'1. Horný limit väzbovej afinity humanizovaných protilátok na antigén je obyčajne trojnásobkom, štvornásobkom alebo päťnásobkom hodnoty donomého imunoglobulínu. Dolný limit väzbovej afinity je tiež často trojnásobkom, štvornásobkom alebo päťnásobkom hodnoty donomého imunoglobulínu. Väzbová afinita sa môže tiež porovnať s afinitou humanízovanej protilátky, ktorá nemá žiadne substitúcie (napr. protilátka, ktorá má donomé CDR a akceptomé FR, ale žiadne FR substitúcie). V takýchto prípadoch je väzba optimalizovanej protilátky (so substitúciami) výhodne aspoň dvakrát až trikrát väčšia alebo trikrát až štyrikrát väčšia než väzba nesubstituovanej protilátky. Na porovnanie sa môže stanoviť aktivita rozličných protilátok, napríklad pomocou BIACORE (t. j. povrchová plazmonová rezonancia pomocou neoznačených čini13
SK 288209 Β6 diel) alebo kompetičná väzbová skúška.
C. Príprava humanizovaných 3D6 protilátok
Výhodné praktické uskutočnenie tohto vynálezu predstavuje humanizovanú protilátku k N-koncu Αβ, menovite na použitie v opísaných terapeutických a/alebo diagnostických metodológiách. Zvlášť výhodným východiskovým materiálom na prípravu humanizovaných protilátok je 3D6. 3D6 je špecifický pre N-koniec Αβ a ukázalo sa, že sprostredkuje fagocytózu (napr. indukuje fagocytózu) amyloidových plakov (pozri príklady 1 - 5). Klonovanie a sekvenovanie cDNA kódujúcej variabilné oblasti ťažkého a ľahkého reťazca 3D6 protilátky je opísané v príklade 6.
Vhodné sekvencie ľudskej akceptomej protilátky sa identifikujú počítačovými porovnaniami sekvencii aminokyselín myších variabilných oblastí so sekvenciami známych ľudských protilátok. Porovnanie sa vykoná oddelene pre ťažký a ľahký reťazec, ale princípy sú podobné pre obidva. Variabilné domény z ľudských protilátok, ktorých sekvencie rámcových oblastí prejavujú vysoký stupeň identity sekvencii s myšími rámcovými oblasťami VL a VH, sa identifikovali dopytom v Kabátovej databáze pomocou NCBI BLAST (verejne dostupné cez NBCI intemetový server Národného inštitútu zdravia) s príslušnými sekvenciami myších rámcových oblastí. V jednom praktickom uskutočnení sa vyberú akceptomé sekvencie, ktoré majú väčšiu než 50 % identitu sekvencii s myšími donomými sekvenciami. Výhodne sa vyberú sekvencie akceptomých protilátok, ktoré majú rovnakých 60 %, 70 %, 80 %, 90 % a viac.
Počítačové porovnanie 3D6 ukázalo, že ľahký reťazec 3D6 prejavuje najväčšiu identitu sekvencii s ľudským subtypom ľahkého reťazca kapa II, a to, že ťažký reťazec 3D6 prejavuje najväčšiu identitu sekvencii s ľudskými ťažkými reťazcami subtypu II, ako sú definované Kabatom, pozri vyššie. Takže ľahká a ťažká ľudská rámcová oblasť sú výhodne odvodené od ľudských protilátok týchto subtypov alebo z konsenzuálnych sekvencii takých subtypov. Výhodné ľudské variabilné oblasti ľahkého reťazca prejavujúce najväčšiu identitu sekvencii so zodpovedajúcou oblasťou z 3D6 sú z protilátok, ktoré majú Kabatove ID čísla 019230, 005131, 005058, 005057, 005059, U21040 a U41645, pričom 019230 je výhodnejší. Výhodné ľudské variabilné oblasti ťažkého reťazca prejavujúce najväčšiu identitu sekvencii s zodpovedajúcou oblasťou z 3D6 sú protilátky, ktoré majú Kabatove ID čísla 045919, 000459,000553,000386 a M23691, pričom 045919 je výhodnejší.
Zvyšky na substitúciu sa ďalej vyberajú nasledujúcim spôsobom. Keď sa aminokyselina líši medzi 3D6 variabilnou rámcovou oblasťou a ekvivalentnou ľudskou variabilnou rámcovou oblasťou, potom aminokyselina ľudskej rámcovej oblasti by mala byť obvykle substituovaná ekvivalentnou myšou aminokyselinou, ak sa dá rozumne predpokladať, že táto aminokyselina:
(1) nekovalentne viaže antigén priamo, (2) susedí s CDR oblasťou, je časťou CDR oblasti v zmysle alternatívnej definície navrhnutej Chothiom a kol., pozri vyššie, alebo inak interaguje s CDR oblasťou (napr. do vzdialenosti asi 3 Á CDR oblasti) (napr. aminokyseliny v polohách L2, H49 a H94 z 3D6), alebo (3) sa nachádza na rozhraní VL-VH (napr. aminokyseliny v polohách L36, L46 a H93 z 3D6).
Počítačové modelovanie variabilných oblastí ťažkého a ľahkého reťazca 3D6 protilátky a humanizácia
3D6 protilátky sú opísané v príklade VII. V stručnosti, vytvoril sa trojrozmerný model založený na najbližších vyriešených štruktúrach myších protilátok pre ťažké a ľahké reťazce. Na tento účel sa zvolila protilátka označená 1CR9 (Protein Data Bank (PDB) ID: 1CR9, Kanyo a kol., J. Mol. Biol. 293: 855 (1999)) ako vzor na modelovanie 3D6 ľahkého reťazca a protilátka označená 1OPG (PDB ID. 1OPG, Kodandapani a kol., J. Biol. Chem. 270: 2268 (1995)) ako vzor na modelovanie ťažkého reťazca. Model sa ďalej zdokonalil sériou krokov minimalizujúcich energiu, čo odstránilo nevýhodné kontakty atómov a optimalizovalo elektrostatické a Van der Waalsove interakcie. Vyriešená štruktúra lqkz (PDB ID: 1QKZ, Derrick a kol., J. Mol. Biol. 293: 81 (1999)) sa zvolila ako vzor na modelovanie CDR3 ťažkého reťazca, keďže 3D6 a 10PG neprejavili významnú homológiu sekvencii, keď sa zorientovali na porovnanie.
Trojrozmerná štruktúrna informácia pre opísané protilátky je verejne dostupná, napríklad z Protein Bank (Proteínovej banky) (PDB) v Research Collaboratory for Structural Bioinformatics (Spoločnom výskumnom laboratóriu pre štruktúrnu bioinformatiku). PDB je voľne dostupná cez World Wide Web internet aje opísaná Bermanom a kol., (2000) Nucleic Acids Research, 28: 235. Počítačové modelovanie umožňuje identifikáciu zvyškov ineragujúcich s CDR. Počítačový model štruktúry 3D6 môže následne slúžiť ako východiskový bod na predpovedanie trojrozmernej štruktúry protilátky obsahujúcej komplementaritu určujúce oblasti 3D6 substituované v štruktúrach ľudskej rámcovej oblasti. Môžu sa skonštruovať ďalšie modely, ktoré reprezentujú štruktúru, keď sa zavedú ďalšie substitúcie aminokyselín.
Vo všeobecnosti je žiaduce substituovať jednu, väčšinu alebo všetky aminokyseliny spĺňajúce uvedené kritériá. Humanizované protilátky podľa tohto vynálezu budú teda obvykle obsahovať substitúciu zvyšku rámcovej oblasti ľudského ľahkého reťazca so zodpovedajúcim zvyškom 3D6 aspoň v 1, 2 alebo 3 a obvyklejšie v 4 z nasledujúcich polôh: Ll, L2, L36 a L46. Humanizované protilátky tiež obvykle obsahujú substitúciu zvyšku rámcovej oblasti ľudského ťažkého reťazca zodpovedajúcim zvyškom 3D6 aspoň v 1, 2 a niekedy
SK 288209 Β6 v 3 z nasledujúcich polôh: H49, H93 a H94. Humanizované protilátky môžu tiež obsahovať substitúciu zvyšku rámcovej oblasti ťažkého reťazca zodpovedajúcim zárodočným zvyškom aspoň v 1, 2 a niekedy v 3 z nasledujúcich polôh: H74, H77 a H89.
Niekedy je však nejasné, či určitá aminokyselina spĺňa uvedené kritériá, a pripravia sa iné varianty imunoglobulínov, z ktorých jeden má túto substitúciu a druhý ju nemá. V prípadoch, keď by substitúcia myším zvyškom zaviedla zvyšok, ktorý je zriedkavý v ľudských imunoglobulínoch v konkrétnej polohe, môže byť žiaduce otestovať protilátku na aktivitu s týmto zvyškom a bez neho. Ak aktivita (napr. väzbová afinita a/alebo väzbová špecificita) je približne rovnaká so substitúciou a bez nej, potom sa môže preferovať protilátka bez substitúcie, keďže sa dá očakávať, že vyvolá menšiu HAHA odozvu, ako sa tu opisuje.
Ďalšími kandidátmi na substitúciu sú aminokyseliny akceptomej ľudskej rámcovej oblasti, ktoré sú nezvyklé pre ľudský imunoglobulín v tejto polohe. Tieto aminokyseliny sa môžu substituovať aminokyselinami z ekvivalentných polôh typickejších ľudských imunoglobulínov. Aminokyseliny z ekvivalentných polôh myšieho 3D6 sa môžu zaviesť do ľudských rámcových oblastí, keď sú takéto aminokyseliny obvyklé pre ľudský imunoglobulín v ekvivalentných polohách.
V ďalších praktických uskutočneniach, keď akceptomým imunoglobulínom rámcovej oblasti ľudského ľahkého reťazca je Kabat ID číslo 019230, obsahuje ľahký reťazec substitúcie aspoň v 1, 2, 3,4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 alebo bežnejšie v 13 z nasledujúcich polôh: L7, L10, L12, L15, L17, L39, L45, L63, L78, L83, L85, L100 alebo L104. V ďalších praktických uskutočneniach, keď akceptomým imunoglobulínom rámcovej oblasti ľudského ťažkého reťazca je Kabat ID číslo 045919, obsahuje ťažký reťazec substitúcie aspoň v 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 alebo bežnejšie v 15 z nasledujúcich polôh: H3, H5, H13, H16, H40, H41, H42, H44, H72, H77, H82A, H83, H84 alebo H108. Tieto polohy sú substituované aminokyselinou z ekvivalentnej polohy ľudského imunoglobulínu, ktorý má typickejší aminokyselinový zvyšok. Príklady vhodných aminokyselín na substitúciu sú uvedené na obrázkoch 1 a 2.
Inými kandidátmi na substitúciu sú nezárodočné zvyšky, ktoré sa vyskytujú v rámcovej oblasti. Počítačové porovnanie 3D6 so známymi zárodočnými sekvenciami ukázalo, že ťažké reťazce vykazujúce najväčší stupeň identity sekvencií, obsahujú zárodočné sekvencie variabilnej oblasti VH3-48, VH3-23, VH3-7, VH321a VH3-11, pričom VH3-23 je výhodnejší. Porovnanie Kabat ID 045919 s VH3-23 ukazuje, že na substitúciu zodpovedajúcimi zárodočnými zvyškami sa môžu zvoliť zvyšky H74, H77 a/alebo H89 (napr. zvyšky H74, H77 a/alebo H89, keď sa porovná Kabat ID 045919 a VH3-23). Podobne zárodočné sekvencie, ktoré majú najväčší stupeň identity s ľahkým reťazcom 3D6, obsahujú Al, A17, A18, A2 a A19, pričom A19 je výhodnejší. Zvyšky, ktoré sa nezhodujú medzi zvolenou akceptomou rámcovou oblasťou ľahkého reťazca a jednou z týchto zárodočných sekvencií, by sa mohli vybrať na substitúciu zodpovedajúcim zárodočným zvyškom.
V tabuľke 1 je zhrnutá sekvenčná analýza VH a VL oblastí 3D6. Sú tu uvedené ďalšie myšie a ľudské štruktúry, ktoré sa môžu použiť na počítačové modelovanie 3D6 protilátky, a ďalšie ľudské protilátky, rovnako ako aj zárodočné sekvencie, ktoré sa môžu použiť pri voľbe substitúcií aminokyselín. Zriedkavé myšie zvyšky sú tiež uvedené v tabuľke 1. Zriedkavé myšie zvyšky sa identifikujú porovnaním donomých VL a/alebo VH sekvencií so sekvenciami iných prvkov podskupiny, do ktorej tieto donomé VL a/alebo VH sekvencie patria (podľa Kabata), a identifikáciou polôh zvyškov, ktoré sa líšia od konsenzu. Tieto špecifické rozdiely donora môžu ukázať na somatické mutácie, ktoré zvyšujú aktivitu. Nezvyklé alebo zriedkavé zvyšky v blízkosti väzbového miesta sa môžu prípadne dostať do styku s antigénom, čím sa stáva zachovanie myšieho zvyšku žiaducim. Ak však nezvyklý myší zvyšok nie je dôležitý pre väzbu, potom sa uprednostní použitie zodpovedajúceho akceptomého zvyšku, keďže myší zvyšok môže vytvoriť imunogénne neoepitopy v humanizovanej protilátke. V situácii, keď nezvyklý zvyšok v donomej sekvencií je v skutočnosti bežným zvyškom v zodpovedajúcej akceptomej sekvencií, potom preferovaným zvyškom je jasne akceptomý zvyšok.
Tabuľka 1: Prehľad V-oblasti sekvencie 3D6
Reťazec Ťažký Ľahký
Myšia podskupina (Kabatova sekv. ID č.) IIID (002688) II (005840-005844, 005851-005853, 005857, 005863)
Myšie homológy (Kabat/Genbank) 002727/163. l'CL 002711/H35-C6'CL 002V33/8-1-12-5-3-l(A2-l)’CL 002715/ASWA2'CL 020669/# 14'CL 005840/1210.7 005843/42.4b.l2.2'CL 005842/BXW-14'CL 005841/42.7B3.2'CL 005851/36-60CRI-
Zriedkavé aminokyseliny (frekvencia výskytu v triede v %) N40 (0,233 %) D42 (0,699 %) Yl (0,35 %) 115 (3,3 %) D27 (0,867 %)-CDRl 178 (0,677 %) L85 (0,625 %)
Reťazec Ťažký Ľahký
W89 (0,815 %)-CDR3 K106A (0,295 %)
Ľudská podskupina III (000488-000491, 000503, 000624) II (005046)
Chothiovo kánonické rozdelenie CDR do skupín [príklad pdb] Hl: trieda 1 [2fbj] H2: trieda 3 [lige] Ll: trieda 4 [lrmf] L2: trieda 1 [llmk] L3: trieda 1 [ltet]
Najbližšia vyriešená myšia štruktúra PDB ID: 1OPG Kodandapani a kol., pozri vyššie; (72 % 2Á) PDB ID: 1CR9; Kanyo a kol., pozri vyššie (94 %, 2Á) PDB ID: 1NLD; Davies a kol., Acta Crystallog. D. Biol. Crystallog. 53: 186 (1997); (98 %, 2,8Á)
Najbližšia vyriešená ľudská štruktúra 1VH (68 %, nmr) 443560 (65 %, IgG, λ myelóm, 1,8Á) KOL/2FB4H (60 %, myelóm, 3Á) 1LVE (57 %, LEN) 1B6DA (54 %, B-J dimér, 2,8Á); 1VGEL (54 %, autoAb)
Výsledky zárodočného dopytu (Hu) (prvé 4) VH3-48 (4512283/BAA75032.1) VH3-23 (4512287/BAA75046.1) VH3-7 (4512300/BAA75056.1) VH3-21 (4512287/BAA75047.1) VH3-11 (4152300/B AA75053.1) Al (x63402) A17 (x63403) A18(x63396) A2(x31952) A19(x63397)
*ťažký reťazec a ľahký reťazec z tej istej protilátky (0-81, Hirabayashi a kol., NAR 20: 2601).
Tu uvedené odkazy na Kabat ID sekvencie sú verejne dostupné, napríklad v Kabátovej databáze sekvencii imunologický zaujímavých proteínov na Katedre biomedicínskeho inžinierstva, Northwestern University. Je tu verejne dostupná trojrozmerná štruktúrna informácia pre protilátky z Protein Data Bank, Research Collaboratory for Structural Bioinformatics (PDB). PDB je voľne prístupná cez World Wide Web internet a je opísaná Bermanom a kol. (2000) Nucleic Acids Research, s. 235 - 242. Uvedené odkazy na zárodočné génové sekvencie sú verejne dostupné, napríklad z databázy sekvencii National Center for Biotechnology Information (NCBI) v zbierkach Igh, lg kapa a lg lambda zárodočných V génov (ako oddelenie National Library of Medicíne (Národnej knižnice medicíny (NLM) pri Národných inštitútoch zdravia (NIH)). Hľadanie homológie v NCBI databáze lg zárodočné gény sa vykonáva pomocou IgG BLAST™.
Vo výhodnom praktickom uskutočnení obsahuje humanizovaná protilátka tohto vynálezu (i) ľahký reťazec s variabilnou doménou obsahujúcou myšie VL 3D6 CDR a ľudskú akceptomú rámcovú oblasť, pričom táto rámcová oblasť má aspoň jeden, výhodne dva, tri alebo štyri zvyšky vybraté zo skupiny obsahujúcej Ll, L2, L36 a L46 substituované zodpovedajúcim 3D6 zvyškom, a (ii) ťažký reťazec obsahujúci VH 3D6 CDR a ľudskú akceptomú rámcovú oblasť, pričom táto rámcová oblasť má aspoň jeden, výhodne dva alebo tri zvyšky vybraté zo skupiny obsahujúcej H49, H93 a H94 substituované zodpovedajúcim 3D6 zvyškom, a prípadne aspoň jeden, výhodne dva alebo tri zvyšky zo skupiny obsahujúcej H74, H77 a H89 sú substituované zodpovedajúcim ľudským zárodočným zvyškom.
Vo výhodnejšom praktickom uskutočnení obsahuje humanizovaná protilátka tohto vynálezu (i) ľahký reťazec s variabilnou doménou obsahujúcou myšie CDR VL 3D6 a ľudskú akceptomú rámcovú oblasť, pričom táto rámcová oblasť má zvyšok 1 substituovaný tyr (Y), zvyšok 2 substituovaný val (V), zvyšok 36 substituovaný leu (L) a/alebo zvyšok 46 substituovaný arg (R), a (ii) ťažký reťazec obsahujúci CDR VH 3D6 a ľudskú akceptomú rámcovú oblasť, pričom táto rámcová oblasť má zvyšok 49 substituovaný ala (A), zvyšok 93 substituovaný val (V), a/alebo zvyšok 94 substituovaný arg (R), a prípadne má zvyšok 74 substituovaný ser (S), zvyšok 77 substituovaný thr (T) a/alebo zvyšok 89 substituovaný val (V).
Vo zvlášť výhodnom praktickom uskutočnení má humanizovaná protilátka tohto vynálezu opísané štruktúrne znaky a ďalej má aspoň jednu (výhodne dve, tri, štyri alebo všetky) z nasledujúcich aktivít: (1) viaže agregovaný Αβί - 42 (napr. ako sa stanoví metódou ELISA); (2) viaže Αβ v plakoch (napr. farbenie AD a/alebo PDAPP plakov); (3) viaže Αβ s dvoj- až trojnásobne vyššou väzbovou afinitou v porovnaní s chimérickým 3D6 (napr. 3D6, ktorý má myšie CDR a ľudskú akceptomú FR); (4) sprostredkuje fagocytózu Αβ (napr. vo fagocytóznej skúške ex vivo, ako sa tu opisuje); a (5) prechádza cez hematoencefalitickú bariéru (napr. prejavuje krátkodobú mozgovú lokalizáciu napríklad v PDAPP zvieracom modeli, ako sa tu opisuje).
V inom praktickom uskutočnení má humanizovaná protilátka tohto vynálezu opísané štruktúrne znaky, viaže Αβ takým spôsobom alebo s takou afinitou, ktorá je dostatočná na vyvolanie aspoň jedného z nasledujúcich účinkov in vivo: (1) znižuje množstvo Αβ plakov; (2) zabraňuje tvorbe plakov; (3) znižuje hladinu rozpustného Αβ; (4) obmedzuje neuritickú patológiu spojenú s amyloidogénnym ochorením; (5) zmenšuje alebo zlepšuje aspoň jeden fyziologický príznak súvisiaci s amyloidogénnym ochorením; a/alebo (6) zlepšuje kognitívnu fúnkciu.
V inom praktickom uskutočnení má humanizovaná protilátka tohto vynálezu opísané štruktúrne vlastnosti
SK 288209 Β6 a špecificky sa viaže na epitop obsahujúci zvyšky Αβ 1 - 5 alebo 3-7.
3. Ľudské protilátky
Ľudské protilátky proti Αβ poskytuje rad nižšie opísaných techník. Niektoré ľudské protilátky sú vyselektované kompetičnými väzbovými experimentmi alebo inak, aby mali rovnakú epitopovú špecificitu ako určitá myšia protilátka, napríklad jedna z opísaných myších monoklonálnych protilátok. Ľudské protilátky sa tiež môžu triediť na určitú epitopovú špecificitu použitím samotného fragmentu Αβ ako imunogénu a/alebo triedením protilátok proti zbierke delečných mutantov Αβ. Ľudské protilátky majú výhodne špecificitu ľudského IgGl izotypu.
a. Triómová metodológia
Základný prístup a ukážkového partnera bunkovej fúzie SPAZ-4 na použitie v tomto prístupe opísal Oestberg a kol., Hybridoma 2: 361 (1983); Oestberg, patent USA č. 4 634 664; a Engleman a kol., patent USA
634 666 (všetky sú tu zaradené ako odkaz vo svojej celosti a na všetky účely). Bunkové línie produkujúce protilátky získané touto metódou sa nazývajú triómy, pretože pochádzajú z troch buniek: dvoch ľudských a jednej myšej. Najprv sa línia myšieho myelómu fúzuje s ľudským B-lymfocytom, čím sa získa protilátku neprodukujúca xenogénna hybridná bunka, ako je bunková línia SPAZ-4 opísaná Oestbergom, pozri vyššie. Xenogénna bunka sa potom fúzuje s imunizovaným B-lymfocytom, čím sa získa protilátku produkujúca triómová bunková línia. Zistilo sa, že triómy produkujú protilátku stabilnejšie ako obyčajné hybridómy pripravené z ľudských buniek.
Imunizované B-lymfocyty sa získajú z krvi, sleziny, lymfatických uzlín alebo kostnej drene ľudského darcu. Ak sa vyžadujú protilátky na špecifický antigén alebo epitop, je výhodné použiť tento antigén alebo jeho epitop na imunizáciu. Imunizácia môže byť buď in vivo alebo in vitro. Na in vivo imunizáciu sa obvykle izolujú B-bunky z človeka imunizovaného Αβ, jeho fragmentom, dlhším polypetidom obsahujúcim Αβ alebo fragment, alebo antiidiotypovou protilátkou k protilátke k Αβ. Pri niektorých metódach sa B-bunky izolujú z rovnakého pacienta, ktorému sa nakoniec podáva protilátková terapia. Pri in vitro imunizácii sa obvykle na B-lymfocyty pôsobí antigénom počas 7-14 dní v prostredí, ako je RPMI-1640 (pozri Engleman, vyššie) s prídavkom 10 % ľudskej plazmy.
Imunizované B-lymfocyty sa fúzujú s xenogénnou hybridnou bunkou, ako je SPAZ-4, pomocou dobre známych metód. Napríklad sa na bunky pôsobí 40 - 50 % polyetylénglykolom s MW 100 - 4000 asi pri 37 stupňoch C počas asi 5 - 10 minút. Bunky sa oddelia od fúznej zmesi a množia sa v prostredí selektívnom pre požadované hybridy (napr. HAT alebo AH). Klony vylučujúce protilátky, ktoré majú vyžadovanú väzbovú špecificitu, sa identifikujú skúšaním triómového kultivačného média na schopnosť viazať sa na Αβ alebo jeho fragment. Triómy produkujúce ľudské protilátky, ktoré majú vyžadovanú špecificitu, sa subklonujú limitnou zrieďovacou technikou a kultivujú sa in vitro v kultivačnom médiu. Získaná triómová bunková línia sa potom skúša na schopnosť viazať Αβ alebo jeho fragment.
Hoci triómy sú geneticky stabilné, neprodukujú protilátky vo veľmi veľkých množstvách. Hladiny expresie sa môžu zvýšiť klonovaním génov protilátky z triómov do jedného alebo viacerých expresných vektorov a transformovaním vektora do štandardnej bunkovej línie cicavca, alebo bakteriálnej, alebo kvasinkovej bunkovej línie.
b. Transgenické neľudské cicavce
Ľudské protilátky na Αβ sa môžu tiež pripraviť z neľudských transgenických cicavcov, ktoré majú transgény zakódované aspoň segmentom ľudského imunoglobulínového lokusu. Endogénny imunoglobulínový lokus takýchto transgenických cicavcov je obvykle funkčne inaktivovaný. Segment ľudského imunoglobulínu obsahuje nepreskupené sekvencie zložiek ťažkého a ľahkého reťazca. Inaktivácia endogénnych imunoglobulínových génov a zavedenie exogénnych imunoglobulinových génov sa môže dosiahnuť cielenou homológnou rekombináciou alebo zavedením YAC chromozómov. Transgenické cicavce, ktoré sú výsledkom tohto procesu, sú schopné funkčne preskupiť sekvencie imunoglobulinových zložiek a exprimovať repertoár protilátok rozličných izotypov zakódovaných génmi ľudského imunoglobulínu, bez expresie endogénnych imunoglobulinových génov. Príprava a vlastnosti cicavcov, ktoré majú tieto vlastnosti, sú podrobne opísané napr. v Lonberg a kol., WO93/12227 (1993); US 5 877 397, US 5 874 299, US 5 814 318, US 5 789 650, US
770 429, US 5 661 016, US 5 633 425, US 5 625 126, US 5 569 825, US 5 545 806, Náture 148: 1547 (1994), Náture Biotechnology 14: 826 (1996), Kucherlapati, WO 91/10741 (1991) (všetky sú tu zaradené ako odkaz vo svojej celosti na všetky účely). Transgenické myši sú zvlášť vhodné. Anti-Αβ protilátky sa získajú imunizáciou transgenického neľudského cicavca, ako opisuje Lonberg alebo Kucherlapati, pozri vyššie, Αβ alebo jeho fragmentom. Monoklonálne protilátky sa pripravia napr. fúzovaním B-buniek z takýchto cicavcov s vhodnou bunkovou líniou myelómu pomocou bežnej Kohler-Milsteinovej technológie. Ľudské polyklonálne protilátky sa môžu tiež získať vo forme séra z ľudí imunizovaných imunogénnym činidlom. Takéto polyklonálne protilátky sa môžu prípadne zakoncentrovať afinitným čistením pomocou Αβ alebo iného amyloid17
SK 288209 Β6 neho peptidu ako afinitného činidla.
c. Metódy phage display
Ďalším prístupom na získanie ľudských anti-Αβ protilátok je skríning knižnice DNA z ľudských B-buniek podľa všeobecného protokolu, ktorý navrhol Huse a kol., Science 246: 1275 - 1281 (1989). Ako je opísané pre triómovú technológiu, takéto B-bunky sa môžu získať z človeka imunizovaného Αβ, z fragmentov, dlhších polypeptidov obsahujúcich Αβ alebo fragmenty, alebo z anti-idiotypových protilátok. Takéto B-bunky sa prípadne získajú z pacienta, ktorému sa nakoniec podáva protilátková terapia. Vyselektujú sa protilátky viažuce sa na Αβ alebo na jeho fragment. Sekvencie kódujúce takéto protilátky (alebo väzbové fragmenty) sa potom klonujú a amplifikujú. Protokol opísaný Husem sa stane účinnejším v kombinácii s technológiou phage-display. Pozri napr. Dower a kol., WO 91/17271, McCafferty a kol., WO 92/01047, Herzig a kol., US 5 877 218, Winter a kol., US 5 871 907, Winter a kol., US 5 858 657, Holliger a kol., US 5 837 242, Johnson a kol., US 5 733 743 a Hoogenboom a kol., US 5 565 332 (všetky sú tu zaradené ako odkaz vo svojej celosti na všetky účely). V týchto metódach sa vytvoria knižnice fágov, v ktorých členy predstavujú rozličné protilátky na svojich vonkajších povrchoch. Protilátky sú väčšinou predstavené ako F v alebo Fab fragmenty. Protilátky predstavené fágom s vyžadovanou špecifickou sa vyselektujú pomocou afinitného obohatenia k peptidu Αβ alebo k jeho fragmentu.
Vo variante phage-display metódy sa môžu pripraviť ľudské protilátky, ktoré majú väzbovú špecificitu vybratej myšej protilátky. Pozri Winter, WO 92/20791. V tejto metóde sa ako východiskový materiál použije variabilná oblasť buď ťažkého, alebo ľahkého reťazca vybratej myšej protilátky. Ak sa napríklad ako východiskový materiál zvolí variabilná oblasť ľahkého reťazca, potom sa vytvorí knižnica fágov, v ktorej členy predstavujú rovnakú variabilnú oblasť ľahkého reťazca (t. j. myší východiskový materiál) a odlišnú variabilnú oblasť ťažkého reťazca. Variabilné oblasti ťažkého reťazca sa získajú z knižnice preskupených variabilných oblastí ľudského ťažkého reťazca. Vyberie sa fág vykazujúci silnú špecifickú väzbu na Αβ (napr. aspoň 108 M'1). Variabilná oblasť ľudského ťažkého reťazca z tohto fágu potom slúži ako východiskový materiál na zostavenie ďalšej knižnice fágov. V tejto knižnici každý fág predstavuje rovnakú variabilnú oblasť ťažkého reťazca (t. j. oblasť identifikovanú z prvej vystavenej knižnice) a odlišnú variabilnú oblasť ľahkého reťazca. Variabilné oblasti ľahkého reťazca sa získajú z knižnice preskupených oblastí ľudského variabilného ľahkého reťazca. Opäť sa vyberie fág vykazujúci silnú špecifickú väzbu na Αβ. Tieto fágy predstavujú variabilné oblasti kompletných ľudských anti-Αβ protilátok. Tieto protilátky obvykle majú rovnakú alebo podobnú epitopovú špecificitu ako myší východiskový materiál.
4. Príprava variabilných oblastí
Ak sú v princípe vybraté CDR a rámcové oblasti humanizovaných imunoglobulínov, existuje veľa metód na prípravu takýchto imunoglobulínov. Kvôli degenerácii kódu bude rad sekvencií nukleových kyselín kódovať každú sekvenciu aminokyselín imunoglobulínu. Požadované sekvencie aminokyselín je možné pripraviť de novo syntézou DNA v tuhej fáze alebo PCR mutagenézou skôr pripraveného variantu požadovaného nukleotidu.
Mutagenéza sprostredkovaná oligonukleotidom je výhodnou metódou na prípravu substitučných, delečných a inzerčných variantov DNA terčového polypeptidu. Pozri Adelman a kol., DM42: 183 (1983). V stručnosti, DNA terčového polypeptidu sa mení hybridizáciou oligonukleotidu kódujúceho požadovanú mutáciu na vzore jednoduchého reťazca DNA. Po hybridizácii sa použije DNA polymeráza na syntézu úplného druhého komplementárneho reťazca vzoru, ktorý obsahuje primér oligonukleotidu a kóduje zvolené alternácie v DNA terčového polypeptidu.
5. Výber konštantných oblastí
Variabilné segmenty protilátok, ktoré sa pripravia podľa uvedeného opisu (napr. variabilné oblasti ťažkých a ľahkých reťazcov chimérickej, humanizovanej alebo ľudskej protilátky) sa obvykle pospájajú aspoň do časti konštantnej oblasti (Fc) imunoglobulínu, obvykle do konštantnej oblasti ľudského imunoglobulínu. Sekvencie DNA ľudskej konštantnej oblasti sa môžu izolovať podľa dobre známych postupov z celej škály ľudských buniek, ale výhodne z umŕtvených B-buniek (pozri Kabat a kol., vyššie a Liu a kol., WO87/02671) (každý z nich je tu zaradený ako odkaz vo svojej celosti na všetky účely). Protilátka bude spravidla obsahovať konštantné oblasti ľahkého aj ťažkého reťazca. Konštantná oblasť ťažkého reťazca obyčajne obsahuje oblasti CH1, kĺb, CH2, CH3 a CH4. Opísané protilátky zahŕňajú protilátky, ktoré majú všetky typy konštantných oblastí, vrátane IgM, IgG, IgD, IgA a IgE a akýkoľvek izotyp, vrátane IgGl, IgG2, IgG3 a IgG4. Voľba konštantnej oblasti závisí sčasti na tom, či sa vyžaduje protilátkovo závislá komplementárna a/alebo bunková sprostredkovaná toxicita. Napríklad izotypy IgGl a IgG3 majú komplementárnu aktivitu a izotypy IgG2 a IgG4 ju nemajú. Ak sa vyžaduje, aby protilátka (napr. humanizovaná protilátka) prejavovala cytotoxickú aktivitu, konštantná doména je obvykle komplement fixujúca konštantná doména a trieda je obvykle IgG 1. Keď sa taká cytotoxická aktivita nevyžaduje, konštantná doména môže byť triedy IgG2. Výber izotypu môže tiež
SK 288209 Β6 ovplyvniť prechod protilátky do mozgu. Výhodný je ľudský izotyp IgGl. Konštantné oblasti ľahkého reťazca môžu byť lambda alebo kapa. Humanizovaná protilátka môže obsahovať sekvencie z viac než jednej triedy alebo izotypu. Protilátky sa môžu exprimovať ako tetraméry obsahujúce dva ľahké a dva ťažké reťazce, ako samostatné ťažké reťazce, ľahké reťazce, ako Fab, Fab', F(ab')2 a Fv alebo ako jednoreťazcové protilátky, v ktorých variabilné oblasti ťažkého a ľahkého reťazca sú spojené spacerom.
6. Expresia rekombinantných protilátok
Chimérické, humanizované a ľudské protilátky sa obvykle pripravujú rekombinantnou expresiou. Nukleové kyseliny kódujúce variabilné oblasti humanizovaného ľahkého a ťažkého reťazca, prípadne spojené s konštantnými oblasťami, sa zavedú do expresného vektora. Ľahké a ťažké reťazce sa môžu klonovať v rovnakých alebo rozdielnych expresných vektoroch. Segmenty DNA kódujúce imunoglobulínové reťazce sa operabilne spoja do riadiacich sekvencií v expresnom vektore (vektoroch), ktorý zabezpečuje expresiu imunoglobulínových peptidov. K expresným riadiacim sekvenciám patria, ale neobmedzujú sa iba na ne, promótory (napr. prirodzene asociované alebo heterológne promótory), signálne sekvencie, enhancerové prvky a transkripčné ukončovacie sekvencie. Sekvencie na riadenie expresie sú výhodne eukaryotické promótorové systémy vo vektoroch schopných transformácie alebo transfekcie eukaryotických hostiteľských buniek. Keď sa tento vektor už zaviedol do vhodného hostiteľa, hostiteľ sa udržiava za podmienok vhodných na vysokú úroveň expresie sekvencií nukleotidov a na oddelenie a čistenie krížovo reagujúcich protilátok.
Tieto expresné vektory sú obvykle replikovateľné v hostiteľských organizmoch buď ako epizoméry, alebo ako integrálna súčasť chromozomálnej DNA hostiteľa. Expresné vektory obyčajne obsahujú selekčné markery (napr. ampicilínovej rezistencie, hygromycínovej rezistencie, tetracyklínovej rezistencie alebo neomycínovej rezistencie), čo umožňuje detegovať bunky transformované požadovanou DNA sekvenciou (pozri napr. Itakura a kol., patent USA č. 4 704 362).
E. coli je prokaryotický hostiteľ mimoriadne vhodný na klonovanie polynukleotidov (napr. DNA sekvencií) tohto vynálezu. Inými mikrobiálnymi hostiteľmi vhodnými na použitie sú bacily, ako je Bacillus subtilus, a iné enterobaktérie, ako sú Salmonella, Serratia a rozličné druhy Pseudomonas. N týchto prokaryotických hostiteľoch sa dajú tiež urobiť expresné vektory, ktoré budú obvykle obsahovať sekvencie na riadenie expresie kompatibilné s hostiteľskou bunkou (napr. začiatok replikácie). Okrem toho môže byť prítomné ľubovoľné množstvo rozličných známych promótorov, ako je laktózový promótorový systém, tryptofánový (trp) promótorový systém, beta-laktamázový promótorový systém alebo promótorový systém z fágu lambda. Promótory budú obvykle riadiť expresiu, prípadne s operátorovou sekvenciou, a majú sekvencie ribozómových väzbových miest a pod. na inicializáciu a dokončenie transkripcie a translácie.
Iné mikróby, ako sú kvasinky, sa dajú tiež použiť na expresiu. Výhodný kvasinkový hostiteľ je Saccharomyces s vhodnými vektormi, ktoré majú podľa potreby sekvencie na riadenie expresie (napr. promótory), začiatok replikácie, terminačné sekvencie a podobne. K typickým promótorm patria 3-fosfoglycerátkináza a iné glykolytické enzýmy. K inducibilným kvasinkovým promótorom patria okrem iných promótory z alkoholdehydrogenázy, izocytochróm C a enzýmy zodpovedné za využitie maltózy a galaktózy.
Okrem mikroorganizmov sa aj tkanivo cicavcov môže použiť na expresiu a produkciu polypeptidov tohto vynálezu (napr. polynukleotidov kódujúcich imunoglobulíny alebo ich fragmenty). Pozri Winnacker, From Genes to Clones (Odgénov ku klonom), VCH Publishers, N. Y., N. Y. (1987). Eukaryotické bunky sa v skutočnosti preferujú, pretože sa vyvinulo značné množstvo vhodných hostiteľských bunkových línií v tomto odbore na sekréciu heterológnych proteínov (napr. intaktných imunoglobulínov), a patria sem bunkové línie COH, rozličné bunkové línie Cos, HeLa bunky, výhodne myelómové bunkové línie alebo trasformované B-bunky alebo hybridómy. Bunky sú výhodne neľudské. Expresné vektory pre tieto bunky obsahujú sekvencie na riadenie expresie, ako je začiatok replikácie, promótor a enhancer (Queen a kol., Immunol. Rev. 89: 49 (1986)), a potrebné miesta spracovania informácie, ako sú ribozómové väzbové miesta, miesta splietania RNA, polyadenylačné miesta a transkripčné terminačné sekvencie. Výhodnými sekvenciami na riadenie expresie sú promótory odvodené z imunoglobulínových génov, SV40, adenovírus, hovädzí papilomavírus, cytomegalovírus a podobne. Pozri Co a kol., J. Immunol. 148: 1149 (1992).
Je tiež možné zabudovať sekvencie kódujúce protilátku do transgénov na zavedenie do genómu transgenického živočícha a následnú expresiu do mlieka transgenického živočícha (pozri napr. Deboer a kol., US 5 741 957, Rosen US 5 304 486 a Meade a kol., US 5 849 992). Vhodné transgény obsahujú kódovacie sekvencie pre ľahký a ťažký reťazec v operabilnom spojení s promótorom a enhancerom zo špecifického génu cicavčej žľazy, ako je kazeín alebo beta laktoglobulín.
Vektory obsahujúce zaujímavé sekvencie polynukleotidov (napr. sekvencie kódujúce ťažký a ľahký reťazec a sekvencie na riadenie expresie) sa môžu preniesť do hostiteľskej bunky známymi metódami, ktoré sa budú meniť v závislosti na bunkovom hostiteľovi. Napríklad transfekcia chloridu vápenatého sa bežne využíva pre prokaryotické bunky, kým pre iných bunkových hostiteľov sa môže použiť pôsobenie fosforečnanu vápenatého, elektroporácia, lipofekcia, biolistika alebo transfekcia na vírusovej báze. (Pozri vo všeobecnosti Sambrook a kol., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Molekulárne klonovanie. Laboratórna príručka
SK 288209 Β6 (Cold Spring Harbor Press, 2. vyd., 1989) (zaradené tu ako odkaz v jeho celosti na všetky účely)). K iným metódam používaným na transformáciu cicavčích buniek patrí použitie polybrénu, protoplastová fúzia, lipozómy, elektroporácia a mikroinjekcia (pozri vo všeobecnosti Sambrook a kol., vyššie). Na prípravu transgenických zvierat sa môžu transgény mikroinjikovať do oplodnených oocytov alebo sa môžu zavrieť do genómu embryonických kmeňových buniek, a jadrá takýchto buniek preniesť do enukleovaných oocytov.
Keď sa ťažký a ľahký reťazec klonujú na samostatných expresných vektoroch, tieto vektory sa kotransfektujú, aby sa tak dosiahla expresia a vytvorenie intaktného imunoglobulínu. Takto exprimované úplné protilátky, ich diméry, individuálne ľahké a ťažké reťazce alebo iné imunoglobulínové formy podľa tohto vynálezu sa môžu prečistiť pomocou štandardných metód v tomto odbore, ku ktorým patrí zrážanie síranom amónnym, afinitné stĺpce, stĺpcová chromatografia, čistenie pomocou HPLC, gélová elektroforéza a podobne (pozri vo všeobecnosti Scopes, Protein Puriflcation (Čistenie proteínov) (Springer Verlag, N. Y., (1982)). Pre farmakologické použitie sú výhodné v zásade čisté imunoglobulíny aspoň asi z 90 až 95 % homogenitou a najvýhodnejšie s 98 až 99 % a väčšou homogenitou.
7. Fragmenty protilátok
Do rámca tohto vynálezu sa uvažuje aj s fragmentárni protilátok. V jednom praktickom uskutočnení sa opisujú fragmenty neľudských, chimérických a/alebo ľudských protilátok. V inom praktickom uskutočnení sa opisujú fragmenty humanizovaných protilátok. Tieto fragmenty obvykle prejavujú špecifickú väzbu k antigénu s afinitou aspoň 107 a obvyklejšie 108 alebo 109 M'1. K fragmentom humanizovaných protilátok patria samostatné ťažké reťazce, ľahké reťazce Fab, Fab1, F(ab')2, Fabc a Fv. Fragmenty sa pripravujú rekombinantnými DNA technikami alebo enzymatickou alebo chemickou separáciou intaktných imunoglobulínov.
8. Skúšanie protilátok na terapeutickú účinnosť vo zvieracích modeloch
Každému jedincovi v skupine 7 - 9-mesačných PDAPP myší sa injekčné podalo 0,5 mg polyklonálnej anti-Αβ alebo špecifickej anti-Αβ monoklonálnej protilátky v PBS. Všetky preparáty protilátok sa prečistili, aby mali nízke hladiny endotoxínov. Monoklonály sa môžu pripraviť proti fragmentu injekčným podaním fragmentu alebo myšej dlhej formy Αβ, prípravou hybridómov a skríningom hybridómov na protilátky, ktoré sa špecificky viažu na požadovaný fragment Αβ bez viazania sa na iné neprekrývajúce sa fragmenty Αβ.
Myši sa injikovali intraperitoneálne podľa potreby počas 4 mesiacov, aby sa udržiavala koncentrácia cirkulujúcej protilátky meraná titrom ELISA väčšia než 1/1000, definovaným pomocou ELISA k Αβ42 alebo inému imunogénu. Titre sa sledovali a myši sa utratili po uplynutí 6 mesiacov injekciou. Post mortem sa urobila histochémia, hladiny Αβ a toxikológia. V každej skupine sa použilo 10 myší.
9. Skríning protilátok na klíringovú aktivitu
Vynález tiež poskytuje metódy skríningu protilátky na aktivitu v odstraňovaní amyloidového depozitu alebo nejakého iného antigénu alebo súvisiacej biologickej entity, pre ktorú sa klíringová aktivita vyžaduje. Na skríning aktivity proti amyloidovému depozitu sa privedie do kontaktu vzorka tkaniva z mozgu pacienta s Alzheimerovou chorobou alebo zvieracieho modelu, ktorý má charakteristické znaky Alzheimerovej patológie s fagocytickými bunkami nesúcimi Fc receptor, ako sú mikrogliálne bunky, a skúšaná protilátka v médiu in vitro. Fagocytické bunky môžu byť primárnou kultúrou alebo bunkovou líniou, ako sú BV-2, C8-B4 alebo THP-1. V niektorých metódach sa zložky miešajú na mikroskopickom sklíčku, aby sa uľahčilo mikroskopické sledovanie. V niektorých metódach sa viaceré reakcie vykonávajú paralelne v jamkách mikrotitrovacej misky. V takomto prevedení sa do jednotlivých jamiek môžu uložiť jednotlivé miniatúrne mikroskopické sklíčka, alebo sa môže použiť nemikroskopické prevedenie, ako je detekcia Αβ metódou ELISA. Výhodne sa urobí séria meraní množstva amyloidovej usadeniny v reakčnej zmesi in vitro, začínajúc od hodnoty základnej línie predtým, ako sa reakcia rozbehla, a v jednej alebo dvoch hodnotách počas reakcie. Antigén sa môže detegovať farbením, napríklad fluorescenčné označenou protilátkou k Αβ alebo inej zložke amyloidových plakov. Protilátka použitá na farbenie môže, ale nemusí byť tá istá ako protilátka skúšaná na klíringovú aktivitu. Zníženie oproti základnej línii počas reakcie amyloidových usadenín naznačuje, že skúšaná protilátka má klíringovú aktivitu. Takéto látky sa pravdepodobne dajú použiť na prevenciu alebo liečbu Alzheimerovej choroby a iných amyloidogénnych chorôb.
