CZ20031601A3 - Humanizované protilátky rozeznávající beta-amyloidní peptid - Google Patents

Humanizované protilátky rozeznávající beta-amyloidní peptid Download PDF

Info

Publication number
CZ20031601A3
CZ20031601A3 CZ20031601A CZ20031601A CZ20031601A3 CZ 20031601 A3 CZ20031601 A3 CZ 20031601A3 CZ 20031601 A CZ20031601 A CZ 20031601A CZ 20031601 A CZ20031601 A CZ 20031601A CZ 20031601 A3 CZ20031601 A3 CZ 20031601A3
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
residue
immunoglobulin
light chain
heavy chain
variable region
Prior art date
Application number
CZ20031601A
Other languages
English (en)
Inventor
Guriq Basi
Jose Saldanha
Ted Yednock
Original Assignee
Neuralab Limited At Al.
Wyeth
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=22953834&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=CZ20031601(A3) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Neuralab Limited At Al., Wyeth filed Critical Neuralab Limited At Al.
Publication of CZ20031601A3 publication Critical patent/CZ20031601A3/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/1703—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • A61K38/1709—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/193—Colony stimulating factors [CSF]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0007—Nervous system antigens; Prions
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • A61P25/16—Anti-Parkinson drugs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4711—Alzheimer's disease; Amyloid plaque core protein
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/53—DNA (RNA) vaccination
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55505—Inorganic adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55566—Emulsions, e.g. Freund's adjuvant, MF59
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55572—Lipopolysaccharides; Lipid A; Monophosphoryl lipid A
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55577—Saponins; Quil A; QS21; ISCOMS
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/567—Framework region [FR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/77—Internalization into the cell
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Psychology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Marine Sciences & Fisheries (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Psychiatry (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Description

Humanizované protilátky rozeznávající β-amyloidní peptid
Příbuzné přihlášky
Tato přihláška si nárokuje prospěch z dříve podané provisorní patentové přihlášky U.S. sériového čísla 60/251 892 (podané 6. prosince 2000) nazvané Humanizované protilátky rozeznávající β-amyloidní peptid. Úplný obsah shora uváděné přihlášky je zde zahrnut odkazem.
Oblast techniky
Alzheimerova choroba (AD) je progresivní choroba, jejímž následkem je senilní demence. Obecně viz Selkoe, TINS 16:403 (1993); Hardy et al., WO 92/13069; Selkoe, 3. Neuropathol. Exp. Neurol. 53:438 (1994); Duff et al., Nátuře 373:476 (1995); Games et al., Nátuře 373:523 (1995). Široce řečeno, choroba spadá do dvou kategorií: Pozdního vzniku, když nastává ve starším věku (65+ let) a časného vzniku, když se vyvine daleko před senilním obdobím, tj. mezi 35 a 60 léty. U obou typů choroby je patologie stejná, ale u případů počínajících v rannějším věku mají abnormality tendenci být vážnější a rozšířenější. Choroba je charakteristická mozkovými lézemi přinejmenším dvou typů, neurofibrilárními uzlíky a senilními plaky. Nurofibri lární uzlíky jsou nitrobuněčné deposity tau proteinu spojeného s mikrotubulemi sestávající ze dvou vláken stočených v párech jedno kolem druhého. Senilní plaky (tj. amyloidní plaky) jsou oblasti dezorganizovaných neuropilů až do průměru 150 pm s extracelulárními amyloidními deposity uprostřed, jež jsou viditelné při mikroskopické analyse mozkové tkáně. Akumulace amyloidních plaků v mozku je spojena rovněž s Downovým syndromem a dalšími poruchami chování.
Základní stavební složkou plaků je peptid nazývaný Αβ nebo β-amyloidní peptid. Αβ peptid je 4-kDa vnitřní 39-43 aminokyselinový fragment většího transmembránového glykoproteinu nazývaného amyloidní prekursorový protein (APP). v důsledku proteolytického zpracování app různými sekretasovými enzymy se Αβ nachází primárně jak v krátké formě • · · · o délce 40 aminokyselin, tak v delší formě o délce v rozsahu 42 - 43 aminokyselin, část hydrofobní transmembránové domény APP se nalézá na C-konci Αβ, a může zodpovídat za schopnost agregace do plaků, obzvláště v případě delší formy. Akumulace amyloidních plaků v mozku vede nakonec k úmrtí neuronových buněk. Tělesné symptomy spojené s tímto poškozením neuronů charakterizují Alzheimerovu chorobu.
S výskytem Alzheimerovy choroby bylo korelováno několik mutací. Viz např. Goate et al., Nátuře 349:704 (1991) (valin717 na isoleucin); Chartier Harlan et al., Nátuře 353:844(1991) (valin717 na glycin); Murrell et al., Science 254:97 (1991) (valin717 na fenylalanin); Mullan et al. , Nátuře Genet. 1:345 (1992) (dvojitá mutace měnící lysí n595-methi oni n596 na asparagin595-leucin596). o takovýchto mutacích se soudí, že způsobují Alzheimerovu chorobu zvýšeným nebo pozměněným zpracováním APP na Αβ, obzvláště zpracováním APP na zvýšená množství delší formy Αβ (tj. Αβ1-42 a Αβ1-43). O mutacích v jiných genech, jako jsou presinilinové geny PSi a PS2, se soudí, že nepřímo ovlivňují zpracování APP ke tvorbě zvýšených množství Αβ (viz Hardy, TINS 20:154 (1997)).
Ke stanovení významu amyloidních plaků v Alzheiměrově chorobě se úspěšně používají myší modely (Games et al., shora·, Johnson-Wood et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 94:1550 (1997)). Konkrétně: Když se PDAPP transgenním myším (jež exprimují mutantní formu lidského APP a u nichž se vyvíjí Alzheimerova choroba v ranném věku) injikuje delší forma Αβ, vykazují jak pokles v rozvoji Alzheimerovy choroby, tak zvýšení titru protilátek k Αβ peptidu (schenk et al . , Nátuře 400:173 (1999). Shora rozebíraná pozorování ukazují, že Αβ, obzvláště ve své delší formě, je u Alzheimerovy choroby kausativním prvkem.
McMichael, EP 526 511, navrhuje podávání homeopatických dávek (menších nebo rovných 10*2 mg/den) Αβ pacientům s vyvinutou AD. U typického člověka s více než 5 litry plasmy by se i u horní hranice tohoto dávkování dalo očekávat generování koncentrace ne vyšší než 2 pg/ml. Normální koncentrace Αβ v lidské plasmě je typicky v rozmezí 50 - 200 pg/ml (Seubert et al. , Nátuře 359:325 (1992)). Protože • · • · dávkování navržené v EP 526 511 by sotva změnilo hladinu endogenního cirkulujícího Αβ, a protože EP 526 511 nenavrhuje použití adjuvans, jako imunostimulantu, nezdá se plausibilní, že by nastával jakýkoli terapeutický užitek.
v souladu s tím existuje potřeba nových terapií a činidel k léčbě Alzheimerovy choroby, konkrétně terapií a činidel způsobujících terapeutickou prospěšnost ve fyziologických (tj. netoxických) dávkách.
Podstata vynálezu
Vynález obsahuje nová terapeutické proti látkové amyloidogenních onemocnění nebo proti látkové imunoglobuliny nebo imunologická činidla, konkrétně činidlo k prevenci a léčbě (např. Alzheimerovy choroby).
Vynález je založen, přinejmenším zčásti, na identifikaci a charakterizaci dvou monoklonálnich protilátek, jež se specificky vážou k Αβ peptidu a jsou účinné ve snižování plakové zátěže nebo snižování neuritové dystrofie spojené amyloidogenními poruchami. Strukturní a funkční analýza těchto protilátek vede k designu různých humanizovaných protilátek k profylaktickému nebo léčebnému použití. Konkrétním rysem vynálezu je humanizace variabilních oblastí těchto protilátek a v souladu s tím je poskytován humanizovaný imunoglobulin řetězce, intaktní humanizované protilátky, a funkční fragmenty imunoglobulinu nebo protilátky, obzvláště fragmenty vážící antigen, odvozené z poskytovaných protilátek.
Zveřejněny jsou rovněž oblasti určující komplementaritu (CDR) poskytovaných monoklonálních protilátek, jakož i polynukleotidové reagence, vektory a hostitelé vhodní ke kódování řečných polypeptidů.
Jsou zveřejněny způsoby léčby amyloidogenních onemocnění nebo poruch (např. Alzheimerovy choroby), jakož i farmaceutické prostředky a soupravy pro použití v takovýchto aplikacích.
Obsaženy jsou rovněž způsoby k identifikaci zbytků v poskytovaných monoklonálních protilátkách, jež jsou významné • · * · • ·
pro správnou imunologickou funkci a pro identifikaci zbytků, jež se hodí k substituci při designu humanizovaných protilátek majících zlepšené vazebné afinity nebo sníženou imunogenicitu, když se použijí jako terapeutická činidla.
Stručný popis obrázků
Obrázek 1 ukazuje přiřazení aminokyselinových sekvencí lehkých řetězců protilátek: myší 3D6, humanizované 3D6, Kabat ID 109230, a zárodečné Al9. Oblasti CDR jsou vyznačeny šipkami. Tučná kursiva vyznačuje vzácně se vyskytující myší zbytky. Tučné písmo ukazuje balící (VH + VL) zbytky. Souvislé vyplnění ukazuje kanonické/CDR interagující zbytky. Hvězdičky vyznačují zbytky vybrané pro zpětnou mutaci v humanizované 3D6, verse 1.
Obrázek 2 ukazuje přiřazení aminokyselinových sekvencí těžkých řetězců protilátek: myší 3D6, humanizované 3D6, Kabat ID 109230, a zárodečné A19. Označování je stejné jako pro Obrázek 1.
Obrázek 3 graficky znázorňuje Αβ vazebné vlastnosti 3d6, chimérické 3d6, a 10d5. Obrázek 3A je graf znázorňující vazbu Αβ k chimérické 3D6 (PK1614) v porovnání s myší 3D6. Obrázek 3B je graf znázorňující kompetici biotinylované 3D6 proti neznačené 3D6, PK1614 a 10D5 ve vazbě k Αβ.
Obrázek 4 zobrazuje homologní model 3D6 VH a VL a ukazuje α-uhlíkovou konturu. VH je ukázán jako přerušovaná čára, VL jako plná čára. oblasti CDR jsou ukázány v páskové formě.
Obrázek 5 graficky zobrazuje vazebné vlastnosti chimérické SD6 a humanizované 3D6 k Αβ. obrázek 5A zobrazuje výsledky ELISA měřící vazbu humanizované 3D6vl a chimérické 3D6 k agregovanému Αβ. Obrázek 5B zobrazuje výsledky ELISA měřící vazbu humanizované 3D6vl a humanizované 3D6v2 k agregovanému Αβ.
Obrázek 6 je graf kvantifikace vazby humanizované 3D6 a chimérické 3D6 k Αβ plakům z řezů mozku PDAPP myší.
Obrázek 7 je graf ukazující výsledky kompetitivního vazebného testu na schopnost humanizovaných 3D6 versí 1 a 2, • « « 9 · · chimérické 3D6, myší 3d6 a 10D5 kompetovat s myší 3d6 ve vazbě k Αβ.
Obrázek 8 graficky znázorňuje test ex vivo fagocytosy na schopnost humanizované 3D6v2, chimérické 3D6 a lidského IgG zprostředkovávat záchyt Αβ mikrogliálními buňkami.
Obrázek 9 zobrazuje přiřazení aminokyselinových sekvencí 10D5 VL a 3D6 vl. Tučně jsou vyznačeny zbytky, jež přesně odpovídají 10D5.
Obrázek 10 zobrazuje přiřazení aminokyselinových sekvencí 10d5 vh a 3d6 vh. Tučně jsou vyznačeny zbytky, jež přesně odpovídají 10D5.
Podrobný popis vynálezu
Tento vynález se týká nových imunologických činidel k prevenci nebo léčbě Alzheimerovy choroby nebo jiných amyloidogenních onemocnění, vynález je založen, přinejmenším zčásti, na charakterizaci dvou monoklonálních imunoglobulinů, 2D6 a 10D5, účinných ve vazbě beta amyloidního proteinu (Αβ) (např. vážících rozpustný nebo agregovaný Αβ), zprostředkování fagocytosy (např. agregovaného Αβ), ve snižování plakové zátěže nebo snižování neuritové dystrofie (např. u pacienta). Vynález je dále založen na stanovení a strukturní charakterizaci primární a sekundární struktury variabilních lehkých a těžkých řetězců těchto imunoglobulinů a identifikaci zbytků důležitých pro aktivitu a imunogenicitu.
Zahrnuty jsou imunoglobuliny, jež obsahují variabilní lehký nebo variabilní těžký řetězec výhodných monoklonálních imunoglobulinů zde popsaných. Zahrnuty jsou výhodné imunoglobuliny, tj. terapeutické imunoglobuliny, jež obsahují humanizovaný variabilní lehký nebo humanizovaný variabilní těžký řetězec, výhodné variabilní lehké nebo variabilní těžké řetězce zahrnují oblast určující komplementaritu (CDR) z daného monoklonálního imunoglobulinů (např. donorového imunoglobulinů) a rámcovou soustavu variabilních oblastí (framework) v podstatě z lidského akceptorového imunoglobulinů. Slovní spojení v podstatě z lidského • · • · ♦ » ΙΤΜ ·« » · · » · · · · akceptorového imunoglobulinu znamená že většina zbytků nebo klíčové zbytky rámcové soustavy jsou z lidské akceptorové sekvence, přičemž jsou však dovoleny substituce v určitých posicích zbytky vybranými ke zlepšení aktivity humanizovaného imunoglobulinu (např. ke změně aktivity tak, aby věrněji napodobovala aktivitu donorového imunoglobulinu) nebo vybranými ke snížení imunogenicity donorového imunoglobulinu.
V jednom provedení vynález zahrnuje lehký nebo těžký řetězec humanizovaného imunoglobulinu, jenž obsahuje komplementaritu určující oblasti (CDR) variabilní oblasti 3D6 (tj. obsahuje jednu, dvě nebo tři CDR ze sekvence variabilní oblasti lehkého řetězce jak je načrtnuta v SEKV. ID. Č. 2 nebo obsahuje jednu, dvě nebo tři CDR ze sekvence variabilní oblasti těžkého řetězce jak je načrtnuta v SEKV. ID. č. 4) a obsahuje variabilní oblast rámcové soustavy v podstatě ze sekvence lehkého nebo těžkého řetězce lidského akceptorového imunoglobulinu, za předpokladu, že přinejmenším jeden zbytek rámcové soustavy je zpětně zmutován na odpovídající myší zbytek, přičemž řečená zpětná mutace podstatně neovlivňuje schopnost daného řetězce řídit vazbu Αβ.
V jiném provedení vynález zahrnuje lehký nebo těžký řetězec humanizovaného imunoglobulinu, jenž obsahuje komplementaritu určující oblasti (CDR) variabilní oblasti 3d6 (tj. obsahuje jednu, dvě nebo tři CDR ze sekvence variabilní oblasti lehkého řetězce jak je načrtnuta v SEKV. ID. Č. 2 nebo obsahuje jednu, dvě nebo tři CDR ze sekvence variabilní oblasti těžkého řetězce jak je načrtnuta v SEKV. ID. Č. 4) a obsahuje variabilní oblast rámcové soustavy v podstatě ze sekvence lehkého nebo těžkého řetězce lidského akceptorového imunoglobulinu, za předpokladu, že přinejmenším jeden zbytek rámcové soustavy je substituován aminokyselinovým zbytkem ze sekvence variabilní oblasti lehkého nebo těžkého řetězce myší 3D6, přičemž zbytek rámcové soustavy je vybrán ze skupiny sestávající z a) zbytku, jenž přímo nekovalentně váže antigen;
b) zbytku přilehlého k CDR; c) zbytku interagujícího s CDR (identifikovaného např. modelováním lehkého nebo těžkého řetězce na vyřešené struktuře homologního známého * ··· imunoglobulinového řetězce); a d) zbytku účastnícího se VL-VH kontaktu.