Analogické metódy sa môžu použiť na skríning protilátok na aktivitu v klíringu iných typov biologických entít. Táto skúška sa môže použiť na detekciu klíringovej aktivity proti prakticky každému druhu biologickej entity. Biologická entita hrá obvykle určitú rolu v ochorení ľudí alebo zvierat. Biologická entita môže byť vo forme vzorky tkaniva alebo v izolovanej forme. Ak ide o vzorku tkaniva, potom táto vzorka tkaniva je výhodne nefixovaná, aby sa umožnil ľahký prístup k zložkám tejto vzorky tkaniva a aby sa predišlo náhodnému porušeniu konformácie zložiek pri fixácii. K príkladom vzoriek tkaniva, ktoré sa môžu skúšať v tejto skúške, patrí kancerózne tkanivo, prekancerózne tkanivo, tkanivo obsahujúce benígne novotvary, ako sú bradavice alebo moly, tkanivo obsahujúce patologické matrice medzi bunkami (napr. fibrinózna perikarditída), tkanivo obsahujúce aberačné antigény a jazvové tkanivo. Príkladmi izolovaných biologických entít, ktoré sa môžu použiť, sú Αβ, vírusové antigény alebo vírusy, proteoglykány, antigény iných patologických mikroorganizmov, tumorové antigény a adhézne molekuly. Takéto antigény sa môžu okrem iných spôsobov získať z prírodných zdrojov, rekombinantnou expresiou alebo chemickou syntézou. Vzorka tkaniva alebo izolovaná biologická entita sa privedú do kontaktu s fagocytickými bunkami nesúcimi Fc receptory, ako sú monocyty alebo mikrogliálne bunky, a skúšaná protilátka v nejakom médiu. Protilátka sa môže smerovať na skúšanú biologickú entitu alebo na antigén súvisiaci s entitou. V druhom prípade sa objekt testuje, či je biologická entita nepriamo podlieha fagocytóze antigénom. Obyčajne, ale nie nevyhnutne, je protilátka s biologickou entitou (niekedy s súvisiacej antigénom) navzájom v kontakte pred pridaním fagocytických buniek. Koncentrácia biologickej entity a/alebo súvisiaceho antigénu ostávajúceho v médiu, ak je prítomné, sa potom sleduje. Zníženie množstva alebo koncentrácie antigénu alebo súvisiacej biologickej entity v médiu naznačuje, že protilátka vyvoláva klíringovú odozvu proti antigénu a/alebo súvisiacej biologickej entite spoločne s fagocytickými bunkami (pozri napr. príklad IV).
B. Nukleová kyselina kódujúca imunologické a terapeutické činidlo
Imunitné odozvy voči amyloidovým depozitom sa môžu tiež vyvolať podaním nukleových kyselín kódujúcich protilátky a ich reťazce používané pri pasívnej imunizácií. Takýmito nukleovými kyselinami môže byť DNA alebo RNA. Segment nukleovej kyseliny kódujúci imunogén je obvykle spojený k regulačnými prvkami, ako sú promótor a enhancer, ktoré umožňujú expresiu DNA segmentu v predpokladaných terčových bunkách pacienta. Na expresiu v krvných bunkách, ako je to žiaduce na indukciu imunitnej odozvy, elementy promótora a enhancera z génov ľahkého a ťažkého reťazca imunoglobulínu alebo hlavný intermediámy počiatočný promótor a enhancer CMV sú vhodné na priamu expresiu. Spojené regulačné elementy a kódovacie sekvencie sa často klonujú do vektora. Na zavedenie dvojreťazcových protilátok sa môžu klonovať dva reťazce v tom istom vektore alebo v samostatných vektoroch.
Existuje rad vírusových vektorových systémov zahŕňajúci retrovírusové systémy (pozri napr. Lawrie a Tumin, Cur. Opin. Genet. Develop. 3: 102 - 109 (1993)); adenovírusové vektory (pozri napr. Bett a kol., J. Virol. 67: 5911 (1993)); adeno-asociované vírusové vektory (pozri napr. Zhou a kol., J. Exp. Med. 179: 1867 (1994)), vírusové vektory z čeľade pox zahŕňajúce vírus vaccinia a vírusy opičích kiahní, vírusové vektory z rodu alfavírus, ako sú vektory odvodené z vírusov Sindbis a Semliki Forest (pozri napr. Dubensky a kol., J. Virol. 70: 508 (1996)), vírus venezuelskej konskej encefalitídy (pozri Johnston a kol., US 5 643 576 a rabdovírusy, ako je vírus vezikulámej stomatitídy (pozri Rose, WO 96/34625), a papilomavírusy (Ohe a kol., Human Gene Therapy 6: 325 (1995); Woo a kol., WO 94/12629 a Xiao a Brandsma, Nucleic Acids Res. 24, 2630-2622(1996)).
DNA kódujúca imunogén alebo vektor obsahujúci imunogén sa môže obaliť do lipozómov. Vhodné lipidy a príbuzné analógy sú opísané v Eppstein a kol., US 5 208 036, Felgner a kol., US 5 264 618, Rose, US 5 279 833 a Epand a kol., US 5 283 185. Vektory a DNA kódujúce imunogén sa môžu adsorbovať na povrch alebo asociovať s partikulovými nosičmi, k príkladom ktorých patria polyméry polymetylmetakrylátu a polylaktidy a laktid-glykolidový kopolymér, pozri napr. McGee a kol., J. Micro Encap (1996).
Vektory génovej terapie alebo nahé polypeptidy (napr. DNA) sa môžu zavádzať in vivo podávaním jednotlivému pacientovi, obvykle systémovou cestou (napr. intravenózne, intraperitoneálne, nazálne, gastricky, intradermálne, intramuskulárne, subdermálne alebo intrakraniálnou infúziou) alebo topickou cestou (pozri napr. Anderson a kol., US 5 399 346). Výraz nahý polynukleoid označuje polynukleotid, ktorý nie je komplexovaný koloidnými materiálmi. Nahé polynukleotidy sa niekedy klonujú do plazmidového vektora. Takéto vektory môžu ďalej zahŕňať facilitačné činidlá, ako je bupivacín (Attarda a kol., US 5 593 970). DNA sa tiež môže podať pomocou génovej pušky. Pozri Xia a Brandsma, vyššie. DNA kódujúca imunogén sa vyzráža na povrchu mikroskopických kovových guľôčok. Mikroprojektily sa urýchlia rázovou vlnou alebo expandujúcim plynným héliom a prenikajú tkanivami do hĺbky niekoľkých vrstiev buniek. Napríklad je vhodný The Accel™ Gene Delivery Device vyrobený firmou Agacetus Inc., Middleton, WI. Nahá DNA môže tiež preniknúť cez kožu do krvného riečiska jednoducho nanesením škvrny DNA na kožu spojeným s chemickým alebo mechanickým podráždením (pozri Howell a kol., WO 95/05853).
V ďalších variantoch sa môžu vektory kódujúce imunogény zaviesť do buniek ex vivo, ako bunky implantované individuálnemu pacientovi (napr. lymfocyty, aspiráty kostnej drene, tkanivové biopsie) alebo ako univerzálne donomé hematopoetické kmeňové bunky, po čom nasleduje reimplantácia týchto buniek pacientovi, obyčajne po selekcii buniek, ktoré majú zavedený vektor.
II. Profylaktické a terapeutické metódy
Tento vynález je zameraný okrem iného na liečbu Alzheimerovej choroby a iných amyloidogénnych ochorení podávaním terapeutických imunologických činidiel (napr. humanizovaných imunoglobulínov) k špecifickým epitopom v Αβ pacientovi za podmienok, ktoré vyvolajú u pacienta priaznivú terapeutickú odozvu (napr. indukciu fagocytózy Αβ, redukciu množstva plakov, inhibíciu tvorby plakov, obmedzenie neuritickej dystrofie, zlepšenie kognitívnej funkcie a/alebo zvrátenie kognitívneho úpadku, jeho liečbu alebo pre21
SK 288209 Β6 venciu u pacienta), napríklad na prevenciu alebo liečbu amyloidogénnej choroby. Vynález je tiež zameraný na použitie opísaných imunologických činidiel (napr. humanizovaných imunoglobulínov) vo výrobe medikamentu na liečbu alebo prevenciu amyloidogénnej choroby.
Výraz liečba, ako sa tu používa, je definovaný ako aplikácia alebo podávanie terapeutického činidla pacientovi, alebo aplikácia alebo podávanie terapeutického činidla izolovanému tkanivu alebo bunkovej línii z pacienta, ktorý má chorobu, symptóm choroby alebo predispozíciu k chorobe, s cieľom vyliečiť, zmierniť, upraviť, uzdraviť, zlepšiť alebo ovplyvniť chorobu, symptómy choroby alebo predispozíciu k chorobe, alebo aby sa z nej zotavil.
Jednou stránkou vynálezu je, že poskytuje metódy prevencie alebo liečby ochorenia súvisiaceho s usadeninami Αβ amyloidov v mozgu pacienta. K takýmto ochoreniam patrí Alzheimerova choroba, Downov syndróm a kognitívna porucha. Posledne menované ochorenie sa môže vyskytovať s inými charakteristikami amyloidogénnej choroby alebo bez nich. Niektoré metódy tohto vynálezu sú spojené s podávaním účinnej dávky protilátky pacientovi, ktorá sa špecificky viaže na zložku amyloidového depozitu. Takéto metódy sú zvlášť užitočné na prevenciu alebo liečbu Alzheimerovej choroby u ľudských pacientov. Ukážkové metódy sú spojené s podávaním účinnej dávky protilátky, ktorá sa viaže na Αβ. Výhodné metódy sú spojené s podávaním účinnej dávky protilátky, ktorá sa špecificky viaže na epitop v rámci Αβ zvyškov 1-10, napríklad protilátky, ktoré sa špecificky viažu na epitop v rámci Αβ zvyškov 1 - 4, protilátky, ktoré sa špecificky viažu na epitop v rámci Αβ zvyškov 1 - 5, protilátky, ktoré sa špecificky viažu na epitop v rámci Αβ zvyškov 1 - 6, protilátky, ktoré sa špecificky viažu na epitop v rámci Αβ zvyškov 1 - 7, alebo protilátky, ktoré sa špecificky viažu na epitop v rámci Αβ zvyškov 3-7. Ešte ďalšou stránkou vynálezu je, že predstavuje podávanie protilátok, ktoré sa viažu na epitop obsahujúci voľný N-koncový zvyšok Αβ. Ešte ďalšou stránkou vynálezu je, že predstavuje podávanie protilátok, ktoré sa viažu na epitop v rámci Αβ zvyškov 1 - 10, kde Αβ zvyšok 1 a/alebo zvyšok 7 je kyselina asparágová. Ešte ďalšou stránkou vynálezu je, že predstavuje podávanie protilátok, ktoré sa špecificky viažu na Αβ peptid bez viazania na amyloidový prekurzorový proteín plnej dĺžky (APP). Ešte ďalšou stránkou vynálezu je, že izotyp protilátky je ľudský IgGl.
Ešte ďalšou stránkou vynálezu je, že predstavuje podávanie protilátok, ktoré sa viažu na amyloidový depozit v pacientovi a vyvolajú klíringovú odozvu proti amyloidovému depozitu. Takáto klíringová odozva sa môže realizovať fagocytózou sprostredkovanou Fc receptorom.
Terapeutické činidlá tohto vynálezu obvykle v zásade neobsahujú nežiaduce nečistoty. To znamená, že činidlo má obvykle čistotu aspoň asi 50 hmotnostných % (w/w), a v zásade neobsahuje interferujúce proteíny a nečistoty. Niekedy majú činidlá čistotu aspoň asi 80 % w/w a výhodnejšie aspoň 90 alebo asi 95 % w/w. Pomocou bežných techník čistenia proteínov sa však môžu získať homogénne peptidy s čistotou aspoň 99 % w/w.
Tieto metódy sa môžu použiť u asymptomatických pacientov aj u pacientov prejavujúcich symptómy choroby. Protilátky používané v takýchto metódach môžu byť humánne, humanizované, chimérické alebo nehumánne protilátky alebo ich fragmenty (napr. fragmenty viažuce antigén) a môžu byť monoklonálne alebo polyklonálne, ako sa tu opisuje. Ešte ďalšou stránkou vynálezu je, že vynález predstavuje podávanie protilátok pripravených z človeka imunizovaného peptidom Αβ, kde človekom môže byť pacient, ktorý sa má liečiť protilátkou.
Ešte ďalšou stránkou vynálezu je, že predstavuje podávanie protilátky s farmaceutickým nosičom ako farmaceutickej kompozície. Protilátka sa môže tiež podávať pacientovi podávaním nukleotidu kódujúceho aspoň jeden reťazec protilátky. Polynukleotid sa exprimuje, aby produkoval reťazec protilátky u pacienta. Polynukleotid prípadne kóduje ťažký a ľahký reťazec protilátky. Polynukleotid sa exprimuje, aby produkoval ťažký a ľahký reťazec u pacienta. V ukážkových praktických uskutočneniach sa u pacienta sleduje hladina podávanej protilátky v krvi pacienta.
Vynález tak spĺňa dlhotrvajúcu potrebu terapeutických režimov prevencie alebo liečby neuropatológie a, u niektorých pacientov, kognitívnej poruchy súvisiacej s Alzheimerovou chorobou.
A. Pacienti vhodní na liečbu
K pacientom vhodným na liečbu patria jednotlivci s rizikom ochorenia, ale neprejavujúci symptómy, ako aj pacienti, ktorí už majú symptómy. V prípade Alzheimerovej choroby je prakticky ktokoľvek v nebezpečenstve ochorenia na Alzheimerovu chorobu, ak žije dostatočne dlho. Tieto metódy sa preto môžu aplikovať profylaktický na všeobecnú populáciu bez potreby zhodnotenia nebezpečenstva pre pacienta. Tieto metódy sú užitočné najmä pre jednotlivcov, ktorí majú známe genetické riziko Alzheimerovej choroby. K takýmto jednotlivcom patria tí, ktorí majú príbuzných, ktorí trpeli touto chorobou, a tí, ktorých nebezpečenstvo sa určí analýzou genetických alebo biochemických markerov. Genetické markery rizika Alzheimerovej choroby zahŕňajú mutácie v APP géne, najmä mutácie v polohe 717 a polohách 670 a 671 označovaných ako Hardyho, resp. Swedishove mutácie (pozri Hardy, vyššie). Iné markery rizika sú mutácie v presenilínových génoch PS 1 a PS2, a ΑβοΕ4, rodinná história AD, hypercholesterolémia alebo ateroskleróza. Jednotlivci v súčasnosti trpiaci Alzheimerovou chorobou sa dajú poznať podľa charakteristickej demencie, ako aj prítomnosťou rizi22
SK 288209 Β6 kových faktorov opísaných vyššie. Okrem toho je k dispozícii veľký počet diagnostických testov na identifikáciu jednotlivcov, ktorí majú AD. Tieto testy zahŕňajú meranie hladiny tau a Αβ42 v likvore. Zvýšené hladiny tau a znížené hladiny Αβ42 znamenajú prítomnosť AD. Jednotlivci trpiaci Alzheimerovou chorobou sa môžu tiež diagnostikovať kritériami ADRDA, ako sa diskutuje v časti príkladov.
U asymptomatických pacientov sa môže začať liečba v ľubovoľnom veku (napr. 10, 20, 30 rokov). Obyčajne však nie je potrebné začať s liečbou skôr, než pacient dosiahne 40, 50, 60 alebo 70 rokov. Liečba obvykle pozostáva z viacnásobných dávok podávaných v určitom období. Liečba sa môže sledovať skúšaním hladín protilátok v určitom období. Ak odozva klesá, indikuje sa posilňovacia dávka. V prípade potenciálnych pacientov s Downovým syndrómom sa môže liečba začať prenatálne podávaním terapeutického činidla matke alebo krátko po narodení.
B. Liečebné režimy a dávkovanie
V profylaktických aplikáciách sa podávajú farmaceutické kompozície alebo medikamenty pacientovi náchylnému na Alzheimerovu chorobu alebo inak pri riziku Alzheimerovej choroby v množstve dostatočnom na odstránenie alebo zníženie rizika, zníženie závažnosti ochorenia, oddialenie nástupu choroby, zahŕňajúc biochemické, histologické a/alebo behaviorálne symptómy ochorenia, jeho komplikácie a prechodné patologické fenotypy prítomné počas rozvoja ochorenia. V terapeutických aplikáciách sa podávajú kompozície alebo medikamenty pacientom s podozrením na takúto chorobu alebo už trpiacim takouto chorobou v množstve dostatočnom na vyliečenie alebo aspoň sčasti na zmiernenie symptómov choroby (biochemické, histologické a/alebo behaviorálne), zahŕňajúc jej komplikácie a prechodné patologické fenotypy vo vývoji choroby.
V niektorých metódach podávanie činidla znižuje alebo odstraňuje myokognitívne poruchy u pacientov, ktoré sa ešte nevyvinuli do charakteristickej Alzheimerovej patológie. Množstvo primerané na dosiahnutie terapeutického alebo profylaktického účinku sa definuje ako terapeuticky alebo profylaktický účinná dávka. V profylaktickom a terapeutickom režime sa činidlá obvykle podávajú v niekoľkých dávkach, až kým sa dosiahne dostatočná imunitná odozva. Výraz imunitná odozva alebo imunologická odozva zahŕňa vývoj humorálnej (sprostredkovanej protilátkou) a/alebo celulámej (sprostredkovanej T-bunkami špecifickými pre antigén alebo produktmi ich sekrécie) odozvy smerovanej proti antigénu v subjekte príjemcu. Takáto odozva môže byť aktívnou odozvou, t. j. indukovaná podávaním imunogénu, alebo pasívnou odozvou, t. j. vyvolanou podávaním imunoglobulínu alebo protilátky alebo primáme imunizovaných T-buniek.
Imunogénne činidlo alebo imunogén je schopný indukovať imunologickú odozvu proti sebe samému pri podávaní cicavcovi, prípadne spolu s adjuvantom. Imunitná odozva sa obvykle sleduje a ak imunitná odozva začne klesať, aplikujú sa opakované dávky.
Efektívne dávkovanie kompozícií podľa tohto vynálezu na liečbu opísaných stavov sa mení v závislosti od množstva rozličných faktorov, ktoré zahŕňajú spôsob podávania, cieľové miesto, fyziologický stav pacienta, či je pacient človek alebo zviera, iné podávané medikácie, a či ide o profylaxiu alebo terapiu. Pacientom je obvykle človek, ale neľudské cicavce, zahŕňajúc transgenické cicavce, sa môžu tiež liečiť. Liečebné dávky je potrebné nastaviť tak, aby sa optimalizovala bezpečnosť a účinnosť.
Na pasívnu imunizáciu s protilátkou je dávkovanie v rozsahu asi od 0,0001 do 100 mg/kg, obvyklejšie 0,01 až 5 mg/kg telesnej hmotnosti hostiteľa. Ukážkovými dávkovaniami môže byť 1 mg/kg telesnej hmotnosti alebo 10 mg/kg telesnej hmotnosti alebo v rozsahu 1-10 mg/kg, výhodne aspoň 1 mg/kg. Subjektom sa môžu podať takéto dávky denne alebo obdeň, týždenne alebo podľa nejakého iného rozvrhu určeného empirickou analýzou. Ukážková liečba vyžaduje podávanie vo viacerých dávkach počas dlhšej periódy, napríklad počas šiestich mesiacov. Ďalšie ukážkové liečebné režimy vyžadujú podávanie raz za dva týždne alebo raz za mesiac, alebo raz za 3 až 6 mesiacov. Ukážkové dávkové rozvrhy sú 1 - 10 mg/kg alebo 15 mg/kg každý deň, 30 mg/kg obdeň alebo 60 mg/kg týždenne. V niektorých metódach sa súčasne podávajú dve alebo viac monoklonálnych protilátok s rozličnými väzbovými špecificitami a v týchto prípadoch dávkovanie každej podávanej protilátky patrí do uvedených rozsahov.
Protilátky sa obvykle podávajú viacdávkovým spôsobom. Intervaly medzi jednotlivými dávkami môžu byť týždňové, mesačné alebo ročné. Intervaly môžu byť tiež nepravidelné podľa údajov merania krvných hladín protilátok k Αβ u pacienta. Pri niektorých metódach sa dávka nastaví tak, aby sa dosiahla koncentrácia protilátky v plazme 1 - 1000 ng/ml a v niektorých metódach 25 - 300 pg/ml. Protilátka sa môže tiež podávať vo forme prípravku postupne uvoľňujúceho liečivo a v takomto prípade sa vyžaduje menej časté podávanie. Dávkovanie a frekvencia podávania sa mení v závislosti na polčase života protilátky v pacientovi. Vo všeobecnosti najdlhší polčas života majú ľudské protilátky, nasledujú humanizované protilátky, chimérické protilátky a neľudské protilátky.
Dávkovanie a frekvencia podávania sa môžu meniť v závislosti od toho, či je aplikácia profylaktická alebo terapeutická. V profylaktických aplikáciách sa kompozície obsahujúce uvedené protilátky alebo ich zmes podajú pacientovi, ktorý ešte nie v chorobnom stave, aby sa zvýšila pacientova odolnosť. Takéto množstvo sa definuje ako profylaktický účinná dávka. Pri takomto použití závisia presné množstvá na stave pacientovho zdravia a celkovej imunite, ale vo všeobecnosti sú v rozsahu 0,1 až 25 mg na dávku, najmä 0,5 až 2,5 mg na
SK 288209 Β6 dávku. Pomerne nízka dávka sa podáva v pomerne zriedkavých intervaloch počas dlhšieho obdobia. U niektorých pacientov pokračuje aplikácia po celý zvyšok života.
Pri terapeutických aplikáciách sa niekedy vyžadujú pomerne vysoké dávky (napr. asi od 1 do 200 mg protilátky na dávku, pričom bežnejšie používané dávky sú od 5 do 25 mg) v pomerne krátkych intervaloch, kým sa progresia choroby zníži alebo zastaví, a výhodne dovtedy, až sa u pacienta prejaví čiastočné alebo úplné odstránenie symptómov choroby. Ďalej môže pacient dostávať dávky v profylaktickom režime.
Dávky nukleových kyselín kódujúcich protilátky sú v rozsahu asi od 10 ng do 1 g, 100 ng až 100 mg, 1 pg až 10 mg alebo 30 - 300 pg DNA na pacienta. Dávky pre infekčné vírusové vektory sa menia od 10 do 100 alebo viac viriónov na dávku.
Terapeutické činidlá na profylaktickú a/alebo terapeutickú aplikáciu sa môžu podávať parenterálnym, topickým, intravenóznym, orálnym, subkutánnym, intraarteriálnym, intrakraniálnym, intraperitoneálnym, intranazálnym alebo intramuskulámym spôsobom. Najobvyklejšou cestou podávania imunogénneho činidla je subkutánna, hoci iné cesty môžu byť rovnako účinné. Ďalšou najobvyklejšou cestou je intramuskuláma injekcia. Tento spôsob injekcie sa najbežnejšie vykoná do svalov ramena alebo nohy. V niektorých metódach sa činidlá vstrekujú priamo do konkrétneho tkaniva, v ktorom sa depozity nazhromaždili, napríklad intrakraniálnou injekciou. Na podávanie protilátky sú výhodné intramuskuláma injekcia alebo intravenózna infúzia. V niektorých metódach sa konkrétne terapeutické protilátky vstrekujú priamo do lebky. V niektorých metódach sa protilátky podávajú ako prípravok alebo zariadenie postupne uvoľňujúci liečivo, ako je zariadenie Medipad™.
Činidlá tohto vynálezu sa môžu prípadne podávať v kombinácii s inými činidlami, ktoré sú aspoň čiastočne účinné pri liečbe amyloidogénnych chorôb. V prípade Alzheimerovho a Downovho syndrómu, pri ktorých sa amyloidové depozity vyskytujú v mozgu, sa činidlá tohto vynálezu môžu tiež podávať súčasne s inými činidlami, ktoré zlepšujú prechod činidiel tohto vynálezu cez hematoencefalitickú bariéru.
C. Farmaceutické kompozície
Činidlá tohto vynálezu sa často podávajú ako farmaceutické kompozície obsahujúce aktívne terapeutické činidlo a celú škálu iných farmaceutický prijateľných zložiek. Pozri Remington's Pharmaceutical Science (Remingtonova farmaceutická veda) (15. vyd., Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania (1980)). Výhodná forma závisí na zamýšľanom spôsobe podávania a terapeutickej aplikácii. Kompozície môžu tiež obsahovať, v závislosti na požadovanom zložení, farmaceutický prijateľné netoxické nosiče a riedidlá, ktoré sú definované ako vehikulá bežne používané pri výrobe farmaceutických kompozícií určených na podávanie zvieratám a ľuďom. Riedidlo sa vyberá tak, aby neovplyvňovalo biologickú aktivitu tejto kombinácie. Príkladmi takýchto riedidiel sú voda, fyziologicky soľný roztok tlmený fosfátom, Ringerov roztok, dextrózový roztok a Hankov roztok. Okrem toho farmaceutická kompozícia alebo zmes môže tiež obsahovať iné nosiče, adjuvanty alebo netoxické, neterapeutické, neimunogénne stabilizátory a podobne.
Farmaceutické kompozície môžu tiež obsahovať veľké pomaly metabolizujúce makromolekuly, ako sú proteíny, polysacharidy, ako je chitosan, kyseliny polymliečne, kyseliny polyglykolové a kopolyméry (ako je sefaróza funkcionalizovaná latexom (TM), agaróza, celulóza a podobne), polyméme aminokyseliny, kopolyméry aminokyselín a lipidové agregáty (ako sú olejové kvapôčky alebo lipozómy). Tieto nosiče môžu tiež pôsobiť ako imunostimulujúce činidlá (t. j. adjuvanty).
Na parenterálne podávanie sa činidlá tohto vynálezu môžu podávať ako injektabilné dávky roztoku alebo suspenzie látky vo fyziologicky prijateľnom riedidle s farmaceutickým nosičom, ktorým môže byť sterilná kvapalina, ako je voda, oleje, soľný roztok, giycerol alebo etanol. Okrem toho môžu byť prítomné v kompozíciách pomocné látky, ako sú zvlhčujúce alebo emulzifikujúce činidlá, povrchovo aktívne látky, látky tlmiace pH a podobne. Inými zložkami farmaceutických kompozícií sú minerálny, živočíšny, rastlinný alebo pôvodom syntetický olej, napríklad arašidový olej, sójový olej a minerálny olej. Výhodnými kvapalnými nosičmi sú vo všeobecnosti glykoly, ako je propylénglykol a polyetylénglykol, najmä pre injektabilné roztoky. Protilátky sa môžu podávať vo forme depotnej injekcie alebo implantátového prípravku, ktoré sa môžu pripraviť takým spôsobom, aby sa umožnilo postupné uvoľňovanie aktívnej zložky. Ukážkový príklad obsahuje monoklonálnu protilátku s koncentráciou 5 mg/ml v zmesi s vodným tlmivým roztokom obsahujúcim 50 mM L-histidínu, 150 mM NaCI a s pH nastaveným na 6,0 pomocou HC1.
Kompozície sa pripravujú v injektabilnej forme, buď ako kvapalné roztoky, alebo suspenzie; môžu sa tiež pripraviť tuhé formy vhodné na rozpustenie alebo suspendovanie v kvapalnom vehikule pred injekčným podaním. Preparát sa tiež môže emulzifikovať alebo obaliť v lipozómoch alebo mikročasticiach, ako je polylaktid, polyglykolid alebo kopolymér na zvýšenie adjuvantného účinku, ako sa diskutovalo vyššie (pozri Langer, Science 249: 1527 (1990) a Hanes, Advanced Drug Delivery Reviews 28: 97 (1997)). Činidlá tohto vynálezu sa môžu podávať vo forme depotnej injekcie alebo implantátového prípravku, ktoré sa môžu pripraviť takým spôsobom, aby sa umožnilo postupné alebo pulzačné uvoľňovanie aktívnej zložky.
Ďalšie zmesi vhodné na iné spôsoby podávania zahŕňajú orálne, intranazálne alebo pulmonárne zmesi, čapíky a transdermálne aplikácie. K spojivám a nosičom pre čapíky patria napríklad polyalkylénglykoly ale24
SK 288209 Β6 bo triglyceridy; takéto čapíky sa môžu pripraviť zo zmesí obsahujúcich aktívnu zložku v rozsahu 0,5 % až 10 %, výhodne 1 % až 2 %. Orálne zmesi obsahujú excipienty, ako sú manitol, laktóza, škrob, stearát horečnatý, sodný sacharín, celulóza a uhličitan horečnatý s čistotou farmaceutického stupňa. Tieto kompozície majú formu roztokov, suspenzií, tabliet, piluliek, kapsúl, prípravkov postupne uvoľňujúcich liečivo alebo práškov a obsahujú 10 % až 95 % aktívnej zložky, výhodne 25 % až 70 %.
Topická aplikácia môže slúžiť na transdermálne alebo intradermálne podanie. Topické podanie sa môže uľahčiť súčasným podávaním činidla s toxínom cholery alebo detoxifikovanými derivátmi alebo ich podjednotkami alebo inými podobnými bakteriálnymi toxínmi (pozri Glenn a kol., Náture 391, 851 (1998)). Súčasné podávanie sa môže dosiahnuť použitím zložiek ako zmesi alebo ako spojených molekúl získaných chemickým zosieťovaním alebo expresiou ako fúzny proteín.
Transdermálne podanie sa môže tiež dosiahnuť použitím kožnej cesty alebo pomocou transferozómov (Paul a kol., Eur. J. Immunol. 25: 3521 (1995); Cevc a kol., Biochem. Biophys. Acta 1368: 201 - 15 (1998)). III. Sledovanie priebehu liečby
Vynález poskytuje metódy sledovania liečby u pacienta trpiaceho Alzheimerovou chorobou alebo náchylného na ňu, t. j. na sledovanie priebehu liečby poskytovanej pacientovi. Táto metóda sa môže použiť na sledovanie terapeutickej liečby u symptomatických pacientov a na profylaktickú aplikáciu u asymptomatických pacientov. Tieto metódy sú hlavne použiteľné na sledovanie pasívnej imunizácie (napr. meranie hladiny podanej protilátky).
Niektoré metódy vyžadujú určenie hodnoty základnej línie, napríklad hladiny alebo profilu protilátky u pacienta pred podaním dávky činidla, a porovnanie tejto hodnoty s hodnotou pre profil alebo hladinu po liečbe. Významné zvýšenie (t. j. väčšie než obvyklá hranica experimentálnej chyby v opakovaných meraniach rovnakej vzorky, vyjadrenej ako jedna smerodajná odchýlka priemeru takých meraní) hodnoty hladiny alebo profilu signalizuje kladný výsledok liečby (t. j. podanie činidla dosiahlo požadovanú odozvu). Ak sa hodnota imunitnej odozvy významne nezmení alebo sa zníži, znamená to negatívny výsledok.
V iných metódach sa stanoví pre kontrolnú populáciu kontrolná hodnota (t. j. priemer a smerodajná odchýlka). Jednotlivci v kontrolnej populácii obvykle neboli predtým liečení. Merané hodnoty hladiny alebo profilu u pacienta po podaní terapeutického činidla sa potom môžu porovnať s kontrolnou hodnotou. Významné zvýšenie v porovnaní s kontrolnou hodnotou (napr. väčšie než jedna smerodajná odchýlka priemeru) signalizuje pozitívny alebo dostatočný výsledok liečby. Neprítomnosť významného zvýšenia alebo zníženie signalizuje negatívny alebo nedostatočný výsledok liečby. Podávanie činidla vo všeobecnosti pokračuje dovtedy, kým sa hodnota oproti kontrolnej hodnote zvyšuje. Ako predtým, dosiahnutie plató voči kontrolnej hodnote je známkou, že poskytovanie liečby sa môže prerušiť alebo sa môžu znížiť dávky a/alebo frekvencia užívania.
V iných metódach sa určí kontrolná hodnota hladiny alebo profilu (napr. priemer a smerodajná odchýlka) z kontrolnej populácie jednotlivcov, ktorí absolvovali liečbu terapeutickým činidlom a ktorých hladiny alebo profily dosiahli plató v odozve na liečbu. Namerané hodnoty hladín alebo profilov u pacienta sa porovnajú s kontrolnou hodnotou. Ak nameraná hodnota u pacienta nie je významne rozdielna (napr. väčšia než smerodajná odchýlka) od kontrolnej hodnoty, môže sa liečba prerušiť. Ak hladina u pacienta je významne pod kontrolnou hodnotou, pokračovanie v podávaní činidla je oprávnené. Ak hodnota u pacienta zostáva pod kontrolnou hodnotou, potom sa môže indikovať zmena liečby.
V iných metódach sa sledujú u pacienta, ktorý nie je v súčasnosti liečený, ale podstúpil v minulosti liečebnú kúru, hladiny alebo profily protilátok, aby sa určilo, či je potrebné obnoviť liečbu. Nameraná hodnota alebo profil u pacienta sa môže porovnať s hodnotou dosiahnutou predtým u pacienta po predchádzajúcej liečebnej kúre. Významné zníženie proti predošlému meraniu (t. j. väčšie než obvyklá hranica chyby v opakovaných meraniach v rovnakej vzorke) naznačuje, že liečba sa môže znova začať. Hodnota nameraná u pacienta sa môže tiež porovnať s kontrolnou hodnotou (priemer plus smerodajná odchýlka) určenou v populácii pacientov po absolvovaní liečebnej kúry. Nameraná hodnota u pacienta sa môže tiež porovnať s kontrolnou hodnotou v populáciách profylaktický ošetrených pacientov, u ktorých sa naďalej neprejavujú symptómy choroby, alebo v populáciách terapeuticky ošetrených pacientov, u ktorých sa prejavilo zlepšenie charakteristík choroby. Vo všetkých týchto prípadoch významné zníženie v porovnaní s kontrolnou hladinou (t. j. väčšie než smerodajná odchýlka) znamená, že liečba by sa mala u pacienta obnoviť.
Vzorkou tkaniva na analýzu je obvykle krv, plazma, sérum, mukózna tekutina alebo likvor pacienta. Vzorka sa analyzuje napríklad na hladiny alebo profily protilátok k Αβ peptidu, napr. hladiny alebo profily humanizovaných protilátok. Metódy ELISA na detekciu protilátok špecifických k Αβ sú opísané v časti príkladov. V niektorých metódach sa určí hladina alebo profil podávanej protilátky pomocou klíringovej skúšky, napríklad vo fagocytóznej skúške in vitro, ako sa tu opisuje. V takých metódach sa vzorka tkaniva z vyšetrovaného pacienta privedie do styku s depozitmi amyloidu (napr. z PDAPP myši) a s fagocytickými bunkami nesúcimi Fc receptory. Potom sa pozoruje následné odstraňovanie depozitu amyloidu. Existencia alebo rozsah klíringovej odozvy poskytuje indikátor existencie a hladiny protilátok účinných na odstraňovanie Αβ
SK 288209 Β6 vo vzorke tkaniva vyšetrovaného pacienta.
Profil protilátky po pasívnej imunizácii obvykle ukazuje prechodný vrchol v koncentrácii protilátky, po ktorom nasleduje exponenciálny pokles. Bez ďalšieho dávkovania sa tento pokles v priebehu niekoľkých dní až mesiacov približuje k hodnotám pred liečbou, v závislosti od polčasu života podávanej protilátky. Napríklad polčas života niektorých ľudských protilátok je rádovo 20 dní.
V niektorých metódach sa urobí meranie základnej línie protilátky k Αβ u pacienta pred poskytnutím liečby, druhé meranie sa urobí čoskoro po určení najvyššej hladiny protilátky a jedno alebo viac ďalších meraní sa urobí v určitých časových intervaloch, aby sa sledoval pokles hladín protilátky. Keď hladina protilátky klesne k základnej línii alebo k stanovenému percentuálnemu podielu hodnoty vrchol mínus základná línia (napr. 50 %, 25 % alebo 10 %), podá sa ďalšia dávka protilátky. V niektorých metódach sa vrchol alebo následne merané hodnoty mínus pozadie porovnajú s referenčnými hodnotami predtým stanovenými tak, že tvoria prospešný profylaktický alebo terapeutický liečebný režim u iných pacientov. Ak namerané hodnoty protilátky sú významne nižšie než referenčná hladina (napr. menšie než priemer mínus jedna smerodajná odchýlka referenčnej hodnoty v populácii pacientov s priaznivým efektom liečby), indikuje sa podávanie ďalšej dávky protilátky.
K ďalším metódam patrí sledovanie nejakého fyziologického symptómu uznávaného v odbore (napr. fyzického alebo duševného symptómu) v priebehu liečby, na ktorý sa bežne spoliehajú výskumníci alebo lekári pri diagnostike alebo sledovaní amyloidogénnych ochorení (napr. Alzheimerovej choroby). Niekto môže napríklad sledovať kognitívne poruchy. Tieto sú symptómami Alzheimerovej choroby a Downovho syndrómu, ale môžu sa tiež vyskytovať bez iných charakteristík niektorej z týchto chorôb. Napríklad kognitívna porucha sa môže sledovať určením pacientovho skóre v Mini-Mental State Exam (miniduševnej štátnej skúške) podľa zvyklostí počas priebehu liečby.
C. Súpravy
Vynález ďalej poskytuje súpravy na uskutočnenie sledovania vyššie opísaných metód. Takéto súpravy obvykle obsahujú činidlo, ktoré sa špecificky viaže na protilátku k Αβ. Súprava môže tiež obsahovať značku. Na detekciu protilátok k Αβ je značka obvykle vo forme označených anti-idiotypických protilátok. Na detekciu protilátok sa činidlo dodáva naviazané na tuhej fáze, ako sú jamky na mikrotitrovacej miske. Súpravy tiež obvykle obsahuje leták poskytujúci návod na použitie súpravy. Leták môže tiež obsahovať graf alebo iný režim korešpondencie korelujúci hladiny meranej značky s hladinami protilátok k Αβ. Výraz leták označuje akýkoľvek písomný alebo zaznamenaný materiál, ktorý je pripojený alebo ináč pribalený k súprave kedykoľvek počas jeho výroby, dopravy, predaja alebo použitia. Napríklad výraz leták zahŕňa reklamné letáčiky a brožúrky, obalový materiál, návody, audio alebo video kazety počítačové disky, ako aj text vytlačený priamo na súprave.
Vynález tiež poskytuje diagnostické súpravy, napríklad výskumnú, detekčnú a/alebo diagnostickú súpravu (napr. na zobrazovanie in vivo). Takéto súpravy obvykle obsahujú protilátku na viazanie k epitopu Αβ, výhodne v rámci zvyškov 1-10. Protilátka je výhodne značkovaná alebo je v súprave pribalené sekundárne značkovacie činidlo. Súprava výhodne obsahuje leták s návodom na vykonanie plánovanej aplikácie, napríklad na vykonanie zobrazovacej skúšky in vivo. Ukážkové protilátky sú tie, ktoré sú tu opísané.
D. Zobrazovanie in vivo
Vynález poskytuje metódy in vivo zobrazovania amyloidových depozitov u pacienta. Takéto metódy sú užitočné na diagnostiku alebo potvrdenie diagnózy Alzheimerovej choroby alebo náchylnosti na ňu. Napríklad sa tieto metódy môžu použiť u pacientov, u ktorých sa prejavujú symptómy demencie. Ak má pacient abnormálne amyloidové depozity, potom tento pacient pravdepodobne trpí Alzheimerovou chorobou. Táto metóda sa môže tiež použiť u asymptomatických pacientov. Prítomnosť abnormálnych depozitov amyloidu naznačuje náchylnosť na budúce symptomatické ochorenie. Metódy sú tiež užitočné na sledovanie progresie choroby a/alebo odozvy na liečbu u pacientov, ktorým bola v minulosti diagnostikovaná Alzheimerova choroba.
Metódy sú založené na podaní činidla, ako je protilátka, ktorá sa viaže na Αβ, pacientovi a potom na detekcii činidla po tom, ako sa naviaže. Výhodné protilátky sa viažu na depozity Αβ u pacienta bez viazania sa na polypetid APP úplnej dĺžky. Protilátky viažuce sa na epitop Αβ v rámci aminokyselín 1 - 10 sú zvlášť výhodné. V niektorých metódach sa protilátka viaže na epitop v rámci aminokyselín Αβ 7 - 10. Takéto protilátky sa obvykle viažu bez vyvolania podstatnej klíringovej odozvy. V iných metódach sa protilátka viaže na epitop v rámci aminokyselín Αβ 1 - 7. Takéto protilátky sa obvykle viažu a vyvolávajú klíringovú odozvu k Αβ. Klíringovej odozve sa však možno vyhnúť použitím fragmentov protilátky, ktoré nemajú konštantnú oblasť úplnej dĺžky, ako sú Fabs. V niektorých metódach môže rovnaká protilátka slúžiť ako liečebné aj diagnostické činidlo. Protilátky viažuce sa vo všeobecnosti na epitopy C-konca k Αβ zvyšku 10 nedávajú taký silný signál ako protilátky viažuce sa k epitopom v rámci zvyškov 1-10, pravdepodobne preto, že C-koncové epitopy v amyloidových depozitoch sú neprístupné. Takéto protilátky sú preto menej výhodné.
SK 288209 Β6
Diagnostické činidlá sa môžu podať intravenóznou injekciou do tela pacienta alebo priamo do mozgu intrakraniálnou injekciou alebo vyvŕtaním diery v lebke. Dávkovanie činidla by malo byť v rovnakých rozmedziach ako pre liečebné metódy. Činidlo je obvykle označené, aj keď v niektorých metódach primárne činidlo s afinitou na Αβ je neznačkované a používa sa sekundárne značkovacie činidlo, ktoré sa viaže na primáme činidlo. Výber značky závisí od prostriedkov na detekciu. Napríklad fluorescenčná značka je vhodná na optickú detekciu. Použitie paramagnetických značiek je vhodné na tomografickú detekciu bez chirurgickej intervencie. Rádioaktívne značky sa môžu tiež detegovať pomocou PET alebo SPECT.
Diagnostika sa vykoná porovnaním počtu, veľkosti a/alebo intenzity označkovaných miest s zodpovedajúcimi hodnotami základnej línie. Hodnoty základnej línie môžu reprezentovať priemerné hladiny v populácii jednotlivcov netrpiacich chorobou. Hodnoty základnej línie môžu tiež reprezentovať hodnoty stanovené u pacienta v minulosti. Napríklad hodnota základnej línie sa môžu určiť u pacienta pred začatím liečby a hodnoty namerané po nej sa môžu porovnať s hodnotami základnej línie. Pokles v hodnotách proti základnej línii signalizuje kladnú odozvu na liečbu.
Tento vynález sa úplnejšie opíše v nasledujúcich neobmedzujúcich príkladoch.
Prehľad obrázkov na výkresoch
Obrázok 1 predstavuje remodelovanie 3D6 VL, je na ňom zobrazené usporiadanie sekvencii aminokyselín ľahkého reťazca myšej 3D6 protilátky, humanizovanej 3D6 protilátky, protilátky Kabat ID 109230 a protilátky zárodočnej línie A19. Oblasti CDR sú označené šípkami. Polotučnou kurzívou sú označené zriedkavé myšie zvyšky. Polotučné sú vyznačené pakovacie zvyšky (VH+VL). Výplň označuje kánonické/CDR interagujúce zvyšky. Hviezdičky označujú zvyšky vybraté na spätnú mutáciu v humanizovanom 3D6, verzia 1. V rámčeku sú zahrnuté všetky zvyšky, ktoré presne súhlasia s hum3D6VLvl.aa a sú číslované podľa Kabata. 3d6vl.aa znamená donorovú myšiu sekvenciu, KABID 019230 ľudskú akceptorovú rámcovú oblasť, hum3D6VLvl.aa humanizovanú 3d6, A19.prot ľudskú zárodočnú oblasť VH.