V jiném provedení vynález zahrnuje lehký nebo těžký řetězec humanizovaného imunoglobulinu, jenž obsahuje 3D6 variabilní oblast CDR a variabilní oblasti rámcové soustavy ze sekvence lehkého nebo těžkého řetězce lidského akceptorového imunoglobulinu, za předpokladu, že přinejmenším jeden zbytek rámcové soustavy je substituován odpovídajícím aminokyselinovým zbytkem ze sekvence variabilní oblasti lehkého nebo těžkého řetězce myší 3D6, kde daný zbytek rámcové soustavy je zbytek schopný ovlivnit konformaci nebo funkci variabilní oblasti lehkého řetězce, jak je identifikována analýzou trojrozměrného modelu variabilní oblasti, například zbytek schopný interakce s antigenem, zbytek blízký vazebnému místu antigenu, zbytek schopný interakce s CDR, zbytek přilehlý k CDR, zbytek do vzdálenosti 6 A od zbytku CDR, zbytek noniové zóny, zbytek balení mezi řetězci, neobvyklý zbytek, nebo zbytek glykosylačního místa na povrchu strukturního modelu.
v jiném provedení vynález zahrnuje lehký řetězec humanizovaného imunoglobulinu, jenž obsahuje komplementaritu určující oblasti (CDR) variabilní oblasti 3D6 (tj. ze sekvence variabilní oblasti lehkého řetězce 3D6 jak je načrtnuta v sekv. id. č. 2) a zahrnuje oblast rámcové soustavy lidského akceptorového imunoglobulinu, za předpokladu, že alespoň jeden zbytek rámcové soustavy vybraný ze skupiny sestávající z Ll, L2, L36 a L46 (Kabatova konvence číslování) je substituován odpovídajícím aminokyselinovým zbytkem ze sekvence variabilní oblasti lehkého řetězce myší 3D6. V jiném provedení vynález zahrnuje těžký řetězec humanizovaného imunoglobulinu, jenž obsahuje komplementaritu určující oblasti (CDR) variabilní oblasti 3d6 (tj. ze sekvence variabilní oblasti těžkého řetězce 3D6 jak je načrtnuta v SEKV. ID. Č. 4) a zahrnuje oblast rámcové soustavy lidského akceptorového imunoglobulinu, za předpokladu, že alespoň jeden zbytek rámcové soustavy vybraný ze skupiny sestávající z H49, H93 a H94 (Kabatova konvence číslování) je substituován odpovídajícím • · • · · · aminokyselinovým zbytkem ze sekvence variabilní oblasti těžkého řetězce myší 3D6.
výhodné lehké řetězce zahrnují kappa II oblasti rámcové soustavy subtypu kappa II (Kabatova konvence), například oblasti rámcové soustavy z akceptorového imunoglobulinu Kabat ID 019230, Kabat ID 005131, Kabat ID 005058, Kabat ID 005057, Kabat ID 005059, Kabat ID U21040, a Kabat ID U41645. Výhodné těžké řetězce zahrnují oblasti rámcové soustavy subtypu lil (Kabatova konvence), například oblasti rámcové soustavy z akceptorového imunoglobulinu Kabat ID 045919, Kabat ID 000459, Kabat ID 000553, Kabat ID 000386, a Kabat ID M23691.
V jednom provedení vynález zahrnuje lehký nebo těžký řetězec humanizovaného imunoglobulinu, jenž obsahuje komplementaritu určující oblasti (CDR) variabilní oblasti 10D5 (tj. obsahuje jednu, dvě nebo tři CDR ze sekvence variabilní oblasti lehkého řetězce jak je načrtnuta v SEKV. ID. Č. 14 nebo obsahuje jednu, dvě nebo tři CDR ze sekvence variabilní oblasti těžkého řetězce jak je načrtnuta v SEKV. ID. Č. 16) a obsahuje variabilní oblast rámcové soustavy v podstatě ze sekvence lehkého nebo těžkého řetězce lidského akceptorového imunoglobulinu, za předpokladu, že přinejmenším jeden zbytek rámcové soustavy je zpětně zmutován na odpovídající myší zbytek, přičemž řečená zpětná mutace podstatně neovlivňuje schopnost daného řetězce řídit vazbu Αβ.
V jiném provedení vynález zahrnuje lehký nebo těžký řetězec humanizovaného imunoglobulinu, jenž obsahuje komplementaritu určující oblasti (CDR) variabilní oblasti 10D5 (tj. obsahuje jednu, dvě nebo tři CDR ze sekvence variabilní oblasti lehkého řetězce jak je načrtnuta v SEKV. ID. Č. 14 nebo obsahuje jednu, dvě nebo tři CDR ze sekvence variabilní oblasti těžkého řetězce jak je načrtnuta v SEKV. ID. č. 16) a obsahuje variabilní oblast rámcové soustavy v podstatě ze sekvence lehkého nebo těžkého řetězce lidského akceptorového imunoglobulinu, za předpokladu, že přinejmenším jeden zbytek rámcové soustavy je substituován aminokyselinovým zbytkem ze sekvence variabilní oblasti lehkého nebo těžkého řetězce myší 10d5, přičemž zbytek rámcové soustavy je vybrán ze skupiny sestávající z a) zbytku, jenž přímo nekovalentně váže antigen;
• · • · • · • · • · · · • · • · · · · · · · · · • · ··· · ··· · · ·
b) zbytku přilehlého k CDR; c) zbytku interagujícího s CDR (identifikovaného např. modelováním lehkého nebo těžkého řetězce na vyřešené struktuře homologního známého imunoglobulinového řetězce); a d) zbytku účastnícího se VL-VH kontaktu.
V jiném provedení vynález zahrnuje lehký nebo těžký řetězec humanizovaného imunoglobuli nu, jenž obsahuje 10D5 variabilní oblast CDR a variabilní oblasti rámcové soustavy ze sekvence lehkého nebo těžkého řetězce lidského akceptorového imunoglobulinu, za předpokladu, že přinejmenším jeden zbytek rámcové soustavy je substituován odpovídajícím aminokyselinovým zbytkem ze sekvence variabilní oblasti lehkého nebo těžkého řetězce myší 10D5, kde daný zbytek rámcové soustavy je zbytek schopný ovlivnit konformaci nebo funkci variabilní oblasti lehkého řetězce, jak je identifikována analýzou trojrozměrného modelu variabilní oblasti, například zbytek schopný interakce s antigenem, zbytek blízký vazebnému místu antigenu, zbytek schopný interakce s CDR, zbytek přilehlý k CDR, zbytek do vzdálenosti 6 Á od zbytku CDR, zbytek noniové zóny, zbytek balení mezi řetězci, neobvyklý zbytek, nebo zbytek glykosylačního místa na povrchu strukturního modelu.
v jiném provedení vynález zahrnuje, navíc k substitucím popsaným shora, substituci přinejmenším jednoho vzácného zbytku lidské rámcové soustavy. Například: Vzácný zbytek může být substituován aminokyselinovým zbytkem, jenž je běžný v této posici pro lidské sekvence variabilního řetězce. Alternativně může být vzácný zbytek substituován odpovídajícím aminokyselinovým zbytkem z homologní zárodečné sekvence variabilního řetězce (např. vzácný zbytek rámcové soustavy lehkého řetězce může být substituován odpovídajícím zárodečným zbytkem z Al, Al7, Al8, A2 nebo Al9 zárodečné imunoglobuli nové sekvence nebo vzácný zbytek rámcové soustavy těžkého řetězce může být substituován odpovídajícím zárodečným zbytkem z VH3-48, VH3-23, VH3-7, VH3-21 nebo VH3-11 zárodečné imunoglobuli nové sekvence.
V jiném provedení vynález zahrnuje humanizovaný imunoglobulin, jenž obsahuje lehký řetězec a těžký řetězec, • · · · jak jsou popsány shora, nebo antigen vážící fragment řečeného imunoglobulinu. V příkladu provedení daný humanizovaný imunoglobulin se váže (např. specificky váže) k beta amyloidnímu peptidu (Αβ) s vazebnou afinitou přinejmenším 107 Μ1, 108 M'1 nebo ΙΟ9 Μ'1. V jiném provedení imunoglobulin nebo antigen vážící fragment obsahuje těžký řetězec isotypu γΐ. v jiném provedení se imunoglobulin nebo antigen vážící fragment váže (např. specificky váže) jak k rozpustnému beta amyloidnímu peptidu (Αβ), tak k agregovanému Αβ. v jiném provedení imunoglobulin nebo antigen vážící fragment zprostředkovává fafocytosu (např. indukuje fagocytosu) beta amyloidního peptidu (Αβ). v ještě jiném provedení, imunoglobulin nebo antigen vážící fragment prochází barierou krev/mozek subjektu, v ještě jiném provedení, imunoglobulin nebo antigen vážící fragment redukuje jak zátěž beta amyloidního peptidu (Αβ), tak neuritovou dystrofii subjektu.
v jiném provedení vynález obsahuje chimérické imunoglobuliny, jež obsahují variabilní oblasti 3D6 (tj. sekvence variabilní oblasti jak jsou načrtnuty v SEKV. ID. Č. 2 nebo SEKV. ID. Č. 4). V ještě jiném provedení vynález zahrnuje imunoglobulin nebo jeho antigen vážící fragment, jenž obsahuje variabilní oblast těžkého řetězce jak je načrtnuta v SEKV. ID. č. 8 nebo variabilní oblast lehkého řetězce jak je načrtnuta v SEKV. ID. Č. 5. v ještě jiném provedení vynález zahrnuje imunoglobulin nebo jeho antigen vážící fragment, jenž obsahuje variabilní oblast těžkého řetězce jak je načrtnuta v sekv. id. č. 12 nebo variabilní oblast lehkého řetězce jak je načrtnuta v SEKV. ID. Č. 11. V jiném provedení vynález obsahuje chimérické imunoglobuliny, jež obsahují variabilní oblasti 10D5 (t j. sekvence variabilní oblasti jak jsou načrtnuty v SEKV. ID. Č. 14 nebo SEKV. ID. Č. 16). V ještě jiném provedení vynález zahrnuje imunoglobulin nebo jeho antigen vážící fragment, jenž dále obsahuje konstantní oblasti z igGl.
Imunoglobuliny zde popsané se obzvlášť hodí k použití v terapeutických způsobech zaměřených k prevenci nebo léčbě amyloidogenních onemocnění. V jednom provedení vynález zahrnuje způsob prevence nebo léčby amyloidogenního onemocnění • · · · ·· ·· ·· ···· • · · ···· · · · • · · · · · ··· · · · (např. Alzheimerovy choroby), jenž zahrnuje podávání účinné dávky humanizovaného imunoglobulinu zde popsaného pacientovi, v jiném provedení vynález zahrnuje farmaceutické prostředky, jež obsahují humanizovaný imunoglobulin zde popsaný a farmaceutický nosič. Rovněž zahrnuty jsou isolované molekuly nukleové kyseliny, vektory a hostitelské buňky produkci imunoglobulinů nebo imunoglobuli nových fragmentů nebo řetězců zde popsaných, jakož i způsoby produkce řečených imunoglobulinů, imunoglobuli nových fragmentů nebo imunoglobuli nových řetězců.
Vynález dále zahrnuje způsob identifikace 3d6 nebo 10D5 zbytků vhodných pro substituci při produkci humanizovaného 3D6 resp. 10D5. Například: Způsob identifikace zbytků variabilní oblasti stavební soustavy vhodných k substituci zahrnuje modelování trojrozměrné struktury variabilní oblasti 3d6 nebo 10D5 na vyřešené homologní imunoglobuli nové struktuře a analýze řečeného modelu na zbytky schopné ovlivnit konformaci nebo funkci 3D6 nebo 10D5 variabilní oblasti tak, že jsou identifikovány zbytky vhodné k substituci. Vynález rovněž zahrnuje použití sekvence variabilní oblasti načrtnuté v SEKV. ID. Č. 2 nebo SEKV. ID. č. 4, nebo jakékoli její části, pro vytvoření trojrozměrného obrazu 3D6 imunoglobulinu, 3D6 imunoglobuli nového řetězce, nebo jejich domén. Rovněž zahrnuto je použití sekvence variabilní oblasti načrtnuté v SEKV. ID. Č. 14 nebo SEKV. ID. č. 16, nebo jakékoli její části, pro vytvoření trojrozměrného obrazu 10D5 imunoglobulinu, 10D5 imunoglobuli nového řetězce, nebo jejich domén.
Před popisem vynálezu může být užitečné pro pochopení nečrtnout definice určitých výrazů, jež budou dále používány.
výrazy imunoglobulin nebo protilátka (používané zde zaměnitelně) odkazují na bílkovinu vážící antigen, která má základní strukturu ze čtyř polypeptidových řetězců, skládajících se ze dvou těžkých ze dvou lehkých řetězců, přičemž řečené řetězce jsou stabilizovány, například disulfidovými vazbami mezi řetězci, a která má schopnost specificky vázat antigen. lak těžké, tak lehké řetězce se uspořádávají do domén, výraz doména odkazuje na globulární • 9 oblast polypeptidů těžkého nebo lehkého řetězce obsahující peptidové smyčky (např. obsahující 3 až 4 peptidové smyčky) stabilizované například β-skládaným listem nebo mezi řetězcovými disulfidovými vazbami. Na domény se zde dále odkazuje jako na konstantní nebo variabilní, podle relativní absence sekvenčních variací v rámci domény různých členů dané třídy v případě konstatní domény, nebo významné variace v rámci domény různých členů dané třídy v případě variabilní domény. Na konstantní domény na lehkém řetězci se odkazuje zaměnitelně jako na konstantní oblasti lehkého řetězce, konstantní domény lehkého řetězce, CL oblasti nebo CL domény. Na konstantní domény na těžkém řetězci se zaměnitelně jako na konstantní oblasti těžkého konstantní domény těžkého řetězce, CH oblasti domény. Na variabilní domény na lehkém řetězci se zaměnitelně jako na variabilní oblasti lehkého variabilní domény lehkého řetězce, VL oblasti domény. Na variabilní domény na těžkém řetězci se zaměnitelně jako na variabilní oblasti těžkého variabilní domény těžkého řetězce, VH oblasti nebo VH domény.
Výraz oblast na část nebo úsek řetězce protilátky a zahrnuje konstantní nebo variabilní domény jak jsou zde definovány, jakož i oddělenější části nebo úseky řečených domén. Například: Variabilní domény nebo oblasti zahrnují komplementaritu určující oblasti neboli CDR proložené v oblasti stavební soustavy neboli FR [framework], jak je zde definována.
Imunoglobuliny nebo protilátky mohou existovat v monomerní nebo polymerní formě. výraz antigen vážící fragment odkazuje na polypeptidový fragment imunoglobuli nu nebo protilátky, jenž váže antigen nebo kompetuje s intaktní protilátkou (tj. s protilátkou z níž byl odvozen) o vazbu na antigen (tj. specifickou vazbu). Výraz konformace odkazuje na terciární strukturu bílkoviny nebo polypeptidů (tj. protiátky, proti látkového řetězce, její domény nebo oblasti). Například: spojení konformace lehkého (nebo těžkého) řetězce odkazuje na terciární strukturu variabilní oblasti lehkého odkazuje řetězce, nebo CH' odkazuje řetězce, nebo VL' odkazuje řetězce, (nebo těžkého) řetězce, a spojení konformace protilátky nebo konformace proti látkového fragmentu odkazuje na terciární strukturu protilátky nebo jejího fragmentu.
Specifická vazba protilátky znamená, že protilátka vykazuje značnou afinitu k antigenu nebo výhodnému epitopu a s výhodou nevykazuje významnou křížovou reaktivitu. Značná nebo výhodná vazba zahrnuje vazbu s afinitou přinejmenším 106, ΙΟ7, ΙΟ8, 109 M1 nebo 101θ M'1. výhodnější jsou afinity vyšší než nebo 107 M'1, s výhodou větší než 108 M1. Přechodné hodnoty mezi zde uvedenými hodnotami jsou zamýšleny rovněž jako spadající do rozsahu vynálezu a indikovány jako rozmezí výhodné afinit, vazebné afinity například 106 mohou s výhodou 107 až 101θ M'1, výhodněji 108 až 101θ M' být až 101θ Μ'1, Protilátka, která nevykazuje významnou křížovou reaktivitu je taková, jež se nebude značně vázat k nežádoucí látce (například k nežádoucímu proteinu). Například: Protilátka, jež specificky váže Αβ bude značně vázat Αβ, ale nebude významně reagovat s ηοη-Αβ proteiny nebo peptidy (např. s ηοη-Αβ proteiny nebo peptidy obsaženými v plaku). Protilátka specifická k výhodnému epitopu nebude například významně křížově reagovat se vzdálenějšími epitopy na témž proteinu nebo peptidu. Specifická vazba může být stanovována v oboru uznávanými způsoby stanovení takovéto vazby. S výhodou je specifická vazba stanovována Scatchardovou analýzou nebo kompetitivním vazebným testem.
Vazebné fragmenty se produkují technikami rekombinantní DNA nebo enzymatickým nebo chemickým štěpením intaktních imunoglobulinů. Vazebné fragmenty zahrnují Fab, Fab', F(ab')2, Fabc, Fv, jednotlivé řetězce a jednovláknové protilátky, imunoglobuliny nebo protilátky jiné než bispecifické nebo bifunkční se chápou tak, že mají obě svá vazebná místa identická. Bispecifická nebo bifunkční protilátka je umělá hybridní protilátka mající dva různé páry těžké/lehkého řetězce a dvě různá vazebná místa. Bispecifické protilátky mohou být produkovány řadou způsobů včetně hybridomové fúze ne provázání Fab' fragmentů, viz např. songsivilai & Lachmann, Clin. Exp. Immunol. 79:315-321 (1990); Kostelny et al.,
3. immunol. 148, 1547-1553 (1992).
• · • · · · výraz humanizovaný imunoglobulin nebo humanizovaná protilátka odkazuje na imunoglobulin nebo protilátku obsahující alespoň jeden řetězec humanizovaného imunoglobulinu nebo protilátky (tj. přinejmenším jeden humanizovaný lehký nebo těžký řetězec), výraz humanizovaný imunoglobulinový řetězec nebo řetězec humanizované protilátky (tj. humanizovaný imunoglobulinový lehký řetězec nebo humanizovaný imunoglobulinový těžký řetězec odkazuje na řetězec imunoglobulinu nebo protilátky (t j . lehký resp. těžký řetězec) mající variabilní oblast, jež obsahuje variabilní oblast stavební soustavy v podstatě z lidského imunoglobulinu nebo protilátky a oblasti určující komplementaritu (CDR) (např.přinejmenším jednu CDR, výhodně dvě CDR a výhodněji tři CDR) v podstatě z ne-lidského imunoglobulinu nebo protilátky, a dále obsahuje konstantní oblasti (např. přinejmenším jednu konstatní oblast nebo její část v případě lehkého řetězce, a s výhodou tři konstantní oblasti v případě těžkého řetězce). Výraz humanizovaná variabilní oblast (tj. humanizovaná variabilní oblast lehkého řetězce nebo humanizovaná variabilní oblast těžkého řetězce) odkazuje na variabilní oblast, jež obsahuje variabilní oblast stavební soustavy v podstatě z lidského imunoglobulinu nebo protilátky a oblasti určující komplementaritu (CDR) v podstatě z ne-lidského imunoglobulinu nebo protilátky.
Spojení v podstatě z lidského imunoglobulinu nebo protilátky nebo v podstatě lidský znamená, že když se pro účele porovnání přiloží k aminokyselinové sekvenci lidského imunoglobulinu nebo protilátky, daná oblast sdílí přinejmenším 80 - 90 %, výhodně 90 - 95 %, výhodněji 95 - 99 % identity (tj. lokální identity sekvence) se sekvencí lidské stavební soustavy nebo konstantní oblasti, přičemž se povolují například konservativní substituce, substituce konsensus sekvencí, zárodečné substituce, zpětné mutace a podobně. Na zavádění konservativních substitucí, substitucí konsensus sekvencí, zárodečných substitucí, zpětných mutací a podobně se často odkazuje jako na optimalizaci sekvence humanizované protilátky nebo řetězce. Spojení v podstatě z ne-lidského imunoglobulinu nebo protilátky nebo v podstatě ne-lidský • · • · · · znamená obsah sekvence imunoglobulinu nebo protilátky přinejmenším z 80 - 95 %, výhodně 90 - 95 %, výhodněji 96 %, 97 %, 98 % nebo 99 % identické se sekvencí ne-lidského organismu, např. ne-lidského savce.
V souladu s tím jsou všechny oblasti nebo zbytky humanizovaného imunoglobulinu nebo protilátky, nebo řetězce humanizovaného imunoglobulinu nebo protilátky, s možnou výjimkou oblastí CDR, v podstatě identické s odpovídajícími oblastmi nebo zbytky jedné nebo více sekvencí nativního lidského imunoglobulinu. výraz odpovídající oblast nebo odpovídající zbytek odkazuje na oblast nebo zbytek druhé aminokyselinové nebo nukleotidové sekvence, jež okupují stejnou (t j. ekvivalentní) posici jako oblast nebo zbytek první aminokyselinové nebo nukleotidové sekvence, když se pro účele porovnání první a druhá sekvence k sobě optimálně přiloží.
výrazy humanizovaný imunoglobulin nebo humanizovaná protilátka nejsou zamýšleny tak, aby zahrnovaly chimérické imunoglobuliny nebo protilátky, jak jsou definovány níže. I když jsou humanizované imunoglobuliny nebo protilátky ve své konstrukci chimérické (tj. obsahují oblasti z více než jednoho druhu bílkoviny), zahrnují další vlastnosti (např. variabilní oblasti obsahují donorové CDR zbytky a zbytky akceptorové stavební soustavy), vlastnosti, jež nemají chimérické imunoglobuliny nebo protilátky jak jsou zde definovány.
Výraz významná identita znamená, že dvě polypeptidové sekvence sdílejí, při optimálním přiložení k sobě, jako pomocí programů GAP nebo BESTFIT za použití default váhy mezery, 50 60 % sekvenční identity, s výhodou 60 - 70 % sekvenční identity, výhodněji 70 - 80 % sekvenční identity, výhodněji přinejmenším 80 - 90 % sekvenční identity, ještě výhodněji přinejmenším 90 - 95 % sekvenční identity, a ještě výhodněji přinejmenším 95 % sekvenční identity nebo víc (např. 99 % sekvenční identity nebo víc). Výraz podstatná identita znamená, že dvě polypeptidové sekvence sdílejí, při optimálním přiložení k sobě, jako pomocí programů GAP nebo bestfit za použití default váhy mezery, přinejmenším 80 - 90 % sekvenční identity, ještě výhodněji přinejmenším 90 - 95 % sekvenční • · • · • · •9 · · 9 9 9» 9
9999 « II* « 9 «
99 99 identity, a ještě výhodněji přinejmenším 95 % sekvenční identity nebo víc (např. 99 % sekvenční identity nebo víc). Pro porovnání sekvencí slouží typicky jedna sekvence jako referenční sekvence, s níž se testovaná sekvence porovnává. Při používání algoritmu porovnání sekvencí se do počítače vkládají testovaná a referenční sekvence, koordináty podsekvence pokud je to zapotřebí, a zadají se parametry programu sekvenčního algoritmu. Algoritmus porovnání sekvencí pak spočítá procento sekvenční identity pro testovanou sekvenci (testované sekvence) v poměru k referenční sekvenci na základě zadaných parametrů programu, výrazy sekvenční identita a identita sekvencí se zde používají zaměnitelně.
Optimální přiřazení sekvencí pro porovnání lze provádět např. algoritmem lokální homologie podle Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981), algoritmem homologního přirovnání podle Needleman & Wunsch, 3. Mol. Biol. 48:443 (1970), způsobem vyhledávání podobnosti podle Pearson & Lipman, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988), počítačovou implementací těchto algoritmů (GAP, BESTFIT, FASTA a TFASTA ve Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI) nebo visuálním prohlížením (viz obecně Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology), ledním příkladem algoritmu, jenž je vhodný ke stanovení procentní sekvenční identity a sekvenční podobnosti je algoritmus BLAST, jenž je popsán v Altschul et al., 3. Mol. Biol. 215:403 (1990). Software pro provádění analýz BLAST je veřejně dostupné prostřednictvím National Center for Biotechnology Information (veřejně dostupné prostřednictvím National institutes of Health NCBI internetového serveru). Typicky lze k provedení porovnání sekvencí použít default parametrů, i když lze používat i vlastní upravené parametry. Pro aminokyselinové sekvence blastp program používá jako default délky slova (w) hodnotu 3, očekávání (E) hodnotu 10 a hodnotící matrici BLOSUM62 (viz Heinikoff & Heinikoff, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 89:10915 (1989)).
S výhodou se posice zbytků, jež nejsou identické, liší konservativními aminokyselinovými substitucemi. Pro účel klasifikace aminokyselinových substitucí jako konservativních • · • · • · « · · · nebo nekonservativních jsou aminokyseliny seskupeny jak následuje: skupina I (hydrofobní postranní řetězce): leu, met, ala, val, ile; Skupina II (neutrální hydrofilní postranní řetězce): cys ser, thr; Skupina III (kyselé postranní řetězce): asp, glu; Skupina IV (basické postranní řetězce): asn, gin, his, lys, arg; Skupina v (zbytky ovlivňující orientaci řetězce): gly, pro; Skupina ví (aromatické postranní řetězce): trp, tyr, phe. Konservativní substituce zahrnují substituce mezi aminokyselinami stejné třídy. Nekonservativní substituce zakládají výměnu člena jedné z těchto tříd za člena jiné.
Humanizované imunoglobuliny nebo protilátky s výhodou váží antigen s afinitou, jež je v rozmezí s faktorem tři, čtyři nebo pět od afinity odpovídající ne-lidské protilátky. Například: Když ne-lidská protilátka má vazebnou afinitu 109 M'1, humanizovaná protilátka bude mít vazebnou afinitu přinejmenším 3 x 109 M'1, 4 x 109 M1, nebo 109 M'1. Při popisu vazebných vlastností řetězce imunoglobulinu nebo protilátky může řetězec být popisován na základě schopnosti řídit vazbu antigenu (např. Αβ). o řetězci se říká, že řídí vazbu antigenu když vykazuje v rámci intaktního imunoglobulinu nebo protilátky (nebo jejich antigen vážícího fragmentu) specifickou vazebnou vlastnost nebo vazebnou afinitu. O mutaci (např. zpětné mutaci) se říká, že podstatně ovlivňuje schopnost těžkého nebo lehkého řetězce řídit vazbu antigenu když ovlivňuje (např. snižuje) vazebnou afinitu intaktního imunoglobulinu nebo protilátky (nebo jejich antigen vážícího fragmentu), jež obsahují řečený řetězec, přinejmenším o jeden řád ve srovnání s protilátkou (nebo jejím antigen vážícím fragmentem) obsahujícím ekvivalentní řetězec bez mutace. Mutace podstatně neovlivňuje (např. nesnižuje) schopnost řetězce řídit vazbu antigenu když ovlivňuje (např. snižuje) vazebnou afinitu intaktního imunoglobulinu nebo protilátky (nebo jejich antigen vážícího fragmentu), jež obsahují řečený řetězec, pouze s faktorem dva, tři nebo čtyři ve srovnání s afinitou protilátky (nebo jejího antigen vážícího fragmentu) obsahující ekvivalentní řetězec bez mutace.
• ·
- 18 ·výraz chimérický imunoglobulin nebo protilátka odkazuje na imunoglobulin nebo protilátku, jejichž lehký a těžký řetězec jsou odvozeny z různých živočišných druhů. Chimérické imunoglobuliny nebo protilátky lze konstruovat například genetickým inženýrstvím, ze segmentů imunoglobulinových genů příslušejících k různým druhům.
Antigen je látka (např. bílkovinná látka nebo peptid) k němuž se protilátka specificky váže.
Výraz epitop nebo antigenní determinanta odkazuje na místo na antigenu, k němuž se imunoglobulin nebo protilátka (nebo jejich antigen vážící fragment) specificky váže. Epitopy mohou být vytvářeny jak z kontinuálních aminokyselin, tak z nekontinuálních aminokyselin, juxtaposovaných terciárním skládáním proteinu. Epitopy vytvářené z kontinuálních aminokyselin typicky přetrvávají po vystavení k denaturujícím rozpouštědlům, zatímco epitopy vytvářené terciárním skládáním struktury se typicky ztrácejí po působení denaturujících rozpouštědel. Epitop typicky obsahuje přinejmenším 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 nebo 15 aminokyselin v unikátní prostorové konformaci. Způsoby stanovení prostorové konformace epitop! zahrnují například rentgenovou krystalografii a 2-rozměrnou nukleární magnetickou resonanci, viz např. Epitope Mapping Protocols, v Methods in Molecular Biology, sv, 66, ed.: G. E. Morris (1996).
Protilátky, jež rozeznávají stejný epitop mohou být identifikovány v jednoduchém imunologickém testu ukazujícím schopnost jedné protilátky blokovat vazbu jiné protilátky k cílovému antigenu, tj. kompetitivním vazebném testu. Kompetitivní vazba je stanovována v testu, v němž testovaný imunoglobulin inhibuje specifickou vazbu referenční protilátky ke společnému antigenu, jako je Αβ. Známé jsou četné typy kompetitivního vazebného testu, například přímé nebo nepřímé radioiimunostanovení (RIA) na pevné fázi, přímé nebo nepřímé enzymové imunostanovení (EIA) na pevné fázi; sendvičový kompetitivní test (viz Stahle et al., Methods in Enzymology 9:242 (1983)); přímá EIA na pevné fázi se systémem biotinavidin (viz Kirkland et al., J. immunol. 137:3614 (1986)); test s přímým značením na pevné fázi; sendvičový test s přímým • · • · · · značením na pevné fázi (viz Harlow a Lané, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (1988)); RIA na pevné fázi s přímým značením za použití značky 1-125 (Cheung et al. , Virology 176:546 (1990)); a RIA s přímým značením (Moldenhauer et al., Scand. J. Immunol. 32:77 (1990)). Typicky takovéto stanovení zahrnuje purifi kovaný antigen navázaný na pevný povrch nebo buňky jej nesoucí, neznačený testovaný imunoglobulin a značený referenční imunoglobulin. Kompetitivní inhibice je měřena stanovením množství značky navázané na pevný povrch nebo buňky v přítomnosti testovaného imunoglobulinu. Obvykle je testovaný imunoglobulin přítomen v přebytku. Obvykle, když je testovaný imunoglobulin přítomen v přebytku, bude inhibovat specifickou vazbu referenční protilátky ke společnému antigenu z přinejmenším 50 - 55 %, 55 - 60 %, 60 - 65 %, 65 - 70 %, 70 - 75 % nebo více.
Epitop je rozeznáván rovněž imunologickými buňkami, například B buňkami nebo T buňkami. Buněčné rozeznávání epitopu lze stanovit in vitro testy, jež měří proliferaci závislou na antigenu, jak je stanovována inkorporací 3H-thymidinu, sekrecí cytokinů, sekrecí protilátky nabo zabíjením závislým na antigenu (test
T lymfocyty).
Příklady epitopů lze nalézt v prekursorového amyloidního proteinu (app) v rámci Αβ peptidu APP. Existuje více isoforem APP, například APP695 , app751, a app770 . Aminokyselinám v APP jsou přiřazena čísla podle sekvence isoformy APP770 (viz např. GenBank přístupové číslo P05067, rovněž uváděno jako SEKV ID. č, 38). Αβ (na nějž se zde odkazuje rovněž jako na beta amyloidní peptid a A-beta) je ~ 4-kDa interní fragment 39 - 43 aminokyselin APP (Αβ39, Αβ40, Αβ41, Αβ42, a Αβ43). Αβ40 například sestává ze zbytků 672 - 711 APP a Αβ42 například sestává ze zbytků 673 - 713 APP. V důsledku proteolytického zpracování APP různými sekretasovými enzymy in vivo nebo in šitu se Αβ nachází jak v krátké formě o délce 40 aminokyselin, tak v delší formě o délce v rozsahu 42 - 43 aminokyselin. Výhodné epitopy nebo antigenní determinanty jak jsou zde popsány se nacházejí v N-konci Αβ peptidu a obsahují s cytotoxickými rámci ale lidského výhodou • · zbytky uvnitř aminokyselin 1 - 10 Αβ, výhodně ze zbytků 1-3, 1-4, 1-5, 1-6, 1-7 nebo 3 - 7 Αβ. Další výhodné epitopy nebo antigenní determinanty obsahují zbytky 2-4, 5, 6, 7 nebo 8 Αβ, 3 - 5, 6, 7, 8 nebo 9 Αβ nebo zbytky 4 - 7, 8, 9 nebo 10 Αβ.
výraz amyloidogenní onemocnění zahrnuje jakékoli onemocnění s tvorbou (nebo způsobené tvorbou) depositů nerozpustných amyloidních fibril. Příklady amyloidogenních onemocnění zahrnují, ale bez omezení, systémovou amyloidosu, Alzheimerovu chorobu, diabetes nastupující v dospělosti, Parkinsonovu chorobu, Huntingtonovu chorobu, frontálnětemporální demenci, a s priony spojenou přenosnou spongiformní encefalopatii (kuru a Creutzfeldtovu-lacobovu chorobu u lidí a scrapie a BSE u ovcí respektive skotu). Různá amyloidogenní onemocnění jsou definována nebo charakterizována povahou polypeptidové složky deponovaných fibril. Například: U subjektů nebo pacientů majících Alzheimerovu chorobu je charakteristickou polypeptidovou složkou amyloidního depositu β-amyloidní bílkovina (např. divokého typu, variantní nebo zmenšená β-amyloidní bílkovina). V souladu s tím je Alzheimerova choroba příkladem choroby charakterizované deposity Αβ nebo choroby spojené s deposity Αβ, např. v mozku subjektu nebo pacienta. Výrazy β-amyloidní protein, β-amyloidní peptid, β-amyloid, Αβ a Αβ peptid jsou zde používány zaměnitelně.
Výraz účinná dávka nebo účinné dávkování je definován jako množství dostatečné k dosažení nebo přinejmenším částečného dosažení žádoucího účinku, výraz terapeuticky účinná dávka je definován jako množství postačující k vyléčení nebo přinejmenším k částečnému zastavení postupu choroby a jejích komplikací u pacienta, jenž už trpí danou chorobou. Množství účinná pro toto použití budou záviset na závažnosti infekce a na celkovém stavu pacientova vlastního imunitního systému.
výraz pacient zahrnuje lidské nebo jiné savčí subjekty, jež dostávají buď profylaktickou anebo terapeutickou léčbu.