Obrázok 2 predstavuje remodelovanie 3D6 VH, je na ňom zobrazené usporiadanie sekvencii aminokyselín ťažkého reťazca myšej protilátky 3D6, humanizovanej protilátky 3D6, protilátky Kabat ID 045919 a protilátky zárodočnej línie VH3-23. Oblasti CDR sú označené šípkami. Polotučnou kurzívou sú označené zriedkavé myšie zvyšky. Polotučné sú vyznačené pakovacie zvyšky (VH+VL). Výplň označuje kánonické/CDR interagujúce zvyšky. Hviezdičky označujú zvyšky vybraté na spätnú mutáciu v humanizovanom 3D6, verzia L V rámčeku sú zahrnuté všetky zvyšky, ktoré presne súhlasia s hum3D6VHvl.aa a sú číslované podľa Kabata. 3d6vh.aa znamená donorovú myšiu sekvenciu, KABID 045919 ľudskú akceptorovú rámcovú oblasť, hum3d6VHvl.aa humanizovanú 3d6 VH, VH-23.prot ľudskú zárodočnú oblasť VH.
Obrázok 3 graficky znázorňuje Αβ väzbové vlastnosti 3D6, chimérického 3D6 a 10D5. Obrázok 3A je graf zobrazujúci väzbu Αβ na chimérický 3D6 (PK1614) na porovnanie s myším 3D6 (Αβ42 ELISA test). Obrázok 3B je graf znázorňujúci kompetíciu biotinylovaného 3D6 proti neoznačenému 3D6, PK1614 a 10D5 pri väzbe na Αβ (Αβ42 ELISA test).
Obrázok 4 znázorňuje homológny model 3D6 VH a VL, pričom ukazuje α-uhlíkovú kostru. VH sa zobrazuje ako bodkovaná čiara a VL ako plná čiara. Oblasti CDR sú vyznačené formou pásky.
Obrázok 5 graficky znázorňuje Αβ väzbové vlastnosti chimérického 3D6 a humanizovaného 3D6. Obrázok 5A zobrazuje výsledky ELISA stanovujúce väzbu humanizovaného 3D6vl a chimérického 3D6 na agregovaný Αβ. Obrázok 5B zobrazuje výsledky ELISA stanovujúce väzbu humanizovaného 3D6vl a humanizovaného 3D6v2 na agregovaný Αβ.
Obrázok 6 je graf kvantifikujúci väzbu humanizovaného 3D6 a chimérického 3D6 na Αβ plaky z mozgových rezov PDAPP myší. Na zistenie tejto väzby sa využíva farbenie PDAPP mozgových rezov s humanizovaným 3D6, MAb titrácie PDAPP mozgových rezov a kanály 70 - 256.
Obrázok 7 je graf ukazujúci výsledky kompetičnej väzbovej skúšky zisťujúcej schopnosť humanizovaného 3D6 verzie 1 a 2, chimérického 3D6, myšieho 3D6 a 10D5 konkurovať myšiemu 3D6 pri väzbe na Αβ.
Obrázok 8 graficky znázorňuje ex vivo fagocytóznu skúšku zisťujúcu schopnosť humanizovaného 3D6v2, chimérického 3D6 a ľudského IgG sprostredkovať pohlcovanie Αβ mikrogliálnymi bunkami.
Obrázok 9 znázorňuje usporiadanie sekvencii aminokyselín 10D5 VL a 3D6 VL. Polotučné sú vyznačené zvyšky, ktoré sa presne zhodujú s 10D5.
Obrázok 10 znázorňuje usporiadanie sekvencii aminokyselín 10D5 VH a 3D6 VH. Polotučné sú vyznačené zvyšky, ktoré sa presne zhodujú s 10D5.
Príklady uskutočnenia vynálezu
Príklad 1: Terapeutická účinnosť anti-Αβ protilátok: mAb 2H3, mAb 10D5, mAb 266, mAb 21F12 a pAb Αβί-42
V tomto príklade sa testuje kapacita rozličných monoklonálnych a polyklonálnych protilátok na Αβ z hľadiska potlačenia akumulácie Αβ v mozgu heterozygótnych transgenických myší.
A. Projekt štúdie
Šesťdesiat samčích a samičích PDAPP heterozygótnych transgenických myší vo veku 8,5 až 10,5 mesiacov sa získalo z Charles River Laboratory. Myši sa rozdelili do šiestich skupín na liečbu s rozličnými protilátkami proti Αβ. Pokiaľ to bolo možné, myši sa rozdelili do skupín rovnomerne s ohľadom na pohlavie, vek, pôvod a zdroj zvierat. Tabuľka 2 znázorňuje plán experimentu.
Tabuľka 2: Plán experimentu
Liečebná skupina Na Liečebná protilátka Špecificita protilátky Izotyp protilátky
1 9 žiadna (samotný PBS) NAb ΝΑ
2 10 Polyklonálna Αβί -42 zmiešaná
3 0 mAb“ 2H3 Αβί - 12 IgGl
4 8 mAb 10D5 Αβ3-7 IgGl
5 6 mAb 266 Αβ13-28 IgGl
6 8 mAb21F12 Αβ33-42 IgG2a
a. Počet myší v skupine na konci experimentu. Všetky skupiny začínali s 10 zvieratami v skupine.
b. NA: neaplikovateľné.
c. myšia polyklonálna: anti-agregovaná Αβ42.
d. mAb: monoklonálna protilátka
Ako je vidieť z tabuľky 2, protilátky zahŕňali štyri myšie Αβ-špecifické monoklonálne protilátky, 2H3 (smerovaná na Αβ 1 - 12), 10D5 (smerovaná na Αβ zvyšky 3 - 7), 266 (smerovaná na Αβ zvyšky 13 - 28 a viaže sa na rozpustný, ale nie na agregovaný AN1792), 21F12 (smerovaná na Αβ zvyšky 33 - 42). Piata skupina sa liečila frakciou Αβ-špecifickej polyklonálnej protilátky (vypestovanej imunizáciou s agregovaným AN 1792). Negatívna kontrolná skupina dostávala samotné riedidlo, PBS, bez protilátky.
B. Sledovanie priebehu liečby
Monoklonálne protilátky sa vstrekovali v dávke asi 10 mg/kg (za predpokladu, že myši vážili 50 g). Titre protilátky sa sledovali počas 28 týždňov liečby. Injekcie sa podávali intraperitoneálne v priemere každých sedem dní, aby sa udržiavali titre anti-Αβ nad 1000. Hoci pre mAb 266 sa namerali nižšie titre, pretože sa neviazal dobre na agregovaný ANI792 použitý v skúške ako záchytný antigén, rovnaký program dávkovania sa zachoval aj pre túto skupinu. Liečba v skupine, ktorá dostávala monoklonálnu protilátku 2H3, sa prerušila po prvých troch týždňoch, pretože protilátka vymizla v in vivo podmienkach príliš rýchlo.
Na stanovenie titra protilátky sa podskupine troch náhodne vybratých myší z každej skupiny odobrala krv bezprostredne pred každým intraperitoneálnou injekciou, celkove 30-krát. Titre protilátky sa merali ako Αβί-42 viažuca protilátka pomocou sendvičovej ELISA s plastovými viacjamkovými miskami pokrytými Αβί-42, ako sa podrobne opisuje v časti Všeobecné materiály a metódy. Priemerné titre pre každý odber sú uvedené v tabuľke 3 pre polyklonálnu protilátku a monoklonály 10D5 a 21F12.
Tabuľka 3:
týždne 21F12 21F12 týždne 10D5 10D5 týždne poly poly
0,15 500 0,15 3000 0,15 1600
0,5 800 0,5 14000 0,5 4000
1 2500 1 5000 1 4500
1,5 1800 1,1 5000 1,5 3000
2 1400 1,2 1300 2 1300
3 6000 2 3000 3 1600
3,5 550 3 4000 3,5 650
4 1600 3,5 500 4 1300
5 925 4 2400 5 450
6 3300 5 925 6 2100
týždne 21F12 21F12 týždne 10D5 10D5 týždne poly poly
7 4000 6 1700 7 1300
8 1400 7 1600 8 2300
9 1900 8 4000 9 700
10 1700 9 1800 10 600
11 1600 10 1800 11 600
12 1000 11 2300 12 1000
13 1500 12 2100 13 900
14 1300 13 2800 14 1900
15 1000 14 1900 15 1200
16 1700 15 2700 16 700
17 1700 16 1300 17 2100
18 5000 17 2200 18 1800
19 900 18 2200 19 1800
20 300 19 2500 20 1200
22 1750 20 980 22 1000
23 1600 22 2000 23 1200
24 1000 23 1000 24 675
25 1100 24 850 25 850
26 2250 25 600 26 1600
27 28 1400 26 27 28 1100 1450 27 28 1900
Priemerné titre boli okolo 1000 počas tohto obdobia pre prípravok polyklonálnej protilátky a boli mierne vyššie ako táto hodnota pre zvieratá liečené 10D5 a 21F12.
Liečenie prebiehalo počas šesťmesačného obdobia, celkove 196 dní. Zvieratá sa utratili týždeň po posled5 nej dávke.
C. Hladiny A3 a APP v mozgu:
Po šiestich mesiacoch liečby s rozličnými prípravkami anti-Αβ protilátok sa mozgy zo zvierat vyňali a per fundovali v soľnom roztoku. Jedna hemisféra sa pripravila pre imunohistochemickú analýzu a druhá sa pou10 žila na kvantifikáciu hladín Αβ a APP. Na meranie koncentrácií rozličných foriem beta-amyloidového peptidu a amyloidového prekurzorového proteínu (APP) sa hemisféra rozobrala a pripravili sa homogenáty hipokampálnej, kortikálnej a cerebelámej oblasti v 5M guanidíne. Tieto sa sériovo zriedili a hladiny amyloidového peptidu alebo APP sa kvantifikovali porovnaním série zriedení štandardov Αβ peptidu alebo APP so známymi koncentráciami vo formáte ELISA.
Hladiny celkového Αβ a Αβί - 42 merané metódou ELISA v homogenátoch kortexu a hipokampu a hodnoty celkového Αβ v cerebelle sú uvedené v tabuľkách 4, 5, resp. 6. Medián koncentrácie celkového Αβ pre kontrolnú skupinu, ktorej sa podával PBS, bol 3,6-krát vyšší v hipokampe než v kortexe (medián 63,389 ng/g hipokampálneho tkaniva v porovnaní s 17,818 ng/g pre kortex). Medián hladiny v cerebelle kontrolnej skupiny (30,6 ng/g tkaniva) bol viac než 2000-krát nižší než v hipokampe. Tieto hladiny sú podobné tým, ktoré sa publikovali v minulosti pre heterozygótne PDAPP transgenické myši v tomto veku (Johnson-Wood a kol., pozri vyššie).
Pre kortex mala jedna liečebná skupina medián hladiny Αβ meranej ako Αβί - 42 významne sa líšiaci od mediánu kontrolnej skupiny (p < 0,05), v ktorej zvieratá dostávali polyklonálnu anti-Αβ protilátku, ako je uvedené v tabuľke 4. Medián hladiny Αβί - 42 bol nižší o 65 % v porovnaní s kontrolou pre túto liečenú skupinu. Medián hladín Αβί - 42 bol tiež významne znížený o 55 % v porovnaní s kontrolou v jednej ďalšej liečebnej skupine, v ktorej zvieratá dostávali mAb 10D5 (p = 0,0433).
Tabuľka 4
Kortex
Liečebná skupina Na Mediány Priemery
Celkový Αβ Αβ42 Celkový Αβ Αβ42
hodnota” ELISA hodnota' P Zmena % Hodnota ELISA Hodnota P Zmena % Hodnota ELISA Hodnota ELISA
PBS 9 17818 NA“ NA 13802 NA NA 16150+/-7456e 12621+/-5738
Polyklonálna 10 6160 0,0055 -65 4892 0,0071 -65 5912+/-4492 4454+/-3347
SK 288209 Β6
Kortex
Liečebná skupina Na Mediány Priemery
Celkový Αβ Αβ42 Celkový Αβ Αβ42
hodnota” ELISA hodnotac P Zmena % Hodnota ELISA Hodnota P Zmena % Hodnota ELISA Hodnota ELISA
αηύ-Αβ42
mAb 10D5 8 7915 0,1019 -56 6214 0,0433 -55 9695+/-6929 6943+/-3351
mAb 266 6 9144 0,1255 -49 8481 0,1255 -39 9204+/-9293 7489+/-6921
mAb21F12 8 15158 0,2898 -15 13578 0,7003 -2 12481+/-7082 11005+/-6324
Poznámky:
a. Počet zvierat v skupine na konci experimentu
b. ng/g tkaniva
c. Mann-Whitneyova analýza
d. NA: neaplikovatefné
e. Smerodajná odchýlka
V hipokampe nebol medián percentuálnej redukcie celkového Αβ súvisiacej s liečbou polyklonálnou antiΑβ protilátkou (50 %, p = 0,0055) väčší ako medián pozorovaný v kortexe (65 %) (tabuľka 5). Absolútna veľkosť redukcie však bola skoro 3-krát väčšia v hipokampe než v kortexe, čisté zníženie 31,683 ng/g tkaniva v hipokampe oproti 11,658 ng/g tkaniva v kortexe. Keď sa meralo ako hladina viac amyloidogénnej formy Αβ, Αβί - 42, namiesto celkového Αβ, dosiahnuté zníženie s polyklonálnou protilátkou bolo významné (p = = 0,0025). Hladiny mediánov v skupinách liečených mAbs 10D5 a 266 sa znížili o 33 %, resp. 21 %.
Tabuľka 5
Hipokampus
Na Mediány Priemery
Celkový Αβ Αβ42 Celkový Αβ Αβ42
hodnota” ELISA hodnota“ P Zmena % Hodnota ELISA Hodnota P Zmena % Hodnota ELISA Hodnota ELISA
PBS 9 63389 NAd NA 54429 NA NA 58351 +/-133 08“ 52801+/-14701
Polyklonálna 3ηΙϊ-Αβ42 10 31706 0,0055 -50 27127 0,0025 -50 30058+/-22454 24853+/-18262
mAb 10D5 8 46779 0,0675 -26 36290 0,0543 -33 44581+/-18632 36465+/-17146
mAb 266 6 48689 0,0990 -23 43034 0,0990 -21 36419+/-27304 32919+/-25372
mAb21F12 8 51563 0,7728 -19 47961 0,8099 -12 57327+7-28927 50305+/-23927
a. Počet zvierat v skupine na konci experimentu
b. ng/g tkaniva
c. Mann-Whitneyova analýza
d. NA: neaplikovateľné 20 e. Smerodajná odchýlka
Celkový Αβ sa tiež meral v cerebelle (tabuľka 6). Tie skupiny, ktorým sa podávali polyklonálne protilátky anti-Αβ a 266, ukázali významné zníženia hladín celkového Αβ (43 %, resp. 46 %, p = 0,0033, resp. p = = 0,0184) a skupina liečená 10D5 mala temer významné zníženie (29 %, p = 0,0675).
Tabuľka 6
CEREBELLUM
Liečebná skupina Na Mediány Priemery
Celkový Αβ Celkový Αβ
Hodnota” ELISA Hodnota“ P Zmena % Hodnota ELISA
PBS 9 30,64 ŇÄ3 NA 40,00+/-31,89“
Polyklonálna 3ηΗ-Αβ42 10 17,61 0,0033 -43 18,15+/-4,36
mAb 10D5 8 21,68 0,0675 -29 27,29+/-19,43
mAb 266 6 16,59 0,0184 -46 19,59+/-6,59
mAb21F12 8 29,80 >0,9999 -3 32,88+/-9,90
a. Počet zvierat v skupine na konci experimentu
b. ng/g tkaniva
SK 288209 Β6
c. Mann-Whitneyova analýza
d. NA: neaplikovateľné
e. Smerodajná odchýlka
Koncentrácia APP sa tiež stanovila metódou ELISA v kortexe a v cerebelle z myší, ktorým bola podávaná protilátka, a z kontrolných myší, ktorým bol podávaný PBS. Použili sa dve rozdielne APP skúšky. Prvá, označená ako ΑΡΡ-α/FL spoznáva APP-alfa (a, vylučovaná forma APP, ktorá bola rozštiepená v sekvencii Αβ) aj formy APP s úplnou dĺžkou (FL), kým druhá spoznáva len APP-α. Na rozdiel od redukcie Αβ spojenej s liečbou v jednej časti liečebných skupín boli hladiny APP fakticky nezmenené u všetkých liečených zvierat v porovnaní s kontrolnými zvieratami. Tieto výsledky naznačujú, že imunizácie s Αβ protilátkami redukujú Αβ bez redukovania APP.
Stručne povedané, hladiny Αβ sa významne znížili v kortexe, hipokampe a v cerebelle u zvierat liečených polyklonálnou protilátkou vypestovanou proti ANI792. Významné liečebné účinky prejavili v menšej miere monoklonálne protilátky k amino-koncovej oblasti Αβί - 42, najmä k aminokyselinám 1 - 16 a 13 - 28.
D. Histochemické analýzy:
Morfológia Αβ-imunoreaktívnych plakov v podskupine mozgov z myší v liečebných skupinách PBS, polyklonálnej Αβ42, 21F12, 266 a 10D5 sa kvalitatívne porovnala s morfológiou z predošlých štúdií, v ktorých sa použili štandardné imunizačné postupy s Αβ42.
Najväčšia zmena vo veľkosti aj vo vzhľade amyloidových plakov sa vyskytla u zvierat imunizovaných polyklonálnou Αβ42 protilátkou. Redukcia uloženého amyloidu, rozrušená morfológia plakov a Αβ imunoreaktivita spojená s bunkami značne pripomínali účinky vyvolané štandardným imunizačným postupom. Tieto pozorovania podporujú výsledky ELISA, v ktorých sa dosiahlo významné zníženie celkového Αβ aj Αβ42 podávaním polyklonálnej Αβ42 protilátky.
Pri podobnom kvalitatívnom vyhodnotení sa zistilo, že amyloidové plaky v skupine 10D5 sa tiež zredukovali v počte a vzhľade, s určitými známkami Αβ imunoreaktivity spojenej s bunkami. V porovnaní s kontrolnými zvieratami polyklonálna Ig frakcia proti Αβ a jedna z monoklonálnych protilátok (10D5) znížili množstvo plakov o 93 %, resp. 81 % (p < 0,005). Zistilo sa, že 21F12 má pomerne slabý účinok sa množstvo plakov. Mikrografíe mozgu po liečbe ρΑΒΑβι _ 42 ukázali difúzne depozity a neprítomnosť mnohých z väčších kompaktných plakov v liečebnej skupine ρΑόΑβι _42 v porovnaní kontrolnými zvieratami.
E. Lymfoproliferatívne odozvy
Αβ-závislá lymfoproliferácia sa merala pomocou buniek sleziny odobratých osem dní po poslednej infúzii protilátky. Čerstvo odobraté bunky, 105 na jamku, sa kultivovali 5 dní v prítomnosti Αβί - 40 s koncentráciou 5 μΜ na stimuláciu. Ako pozitívna kontrola sa ďalšie bunky kultivovali s mitogénom T-buniek, PHA, a ako negatívna kontrola sa bunky kultivovali bez prídavku peptidu.
Splenocyty zo starých PDAPP myší pasívne imunizované rozličnými anti-Αβ protilátkami sa stimulovali in vitro ANI792 a merala sa proliferatívna a cytokínna odozva. Účelom týchto skúšok bolo stanoviť, či pasívna imunizácia uľahčuje prezentáciu antigénu, a tak inicializuje odozvy T-buniek špecifické na AN1792. Žiadna proliferatívna alebo cytokínna odozva špecifická na ANI792 sa nepozorovala u myší pasívne imunizovaných anti-Αβ protilátkami.
Príklad 2: Terapeutická účinnosť anti-Αβ protilátok: mAb 2H3, mAb 10D5, mAb 266, mAb 21F12, mAb 3D6, mAb 1601 apAb Αβί -42
V druhej štúdii sa zopakovala liečba s 10D5 a skúšali sa dve ďalšie anti-Αβ protilátky, monoklonály 3D6 (Αβί - 5) a 1601 (Αβ33 - 42). Kontrolné skupiny dostali buď PBS, alebo protilátku zodpovedajúcu irelevantnému izotypu (TM2a). Myši boli staršie (11,5 - 12 mesiacov staré heterozygóty) ako v predošlej štúdii, inak bol plán experimentu rovnaký. Opäť po šiestich mesiacoch liečby 10D5 znížil množstvo plakov o viac než 80 % v porovnaní buď s PBS, alebo s kontrolami protilátok zodpovedajúcimi izotypu (p = 0,003). Jedna z ďalších protilátok proti Αβ, 3D6 bola rovnako účinná a vyvolala 86 % redukciu (p = 0,003). Naopak tretia protilátka proti peptidu, 16C11 nemala žiadny účinok na množstvo plakov. Podobné výsledky sa získali pri meraniach ELISA s Αβ42.
Tieto výsledky názorne ukazujú, že protilátková odozva proti Αβ peptidu v neprítomnosti T-bunkovej imunity je dostatočná na zníženie amyloidových depozitov v PDAPP myšiach, ale aj to, že nie všetky antiΑβ protilátky sú rovnako účinné. Protilátky smerované na epitopy obsahujúce aminokyseliny Αβ 1 - 5 alebo 3 - 7 sú zvlášť účinné. Stručne povedané, môže sa ukázať, že pasívne podávané protilátky proti Αβ (t. j. pasívna imunizácia) znižujú rozsah plakových depozitov v myšom modeli Alzheimerovej choroby.
Príklad 3: Sledovanie väzby protilátky v CNS
Tento príklad ukazuje, že ak sa udržujú mierne koncentrácie protilátok v sére (25 - 70 ng/ml), získajú tieto protilátky prístup do CNS v hladinách dostatočných na zasiahnutie na β-amyloidové plaky.
Aby sa stanovilo, či protilátky proti Αβ môžu pôsobiť priamo v CNS, mozgy vybraté zo soľného roztoku z príkladu II sa vyšetrili na prítomnosť periférne podaných protilátok. Na nefixované kryostatické rezy mozgu sa pôsobilo fluorescenčným činidlom proti myšiemu imunoglobulínu (kozí anti-myší IgG-Cy3). Plaky v mozgoch 10D5 a 3D6 liečebných skupín boli silne dekorované protilátkou, kým v skupine 16C11 nebolo žiadne zafarbenie. Aby sa zistil úplný rozsah plakových usadenín, séria rezov z každého mozgu sa imunoreagovala najprv s anti-Αβ protilátkou, a potom so sekundárnym činidlom. V porovnaní s 16C11 skupinou sa množstvo plakov značne znížilo v týchto liečebných skupinách. Vniknutie protilátky do CNS nebol spôsobený abnormálnym prenikaním cez hematoencefalitickú bariéru, pretože vaskulárna priepustnosť sa nezvýšila, ako sa nameralo pomocou Evans Blue v PDAPP myšiach. Okrem toho koncentrácia protilátky v mozgovom parenchýme starých PDAPP myší bola rovnaká ako v netransgenických myšiach a predstavuje 0,1 % koncentrácie protilátky v sére (bez ohľadu na izotyp).
Tieto údaje naznačujú, že periférne podávané protilátky môžu prenikať do CNS, kde môžu priamo vyvolať odstraňovanie amyloidu. Je pravdepodobné, že 16C11 mal tiež prístup k plakom, ale nebol schopný naviazať sa.
Príklad 4: Ex vivo skríningová skúška na aktivitu protilátky proti amyloidovým depozitom
Na vyšetrenie účinku protilátok na odstraňovanie plakov sme pripravili ex vivo skúšku, v ktorej sa primáme mikrogliálne bunky kultivovali s nefixovanými kryostatickými rezmi buď PDAPP myši alebo ľudských AD mozgov. Mikrogliálne bunky sa získali z cerebrálnych kortexov novonarodených DBA/2N myší (1-3 dni). Kortexy sa mechanicky disociovali v HBSS (Hanksov vyvážený soľný roztok, Sigma) s 50 pg/ml DNázy I (Sigma). Disociované bunky sa prefiltrovali 100 pm sitom (Falcon) a odstreďovali sa 5 minút pri 1000 ot./min. Peleta sa resuspendovala v rastovom médiu (vysoko glukózový DMEM, 10 % FBS, 25 ng/ml rmGM-CSF) a bunky sa naniesli s hustotou 2 mozgov na T-75 plastovú kultivačnú nádobu. Po 7 - 9 dňoch sa nádobky nechali rotovať na orbitálnej trepačke 2 hodiny pri 37 °C a pri 200 ot./min. Bunková suspenzia sa odstredila pri 1000 ot./min. a resuspendovala v skúšobnom médiu.
pm kryostatické rezy PDAPP myších mozgov alebo ľudských AD mozgov (post mortem čas < 3 hodiny) sa nechali rozpustiť na polylyzínom pokrytých okrúhlych sklíčkach a umiestnili sa do jamiek 24-jamkových tkanivových kultivačných misiek. Sklíčka sa opláchli dvakrát skúšobným médiom obsahujúcim H-SFM (voľné médium hybridóm-sérum, Gibco BRL) s 1 % FBS, glutamínom, penicilínom/streptomycínom a 5 ng/ml rmGM-CSF (R&D). Kontrolné alebo anti-Αβ protilátky sa pridávali 1 hodinu v 2x koncentrácii (konečná 5 gg/ml). Potom sa naočkovali mikrogliálne bunky s hustotou 0,8 x 106 buniek/ml skúšobného média. Kultúry sa udržiavali vo zvlhčujúcom inkubátore (37 °C, 5 % CO2) 24 hodín alebo viac. Na konci inkubácie sa kultúry fixovali 4 % paraformaldehydom a permeabilizovali sa 0,1 % Tritonom-X100. Rezy sa zafarbili biotinylovaným 3D6 a potom konjugátom streptavidín/Cy3 (Jackson ImmunoResearch). Exogénne mikrogliálne bunky sa vizualizovali jadrovým farbením (DAPI), Kultúry sa pozorovali v invertnom fluorescenčnom mikroskope (Nikon, TE300) a nasnímali sa mikrofotografíe digitálnou kamerou SPOŤ pomocou SPOŤ softvéru (Diagnostic Instruments). Na Western blot analýzu sa kultúry extrahovali v 8M močovine zriedenej 1 : 1 v redukujúcom tricínovom vzorkovom tlmivom roztoku a naniesli sa na 16 % tricínový gél (Novex). Po prenose na immobilon sa škvrny exponovali 5 pg/ml ρ80Αβ42 a potom HRP-konjugovaňou anti-myšou protilátkou a vyvolali sa s ECDL (Amersham).
Keď sa skúška vykonala s PDAPP mozgovými rezmi v prítomnosti 16C11 (jedna z protilátok proti Αβ, ktorá nebola účinná in vivo), β-amyloidové plaky zostali intaktné a nepozorovala sa žiadna fagocytóza. Naproti tomu, keď sa susediace rezy kultivovali v prítomnosti 10D5, amyloidové depozity väčšinou zmizli a mikrogiálne bunky prejavili početné fagocytické vezikuly obsahujúce Αβ. Identické výsledky sa získali s rezmi AD mozgov; fagocytóza AD plakov indukovaná 10D5, kým 16C11 bola neúčinná. Okrem toho skúška poskytla porovnateľné výsledky, keď sa vykonali buď s myšími, alebo s ľudskými mikrogliálnymi bunkami a s myšími, králičími protilátkami alebo s protilátkami primátov proti Αβ.
Tabuľka 7 porovnáva väzbu Αβ oproti fagocytóze pre niektoré rozličné väzbové specificity protilátok. Je vidieť, že protilátky viažuce sa na epitopy v rámci aminokyselín 1 - 7 viažu a odstraňujú amyloidové depozity, kým protilátky viažuce sa k epitopom v rámci aminokyselín 4 - 10 sa viažu bez odstraňovania amyloidových depozitov. Protilátky viažuce sa na epitopy C-konca ku zvyšku 10 sa ani neviažu a ani neodstraňujú amyloidové depozity.
SK 288209 Β6
Tabuľka 7: Analýza epitopovej špecificity
Protilátka
Epitop Izotvp Farbenie Fagocvtóza
N-koniec
mab
3D6 1-5 IgG2b + +
10D5 3-7 IgGl + +
22C8 3-7 IgG2a + +
6E10 5-10 IgGl + -
14A8 4-10 potkaní IgG 1 + -
aminokvs. 13-28
18G11 10-18 potkaní IgG 1 - -
266 16-24 IgGl - -
22D12 18-21 IgG2b - -
C-koniec
2G3 -40 IgGl - -
1601 -40/-42 IgGl - -
21F12 -42 IgG2a - -
Imunitné sérum
králičie (CFA) 1-6 + +
myšie (CFA) 3-7 + +
myšie (QS-21) 3-7 + +
opičie (QS-21) 1-5 + +
myšie (MAPU - 7) + +
Protilátka
V tabuľke 8 sú výsledky získané s niekoľkými protilátkami proti Αβ, pričom sa porovnávajú ich schop-
nosti vyvolať fagocytózu v skúške ex vivo a znížiť množstvo plakov in vivo v štúdiách s pasívnym prenosom.
Hoci 1601 a 21F12 sa viažu na agregovaný syntetický Αβ peptid s vysokou afinitou, tieto protilátky neboli
schopné reagovať s β-amyloidovými plakmi v nefixovaných mozgových rezoch, neboli schopné aktivovať
fagocytózu v skúške ex vivo a neboli účinné in vivo. 10D5, 3D6 a polyklonálna protilátka proti Αβ boli aktív-
ne vo všetkých troch meraniach. Tieto výsledky ukazujú, že účinnosť in vivo je spôsobená priamym odstra-
ňovaním plakov sprostredkovaným protilátkou v CNS a že skúška ex vivo má prognostický význam pre účinnosť in vivo.
Tabuľka 8: Skúška ex vivo ako predpoveď účinnosti in vivo
Protilátka Izotyp Afinita na agregovaný Αβ (pM) Väzba na β-amyloidové plaky Účinnosť ex vivo Účinnosť in vivo
monoklonálna
3D6 IgG2b 470 + + +
10D5 IgGl 43 + + +
16C11 IgGl 90 - - -
21F12 IgG2a 500 - - -
TM2a IgGl - - - -
polyklonálna
1-42 mix 600 + + +
Rovnaká skúška sa použila na testovanie klíringovej aktivity protilátky proti fragmentu synukleínu označovaného ako NAC. Ukázalo sa, synukleín je proteín súvisiaci s amyloidovými plakmi. Ako predtým, protilátka k NAC sa priviedla do styku so vzorkou mozgového tkaniva obsahujúceho amyloidové plaky a s mikrogliálnymi bunkami. Ako kontrola sa použilo králičie sérum. Následné pozorovanie ukázalo značné zníženie počtu a veľkosti plakov, čo poukazuje na klíringovú aktivitu protilátky.
Na potvrdenie toho, že Αβ sa intemalizovalo v priebehu skúšky ex vivo, sa použila konfokálna mikroskopia. V prítomnosti kontrolných protilátok zostali exogénne mikrogliálne bunky v konfokálnej rovine nad tkanivom, neboli tam žiadne fagocytické vezikuly obsahujúce Αβ a plaky v reze ostávali nezmenené. V prítomnosti 10D5 bol temer všetok materiál plakov uzatvorený vo vezikulách v exogénnych mikrogliálnych bun33
SK 288209 Β6 kách. Na zistenie osudu internalizovaného peptidu sa kultúry liečené 10D5 extrahovali 8M močovinou v rozličných časoch a vyšetrili sa Western blot analýzou. V čase jednej hodiny, keď ešte nedochádzalo k žiadnej fagocytóze, reakcia s polyklonálnou protilátkou proti Αβ ukázala silný 4 kD pás (zodpovedajúci Αβ peptidu). Αβ imunoreaktivita sa znížila v čase 1 deň a bola neprítomná v čase 3 dni. Protilátkou sprostredkovaná fagocytóza Αβ teda vedie k jej degradácii.
Na určenie toho, či fagocytóza v skúške ex vivo bola sprostredkovaná Fc, pripravili sa F(ab')2 fragmenty anti-Αβ protilátky 3D6. Hoci F(ab')2 fragmenty si zachovali plnú funkčnosť na reakciu s plakmi, neboli schopné aktivovať fagocytózu mikrogliálnych buniek. Okrem toho fagocytóza s celou protilátkou mohla byť blokovaná činidlom proti myším Fc receptorom (anti-CD 16/32). Tieto údaje naznačujú, že k odstraňovaniu Αβ in vivo dochádza prostredníctvom fagocytózy sprostredkovanej Fc receptormi.
Príklad 5: Prenikanie protilátok cez hematoencefalitickú bariéru
V tomto príklade sa stanovuje koncentrácia protilátky dopravenej do mozgu po intravenóznej injekcii do periférneho tkaniva buď normálnych, alebo PDAPP myší. PDAPP alebo kontrolné normálne myši sa po liečbe per fundovali 0,9 % NaCl. Oblasti mozgu (hipokampus alebo kortex) sa oddelili a rýchlo zmrazili. Mozog sa homogenizoval v 0,1 % tritone + inhibítoroch proteázy. V extraktoch sa detegoval imunoglobulín metódou ELISA. Ako záchytné činidlo sa na RIA platňu naniesol F(ab')2 kozí anti-myší IgG. Sérum alebo mozgové extrakty sa inkubovali 1 hodinu. Izotypy sa detegovali anti-myším IgGl-HRP alebo IgG2a-HRP alebo IgG2b-HRP (Caltag). V CNS boli prítomné protilátky, bez ohľadu na izotyp, v koncentrácii, ktorá je 1 : 1000 tej, ktorá sa našla v krvi. Keď napríklad koncentrácia IgGl v krvi bola trikrát väčšia ako koncentrácia IgG2, bola rovnako trikrát väčšia v mozgu, pričom obidve látky boli prítomné v 0,1 % ich zodpovedajúcich hladín v krvi. Tento výsledok sa pozoroval v transgenických aj v netransgenických myšiach, čo naznačuje, že PDAPP myši nemajú špecificky priepustnú hematoencefalitickú bariéru.
Príklad VI: Klonovanie a sekvenovanie myších 3D6 variabilných oblastí
Klonovanie a analýza sekvencie VH 3D6. Variabilná VH oblasť ťažkého reťazca 3D6 sa klonovala RT-PCR pomocou mRNA pripravenej z hybridómových buniek dvoma nezávislými metódami. V prvej metóde sa konsenzuálne priméry použili do VH oblasti líder peptidu zahŕňajúceho translačný iniciačný kodón ako 5'primér (DNA #3818 - 3829) a špecifický 3'primér g2b (DNA #3832) konštantných oblastí. Sekvencie z PCR amplifikovaného produktu, ako aj z opakovane nezávisle odvodených klonov, úplne navzájom súhlasili. Ako ďalšia kontrola sekvencie vo VH oblasti 3D6 sa výsledok potvrdil sekvenovaním VH fragmentu získaného metodológiou 5'RACE RT-PCR a 3'g2b špecifického priméru (DNA #3832). Sekvencia sa opäť odvodila z PCR produktu, ako aj z viacnásobne nezávisle izolovaných klonov. Obe sekvencie sa navzájom úplne zhodujú (s výnimkou V8I substitúcie v líder oblasti z 5'RACE produktu), čo naznačuje, že sekvencie sú odvodené z mRNA kódujúcej VH oblasť 3D6. Nukleotid (SEQ ID NO: 3) a sekvencia aminokyselín (SEQ ID NO: 4) VH oblasti 3D6 sú uvedené v tabuľke 9A, resp. na obrázku 2.
Tabuľka 9A: Sekvencia nukleotidov myšej VH 3D6
ATGAACTTCGGGCTCAGCTTGATTTTCCTTGTCCTTGTTTTAAAAGGTGTCCAGTGTGA
AGTGAAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTAGTGAAGCCTGGAGCGTCTCTGAAACTCT
CCTGTGCAGCCTCTGGATTCACTTTCAGTAACTATGGCATGTCTTGGGTTCGCCAGAAT
TCAGACAAGAGGCTGGAGTGGGTTGCATCCATTAGGAGTGGTGGTGGTAGAACCTACTA
TTCAGACAATGTAAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGAGAATGCCAAGAACACCCTGT
ACCTGCAAATGAGTAGTCTGAAGTCTGAGGACACGGCCTTGTATTATTGTGTCAGATAT
GATCACTATAGTGGTAGCTCCGACTACTGGGGCCAGGGCACCACT (SEQ ID NO: 3) *Líder peptid je podčiarknutý.
Klonovanie a analýza sekvencie VL 3D6. Variabilná VL oblasť ľahkého reťazca 3D6 sa klonovala analogickým spôsobom ako VH oblasť. V prvom pokuse sa vytvorila sada konsenzuálnych primérov na amplifikáciu myších VL oblastí nasledujúcim spôsobom: pripravili sa 5'priméry (DNA #3806 - 3816) na hybridizáciu do VL oblasti obsahujúcej translačný iniciačný kodón a 3'primér (DNA #3817) bol špecifický pre myšiu Ck oblasť nadol od V-J spojovacej oblasti. Analýza sekvencie DNA PCR fragmentu, ako aj nezávisle odvodené klony izolované pomocou konsenzuálnej sady primérov ľahkého reťazca ukázali, že získaná cDNA bola odvodená z nefunkčné preskupenej informácie, pretože sekvencia obsahovala rámcovo posunutú mutáciu medzi spojkou V-J oblasti.
V druhom pokuse sa použil 5'RACE na klonovanie druhej VL kódujúcej cDNA. Analýza sekvencie DNA tohto produktu (konsenzus 11) ukázala, že kódoval funkčnú mRNA. Možno teda usúdiť, že sekvencia kóduje správnu mRNA ľahkého reťazca 3D6. Nukleotid (SEQ ID NO: 1) a sekvencia aminokyselín (SEQ ID NO: 2) VL oblasti 3D6 sú uvedené v tabuľke 9B, resp. na obrázku 1.
SK 288209 Β6
Tabuľka 9B: Sekvencia nukleotidov myšej VL 3D6
ATGATGAGTCCTGCCCAGTTCCTGTTTCTGTTAGTGCTCTGGATTCGGGAAACCAACGG
TTATGTTGTGATGACCCAGACTCCACTCACTTTGTCGGTTACCATTGGACAACCAGCCT
CCATCTCTTGCAAGTCAAGTCAGAGCCTCTTAGATAGTGATGGAAAGACATATTTGAAT TGGTTGTTACAGAGGCCAGGCCAGTCTCCAAAGCGCCTAATCTATCTGGTGTCTAAACT GGACTCTGGAGTCCCTGACAGGTTCACTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTTACACTGA AAATCAGCAGAATAGAGGCTGAGGATTTGGGACTTTATTATTGCTGGCAAGGTACACAT TTTCCTCGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAA (SEQ ID NO: 1) *Líder peptid je podčiarknutý.
Priméry použité na klonovanie 3D6 VL cDNA sú uvedené v tabuľke 10.
Tabuľka 10
DNA Veľkosť Kódujúci reťazec? DNA sekvencia Komentáre
3806 40 Áno ACT.AGT.CGA.CAT.GAA.GTT.GCC.TGT.TA G.GCT.GTT.GGT.GCT.G (SEQ ID NO: 39) myší kapa variabilný primér 1 MKV PRIMÉR 1, MRC súbor; % A+T = 50,00 [20]; % C+G = 50,00 [20] Davis, Botstein, Roth Teplota topenia 72,90 °C
3807 39 Áno ACT.AGT.CGA.CAT.GGA.GWC.AGA.CAC.AC T.CCT.GYT.ATG.GGT (SEQ ID NO: 40) myší kapa variabilný primér 2 MKV PRIMÉR 2, MRC súbor; % A+T = 46,15 [18%]; % C+G = 48,72 [19] Davis, Botstein, Roth Teplota topenia 72,05 °C
3808 40 Áno ACT.AGT.CGA.CAT.GAG.TGT.GCT.CAC.TC A.GGT.CCT.GGS.GTT.G (SEQ ID NO: 41) myší kapa variabilný primér 3 MKV PRIMÉR 3, MRC súbor; % A+T = 45,00 [20]; % C+G = 52,50 [21] Davis, Botstein, Roth Teplota topenia 73,93 °C
3809 43 Áno ACT.AGT.CGA.CAT.GAG.GRC.CCC.TGC.TC A.GWT.TYT.TGG.MWT.CTT.G (SEQ ID NO: 42) myší kapa variabilný primér 4 MKV PRIMÉR 4, MRC súbor; % A+T = 41,86 [18]; % C+G = 46,51 [20] Davis, Botstein, Roth Teplota topenia 72,34 °C
3810 40 Áno ACT . AGT . CGA. CAT . GGA. TTT . WCA. GGT.GCA.GAT.TWT.CAG.CTT.C (SEQ ID NO: 43) myší kapa variabilný primér 5 MKV PRIMÉR 5, MRC súbor; % A+T = 52,50 [21]; % C+G = 42,50 [17] Davis, Botstein, Roth Teplota topenia 69,83 °C
3811 37 Áno ACT.AGT.CGA.CAT.GAG. GTK.CYY.TGY.TS A.GYT.YCT.GRG.G (SEQ ID NO: 44) myší kapa variabilný primér 6 MKV PRIMÉR 6, MRC súbor; % A+T = 37,84 [14]; % C+G = 40,54 [15] Davis, Botstein, Roth Teplota topenia 68,01 °C
3812 41 Áno ACT.AGT.CGA.CAT.GGG.CWT.CAA.GAT.GG A.GTC.ACA.KWY.YCW.GG (SEQ ID NO:45) myší kapa variabilný primér 7 MKV PRIMÉR 7, MRC súbor; % A+T = 39,02 [16]; % C+G = 46,34 [19] Davis, Botstein, Roth Teplota topenia 71,70 °C
3813 41 Áno ACT.AGT.CGA.CAT.GTG.GGG.AYC.TKT.TT Y.CMM.TTT.TTC.AAT.TG (SEQ ID NO: 46) myší kapa variabilný primér 8 MKV PRIMÉR 8, MRC súbor; % A+T = 53,66 [22];
DNA Veľkosť Kódujúci reťazec? DNA sekvencia Komentáre
% C+G = 34,15 [14] Davis, Botstein, Roth Teplota topenia 66,70 °C
3814 35 Áno ACT.AGT.CGA.CAT.GGT.RTC.CWC.ASC.TC A.GTT.CCT.TG (SEQ ID NO: 47) myší kapa variabilný primér 9 MKV PRIMÉR 9, MRC súbor; % A+T = 45,71 [16]; % C+G = 45,71 [16] Davis, Botstein, Roth Teplota topenia 69,36 °C
3815 37 Áno ACT.AGT.CGA.CAT.GTA.TAT.ATG.TTT.GT T.GTC.TAT.TTC.T (SEQ ID NO: 48) myší kapa variabilný primér 10 MKV PRIMÉR 10, MRC súbor; % A+T = 70,27 [26]; % C+G = 29,37 [11] Davis, Botstein, Roth Teplota topenia 63,58 °C
3816 38 Áno ACT.AGT.CGA.CAT.GGA.AGC.CCC.AGC.TC A.GCT.TCT.CTT.CC (SEQ ID NO: 49) myší kapa variabilný primér 11 MKV PRIMÉR 11, MRC súbor; % A+T = 44,74 [17]; % C+G = 55,26 [21] Davis, Botstein, Roth Teplota topenia 74,40 °C
3817 27 Nie GGA. TCC . CGG. GTG. GAT . GGT . GGG. AAG . AT G (SEQ ID NO: 50) myší kapa reverzný primér ľahkého reťazca, aa 116 - 122; Ck primér konštantnej oblasti, MRC súbor+Smal miesto; % A+T = 47,06 [8]; % C+G = 52,94 [9] Davis, Botstein, Roth Teplota topenia 57,19 °C
3818 37 Áno ACT.AGT.CGA.CAT.GAA.ATG.CAG.CTG.GG T.CAT.STT.CTT.C (SEQ ID NO: 51) myší ťažký variabilný primér 1 MHV primér 1, MRC súbor;
3819 36 Áno ACT.AGT.CGA.CAT.GGG.ATG.GAG.CTR.TA T.CAT.SYT.CTT (SEQ ID NO: 52) myší ťažký variabilný primér 2 MHV primér 2, MRC súbor;
3820 37 Áno ACT.AGT.CGA.CAT.GAA.GWT.GTG.GTT.AA A.CTG.GGT.TTT.T (SEQ ID NO: 53) myší ťažký variabilný primér 3 MHV primér 3, MRC súbor;
3821 35 Áno ACT.AGT.CGA.CAT.GRA.CTT.TGG.GYT.CA G.CTT.GRT.TT (SEQ ID NO: 54) myší ťažký variabilný primér 4 MHV primér 4, MRC súbor;
3822 40 Áno ACT.AGT.CGA.CAT.GGA.CTC.CAG.GCT.CA A.TTT.AGT.TTT.CCT.T (SEQ ID NO: 55) myší ťažký variabilný primér 5 MHV primér 5, MRC súbor;
3823 37 Áno ACT.AGT.CGA.CAT.GGC.TGT.CYT.RGS.GC T.RCT.CTT.CTG.C (SEQ ID NO: 56) myší ťažký variabilný primér 6 MHV primér 6, MRC súbor;
3824 36 Áno ACT.AGT.CGA.CAT.GGR.ATG.GAG.CKG.GR T.CTT.TMT.CTT (SEQ ID NO: 57) myší ťažký variabilný primér 7 MHV primér 7, MRC súbor;
3825 33 Áno ACT . AGT . CGA. CAT . GAG. AGT . GCT . GAT . TC T.TTT.GTG (SEQ ID NO: 58) myší ťažký variabilný primér 8 MHV primér 8, MRC súbor;
3826 40 Áno ACT.AGT.CGA.CAT.GGM.TTG.GGT.GTG.GA M.CTT.GCT.ATT.CCT.G (SEQ ID NO: 59) myší ťažký variabilný primér 9 MHV primér 9, MRC súbor;
3827 37 Áno ACT.AGT.CGA.CAT.GGG.CAG.ACT.TAC.AT T.CTC.ATT.CCT.G (SEQ ID NO: 60) myší ťažký variabilný primér 10 MHV primér 10, MRC súbor;
3828 38 Áno ACT.AGT.CGA.CAT.GGA.TTT.TGG.GCT.GA T.TTT.TTT.TAT.TG (SEQ ID NO: 61) myší ťažký variabilný primér 11 MHV primér 11, MRC súbor;
3829 37 Áno ACT . AGT . CGA. CAT . GAT . GGT . GTT . AAG. TC T.TCT.GTA.CCT.G (SEQ ID NO: 62) myší ťažký variabilný primér 12 MHV primér 12, MRC súbor;
3832 27 Nie GGA.TCC.CGG.GAG.TGG.ATA.GAC.tGA.TG G (SEQ ID NO: 63) myší IgG2b reverzný primér ťažkého reťazca poloha aa 119 - 124, MRC súbor;
SK 288209 Β6
Od N-konca k C-koncu ľahký aj ťažký reťazec obsahujú domény FR1, CDR1, CDR2, FR3, CDR3 a FR4. Priradenie aminokyselín v každej doméne je v súlade s číselnou konvenciou Kabata a kol., pozri vyššie.
Expresia chimérickej 3D6 protilátky: Variabilné oblasti ťažkého a ľahkého reťazca sa skonštruovali tak, aby kódovali spletacie donomé sekvencie nadol od zodpovedajúcej VDJ alebo VJ spojky a naklonovali sa do cicavčieho expresného vektora pCMV-hyl pre ťažký reťazec a pCMV-hKl pre ľahký reťazec. Tieto vektory kódujú ľudské γΐ a Ck konštantné oblasti ako exonické fragmenty nadol od vloženej kazety variabilnej oblasti. Po verifikácii sekvencie sa expresné vektory ťažkého reťazca a ľahkého reťazca kotransfektovali do COS buniek. Na potvrdenie reprodukovateľnosti výsledku sa dva rozdielne klony ťažkého reťazca (H2.2 a H3.2) nezávisle kotransfektovali s tromi rozličnými chimérickými klonmi ľahkého reťazca (L3, L4 a L10). Ako pozitívna kontrola vektorov sa urobila chimérická transfekcia 21.6 protilátky. Kondicionačné médiá sa odobrali 48 hodín po transfekcii a skúšali sa Westem blot analýzou na produkciu protilátok alebo metódou ELISA na Αβ väzbu.
Všetky viacnásobné transfektanty exprimovali kombinácie ťažký reťazec + ľahký reťazec, ktoré boli spoznané kozou anti-ľudskou IgG (H+L) protilátkou vo Westem blot skúške.
Priama väzba 3D6 a chimérických 3D6 (PK1614) protilátok k Αβ sa skúšala analýzou ELISA. Zistilo sa, že chimérický 3D6 sa viazal na Αβ s vysokou afinitou, podobnou tej, akú prejavovalo 3D6 (obrázok 3A). Ďalej kompetičná inhibičná skúška na báze ELISA ukázala, že chimérická 3D6 a myšia 3D6 protilátka rovnako konkurujú vo väzbe biotinylovanému 3D6 k Αβ (obrázok 3B). Chimérická protilátka ukázala väzbové vlastnosti nerozlíšiteľné od referenčnej vzorky 3D6.
Tabuľka 11.
Kone. (pg/ml) 3D6 PK1614 IgGl
0,037 119,3
0,11 118,6 118,9
0,33 99,7 71,25
1 98,63 84,53 134,4
Okrem toho 3D6 aj PK1614 boli účinné pri odstraňovaní Αβ plakov. Skúška ex vivo ukazuje, že keď sa koncentrácia protilátky zvyšuje, množstvo Αβ sa znižuje rovnakým spôsobom pre myšiu aj pre chimérickú 3D6 protilátku. Možno teda usúdiť, že sekvencie kódujú funkčné ľahké, resp. ťažké reťazce 3D6.
Príklad 7. Humanizácia 3D6
Modelovanie homológie/molekulárne modelovanie. Aby sa identifikovali kľúčové štrukturálne rámcové zvyšky v myšej 3D6 protilátke, generoval sa trojrozmerný model založený na najbližších myších protilátkach pre ťažké a ľahké reťazce. Na tento účel sa vybrala protilátka označená 1CR9 ako vzor na modelovanie ľahkého reťazca 3D6 (PDB ID: 1CR9, Kanyo a kol., pozri vyššie) a protilátka označená 10PG sa vybrala ako vzor na modelovanie ťažkého reťazca (PDB ID: 1OPG Kodandapani a kol., pozri vyššie) (pozri tiež tabuľku 1). Porovnanie sekvencie aminokyselín 3D6 s ľahkým a ťažkým reťazcom týchto protilátok ukázal, že s výnimkou CDR3 ťažkého reťazca majú protilátky 1CR9 a 1OPG významnú sekvenčnú homológiu s 3D6. Okrem toho CDR slučky vybratých protilátok patria do rovnakých kánonických Chothiových štruktúrnych tried ako CDR slučky 3D6, opäť s výnimkou CĎR3 ťažkého reťazca. Preto sa na začiatku zvolili 1CR9 a 1OPG ako protilátky s vyriešenou štruktúrou na modelovanie homológie 3D6.