Rozpustný nebo disociováný Αβ odkazuje na neagregovaný nebo desagregovaný Αβ polypeptid. Nerozpustný • · « · · ·
- 21 Αβ odkazuje na agregovaný Αβ polypeptid, například Αβ držený pohromadě nekovalentními vazbami. 0 Αβ (např. Αβ42) se soudí, že agreguje, přinejmenším zčásti, pro přítomnost hydrofobních zbytků na C-konci peptidu (části transmembránové domény APP). Jedním způsobem jak připravit rozpustný Αβ je rozpustit lyofilizovaný peptid v čistém DMSO se sonikací. výsledný roztok se centrifuguje k odstranění nerozpustných částic.
• · • · • · · · • · · ·
- 22 I. imunologická a terapeutická činidla
Imunologická a terapeutická činidla podle vynálezu zahrnují imunogeny nebo protilátky, nebo jejich funkční nebo antigen vážící fragmenty, jak jsou zde definovány, nebo z nich sestávají. O základní strukturní jednotce protilátky je známo, že je tetramerem podjednotek. Každý tetramer sestává ze dvou identických párů polypeptidových řetězců, přičemž každý pár má jeden lehký (asi 25 kDa) a jeden těžký řetězec (asi 50 70 kDa). Aminokoncová část každého řetězce obsahuje variabilní oblast o 100 až 110 nebo více aminokyselinách, primárně zodpovědnou za rozeznání antigenu. Karboxykoncová část každého řetězce definuje konstantní oblast, primárně zodpovědnou za efektorovou funkci .
Lehké řetězce jsou klasifikovány jako buď kapa anebo lambda a jsou asi 230 zbytků co do délky. Těžké řetězce jsou klasifikovány jako gama (γ), mí (μ), alfa (a), delta (δ) nebo epsilon (e), jsou o délce 450 - 600 zbytků a definují proti látkový isotyp jako igG, igM, igA, igD respektive igE. Jak těžké, tak lehké řetězce jsou složeny do domén, výraz doména odkazuje na globulární oblast bílkoviny, například imunoglobulinu nebo protilátky. Domény imunoglobulinu nebo protilátky obsahují například 3 nebo čtyři peptidové smyčky stabilizované β-skládaným listem nebo mezi řetězcovými disulfidovými vazbami. Intaktní lehké řetězce mají například dvě domény (vL a CL) a intaktní těžké řetězce mají například čtyři nebo pět domén (VH, CH1, CH2 a CH3).
v rámci lehkých a těžkých řetězců jsou variabilní a konstantní oblasti spojené J oblastí o asi 12 nebo více aminokyselinách, přičemž těžký řetězec obsahuje rovněž D oblast o asi 10 nebo více aminokyselinách, (viz obecně Fundamental Immunology (Paul W., ed., 2. vydání, Raven Press, N.Y. (1989), kap. 7) zahrnuto odkazem v úplnosti pro veškeré účele).
variabilní oblasti každého páru lehkého/těžkého řetězce vytvářejí vazebné místo pro antigen. Takto má intaktní protilátka dvě vazebná místa. S výjimkou bifunkčních nebo bispecifických protilátek jsou tato dvě vazebná místa stejná.
··
Všechny řetězce vykazují stejnou obecnou strukturu relativně konservovaných oblastí rámcové soustavy (FR, framework) spojených třemi hypervariabilním oblastmi, nazývanými rovněž komplementaritu určující oblasti neboli CDR. Přirozeně se vyskytující nebo rekombinantně produkované řetězce mohou být exprimovány se zaváděcí sekvencí, jež je odstraněna v průběhu buněčného zpracování za tvorby maturního řetězce. Maturní řetězce mohou být rekombinantně produkovány rovněž se zaváděcí sekvencí přirozeně se nevyskytující, například k podpoře sekrece nebo změněnému zpracování konkrétního řetězce, jenž je předmětem zájmu.
CDR oblasti dvou maturních řetězců každého páru jsou drženy oblastmi rámcové soustavy, což umožňuje vazbu ke specifickému antigenu. On N-konce k c-konci obsahuje jak lehký, tak těžký řetězec domény FRl, CDRl, FR2, CDR2, FR3, CDR3 a FR4. Na FR4 se v oboru odkazuje rovněž jako na D/3 oblast variabilního těžkého řetězce a 3 oblast variabilního lehkého řetězce. Přiřazení aminokyselin každé domény je v souladu s definicemi Kabata, Sequences of Próteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1987 a 1991). Alternativní strukturní definice byla navržena Chothiou et al., 3. Mol. Biol. 196:901 (1987); Nátuře 342:878 (1989); 3. Mol. Biol. 186:651 (1989) (dále se společně odkazuje jako na Chothia et al. a zahrnuje se v úplnosti odkazem pro veškeré účele).
A. Αβ protilátky
Terapeutická činidla podle vynálezu zahrnují protilátky, jež se specificky vážou k Αβ nebo jiným složkám amyloidních plaků. Takovéto protilátky mohou být monoklonální nebo polyklonální. Některé takovéto protilátky se specificky vážou k agregované formě Αβ bez vazby na rozpustnou formu. Některé se vážou specificky k rozpustné formě bez vazby k agregované formě. Některé se vážou jak k agregované, tak rozpustné formě. Některé takovéto protilátky se vážou k přirozeně se vyskytující krátké formě Αβ (tj. Αβ39, 40, nebo 41) bez vazby k přirozeně se vyskytující delší formě Αβ (tj. Αβ42, nebo • · • « • · • · · ·
- 24 Αβ43). Některé protilátky se vážou k delší formě Αβ bez vazby ke krátké formě. Některé protilátky se vážou k Αβ bez vazby k prekursorové amyloidní bílkovině plné délky. Protilátky používané v terapeutických způsobech mají s výhodou intaktní konstantní oblast nebo přinejmenším dostatek konstantní oblasti pro interakci s Fc receptorem. výhodný je lidský isotyp igGl protože má mezi lidskými isotypy nejvyšší afinitu k FcRl receptorů na fagocytových buňkách. Použity mohou být rovněž bispecifické Fab fragmenty, u nichž má jedno rameno specifitu pro Αβ, a druhé pro Fc receptor. výhodné protilátky se vážou k Αβ s afinitou větší (nebo rovnou) asi ΙΟ6, ΙΟ7, 108, 109 M'1 nebo ΙΟ10 M'1 (včetně afinit mezi těmito hodnotami).
Polyklonální séra typicky obsahují směsnou populaci protilátek vážících se k několika epitopům podél délky Αβ. Polyklonální séra však mohou být specifická ke konkrétnímu segmentu Αβ, jako je Αβ1-10. Monoklonální protilátky se vážou ke specifickému epitopu v Αβ, jenž může být konformační nebo nekonformační epitop. Profylaktická a terapeutická účinnost protilátek může být testována postupy s použitím transgenních zvířecích modelů, popsanými v Příkladech, výhodné monoklonální protilátky se vážou k epitopu v rámci zbytků 1 - 10 Αβ (s prvním N-koncovým zbytkem přirozeného Αβ označovaným 1). Některé výhodné monoklonální protilátky se vážou k epitopu v rámci aminokyselin 1 - 5 a některé k epitopu v rámci 5-10. Některé výhodné protilátky se vážou k epitopům v rámci aminokyselin 1-3, 1-4, 1-5, 1-6, 1-7 nebo 3-7. Některé výhodné protilátky se vážou k epitopům začínajícím u zbytků 1 - 3 a končícím u zbytků 7 - 11 Αβ. Méně výhodné protilátky zahrnují ty, jež se vážou k epitopům se zbytky 10 15, 15 - 20, 25 - 30, 10 - 20, 20, 30, nebo 10 - 25 Αβ. Doporučuje se, aby takovéto protilátky byly před použitím hodnoceny na aktivitu v v myších modelech popsaných v Příkladech. Bylo například nalezeno, že určité protilátky k epitopům v rámci zbytků 10 -18, 16-24, 18-21, a 33 - 42 nemají aktivitu (např. nemají schopnost snižovat plakovou zátěž nebo odstraňovat neuritickou patologii spojenou s Alzheimerovou chorobou). U některých způsobů se používá více protilátek majících vazebné spécifi ty k různým epitopům.
• · • · · · c ·
Takovéto protilátky mohou být podávány postupně nebo simultánně. Použít lze rovněž protilátky k amyloidním složkám jiným než Αβ (tj. podávat je nebo společně je podávat). Protilátky mohou být řízeny například proti bílkovině spojené s amyloidy, synukleinu.
Když se o protilátce říká, že váže epitop v rámci specifických zbytků, jako například Αβ 1 - 5, myslí se tím, že se protilátka váže specificky k polypeptidu obsahujícímu specifické zbytky (t j. Αβ 1 - 5 v tomto příkladě). Takováto protilátka nemusí být nutně v kontaktu s každým zbytkem v rámci Αβ 1 - 5. Ani každá jednoduchá aminokyselinová substituce nebo delece nemusí u Αβ 1 - 5 nutně ovlivnit významně vazebnou afinitu. Epitopová spécifi ta protilátky může být stanovena například vytvořením knihovny exposice na fágu, v níž jednotlivý členové vystavují různé subsekvence Αβ. Knihovna exposice na fágu je pak selektována na členy specificky vážící testovanou protilátku. Isolována je rodina sekvencí. Takováto rodina typicky obsahuje u různých členů společnou jádrovou sekvenci a různé délky přilehlých sekvencí. Nej kratší jádrová sekvence vykazující specifickou vazbu k protilátce pak definuje epitop vázaný protilátkou. Protilátky mohou být testovány na epitopovou spécifi tu rovněž kompetičním testem s protilátkou, jejíž epitopová sekvence je již určena. Například: Protilátky, jež kompetují s protilátkou 3D6 o vazbu k Αβ, vážou stejný nebo podobný epitop jak 3D6, tj. v rámci zbytků Αβ 1 - 5. Podobně protilátky, jež kompetují s protilátkou 10D5 o vazbu k Αβ, vážou stejný nebo podobný epitop, tj. v rámci zbytků Αβ 3 - 7. Hodnocení protilátek na epitopovou spécifi tu je důležitý predikční prvek k terapeutické účinnosti. Například: Protilátka, jež má stanovenu vazbu k epitopu v rámci zbytků 1 - 7 Αβ bude pravděpodobně účinná v prevenci a léčbě Alzheiměrový choroby podle způsobů tohoto vynálezu.
Monoklonální nebo polyklonální protilátky, které se specificky vážou k výhodnému segmentu Αβ bez vazby k jiným blastem Αβ, mají řadu výhod v porovnání s monoklonálnimi protilátkami vážícími se k jiným oblastem nebo s polyklonálním séry k intaktnímu Αβ. Předně, pro stejné hmotnostní dávkování, • · • « • · • · · ·
- 26 k výhodným protilátek
Za druhé, dávkování protilátek, jež se specificky vážou segmentům, obsahuje vyšší molární dávkování účinných v odstraňování amyloidních plaků. protilátky, jež se specificky vážou k výhodným segmentům, mhou indukovat odstraňovači odezvu proti amyloidním depositům bez indukce odstraňovači odezvy proti intaktnímu APP polypeptidu, čímž redukují potenciální vedlejší účinky.
1. Produkce ne-lidských protilátek
Tento vynález zahrnuje ne-lidské protilátky, například protilátky mající spécifi tu pro výhodné Αβ epitopy podle vynálezu. Takovéto protilátky lze použít k formulaci různých terapeutických prostředků podle vynálezu nebo výhodně k poskytnutí oblastí určujících komplementaritu pro produkci humanizovaných nebo chimérických protilátek (popsaných podrobně níže). Produkce ne-lidských monoklonálních protilátek, např. myších, morčecích, primátích, králičích nebo potkaních, může být provedena například imunizací zvířete Αβ. Použít lze rovněž delší polypeptid obsahující Αβ nebo imunogenní fragment Αβ nebo anti-idiotypické protilátky k protilátce proti Αβ. Viz Harlow & Lané, shora, zahrnuto odkazem pro veškeré účele. Takovýto imunogen může být získán z přirozeného zdroje, peptidovou syntézou nebo rekombinantní expresí. Imunogen může být případně podáván ve fúzi nebo jiném komplexu s nosičovou bílkovinou, jak je popsáno níže. imunogen může být případně podáván s adjuvans. výraz adjuvans odkazuje na sloučeninu, jež při podávání spolu s antigenem podporuje imunitní odezvu k antigenu, ale při samostatném podávání negeneruje imunitní odezvu k antigenu. Adjuvans může podporovat imunitní odezvu několika mechanismy včetně rekrutování lymfocytů, stimulace B nebo T buněk, a stimulace makrofágů. Může být použito několik typů adjuvans, jak je popsáno níže. Pro imunizaci laboratorních zvířat je výhodné kompletní Freundovo adjuvans následované nekompletním adjuvans.
Pro přípravu polyklonálních protilátek se typicky používají králíci nebo morčata. Typické preparace • · polyklonálních protilátek, např. pro pasivní ochranu, lze provádět například jak následuje: 125 netransgenních myší se imunizuje 100 pg Αβ1-42 plus adjuvans CFA/IFA, a usmrtí po 4 5 měsících. Z imunizovaných myší se shromáždí krev. IgG se oddělí od ostatních složek krve. Protilátka specifická k imunogenu může být částečně purifikována afinitní chromatografií, v průměru se získá asi 0,5 - 1 mg imunogenspecifické protilátky na myš, což dává celkově 60 - 120 mg.
Pro přípravu monoklonálních protilátek se typicky používají myši. Monoklonály lze připravit proti fragmenty injikováním fragmentu nebo delší formy Αβ do myší, přípravou hybridomů a hodnocením hybridomů na protilátku, jež se specificky váže k Αβ. Pozdější hodnocení může být prováděno stanovováním vazby protilátky k souboru delečních mutantů Αβ peptidu a určováním, které deleční mutanty se vážou k protilátce, vazba může bát určena například imunoblotem nebo ELISA. Nejmenší fragment vykazující specifickou vazbu definuje epitop protilátky. Alternativně může být epitopová specifita určena kompetičním testem, v němž testovaná a referenční protilátka kompetují o vazbu k Αβ. Když testovaná a referenční protilátka vykazují kompetici, vážou se ke stejnému epitopu nebo k epitopům dostatečně blízkým tak, že vazba jedné protilátky interferuje s vazbou druhé. Výhodným isotypem pro takovéto protilátky je myší isotyp lgG2a nebo ekvivalentní isotyp u jiných druhů. Myší isoty lgG2a je ekvivalentní lidskému isotypu igGl.
2. Chimérické a humanizované protilátky
Tento vynález rovněž zahrnuje chimérické nebo humanizované protilátky (tj. chimérické nebo humanizované imunoglobuliny) specifické pro beta amyloidní peptid. Chimérické nebo humanizované protilátky mají stejnou nebo podobnou vazebnou specifitu a afinitu jako myší nebo jiná ne-lidská protilátka, jež poskytuje výchozí matriál pro konstrukci chimérické nebo humanizované protilátky.
A. Produkce chimérických protilátek
Výraz chimérická protilátka odkazuje na protilátku, jejíž geny pro lehký a těžký řetězec jsou zkonstruovány, typicky genetickým inženýrským způsobem, ze segmentů imunoglobulinových genů náležejících k různým biologickým druhům. Například: Variabilní (V) segmenty genů z myší monoklonální protilátky mohou být napojeny na lidské konstantní (C) segmenty, jako jsou IgGl a lgG4. Lidský isotyp IgGl je výhodný. Typická chimérická protilátka je tudíž hybridní bílkovina sestávající z V nebo antigen-vážící domény z myší protilátky a C nebo efektorové domény z lidské protilátky.
B. Produkce humanizovaných protilátek výraz humanizovaná protilátka odkazuje na protilátku obsahující přinejmenším jeden řetězec, jenž obsahuje zbytky variabilní oblasti rámcové soustavy v podstatě z řetězce lidské protilátky (na niž se odkazuje jako na akceptorový imunoglobulin nebo protilátku) a přinejmenším jednu komplementaritu určující oblast v podstatě z myší protilátky (na niž se odkazuje jako na donorový imunoglobulin nebo protilátku). Viz Queen et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 86:10029 (1989); US 5 530 101; US 5 585 089; US 5 693 761; US 5 693 762; Selick et al, WO 90/07861, a Winter US 5 225 539 (zahrnuto v úplnosti odkazem pro veškeré účele). Konstantní oblast(i), pokud jsou přítomny, jsou rovněž v podstatě nebo úplně z lidských imunoglobulinů.
Substituce myších CDR do rámcové soustavy lidské variabilní domény by měla nejpravděpodobněji vést k zachování jejich správné prostorové orientace když rámcová soustava lidské variabilní domény nabude stejnou nebo podobnou konformaci jako rámcová soustava myší variabilní domény, z níž CDR pocházejí. Tohot lze dosáhnou získáním lidských variabilních domén z lidských protilátek, u nichž sekvence rámcové soustavy vykazuje vysoký stupeň sekvenční identity s rámcovou soustavou myších variabilních domén, z nichž jsou ·* ·· ♦· ·« • · · * ♦ · «
CDR odvozeny. Rámcové soustavy variabilních oblastí těžkého a lehkého řetězce mohou být odvozeny ze sekvencí stejné lidské protilátky nebo rozdílných lidských protilátek. Sekvence lidské protilátky mohou být sekvencemi přirozeně se vyskytujících lidských protilátek nebo mohou být konsensus sekvencemi několika lidských protilátek, viz Kettleborough et al., Protein Engineering 4:773 (1991); Kolbinger et al.,
Protein Engineering 6:971 (1993); a Carter et al.,
WO 92/22653.
Pokud máme identifikovány komplementaritu určující oblasti myšího donorového imunoglobulinu a vhodné lidské akceptorové imunoglobuliny, další krok je určit které, pokud vůbec, zbytky z těchto složek musí být substituovány k optimalizaci vlastností výsledné humanizované protilátky. Obecně musí být substituce lidských aminokyselinových zbytků myšími minimalizována, protože zavádění myších zbytků zvyšuje risiko, že protilátka bude vyvolávat u lidí odezvu lidskýchproti-myších protilátek (HAMA), v oboru uznávané způsoby pro stanovení imunitní odpovědi lze provádět monitorováním HAMA odezvy u konkrétního pacienta nebo v průběhu klinických zkoušek, u pacientů, jimž se podávají humanizované protilátky se může provést zjištění imunogenicity na začátku a v průběhu celého podávání řečené terapie. HAMA odezva se měří například detekcí protilátek k humanizovanému terapeutickému činidlu, ve vzorcích séra z pacientů užívajících způsob v oboru známý, včetně technologie povrchové plasmonové resonance (BIACORE) nebo analýz ELISA na pevné fázi.
Určité aminokyseliny ze zbytků rámcové soustavy lidské variabilní oblasti jsou vybrány pro substituci na základě jejich možného vlivu na konformaci CDR nebo na vazbu k antigenu. Nepřirozená juxtaposice myších CDR oblastí s rámcovou soustavou lidské variabilní oblasti může vést k nepřirozeným konformačním omezením, jež vedou, pokud nejsou korigovány substitucí některých aminokyselinových zbytků, ke ztrátě vazebné afinity.
výběr aminokyselinových zbytků pro substituci je zčásti určován počítačovým modelováním. Popsáno je zde výpočetní hardware a software k vytváření trojrozměrnému zobrazování • « ·· ·· w » · · _ 30 - ·· ·· *.»**·.* *.·**.·* imunoglobulinových molekul. Obecně jsou modely molekul produkovány z výchozích struktur vyřešených pro imunoglobulinové řetězce nebo jejich domény. Řetězce, jež mají být modelovány se porovnávají co do podobnosti aminokyselinové sekvence s řetězci nebo doménami s vyřešenými trojrozměrnými strukturami a řetězce nebo domény vykazující největší sekvenční podobnost jsou vybrány (je vybrán) jako výchozí body pro konstrukci modelu molekuly. Pro modelování se vyberou řetězce nebo domény sdílející přinejmenším 50 % sekvenční identity, s výhodou 60 %, 70 %, 80 %, 90 % sekvenční identity nebo více. Vyřešené výchozí struktury jsou modifikovány tak, aby připouštěly rozdíly mezi aktuálními aminokyselinami v modelovaných imunoglobulinových řetězcích nebo doménách a ve výchzích strukturách. Modifikované struktury jsou pak začleněny do kompositního imunoglobulinu. Nakonec je model upřesněn minimalizací energie a ověřením, že všechny atomy jsou navzájem v patřičných vzdálenostech a že délky vazeb jsou v chemicky přijatelných mezích.
Výběr aminokyselinových zbytků pro substituci může být rovněž zčásti určen zkoumáním charakteristik aminokyselin v konkrétním místě, empirickým pozorováním důsledků substituce nebo mutagenese konkrétních aminokyselin. Například: Když se aminokyselina liší mezi zbytkem myší rámcové soustavy variabilní oblasti a vybraným zbytkem lidské rámcové soustavy variabilní oblasti, aminokyselina lidské rámcové soustavy má obvykle být substituována ekvivalentní aminokyselinou z rámcové soustavy myší protilátky když se rozumně očekává, že tato aminokyselina
1) přímo nekovalentně váže antigen,
2) přiléhá k CDR oblasti,
3) jinak interaguje s CDR oblastí (např. je v rozmezí 3 - 6 Á od CDR oblasti, jak určí počítačové modelování), nebo
4) participuje na VL-VH dotekové ploše.
zbytky, jež přímo nekovalentně vážou antigen zahrnují zbytky v posicích oblastí rámcové soustavy, jež mají dobrou pravděpodobnost, že budou přímo interagovat s aminokyselinami antigenu podle uznávaných chemických sil, například vodíkovou ·· ·· v · vazbou, van der waalsovskými silami, hydrofobní interakcí a podobně.
Oblasti CDR a rámcové soustavy jsou definovány Kabatem et al. a Chothiou et al. , shora. Když zbytky rámcové soustavy, jak jsou definovány Kabatem et al., shora, vytvářejí strukturní smyčky zbytků, jak je definována chothiou et al., shora, k substituci do lidské protilátky mohou být vybrány aminokyseliny přítomné v myší protilátce, zbytky, jež jsou přilehlé k oblasti CDR zahrnují aminokyselinové zbytky v posicích bezprostředně přilehlých v sekvenci humanizovaného imunoglobulinového řetězce k jedné nebo více CDR, například v posicích bezprostředně přilehlých k CDR jak je definována Kabatem et al., nebo CDR jak je definována Chothiou et al. (viz Chothia a Lesk, JMB 196:901 (1987)). U těchto aminokyselin je obzvlášť pravděpodobné, že budou interagovat s aminokyselinami v CDR a, když jsou vybrány z akceptoru, distortovat donorové CDR a snižovat afinitu. Navíc: Přilehlé aminokyseliny mohou interagovat přímo s antigenem (Amit et al., Science 233:747 (1986), což je zde zahrnuto odkazem) a může být žádoucí vybrat tyto aminokyseliny z donoru k udržení všech kontaktů antigenu, jež poskytují afinitu původní proti látce.
Zbytky, jež jinak interagují s CDR oblastí zahrnují zbytky u nichž analýza sekundární struktury určila, že jsou v prostorové orientaci postačující k ovlivnění CDR oblasti. V jednom provedení jsou zbytky, jež jinak interagují s CDR oblastí identifikovány analýzou trojrozměrného modelu donorového imunoglobuli nu (např. počítačově generovaného modelu). Trojrozměrný model, typicky původní donorové protilátky, ukazuje, že určité aminokyseliny vně CDR jsou blízko oblastem CDR a mají dobrou pravděpodobnost interagovat s oblastmi CDR vodíkovou vazbou, van der Waalsovskými silami, hydrofobními interakcemi, atd.. Pro tyto aminokyselinové posice mají být vybrány aminokyseliny donorového imunoglobuli nu spíše než aminokyseliny akceptorového imunoglobulinu. Aminokyseliny podle tohoto kriteria budou obecně mít některý atom bočního řetězce ve vzdálenosti do 3 Angstromových jednotek (Á) od některého atomu v CDR • c ··>· oblastech a musí obsahovat atom, jenž může interagovat s atomy CDR podle uznávaných chemických sil, jak jsou ve výčtu shora.
v případě atomů, jež mohou vytvářet vodíkovou vazbu, jsou 3 Á měřeny mezi jejich jádry, ale pro atomy, jež netvoří vazbu, jsou 3 Á měřeny mezi jejich van der waalsovými povrchy. Ve druhém případě tudíž musí být jádra ve vzdálenosti do asi 6 Á (3 Á plus suma jejich van der Waalsových poloměrů) pro atomy uvažované jako schopné interakce, v mnoha případech budou jádra od 4 nebo 5 do 6 Á vzdálená. Při určování zda aminokyselina může interagovat s oblastmi CDR je výhodné neuvažovat posledních 8 aminokyselin CDR 2 těžkého řetězce jako součást oblastí CDR, protože z hlediska struktury se těchto 8 aminokyselin chová spíše jako součást rámcové soustavy.
Aminokyseliny schopné interakce s aminokyselinami oblastí CDR lze identifikovat ještě jiným způsobem. Plocha povrchu dostupného rozpouštědlu je pro každou aminokyselinu vypočtena dvěma způsoby: 1) v intaktní protilátce, a 2) v hypotetické molekule sestávající z protilátky s odstraněnými oblastmi CDR. Významný rozdíl mezi těmito čísly činící asi 10 čtverečných Angstromů nebo víc ukazuje, že přístup aminokyseliny rámcové soustavy k rozpouštědlu je přinejmenším zčásti blokován oblastmi CDR, a že tedy daná aminokyselina vstupuje do kontaktu s CDR. Plocha povrchu dostupného rozpouštědlu může být pro aminokyselinu vypočítána na základě trojrozměrného modelu protilátky s použitím algoritmů v oboru známých (např. Connolly, 3. Appl. Cryst. 16:548 (1983) a Lee a Richards, 3. Mol. Biol. 55:379 (1971), obě zde zahrnuty odkazem).
Aminokyseliny rámcové soustavy mohou rovněž v některých případech interagovat s oblastmi CDR nepřímo, ovlivňováním konformace jiné aminokyseliny rámcové soustavy, jež pak dále vstupuje do kontaktu s CDR.
aminokyselinách některých posic v rámcové soustavě se ví, že jsou v mnohých protilátkách schopné interakce s CDR (Chothia a Lesk, výše, Chothia et al., výše a Tramontano et al., 3, Mol. Biol. 215:175 (1990), všechny jsou zde zahrnuty odkazem). Hlavně se ví o aminokyselinách v posicích 2, 48, 64 a 71 lehkého řetězce a 26 - 30, 71 a 94 těžkého řetězce • · • · • · • · · ·
- 33 (číslování podle Kabata), že jsou v mnohých protilátkách schopné interakce s oblastmi CDR. Rovněž aminokyseliny v posicích 35 lehkého řetězce a 93 a 103 těžkého řetězce budou pravděpodobně interagovat s oblastmi CDR. Ve všech těchto číslovaných posicích je pro zařazení do humanizovaného imunoglobulinu výhodný výběr donorových aminokyselin spíše než akceptorových aminokyselin (pokud se liší). Na druhé straně, určité zbytky schopné interakce s oblastí CDR, jako je prvních 5 aminokyselin lehkého řetězce, mohou být někdy vybrány z akceptorového imunoglobulinu bez ztráty afinity humanizovaného imunoglobulinu.
zbytky, jež participují na VL-VH dotekové ploše nebo balící zbytky, zahrnují zbytky na doteku mezi VL a VH jak jsou definovány například Novotným a Haberem, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 82:4592-6 (1985) nebo Chothiou et al., výše. Obvykle mají být neobvyklé balící zbytky, pokud se liší od zbytků v lidských rámcových soustavách, v humanizovaném imunoglobulinu zachovány.
Obecně jsou jedna nebo více aminokyselin, splňujících kriteria uvedená shora, substituovány. V některých provedeních je substituována většina nebo jsou substituovány všechny aminokyseliny splňující kriteria shora, v některých případech je pochybnost, zda konkrétní aminokyselina splňuje kriteria shora, a produkují se variantní imunoglobuliny, z nichž jeden má konkrétní substituci a druhý z nich ne. Alternativní variantní imunoglobuliny takto produkované lze testovat v kterémkoli zde popsaném testu na žádoucí aktivitu a lze vybrat výhodný imunoglobulin.
Obvykle jsou CDR oblasti v podstatě identické, a obvykleji identické s odpovídajícími CDR oblastmi donorové protilátky. I když to obvykle není žádoucí, je někdy možné provést jednu nebo více konservativních substitucí CDR zbytků, aniž by byla značněji ovlivněna vazebná afinita výsledného humanizovaného imunoglobulinu. Konservativními substituce se zamýšlí kombinace jako gly, al; val, ile, leu; asp, glu; asn, gin; ser, thr; lys, arg; a phe, tyr.
Dalšími kandidáty na substituci jsou aminokyseliny akceptorové lidské rámcové soustavy, jež jsou neobvyklé nebo • · • · • · · ·
- 34 vzácné v dané posici v lidském imunoglobulinu. Tyto aminokyseliny mohou být substituovány aminokyselinami z ekvivalentní posice myší donorové protilátky nebo z ekvivalentní posice typičtějšího lidského imunoglobulinu. Substituce může být žádoucí například když aminokyselina v oblast lidské stavební soustavy akceptorového imunoglobulinu je vzácná v této posici a odpovídající aminokyselina v donorovém imunoglobulinu je běžná pro tuto posici v sekvencích lidských imunoglobulinů; nebo když je aminokyselina v akceptorovém imunoglobulinu vzácná pro tuto posici a odpovídající aminokyselina v donorovém imunoglobulinu je rovněž vzácná, relativně k jiným lidským sekvencím. Toto kriterium pomáhá zajistit, aby netypická aminokyselina v lidské rámcové soustavě nenarušovala strukturu protilátky. Náhradou neobvyklé aminokyseliny lidského akceptoru aminokyselinou z donorové protilátky, jež je náhodou typická pro lidské protilátky, se může navíc humanizovaná protilátka stát méně antigenní.
Termín vzácná, jak se zde používá, znamená, že aminokyselina vyskytující se v dané posici je v méně než v 20 %, ale obvykle v méně než v 10 % sekvencí z representativního vzorku sekvencí a výraz běžná, jak se zde používá, znamená, že vyskytující se aminokyselina je ve více než v 25 %, ale obvykle ve více než v 50 % sekvencí z representativního vzorku. Například: Sekvence variabilních oblastí všechny lehkých respektive těžkých řetězců jsou seskupeny do podskupin sekvencí, které jsou obzvlášť homologické mezi sebou a mají stejné aminokyseliny v určitých kritických posicích (Kabat et al., shora). Při rozhodování zda aminokyselina v lidské akceptorové sekvenci je vzácná nebo běžná bude často výhodné uvažovat jen lidské sekvence ze stejné podskupiny, jako je akceptorová sekvence.
Dalšími kandidáty na substituci jsou aminokyseliny variabilní oblasti lidské rámcové soustavy, jež mohou být identifikovány jako část CDR při alternativní definici nevržené Chothiou et al., shora. Dalšími kandidáty na substituci jsou aminokyseliny variabilní oblasti lidské rámcové soustavy, jež mohou být identifikovány jako část CDR • · • · · · při definování AbM nebo kontaktu. Zejména: CDRl ve variabilním těžkém řetězci je definována jako obsahující zbytky 26 - 32.
Dalšími kandidáty na substituci jsou zbytky akceptorové rámcové soustavy, jež odpovídají vzácným nebo neobvyklým zbytkům donorové rámcové soustavy. Vzácné nebo neobvyklé zbytky donorové rámcové soustavy jsou ty, jež jsou vzácné nebo neobvyklé (jak jsou zde definovány) pro myší protilátky v dané posici. Pro myší protilátky lze stanovit podskupinu podle Kabata a identifikovat posice, jež se liší od konsensu. Tyto donorové specifické rozdíly mohou ukazovat na aktivitu zvyšující somatické mutace v myší sekvenci. Neobvyklé zbytky s predikcí vlivu na vazbu jsou zachovávány, zatímco zbytky s predikcí nedůležitosti pro vazbu mohou být substituovány.
Dalšími kandidáty na substituci jsou zbytky ne-zárodečné linie vyskytující se v oblasti akceptorové rámcové soustavy. Když například akceptorový protilátkový řetězec (tj. lidský protilátkový řetězec sdílející významnou sekvenční identitu s donorovým proti látkovým řetězcem) je porovnán se zárodečným proti látkovým řetězcem (podobně sdílejícím významnou sekvenční identitu s donorovým řetězcem), zbytky, jež nesouhlasí mezi rámcovou soustavou akceptorového řetězce a rámcovou soustavou zárodečného řetězce mohou být substituovány odpovídajícími zbytky ze zárodečné sekvence.
Kromě specifických aminokyselinových substitucí rozebíraných shora, oblasti rámcové soustavy humanizovaných imunoglobulinů jsou obvykle v podstatě identické, a obvykleji identické, s oblastmi rámcové soustavy lidských protilátek, z nichž jsou odvozeny. Samozřejmě, mnohé aminokyseliny v oblasti rámcové soustavy poskytují malý nebo žádný přímý příspěvek ke spécifi tě nebo afinitě protilátky. Tolerovány tedy mohou být mnohé jednotlivé konservativní substituce zbytků rámcové soustavy, aniž by se značně měnila spécifi ta nebo afinita výsledného humanizovaného imunoglobulinu. v jednom provedení tedy oblast rámcové soustavy humanizovaného imunoglobulinu sdílí přinejmenším 85 % sekvenční identity se sekvencí lidské variabilní oblasti nebo konsensem takovýchto sekvencí, v jiném provedení oblast rámcové soustavy humanizovaného imunoglobulinu sdílí přinejmenším 90 %, s • · • · • · · · výhodou 95 %, výhodněji 96 %, 97 %, 98 % nebo 99 % sekvenční identity se sekvencí lidské variabilní oblasti nebo konsensem takovýchto sekvencí, obecně jsou však takovéto substituce nežádoucí.