Prvý návrh modelu homológie 3D6 variabilnej oblasti založeného na protilátkach uvedených vyššie sa vytvoril pomocou softvérového balíka Look & SegMod Modules GeneMine (v3.5). Tento softvér sa zakúpil s trvalou licenciou od Molecular Application Group (Palo Alto, CA). Tento softvérový balík, ktorého autormi sú Dr. Michael Levitt a Chris Lee, uľahčuje proces molekulového modelovania automatizáciou krokov zahrnutých v štruktúrnom modelovaní primárnej sekvencie na vzore známej štruktúry založenej na sekvenčnej homológii. Pri práci na pracovnej stanici Silicon Graphics IRIS v prostredí UNIX sa modelovaná štruktúra automaticky vylepšuje sériou krokov minimalizujúcim energiu, aby sa odstránili nevýhodné kontakty atómov a minimalizovali elektrostatické a Van der Waalsove interakcie.
Ešte viac vylepšený model sa vytvoril pomocou modelovacích možností Quanta®. Dopyt v PDB databáze na CDR3 ťažkého reťazca 3D6 identifikoval lqkz ako najviac homológny a majúci rovnaký počet zvyškov ako 3D6. CDR3 ťažkého reťazca 3D6 sa preto modeloval pomocou kryštalickej štruktúry lqkz ako vzoru, α-uhlíková kostra modelu 3D6 je znázornená na obrázku 4. VH doména je znázornená ako bodkovaná čiara, VL doména ako plná čiara a CDR slučky sú vyznačené formou pásky.
Výber ľudských akceptomých protilátkových sekvencií. Počítačovým porovnaním sekvencií aminokyselín myších variabilných oblastí so sekvenciami známych ľudských protilátok sa identifikovali vhodné ľudské akceptomé protilátkové sekvencie. Porovnanie sa vykonalo oddelene pre ťažké a ľahké reťazce 3D6. Konkrétne, variabilné domény z ľudských protilátok, ktorých sekvencie rámcových oblastí prejavovali vysoký stupeň identity sekvencii s myšími VL a VH rámcovými oblasťami, sa identifikovali dopytom v Kabátovej databáze pomocou NCBI BLAST (verejne dostupné cez intemetový server NCBI národných inštitútov zdravia) na zodpovedajúce sekvencie myších rámcových oblastí.
Dve kandidátske sekvencie sa vybrali ako akceptomé sekvencie podľa uvedených kritérií: (1) homológia s predmetnou sekvenciou; (2) rovnaké kánonické CDR štruktúry s donomou sekvenciou; a (3) neprítomnosť zriedkavého aminokyselinového zvyšku v rámcových oblastiach. Zvolená akceptomá sekvencia pre VL je Kabatovo ID číslo (KABID) 019230 (Genbank prístupové č. S40342) a pre VH je KABID 045919 (Genbank prístupové č. AF115110). Prvé verzie humanizovanej 3D6 protilátky využívajú tieto akceptomé protilátkové sekvencie.
Substitúcia aminokyselinových zvyškov. Ako sa spomenulo, humanizované protilátky tohto vynálezu obsahujú variabilné rámcové oblasti v zásade z ľudského imunoglobulínu (akceptomého imunoglobulínu) a komplementaritu určujúce oblasti v zásade z myšieho imunoglobulínu (donomý imunoglobulín) označeného ako 3D6. Po identifikácii komplementaritu určujúcich oblastí 3D6 a vhodných ľudských akceptomých imunoglobulínov bolo treba v ďalšom kroku určiť, či, ak vôbec, substituovať zvyšky z týchto komponentov, aby sa optimalizovali vlastnosti výslednej humanizovanej protilátky. Na výber zvyškov na substitúciu sa použili opísané kritériá.
Obrázky 1 a 2 znázorňujú usporiadania pôvodných myších 3D6 VL, resp. VH s prípadnou verziou 1 humanizovanej sekvencie, zodpovedajúcu ľudskú rámcovú akceptomú sekvenciu a napokon ľudskú zárodočnú sekvenciu V oblasti prejavujúcu najvyššiu homológiu s ľudskou rámcovou akceptomou sekvenciou. Tieňo20 vané zvyšky znamenajú kánonické (súvislá výplň), vemierove (bodkovaný obrys), pakovacie (polotučné) a zriedkavé aminokyseliny (polotučná kurzíva) a sú na obrázku vyznačené. Hviezdičky označujú zvyšky spätne zmutované na myšie zvyšky v ľudskej akceptomej rámcovej sekvencii a CDR oblasti sú označené čiarou nad nimi. Súhrn zmien zavedených do verzie 1 humanizovaných 3D6 VH a VL sú uvedené v tabuľke 12.
Tabuľka 12. Súhrn zmien v humanizovanom 3D6.vl
Zmeny VL (112 zvyškov) VH (119 zvyškov)
Hu—>Mu: Rámec 4/112 3/119(1 kánon., 1 obal)
CDR 1 6/16 3/5
CDR 2 4/7 7/14
CDR 3 5/8 4/10
Hu—> Mu 19/112(17%) 17/119(14%)
Mu—»Hu: Rámec 13/112 14/119
Poznámky k spätným mutáciám 1. 12V, ktorý je v kánonickej polohe 2. Y36L, ktorý je obalový zvyšok a tiež leží pod CDR 3. L46R, ktorý je obalový zvyšok a leží pod CDR 4. S49A Vemier/pod CDR 5. A93V, ktorý je obalový zvyšok a zvyšok vemierovej zóny 6. K94R, ktorý je kánonický zvyšok
Poznámky k akceptoru 7. KABID 019230/Genbank ACC#S40342 8. Hu k LC podskupina II 9. CDR z rovnakej kánonickej štruktúrnej skupiny ako donor (m3D6) Ll = trieda 4 L2 = trieda 1 L3 = trieda 1 10. Neznáma špecificita 11. KABID045919/Genbank Acc#AF 115110 12. Hu HC podskupina III 13. CDR z rovnakej kánonickej štruktúrnej skupiny ako donor (m3D6) Hl = trieda 1 H2 = trieda 3 14. Spoznáva kapsulárny polysacharid Neisseria meningitis
Akceptomá zárodočná línia 15. VH3-23 16. A3&A19
Tabuľky 13 a 14 uvádzajú Kabatove číslovacie kľúče pre rozličné ľahké, resp. ťažké reťazce.
Tabuľka 13: Kľúč ku Kabatovmu číslovaniu ľahkého reťazca
KAB Myší 3D6 Ľudský KABID A19 Zárodoč.
č. C Typ VL 3D6 019230 línia Poznámka
1 1 FR1 Y Y D D Zriedkavý myší, môže sa dotýkať CDR
2 2 V V I I Kánonický/kontakt s CDR
3 3 V V V V
4 4 M M M M
5 5 T T T T
SK 288209 Β6
Myší 3D6 Ľudský KABID A19 Zárodoč.
L Typ VL 3D6 019230 línia Poznámka
6 Q Q Q Q
7 T S S s
8 P P P P
9 L L L L
10 T S S S
11 L L L L
12 S P P P
13 V V V V
14 T T T T
15 I P P P
16 G G G G
17 Q E E E
18 P P P P
19 A A A A
20 S S S S
21 I I I I
22 s s s S
23 c c c c
24 CDR1 K K R R
25 s s S S
26 s s s s
27 Q Q Q Q
28 s s s s
29 L L L L
30 L L L L
31 D D H H
32 S S S S
33 D D N N
34 G G G G
35 K K Y Y
36 T T N N
37 Y Y Y Y
38 L L L L
39 N N D D
40 FR2 W W W W
41 L L L L Pakovací zvyšok
42 L L L L
43 Q Q Q Q
44 R K K K
45 P P P P
46 G G G G
47 Q Q Q Q
48 S s s s
49 P P P P
50 K Q Q Q
51 R R L L Pakovací zvyšok
52 L L L L
53 I 1 I I
54 Y Y Y Y
55 CDR2 L L L L
56 V V G G
57 S S S S
58 K K N N
59 L L R R
60 D D A A
61 S S S S
62 G G G G
Myší
3D6
č. Typ VL
CDR3
H
F
100 P
101 R
102 T
103 FR4 F
104 G
105 G
106 G
107 T
108 K
109 L
110 E
111 I
112 K
Ľudský KABID A19 Zárodoč.
3D6 019230 línia
V V V
P P P
D D D
R R R
F F F
T S S
G G G
S S S
G G G
S S S
G G G
T T T
D D D
F F F
T T T
L L L
K K K
I I I
S S S
R R R
I V Y
E E E
A A A
E E E
D D D
L V V
G G G
L V V
Y Y Y
Y Y Y
C c c
W w M
Q Q Q
G G A
T T L
H Q Q
F T T
P P P
R R
T T
F F
G G
Q Q
G G
T T
K K
V V
E E
I I
K K
Poznámka
V P D R F S G S G S G T D F T L K I S R
V E A E D
V G
V
V
V C M
Q
A
L
Kľúč ku Kabatovmu číslovaniu ťažkého reťazca
á ΙϊΕ Myší 3D6 VH Ľudský 3D6 VH KABID 045919 VH3-23 Zárodoč. Poznámka línia
1 FR1 E E E E
2 V V V V
3 K Q Q Q
4 L L L L
5 V L L L
6 E E E E
7 S S S S
8 G G G G
9 G G G G
10 G G G G
11 L L L L
12 V V V V
13 K Q Q Q
14 P P P P
15 G G G G
16 A G G G
17 S S S S
18 L L L L
19 K R R R
20 L L L L
21 S S S S
22 C C C C
23 A A A A
24 A A A A
25 S S S S
26 G G G G
27 F F F F
28 T T T T
29 F F F F
30 S S S S
31 CDR1 N N S S
32 Y Y Y Y
33 G G A A
34 M M V M
35 S S S S
36 FR2 W W W W
37 V V v v
38 R R R R
39 Q Q Q Q
40 N A A A Zriedkavý myší, nahrádza w/Hum
41 S P P P
42 D G G G Zriedkavý myší, nahrádza w/Hum
43 K K K K
44 R G G G
45 L L L L
46 E E E E
47 W W W W
48 V V V V
49 A A A A kontakt CDR/veneer
50 CDR2 S S A A
51 I I I I
52 R R S S
53 S S G G
54 G G S S
55 G G G G
56 G G G G
SK 288209 Β6
ά ΙϊΡ Myší 3D6 VH Ľudský 3D6 VH KABID 045919 VH3-23 Zárodoč. Poznámka línia
57 R R S S
58 T T T T
59 Y Y Y Y
60 Y Y Y Y
61 S S A A
62 D D D D
63 N N S S
64 V V V V
65 K K K K
66 G G G G
67 FR3 R R R R
68 F F F F
69 T T T T
70 I I I I
71 S S S S
72 R R R R
73 E D D D
74 N N N N
75 A A A S
76 K K K K
77 N N N N
78 T S S T
79 L L L L
80 Y Y Y Y
81 L L L L
82 Q Q Q Q
83 M M M M
84 S N N N
85 S S S S
86 L L L L
87 K R R R
88 S A A A
89 E E E E
90 D D D D
91 T T T T
92 A A A A
93 L L L V
94 Y Y Y V
95 Y Y Y Y
96 C C C c
97 V V A A Pakovací zvyšok, použi myší
98 R R K K Kánonický, použi myší
99 CDR3 Y Y D
100 D D N
101 H H Y
102 Y Y D
103 S S F
104 G G W
105 S S S
106 S S G
107 - - T
108 - - F
109 D D D
110 Y Y Y
111 FR4 W W W
112 G G G
113 Q Q Q
KAB ď ď Typ Myší 3D6 VH Ľudský 3D6 VH KABID 045919
106 114 G G G
107 115 T T T
108 116 T L L
109 117 V V V
110 118 T T T
111 119 V V V
112 120 S S S
113 121 S s s
VH3-23
Zárodoč.
línia
Poznámka
Humanizované protilátky výhodne prejavujú špecifickú väzbovú afinitu pre Αβ aspoň ΙΟ7, ΙΟ8, 109 alebo 1O10 M'1. Horný limit väzbovej afinity humanizovaných protilátok pre Αβ je obyčajne trikrát, štyrikrát alebo päťkrát vyšší ako limit pre 3D6 (t. j. ~109 M'1). Dolný limit väzbovej afinity je tiež často trojnásobkom, štvornásobkom alebo päťnásobkom limitu pre 3D6.
Zostrojenie a expresia humanizovaných 3D6 VH a VL, verzia 1.
V stručnosti, syntetizovali sa 4 veľké jednoreťazcové prekrývajúce sa oligonukleotidy pre každú V-oblasť. Okrem toho sa syntetizovali 4 krátke PCR priméry pre každú V oblasť, aby sa ďalej uľahčilo zostrojenie špecifickej V oblasti. DNA sekvencie oligonukleotidov použité na tento účel sú uvedené v tabuľke 15.
Tabuľka 15: Oligonukleotidy DNA
DNA č. Veľkosť Kódovanie ? Sekvencia Komentáre
4060 136 Áno tccgc aagct tgccg ccacc ATGGA CATGC GCGTG CCCGC CCAGC TGCTG GGCCT GCTGA TGCTG TGGGT GTCCG GCTCC TCCGG CTACG TGGTG ATGAC CCAGT CCCCC CTGTC CCTGC CCGTG ACCCC CGGCG A (SEQ ID NO: 17) hum 3D6 VL-A
4061 131 Nie CTGGG GGGAC TGGCC GGGCT TCTGC AGCAG CCAGT TCAGG TAGGT CTTGC CGTCG GAGTC CAGCA GGGAC TGGGA GGACT TGCAG GAGAT GGAGG CGGGC TCGCC GGGGG TCACG GGCAG GGACA GGGGG G (SEQ ID NO: 18) hum 3D6 VL-B
4062 146 Áno ACCTG AACTG GCTGC TGCAG AAGCC CGGCC AGTCC CCCCA GCGCC TGATC TACCT GGTGT CCAAG CTGGA CTCCG GCGTG CCCGA CCGCT TCTCC GGCTC CGGCT CCGGC ACCGA CTTCA CCCTG AAGAT CTCCC GCGTG GAGGC C (SEQ ID NO: 19) hum 3D6 VL-C
4063 142 Nie aattc tagga tccac tcacg CTTGA TCTCC ACCTT GGTGC CCTGG CCGAA GGTGC GGGGG AAGTG GGTGC CCTGC CAGCA GTAGT ACACG CCCAC GTCCT CGGCC TCCAC GCGGG AGATC TTCAG GGTGA AGTCT GTGCC GG (SEQ ID NO: 20) hum 3D6 VL-D
4064 16 Nie CTGGG GGGAC TGGCC G (SEQ ID NO: 21) hum 3D6 VL-A+B Dozadu %A+T =18,75 [3]; % C+G = 81,2 [13]
DNA č. Veľkosť Kódovanie ? Sekvencia Komentáre
Davis, Botstein, Roth Teplota topenia 66,96 °C
4065 22 Áno ACCTG AACTG GCTGC TGCAG AA (SEQ ID NO: 22) hum 3D6 VL-C+D Dopredu %A+T = 45,45 [10]; % C+G = 54,55(12] Davis, Botstein, Roth Teplota topenia 64,54 °C
4066 138 Áno acaga aagct tgccg ccacc ATGGA GTTTG GGCTG AGCTG GCTTT TTCTT GTGGC TATTT TAAAA GGTGT CCAGT GTGAG GTGCA GCTGC TGGAG TCCGG CGGCG GCCTG GTGCA GCCCG GCGGC TCCCT GCGCC TGT (SEQ ID NO: 23) hum 3D6 VH-A
4067 135 Nie GCCGC CGGAG CGGAT GGAGG CCACC CACTC CAGGC CCTTG CCGGG GGCCT GGCGC ACCCA GGACA TGCCG TAGTT GGAGA AGGTG AAGCC GGAGG CGGCG CAGGA CAGGC GCAGG GAGCC GCCGG GCTGC ACCAG (SEQ ID NO: 24) hum 3D6 VH-B
4068 142 Áno CTGGA GTGGG TGGCC TCCAT CCGCT CCGGC GGCGG CCGCA CCTAC TACTC CGACA ACGTG AAGGG CCGCT TCACC ATCTC CCGCG ACAAC GCCAA GAACT CCCTG TACCT GCAGA TGAAC TCCCT GCGCG CCGAG GACAC CG (SEQ ID NO: 25) hum 3D6 VH-C
4069 144 Nie ctgca aggat ccact caccG GAGGA CACGG TCACC AGGGT GCCCT GGCCC CAGTA GTCGG AGGAG CCGGA GTAGT GGTCG TAGCG CACGC AGTAG TACAG GGCGG TGTCC TCGGC GCGCA GGGAG TTCAT CTGCA GGTAC AGGG (SEQ ID NO: 26) hum 3D6 VH-D
4070 16 Nie GCCGC CGGAG CGGAT G (SEQ ID NO: 27) hum 3D6 VH-A+B Dozadu %A+T= 18,75 [3]; % C+G = 81,25 [13] Davis, Botstein, Roth Teplota topenia 66,96 °C
4071 20 Áno CTGGA GTGGG TGGCC TCCAT (SEQ ID NO: 28) hum 3D6 VH-C+D Dopredu % A+T = 35,00 [7]; % C+G = 65,00(13] Davis, Botstein, Roth Teplota topenia 66,55°C
4072 19 Áno tcc gca agc ttg ccg cca c (SEQ ID NO: 29) hum 3D6 VL-A+B Dopredu % A+T = 31,58 [6]; % C+G = 68,42 [13] Davis, Botstein, Roth Teplota topenia 66,64 °C
SK 288209 Β6
DNA č. Veľkosť Kódovanie ? Sekvencia Komentáre
4073 29 Nie aat tct agg atc cac tca cgC TTG ATC TC (SEQ ID NO: 30) hum 3D6 VL-C+D Dozadu % A+T = 55,17 [16]; % C+G = 44,83 [31] Davis, Botstein, Roth Teplota topenia 66,04 °C
4074 23 Áno aca gaa agc ttg ccg cca ccA TG (SEQ ID NO: 31) hum 3D6 VH-A+B Dopredu % A+T = 43,48 [10]; % C+G = 56,52 [13] Davis, Botstein, Roth Teplota topenia 66,33 °C
4075 22 Nie ctg caa gga tcc act cac cGG A (SEQ ID NO: 32) hum 3D6 VH-C+D Dozadu % A+T = 40,91 [9]; % C+G = 59,09 [13] Davis, Botstein, Roth Teplota topenia 66,40 °C
Humanizovaný ľahký reťazec sa poskladal pomocou PCR. Analýza DNA sekvencie viac než dvoch tuctov klonov odhalila rozptýlené bodové mutácie a delécie pozdĺž VL oblasti s ohľadom na očakávanú sekvenciu. Analýza sekvencii ukázala, že kloň 2.3 bol prístupný na opravu 2 priestorovo blízkych jednoduchých nukleotidových delécií v amino-koncovej oblasti. Preto sa vykonala lokálne orientovaná mutagenéza na klone pCRShum3D6vl2.3 pomocou oligonukleotidov, aby sa zaviedli 2 vynechané nukleotidy, a oprava bodových mutácií sa potvrdila analýzou DNA sekvencie, po čom sa VL inzert naklonoval do expresného vektora ľahkého reťazca pCMV-cK.
Zostrojenie humanizovaného VH pomocou metód založených na PCR viedlo ku klonom s veľkými deléciami v 5' polovici sekvencie. Ďalšie snahy optimalizovať PCR podmienky sa stretli s čiastočným úspechom. Klony zostrojené za optimalizovaných PCR podmienok mali stále 10 - 20 nt delécie v oblasti mapujúcej prekrytie A+B fragmentov. Použila sa preto alternatívna stratégia na zostrojenie VH využijúc metódu rozšírenia prekrytia sprostredkovaného DNA polymerázou (T4, Klenow a Sequenase), po čom nasledovala T4 DNA ligáza na kovalentné spojenie prekrývajúcich sa koncov. Analýza DNA sekvencie podskupiny klonov získaných zo zostrojeného VH pomocou tohto druhého postupu ukázala rozptýlené bodové mutácie a delécie medzi klonmi. Analýza viac než dvoch tuctov klonov ukázala v podstate rovnaký obraz, ako je ilustrované na týchto klonoch. Podobné výsledky, ktoré sa pozorovali po prvom pokuse o zostrojenie klonov VH a VL, naznačili, že pozorované chyby DNA sekvencie vznikli z chýb automatického syntezátora v priebehu syntézy dlhých DNA použitých na ich zostrojenie.
Humanizovaný VH kloň 2.7 sa vybral na opravu lokálne orientovanou mutagenézou 3 nukleotidových delécií, ktoré podľa pozorovania tento kloň obsahuje.
Príklad 8: Charakterizácia humanizovanej protilátky 3D6v2
Druhá verzia humanizovaného 3D6 sa vytvorila tak, že mala každú zo substitúcií naznačených pre verziu 1, okrem D—>Y substitúcie na zvyšku 1. Substitúcia na tomto zvyšku sa uskutočnila vo verzii 1, pretože zvyšok sa identifikoval ako zvyšok interagujúci s CDR. Substitúcia však odstránila zvyšok, ktorý bol zriedkavý pre ľudské imunoglobulíny v tejto polohe. Preto sa vytvorila verzia bez substitúcie. Okrem toho nezárodočné zvyšky v rámcových oblastiach ťažkého reťazca sa substituovali zárodočnými zvyškami, menovite H74 = S, H77 = T a H89 = V. Kabatovo číslovanie pre ľahký a ťažký reťazec verzie 2 je rovnaké, ako je použité v tabuľkách 13, resp. 14, s tou výnimkou, že zvyšok 1 verzie 2 ľahkého reťazca je asp (D), zvyšok 74 ťažkého reťazca je ser (S), zvyšok 77 ťažkého reťazca je thr (T) a zvyšok 89 ťažkého reťazca je val (V). Sekvencie nukleotidov ľahkého a ťažkého reťazca humanizovaného 3D6 verzie 1 sú uvedené ako SEQ ID NO: 34, resp. 36. Sekvencie nukleotidov ľahkého a ťažkého reťazca humanizovaného 3D6 verzie 2 sú uvedené ako SEQ ID NO: 35, resp. 37.
Príklad 9: Funkčné skúšky humanizovaných 3D6 protilátok
Väzba humanizovaného 3D6vl k agregovanému Αβ. Funkčné skúšanie humanizovaného 3D6vl sa vykonalo pomocou kondicionovaného média z dočasne transfektovaných COS buniek. Bunky sa transfektovali s plne chimérickou protilátkou, zmesou chimérický ťažký reťazec + humanizovaný ľahký reťazec alebo chimérický ľahký reťazec + humanizovaný ťažký reťazec, a napokon plne humanizovanou protilátkou. Kondicionované médium sa skúšalo na väzbu k agregovanému Αβ41 - 42 skúškou ELISA. Humanizovaná protilátka preukázala dobrú aktivitu v rámci experimentálnej chyby a prejavila väzbové vlastnosti nerozlíšiteľné od chimérickej 3D6 referenčnej vzorky. Výsledky sú uvedené v tabuľke 16.
Tabuľka 16:
ng/ml Chimérický hu VH/Ch VL Ch VH/Hu VL Hu VH/Hu VL
690 0,867
600 0,895
260 0,83
230 0,774
200 0,81
190 0,811
87 0,675
77 0,594
67 0,689
63 0,648
29 0,45
25 0,381
22 0,496
21 0,438
9,6 0,251
8,5 0,198
7,4 0,278
7 0,232
3,2 0,129
2,3 0,124
Na porovnanie väzbových afinít humanizovaných protilátok 3D6vl a 3D6v2 sa vykonala analýza ELISA s použitím agregovaného Αβ ako antigénu. Výsledky ukázali, že 3D6vl (H1L1) aj 3D6v2 (H2L2) mali temer identické väzbové vlastnosti (obrázok 5).
Replacement NET (rNET) analýza h3D6v2. Skúška na mapy epitopu rNET poskytuje informáciu o prí10 spevku individuálnych zvyškov v epitope k celkovej väzbovej aktivite protilátky. Analýza rNET používa syntetické, systematicky jednoducho substituované analógy peptidov. Väzba skúšanej protilátky sa stanoví oproti prirodzenému peptidu (prirodzený antigén) a oproti 19 alternatívnym jednoducho substituovaným peptidom, pričom každý peptid je substituovaný v prvej polohe jednou z 19 neprirodzených aminokyselín pre túto polohu. Vygeneruje sa profil odrážajúci účinok substitúcie v tejto polohe s rozličnými neprirodzenými zvyškami. Podobne sa vygenerujú profily v ďalších polohách pozdĺž peptidu antigénu. Kombinovaný profil alebo mapa epitopu (odrážajúca substitúciu v každej polohe všetkými 19 neprirodzenými zvyškami) sa potom môže porovnať s mapou generovanou podobným spôsobom pre druhú protilátku. V zásade podobné alebo identické mapy naznačujú, že porovnávané protilátky majú rovnakú alebo podobnú špecificitu epitopu.
Táto analýza sa vykonala pre 3D6 a humanizovaný 3D6, verziu 2. Protilátky sa skúšali na väzbu proti pri20 rodzenému Αβ peptidu DAEFRHDSGY (SEQ ID NO: 33). Zvyšky 1 - 8 sa systematicky substituovali každým z 19 neprirodzených zvyškov pre túto polohu. Podobne sa generovali mapy pre 3D6 a h3D6v2. Výsledky sú uvedené v tabuľkovej forme v tabuľke 17.
Tabuľka 17: Αβ: replacement Net Epitope (rNET) mapovanie wt3D6 a humanizovaného 3D6
Substitúcia Divoký typ 3D6 [OD] Humanizovaný 3D6 [OD] Substitúcia Divoký typ 3D6 [OD] Humanizovaný 3D6 [OD]
Zvyšok 1 =A 0,464 0,643 Zvyšok 5 = A 0,275 0,435
C 0,450 0,628 C 0,359 0,635
D 0,577 0,692 D 0,080 0,163
E 0,576 0,700 E 0,115 0,187
F 0,034 0,062 F 0,439 0,569
G 0,569 0,738 G 0,485 0,679
H 0,054 0,117 H 0,577 0,680
I 0,048 0,118 I 0,510 0,671
K 0,033 0,057 K 0,573 0,693
L 0,073 0,148 L 0,517 0,691
M 0,039 0,072 M 0,418 0,611
N 0,587 0,757 N 0,476 0,655
SK 288209 Β6
Substitúcia Divoký typ 3D6 [OD] Humanizovaný 3D6 [OD] Substitúcia Divoký typ 3D6 [OD] Humanizovaný 3D6 [OD]
P 0,069 0,144 P 0,093 0,198
Q 0,441 0,689 Q 0,388 0,565
R 0,056 0,155 R 0,613 0,702
S 0,569 0,762 S 0,487 0,633
T 0,450 0,702 T 0,530 0,639
v 0,057 0,190 V 0,493 0,562
w 0,031 0,070 w 0,393 0,461
Y 0,341 0,498 Y 0,278 0,230
Zvyšok 2 = A 0,548 0,698 Zvyšok 6 = A 0,587 0,707
C 0,553 0,694 C 0,585 0,703
D 0,119 0,222 D 0,584 0,701
E 0,563 0,702 E 0,579 0,702
F 0,577 0,717 F 0,586 0,704
G 0,527 0,720 G 0,592 0,709
H 0,534 0,741 H 0,596 0,688
I 0,522 0,722 I 0,602 0,708
K 0,548 0,722 K 0,585 0,691
L 0,482 0,705 L 0,584 0,688
M 0,535 0,705 M 0,583 0,687
N 0,525 0,735 N 0,580 0,686
P 0,445 0,707 P 0,587 0,705
Q 0,567 0,756 Q 0,570 0,695
R 0,562 0,719 R 0,576 0,686
S 0,587 0,705 S 0,573 0,689
T 0,552 0,712 T 0,573 0,700
v 0,550 0,702 V 0,588 0,715
w 0,553 0,701 w 0,576 0,696
Y 0,547 0,704 Y 0,595 0,708
Zvyšok 3=A 0,038 0,061 Zvyšok 7 = A 0,580 0,688
C 0,222 0,410 C 0,559 0,676
D 0,019 0,027 D 0,573 0,681
E 0,542 0,689 E 0,565 0,677
F 0,034 0,060 F 0,546 0,668
G 0,016 0,019 G 0,562 0,679
H 0,016 0,020 H 0,557 0,675
I 0,019 0,024 I 0,552 0,681
K 0,053 0,090 K 0,565 0,685
L 0,019 0,026 L 0,566 0,701
M 0,019 0,027 M 0,562 0,697
N 0,024 0,032 N 0,573 0,688
P 0,017 0,020 P 0,582 0,678
Q 0,153 0,406 Q 0,563 0,679
R 0,015 0,023 R 0,551 0,677
S 0,016 0,021 S 0,563 0,674
T 0,015 0,019 T 0,560 0,685
V 0,016 0,021 v 0,563 0,687
w 0,149 0,304 w 0,547 0,685
Y 0,016 0,020 Y 0,560 0,682
Zvyšok 4 = A 0,016 0,020 Zvyšok 8 = A 0,573 0,687
C 0,020 0,023 C 0,583 0,700
D 0,017 0,020 D 0,586 0,697
E 0,016 0,021 E 0,601 0,701
F 0,557 0,703 F 0,586 0,687
SK 288209 Β6
Substitúcia Divoký typ 3D6 [OD] Humanizovaný 3D6 [OD] Substitúcia Divoký typ 3D6 [OD] Humanizovaný 3D6 [OD]
G H I K L M N P Q R S T v w Y 0,016 0,470 0,119 0,015 0,559 0,549 0,085 0,030 0,065 0,016 0,026 0,016 0,213 0,291 0,529 0,020 0,723 0,360 0,018 0,716 0,725 0,089 0,056 0,110 0,019 0,031 0,021 0,494 0,568 0,730 G 0,569 0,681
H 0,559 0,683
I 0,568 0,686
K 0,557 0,698
L 0,570 0,686
M 0,571 0,693
N 0,573 0,700
P 0,574 0,694
Q 0,590 0,703
R 0,589 0,699
S 0,599 0,719
T 0,586 0,689
v 0,578 0,688
w 0,567 0,687
Y 0,574 0,680
Je pozoruhodné, že profily sú prakticky identické pre 3D6 a h3D6v2, keď sa pozeráme na substitúcie vo všetkých polohách (t. j. hodnoty sa menia identickým spôsobom, keď sa porovnajú údaje v stĺpci 1 (3D6) so stĺpcom 2 (h3D6v2)). Tieto údaje ukazujú, že špecifická h3D6v2 sa zachováva, pretože mapa epitopu h3D6v2 rNET je prakticky identická s m3D6, ak sa použijú zvyšky Αβ 1 - 4 aj 5 - 8.
Imunohistochémia PDAPP mozgových rezov ukazuje špecifickú protilátky h3D6vl. Humanizovaná 3D6vl protilátka spozná Αβ v kryostaticky pripravených mozgových rezoch z PDAPP myší. Humanizovaný 3D6vl aj PK1614 sa viažu na PDAPP plaky s tým istým spôsobom odozvy na dávku, ako sa odmeralo množstvom fluorescencie (kvantifikovaného v pixeloch) na snímku oproti množstvu protilátky použitému na farbenie tkaniva (obrázok 6). V tomto experimente sa použili identické anti-humánne sekundárne protilátky. Príprava rezov, farbenie a príprava obrazov sa už skôr opísali. Analýza obrazov h3D6v2 farbenia na rezoch PDAPP a AD mozgov v identických experimentoch ukázali, že h3D6v2 spozná Αβ plaky podobným spôsobom ako 3D6vl (napr. silne zasiahnuté plaky).
Kompetičná väzbová analýza h3D6. Schopnosť h3D6 protilátok vl a v2 súperiť s myším 3D6 sa merala metódou ELISA pomocou biotinylovanej 3D6 protilátky. Kompetičná väzbová analýza zistila, že h3D6vl, h3D6v2 a chimérický PK1614 môžu súperiť s m3D6 vo väzbe s Αβ (obrázok 7). h3D6vl a h3D6v2 boli identické v schopnosti súperiť s 3D6 voči Αβ. Protilátka 10D5 sa použila ako negatívna kontrola, pretože má odlišný väzbový epitop než 3D6. Analýza BIAcore tiež ukázala vysokú afinitu h3D6vl a h3D6v2 pre Αβ (tabuľka 18).
Tabuľka 18: Merania afinít Αβ protilátok pomocou BIAcore technológie
Protilátka kal (1/Ms) kdl (1/s) Kd (nM)
Mu3D6 4,06E + 05 3,57E - 04 0,88
Chimérický 3D6 4,58E + 05 3,86E - 04 0,84
Hu 3D6vl 1.85E + 05 3,82E - 04 2,06
Hu 3D6v2 1.70E + 05 3,78E - 04 2,24
V porovnaní s 3D6, ktorý má Kd 0,88 nM, h3D6vl aj h3D6v2 mali asi 2-krát až 3-krát menšiu väzbovú afinitu, nameranú ako 2,06 nM a 2,24 nM pre h3D6vl, resp. h3D6v2. Kompetičná väzbová skúška ELISA ukázala približne 6-krát nižšiu väzbovú afinitu pre h3D6vl a h3D6v2. Humanizované protilátky obvykle strácajú asi 3- až 4-násobok väzbovej afinity v porovnaní k ich myším náprotivkom. Asi trojnásobný úbytok (priemer výsledkov ELISA a BIAcore) pre h3D6vl a h3D6v2 je teda v uznávanom rozmedzí.
Skúška ex vivo pomocou h3D6v2 protilátky. Schopnosť h3D6v2 stimulovať mikrogliálne bunky sa skúšala pomocou fagocytóznej skúšky ex vivo (obrázok 8). h3D6v2 bol rovnako účinný ako chimérický 3D6 pri indukcii fagocytózy agregátov Αβ z mozgového tkaniva PDAPP myší. Ako negatívna kontrola sa v tomto experimente použil IgG, pretože nie je schopný viazať sa na Αβ, a preto nemôže vyvolať fagocytózu.
Mozgová lokalizácia h3D6 in vivo. Každá z nasledujúcich protilátok, 125I značkované h3D6v2, m3D6 a protilátka DAE13, sa intravenózne podali 14 individuálnym PDAPP myšiam v samostatných experimentoch. Myši sa utratili po 7 dňoch a per fundovali sa pre ďalšiu analýzu. Oblasti ich mozgov sa rozobrali a merali na aktivitu l25I v špecifických oblastiach mozgu. Aktivita rádioaktívnej značky v mozgu sa porovnala s aktivitou vo vzorkách séra. Výsledky pre sérum, resp. pre oblasti mozgu sú uvedené v tabuľkách 19 a 20.
Tabuľka 19
m3D6 DAE13 Hu3D6
30389,1 17463,9 40963,8
12171 13200,6 24202,2
3418,2 36284,7 12472,4
18678,9 421,3 33851,8
27241 19702 27187,3
26398,8 24855,8 29016,9
27924,8 29287,4 33830,7
12008,4 12733,1 26734,9
29487,8 27722,5 30144,5
25498,6 30460,7 35126,9
9652 23320,1 28414,8
24599,3 7119,1 16956,1
29240 28093,5 18190,7
11922,7 17443,1 24659,7 26748,9 25671,4
Tabuľka 20
m3D6 DAE13 Hu3D6 (H2L2)
cereb kort hipok cereb kort hipok cereb kort hipok
1991,9 1201,1 4024 1277,5 2522,9 5711,9 2424,6 3759,4 11622
238,9 746,1 2523 502,5 2123,5 6965,8 1509,8 2274,9 7018,2
645,9 603 1241,1 2325 3528,2 7801,6 500 2265,9 5316,3
1000 2508,2 4644,2 232,7 849,8 1891,9 2736,2 5703,7 10395,5
1266,9 3737,9 7975,8 891,6 2621 8245,2 1192,2 3188 10170
1422 2398,7 7731,1 1102,6 2087,5 7292,3 2269,4 3481,4 9621,6
1700,4 2154,4 7124,1 1650,6 3488,4 10284,8 1526,7 3028 8331,3
542,5 812,4 2456,8 712,9 2318,5 6643,3 1538,1 4194,1 11244,8
1309 3010,5 8693,5 1172,9 1953,6 7363 1245,7 1699,4 6831,2
1372,2 997,5 2425,4 1067,9 3697,2 12280,7 2708,8 2789 7887,4
778,6 1291,9 5654,4 1952,2 2120,7 6412,7 2251,3 3897,5 11121,5
1199,3 1683,4 4887,3 1005,2 1852,5 5121,4 1529,6 1772,2 7986,9
1021,8 3234,5 8036,2 961,5 3382,9 8473,1 644,1 1663,4 5056,5
742,1 1273,7 1056.7 1320.8 3405,2 4262,6 852,3 997,5 1943,2 3065,7 6717,4 10213,1 1516,4 1620,6 9888
Údaje ukazujú, že h3D6v2 sa zhromažďuje v mozgu a zvlášť bola koncentrovaná v hipokampálnej oblasti, o ktorej je známe, že sa v nej zhlukuje Αβ. Počty impulzov v mozgu pre m3D6 a DAE13 boli porovnateľné s h3D6v2. Všetky tri protilátky boli schopné prekonávať hematoencefalitickú bariéru, ako je to vidieť z väzby na Αβ plaky in vivo.
Príklad X. Klonovanie a sekvenovanie myších 10D5 variabilných oblastí
Klonovanie a analýza sekvencie 10D5 VH. Oblasti VH a VL 10D5 z hybridómových buniek sa klonovali
RT-PCR pomocou 5'RACE postupov. Sekvencia nukleotidov (SEQ ID NO: 13) a vydedukovaná sekvencia aminokyselín (SEQ ID NO: 14) odvodená z dvoch nezávislých klonov cDNA kódujúcich predpokladanú 10D5 VL doménu sú uvedené v tabuľke 21 a na obrázku 9. Sekvencia nukleotidov (SEQ ID NO: 15) a vyde15 dukovaná sekvencia aminokyselín (SEQ ID NO: 16) odvodená z dvoch nezávislých klonov cDNA kódujúcich predpokladanú 10D5 VH doménu sú uvedené v tabuľke 22 a na obrázku 10. Sekvencie 10D5 VL a VH spĺňajú kritériá pre funkčné V-oblasti do takej miery, že obsahujú spojitý ORF z iniciátorového metionínu k C-oblasti a majú rovnaké konzervatívne zvyšky charakteristické pre gén V-oblasti imunoglobulínu.
Tabuľka 21: Sekvencia myšej 10D5 VL DNA
ATGAAGTTGCCTGTTAGGCTGTTGGTACTGATGTTCTGGATTCCTGCTTCCAGCAGTGA
TGTTTTGATGACCCAAACTCCACTCTCCCTGCCTGTCAGTCTTGGAGATCAAGCCTCCA
TCTCTTGCAGATCTAGTCAGAACATTATACATAGTAATGGAAACACCTATTTAGAATGG
TACCTGCAGAAACCAGGCCAGTCTCCAAAGCTCCTGATCTACAAAGTTTCCAACCGATT
TTCTGGGGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTCAAGA CCGCTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGGAA (SEQ ID NO: 13) *Líder peptid je podčiarknutý
SK 288209 Β6
Tabuľka 22: Sekvencia myšej 10D5 VH DNA
ATGGACAGGCTTACTTCCTCATTCCTGCTGCTGATTGTCCCTGCATATGTCCTGTCCCA
GGCTACTCTGAAAGAGTCTGGCCCTGGAATATTGCAGTCCTCCCAGACCCTCAGTCTGA
CTTGTTCTTTCTCTGGGTTTTCACTGAGCACTTCTGGTATGGGAGTGAGCTGGATTCGT
CAGCCTTCAGGAAAGGGTCTGGAGTGGCTGGCACACATTTACTGGGATGATGACAAGCG
CTATAACCCATCCCTGAAGAGCCGGCTCACAATCTCCAAGGATACCTCCAGAAAGCAGG
TATTCCTCAAGATCACCAGTGTGGACCCTGCAGATACTGCCACATACTACTGTGTTCGA
AGGCCCATTACTCCGGTACTAGTCGATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGT
CACCGTCTCCTCA (SEQ ID NO: 15) *Líder peptid je podčiarknutý
Príklad XI. Prevencia a liečba ľudských pacientov
Na určenie bezpečnosti u ľudí sa uskutočnila fáza I skúšky s jednou dávkou. Terapeutické činidlo sa podáva pri zvyšujúcom sa dávkovaní rozličným pacientom vychádzajúc asi z 0,01-násobku hladiny očakávanej účinnosti a zvyšuje sa po trojnásobkoch, až kým sa dosiahne asi 10-násobok účinnej hladiny pre myši.
Na určenie terapeutickej účinnosti sa vykoná fáza II skúšky. Vyberú sa pacienti v počiatočnom alebo v miernom štádiu Alzheimerovej choroby definovanom kritériami Asociácie pre Alzheimerovu chorobu a pre príbuzné ochorenia (ADRDA) pre pravdepodobnú AD. Vhodní pacienti dosahujú skóre v rozmedzí 12 - 26 v mini-mentálnej štátnej skúške (MMSE). Ďalšie výberové kritériá sú, že pacient pravdepodobne nezomrie do skončenia skúšky a že nie sú prítomné komplikujúce problémy, ako je sprievodná liečba, ktorá môže interferovať. Vyhodnotenie základnej línie funkcií pacienta sa robí pomocou klasických psychometrických mier, ako sú MMSE a ADAS, ktorá je úplnou stupnicou na vyhodnotenie pacientov so stavom a funkčnosťou Alzheimerovej choroby. Tieto psychometrické stupnice sú meradlom progresie Alzheimerovho stavu. Na sledovanie liečby sa môžu tiež použiť vhodné miery kvality života. Progresia choroby sa môže tiež sledovať pomocou MRI. Môžu sa tiež sledovať krvné profily pacientov pomocou skúšok protilátok špecifických na imunogén alebo odozvami T-buniek.
Po meraniach základnej línie začnú pacienti dostávať liečbu. Sú náhodne rozdelení a liečení buď terapeutickým činidlom, alebo placebom v slepom pokuse. Pacienti sa sledujú zakaždým aspoň šesť mesiacov. Účinnosť sa stanoví ako významné spomalenie progresie v liečenej skupine v porovnaní so skupinou liečenou placebom.
V druhej skúške fázy II sa vyhodnotí konverzia pacientov z počiatočného štádia straty pamäti iného typu ako Alzheimerova choroba, ktorá sa niekedy označuje ako porucha pamäti súvisiaca s vekom (AAMI), alebo mierna kognitívna porucha (MCI), na pravdepodobnú Alzheimerovu chorobu, ako je definovaná kritériami ADRDA. Pacienti s vysokým rizikom konverzie na Alzheimerovu chorobu sa vyberú z neklinickej populácie pomocou skríningu referenčných populácií na počiatočné znaky straty pamäti alebo iné ťažkosti spojené s predalzheimerovskou symptomatológiou, rodinnou históriou Alzheimerovej choroby, genetickými rizikovými faktormi, vekom, pohlavím a inými znakmi, o ktorých sa zistilo, že predikujú vysoké riziko vzniku Alzheimerovej choroby. Vyhodnotí sa skóre základnej línie vhodných parametrov, ako sú MMSE a ADAS, spolu s inými parametrami navrhnutými na vyhodnotenie bežnejšej populácie. Tieto populácie pacientov sa rozdelia do vhodných skupín, v ktorých sa porovnáva placebo s rozličnými možnosťami dávkovania liečiva. Tieto populácie pacientov sa sledujú v intervaloch asi šesť mesiacov a konečný výsledok pre každého pacienta je údaj, či konvertuje na konci pozorovania na pravdepodobnú Alzheimerovu chorobu, ako je definovaná kritériami ADRDA.
Všeobecné materiály a metódy
A. Príprava polyklonálnych a monoklonálnych Αβ protilátok
Anti-Αβ polyklonálna protilátka sa pripravila z krvi odobratej z dvoch skupín zvierat. Prvú skupinu tvorilo 100 samičích myší Swiss Webster vo veku 6 až 8 týždňov. V nultý, 15. a 29. deň boli imunizované 100 pg ANI 1792 kombinovaného s CFA/IFA. Štvrtú injekciu dostali 36. deň s polovičnou dávkou AN1792. Pri utratení v 42. deň sa zvieratá nechali vykrvácať, pripravilo sa sérum a séra sa spojili, čím sa ho získalo celkove 64 ml. V druhej skupine bolo 24 samičích myší izogenických z PDAPP myšami, ale nie transgenických pre ľudský APP gén, starých 6 až 9 týždňov. Imunizovali sa v nultý, 14., 28. a 56. deň 100 pg AN1792 kombinovaného s CFA/IFA. Tieto zvieratá sa tiež nechali vykrvácať pri utratení na 63. deň, pripravilo sa sérum a spojením sa získalo 14 ml séra. Tieto dve dávky séra sa spojili. Protilátková frakcia sa prečistila postupne dvoma zrážacími cyklami 50 % nasýteným roztokom síranu amónneho. Výsledná zrazenina sa dialyzovala oproti PBS a skúšala sa na endotoxín. Hladina endotoxínu bola menšia než 1 EU/mg.
Anti-Αβ monoklonálne protilátky sa pripravili z tekutiny ascitu. Tekutina sa najprv zbavila lipidov pridaním koncentrovaného dextránsulfátu sodného k ľadovej tekutine ascitu pri miešaní v ľade, kým sa dosiahla konečná koncentrácia 0,238 %. Potom sa pridával za miešania koncentrovaný CaCl2, až sa dosiahla konečná koncentrácia 64 mM. Tento roztok sa odstredil pri 10 000 x g a peleta sa odstránila. Supernatant sa miešal na
SK 288209 Β6 ľade s rovnakým objemom nasýteného síranu amónneho pridávaného po kvapkách. Roztok sa znova odstredil pri 10 000 x g a supernatant sa odstránil. Peleta sa resuspendovala a dialyzovala sa proti 20 mM Tris-HCl, 0,4 M NaCI pri pH 7,5. Táto frakcia sa naniesla na stĺpec Pharmacia FPLC Sepharose Q a eluovala sa s reverzným gradientom od 0,4 M do 0,275 M NaCI v 20 mM Tris-HCl pri pH 7,5. Pík protilátky sa identifikoval absorbanciou pri 280 nm a vhodné frakcie sa spojili. Prečistený preparát protilátky sa charakterizoval meraním koncentrácie proteínu pomocou metódy BCA a čistota pomocou SDS-PAGE. Zásobný roztok sa tiež skúšal na endotoxin. Hladina endotoxínu bola menšia než 1 EU/mg. Titrom menším než 100 sa na základe dohody priradila hodnota titra 25.
B. Meranie titrov protilátky
Myšiam sa odobrala krv pomocou malého zárezu na chvostovej žile a do mikroodstredivkovej kyvety sa zachytilo asi 200 μΐ krvi. Morčatám sa odobrala krv tak, že sa najprv oholili na zadnej časti päty a potom pomocou ihly č. 18 sa prepichla metatarzálna žila a odobrala sa krv do mikroodstredivkovej kyvety. Krv sa nechala zrážať jednu hodinu pri teplote miestnosti (RT), premiešala sa, a potom sa odstred’ovala 10 minút pri 14 000 x g, aby sa oddelila zrazenina od séra. Sérum sa potom prenieslo do čistej mikroodstredivkovej kyvety a skladovalo sa pri 4 °C, kým sa netitrovalo.
Titre protilátky sa merali metódou ELISA. Na 96-jamkové mikrotitrovacie misky (misky Costar EIA) sa nanieslo 100 μΐ roztoku obsahujúceho buď 10 μg/ml Αβ42 alebo SAPP alebo iných antigénov, ako je to uvedené v každej z príslušných správ, a udržiavali sa pri RT cez noc. Jamky sa odsali a do jamiek sa pridali séra začínajúc pri zriedení 1/100 vo vzorkovom riedidle (Specimen Diluent) (0,014 M fosforečnan sodný, pH 7,4, 0,15 M NaCI, 0,6 % hovädzieho sérového albumínu, 0,05 % timerosalu). Sedem sérií zriedení vzorky sa pripravilo priamo v miskách v troch krokoch, aby sa dosiahlo konečné zriedenie 1/218700. Zriedené roztoky sa inkubovali v jamkách pokrytej misky jednu hodinu pri RT. Misky sa potom opláchli štyrikrát PBS obsahujúcim 0,05 % Tween 20. K jamkám sa pridala druhá protilátka, kozí anti-myší Ig konjugovaný s chrenovou peroxidázou (získaný od firmy Boehringer Mannheim), ako 100 μΐ roztoku v zriedení 1/3000 vo vzorkovom riedidle a inkuboval sa jednu hodinu pri RT. Misky sa opäť opláchli štyrikrát PBS s Tween 20. Na vyvolanie chromogénu sa do každej jamky pridalo 100 μΐ Slow TMB (3,3',5,5'-tetrametylbenzidínu získaného od firmy Pierce Chemicals) a inkubovali sa 15 minút pri RT. Reakcia sa zastavila prídavkom 25 μΐ 2M H2SO4. Farebná intenzita sa potom odčítala na Molecular Devices Vmax pri (450 nm - 650 nm).
Titre boli definované ako prevrátená hodnota zriedenia séra, ktorá poskytla polovicu maxima OD. Maximálne OD sa väčšinou získalo z východiskového zriedenia 1/100, okrem prípadov s veľmi vysokými titrami, v ktorých bolo potrebné vyššie východiskové zriedenie na dosiahnutie maximálneho OD. Ak 50 % bod padol medzi dve zriedenia, na výpočet konečného titra sa urobila lineárna extrapolácia. Pri výpočte geometrického priemeru titrov protilátky sa titrom menším než 100 na základe dohody priradila hodnota titra 25.
C. Príprava mozgového tkaniva
Po eutanázii sa mozgy vybrali a jedna hemisféra sa pripravila na imunohistochemickú analýzu, kým z druhej hemisféry sa oddelili tri oblasti mozgu (hipokampus, kortex a cerebellum) a použili sa na meranie koncentrácie rozličných Αβ proteínov a APP foriem pomocou špecifických metód ELISA (Johnson-Wood a kol., pozri vyššie).
Tkanivá určené na ELISA sa homogenizovali v 10 objemoch ľadového guanidínového tlmivého roztoku (5,0 M guanidín-HCl, 50 mM Tris-Hcl, pH 8,0). Homogenáty sa mierne miešali tri až štyri hodiny pri RT na Adamsovom nutátore (Fischer) a pred kvantifikáciou Αβ a APP sa uchovávali pri -20 °C. Prechádzajúce experimenty ukázali, že pri týchto podmienkach uchovávania boli analyty stabilné a že syntetický Αβ proteín (Bachem) sa dal kvantitatívne získať, keď sa napichal do homogenátu kontrolného mozgového tkaniva z myší toho istého vrhu (Johnson-Wood a kol., pozri vyššie).
D. Meranie hladín Αβ
Mozgové homogenáty sa zriedili 1 : 10 s ľadovým kazeínovým riedidlom (Casein Diluent) (0,25 % kazeínu, PBS, 0,05 % azidu sodného, 20 pg/ml aprotinínu, 5 mM EDTA pH 8,0, 10 pg/ml leupeptínu) a odstreďovali sa 20 min. pri 16 000 x g a pri 4 °C. Pripravili sa štandardy Αβ proteínu (aminokyseliny 1 - 42) a APP štandardy, pričom výsledná zmes obsahovala 0,5 M guanidín a 0,1 % hovädzieho sérového albumínu (BSA). Sendvičová ELISA na celkový Αβ využíva monoklonálnu protilátku 266 špecifickú na aminokyseliny Αβ 13-28 (Seubert a kol., pozri vyššie) ako záchytnú protilátku, a biotinylovanú monoklonálnu protilátku 3D6 špecifickú na aminokyseliny Αβ 1 - 5 (Johnson-Wood a kol., pozri vyššie) ako reportérsku protilátku. Monoklonálna protilátka 3D6 nespoznala vylučovaný APP alebo APP úplnej dĺžky, ale detegovala len typy Αβ s amino-koncovou kyselinou asparágovou. Táto skúška mala dolnú hranicu citlivosti ~50 ng/ml (11 nM) a nepreukázala žiadnu krížovú reaktivitu k endogénnemu myšiemu Αβ proteínu pri koncentráciách až do 1 ng/ml (Johnson-Wood a kol., pozri vyššie).
Sendvičová ELISA špecifická na Αβί - 42 používa ako záchytnú protilátku ιηΑβ 21F12, ktorý je špeci51