Humanizované protilátky s výhodou vykazují specifickou vazebnou aktivitu pro antigen přinejmenším ΙΟ7, ΙΟ8, 109 nebo 101θ M'1. Obvykle je horní hranice afinity humanizované protilátky k antigenu v rozmezí s faktorem tři, čtyři nebo pět od afinity donorového imunoglobulinu. často je dolní hranice vazebné afinity rovněž v rozmezí s faktorem tři, čtyři nebo pět od afinity donorového imunoglobulinu. Alternativně může být vazebná afinita porovnána s afinitou humanizované protilátky, jež nemá žádné substituce (např. protilátky amjící donorové oblasti CDR a akceptorové oblast FR, ale žádné FR substituce). V takovýchto případech je vazba optimalizované protilátky (se substitucemi) s výhodou přinejmenším dvakrát až třikrát nebo třikrát až čtyřikrát větší než vazba nesubstituované protilátky. Pro provedení porovnání lze aktivity různých protilátek stanovit například pomocí BIACORE (tj. povrchové plasmonové resonance s použitím neznačených činidel) nebo kompetitivním vazebným testem.
C. Produkce humanizovaných 3d6 protilátek
Výhodné provedení vynálezu uvádí humanizovanou protilátku k N-konci Αβ, obzvlášť pro použití v terapeutických nebo diagnostických způsobech zde popsaných. Obzvlášť výhodným výchozím materiálem pro produkci humanizovaných protilátek je 3d6. 3d6 je specifická pro N-konec Αβ, a bylo u ní předvedeno, že zprostředkovává fagocytosu (např. indukuje fagocytosu) amyloidních plaků (viz Příklady 1 - 5). Klonování a sekvenování cDNA kódujících variabilní oblasti lehkého a těžkého řetězce protilátky 3D6 je popsáno v Příkladu 6.
Vhodná lidská akceptorová protilátka je identifikována počítačovými porovnáními aminokyselinových sekvencí myších variabilních oblastí se sekvencemi známých lidských protilátek. Porovnání jsou prováděna odděleně pro lehký a těžký řetězec, ale princip je podobný pro oba. Konkrétně byly • · • · • · · · pomocí dotazu na Kabatovu databázi s použitím NCBI BLAST (veřejně dostupné prostřednictvím National institutes of Health NCBI internetového serveru) identifikovány variabilní domény z lidských protilátek, jejichž sekvence rámcové soustavy vykazuje vysoký stupeň sekvenční identity se sekvencemi myších VL a VH oblastí rámcové soustavy, v jednom provedení jsou vybrány akceptorové sekvence sdílející víc než 50 % sekvenční identity s myšími donorovými sekvencemi. S výhodou jsou vybrány sekvence akceptorové protilátky sdílející 60 %, 70 %, 80 %, 90 % nebo více.
Počítačové porovnání 3D6 odhalilo, že lehký řetězec 3d6 vykazuje největší sekvenční identitu s lidskými lehkými řetězci subtypu kapa li a že těžký řetězec 3D6 vykazuje největší sekvenční identitu s lidskými těžkými řetězci subtypu lil, jak jsou definovány Kabatem et al., shora, oblasti lehké a těžké lidské rámcové soustavy jsou takto s výhodou odvozeny z lidských protilátek těchto subtypů, nebo z konsensus sekvencí těchto subtypů. výhodné variabilní oblasti lidského lehkého řetězce vykazující největší sekvenční identitu s odpovídající oblastí 3D6 jsou z protilátek majících Kabatova ID čísla 019230, 005131, 005058, 005057, 005059, U21040, a U41645, přičemž 019230 je výhodnější, výhodné variabilní oblasti lidského těžkého řetězce vykazující největší sekvenční identitu s odpovídající oblastí 3D6 jsou z protilátek majících Kabatova ID čísla 045919, 000459, 000553, 000386, a M23691, přičemž 045919 je výhodnější.
zbytky jsou pak vybrány pro substituci, jak následuje: Když se aminokyselina liší mezi 3d6 variabilní oblasti rámcové soustavy a ekvivalentní variabilní oblasti lidské rámcové soustavy, aminokyselina lidské rámcové soustavy má obvykle být substituována ekvivalentní myší aminokyselinou když se rozumně očekává, že tato aminokyselina
1) přímo nekovalentně váže antigen,
2) přiléhá k CDR oblasti, je částí CDR oblasti podle alternativní definice navržené Chothiou et al., shora, nebo jinak interaguje s CDR oblastí (např. je ve vzdálenosti do 3 A od CDR (například aminokyseliny v posicích L2, H49 a H94 z 3D6), nebo • · • · · · • · · · • · · • 4 · · ·
4) participuje na VL-VH dotekové ploše (např. aminokyseliny v posicích L36, L46 a H93 z 3D6) .
Počítačové modelování variabilních oblastí těžkého a lehkého řetězce protilátky 3d6 a humanizace protilátky 3d6 jsou popsány v Příkladu 7. Ve stručnosti: Trojrozměrný model byl generován za základě nejbližších vyřešených struktur těžkého a lehkého řetězce myší protilátky. Pro tento účel byla jako templát pro modelování 3d6 lehkého řetězce vybrána protilátka označovaná 1CR9 (id. kód v Protein Data Bank (PDB): 1CR9; Kanyo et al., 3. Mol. Biol. 293:855 (1999) a jako templát pro modelování 3D6 těžkého řetězce vybrána protilátka označovaná 1OPG (id. PDB: 1OPG; Kodandapani et al., 3. Biol. Chem. 270:2268 (1995)). Model byl dále upřesněn sérií kroků minimalizace energie k odstranění nežádoucích kontaktů a optimalizace elektrostatických a van der waalsovských interakcí. 3ako templát pro modelování CDR3 těžkého řetězce byla vybrána vyřešená struktura lqkz (id. PDB: 1QKZ; Derrick et al., 3. Mol. Biol. 293:81 (1999)) protože 3D6 a 1OPG nebykazují při přiložení pro účel porovnání významnou sekvenční homologii v této oblasti.
Trojrozměrné strukturní informace pro protilátky zde popsané jsou veřejně dostupné například z Protein Data Bank (PDB), Research Collaboratory for structural Bioinformatics. PDB je volně dostupná prostřednictvím World Wide Web internetu a je popsána Bermanem et al. (2000) Nucleic Acids Research,
28:235. Počítačové modelováním umožňuje identifikaci zbytků interagujících s CDR. Počítačový model struktury 3D6 pak slouží jako výchozí bod pro predikci trojrozměrné struktury protilátky obsahující 3d6 oblasti určující komplementaritu substituované ve strukturách lidské rámcové soustavy. Další modely reprezentující danou strukturu lze konstruovat poté, co se zavedou další aminokyselinové substituce.
Obecně je žádoucí substituce jedné, většiny nebo všech aminokyselin splňujících kriteria uvedená shora, v souladu s tím budou humanizované protilátky podle vynálezu obvykle obsahovat substituce zbytků lidské rámcové soustavy lehkého řetězce odpovídajícími zbytky 3D6 přinejmenším v 1, 2 nebo 3, a obvykleji 4, z následujících posic: Ll, l_2, L36 a L46.
• · ·· ·· ·· ·· ···( ··· · · · · ·· I • ···· · ··· · · ·
39-·.·· ·*· ·· ·’· ·· : ·· ·· ·· ·· · · · ·
Humanizované protilátky rovněž obvykle obsahují substituce zbytků lidské rámcové soustavy těžkého řetězce odpovídajícími zbytky 3D6 přinejmenším v 1, 2 a někdy 3 z následujících posic: H49, H93 a H94. Humanizované protilátky mohou rovněž obsahovat substituce zbytků rámcové soustavy těžkého řetězce odpovídajícími zbytky zárodečné linie přinejmenším v 1, 2 a někdy 3 z následujících posic: H74, H77 a H89.
v některých případech existuje určitá pochybnost, zda konkrétní aminokyselina splňuje kriteria shora, a produkují se variantní imunoglobuliny, z nichž jeden má konkrétní substituci a druhý z nich ne. V těchto případech, když by myší zbytek zaváděl zbytek, jenž je v konkrétní posici v lidských imunoglobulinech vzácný, může být žádoucí testovat protilátku na aktivitu s touto konkrétní substitucí nebo bez ní. Když je aktivita (např. vazebná afinita nebo vazebná spéci fi ta) zhruba stejná s nebo bez substituce, protilátka bez substituce může být výhodnější, protože se u ní dá očekávat, že bude vyvolávat méně haha odezvy, jek je popsána níže.
Jinými kandidáty na substituci jsou aminokyseliny akceptorové lidské rámcové soustavy, jež jsou neobvyklé v dané posici v lidském imunoglobulinu. Tyto aminokyseliny mohou být substituovány aminokyselinami z ekvivalentní posice typičtějšího lidského imunoglobulinu. Alternativně mohou být do oblasti lidské rámcové soustavy zavedeny aminokyseliny z ekvivalentní posice myší 3D6, když jsou takovéto aminokyseliny v ekvivalentní posici typické pro lidský imunoglobulin.
v dalších provedeních, když je lidská rámcová soustava lehkého řetězce akceptorového imunoglobulinu Kabat id. č. 019230, lehký řetězec obsahuje substituce přinejmenším v 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 nebo obvykleji 13 z následujících posic: L7, LlO, Ll2, L15, L17, L39, L45, L63, L78, L83, L85, L100 nebo L104. v dalších provedeních, když je lidská rámcová soustava těžkého řetězce akceptorového imunoglobulinu Kabat id. č. 045919, těžký řetězec obsahuje substituce přinejmenším v 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 nebo obvykleji 15 z následujících posic: H3, H5, H13, H16, H19, H40, H41, H42, H44, H72, H77, H82A, H83, H84 • · • · · · * · · · · · · · ·· · · · · · · 4 • · · · · ··· · · nebo H108. Tyto posice jsou substituovány aminokyselinou z ekvivalentní posice lidského imunoglobulinu majícího typičtější aminokyselinový zbytek. Příklady patřičných aminokyselin k substituci jsou ukázány v obrázcích 1 a 2.
Dalšími kandidáty na substituci jsou zbytky ne-zárodečné linie vyskytující se v oblasti rámcové soustavy. Počítačové porovnání 3d6 se známými sekvencemi zárodečné linie ukázalo, že těžké řetězce vykazující největší stupeň sekvenční identity zahrnují sekvence zárodečných variabilních oblastí VH3-48, VH3-23, VH3-7, VH3-21, a VH3-11, přičemž VH3-23 je výhodnější. Porovnání Kabat id. 045919 s VH3-23 s VH3-23 odhaluje, že zbytky H74, H77 nebo H89 mohou být vybrány pro substituci odpovídajícími zárodečnými zbytky (např. H74, H77 nebo H89 při porovnání Kabat id. 045919 s VH3-23 s VH3-23). Podobně: Zárodečné sekvence mající největší stupeň identity k 3D6 lehkému řetězci zahrnují Al, A17, A18, A2 a A19, přičemž A19 je nejvýhodnější, zbytky nesouhlasící mezi vybranou rámcovou soustavou akceptorového lehkého řetězce a jednou z těchto zárodečných sekvencí mohou být vybrány k substituci odpovídajícím zárodečným zbytkem.
Tabulka 1 shrnuje sekvenční analýzu VH a VL oblastí 3D6. Uvedeny jsou další myší a lidské struktury, jež mohou být použity k modelování protilátky 3D6 a dalších lidských protilátek, jakož i sekvence zárodečné linie, jež mohou být použity k výběru aminokyselinových substitucí, v Tabulce 1 jsou rovněž uvedeny vzácné myší zbytky. Vzácné myší zbytky jsou identifikovány porovnáním donorových VL nebo VH sekvencí se sekvencemi jiných členů subskupiny, k níž VL nebo VH sekvence přísluší (podle Kabata) a identifikací posic zbytku, jež se liší od konsensu. Tyto donor-specifické rozdíly mohou ukazovat na somatické mutace, jež zvyšují aktivitu. Neobvyklé nebo vzácné zbytky blízko vazebného místa mohou potenciálně vstupovat do kontaktu s antigenem, což činí žádoucím zachovat myší zbytek. Když však myší zbytek není důležitý pro vazbu, výhodné je použití odpovídajícího akceptorového zbytku, protože myší zbytek může vytvářet v humanizované protilátce imunogenní neoepitopy. v situaci, kde neobvyklý zbytek v donorové sekvenci je ve skutečnosti zbytek běžný
- 41 -· * · * J- · · * a v odpovídající akceptorovou sekvencí, výhodným zbytkem je jasně akceptorový zbytek.
Tabulka 1: Přehled sekvence V-oblast 3D6
Řetězec těžký lehký
Myší subskupina (id. č. Kabatovy sekv.) IHD (02688) II (005840-005844,005851- 005853, 005857, 005863)
Myší homology (Kabat/Genbank) 002727/163.1'CL OO2711/H35-C6'CL OO2733/8-l-12-5-3-l(A2- 1)'CL OO2715/ASWA21 CL 020669/#14'CL 005840/1210.7 005843/42.4bl2.2'CL 005842/BXW-14'CL 005841/42.7B3.2'CL 005851/36-60CRI-
Vzácné amino- kyseliny (% frekvence ve třídě) N40 (0,233 %) D42 (0,699 %) Yl (0,035 %) 115 (3,3 %) D27 (0,867 %)-CDRl 178 (0,677 %) L85 (0,625 %) W89 (0,815 %)-CDR3 K106A (0,295 %)
Lidská podskupina III (000488-000491, 000503, 000624) II (005046)
Chothi ovo kanonické cdr seskupení (příklad z pdb) Hl: třída 1 (2fbj) H2: třída 3 (ligc) Ll: třída 4 (lrmf) L2: třída 1 (llmk) L3: třída 1 (ltet)
Nejbližší vyřešené myší struktury pdb id: 1OPG Kodanda- pandi et al., výše (72 %, 2 A) pdb id: 1CR9; Kanyo et al., výše, (72 %, 2 A) PDB id: lNLD; Davies et al., Acta Crystallogr. D 53:186 (1997); (98 %, 2,8 A)
Nejbližší vyřešené lidské struktury 1VH (68 %, nmr) 443560 (65 %, igG, λ myelom, 1,8 A) KOL/2FB4H (60 %, myelom, 3 Á) 1LVE (57 %, LEN) 1B6DA (54 %, B-l dimer, 2,8 A) 1VGEL (54 %, autoAb)
• · • · · · • · · · ·
Výsledky dotazu VH3-48 (4512283/ Al(x63402)
na zárodečnou BAA75032.1)
(Hu) linii VH3-23 (4512287/ Al7(x63403)
(4 shora) BAA75046.1)
VH3-7 (4512300/ A18(X63396)
BAA75O56.1)
VH3-21 (4512287/ A2(m31952)
BAA75047.1)
VH3-11 (4512300/ Al9(x63397)
BAA75O53.1)
těžký řetězec a lehký řetězec ze stejné protilátky (0-81, Hirabayashi et al. NAR 20:2601)
Kabatovy sekvence, na něž se zde odkazuje jsou veřejně dostupné například z Northwestern university Biomedical Engineering Department, Kabat Database of Sequences of Proteins of immunological Interest. Trojrozměrné strukturní informace pro protilátky zde popsané jsou veřejně dostupné například z Protein Data Bank (PDB), Research Collaboratory for Structural Bioinformatics. PDB je volně dostupná prostřednictvím World wide Web internetu a je popsána Bermanem et al. (2000) Nucleic Acids Research, str. 235 - 242. Sekvence genů zárodečné linie, na něž se zde odkazuje jsou veřejně dostupné například z National Center for Biotechnology Information (ncbi) databáze sekvencí ve sbírce igh, ig kapa a Ig lambda zárodečných v genů (jako divize National Library of Medicine (NLM) u National Institutes of Health (NIH)). Vyhledávání homologií v NCBI ig Germline Genes je poskytováno IgG BLAST™.
v jednom provedení humanizovaný imunoglobulin podle vynálezu obsahuje a) lehký řetězec obsahující variabilní doménu obsahující oblasti CDR VL 3d6 a lidskou akceptorovou rámcovou soustavu, přičemž tato rámcová soustava má přinejmenším jeden, s výhodou dva, tři nebo čtyři zbytky vybrané ze skupiny sestávající z Ll, L2, L36 a L46 substituovaných odpovídajícím zbytkem 3d6 a b) těžký řetězec obsahující variabilní doménu obsahující oblasti CDR VH 3D6 a ·· ·< ·· ·· ·· ···· ··· · · · · ·· · • ** * · · · ··« · * #
4?-* *· * · · · · * · · · ί “ ·· · · ·· · · φφ lidskou akceptorovou rámcovou soustavu, přičemž tato rámcová soustava má přinejmenším jeden, s výhodou dva nebo tři zbytky vybrané ze skupiny sestávající z H49, H93 a H94 substituovaných odpovídajícím zbytkem 3d6, a případně přinejmenším jeden, s výhodou dva nebo tři zbytky vybrané ze skupiny sestávající z H74, H77 a H89 substituovaných odpovídajícím zbytkem lidské zárodečné linie.
Ve výhodnějším provedení humanizovaný imunoglobulin podle vynálezu obsahuje a) lehký řetězec obsahující variabilní doménu obsahující oblasti CDR VL 3D6 a lidskou akceptorovou rámcovou soustavu, přičemž tato rámcová soustava má zbytek 1 substituovaný tyr (Y) , zbytek 2 substituovaný val (v), zbytek 36 substituovaný leu (L), a zbytek 46 substituovaný arg (R), a b) těžký řetězec obsahující variabilní doménu obsahující oblasti CDR VH 3d6 a lidskou akceptorovou rámcovou soustavu, přičemž tato rámcová soustava má zbytek 49 substituovaný ala (A), zbytek 93 substituovaný val (v), a zbytek 94 substituovaný arg (R) , a případně zbytek 74 substituovaný ser (S), zbytek 77 substituovaný thr (T), a zbytek 89 substituovaný val (v).
v obzvlášť výhodném provedení má humanizovaná protilátka podle vynálezu strukturní vlastnosti jak jsou zde popsány a dále má přinejmenším jednu (s výhodou dvě, tři, čtyři nebo všechny) z následujících aktivit 1) váže agregovaný Αβ1-42 (např. jak je stanoveno pomocí ELISA); 2) váže Αβ v plácích (např. barvení AD nebo pdapp plaků); 3) váže Αβ s dva- až třikrát vyšší vazebnou afinitou v porovnání s chimérickou 3D6 (např. 3D6 mající myší oblasti CDR a lidské akceptorové oblasti rámcové soustavy); 4) zprostředkovává fagocytosu Αβ (např. v ex vivo testu na fagocytosu, jak je zde popsán); a
5) prochází barierou krev/mozek (např. zjišťuje se krátkodobá mozková lokalizace, např. v pdapp zvířecím modelu, jak je zde popsán).
v jiném provedení má humanizovaná protilátka podle vynálezu má strukturní vlastnosti jak jsou zde popsány, váže Αβ způsobem nebo s afinitou dostačující vyvolat přinejmenším jeden z následujících in vivo účinků: 1) snížit zátěž Αβ plaů; 2) bránit tvorbě plaků; 3) snížit hladinu rozpustného Αβ;
• · · · · · • · · · ·
4) snížit neuritovou patologii spojenou s amyloidogenní poruchou; 5) zmenšovat nebo zlepšovat přinejmenším jeden fyziologický symptom spojený s amyloidogenní poruchou;
6) zlepšovat kognitivní funkci.
V jiném provedení má humanizovaná protilátka podle vynálezu má strukturní vlastnosti jak jsou zde popsány, a specificky se váže k epitopu obsahujícímu zbytky 1-5 nebo 3 - 7 Αβ.
3. Lidské protilátky
Lidské protilátky proti Αβ jsou poskytovány řadou technik popsaných níže. Některé lidské protilátky jsou vybrány pomocí kompetitivních vazebných pokusů, nebo jinak, k získání stejné epitopové specifity jako konkrétní myší protilátka, jako je některá z myších protilátek zde popsaných. Lidské protilátky mohou být rovněž vybírány hodnocením na konkrétní epitopovou specifitu s použitím pouhého fragmentu Αβ jako imunogenu, nebo hodnocením protilátek proti souboru delečních mutantů Αβ. Lidské protilátky mají s výhodou isotypovou specifitu lidského igGl.
a. Triomová metodologie základní přístup a typický buněčný fúzní partner, SPAZ-4, pro použití v tomto přístupu byly popsány oestbergem et al., Hybridoma 2:361 (1983); Oestberg, US patent čís. 4 634 664; a Engleman et al., US patent čís. 4 634 666 (z nichž všechny jsou zde zahrnuty v úplnosti odkazem pro všechny účele). Buněčné linie produkující protilátky a získané tímto způsobem se nazývají triomy, protože jsou potomstvem ze tří buněk, dvou lidských a jedné myší. Na počátku se myší myelomová linie fúzuje s lidskými B-lymfocyty k získání xenogeneické hybridní buňky neprodukující protilátky, jako je SPAZ-4 buněčná linie popsaná Oestbergem, výše. Xenogeneická buňka je pak fúzovaná s imunizovaným lidským B-lymfocytem k získání triomové buněčné linie produkující protilátku. U triomů bylo nalezeno, že
- 45 produkují protilátky stabilněji než obyčejné hybridomy připravené z lidských buněk.
imunizované B-lymfocyty se získají z krve, sleziny, lymfatických uzlin nebo kostní dřeně lidského dárce. Když jsou žádoucí protilátky proti specifickému antigenu nebo epitopu, výhodné je použít tento antigen nebo jeho epitop k imunizaci, imunizace může být buď in vivo nebo in vitro. Pro in vivo imunizaci jsou B buňky typicky isolovány z lidského subjektu imunizovaného Αβ, jeho fragmentem, větším peptidem obsahujícím Αβ nebo fragment, nebo anti-idiotypovou protilátkou k protilátce k Αβ. l) některých způsobů se B buňky isolují ze stejného pacienta, jemuž bude nakonec podávána protilátková terapie. Pro in vitro imunizaci jsou typicky B-lymfocyty vystaveny antigenu po dobu 7-14 dnů v médiu jako je RPMI-1640 (viz Engleman, shora) doplněném 10 % lidské plasmy.
Imunizované B-lymfocyty jsou fúzovány ke xenogeneické hybridní buňce jako je SPAZ-4 dobře známými způsoby. Například: Na buňky se působí 40 - 50 %-ním polyethylenglykolem o mol. hmotn. 1000 - 4000, při asi 37 stupních C, po asi 5 - 10 min. Buňky jsou separovány z fúzovací směsi a propagovány v médiu selektivním pro žádaný hybrid (např. HAT nebo AH). Klony secernující protilátky s požadovanou spécifi tou jsou identifikovány testováním triomových kultivačních médií na schopnost vázat Αβ nebo jeho fragment. Triomy produkující lidské protilátky s požadovanou spécifitou jsou subklonovány technikou limitovaného ředění a rozrůstány in vitro v kultivačním médiu, získané triomové buněčné linie jsou pak testovány na schopnost vázat Αβ nebo jeho fragment.
I když triomy jsou geneticky stabilní, neprodukují protilátky ve velmi vysokých hladinách. Hladiny exprese mohou být zvýšeny klonováním proti látkových genů z triom do jednoho nebo více vektorů exprese, a transformování vektoru do standardních savčích, bakteriálních nebo kvasníčných buněčných 1 i ni í .
• ·
b. Transgenní ne-lidští savci
Lidské protilátky proti Αβ mhou být rovněž produkovány z ne-lidských transgenních savců majících transgeny, jež kódují přinejmenším segment lidského imunoglobulinového lokusu. obvykle je endogenní imunoglobul i nový lokus takovéhoto transgenního savce funkčně inaktivován. S výhodou segment lidského imunoglobulinového lokusu obsahuje nerearanžované sekvence složek těžkého a lehkého řetězce. Jak inaktivace endogenních imunoglobuli nových genů, tak zavedení exogenních imunoglobulinových genů může být dosaženo cílenou homologní rekombinací, nebo zavedením YAK chromosomů. Transgenní savci pocházející z tohoto postupu mají schopnost funkčního rearanžovaní sekvencí složek imunoglobulinu a exprese repertoáru protilátek různých isotypů kódovaných lidskými imunoglobuli novými geny, bez exprese edogenních imunoglobulinových genů. Produkce a vlastnosti savců majících tyto vlastnosti jsou podrobně popsány např. Lonbergem et al., WO 93/12227 (1993); US 5 877 397; US 5 874 299; US 5 814 318; US 5 789 650; US 5 770 429; US 5 661 016; US 5 633 425; US 5 625 126; US 5 569 825; US 5 545 806; Nátuře 148:1547 (1994); Nátuře Biotechnology 14:826 (1996); Kucherlapati, WO 91/10741 (1991) (z nichž všechny jsou zde zahrnuty v úplnosti odkazem pro všechny účele). Obzvlášť vhodné jsou transgenní myši. Anti-Αβ protilátky se získají imunizací transgenního ne-lidského savce Αβ nebo jeho fragmentem tak, jak je popsáno Lonbergem nebo Kucherlapatim, shora, monoklonální protilátky se připravují např. fúzí B-buněk z takovéhoto savce s vhodnými myelomovými buněčnými liniemi s použitím konvenční technologie Kohlera-Milsteina. Lidské polyklonální protilátky mohou být rovněž poskytnuty ve formě séra z lidí imunizovaných imunogenním činidlem. Takovéto polyklonální protilátky mohou případně být zkoncentrovány afinitní purifikací s použitím Αβ nebo jiného amyloidního peptidu jako afinitní ho činidla.
• ·· * · • · · · • · « • · · > · ·
c. Metody fágové expozice
Další přístup k získání lidských anti-Αβ protilátek je vyhledávání v DNA bance z lidských B buněk podle obecného protokolu uváděného Husem et al., Science 246:1275-1281 (1989). Jak je popsáno u triomové metodologie, takovéto B buňky mohou být získány z lidí imunizovaných Αβ, fragmenty, delšími polypeptidy obsahujícími Αβ nebo fragmenty nebo antiidiotypovými protilátkami. B buňky se případně získávají ze stejného pacienta, jemuž bude nakonec podávána protilátková léčba. Sekvence kódující takovéto protilátky (nebo vazebné fragmenty) jsou pak klonovány a amplifikovány. Protokol popsaný Husem se stává účinnějším v kombinaci s technologií expozice na fágu. viz např. Dower et al., WO 91/17271;
McCafferty et al. , WO 92/01047; Herzig et al. , US 5 877 218; Winter et al., US 5 871 907; Winter et al ., US 5 858 657;
Holliger et al., US 5 837 242; Johnson et al., US 5 733 743; a
Hoogenboom et al., US 5 565 332 (každý z nich je zahrnut v úplnosti odkazem pro veškeré účele). U těchto metod jsou produkovány fágové knihovny, v nichž členové vystavují různé protilátky na svých vnějších površích. Protilátky jsou obvykle vystavovány jako Fv nebo Fab fragmenty. Fágy vystavující protilátky s žádanou spécifi tou jsou vybrány afinitním obohacením s Αβ peptidem nebo jeho fragmentem.
U variace metody fágové expozice lze produkovat lidské protilátky mající specifitu vybrané myší protilátky. Viz Winter WO 92/20791. U tohoto způsobu se jako výchozí materiál používá variabilní oblast buď těžkého anebo lehkého řetězce vybrané myší protilátky. Když je například vybrána jako výchozí materiál variabilní oblast lehkého řetězce, zkonstruuje se fágová knihovna, jejíž členové vystavují stejnou variabilní oblast lehkého řetězce (tj. myší výchozí materiál) a různé variabilní oblasti těžkého řetězce. Tyto variabilní oblasti těžkého řetězce jsou získány z knihovny variabilních oblastí rearanžovaných lidských těžkých řetězců. Vybrán je fág vykazující silnou specifickou vazbu k Αβ (např. alespoň 108 nebo s výhodou alespoň 109 M'1). Variabilní oblast lidského těžkého řetězce z tohoto fága pak slouží jako výchozí • · • · » » materiál pro konstrukci další fágové knihovny, v této knihovně každý fág vystavuje stejnou variabilní oblast těžkého řetězce (tj. oblast identifikovanou z první vystavovací knihovny) a různé variabilní oblasti lehkého řetězce. Tyto variabilní oblasti lehkého řetězce jsou získány z knihovny variabilních oblastí rearanžovaných lidských lehkých řetězců. Znovu: vybrán je fág vykazující silnou specifickou vazbu k Αβ. Tyto fágy vystavují variabilní oblasti plně lidských anti- Αβ protilátek. Tyto protilátky obvykle mají stejnou nebo podobnou epitopovou specifitu jako myší výchozí materiál.
4. Produkce variabilních oblastí
Když jsou koncepčně vybrány složky CDR a rámcové soustavy humanizovaných imunoglobulinů, existuje řada způsobů dostupných pro produkci takových imunoglobulinů. Z důvodu degenerace kódu bude každou imunoglobulinovou aminokyselinovou sekvenci kódovat řada sekvencí nukleové kyseliny, žádaná sekvence nukleové kyseliny mohou být produkovány de novo syntézou dna na pevné fázi nebo PCR mutagenesou dříve připraveného variantu žádaného polynukleotidu. Pro přípravu substituovaných, deletovaných nebo inserčních variant DNA cílového polypeptidu je výhodnou metodou mutagenesa zprostředkovávaná oligonukleotidy. Viz Adelman et al., DNA 2:183 (1983). Ve stručnosti: DNA cílového polypeptidu je pozměňována hybridizaci oligonukleotidu kódujícího žádanou mutaci k templátů jednovláknové DNA. Pohybridizaci se použije DNA polymerasa k syntéze úplného druhého komplementárního vlákna templátů, jež inkorporuje oligonukleotidový primer a kóduje vybranou změnu v DNA cílového polypeptidu.
• ·
5. Výběr konstantních oblastí
Chimérické, humanizované a lidské protilátky jsou typicky produkovány rekombinantní expresí. Nukleové kyseliny kódující variabilní oblasti humanizovaného lehkého a těžkého řetězce, spojené případně s konstantními oblastmi, jsou zavedeny do vektorů exprese. Lehký a těžký řetězec mohou být klonovány do stejného vektoru nebo do různých vektorů exprese. Segmenty DNA kódující imunoglobuli nové řetězce jsou funkčně spojeny s řídícími sekvencemi vektoru(ů) exprese, jenž zajišťuje expresi imunoglobuli nových polypeptidů. Sekvence řízení exprese zahrnují, ale bez omezení, promotory (např. přirozeně spojené nebo heterologní promotory), signální sekvence, zesilovací prvky, a sekvence transkripční terminace. ve vektorech schopných transformace nebo transfekce eukaryotických buněk jsou sekvence řízení exprese s výhodou eukaryotické promotorové systémy. Poté, co je vektor inkorporován do patřičného hostitele, hostitel je udržován v podmínkách vhodných pro vysokou hladinu exprese nukleotidových sekvencí a shromažďování a purifikaci křížově reagujících protilátek.
Tyto vektory exprese jsou typicky replikovatelné v hostitelském organismu buď jako episomy, nebo jako integrální součást hostitelské chromosomální DNA. vektory exprese běžně obsahují selekční markér (například resistenci k ampicilinu, hygromycinu, tetracyklinu nebo neomycinu) k umožnění detekce těch buněk, jež jsou transformovány žádoucími sekvencemi DNA (viz např. Itakura et al., US patent 4 704 362).
E. coli je jedním prokaryotickým hostitelů obzvlášť užitečných ke klonování polynukleotidů (např. DNA sekvencí) podle vynálezu. Jiní mikrobiální hostitelé vhodní pro použití zahrnují bacily, jako je Bacillus subtilus, a jiné enterobacteriaceae, jako jsou Salmonella, Seratia, a různé druhy Pseudomonas, M těchto prokaryotických hostitelích lze rovněž sestavovat vektory exprese, které budou typicky obsahovat sekvence řízení exprese kompatibilní s hostitelskými buňkami (například počátek replikace). Navíc bude přítomen «· »· • · c » · » ♦ · * *9 · > · 9 · ·„
9· «· · · I » 1 ·· » » · 1 » » · a •9 *9 jakýkoli počet z řady dobře známých promotorů, jako jsou laktosový promotorový systém, tryptofanový (trp) promotorový systém, beta-laktamasový promotorový systém, nebo promotorový systém lambda fága. Tyto promotory budou typicky řídit expresi, případně s operátorovou sekvencí, a budou mít vazebné místo pro ribosom a podobně, pro iniciaci a kompletování transkripce a translace.
Jiné mikroby, jako jsou kvasinky, jsou rovněž užitečné k expresi. Saccharomyces je výhodný kvasinkový hostitel, s vhodnými vektory majícími sekvence řízení exprese (např. promotory), počátek replikace, terminačni sekvence a podobně, jak je žádoucí. Typické promotory zahrnují 3-fosfoglycerát kinasu a jiné glykolytické enzymy, indukovatelné kvasinkové promotory zahrnují, mezi jinými, promotory z alkoholdehydrogenasy, isocytochromu C, a enzymů zodpovědných za spotřebu maltosy a galaktosy.