SK 288209 Β6 fický na aminokyseliny Αβ 33 - 42 (Johnson-Wood a kol., pozri vyššie). V tejto skúške je tiež reportérska protilátka biotinylovaný ιηΑβ 3D6, ktorý má dolnú hranicu citlivosti asi 125 pg/ml (28 μΜ, Johnson-Wood a kol., pozri vyššie). Na Αβ ELISY sa 100 pl buď ηχΑβ 266 (s koncentráciou 10 pg/ml) alebo πιΑβ 21F12 (s koncentráciou 5 pg/ml) nanieslo do jamiek 96-jamkových imunoskúšobných misiek (Costar) inkubáciou cez noc pri RT. Roztoky sa odstránili odsatím a jamky sa zablokovali aspoň na 1 hodinu pri RT prídavkom 200 pl 0,25 % ľudského sérového albumínu v tlmivom roztoku PBS. Blokujúci roztok sa odstránil a misky sa pred použitím uchovávali vysušené pri 4 °C. Misky sa pred použitím rehydrovali vlhčiacim tlmivým roztokom (Wash Buffer) [Soľný roztok tlmený Tris (0,15 M NaCl, 0,01 M Tris-HCl, pH 7,5) plus 0,05 % Tween 20]. Pridali sa vzorky a štandardy v troch alikvotných dávkach po 100 pl na jamku a inkubovali sa cez noc pri 4 °C. Po každom kroku skúšky sa misky opláchli aspoň trikrát vlhčiacim tlmivým roztokom. Pridal sa biotinylovaný ιηΑβ 3D6 zriedený na 0,5 pg/ml v kazeínovom skúšobnom tlmivom roztoku (Casein Assay Buffer) (0,25 % kazeínu, PBS, 0,05 % Tween 20, pH 7,4) a inkuboval sa v jamkách 1 hodinu pri RT. Pridal sa konjugát avidínchrenová peroxidáza (Avidín-HPR sa získal od firmy Vector, Burlingame, CA) zriedený v pomere 1 : 4000 v kazeínovom skúšobnom tlmivom roztoku a nechal sa reagovať 15 minút pri RT, po čom sa enzymatická reakcia zastavila pridaním 25 pl 2N H2SO4. Reakčný produkt sa kvantifikoval pomocou Molecular Devices Vmax merajúcim rozdiel absorbancii pri 450 nm a 650 nm.
E. Meranie hladín APP
Použili sa dve rozdielne skúšky na APP. Prvá, označená ako ΑΡΡ-α/FL, spoznáva APP-alfa (a) formu APP aj APP s úplnou dĺžkou. Druhá skúška je špecifická na APP-α. Skúška ΑΡΡ-α/FL spozná vylučovaný APP obsahujúci prvých 12 aminokyselín Αβ. Pretože reportérska protilátka (2H3) nie je špecifická na miesto α-pripojenia nachádzajúce sa medzi aminokyselinami 612 - 613 APP695 (Esch a kol., Science 248: 1122 až 1124 (1990)), táto skúška tiež spozná APP úplnej dĺžky (APP-FL). Predbežné experimenty, ktoré využívajú imobilizované APP protilátky k cytoplazmatickému chvostu APP-FL na odstránenie APP-FL z mozgových homogenátov, naznačujú, že približne 30 - 40 % ΑΡΡ-α/FL APP je FL (údaje tu nie sú uvedené). Záchytná protilátka na skúšky ΑΡΡ-α/FL aj na APP-α je πιΑβ 8E5 vytvorená proti aminokyselinám 444 až 592 APP695 formy (Games a kol., pozri vyššie). Reportérska mAb pre skúšku na ΑΡΡ-α/FL je mAb 2H3 špecifická na aminokyseliny 597 - 608 APP695 (Johnson-Wood a kol., pozri vyššie) a reportérska protilátka pre skúšku na APP-α je biotinylovaný derivát mAb 16H9 vytvorený k aminokyselinám 605 až 611 APP. Dolná hranica citlivosti skúšky na ΑΡΡ-α/FL je asi 11 ng/ml (150 pM) (Johnson-Wood a kol.) a dolná hranica pre APP-α špecifickú skúšku je 22 ng/ml (0,3 nM). Na obidve APP skúšky sa naniesol do jamiek 96-jamkových EIA misiek mAb 8E5, ako je to opísané pre mAb 266. Ako referenčný štandard pre APP-α skúšku a pre ΑΡΡ-α/FL skúšku sa použil prečistený rekombinantný, sekréciou získaný APP-α (Esch a kol., pozri vyššie). Vzorky mozgového homogenátu v 5 M guanidíne sa zriedili v pomere 1 : 10 v vzorkovom riedidle ELISA (ELISA Specimen Diluent) (0,014 M fosfátový tlmivý roztok, pH 7,4, 0,6 % hovädzieho sérového albumínu, 0,05 % timerosalu, 0,5 M NaCl, 0,1 % NP40). Potom sa zriedili v pomere 1 : 4 vo vzorkovom riedidle obsahujúcom 0,5 M guanidín. Zriedené homogenáty sa odstreďovali 15 sekúnd pri 16 000 x g a pri RT. Na misku sa pridali APP štandardy a vzorky v dvoch alikvotných dávkach a inkubovali sa 1,5 hodiny pri RT. Biotinylovaná reportérska protilátka 2H3 alebo 16H9 sa inkubovala so vzorkami 1 hodinu pri RT. Streptavidín-alkalická fosfatáza (Boehringer Mannheim) zriedená v pomere 1 : 1000 vo vzorkovom riedidle sa inkubovala 1 hodinu v jamkách pri RT. Pridal sa fluorescenčný substrát 4-metyl-umbelliferylfosfát na 30-minútovú inkubáciu a misky sa odčítali na fluorimetri Cytofluor tm 2350 (Millipore) pri 365 nm excitácii a 450 nm emisii.
F. Imunohistochémia
Mozgy sa fixovali 3 dni pri 40 °C v 4 % paraformaldehyde v PBS a do rozdeľovania sa uchovávali jeden až sedem dní pri 4 °C v 1 % paraformaldehyde v PBS. Na vibratóme sa narezali 40 mikrometrov hrubé rezy a pred imunohistochemickým spracovaním sa uchovávali v kryoprotektante (30 % glycerolu, 30 % etylénglykolu vo fosfátovom tlmivom roztoku) pri 20 °C. Z každého mozgu sa inkubovalo cez noc šesť rezov na úrovni dorzálneho hipokampu získaných vo vzdialenostiach 240 nm od seba s nasledujúcimi protilátkami: (1) biotinylovaný anti-Αβ (mAb, 3D6, špecifický na ľudský Αβ) zriedený na koncentráciu 2 pg/ml v PBS a 1 % konskom sére; alebo (2) biotinylovaný mAb špecifický na ľudský APP, 8E5, zriedený na koncentráciu 3 pg/ml v PBS a 1,0 % konskom sére; alebo (3) mAb špecifický na gliálny fibrilámy acidický protein (GFAP; Sigma Chemical Co.) zriedený v pomere 1 : 500 0,25 % Tritonom X-100 a 1 % konským sérom v soľnom roztoku tlmenom Tris, pH 7,4 (TBS); alebo (4) mAb špecifický na CD1 lb, MAC-1 antigén (Chemicon International) zriedený v pomere 1 : 100 0,25 % Tritonom X-100 a 1 % králičím sérom v TBS; alebo (5) mAb špecifický pre MHC II antigén (Pharmingen) zriedený v pomere 1 : 100 0,25 % Tritonom X-100 a 1 % králičím sérom v TBS; alebo (6) potkaní mAb špecifický na CD 43 (Pharmingen) zriedený v pomere 1 : 100 1 % králičím sérom v PBS; alebo (7) potkaní mAb špecifický na CD 45RA (Pharmingen) zriedený v pomere 1 : 100 1 % králičím sérom v PBS; alebo (8) potkaní monoklonálny Αβ špecifický na CD 45RB (Pharmingen) zriedený v pomere 1 : 100 1 % králičím sérom v PBS; alebo (9) potkaní monoklonálny Αβ špecifický na
SK 288209 Β6
CD 45 (Pharmingen) zriedený v pomere 1 : 100 1 % králičím sérom v PBS; alebo (10) biotinylovaný polyklonálny škrečí Αβ špecifický na CD3e (Pharmingen) zriedený v pomere 1 : 100 1 % králičím sérom v PBS; alebo (11) potkaní mAb špecifický na CD3 (Serotec) zriedený v pomere 1 : 200 1 % králičím sérom v PBS; alebo (12) s roztokom PBS bez primárnej protilátky obsahujúcim 1 % normálneho konského séra.
Na rezy pre reakciu s roztokmi protilátok uvedenými pod bodmi 1,2 a 6 až 12 vyššie sa pôsobilo 20 minút pri RT 1,0 % Tritonom X-100, 0,4 % hydrogénperoxidom v PBS, aby sa zablokovala endogénna peroxidáza. Potom sa inkubovali cez noc pri 4 °C s primárnou protilátkou. Rezy zreagované s 3D6 alebo 8E5 mAb sa potom nechali reagovať jednu hodinu pri RT s komplexom chrenová peroxidáza-avidín-biotín s komponentmi A a B súpravy zriedenými v pomere 1 : 75 v PBS (Vector Elite Standard Kit, Vector Labs, Burlingame, CA). Rezy zreagované s protilátkami špecifickými na CD 45RA, CD 45RB, CD 45, CD3 a roztok PBS bez primárnej protilátky sa inkubovali 1 hodinu pri RT s biotinylovaným anti-potkaním IgG (Vector) zriedeným v pomere 1 : 75 v PBS alebo s biotinylovaným anti-myším IgG (Vector) zriedeným v pomere 1 : 75 v PBS. Rezy sa potom nechali reagovať jednu hodinu pri RT s komplexom chrenová peroxidáza-avidín-biotín s komponentmi A a B súpravy zriedenými v pomere 1 : 75 v PBS (Vector Elite Standard Kit, Vector Labs, Burlingame, CA).
Rezy sa vyvolali v 0,01 % hydroxide sodnom, 0,05 % 3,3'-diaminobenzidíne (DAB) pri RT. Na rezy určené na inkubáciu s protilátkami špecifickými na GFAP, MAC-1 a MHC II sa pôsobilo 0,6 % hydrogénperoxidom pri RT, aby sa zablokovala endogénna peroxidáza, a potom sa inkubovali cez noc s primárnou protilátkou pri 4 °C. Rezy zreagované s ΰΡΑβ protilátkou sa inkubovali 1 hodinu pri RT s biotinylovaným antimyším IgG pripraveným v koňoch (Vector Laboratories; Vectastain Elite ABC Kit) zriedeným v pomere 1 : 200 s TBS. Rezy sa potom ďalej nechali reagovať jednu hodinu s komplexom avidín-biotín-peroxidáza (Vector Laboratories; Vectastain Elite ABC Kit) zriedeným v pomere 1 : 1000 s TBS. Rezy inkubované s monoklonálnou protilátkou špecifickou na MAC-1 alebo MHC II ako s primárnou protilátkou sa potom nechali reagovať 1 hodinu pri RT s biotinylovaným anti-potkaním IgG pripraveným v králikoch a zriedeným v pomere 1 : 200 s TBS, po čom nasledovala inkubácia 1 hodinu s komplexom avidín-biotín-peroxidáza zriedeným v pomere 1 : 100 s TBS. Rezy inkubované s protilátkami špecifickými na GFAP, MAC-1 a MHC II sa potom vyvolali pôsobením 0,05 % DAB, 0,01 % hydrogénperoxidu, 0,04 % chloridom nikelnatým v TBS 4, resp. 11 minút pri RT.
Imunoznačené rezy sa upevnili na mikroskopické sklíčka (VWR, Superfŕost slides), nechali sa vysušiť cez noc na vzduchu, ponorili sa do Proparu (Anatech) a prekryli sa krycími sklíčkami pomocou Permountu (Fisher) ako upevňovacieho média.
Na zafarbenie Αβ plakov sa časť GFAP-pozitívnych; rezov upevnila na sklíčka Superfrost, ktoré sa inkubovali 7 minút v 1 % vodnom roztoku tioflavínu S (Sigma), po čom nasledovalo imunohistochemické spracovanie. Rezy sa potom dehydrovali a očistili v Propare, a potom sa prekryli krycími sklíčkami upevnenými Permountom.
G. Analýza obrazov
Na analýzu imunoreaktívnych preparátov sa použil systém na analýzu obrazov Videometric 150 (Oncor, Inc., Gaithersburg, MD) pripojený k mikroskopu Nikon Microphot-FX cez CCD videokameru a monitor Sony Trinitron. Obraz rezu sa uložil do vyrovnávacej pamäte videa a určil sa farebný a saturačný prah na výber a výpočet celkovej plochy pixelov obsadených imunoznačkovanými štruktúrami. Pre každý rez sa ručne ohraničil hipokampus a vypočítala sa celková plocha pixelov obsadených hipokampom. Percentuálny podiel množstva amyloidu sa meral ako: (podiel plochy hipokampu obsahujúci depozity Αβ imunoreaktívne s mAb 3D6) x 100. Podobne sa meral percentuálny podiel neuritickej záťaže ako: (podiel plochy hipokampu obsahujúcej dystrofické neurity reaktívne s monoklonálnou protilátkou 8E5) x 100. C-Imaging systém (Compix, Ibc., Cranberry Township, PA) pracujúci s Simple 2 softvérovým aplikačným programom sa prepojil s mikroskopom Nikon Microphot-FX cez kameru Optronics a použil sa na kvantifikáciu percentuálneho podielu retrospeniálneho kortexu obsadeného GFAP-pozitívnymi astrocytmi a MAC-1- a MHC II-pozitívnou mikrogliou. Obraz imunoreaktívneho rezu sa uložil vo vyrovnávacej pamäte videa a určil sa monochrómový prah na výber a výpočet celkovej plochy pixelov obsadených imunoznačkovanými bunkami. Pre každý rez sa ručne ohraničil retrospleniálny kortex (RSC) a vypočítala sa celková plocha pixelov obsadených RSC. Percentuálny podiel astrocytózy sa definoval ako: (podiel RSC obsadeného GFAP-pozitívnymi astrocytmi) x 100. Podobne bol percentuálny podiel mikrogliózy definovaný ako: (podiel RSC obsadeného MAC-1- alebo MHC II-reaktívnou mikrogliou) x 100. Pri všetkých analýzach obrazov sa pre každé zviera kvantifikovalo šesť rezov na úrovni dorzálneho hipokampu získaných vo vzdialenostiach 240 pm od seba. Vo všetkých prípadoch nebol vyhodnocujúcemu pracovníkovi známy spôsob liečby zvierat.
Aj keď bol uvedený vynález podrobne opísaný z dôvodov jasného porozumenia, bude zrejmé, že sa v rámci pripojených patentových nárokov môžu urobiť určité modifikácie. Všetky citované publikácie a patentové dokumenty, ako aj texty objavujúce sa v obrázkoch a zoznamoch sekvencii, sú teda zaradené ako odkazy vo svojej celosti na všetky účely v rovnakom rozsahu, ako by bol takto každý jednotlivo označený.
Z uvedeného bude zrejmé, že vynález ustanovuje rad využití. Vynález napríklad ustanovuje použitie ktorejkoľvek z opísaných protilátok k Αβ pri liečbe, profylaxii alebo pri diagnostike amyloidogénnej choroby, alebo pri výrobe medikamentu alebo diagnostickej kompozície na to isté použitie.
Zoznam sekvencii <110> Neuralab Limited < 120> Humanizované protilátky, ktoré spoznajú beta-amyloidový peptid <130> ELN-002PC <150> 60/251,892 <151> 2000-12-06 <160> 63 <170> FastSEQ pre Windows verzia 4.0 <210> 1 <211> 396 <212>DNA <213> Mus musculus <220>
<221>CDS <222> (1)... (396) <221> sig peptid <222> (1)... (60) <400> 1
atg atg agt cct gcc cag ttc ctg ttt ctg tta gtg ctc tgg att cgg 48
Met Met Ser Pro Ala Gin Phe Leu Phe Leu Leu Val Leu Trp íle Arg
-15 -10 -5
gaa acc aac ggt tat gtt gtg atg acc cag act cca ctc act ttg tcg 96
Glu Thr Asn Gly Tyr Val Val Met Thr Gin Thr Pro Leu Thr Leu Ser
1 5 10
gtt acc att gga caa cca gcc tcc atc tct tgc aag tca agt cag agc 144
Val Thr íle Gly Gin Pro Ala Ser íle Ser Cys Lys Ser Ser Gin Ser
15 20 25
ctc tta gat agt gat gga aag aca tat ttg aat tgg ttg tta cag agg 192
Leu Leu Asp Ser Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gin Arg
30 35 40
cca ggc cag tct cca aag cgc cta atc tat ctg gtg tct aaa ctg gac 240
Pro Gly Gin Ser Pro Lys Arg Leu íle Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp
45 50 55 60
tct gga gtc cct gac agg ttc act ggc agt gga tca ggg aca gat ttt 288
Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe
65 70 75
aca ctg aaa atc agc aga ata gag get gag gat ttg gga ctt tat tat 336
Thr Leu Lys íle Ser Arg íle Glu Ala Glu Asp Leu Gly Leu Tyr Tyr
80 85 90
tgc tgg caa ggt aca cat ttt cct cgg acg ttc ggt gga ggc acc aag 384
Cys Trp Gin Gly Thr His Phe Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys
95 100 105
ctg gaa atc aaa 396
Leu Glu íle Lys
110 <210>2 <211> 132 <212> PRT <213> Mus musculus <220>
<221> SIGNÁL <222> (1)... (20) <400> 2
Met Met Ser Pro Ala Gin -15 Phe Leu Phe Leu Leu -10 Val Leu Trp íle Arg -5
Glu Thr Asn Gly Tyr Val Val Met Thr Gin Thr Pro Leu Thr Leu Ser
1 5 10
Val Thr íle Gly Gin Pro Ala Ser íle Ser Cys Lys Ser Ser Gin Ser
15 20 25
Leu Leu Asp Ser Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gin Arg
30 35 40
Pro Gly Gin Ser Pro Lys Arg Leu íle Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp
45 50 55 60
Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe
65 70 75
Thr Leu Lys íle Ser Arg íle Glu Ala Glu Asp Leu Gly Leu Tyr Tyr
80 85 90
Cys Trp Gin Gly Thr His Phe Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys
95 100 105
Leu Glu íle Lys
110
<210> 3 <211> 414 <212>DNA <213> Mus Musculus <220>
<221>CDS <222> (1)...(414) <221> sig peptid <222> (1)...(57) <400> 3
atg Met aac Asn ttc Phe ggg Gly ctc Leu -15 agc Ser ttg Leu att íle ttc Phe ctt Leu gtc Val -10 ctt Leu gtt Val tta Leu aaa Lys -5 ggt Gly 48
gtc cag tgt gaa gtg aag ctg gtg gag tct ggg gga ggc tta gtg aag 96
Val Gin Cys Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys
1 5 10
cct gga gcg tct ctg aaa ctc tcc tgt gca gcc tct gga ttc act ttc 144
Pro Gly Ala Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe
15 20 25
agt aac tat ggc atg tct tgg gtt cgc cag aat tca gac aag agg ctg 192
Ser Asn Tyr Gly Met Ser Trp Val Arg Gin Asn Ser Asp Lys Arg Leu
30 35 40 45
gag tgg gtt gca tcc att agg agt ggt ggt ggt aga acc tac tat tca 240
Glu Trp Val Ala Ser íle Arg Ser Gly Gly Gly Arg Thr Tyr Tyr Ser
50 55 55 60
gac aat gta aag ggc ega ttc acc atc tcc aga gag aat gcc aag aac 288
Asp Asn Val Lys Gly Arg Phe Thr íle Ser Arg Glu Asn Ala Lys Asn
70 75
acc ctg tac ctg caa atg agt agt ctg aag tct gag gac acg gcc ttg 336
Thr Leu Tyr Leu Gin Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Leu
80 85 90
tat tat tgt gtc aga tat gat cac tat agt ggt agc tcc gac tac tgg 384
Tyr Tyr Cys Val Arg Tyr Asp His Tyr Ser Gly Ser Ser Asp Tyr Trp
95 100 105
ggc cag ggc acc act gtc aca gtc tcc tca 414
Gly Gin Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
110 115 <210>4 <211> 138 <212> PRT <213> Mus musculus <220>
<221> SIGNÁL <222> (1)...(19) <400>4
Met Asn Phe Gly Leu -15 Ser Leu íle Phe Leu -10 Val Leu Val Leu Lys -5 Gly
Val Gin Cys Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys
1 5 10
Pro Gly Ala Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe
15 20 25
Ser Asn Tyr Gly Met Ser Trp Val Arg Gin Asn Ser Asp Lys Arg Leu
30 35 40 45
Glu Trp Val Ala Ser íle Arg Ser Gly Gly Gly Arg Thr Tyr Tyr Ser
50 55 60
Asp Asn Val Lys Gly Arg Phe Thr íle Ser Arg Glu Asn Ala Lys Asn
65 70 75
Thr Leu Tyr Leu Gin Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Leu
80 85 90
Tyr Tyr Cys Val Arg Tyr Asp His Tyr Ser Gly Ser Ser Asp Tyr Trp
95 100 105
Gly Gin Gly Thr Thr íle Thr Val Ser Ser
110 115 <210> 5 <211>132 <212> PRT <213> Umelá sekvencia <220>
<221> SIGNÁL <222> (1)... (20) <223> humanizovaná 3D6 variabilná oblasť ľahkého reťazca <400> 5
Met Met Ser Pro Ala Gin Phe Leu Phe Leu Leu Val Leu Trp íle Arg
-20 -15 -10 -5
Glu Thr Asn Gly Tyr Val Val Met Thr Gin Ser Pro Leu Ser Leu Pro
1 5 10
Val Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser íle Ser Cys Lys Ser Ser Gin Ser
15 20 25
Leu Leu Asp Ser Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gin Lys
35 40
SK 288209 Β6
Pro Gly Gin Ser Pro Gin Arg Leu íle Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp
45 50 55 60
Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe
65 70 75
Thr Leu Lys íle Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr
80 85 90
Cys Trp Gin Gly Thr His Phe Pro Arg Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys
95 100 105
Val Glu íle Lys 110 <210>6 <211> 125 <212> PRT <213> Homo sapiens <220>
<221> SIGNÁL <222> (1)...(19) <400>6
Met Gly Leu Leu Met -15 Leu Trp Val Ser Gly -10 Ser Ser Gly Asp íle -5 Val
Met Thr Gin Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly Glu Pro Ala
1 5 10
Ser íle Ser Cys Arg Ser Ser Gin Ser Leu Leu His Ser Asn Gly
15 20 25 Tyr
Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gin Lys Pro Gly Gin Ser Pro Gin Leu
30 35 40 45
Leu íle Tyr Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys íle Ser Arg Val
65 70 75
Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gin Ala Leu Gin Thr
80 85 90
Pro Arg Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu íle Lys
100 105 <210>7 <211>100 <212> PRT <213> Homo sapiens <400>7
Asp 1 íle Val Met Thr 5 Gin Ser Pro Leu Ser 10 Leu Pro Val Thr Pro 15 Gly
Glu Pro Ala Ser íle Ser Cys Arg Ser Ser Gin Ser Leu Leu His Ser
20 25 30
Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gin Lys Pro Gly Gin Ser
35 40 45
Pro Gin Leu Leu íle Tyr Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys íle
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gin Ala
85 90 95
Leu Gin Thr Pro 100 <210> 8 <211> 138 <212> PRT <213> Umelá sekvencia 5 <220>
<223> Humanizovaná 3D6 variabilná oblasť ťažkého reťazca <221> SIGNÁL 10 <222> (1)...(19) <400>8
Met Asn Phe Gly Leu -15 Ser Leu íle Phe Leu -10 Val Leu Val Leu Lys -5 Gly
Val Gin Cys Glu Val Gin Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin
1 5 10
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe
15 20 25
Ser Asn Tyr Gly Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu
30 35 40 45
Glu Trp Val Ala Ser íle Arg Ser Gly Gly Gly Arg Thr Tyr Tyr Ser
50 55 60
Asp Asn Val Lys Gly Arg Phe Thr íle Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn
65 70 75
Ser Leu Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu
80 85 90
Tyr Tyr Cys Val Arg Tyr Asp His Tyr Ser Gly Ser Ser Asp Tyr Trp
95 100 105
Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
110 115 <210>9 <211> 121 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 9
Glu Val Gin Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Val Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala íle Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr íle Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Asp Asn Tyr Asp Phe Trp Ser Gly Thr Phe Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 10 <211> 98 <212>PRT <213> Homo Sapiens
SK 288209 Β6 <400> 10
Glu Val Gin Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala íle Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr íle Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
90 95
Ala Lys <210> 11 5 <211>132 <212> PRT <213> Umelá sekvencia <220>
<221> SIGNÁL <222> (1) ...(20) <223> humanizovaná 3D6 variabilná oblasť ľahkého reťazca <400> 11
Met -20 Met Ser Pro Ala Gin -15 Phe Leu Phe Leu Leu -10 Val Leu Trp íle Arg -5
Glu Thr Asn Gly Asp Val Val Met Thr Gin Ser Pro Leu Ser Leu Pro
1 5 10
Val Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser íle Ser Cys Lys Ser Ser Gin Ser
15 20 25
Leu Leu Asp Ser Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gin Lys
30 35 40
Pro Gly Gin Ser Pro Gin Arg Leu íle Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp
45 50 55 60
Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe
65 70 7 5
Thr Leu Lys íle Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr
80 85 90
Cys Trp Gin Gly Thr His Phe Pro Arg Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys
95 100 105
Val Glu íle Lys
110 <210> 12 <211> 138 <212>PRT <213> Umelá sekvencia <220>
<223> Humanizovaná 3D6 variabilná oblasť ľahkého reťazca 25 <221> SIGNÁL <222> (1)...(19) <400> 12
SK 288209 Β6
Met Asn Phe Gly Leu -15 Ser Leu íle Phe Leu -10 Val Leu Val Leu Lys -5 Gly
Val Gin Cys Glu 1 Val Gin Leu Leu 5 Glu Ser Gly Gly Gly 10 Leu Val Gin
Pro Gly 15 Gly Ser Leu Arg Leu 20 Ser Cys Ala Ala Ser 25 Gly Phe Thr Phe
Ser 30 Asn Tyr Gly Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro 1 35 40 Gly Lys Gly Leu 45
Glu Trp Val Ala Ser 50 íle Arg Ser Gly Gly 55 Gly Arg Thr Tyr Tyr 60 Ser
Asp Asn Val Lys 65 Gly Arg Phe Thr íle 70 Ser Arg Asp Asn Ser 75 Lys Asn
Thr Leu Tyr 80 Leu Gin Met Asn Ser 85 Leu Arg Ala Glu Asp 90 Thr Ala Val
Tyr Tyr 95 Cys Val Arg Tyr Asp 100 His Tyr Ser Gly Ser 105 Ser Asp Tyr Trp
Gly 110 Gin Gly Thr Leu Val Thr 115 Val Ser Ser
<210> 13 <211> 393 <212>DNA <213>Mus musculus <220>
<221> CDS <222> (1)... (393) <221> sig peptid <222> (1)... (57) <400> 13
atg aag ttg cct gtt agg ctg ttg gta ctg atg ttc tgg att cct get 48
Met Lys Leu Pro Val Arg Leu Leu Val Leu Met Phe Trp íle Pro Ala
-15 -10 -5
tcc agc agt gat gtt ttg atg acc caa act cca ctc tcc ctg cct gtc 96
Ser Ser Ser Asp Val Leu Met Thr Gin Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val
1 5 10
agt ctt gga gat caa gcc tcc atc tct tgc aga tct agt cag aac att 144
Ser Leu Gly Asp Gin Ala Ser íle Ser Cys Arg Ser Ser Gin Asn íle
15 20 25
ata cat agt aat gga aac acc tat tta gaa tgg tac ctg cag aaa cca 192
íle His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gin Lys Pro
30 35 40 45
ggc cag tct cca aag ctc ctg atc tac aaa gtt tcc aac ega ttt tct 240
Gly Gin Ser Pro Lys Leu Leu íle Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser
50 55 60
ggg gtc cca gac agg ttc agt ggc agt gga tca ggg aca gat ttc aca 288
Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
65 70 75
ctc aag atc aag aaa gtg gag get gag gat ctg gga att tat tac tgc 336
Leu Lys íle Lys Lys Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly íle Tyr Tyr Cys
80 85 90
ttt caa ggt tca cat gtt ccg ctc acg ttc ggt get ggg acc aag ctg 384
Phe Gin Gly Ser His Val Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu
95 100 105
gag ctg gaa 393
Glu Leu Glu 110
SK 288209 Β6 <210> 14 <211> 131 <212> PRT <213> Mus musculus <220>
<221> SIGNÁL <222> (1)...(19) <400> 14
Met Lys Leu Pro Val -15 Arg Leu Leu Val Leu -10 Met Phe Trp íle Pro -5 Ala
Ser Ser Ser Asp Val Leu Met Thr Gin Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val
1 5 10
Ser Leu Gly Asp Gin Ala Ser íle Ser Cys Arg Ser Ser Gin Asn íle
15 20 25
íle His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gin Lys Pro
30 35 40 45
Gly Gin Ser Pro Lys Leu Leu íle Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
65 70 75
Leu Lys íle Lys Lys Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly íle Tyr Tyr Cys
80 85 90
Phe Gin Gly Ser His Val Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu
95 100 105
Glu Leu Glu
110
<210> 15 15 <211>426 <212>DNA <213> Mus musculus <220>
<221>CDS <222> (1) ...(426) <221> sig peptid <222> (1)... (57) <400> 15
atg gac agg ctt act tcc tca ttc ctg ctg ctg att gtc cct gca tat 48
Met Asp Arg Leu Thr Ser Ser Phe Leu Leu Leu íle Val Pro Ala Tyr
-15 -10 -5
gtc ctg tcc cag get act ctg aaa gag tet ggc cct gga ata ttg cag 96
Val Leu Ser Gin Ala Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly íle Leu Gin
1 5 10
tcc tcc cag acc ctc agt ctg act tgt tet ttc tet ggg ttt tca ctg 144
Ser Ser Gin Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu
15 20 25
age act tet ggt atg gga gtg age tgg att cgt cag cct tca gga aag 192
Ser Thr Ser Gly Met Gly Val Ser Trp íle Arg Gin Pro Ser Gly Lys
30 35 40 45
ggt ctg gag tgg ctg gca cac att tac tgg gat gat gac aag cgc tat 240
Gly Leu Glu Trp Leu Ala His íle Tyr Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr
50 55 60
aac cca tcc ctg aag age cgg ctc aca atc tcc aag gat acc tcc aga 288
SK 288209 Β6
Asn Pro Ser Leu 65 Lys Ser Arg Leu Thr 70 íle Ser Lys Asp Thr 75 Ser Arg
aag cag gta ttc ctc aag atc acc agt gtg gac cct gca gat act gcc
Lys Gin Val Phe Leu Lys íle Thr Ser Val Asp Pro Ala Asp Thr Ala
80 85 90
aca tac tac tgt gtt ega agg ccc att act ccg gta cta gtc gat get
Thr Tyr Tyr Cys Val Arg Arg Pro íle Thr Pro Val Leu Val Asp Ala
95 100 105
atg gac tac tgg ggt caa gga acc tca gtc acc gtc tcc tca
Met Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
110 115 120 <210> 16 <211> 142 <212> PRT <213> Mus musculus
<220> <221> <222> SIGNÁL
(D··. (19)
<400> 16
Met Asp Arg Leu Thr Ser Ser Phe Leu Leu Leu íle Val Pro Ala Tyr
-15 -10 -5
Val Leu Ser Gin Ala Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly íle Leu Gin
1 5 10
Ser Ser Gin Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu
15 20 25
Ser Thr Ser Gly Met Gly Val Ser Trp íle Arg Gin Pro Ser Gly Lys
30 35 40 45
Gly Leu Glu Trp Leu Ala His íle Tyr Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr
50 55 60
Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Leu Thr íle Ser Lys Asp Thr Ser Arg
65 70 75
Lys Gin Val Phe Leu Lys íle Thr Ser Val Asp Pro Ala Asp Thr Ala
80 85 90
Thr Tyr Tyr Cys Val Arg Arg Pro íle Thr Pro Val Leu Val Asp Ala
95 100 105
Met Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
110 115 120
<210> 17 15 <211> 136 <212>DNA <213> Umelá sekvencia <220>
<223> Primér <400> 17
tccgcaagct tgccgccacc atggacatgc gcgtgcccgc ccagctgctg ggcctgctga 60
tgctgtgggt gtccggctcc tccggctacg tggtgatgac ccagtccccc ctgtccctgc 120
ccgtgacccc cggcga 136
<210> 18 <211> 131 <212>DNA <213> Umelá sekvencia
SK 288209 Β6 cgtcggagtc tcacgggcag taggtcttgc tcgccggggg <220>
<223> Primér <400> 18 ctggggggac cagcagggac ggacaggggg tggccgggct tgggaggact g
tctgcagcag tgcaggagat ccagttcagg ggaggcgggc <210> 19 <211> 146 <212>DNA <213> Umelá sekvencia <220>
<223> Primér <400> 19 acctgaactg ccaagctgga ccctgaagat gctgctgcag ctccggcgtg ctcccgcgtg aagcccggcc cccgaccgct gaggcc agtcccccca tctccggctc gcgcctgatc cggctccggc tacctggtgt accgacttca <210> 20 <211> 142 <212>DNA <213> Umelá sekvencia <220>
<223> Primér <400> 20 aattctagga aagtgggtgc ttcagggtga tccactcacg cctgccagca agtcggtgcc cttgatctcc gtagtacacg gg accttggtgc cccacgtcct cctggccgaa cggcctccac ggtgcggggg gcgggagatc <210> 21 <211> 16 <212>DNA <213> Umelá sekvencia <220>
<223> Primér <400>21 ctggggggac tggccg <210> 22 <211> 22 <212>DNA <213> Umelá sekvencia <220>
<223> Primér <400> 22 acctgaactg gctgctgcag aa <210> 23 <211> 138 gctttttctt cggcggcctg gtggctattt gtgcagcccg <212>DNA <213> Umelá sekvencia <220>
<223> Primér <400> 23 acagaaagct taaaaggtgt gcggctccct tgccgccacc ccagtgtgag gcgcctgt atggagtttg gtgcagctgc ggctgagctg tggagtccgg
120
138 <210>24 <211> 135 <212>DNA <213> Umelá sekvencia <220>
<223> Primér <400> 24 gccgccggag ggacatgccg gccgggctgc cggatggagg tagttggaga accag ccacccactc aggtgaagcc caggcccttg ggaggcggcg ccgggggcct caggacaggc ggcgcaccca gcagggagcc
120
135 <210> 25 <211> 142 <212>DNA <213> Umelá sekvencia <220>
<223> Primér <400> 25 ctggagtggg aagggccgct tccctgcgcg tggcctccat tcaccatctc ccgaggacac ccgctccggc ccgcgacaac cg ggcggccgca gccaagaact cctactactc ccctgtacct cgacaacgtg gcagatgaac
120
142 <210>26 <211> 144 <212>DNA <213> Umelá sekvencia <220>
<223> Primér <400> 26 ctgcaaggat aggagccgga gggagttcat ccactcaccg gtagtggtcg ctgcaggtac gaggacacgg tagcgcacgc aggg tcaccagggt agtagtacag gccctggccc ggcggtgtcc cagtagtcgg tcggcgcgca
120
144 <210>27 <211> 16 <212>DNA <213> Umelá sekvencia <220>
<223> Primér
SK 288209 Β6 <400> 27 gccgccggag cggatg 16 <210> 28 <211> 20 <212>DNA <213> Umelá sekvencia <220>
<223> Primér <400> 28 ctggagtggg tggcctccat 20 <210> 29 <211> 19 <212>DNA <213> Umelá sekvencia <220>
<223> Primér <400> 29 tccgcaagct tgccgccac 19 <210>30 <211> 29 <212>DNA <213> Umelá sekvencia <220>
<223> Primér <400> 30 aattctagga tccactcacg cttgatctc 29 <210> 31 <211>23 <212>DNA <213> Umelá sekvencia <220>
<223> Primér <400>31 acagaaagct tgccgccacc atg 23 <210>32 <211> 22 <212>DNA <213> Umelá sekvencia <220>
<223> Primér <400> 32 ctgcaaggat ccactcaccg ga 22 <210> 33 <211>10 <212> PRT <213> Umelá sekvencia <220>
<223> Interný peptid <400> 33
Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr 15 10
<210>34 <211>402 <212>DNA <213> Umelá sekvencia
<220> <223> h3D6 verzia 1 VL
<400> 34
atggacatgc gcgtgcccgc ccagctgctg ggcctgctga tgctgtgggt gtccggctcc 60
tccggcgacg tggtgatgac ccagtccccc ctgtccctgc ccgtgacccc cggcgagccc 120
gcctccatct cctgcaagtc ctcccagtcc ctgctggact ccgacggcaa gacctacctg 180
aactggctgc tgcagaagcc cggccagtcc ccccagcgcc tgatctacct ggtgtccaag 240
ctggactccg gcgtgcccga ccgcttctcc ggctccggct ccggcaccga cttcaccctg 300
aagatctccc gcgtggaggc cgaggacgtg ggcgtgtact actgctggca gggcacccac 360
ttcccccgca ccttcggcca gggcaccaag gtggagatca ag 402
<210> 35 <211> 402 <212>DNA <213> Umelá sekvencia
<220> <223> h3D6 verzia 2 VL
<400> 35
atggacatgc gcgtgcccgc ccagctgctg ggcctgctga tgctgtgggt gtccggctcc 60
tccggcgacg tggtgatgac ccagtccccc ctgtccctgc ccgtgacccc cggcgagccc 120
gcctccatct cctgcaagtc ctcccagtcc ctgctggact ccgacggcaa gacctacctg 180
aactggctgc tgcagaagcc cggccagtcc ccccagcgcc tgatctacct ggtgtccaag 240
ctggactccg gcgtgcccga ccgcttctcc ggctccggct ccggcaccga cttcaccctg 300
aagatctccc gcgtggaggc cgaggacgtg ggcgtgtact actgctggca gggcacccac 360
ttcccccgca ccttcggcca gggcaccaag gtggagatca ag 402
<210> 36 <211> 414 <212>DNA <213> Umelá sekvencia
<220>
<223> h3D6 verzia 1 VH <400> 36
atggagtttg ggctgagctg gctttttctt gtggctattt taaaaggtgt ccagtgtgag 60
gtgcagctgc tggagtccgg cggcggcctg gtgcagcccg gcggctccct gcgcctgtcc 120
tgcgccgcct ccggcttcac cttctccaac tacggcatgt cctgggtgcg ccaggccccc 180
ggcaagggcc tggagtgggt ggcctccatc cgctccggcg gcggccgcac ctactactcc 240
gacaacgtga agggccgctt caccatctcc cgcgacaacg ccaagaactc cctgtacctg 300
cagatgaact ccctgcgcgc cgaggacacc gccctgtact actgcgtgcg ctacgaccac 360
tactccggct cctccgacta ctggggccag ggcaccctgg tgaccgtgtc ctcc 414
<210>37 <211> 414 <212>DNA <213> Umelá sekvencia
<220> <223> h3D6 verzia 2 VH
<400> 37
atggagtttg ggctgagctg gctttttctt gtggctattt taaaaggtgt ccagtgtgag 60
gtgcagctgc tggagtccgg cggcggcctg gtgcagcccg gcggctccct gcgcctgtcc 120
tgcgccgcct ccggcttcac cttctccaac tacggcatgt cctgggtgcg ccaggccccc 180
ggcaagggcc tggagtgggt ggcctccatc cgctccggcg gcggccgcac ctactactcc 240
gacaacgtga agggccgctt caccatctcc cgcgacaact ccaagaacac cctgtacctg 300
cagatgaact ccctgcgcgc cgaggacacc gccgtgtact actgcgtgcg ctacgaccac 360
tactccggct cctccgacta ctggggccag ggcaccctgg tgaccgtgtc
<210> 38 <211> 770 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 38
Met 1 Leu Pro Gly Leu 5 Ala Leu Leu Leu Leu 10 Ala Ala Trp Thr Ala 15 Arg
Ala Leu Glu Val Pro Thr Asp Gly Asn Ala Gly Leu Leu Ala Glu Pro
20 25 30
Gin íle Ala Met Phe Cys Gly Arg Leu Asn Met His Met Asn Val Gin
35 40 45
Asn Gly Lys Trp Asp Ser Asp Pro Ser Gly Thr Lys Thr Cys íle Asp
50 55 60
Thr Lys Glu Gly íle Leu Gin Tyr Cys Gin Glu Val Tyr Pro Glu Leu
65 70 75 80
Gin íle Thr Asn Val Val Glu Ala Asn Gin Pro Val Thr íle Gin Asn
85 90 95
Trp Cys Lys Arg Gly Arg Lys Gin Cys Lys Thr His Pro His Phe Val
100 105 110
íle Pro Tyr Arg Cys Leu Val Gly Glu Phe Val Ser Asp Ala Leu Leu
115 120 125
Val Pro Asp Lys Cys Lys Phe Leu His Gin Glu Arg Met Asp Val Cys
130 135 140
Glu Thr His Leu His Trp His Thr Val Ala Lys Glu Thr Cys Ser Glu
145 150 155 160
Lys Ser Thr Asn Leu His Asp Tyr Gly Met Leu Leu Pro Cys Gly íle
165 170 175
Asp Lys Phe Arg Gly Val Glu Phe Val Cys Cys Pro Leu Ala Glu Glu
180 185 190
Ser Asp Asn Val Asp Ser Ala Asp Ala Glu Glu Asp Asp Ser Asp Val
SK 288209 Β6
195 200 205
Trp Trp 210 Gly Gly Ala Asp Thr 215 Asp Tyr Ala Asp Gly 220 Ser Glu Asp Lys
Val Val Glu Val Ala Glu Glu Glu Glu Val Ala Glu Val Glu Glu Glu
225 230 235 240
Glu Ala Asp Asp Asp Glu Asp Asp Glu Asp Gly Asp Glu Val Glu Glu
245 250 255
Glu Ala Glu Glu Pro Tyr Glu Glu Ala Thr Glu Arg Thr Thr Ser íle
260 265 270
Ala Thr Thr Thr Thr Thr Thr Thr Glu Ser Val Glu Glu Val Val Arg
275 280 285
Glu Val Cys Ser Glu Gin Ala Glu Thr Gly Pro Cys Arg Ala Met íle
290 295 300
Ser Arg Trp Tyr Phe Asp Val Thr Glu Gly Lys Cys Ala Pro Phe Phe
305 310 315 320
Tyr Gly Gly Cys Gly Gly Asn Arg Asn Asn Phe Asp Thr Glu Glu Tyr
325 330 335
Cys Met Ala Val Cys Gly Ser Ala Met Ser Gin Ser Leu Leu Lys Thr
340 345 350
Thr Gin Glu Pro Leu Ala Arg Asp Pro Val Lys Leu Pro Thr Thr Ala
355 360 365
Ala Ser Thr Pro Asp Ala Val Asp Lys Tyr Leu Glu Thr Pro Gly Asp
370 375 380
Glu Asn Glu His Ala His Phe Gin Lys Ala Lys Glu Arg Leu Glu Ala
385 390 395 400
Lys His Arg Glu Arg Met Ser Gin Val Met Arg Glu Trp Glu Glu Ala
405 410 415
Glu Arg Gin Ala Lys Asn Leu Pro Lys Ala Asp Lys Lys Ala Val íle
420 425 430
Gin His Phe Gin Glu Lys Val Glu Ser Leu Glu Gin Glu Ala Ala Asn
435 440 445
Glu Arg Gin Gin Leu Val Glu Thr His Met Ala Arg Val Glu Ala Met
450 455 460
Leu Asn Asp Arg Arg Arg Leu Ala Leu Glu Asn Tyr íle Thr Ala Leu
465 470 475 480
Gin Ala Val Pro Pro Arg Pro Arg His Val Phe Asn Met Leu Lys Lys
485 490 495
Tyr Val Arg Ala Glu Gin Lys Asp Arg Gin His Thr Leu Lys His Phe
500 505 510
Glu His Val Arg Met Val Asp Pro Lys Lys Ala Ala Gin íle Arg Ser
515 520 525
Gin Val Met Thr His Leu Arg Val íle Tyr Glu Arg Met Asn Gin Ser
530 535 540
Leu Ser Leu Leu Tyr Asn Val Pro Ala Val Ala Glu Glu íle Gin Asp
545 550 555 560
Glu Val Asp Glu Leu Leu Gin Lys Glu Gin Asn Tyr Ser Asp Asp Val
565 570 575
Leu Ala Asn Met íle Ser Glu Pro Arg íle Ser Tyr Gly Asn Asp Ala
580 585 590
Leu Met Pro Ser Leu Thr Glu Thr Lys Thr Thr Val Glu Leu Leu Pro
595 600 605
Val Asn Gly Glu Phe Ser Leu Asp Asp Leu Gin Pro Trp His Ser Phe
610 615 620
Gly Ala Asp Ser Val Pro Ala Asn Thr Glu Asn Glu Val Glu Pro Val
625 630 635 640
Asp Ala Arg Pro Ala Ala Asp Arg Gly Leu Thr Thr Arg Pro Gly Ser
645 650 655
Gly Leu Thr Asn íle Lys Thr Glu Glu íle Ser Glu Val Lys Met Asp
660 665 670
Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gin Lys Leu
675 680 685
Val Phe 690 Phe Ala Glu Asp Val 695 Gly Ser Asn Lys Gly 700 Ala íle íle Gly
Leu Met Val Gly Gly Val Val íle Ala Thr Val íle Val íle Thr Leu
705 710 715 720
Val Met Leu Lys Lys Lys Gin Tyr Thr Ser íle His His Gly Val Val
725 730 735
Glu Val Asp Ala Ala Val Thr Pro Glu Glu Arg His Leu Ser Lys Met
740 745 750
Gin Gin Asn Gly Tyr Glu Asn Pro Thr Tyr Lys Phe Phe Glu Gin Met
755 760 765
Gin Asn 770 <210> 39 <211> 15 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>
<223> Priméry <400> 39 acttatatct gtttt 15 <210 40 <211> 15 <212>DNA <213> Umelá sekvencia <220>
<223> Priméry <400> 40 acttatacac tttgt 15 <210> 41 25 <211>15 <212>DNA <213> Umelá sekvencia <220>
<223> Priméry <400>41 acttatgttc attst 15 <210>42 <211> 16 <212>DNA <213> <213> Umelá sekvencia <220>
<223> Priméry <400> 42 acttatgccc attgtt <210>43 <211> 15 <212>DNA <213> <213> Umelá sekvencia <220>
<223> Priméry <400> 43 acttatatat attgt 15 <210>44 <211> 14 <212>DNA <213> <213> Umelá sekvencia <220>
<223> Priméry <400> 44 acttatgkyy attg <210> 45 <211> 15 <212>DNA <213> <213> Umelá sekvencia <220>
<223> Priméry <400> 45 acttatgtat acayw 15 <210>46 <211> 15 <212>DNA <213> <213> Umelá sekvencia <220>
<223> Priméry <400> 46 acttatggct ymtct 15 <210>47 <211> 13 <212>DNA <213> <213> Umelá sekvencia <220>
<223> Priméry <400> 47 acttattccc att
SK 288209 Β6 <210>48 <211> 14 <212>DNA <213> <213> Umelá sekvencia <220>
<223> Priméry <400> 48 acttatatgt tete <210> 49 <211> 14 <212>DNA <213> <213> Umelá sekvencia <220>
<223> Priméry <400> 49 acttataccc attt <210> 50 <211> 11 <212>DNA <213> <213> Umelá sekvencia <220>
<223> Priméry <400> 50 ggacggttgg g <210> 51 <211> 14 <212>DNA <213> <213> Umelá sekvencia <220>
<223> Priméry <400> 51 acttataggg tttt <210>52 <211> 14 <212>DNA <213> <213> Umelá sekvencia <220>
<223> Priméry <400> 52 acttatgggr tttt
SK 288209 Β6 <210>53 <211> 14 <212>DNA <213> <213> Umelá sekvencia <220>
<223> Priméry <400> 53 acttatatgt agtt <210> 54 <211> 13 <212>DNA <213> <213> Umelá sekvencia <220>
<223> Priméry <400> 54 acttatatgt gtt 13 <210>55 <211> 15 <212>DNA <213> <213> Umelá sekvencia <220>
<223> Priméry <400> 55 acttatacgt atttt <210> 56 <211> 14 <212>DNA <213> <213> Umelá sekvencia <220>
<223> Priméry <400> 56 acttatctts tttg 14 <210>57 <211> 14 <212>DNA <213> <213> Umelá sekvencia <220>
<223> Priméry <400> 57 acttatrggg tttt
SK 288209 Β6 <210> 58 <211>13 <212>DNA <213> <213> Umelá sekvencia <220>
<223> Priméry <400> 58 acttatgttt ttg 13 <210> 59 <211> 15 <212>DNA <213> <213> Umelá sekvencia <220>
<223> Priméry <400> 59 acttatmgtg mtttt <210> 60 <211> 14 <212>DNA <213> <213> Umelá sekvencia <220>
<223> Priméry <400> 60 acttatggtc tctt <210> 61 <211> 14 <212>DNA <213> <213> Umelá sekvencia <220>
<223> Priméry <400>61 acttatatgt tttt 14 <210> 62 <211> 14 <212>DNA <213> <213> Umelá sekvencia <220>
<223> Priméry <400> 62 acttattttg ttat 14 <210> 63
SK 288209 Β6 <211> 11 <212>DNA <213> <213> Umelá sekvencia <220>
<223> Priméry <400> 63 ggacgggaca g

Claims (17)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Humanizovaný imunoglobulin, ktorý sa špecificky viaže na beta-amyloidový peptid (Αβ), alebo jeho časť viažuca antigén, obsahujúci (i) variabilnú oblasť ľahkého reťazca obsahujúcu komplementaritu určujúce oblasti (CDR) a zvyšky L2, L36 a L46 (Kabatovo číslovanie) variabilnej rámcovej oblasti ľahkého reťazca zo sekvencie variabilnej oblasti ľahkého reťazca 3D6 imunoglobulínu označenej ako SEQ ID NO: 2, pričom zostávajúca časť variabilnej oblasti ľahkého reťazca je z ľahkého reťazca ľudského akceptorového imunoglobulínu vybraného zo skupiny pozostávajúcej z Kabat ID 019230, Kabat ID005131, Kabat ID 005058, Kabat ID 005057, Kabat ID 005059, Kabat ID U21040 a Kabat ID U41645; a (ii) variabilnú oblasť ťažkého reťazca obsahujúcu komplementaritu určujúce oblasti (CDR) a zvyšky H49, H93 a H94 (Kabatovo číslovanie) variabilnej rámcovej oblasti ťažkého reťazca zo sekvencie variabilnej oblasti ťažkého reťazca 3D6 imunoglobulínu označenej ako SEQ ID NO:4 a zvyšky H74, H77 a H89 variabilnej rámcovej oblasti ťažkého reťazca z ľudskej zárodočnej sekvencie VH3 - 23, pričom zostávajúca časť variabilnej oblasti ťažkého reťazca je z ťažkého reťazca ľudského akceptorového imunoglobulínu vybraného zo skupiny pozostávajúcej z Kabat ID 045919, Kabat ID 000459, Kabat ID 000553, Kabat ID 000386 a Kabat IDM23691.
  2. 2. Humanizovaný imunoglobulin alebo jeho časť viažuca antigén podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že komplementaritu určujúce oblasti ľahkého reťazca sú nasledujúce:
    CDR1 ľahkého reťazca:
    Lys Ser Ser Gin Ser Leu Leu Asp Ser Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn (zvyšky 24 - 39 SEQ ID NO: 2);
    CDR2 ľahkého reťazca:
    Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser (zvyšky 55-61 SEQ ID NO: 2); a
    CDR3 ľahkého reťazca:
    Trp Gin Gly Thr His Phe Pro Arg Thr (zvyšky 94 - 102 SEQ ID NO: 2).
  3. 3. Humanizovaný imunoglobulin alebo jeho časť viažuca antigén podľa nároku 1 alebo 2, vyznačujúci sa tým, že komplementaritu určujúce oblasti ťažkého reťazca sú nasledujúce:
    CDR1 ťažkého reťazca:
    Asn Tyr Gly Met Ser (zvyšky 31-35 SEQ ID NO: 4);
    CDR2 ťažkého reťazca:
    Ser íle Arg Ser Gly Gly Gly Arg Thr Tyr Tyr Ser Asp Asn Val Lys Gly (zvyšky 50 - 66 SEQ ID NO: 4); a CDR3 ťažkého reťazca:
    Tyr Asp His Tyr Ser Gly Ser Ser Asp Tyr (zvyšky 99 - 108 SEQ ID NO: 4).
  4. 4. Humanizovaný imunoglobulin alebo jeho časť viažuca antigén podľa ktoréhokoľvek z predchádzajúcich nárokov, vyznačujúci sa tým, že ľudský akceptorový ľahký reťazec je Kabat ID 019230.
  5. 5. Humanizovaný imunoglobulin alebo jeho časť viažuca antigén podľa ktoréhokoľvek z predchádzajúcich nárokov, vyznačujúci sa tým, že ľudský akceptorový ťažký reťazec je Kabat ID 045919.
  6. 6. Humanizovaný imunoglobulin alebo jeho časť viažuca antigén podľa ktoréhokoľvek z predchádzajúcich nárokov, vyznačujúci sa tým, že (i) sa viaže k rozpustnému beta-amyloidovému peptidu (Αβ) aj k agregovanému Αβ; (ii) sprostredkuje fagocytózu beta-amyloidového peptidu (Αβ); (iii) prechádza cez hematoencefalitickú bariéru v subjekte; alebo (iv) redukuje záťaž beta-amyloidovým peptidom (Αβ) v subjekte.
  7. 7. Humanizovaný imunoglobulin alebo jeho časť viažuca antigén podľa ktoréhokoľvek z predchádzajúcich nárokov, vyznačujúci sa tým, že sekvencia variabilnej oblasti ťažkého reťazca je uvedená v zvyškoch 1-119 SEQ ID NO: 12.
  8. 8. Humanizovaný imunoglobulin alebo jeho časť viažuca antigén podľa ktoréhokoľvek z predchádzajúcich nárokov, vyznačujúci sa tým, že sekvencia variabilnej oblasti ľahkého reťazca je uve74 dená v zvyškoch 1-112 SEQ ID NO: 11.
  9. 9. Humanizovaný imunoglobulín alebo jeho časť viažuca antigén podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že sekvencia variabilnej oblasti ľahkého reťazca je uvedená v zvyškoch 1-112 SEQ ID NO: 11 a sekvencia variabilnej oblasti ťažkého reťazca je uvedená v zvyškoch 1-119 SEQ ID NO: 12.
    5 10. Humanizovaný imunoglobulín alebo jeho časť viažuca antigén podľa ktoréhokoľvek z predchádzajúcich nárokov, vyznačujúci sa tým, že konštantné oblasti sú odvodené z ľudského IgGl alebo ľudského IgG4.
    11. Fragment viažuci antigén podľa ktoréhokoľvek z predchádzajúcich nárokov, ktorým je Fab, Fab', Fabc, Fv, F(ab')2 fragment, alebo protilátka s jednoduchým reťazcom.
  10. 10 12. Farmaceutická kompozícia, vyznačujúca sa tým, že obsahuje imunoglobulín alebo jeho časť viažucu antigén podľa nárokov 1 až 11 a farmaceutický nosič.
  11. 13. Humanizovaný imunoglobulín podľa nárokov 1 až 11 na použitie ako liečivo.
  12. 14. Použitie účinnej dávky humanizovaného imunoglobulínu alebo jeho časti viažucej antigén podľa nárokov 1 až 11 na prípravu liečiva na prevenciu alebo liečenie amyloidogénneho ochorenia u pacienta.
  13. 15 15. Použitie podľa nároku 14, kde amyloidogénnym ochorením je Alzheimerova choroba.
  14. 16. Použitie podľa nároku 14 alebo 15, kde účinnou dávkou je (i) od 0,01 mg/kg telesnej hmotnosti do 5 mg/kg telesnej hmotnosti; (ii) 1 mg/kg telesnej hmotnosti; (iii) 1 mg/kg telesnej hmotnosti až 10 mg/kg telesnej hmotnosti; alebo (iv) 10 mg/kg telesnej hmotnosti.
  15. 17. Použitie podľa nárokov 14 až 16, kde imunoglobulín je podávaný vo viacnásobných dávkach v dáv20 kováčom intervale 2 týždne, jeden mesiac, 3 až 6 mesiacov alebo 1 rok.
  16. 18. Izolovaná nukleová kyselina, vyznačujúca sa tým, že kóduje imunoglobulín alebo jeho časť viažucu antigén podľa nárokov 1 až 11.
  17. 19. Izolovaná nukleová kyselina podľa nároku 18, vyznačujúca sa tým, že obsahuje nukleotidovú sekvenciu SEQ ID NO: 35 a SEQ ID NO: 37.
    25 20. Vektor, vyznačujúci sa tým, že obsahuje nukleovú kyselinu podľa nároku 18 alebo 19.
SK850-2003A 2000-12-06 2001-12-06 Humanizované protilátky, ktoré spoznajú beta-amyloidový peptid, izolovaná nukleová kyselina, ktorá ich kóduje, vektor, izolovaná hostiteľská bunka, farmaceutická kompozícia s ich obsahom a spôsob ich prípravy SK288209B6 (sk)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US25189200P 2000-12-06 2000-12-06
PCT/US2001/046587 WO2002046237A2 (en) 2000-12-06 2001-12-06 Humanized antibodies that recognize beta amyloid peptide

Publications (2)

Publication Number Publication Date
SK8502003A3 SK8502003A3 (en) 2004-03-02
SK288209B6 true SK288209B6 (sk) 2014-07-02

Family

ID=22953834

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SK850-2003A SK288209B6 (sk) 2000-12-06 2001-12-06 Humanizované protilátky, ktoré spoznajú beta-amyloidový peptid, izolovaná nukleová kyselina, ktorá ich kóduje, vektor, izolovaná hostiteľská bunka, farmaceutická kompozícia s ich obsahom a spôsob ich prípravy

Country Status (39)

Country Link
US (2) US7189819B2 (sk)
EP (2) EP2045267A3 (sk)
JP (6) JP4166569B2 (sk)
KR (2) KR20070004139A (sk)
CN (4) CN100448893C (sk)
AR (1) AR035402A1 (sk)
AT (1) ATE414719T1 (sk)
AU (2) AU2592102A (sk)
BG (1) BG66292B1 (sk)
BR (1) BR0115978A (sk)
CA (1) CA2430772C (sk)
CY (1) CY1108740T1 (sk)
CZ (1) CZ20031601A3 (sk)
DE (1) DE60136651D1 (sk)
DK (1) DK1358213T3 (sk)
EA (2) EA010469B1 (sk)
EC (1) ECSP034685A (sk)
EE (1) EE05309B1 (sk)
ES (1) ES2317953T3 (sk)
GE (1) GEP20084339B (sk)
HK (1) HK1070904A1 (sk)
HR (1) HRP20030547A8 (sk)
HU (1) HU229681B1 (sk)
IL (2) IL156030A0 (sk)
IS (1) IS2620B (sk)
MX (1) MXPA03005048A (sk)
MY (2) MY162171A (sk)
NO (1) NO339290B1 (sk)
NZ (3) NZ546621A (sk)
PE (1) PE20020574A1 (sk)
PL (1) PL211761B1 (sk)
PT (1) PT1358213E (sk)
SI (1) SI1358213T1 (sk)
SK (1) SK288209B6 (sk)
TW (1) TWI255272B (sk)
UA (1) UA87093C2 (sk)
UY (1) UY27062A1 (sk)
WO (1) WO2002046237A2 (sk)
ZA (1) ZA200305169B (sk)

Families Citing this family (188)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7179892B2 (en) * 2000-12-06 2007-02-20 Neuralab Limited Humanized antibodies that recognize beta amyloid peptide
US20080050367A1 (en) * 1998-04-07 2008-02-28 Guriq Basi Humanized antibodies that recognize beta amyloid peptide
US6913745B1 (en) * 1997-12-02 2005-07-05 Neuralab Limited Passive immunization of Alzheimer's disease
US6787523B1 (en) 1997-12-02 2004-09-07 Neuralab Limited Prevention and treatment of amyloidogenic disease
US6743427B1 (en) 1997-12-02 2004-06-01 Neuralab Limited Prevention and treatment of amyloidogenic disease
US7964192B1 (en) 1997-12-02 2011-06-21 Janssen Alzheimer Immunotherapy Prevention and treatment of amyloidgenic disease
TWI239847B (en) * 1997-12-02 2005-09-21 Elan Pharm Inc N-terminal fragment of Abeta peptide and an adjuvant for preventing and treating amyloidogenic disease
US6761888B1 (en) * 2000-05-26 2004-07-13 Neuralab Limited Passive immunization treatment of Alzheimer's disease
US7790856B2 (en) * 1998-04-07 2010-09-07 Janssen Alzheimer Immunotherapy Humanized antibodies that recognize beta amyloid peptide
US20050059802A1 (en) * 1998-04-07 2005-03-17 Neuralab Ltd Prevention and treatment of amyloidogenic disease
US20030147882A1 (en) * 1998-05-21 2003-08-07 Alan Solomon Methods for amyloid removal using anti-amyloid antibodies
IL151378A0 (en) 2000-02-24 2003-04-10 Univ Washington Humanized antibodies that sequester amyloid beta peptide
PE20020574A1 (es) * 2000-12-06 2002-07-02 Wyeth Corp Anticuerpos humanizados que reconocen el peptido amiloideo beta
US7700751B2 (en) 2000-12-06 2010-04-20 Janssen Alzheimer Immunotherapy Humanized antibodies that recognize β-amyloid peptide
ES2437875T3 (es) 2001-04-30 2014-01-14 Eli Lilly And Company Anticuerpos humanizados que reconocen el péptido beta-amiloide
ES2312569T3 (es) 2001-04-30 2009-03-01 Eli Lilly And Company Anticuerpos humanizados.
WO2003014162A1 (en) † 2001-08-03 2003-02-20 Medical & Biological Laboratories Co., Ltd. ANTIBODY RECOGNIZING GM1 GANGLIOSIDE-BOUND AMYLOID β-PROTEIN AND DNA ENCODING THE ANTIBODY
JP2005500389A (ja) * 2001-08-17 2005-01-06 イーライ・リリー・アンド・カンパニー Ａβに関連する病態および疾患を治療するための、可溶性Ａβに高い親和性を有する抗体の使用
AU2002329775C1 (en) 2001-08-17 2011-04-07 Eli Lilly And Company Assay method for alzheimer's disease
US7521053B2 (en) 2001-10-11 2009-04-21 Amgen Inc. Angiopoietin-2 specific binding agents
US7658924B2 (en) 2001-10-11 2010-02-09 Amgen Inc. Angiopoietin-2 specific binding agents
AR038568A1 (es) 2002-02-20 2005-01-19 Hoffmann La Roche Anticuerpos anti-a beta y su uso
MY139983A (en) * 2002-03-12 2009-11-30 Janssen Alzheimer Immunotherap Humanized antibodies that recognize beta amyloid peptide
GB2392792B (en) * 2002-09-07 2004-12-15 Matsushita Electric Ind Co Ltd Improvements to television and radio programme control
TW200509968A (en) * 2002-11-01 2005-03-16 Elan Pharm Inc Prevention and treatment of synucleinopathic disease
US20080014194A1 (en) * 2003-10-31 2008-01-17 Elan Pharmaceuticals, Inc. Prevention and Treatment of Synucleinopathic and Amyloidogenic Disease
US9034337B2 (en) * 2003-10-31 2015-05-19 Prothena Biosciences Limited Treatment and delay of outset of synucleinopathic and amyloidogenic disease
US8506959B2 (en) * 2002-11-01 2013-08-13 Neotope Biosciences Limited Prevention and treatment of synucleinopathic and amyloidogenic disease
US8697082B2 (en) * 2002-11-01 2014-04-15 Neotope Biosciences Limited Prevention and treatment of synucleinopathic and amyloidogenic disease
GB0300571D0 (en) * 2003-01-10 2003-02-12 Imp College Innovations Ltd Modification of feeding behaviour
DE10303974A1 (de) 2003-01-31 2004-08-05 Abbott Gmbh & Co. Kg Amyloid-β(1-42)-Oligomere, Verfahren zu deren Herstellung und deren Verwendung
JP2006516639A (ja) * 2003-02-01 2006-07-06 ニユーララブ・リミテツド 可溶性Ａ−βに対する抗体を生成させるための能動免疫
EP1596809B1 (en) 2003-02-10 2010-05-26 Applied Molecular Evolution, Inc. Abeta binding molecules
WO2005028511A2 (en) * 2003-03-28 2005-03-31 Centocor, Inc. Anti-amyloid antibodies, compositions, methods and uses
US7732162B2 (en) 2003-05-05 2010-06-08 Probiodrug Ag Inhibitors of glutaminyl cyclase for treating neurodegenerative diseases
US7358331B2 (en) * 2003-05-19 2008-04-15 Elan Pharmaceuticals, Inc. Truncated fragments of alpha-synuclein in Lewy body disease
EP1480041A1 (en) * 2003-05-22 2004-11-24 Innogenetics N.V. Method for the prediction, diagnosis and differential diagnosis of Alzheimer's disease
PE20050627A1 (es) * 2003-05-30 2005-08-10 Wyeth Corp Anticuerpos humanizados que reconocen el peptido beta amiloideo
CN1898266B (zh) * 2003-10-27 2011-09-21 惠氏公司 使用羟磷灰石层析除去高分子量聚集体
US7674599B2 (en) 2003-11-08 2010-03-09 Elan Pharmaceuticals, Inc. Methods of using antibodies to detect alpha-synuclein in fluid samples
PE20050925A1 (es) * 2003-11-10 2005-11-29 Schering Corp Anticuerpo recombinante humanizado anti-interleuquina 10
WO2005082939A2 (en) 2004-02-23 2005-09-09 Eli Lilly And Company Anti-abeta antibody
US20050225165A1 (en) * 2004-04-13 2005-10-13 Naik Sanjeev M Brake by-wire control system
AT500483B1 (de) * 2004-07-13 2006-01-15 Mattner Frank Dr Set zur vorbeugung oder behandlung der alzheimer'schen erkrankung
KR20070040824A (ko) * 2004-07-30 2007-04-17 리나트 뉴로사이언스 코퍼레이션 아밀로이드-베타 펩티드에 대해 지시된 항체 및 이의 사용방법
MX2007001679A (es) 2004-08-09 2007-05-23 Elan Pharm Inc Prevencion y tratamiento de la enfermedad sinucleinopatica y amiloidogenica.
US7300773B2 (en) 2004-08-27 2007-11-27 Wyeth Research Ireland Limited Production of TNFR-Ig
US7335491B2 (en) * 2004-08-27 2008-02-26 Wyeth Research Ireland Limited Production of anti-abeta
TWI384069B (zh) 2004-08-27 2013-02-01 Pfizer Ireland Pharmaceuticals 多胜肽之製法
MX2007003906A (es) * 2004-10-05 2007-05-21 Wyeth Corp Metodos y composiciones para mejorar la produccion de proteinas recombinantes.
WO2006066049A2 (en) * 2004-12-15 2006-06-22 Neuralab Limited Humanized antibodies that recognize beta amyloid peptide
PE20061329A1 (es) * 2004-12-15 2006-12-08 Neuralab Ltd Anticuerpos ab humanizados para mejorar la cognicion
JP2008524247A (ja) * 2004-12-15 2008-07-10 エラン ファーマ インターナショナル リミテッド 認知の改善における使用のためのアミロイドβ抗体
WO2006081171A1 (en) 2005-01-24 2006-08-03 Amgen Inc. Humanized anti-amyloid antibody
GT200600031A (es) 2005-01-28 2006-08-29 Formulacion anticuerpo anti a beta
JP2008528638A (ja) * 2005-01-28 2008-07-31 ワイス ポリペプチドの安定化液体処方
UY29504A1 (es) 2005-04-29 2006-10-31 Rinat Neuroscience Corp Anticuerpos dirigidos contra el péptido amiloide beta y métodos que utilizan los mismos.
AU2006259298B2 (en) * 2005-06-17 2012-06-14 Wyeth Llc Methods of purifying Fc region containing proteins
US9133267B2 (en) * 2005-11-22 2015-09-15 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Antibody treatment of Alzheimer's and related diseases
CN117903302A (zh) 2005-11-30 2024-04-19 Abbvie 公司 抗-Aβ球聚体抗体，其相关产品，生产所述抗体的方法，所述抗体的应用以及使用方法
PL1976877T5 (pl) 2005-11-30 2017-09-29 Abbvie Inc Przeciwciała monoklonalne przeciwko białku amyloidu beta oraz ich zastosowania
RU2551782C2 (ru) 2005-12-12 2015-05-27 Ац Иммуне Са Специфические в отношении амилоида бета (а бета) 1-42 моноклональные антитела, обладающие терапевтическими свойствами
KR101401159B1 (ko) 2005-12-12 2014-05-29 에프. 호프만-라 로슈 아게 가변 부위에 글리코실화를 가지는 아밀로이드 베타에 대한 항체
US8784810B2 (en) 2006-04-18 2014-07-22 Janssen Alzheimer Immunotherapy Treatment of amyloidogenic diseases
JP2009538924A (ja) * 2006-06-01 2009-11-12 エラン ファーマシューティカルズ，インコーポレイテッド Ａｐｐの神経活性断片
WO2008011348A2 (en) * 2006-07-14 2008-01-24 Ac Immune S.A. Humanized antibody against amyloid beta
RU2009111138A (ru) * 2006-10-12 2010-11-20 Вайет (Us) Способы и композиции с уменьшенной опалесценцией
US8188046B2 (en) 2006-10-16 2012-05-29 University Of South Florida Amyloid beta peptides and methods of use
US8455626B2 (en) 2006-11-30 2013-06-04 Abbott Laboratories Aβ conformer selective anti-aβ globulomer monoclonal antibodies
IL199534A (en) 2007-01-05 2013-01-31 Univ Zuerich An isolated human antibody capable of detecting a neoepitope in a disease-related protein, a polynucleotide encoding an antibody, a vector containing the polynucleotide, a host cell containing the polynucleotide or vector, a preparation containing the antibody and related methods and uses.
CA2764852C (en) 2007-01-05 2018-09-18 University Of Zurich Method of providing disease-specific binding molecules and targets
KR101160385B1 (ko) 2007-01-18 2012-07-10 일라이 릴리 앤드 캄파니 페길화된 Ａβ ＦＡＢ
US8147833B2 (en) * 2007-02-23 2012-04-03 Neotope Biosciences Limited Prevention and treatment of synucleinopathic and amyloidogenic disease
PT3067066T (pt) 2007-02-23 2019-06-17 Univ California Prevenção e tratamento da doença sinucleinopática e amiloidogénica
PL2118300T3 (pl) * 2007-02-23 2015-11-30 Prothena Biosciences Ltd Zapobieganie i leczenie synukleinopatii i amyloidozy
EP2486928A1 (en) 2007-02-27 2012-08-15 Abbott GmbH & Co. KG Method for the treatment of amyloidoses
WO2008106657A2 (en) * 2007-03-01 2008-09-04 Intezyne Technologies, Inc. Encapsulated amyloid-beta peptides
MX2009009234A (es) 2007-03-01 2009-12-01 Probiodrug Ag Uso nuevo de inhibidores de ciclasa de glutaminilo.
CA2684323A1 (en) * 2007-04-18 2008-10-30 Janssen Alzheimer Immunotherapy Prevention and treatment of cerebral amyloid angiopathy
EP2865670B1 (en) 2007-04-18 2017-01-11 Probiodrug AG Thiourea derivatives as glutaminyl cyclase inhibitors
US8003097B2 (en) 2007-04-18 2011-08-23 Janssen Alzheimer Immunotherapy Treatment of cerebral amyloid angiopathy
US7931899B2 (en) 2007-05-14 2011-04-26 Medtronic, Inc Humanized anti-amyloid beta antibodies
EP2152309B1 (en) 2007-05-14 2013-07-10 Medtronic, Inc. Methods and device to neutralize soluble toxic agents in the brain
US8323654B2 (en) * 2007-05-14 2012-12-04 Medtronic, Inc. Anti-amyloid beta antibodies conjugated to sialic acid-containing molecules
WO2008146854A1 (ja) * 2007-05-28 2008-12-04 National Institute Of Advanced Industrial Science And Technology 抗モータリン抗体のパラトープ及びエピトープ
JP5142265B2 (ja) 2007-05-28 2013-02-13 独立行政法人産業技術総合研究所 抗モータリン抗体のパラトープ及びエピトープ
TW201518320A (zh) * 2007-06-12 2015-05-16 Ac Immune Sa 特異性結合β-類澱粉蛋白之抗體及相關核酸分子、表現載體、細胞、組合物、套組、方法及用途
US8613923B2 (en) * 2007-06-12 2013-12-24 Ac Immune S.A. Monoclonal antibody
US8048420B2 (en) 2007-06-12 2011-11-01 Ac Immune S.A. Monoclonal antibody
WO2009002562A2 (en) 2007-06-27 2008-12-31 Marine Polymer Technologies, Inc. Complexes of il-15 and il-15ralpha and uses thereof
PL2182983T3 (pl) 2007-07-27 2014-10-31 Janssen Alzheimer Immunotherap Leczenie chorób amyloidowych z wykorzystaniem humanizowanych przeciwciał specyficznych względem Abeta
GB0718737D0 (en) * 2007-09-25 2007-11-07 Glaxo Group Ltd Antibodies
EP2586795B1 (en) * 2007-10-05 2018-05-16 Genentech, Inc. Use of anti-amyloid beta antibody in ocular diseases
JO3076B1 (ar) 2007-10-17 2017-03-15 Janssen Alzheimer Immunotherap نظم العلاج المناعي المعتمد على حالة apoe
US8445649B2 (en) 2007-10-29 2013-05-21 Tao Health Life Pharma Co., Ltd. Antibody and use thereof
NZ583632A (en) 2007-11-16 2012-05-25 Univ Rockefeller Antibodies specific for the protofibril form of beta-amyloid protein
WO2009070648A2 (en) * 2007-11-27 2009-06-04 Medtronic, Inc. Humanized anti-amyloid beta antibodies
WO2009079566A2 (en) 2007-12-18 2009-06-25 Acumen Pharmaceuticals, Inc. Novel addl receptor polypeptides, polynucleotides and host cells for recombinant production
US8414893B2 (en) * 2007-12-21 2013-04-09 Amgen Inc. Anti-amyloid antibodies and uses thereof
AU2015249034B2 (en) * 2007-12-28 2017-07-27 Prothena Biosciences Limited Treatment and prophylaxis of amyloidosis
JO2913B1 (en) 2008-02-20 2015-09-15 امجين إنك, Antibodies directed towards angiopoietin-1 and angiopoietin-2 proteins and their uses
AR072001A1 (es) 2008-06-03 2010-07-28 Abbott Lab Inmunoglobulina con dominio variable dual y usos de la misma
MX2011000875A (es) * 2008-07-21 2011-04-05 Probiodrug Ag Ensayo de anticuerpo de diagnostico.
US9067981B1 (en) 2008-10-30 2015-06-30 Janssen Sciences Ireland Uc Hybrid amyloid-beta antibodies
ES2699434T3 (es) * 2008-10-31 2019-02-11 Wyeth Llc Purificación de proteínas ácidas utilizando cromatografía de hidroxiapatita cerámica
US20110313134A1 (en) * 2008-11-06 2011-12-22 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Engineered antibodies with reduced immunogenicity and methods of making
SI2370466T1 (sl) 2008-12-19 2015-11-30 Biogen International Neuroscience Gmbh Človeška avtoprotitelesa proti alfa-sinukleinu
US8614297B2 (en) * 2008-12-22 2013-12-24 Hoffmann-La Roche Inc. Anti-idiotype antibody against an antibody against the amyloid β peptide
WO2010120561A1 (en) * 2009-04-01 2010-10-21 Genentech, Inc. Anti-fcrh5 antibodies and immunoconjugates and methods of use
FR2945538B1 (fr) 2009-05-12 2014-12-26 Sanofi Aventis Anticorps humanises specifiques de la forme protofibrillaire du peptide beta-amyloide.
EP3381937A3 (en) 2009-08-13 2018-10-31 The Johns Hopkins University Methods of modulating immune function
GB0914691D0 (en) * 2009-08-21 2009-09-30 Lonza Biologics Plc Immunoglobulin variants
ES2548913T3 (es) 2009-09-11 2015-10-21 Probiodrug Ag Derivados heterocíclicos como inhibidores de glutaminil ciclasa
NZ623607A (en) 2009-10-23 2016-07-29 Millennium Pharm Inc Anti-gcc antibody molecules and related compositions and methods
TWI509246B (zh) 2009-12-11 2015-11-21 Araclon Biotech Sl 用於改良偵測澱粉樣β肽類之方法與試劑
CN102781962B (zh) 2010-03-03 2014-12-10 阿布林克斯公司 双互补位A-β结合多肽
ES2586231T3 (es) 2010-03-03 2016-10-13 Probiodrug Ag Inhibidores de glutaminil ciclasa
AU2011226074B2 (en) 2010-03-10 2015-01-22 Vivoryon Therapeutics N.V. Heterocyclic inhibitors of glutaminyl cyclase (QC, EC 2.3.2.5)
CA2796339C (en) 2010-04-15 2020-03-31 Abbott Laboratories Amyloid-beta binding proteins
EP2560953B1 (en) 2010-04-21 2016-01-06 Probiodrug AG Inhibitors of glutaminyl cyclase
CN103179981B (zh) 2010-07-30 2017-02-08 Ac免疫有限公司 安全和功能性的人源化抗β‑淀粉样蛋白抗体
NZ707327A (en) 2010-08-02 2017-01-27 Regeneron Pharma Mice that make binding proteins comprising vl domains
AR082461A1 (es) 2010-08-03 2012-12-12 Abbott Lab Inmunoglobulinas con dominio variable dual y usos de las mismas
CA2808187A1 (en) 2010-08-14 2012-02-23 Abbvie Inc. Amyloid-beta binding proteins
KR20130139884A (ko) 2010-08-26 2013-12-23 애브비 인코포레이티드 이원 가변 도메인 면역글로불린 및 이의 용도
DE12192727T1 (de) 2011-02-25 2013-07-11 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. ADAM6 Mäuse
US8530670B2 (en) 2011-03-16 2013-09-10 Probiodrug Ag Inhibitors
EP2511296A1 (en) 2011-04-12 2012-10-17 Araclón Biotech, S. L. Antibody, kit and method for determination of amyloid peptides
DK2723379T3 (en) 2011-06-23 2018-10-15 Biogen Int Neuroscience Gmbh ANTI-ALPHA SYNUCLEIN BINDING MOLECULES
PT3572517T (pt) 2011-08-05 2021-06-23 Regeneron Pharma Murganhos da cadeia leve universal humanizada
JP2012034697A (ja) * 2011-09-16 2012-02-23 Janssen Alzheimer Immunotherapy βアミロイドペプチドを認識するヒト化抗体
PL2627773T3 (pl) 2011-10-17 2017-11-30 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Ograniczony łańcuch ciężki immonoglobuliny pochodzącej od myszy
PE20141568A1 (es) * 2011-10-28 2014-11-21 Neotope Biosciences Ltd Anticuerpos humanizados que reconocen la alfa-sinucleina
SI2793567T1 (sl) 2011-12-20 2019-05-31 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Humanizirane lahkoverižne miši
CA2861610A1 (en) 2011-12-30 2013-07-04 Abbvie Inc. Dual specific binding proteins directed against il-13 and/or il-17
SG11201406347TA (en) 2012-04-05 2014-11-27 Ac Immune Sa Humanized tau antibody
SG11201406855TA (en) 2012-04-27 2014-11-27 Millennium Pharm Inc Anti-gcc antibody molecules and use of same to test for susceptibility to gcc-targeted therapy
ME03551B (me) 2012-06-12 2020-07-20 Regeneron Pharma Humanizovane nehumane živoтinje sa ograničenim lokusima imunoglobulinskog тeškog lanca
CN105579061A (zh) * 2012-07-03 2016-05-11 杨森阿尔茨海默氏症免疫治疗公司 C端和中央表位的Aβ抗体
UA118441C2 (uk) 2012-10-08 2019-01-25 Протена Біосаєнсиз Лімітед Антитіло, що розпізнає альфа-синуклеїн
KR20210111353A (ko) 2012-11-01 2021-09-10 애브비 인코포레이티드 항-ｖｅｇｆ／ｄｌｌ4 이원 가변 도메인 면역글로불린 및 이의 용도
WO2014130690A1 (en) 2013-02-20 2014-08-28 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals with modified immunoglobulin heavy chain sequences
JP2016522793A (ja) 2013-03-15 2016-08-04 アッヴィ・インコーポレイテッド ＩＬ−１βおよび／またはＩＬ−１７に対して指向された二重特異的結合タンパク質
SG11201509566RA (en) 2013-05-20 2015-12-30 Genentech Inc Anti-transferrin receptor antibodies and methods of use
AR096687A1 (es) 2013-06-24 2016-01-27 Genentech Inc Anticuerpos anti-fcrh5
WO2015004633A1 (en) 2013-07-12 2015-01-15 Neotope Biosciences Limited Antibodies that recognize islet-amyloid polypeptide (iapp)
US9850302B2 (en) 2013-07-12 2017-12-26 Prothena Biosciences Limited Antibodies that recognize IAPP
BR122021025087B1 (pt) 2013-12-17 2023-04-04 Genentech, Inc Anticorpo anti-cd3, célula hospedeira procariótica, método de produção do anticorpo biespecífico, imunoconjugado, composição, uso do anticorpo biespecífico e kit
KR20160131082A (ko) 2014-03-12 2016-11-15 프로테나 바이오사이언시즈 리미티드 Lg1-3에 특이적인 항-라미닌4 항체
WO2015136472A1 (en) 2014-03-12 2015-09-17 Prothena Biosciences Limited Anti-laminin4 antibodies specific for lg4-5
SG10201808083VA (en) 2014-03-21 2018-10-30 Regeneron Pharma Vl antigen binding proteins exhibiting distinct binding characteristics
CN106255410B (zh) 2014-03-21 2020-01-10 瑞泽恩制药公司 产生单结构域结合蛋白的非人动物
WO2015155694A1 (en) 2014-04-08 2015-10-15 Prothena Biosciences Limited Blood-brain barrier shuttles containing antibodies recognizing alpha-synuclein
WO2015165961A1 (en) 2014-04-29 2015-11-05 Affiris Ag Treatment and prevention of alzheimer's disease (ad)
WO2015191934A2 (en) 2014-06-11 2015-12-17 Abbvie Inc. Blood-brain barrier (bbb) penetrating dual specific binding proteins for treating brain and neurological diseases
CN107001473B (zh) 2014-11-19 2021-07-09 豪夫迈·罗氏有限公司 抗-运铁蛋白受体抗体及使用方法
EP3221361B1 (en) 2014-11-19 2021-04-21 Genentech, Inc. Anti-transferrin receptor / anti-bace1 multispecific antibodies and methods of use
MA41115A (fr) 2014-12-02 2017-10-10 Biogen Int Neuroscience Gmbh Procédé de traitement de la maladie d'alzheimer
AU2015360579A1 (en) 2014-12-10 2017-05-18 Genentech, Inc. Blood brain barrier receptor antibodies and methods of use
WO2016094881A2 (en) 2014-12-11 2016-06-16 Abbvie Inc. Lrp-8 binding proteins
TWI786505B (zh) 2015-01-28 2022-12-11 愛爾蘭商普羅佘納生物科技有限公司 抗甲狀腺素運送蛋白抗體
TWI781507B (zh) 2015-01-28 2022-10-21 愛爾蘭商普羅佘納生物科技有限公司 抗甲狀腺素運送蛋白抗體
TWI711631B (zh) 2015-01-28 2020-12-01 愛爾蘭商普羅佘納生物科技有限公司 抗甲狀腺素運送蛋白抗體
CA2979702A1 (en) 2015-03-19 2016-09-22 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals that select for light chain variable regions that bind antigen
US20160314288A1 (en) * 2015-04-22 2016-10-27 Qualcomm Incorporated Method and apparatus for write restricted storage
TW201710286A (zh) 2015-06-15 2017-03-16 艾伯維有限公司 抗ｖｅｇｆ、ｐｄｇｆ及／或其受體之結合蛋白
AU2016280102B2 (en) 2015-06-16 2022-06-16 Genentech, Inc. Humanized and affinity matured antibodies to FcRH5 and methods of use
BR112017024610A2 (pt) 2015-06-24 2018-07-31 F. Hoffmann-La Roche Ag anticorpos para receptor antitransferrina com afinidade especificada
RU2753390C1 (ru) 2015-10-02 2021-08-13 Ф. Хоффманн-Ля Рош Аг Биспецифические антитела к человеческому cd20/человеческому рецептору трансферрина и способы их применения
AR106189A1 (es) 2015-10-02 2017-12-20 Hoffmann La Roche ANTICUERPOS BIESPECÍFICOS CONTRA EL A-b HUMANO Y EL RECEPTOR DE TRANSFERRINA HUMANO Y MÉTODOS DE USO
JP7452829B2 (ja) * 2015-11-09 2024-03-19 ザ・ユニバーシティ・オブ・ブリティッシュ・コロンビア アミロイドベータのエピトープおよびそれに対する抗体
KR20180088828A (ko) 2015-11-09 2018-08-07 더 유니버시티 오브 브리티쉬 콜롬비아 아밀로이드 베타에서의 n-말단 에피토프 및 이에 형태적으로-선택적인 항체
CN108350052A (zh) 2015-11-09 2018-07-31 英属哥伦比亚大学 淀粉样蛋白β中间区域中的表位及其构象选择性抗体
EP3452508A1 (en) 2016-05-02 2019-03-13 Prothena Biosciences Limited Antibodies recognizing tau
CA3022765A1 (en) 2016-05-02 2017-11-09 Prothena Biosciences Limited Antibodies recognizing tau
WO2018007922A2 (en) 2016-07-02 2018-01-11 Prothena Biosciences Limited Anti-transthyretin antibodies
WO2018007924A2 (en) 2016-07-02 2018-01-11 Prothena Biosciences Limited Anti-transthyretin antibodies
JP7016470B2 (ja) 2016-07-02 2022-02-07 プロセナ バイオサイエンシーズ リミテッド 抗トランスサイレチン抗体
US20180125920A1 (en) 2016-11-09 2018-05-10 The University Of British Columbia Methods for preventing and treating A-beta oligomer-associated and/or -induced diseases and conditions
KR20200030029A (ko) 2017-05-02 2020-03-19 프로테나 바이오사이언시즈 리미티드 타우 인식 항체
CA3073066A1 (en) 2017-08-22 2019-02-28 Biogen Ma Inc. Pharmaceutical compositions containing anti-beta amyloid antibodies
DK3461819T3 (da) 2017-09-29 2020-08-10 Probiodrug Ag Inhibitorer af glutaminylcyklase
US20220031867A1 (en) 2018-10-04 2022-02-03 University Of Rochester Glymphatic delivery by manipulating plasma osmolarity
TW202035442A (zh) 2018-12-20 2020-10-01 美商建南德克公司 經修飾之抗體Fc及其使用方法
PE20212324A1 (es) 2019-03-03 2021-12-14 Prothena Biosciences Ltd Anticuerpos que reconocen tau
TW202216760A (zh) 2020-07-23 2022-05-01 愛爾蘭商歐薩爾普羅席納有限公司 抗類澱粉β (ABETA)抗體
TW202300517A (zh) 2021-03-12 2023-01-01 美商美國禮來大藥廠 抗類澱粉β抗體及其用途
WO2022251048A1 (en) 2021-05-24 2022-12-01 Eli Lilly And Company Anti-amyloid beta antibodies and uses thereof

Family Cites Families (193)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4704362A (en) 1977-11-08 1987-11-03 Genentech, Inc. Recombinant cloning vehicle microbial polypeptide expression
CH652145A5 (de) 1982-01-22 1985-10-31 Sandoz Ag Verfahren zur in vitro-herstellung von hybridomen welche humane monoklonale antikoerper erzeugen.
JPS58210302A (ja) * 1982-05-31 1983-12-07 Ngk Insulators Ltd セラミツクロ−タ−
GB8308235D0 (en) 1983-03-25 1983-05-05 Celltech Ltd Polypeptides
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4634666A (en) 1984-01-06 1987-01-06 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Human-murine hybridoma fusion partner
US5208036A (en) 1985-01-07 1993-05-04 Syntex (U.S.A.) Inc. N-(ω, (ω-1)-dialkyloxy)- and N-(ω, (ω-1)-dialkenyloxy)-alk-1-yl-N,N,N-tetrasubstituted ammonium lipids and uses therefor
US4666829A (en) 1985-05-15 1987-05-19 University Of California Polypeptide marker for Alzheimer's disease and its use for diagnosis
US5618920A (en) 1985-11-01 1997-04-08 Xoma Corporation Modular assembly of antibody genes, antibodies prepared thereby and use
JPS63501765A (ja) 1985-11-01 1988-07-21 インタ−ナショナル、ジェネティック、エンジニアリング　インコ−ポレ−テッド 抗体遺伝子のモジュ−ル組立体、それにより産生された抗体及び用途
US4713366A (en) 1985-12-04 1987-12-15 The Ohio State University Research Foundation Antigenic modification of polypeptides
US5096706A (en) 1986-03-25 1992-03-17 National Research Development Corporation Antigen-based treatment for adiposity
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
US6548640B1 (en) * 1986-03-27 2003-04-15 Btg International Limited Altered antibodies
US5278049A (en) 1986-06-03 1994-01-11 Incyte Pharmaceuticals, Inc. Recombinant molecule encoding human protease nexin
US5231170A (en) 1986-08-27 1993-07-27 Paul Averback Antibodies to dense microspheres
US5187153A (en) 1986-11-17 1993-02-16 Scios Nova Inc. Methods of treatment using Alzheimer's amyloid polypeptide derivatives
US5220013A (en) 1986-11-17 1993-06-15 Scios Nova Inc. DNA sequence useful for the detection of Alzheimer's disease
US5389677B1 (en) * 1986-12-23 1997-07-15 Tristrata Inc Method of treating wrinkles using glycalic acid
EP0832981A1 (en) 1987-02-17 1998-04-01 Pharming B.V. DNA sequences to target proteins to the mammary gland for efficient secretion
US4912206A (en) 1987-02-26 1990-03-27 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services CDNA clone encoding brain amyloid of alzheimer's disease
WO1988007089A1 (en) 1987-03-18 1988-09-22 Medical Research Council Altered antibodies
US4883666A (en) 1987-04-29 1989-11-28 Massachusetts Institute Of Technology Controlled drug delivery system for treatment of neural disorders
US5258498A (en) 1987-05-21 1993-11-02 Creative Biomolecules, Inc. Polypeptide linkers for production of biosynthetic proteins
US5245015A (en) 1991-04-26 1993-09-14 Tanox Biosystems, Inc. Monoclonal antibodies which neutralize HIV-1 through reaction with a conformational epitope in vitro
US5057540A (en) 1987-05-29 1991-10-15 Cambridge Biotech Corporation Saponin adjuvant
US5583112A (en) 1987-05-29 1996-12-10 Cambridge Biotech Corporation Saponin-antigen conjugates and the use thereof
US5571499A (en) 1987-06-24 1996-11-05 Autoimmune, Inc. Treatment of autoimmune diseases by aerosol administration of autoantigens
US5571500A (en) 1987-06-24 1996-11-05 Autoimmune, Inc. Treatment of autoimmune diseases through administration by inhalation of autoantigens
US5849298A (en) 1987-06-24 1998-12-15 Autoimmune Inc. Treatment of multiple sclerosis by oral administration of bovine myelin
US5869054A (en) 1987-06-24 1999-02-09 Autoimmune Inc. Treatment of multiple sclerosis by oral administration of autoantigens
US5641474A (en) 1987-06-24 1997-06-24 Autoimmune, Inc. Prevention of autoimmune diseases by aerosol administration of autoantigens
US5645820A (en) 1987-06-24 1997-07-08 Autoimmune, Inc. Treatment of autoimmune diseases by aerosol administration of autoantigens
US5004697A (en) 1987-08-17 1991-04-02 Univ. Of Ca Cationized antibodies for delivery through the blood-brain barrier
US5677425A (en) 1987-09-04 1997-10-14 Celltech Therapeutics Limited Recombinant antibody
US5231000A (en) 1987-10-08 1993-07-27 The Mclean Hospital Antibodies to A4 amyloid peptide
US5089603A (en) * 1989-06-21 1992-02-18 Tanox Biosystems, Inc. Antigenic epitopes present on membrane-bound but not secreted iga
US5576184A (en) 1988-09-06 1996-11-19 Xoma Corporation Production of chimeric mouse-human antibodies with specificity to human tumor antigens
IL162181A (en) 1988-12-28 2006-04-10 Pdl Biopharma Inc A method of producing humanized immunoglubulin, and polynucleotides encoding the same
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US5227159A (en) * 1989-01-31 1993-07-13 Miller Richard A Anti-idiotype antibodies reactive with shared idiotopes expressed by B cell lymphomas and autoantibodies
US5399346A (en) 1989-06-14 1995-03-21 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Gene therapy
US5633076A (en) 1989-12-01 1997-05-27 Pharming Bv Method of producing a transgenic bovine or transgenic bovine embryo
GB8928874D0 (en) * 1989-12-21 1990-02-28 Celltech Ltd Humanised antibodies
US5859205A (en) 1989-12-21 1999-01-12 Celltech Limited Humanised antibodies
EP1690935A3 (en) 1990-01-12 2008-07-30 Abgenix, Inc. Generation of xenogeneic antibodies
US5279833A (en) 1990-04-04 1994-01-18 Yale University Liposomal transfection of nucleic acids into animal cells
US5264618A (en) 1990-04-19 1993-11-23 Vical, Inc. Cationic lipids for intracellular delivery of biologically active molecules
EP0527823A1 (en) 1990-04-24 1993-02-24 The Regents Of The University Of California Purification, detection and methods of use of protease nexin-2
US5753624A (en) 1990-04-27 1998-05-19 Milkhaus Laboratory, Inc. Materials and methods for treatment of plaquing disease
EP0526511B1 (en) 1990-04-27 1997-05-28 MCMICHAEL, John Method and composition for treatment of central nervous systems disease states associated with abnormal amyloid beta protein
US5427908A (en) 1990-05-01 1995-06-27 Affymax Technologies N.V. Recombinant library screening methods
US5593970A (en) 1990-06-11 1997-01-14 Biochem Pharma Inc. Heterocyclic anthracycline analogs
ES2217250T3 (es) 1990-06-15 2004-11-01 Scios Inc. Mamifero transgenico, no humano que muestra la patologia de formacion amiloides de la enfermedad de alzheimer.
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
DK0585287T3 (da) 1990-07-10 2000-04-17 Cambridge Antibody Tech Fremgangsmåde til fremstilling af specifikke bindingsparelementer
US5780587A (en) 1990-08-24 1998-07-14 President And Fellows Of Harvard College Compounds and methods for inhibiting β-protein filament formation and neurotoxicity
US5661016A (en) 1990-08-29 1997-08-26 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5633425A (en) 1990-08-29 1997-05-27 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
WO1993012227A1 (en) 1991-12-17 1993-06-24 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5877397A (en) 1990-08-29 1999-03-02 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5770429A (en) 1990-08-29 1998-06-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5625126A (en) 1990-08-29 1997-04-29 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5814318A (en) 1990-08-29 1998-09-29 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5789650A (en) 1990-08-29 1998-08-04 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
DK0546073T3 (da) 1990-08-29 1998-02-02 Genpharm Int Frembringelse og anvendelse af transgene, ikke-humane dyr, der er i stand til at danne heterologe antistoffer
US5874299A (en) 1990-08-29 1999-02-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5702906A (en) 1990-09-25 1997-12-30 Genentech, Inc. Antibodies to neurotrophic factor-4 (NT-4)
ES2236682T5 (es) 1991-01-21 2011-03-31 Elan Pharmaceuticals, Inc. Ensayo y modelo para la enfermedad de alzheimer.
US5192753A (en) 1991-04-23 1993-03-09 Mcgeer Patrick L Anti-rheumatoid arthritic drugs in the treatment of dementia
US5858657A (en) 1992-05-15 1999-01-12 Medical Research Council Methods for producing members of specific binding pairs
US5871907A (en) 1991-05-15 1999-02-16 Medical Research Council Methods for producing members of specific binding pairs
DK0590058T3 (da) * 1991-06-14 2004-03-29 Genentech Inc Humaniseret heregulin-antistof
WO1994004679A1 (en) 1991-06-14 1994-03-03 Genentech, Inc. Method for making humanized antibodies
US5434050A (en) 1991-08-13 1995-07-18 Regents Of The University Of Minnesota Labelled β-amyloid peptide and methods of screening for Alzheimer's disease
US5283185A (en) 1991-08-28 1994-02-01 University Of Tennessee Research Corporation Method for delivering nucleic acids into cells
US5565332A (en) 1991-09-23 1996-10-15 Medical Research Council Production of chimeric antibodies - a combinatorial approach
US5837268A (en) 1991-10-16 1998-11-17 University Of Saskatchewan GnRH-leukotoxin chimeras
US5679348A (en) 1992-02-03 1997-10-21 Cedars-Sinai Medical Center Immunotherapy for recurrent HSV infections
CA2129899C (en) 1992-02-11 2011-01-04 James J. Mond Dual carrier immunogenic construct
US5714350A (en) * 1992-03-09 1998-02-03 Protein Design Labs, Inc. Increasing antibody affinity by altering glycosylation in the immunoglobulin variable region
US5733743A (en) 1992-03-24 1998-03-31 Cambridge Antibody Technology Limited Methods for producing members of specific binding pairs
US5441870A (en) 1992-04-15 1995-08-15 Athena Neurosciences, Inc. Methods for monitoring cellular processing of β-amyloid precursor protein
US5604102A (en) 1992-04-15 1997-02-18 Athena Neurosciences, Inc. Methods of screening for β-amyloid peptide production inhibitors
US5851787A (en) 1992-04-20 1998-12-22 The General Hospital Corporation Nucleic acid encoding amyloid precursor-like protein and uses thereof
WO1993022332A2 (en) 1992-04-24 1993-11-11 Board Of Regents, The University Of Texas System Recombinant production of immunoglobulin-like domains in prokaryotic cells
WO1993025210A1 (en) * 1992-06-18 1993-12-23 President And Fellows Of Harvard College Diphtheria toxin vaccines
US5766846A (en) 1992-07-10 1998-06-16 Athena Neurosciences Methods of screening for compounds which inhibit soluble β-amyloid peptide production
US5837672A (en) 1992-07-10 1998-11-17 Athena Neurosciences, Inc. Methods and compositions for the detection of soluble β-amyloid peptide
BR9306984A (pt) 1992-08-27 1999-01-12 Deakin Res Ltd Análogo de antígeno de peptídeo de um antígeno de peptídeo nativo vacina anticorpo processo para vacinar um hospedeiro necessitando deste tratamento estojo diagnóstico processos para preparar um análogo de um antiígeno de um antígeno de peptídeo nativo para preparar uma vacina para analisar uma amostra para um antígeno de peptídeo nativo e para analisar uma amostra para um anticorpo
US5958883A (en) 1992-09-23 1999-09-28 Board Of Regents Of The University Of Washington Office Of Technology Animal models of human amyloidoses
US5605811A (en) 1992-10-26 1997-02-25 Athena Neurosciences, Inc. Methods and compositions for monitoring cellular processing of beta-amyloid precursor protein
US6210671B1 (en) * 1992-12-01 2001-04-03 Protein Design Labs, Inc. Humanized antibodies reactive with L-selectin
WO1994012629A1 (en) 1992-12-02 1994-06-09 Baylor College Of Medicine Episomal vectors for gene therapy
DK0672142T3 (da) 1992-12-04 2001-06-18 Medical Res Council Multivalente og multispecifikke bindingsproteiner samt fremstilling og anvendelse af disse
EP0683234B2 (en) 1993-01-25 2007-06-06 Takeda Chemical Industries, Ltd. Antibody against beta-amyloid or their derivative and use thereof
US5955317A (en) 1993-01-25 1999-09-21 Takeda Chemical Industries, Ltd. Antibodies to β-amyloids or their derivatives and use thereof
DE614989T1 (de) 1993-02-17 1995-09-28 Morphosys Proteinoptimierung Verfahren für in vivo Selektion von Ligandenbindende Proteine.
EP0689551B1 (en) * 1993-03-17 2008-02-20 THE GOVERNMENT OF THE UNITED STATES OF AMERICA, as represented by THE SECRETARY, DEPARTMENT OF HEALTH AND HUMAN SERVICES Immunogenic chimeras comprising nucleic acid sequences encoding endoplasmic reticulum signal sequence peptides and at least one other peptide, and their uses in vaccines and disease treatments
CN1087176C (zh) 1993-03-23 2002-07-10 史密斯克莱·比奇曼生物公司 含有3－o脱酰基单磷酰脂a的疫苗制剂
IT1270939B (it) 1993-05-11 1997-05-26 Angeletti P Ist Richerche Bio Procedimento per la preparazione di immunogeni e reagenti diagnostici,e immunogeni e reagenti diagnostici cosi' ottenibili.
US5464823A (en) 1993-07-20 1995-11-07 The Regents Of The University Of California Mammalian antibiotic peptides
AU705889B2 (en) 1993-08-26 1999-06-03 Regents Of The University Of California, The Method, compositions and devices for administration of naked polynucleotides which encode antigens and immunostimulatory peptides
US5652334A (en) 1993-09-08 1997-07-29 City Of Hope Method for design of substances that enhance memory and improve the quality of life
US5385887A (en) * 1993-09-10 1995-01-31 Genetics Institute, Inc. Formulations for delivery of osteogenic proteins
DK0735893T3 (da) 1993-09-14 2009-03-09 Pharmexa Inc PAN DR-bindende peptider til styrkelse af immunsvaret
US5470951A (en) 1993-09-29 1995-11-28 City Of Hope Peptides for antagonizing the effects of amyloid βprotein
US5858981A (en) * 1993-09-30 1999-01-12 University Of Pennsylvania Method of inhibiting phagocytosis
JP3504963B2 (ja) * 1993-10-22 2004-03-08 智靖 羅 抗ヒト高親和性ＩｇＥ受容体モノクローナル抗体に係るアミノ酸配列をコードするＤＮＡ断片
US5744368A (en) 1993-11-04 1998-04-28 Research Foundation Of State University Of New York Methods for the detection of soluble amyloid β-protein (βAP) or soluble transthyretin (TTR)
US5827690A (en) 1993-12-20 1998-10-27 Genzyme Transgenics Corporatiion Transgenic production of antibodies in milk
US5434170A (en) 1993-12-23 1995-07-18 Andrulis Pharmaceuticals Corp. Method for treating neurocognitive disorders
US5877218A (en) 1994-01-10 1999-03-02 Teva Pharmaceutical Industries, Ltd. Compositions containing and methods of using 1-aminoindan and derivatives thereof and process for preparing optically active 1-aminoindan derivatives
WO1995020666A2 (en) 1994-01-27 1995-08-03 Regents Of The University Of Minnesota Transgenic non-human mammals with progressive neurologic disease
US5877399A (en) 1994-01-27 1999-03-02 Johns Hopkins University Transgenic mice expressing APP-Swedish mutation develop progressive neurologic disease
AU692237B2 (en) 1994-02-03 1998-06-04 Picower Institute For Medical Research, The Compositions and methods for advanced glycosylation endproduct-mediated modulation of amyloidosis
CA2122573A1 (en) * 1994-04-13 1995-10-14 John M. Pratt Dynamic electronic mail facility for applications executing in an integrated operating environment
US6372716B1 (en) * 1994-04-26 2002-04-16 Genetics Institute, Inc. Formulations for factor IX
US5505947A (en) 1994-05-27 1996-04-09 The University Of North Carolina At Chapel Hill Attenuating mutations in Venezuelan Equine Encephalitis virus
US5622701A (en) 1994-06-14 1997-04-22 Protein Design Labs, Inc. Cross-reacting monoclonal antibodies specific for E- and P-selectin
US6417178B1 (en) * 1994-07-19 2002-07-09 University Of Pittsburgh Amyloid binding nitrogen-linked compounds for the antemortem diagnosis of alzheimer's disease, in vivo imaging and prevention of amyloid deposits
US6114133A (en) 1994-11-14 2000-09-05 Elan Pharmaceuticals, Inc. Methods for aiding in the diagnosis of Alzheimer's disease by measuring amyloid-β peptide (x-≧41)
US5589154A (en) 1994-11-22 1996-12-31 Rutgers, The State University Of New Jersey Methods for the prevention or treatment of vascular hemorrhaging and Alzheimer's disease
US5688651A (en) 1994-12-16 1997-11-18 Ramot University Authority For Applied Research And Development Ltd. Prevention of protein aggregation
WO1996024369A1 (en) * 1995-02-06 1996-08-15 Genetics Institute, Inc. Formulations for il-12
US5786180A (en) 1995-02-14 1998-07-28 Bayer Corporation Monoclonal antibody 369.2B specific for β A4 peptide
US5624937A (en) * 1995-03-02 1997-04-29 Eli Lilly And Company Chemical compounds as inhibitors of amyloid beta protein production
US6303567B1 (en) 1995-03-14 2001-10-16 Praecis Pharmaceuticals, Inc . Modulators of β-amyloid peptide aggregation comprising D-amino acids
US5854215A (en) 1995-03-14 1998-12-29 Praecis Pharmaceuticals Incorporated Modulators of β-amyloid peptide aggregation
US5817626A (en) 1995-03-14 1998-10-06 Praecis Pharmaceuticals Incorporated Modulators of beta-amyloid peptide aggregation
CA2214247C (en) 1995-03-14 2004-02-10 Praecis Pharmaceuticals Incorporated Modulators of amyloid aggregation
US6121022A (en) 1995-04-14 2000-09-19 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US5869046A (en) 1995-04-14 1999-02-09 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US7153510B1 (en) 1995-05-04 2006-12-26 Yale University Recombinant vesiculoviruses and their uses
EP0750907B1 (en) 1995-06-30 2002-03-20 American Cyanamid Company Stable macrolide and macrolide vaccine compositions
US5824322A (en) 1995-08-21 1998-10-20 Cytrx Corporation Compositions and methods for growth promotion
AU707484B2 (en) * 1995-09-14 1999-07-08 Regents Of The University Of California, The Antibodies specific for native PrPsc
US5731284A (en) * 1995-09-28 1998-03-24 Amgen Inc. Method for treating Alzheimer's disease using glial line-derived neurotrophic factor (GDNF) protein product
US5985242A (en) 1995-10-27 1999-11-16 Praecis Pharmaceuticals, Inc. Modulators of β-amyloid peptide aggregation comprising D-amino acids
US5750361A (en) 1995-11-02 1998-05-12 The Regents Of The University Of California Formation and use of prion protein (PRP) complexes
AU1072897A (en) 1995-12-12 1997-07-03 Karolinska Innovations Ab Peptide binding the klvff-sequence of amyloid beta
US5770700A (en) * 1996-01-25 1998-06-23 Genetics Institute, Inc. Liquid factor IX formulations
EP0787764B1 (en) * 1996-02-03 2003-04-09 Mitsubishi Gas Chemical Company, Inc. Oxygen-absorbing resin composition and packing material, multi-layered packing material, package and packing method using the same
US6150091A (en) 1996-03-06 2000-11-21 Baylor College Of Medicine Direct molecular diagnosis of Friedreich ataxia
US6284533B1 (en) 1996-05-01 2001-09-04 Avant Immunotherapeutics, Inc. Plasmid-based vaccine for treating atherosclerosis
TW373320B (en) * 1996-05-27 1999-11-01 United Microelectronics Corporaiton Structure and production method of capacitor of dynamic RAM
US6057367A (en) 1996-08-30 2000-05-02 Duke University Manipulating nitrosative stress to kill pathologic microbes, pathologic helminths and pathologically proliferating cells or to upregulate nitrosative stress defenses
US6022859A (en) 1996-11-15 2000-02-08 Wisconsin Alumni Research Foundation Inhibitors of β-amyloid toxicity
US6218506B1 (en) 1997-02-05 2001-04-17 Northwestern University Amyloid β protein (globular assembly and uses thereof)
US20030068316A1 (en) * 1997-02-05 2003-04-10 Klein William L. Anti-ADDL antibodies and uses thereof
US6277375B1 (en) 1997-03-03 2001-08-21 Board Of Regents, The University Of Texas System Immunoglobulin-like domains with increased half-lives
US5798102A (en) 1997-03-04 1998-08-25 Milkhaus Laboratory, Inc. Treatment of cardiomyopathy
US20020086847A1 (en) * 1997-04-09 2002-07-04 Mindset Biopharmaceuticals (Usa) Recombinant antibodies specific for beta-amyloid ends, DNA encoding and methods of use thereof
US8173127B2 (en) * 1997-04-09 2012-05-08 Intellect Neurosciences, Inc. Specific antibodies to amyloid beta peptide, pharmaceutical compositions and methods of use thereof
US6787319B2 (en) * 1997-04-16 2004-09-07 American Home Products Corp. β-amyloid peptide-binding proteins and polynucleotides encoding the same
US6339068B1 (en) * 1997-05-20 2002-01-15 University Of Iowa Research Foundation Vectors and methods for immunization or therapeutic protocols
US6175057B1 (en) * 1997-10-08 2001-01-16 The Regents Of The University Of California Transgenic mouse model of alzheimer's disease and cerebral amyloid angiopathy
US6710226B1 (en) * 1997-12-02 2004-03-23 Neuralab Limited Transgenic mouse assay to determine the effect of Aβ antibodies and Aβ Fragments on alzheimer's disease characteristics
TWI239847B (en) * 1997-12-02 2005-09-21 Elan Pharm Inc N-terminal fragment of Abeta peptide and an adjuvant for preventing and treating amyloidogenic disease
US6750324B1 (en) * 1997-12-02 2004-06-15 Neuralab Limited Humanized and chimeric N-terminal amyloid beta-antibodies
US7964192B1 (en) * 1997-12-02 2011-06-21 Janssen Alzheimer Immunotherapy Prevention and treatment of amyloidgenic disease
US6743427B1 (en) * 1997-12-02 2004-06-01 Neuralab Limited Prevention and treatment of amyloidogenic disease
US20080050367A1 (en) * 1998-04-07 2008-02-28 Guriq Basi Humanized antibodies that recognize beta amyloid peptide
US6787523B1 (en) * 1997-12-02 2004-09-07 Neuralab Limited Prevention and treatment of amyloidogenic disease
US6913745B1 (en) * 1997-12-02 2005-07-05 Neuralab Limited Passive immunization of Alzheimer's disease
US7179892B2 (en) * 2000-12-06 2007-02-20 Neuralab Limited Humanized antibodies that recognize beta amyloid peptide
US6528624B1 (en) * 1998-04-02 2003-03-04 Genentech, Inc. Polypeptide variants
US6194551B1 (en) 1998-04-02 2001-02-27 Genentech, Inc. Polypeptide variants
US20050059591A1 (en) * 1998-04-07 2005-03-17 Neuralab Limited Prevention and treatment of amyloidogenic disease
US20050059802A1 (en) * 1998-04-07 2005-03-17 Neuralab Ltd Prevention and treatment of amyloidogenic disease
JP2002512776A (ja) * 1998-04-28 2002-05-08 スミスクライン・ビーチャム・コーポレイション 免疫原性の低下したモノクローナル抗体
US20030147882A1 (en) * 1998-05-21 2003-08-07 Alan Solomon Methods for amyloid removal using anti-amyloid antibodies
US6727349B1 (en) * 1998-07-23 2004-04-27 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Recombinant anti-CCR2 antibodies and methods of use therefor
CA2354862A1 (en) * 1998-10-19 2000-04-27 Yeda Research And Development Co. Ltd. Treatment of systemic lupus erythematosus by down-regulating the autoimmune response to autoantigens
US6441870B1 (en) * 1998-12-22 2002-08-27 Gateway, Inc. Automatic gamma correction for multiple video sources
DK1409654T3 (da) * 1999-06-16 2008-12-08 Boston Biomedical Res Inst Immunologisk styring af beta-amyloid-niveauer in vivo
US6264335B1 (en) * 1999-06-25 2001-07-24 James C. Bass, Sr. Light-reflective marking clip
US6756378B2 (en) * 1999-06-30 2004-06-29 Pharmacopeia Drug Discovery, Inc. VLA-4 inhibitor compounds
US6294171B2 (en) 1999-09-14 2001-09-25 Milkhaus Laboratory, Inc. Methods for treating disease states comprising administration of low levels of antibodies
US20020094335A1 (en) * 1999-11-29 2002-07-18 Robert Chalifour Vaccine for the prevention and treatment of alzheimer's and amyloid related diseases
US6399314B1 (en) 1999-12-29 2002-06-04 American Cyanamid Company Methods of detection of amyloidogenic proteins
IL151378A0 (en) * 2000-02-24 2003-04-10 Univ Washington Humanized antibodies that sequester amyloid beta peptide
JP2003534351A (ja) * 2000-05-22 2003-11-18 ニュー・ヨーク・ユニヴァーシティー アミロイドβ及びアミロイド沈着物に対する免疫応答誘導のための、アミロイドβと相同的な、合成の、免疫原性だが非アミロイド原性ペプチド
US20020009445A1 (en) * 2000-07-12 2002-01-24 Yansheng Du Human beta-amyloid antibody and use thereof for treatment of alzheimer's disease
US20030092145A1 (en) * 2000-08-24 2003-05-15 Vic Jira Viral vaccine composition, process, and methods of use
PE20020574A1 (es) * 2000-12-06 2002-07-02 Wyeth Corp Anticuerpos humanizados que reconocen el peptido amiloideo beta
ES2312569T3 (es) * 2001-04-30 2009-03-01 Eli Lilly And Company Anticuerpos humanizados.
ES2437875T3 (es) * 2001-04-30 2014-01-14 Eli Lilly And Company Anticuerpos humanizados que reconocen el péptido beta-amiloide
US6906169B2 (en) * 2001-05-25 2005-06-14 United Biomedical, Inc. Immunogenic peptide composition comprising measles virus Fprotein Thelper cell epitope (MUFThl-16) and N-terminus of β-amyloid peptide
US6733547B2 (en) * 2001-12-10 2004-05-11 Delphi Technologies, Inc. Method of making a paste composition for lead acid battery
MY139983A (en) * 2002-03-12 2009-11-30 Janssen Alzheimer Immunotherap Humanized antibodies that recognize beta amyloid peptide
PE20050627A1 (es) * 2003-05-30 2005-08-10 Wyeth Corp Anticuerpos humanizados que reconocen el peptido beta amiloideo

Also Published As

Publication number Publication date
CN101081868A (zh) 2007-12-05
JP4166569B2 (ja) 2008-10-15
EA200602015A1 (ru) 2007-02-27
WO2002046237A2 (en) 2002-06-13
CZ20031601A3 (cs) 2003-12-17
KR20030066695A (ko) 2003-08-09
JP2009159981A (ja) 2009-07-23
HUP0302589A2 (hu) 2003-10-28
CA2430772C (en) 2010-11-30
IL156030A0 (en) 2003-12-23
HK1070904A1 (en) 2005-06-30
CN101081867A (zh) 2007-12-05
NO20032549D0 (no) 2003-06-05
US7582733B2 (en) 2009-09-01
ZA200305169B (en) 2004-07-09
JP4944149B2 (ja) 2012-05-30
AU2002225921B8 (en) 2008-07-31
NZ526813A (en) 2006-10-27
CY1108740T1 (el) 2014-04-09
PE20020574A1 (es) 2002-07-02
DE60136651D1 (de) 2009-01-02
MXPA03005048A (es) 2004-09-10
PL366341A1 (en) 2005-01-24
DK1358213T3 (da) 2009-03-02
US7189819B2 (en) 2007-03-13
MY162171A (en) 2017-05-31
KR100996936B1 (ko) 2010-11-29
JP2008073051A (ja) 2008-04-03
WO2002046237A3 (en) 2003-09-04
NO339290B1 (no) 2016-11-21
IS2620B (is) 2010-05-15
US20050009150A1 (en) 2005-01-13
CA2430772A1 (en) 2002-06-13
HU229681B1 (en) 2014-04-28
EA011450B1 (ru) 2009-02-27
AR035402A1 (es) 2004-05-26
AU2592102A (en) 2002-06-18
JP5059541B2 (ja) 2012-10-24
HRP20030547A8 (en) 2010-05-31
AU2002225921B2 (en) 2008-07-10
NO20032549L (no) 2003-08-05
SI1358213T1 (sl) 2009-04-30
EP2045267A2 (en) 2009-04-08
ES2317953T3 (es) 2009-05-01
MY163362A (en) 2017-09-15
EE05309B1 (et) 2010-06-15
BG107850A (bg) 2004-02-27
ATE414719T1 (de) 2008-12-15
IL156030A (en) 2009-06-15
NZ546621A (en) 2008-09-26
PL211761B1 (pl) 2012-06-29
UY27062A1 (es) 2002-07-31
EP1358213A2 (en) 2003-11-05
GEP20084339B (en) 2008-03-25
JP2005500808A (ja) 2005-01-13
HRP20030547A2 (en) 2005-06-30
NZ546620A (en) 2008-04-30
CN100448893C (zh) 2009-01-07
IS6848A (is) 2003-06-16
EP1358213B1 (en) 2008-11-19
EP2045267A3 (en) 2010-12-08
JP2008099694A (ja) 2008-05-01
US20030165496A1 (en) 2003-09-04
EA010469B1 (ru) 2008-08-29
CN1541225A (zh) 2004-10-27
JP2008073052A (ja) 2008-04-03
CN101081869A (zh) 2007-12-05
HUP0302589A3 (en) 2008-03-28
ECSP034685A (es) 2003-09-24
EA200300637A1 (ru) 2004-06-24
BR0115978A (pt) 2005-05-03
KR20070004139A (ko) 2007-01-05
TWI255272B (en) 2006-05-21
JP2012147797A (ja) 2012-08-09
PT1358213E (pt) 2009-01-28
SK8502003A3 (en) 2004-03-02
UA87093C2 (ru) 2009-06-25
BG66292B1 (en) 2013-02-28
EE200300264A (et) 2003-10-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
SK288209B6 (sk) Humanizované protilátky, ktoré spoznajú beta-amyloidový peptid, izolovaná nukleová kyselina, ktorá ich kóduje, vektor, izolovaná hostiteľská bunka, farmaceutická kompozícia s ich obsahom a spôsob ich prípravy
CA2518275C (en) Humanized antibodies that recognize beta amyloid peptide
US7893214B2 (en) Humanized antibodies that recognize beta amyloid peptide
US7790856B2 (en) Humanized antibodies that recognize beta amyloid peptide
US7700751B2 (en) Humanized antibodies that recognize β-amyloid peptide
US20050249725A1 (en) Humanized antibodies that recognize beta amyloid peptide
AU2007231640B2 (en) Humanized antibodies that recognize beta amyloid peptide
JP2012034697A (ja) βアミロイドペプチドを認識するヒト化抗体

Legal Events

Date Code Title Description
TC4A Change of owner's name

Owner name: WYETH LLC, MADISON, NJ, US

Effective date: 20100623

PC4A Assignment and transfer of rights

Owner name: WYETH LLC, MADISON, NJ, US

Free format text: FORMER OWNER: ELAN PHARMA INTERNATIONAL LIMITED, DUBLIN 2, IE; WYETH LLC , MADISON, NJ, US

Effective date: 20140325

Owner name: WYETH LLC, MADISON, NJ, US

Free format text: FORMER OWNER: CRIMAGUA LIMITED, DUBLIN 2, IE; WYETH LLC, MADISON, NJ, US

Effective date: 20140327

Owner name: CRIMAGUA LIMITED, DUBLIN 2, IE

Free format text: FORMER OWNER: ELAN PHARMA INTERNATIONAL LIMITED, DUBLIN 2, IE; WYETH LLC , MADISON, NJ, US

Effective date: 20140325

Owner name: JANSSEN ALZHEIMER IMMUNOTHERAPY, DUBLIN 24, IE

Free format text: FORMER OWNER: CRIMAGUA LIMITED, DUBLIN 2, IE; WYETH LLC, MADISON, NJ, US

Effective date: 20140327

TE4A Change of owner's address

Owner name: WYETH LLC, MADISON, NJ, US

Effective date: 20140507

Owner name: ELAN PHARMA INTERNATIONAL LIMITED, DUBLIN 2, IE

Effective date: 20140507

MM4A Patent lapsed due to non-payment of maintenance fees

Effective date: 20171206