Navíc k mikroorganismům mohou být k expresi a produkci polypeptidů podle vynálezu (např. polynukleotidů kódujících iminoglobuliny nebo jejich fragmenty) použity rovněž tkáňové kultury savčích buněk, viz Winnacker, From Genes to dones, VCH Publishers, N.Y., N.Y. (1987). Ve skutečnosti jsou eukaryotické buňky výhodné, protože v oboru byla vyvinuta řada vhodných hostitelských buněčných linií secernovat heterologní bílkoviny (např. intaktní imunoglobuliny); ty zahrnují buněčné linie CHO, různé Cos buněčné linie, HeLa buňky, s výhodou myelomové buněčné linie, nebo transformované B-buňky nebo hybridomy. S výhodou jsou tyto buňky ne-lidské. Vektory exprese pro tyto buňky mohou obsahovat sekvence řízení exprese, jako jsou počátek replikace, promotor, nebo zesilovací prvek (Queen et al., Immunol. Rev. 89:49 (1986)), a potřebnou informaci k místům zpracování, jako jsou vazebná místa pro ribosom, místa sestřihu RNA, polyadenylační místa a sekvence transkripční terminace. Výhodnými sekvencemi řízení exprese jsou promotory odvozené od imunoglobulinových genů, SV40, adenoviru, papiloma viru, cytomegaloviru a podobně. Viz Co et al., J. Immunol. 148:1149 (1992).
Alternativně mohou být sekvence kódující protilátky dány do transgenů k zavedení do genomu transgenního zvířete a •0 0·0· k následné expresi v mléce tohoto transgenního zvířete (viz např. Deboer et al., US 5 741 957; Rosen US 5 304 489; a Meade et al., US 5 849 992). Vhodné transgeny zhrnují kódující sekvence pro lehké nebo těžké řetězce ve funkčním spojení s promotorem a zesilovacím prvkem genu specifického pro prsní žlázu, jako je kasein nebo 1aktoglobulin.
vektory obsahující polynukleotidové sekvence, jež jsou předmětem zájmu (např. sekvence kódující lehké a těžké řetězce a sekvence řízení exprese) mohou být přeneseny do hostitelské buňky dobře známými způsoby, jež se mění podle typu buněčného hostitele. Například: Transfekce s chloridem vápenatým se běžně používá pro prokarytické buňky, zatímco zpracování s fosforečnanem vápenatým, elektroporace, lipoinfekce, bioli štika nebo trnasfekce založená na virech mohou být použity pro jiné buněčné hostitele. (Obecně viz Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Springt Harbor Press, 2. vyd., 1989) (zahrnuto odkazem v úplnosti pro veškeré účele). Jiné způsoby transformace savčích buněk zahrnují použití polybrenu, fúzi protoplastů, liposomy, elektroporaci, a mikroinjekce (obecně viz Sambrook et al., shora). Pro produkci transgenních zvířat mohou být transgeny mikroinji kovány do oplodněných oocytů, nebo mohou být inkorporovány do genomu embryonálních kmenových buněk a jádra takovýchto buněk přenesena do enukleovaných oocytů.
Pokud jsou těžký a lehký řetězec klonovány na separátních vektorech exprese, vektory jsou kotransfekovány pro získání expreese a složení intaktních imunoglobulinů. Jakmile jsou exprimovány, celé protilátky, jejich dimery, individuální lehké a těžké řetězce, nebo jiné imunoglobuli nové formy podle vynálezu, mohou být purifi kovány podle standardních postupů z oboru, včetně srážení síranem amonným, afinitních kolon, kolonové chromatografie, HPLC purifikace, gelové elektroforézy a podobně (obecně viz Scopes, Protein Purification (springerverlag, N.Y. (1982). Výhodné pro farmaceutické použití jsou v podstatě čisté imunoglobuliny o 90 až 95 % homogenity a nejvýhodnější jsou o 98 % až 99 %, nebo více, homogenity.
• · · ·
7. Fragmenty protilátek
Pro rozsah vynálezu jsou zamýšleny rovněž fragmenty protilátek, v jednom provedení jsou poskytnuty fragmenty ne-lidských, chimérických nebo lidských protilátek. V jiném provedení jsou poskytnuty fragmenty humanizovaných protilátek. Tyto fragmenty typicky vykazují specifickou vazbu k antigenu s afinitou přinejmenším 107, a typičtěji 108 nebo 109 M’1. Fragmenty humanizovaných protilátek zahrnují separované těžké řetězce, lehké řetězce, Fab, Fab', F(ab')2, Fabc a Fv. Fragmenty jsou produkovány technikami rekombinantní DNA nebo enzymatickou nebo chemickou separací intaktních imunoglobulinů.
8. Testování protilátek na terapeutickou účinnost ve zvířecích modelech
Skupiny PDAPP myší starých 7-9 měsíců dostaly injekce s 0,5 mg polyklonálních anti-Αβ nebo specifických monoklonálnich anti-Αβ protilátek v PBS. Všechny preparáty protilátek byly purifikovány tak, aby měly nízké hladiny endotoxinů. Monoklonály lze připravit proti fragmentu injikováním fragmentu nebo delší formy Αβ do myši, přípravou hybridomů a hodnocením hybridomů na protilátku, jež se specificky váže k žádanému fragmentu Αβ bez vazby k jiným nepřekrývajícím se fragmentům Αβ.
Myši dostávají injekce intraperitoneálně jak je zapotřebí po období 4 měsíců k udržení koncentrace cirkulující protilátky měřené elisa ti trém větším než 1/1000 definovaném pomocí ELISA k Αβ42 nebo jinému imunogenu. Titry se monitorují a myši jdou usmrceny na konci 6. měsíce podávání injekcí. Provedou se post mortem histochemie, Αβ hladiny a toxikologie. Na skupinu se používá 10 myší.
• · · ·
9. Hodnocení protilátek na odstraňovači aktivitu.
Vynález rovněž poskytuje způsoby hodnocení protilátky na aktivitu v odstraňování amyloidního depositu nebo jakéhokoli jiného antigenů, nebo s ním spojené biologické entity, u níž je odstraňovači aktivita žádoucí. K vyhledávání aktivity proti amyloidnímu depositu se vzorek tkáně z mozku pacienta s Alzheiměrovou chorobou nebo zvířecí model mající charakteristickou Alzheimerovu patologii uvede do kontaktu s fagocytickými buňkami nesoucími Fc receptor, jako jsou mikrogliální buňky, a s testovanou protilátkou v médiu in vitro. Fagocytické buňky mohou být primární kultura nebo buněčné linie, jako je BV-2, C8-B4 nebo thp-1. U některých způsobů se složky smíchají na mikroskopickém sklíčku k umožnění mikroskopického sledování. U některých způsobů se provádí více reakcí paralelně v jamkách mikrotitrační destičky, v tomto formátu lze do oddělených jamek montovat oddělená miniaturní mikroskopická sklíčka, nebo lze použít nemikroskopický detekční formát, jako je ELISA detekce Αβ. S výhodou se provádí série měření množství amyloidního depositu v in vitro reakční směsi, od počáteční hodnoty základní čáry předtím, než reakce začala, a s jednou nebo více testovanými hodnotami v průběhu reakce. Antigen lze detekovat například vybarvením s fluorescenčně značenou protilátkou k Αβ nebo jiné složce amyloidních plaků. Protilátka použitá k barvení může nebo nemusí být stejná jako protilátka testovaná na odstraňovači aktivitu. Snížení amyloidních depositů během reakce v porovnání se základní čarou indikuje, že testovaná protilátka má odstraňovači aktivitu. Takovéto protilátky budou pravděpodobně užitečné k prevenci nebo léčbě Alzheiměrový choroby a jiných amyloidogenních onemocnění.
Analogické způsoby mohou být použity v hodnocení protilátek na aktivitu v odstraňování jiných typů biologických entit. Test může být použit k detekci odstraňovači aktivity proti biologickým entitám snad všech druhů. Typicky má biologická entita určitou roli v lidské nebo zvířecí nemoci. Biologická entita může být poskytnuta jako vzorek tkáně nebo v isolované formě. Když je poskytnuta jako vzorek tkáně, • · • · • · · ·
vzorek tkáně je s výhodou nefixovaný k poskytnutí snadného přístupu ke složkám vzorku tkáně a k zamezení narušení konformace složek, jež se může přihodit při fixování. Příklady vzorků tkáně, jež mohou být testovány v tomto testu zahrnují rakovinnou tkáň, prekancerózní tkáň, tkáně obsahující benigní růsty jako bradavice a skvrny, tkáň infikovanou patogenními mikroorganismy, tkáň infiltrovanou zánětovými buňkami, tkáň nesoucí patologický materiál mezi buňkami (např. fibrilární perikarditidu), tkáň nesoucí aberantní antigeny, a tkáň rány. Příklady isolovaných biologických entit, jež lze použít, zahrnují Αβ, virové antigeny nebo viry, proteoglykany, antigeny nebo jiné patogenní mikroorganismy, nádorové antigeny, a adhesní molekuly. Takovéto antigeny mohou být získány, kromě jiných prostředků, z přirozených zdrojů, rekombinantní exprese nebo chemické syntézy. Vzorek tkáně nebo isolovaná biologická entita jsou v médiu uvedeny do kontaktu s fagocytickými buňkami nesoucími Fc receptor, jako jsou monocyty nebo mikrogliální buňky, a s testovanou protilátkou. Protilátka může být proti testované biologické entitě nebo proti antigenu asociovanému s touto entitou. V posledně jmenované situaci je cílem testovat, zd je biologická entita zástupně fagocytována s antigenem. Obvykle, i když ne nutně, jsou protilátka a biologická entita (někdy s asociovaným antigenem) uváděny do vzájemného kontaktu před přidáním fagocytických buněk. Pak se monitoruje koncentrace biologické entity nebo asociovaného antigenu přetrvávajících v médiu, pokud jsou tam přítomné, snížení množství nebo koncentrace antigenu nebo asociované biologické entity v médiu indikuje, že testovaná protilátka má odstraňovači aktivitu proti antigenu nebo asociované biologické entitě ve spojení s fagocytickými buňkami (viz např. Příklad 4).
B. Nukleové kyseliny kódující imunologická a terapeutická činidla
Imunitní odezvy proti amyloidním depositů mohou být rovněž indukovány podáváním nukleových kyselin kódujících • · • ·
Es:
protilátky a řetězce, z nichž se skládají, používaných k pasivní imunizaci. Takovýmito nukleovými kyselinami mohou být DNA nebo RNA. Segment nukleové kyseliny typicky kódující imunogen je typicky spojen s regulačními prvky, jako je promotor a zesilovací prvek, jež umožňují expresi DNA segmentu v zamýšlených cílových buňkách pacienta. Pro expresi v krevních buňkách, jak je žádoucí pro indukci imunitní odezvy, jsou k řízení exprese vhodné promotorové a zesilovací prvky z imunoglobulinových genů lehkého nebo těžkého řetězce nebo hlavního intermediárního časného promotoru a zesilovacího prvku CMV. Spojené regulační prvky a kódující sekvence jsou často klonovány do vektoru. Pro podávání dvoj řetězcových protilátek mohou tyto dva řetězce být klonovány ve stejném vektoru nebo v separátních vektorech.
Dostupná je řada vektorových systémů včetně retrovirových systémů (viz např. Lawrie a Tumin, Cur. Opin. Genet. Develop. 3:102-109 (1993)); adenovirových vektorů (viz např. Bett et al., 3. Virol. 67:5911 (1993)); adeno-asociováných virových vektorů (viz např. zhou et al., 3. Exp. Med. 179:1867 (1994)); virových vektorů z rodiny neštovic včetně viru vaccinie a virů ptačích neštovic, virové vektory z rodu alfa viru jako jsou vektory odvozené z Sindibi a semliki Forest Virus (viz např. Dubensky et al., 3. Virol. 70:508 (1996)); venezuelský virus encefalitidy koní (viz 3ohnston et al., US 5 643 576) a rhabdoviry, jako je virus vesikulární stomatitidy (viz Rose et al., wo 96/34625) a papilomaviry (Ohe et al., Human Gene Therapy 6:325 (1995); Woo et al., wo 94/12629 a Xiao a
Brandsma, Nucleic Acids Res. 24:2630-2622 (1996)).
DNA kódující imunogen, nebo vektor ji obsahující, mohou být sbaleny do liposomu. Vhodné lipidy a příbuzné analogy jsou popsány Eppsteinem et al, US 5 208 036; Felgnerem et al, US 5 264 618; Rosem et al, US 5 279 833; a Epandem et al, US 5 283 185. Vektory a dna kódující imunogen mohou rovněž být adsorbovány na částicový nosič, nebo asociovány s ním, kde příklady nosičů zahrnují polymethyl methakrylát a polylaktidy a poly(laktid-ko-glykosidy), viz např. McGee et al., 3. Micro Encaps. (1996).
• · • · · · • ···· · ··· · · ·
- se:-: : · : :: : ·: :.:
vektory genové terapie nebo holé polynukleotidy (např. DNA) mohou být dodávány in vivo podáváním jednotlivému pacientovi, typicky systémovým podáváním (např. nitrožilním, intraperitoneálním, nasálním, gastrickým, intradermálním, nitrosvalovým, podkožním nebo intrakraniální infuzí) nebo místní aplikací (viz např. Andreson et al . , US 5 399 364). výraz holý polynukleotid odkazuje na polynukleotid nekomplexovaný s koloidním materiálem. Holé nukleotidy jsou někdy klonovány do plasmidového vektoru. Takovéto vektory mohou dále obsahovat ulehčující činidlo, jako je bupivacin (Attardo et al., US 5 593 970). DNA lze rovněž podávat s použitím genové pistole, viz Xiao a Brandsma, shora. DNA kódující imunogen je přecipitována na povrch mikroskopických kovových zrnek. Tyto mikroprojektily jsou urychleny rázovou vlnou nebo expandujícím plynným heliem, a pronikají tkáněmi do hloubky několika buněčných vrstev, vhodný je například systém The Accel™ Gene Delivery Device vyráběný společností Agacetus, lne., Middleton WI. Alternativně může holá DNA proniknout kůží do krevního řečiště jednoduše nanesením DNA na kůži s chemickým nebo mechanickým podrážděním (viz Howel et al., WO 95/05853).
V další variaci mohou být vektory kódující imunogeny dodány do buněk ex vivo, jako je do buněk explantovaných z jednotlivého pacienta (např. lymfocytů, odsáté kostní dřeně, odebrané tkáně) nebo do universálních donorových hematopoietických kmenových buněk, s následnou reimplantací těchto buněk do pacienta, obvykle po selekci na buňky, jež inkorporovaly vektor.
• · • · · ·
57.
II. Profylaktické a terapeutické způsoby
Tento vynález je mezi jiným zaměřen na léčbu Alzheimerovy choroby a jiných amyloidogenních onemocnění podáváním terapeutických imunologických činidel (např. humanizovaných imunoglobulinů) ke specifickým epitopům v rámci Αβ pacientovi za podmínek, jež generují prospěšnou terapeutickou odezvu u pacienta (např. indukci fagocytosy Αβ, redukci plakové zátěže, inhibici tvorby plaků, zlepšení kognitivní funkce, nebo zvrat, léčbu nebo prevenci kognitivního úpadku) u pacienta, například, pro prevenci nebo léčbu amyloidogenního onemocnění. Vynález je rovněž zaměřen na použití zveřejňovaných imunologických činidel (např. humanizovaných imunoglobulinů) ve výrobě medikamentu k léčbě nebo prevenci amyloidogenního onemocnění.
Výraz léčba jak se zde používá je definován jako aplikace nebo podávání terapeutického činidla pacientovi, nebo aplikace nebo podávání terapeutického činidla isolované tkáni nebo buněčné linii z pacienta, jenž má chrobu, symptomy choroby nebo predisposici k chorobě, s účelem vyléčit, léčit, zmírnit, odstranit, změnit, napravit, zlepšit, vylepšit nebo ovlivnit chorobu, symptomy choroby nebo predisposici k chorobě.
v jednom ohledu vynález poskytuje způsob prevence nebo léčby choroby spojené s amyloidními deposity Αβ v mozku pacienta. Takovéto choroby zahrnují Alzheimerovu chorobu, Downův syndrom a kognitivní poruchy. Posledně jmenované poruchy se mohou vyskytovat s nebo bez jiných charakteristik amyloidogenních onemocnění. Některé způsoby vynálezu zahrnují podávání účinné dávky protilátky, jež se specificky váže ke složce amyloidního depositu, pacientovi. Takovéto způsoby jsou obzvlášť užitečné pro prevenci nebo léčbu Alzheimerovy choroby u lidských pacientů. Typické způsoby zahrnují podávání účinné dávky protilátky, jež se specificky váže k Αβ. Výhodné způsoby zahrnují podávání účinné dávky protilátky, jež se specificky váže k epitopu v rámci zbytků 1 - 10 Αβ, například protilátek, jež se specificky váží k epitopu v rámci zbytků 1 - 3 Αβ, protilátek, jež se specificky váží k epitopu v rámci zbytků • · • · • · · ···· ·· · • · · · · · ··· · · · — E8.-. · ···· ····
1-4 Αβ, protilátek, jež se specificky váží k epitopu v rámci zbytků 1-5 Αβ, protilátek, jež se specificky váží k epitopu v rámci zbytků 1-6 Αβ, protilátek, jež se specificky váží k epitopu v rámci zbytků 1-7 Αβ, nebo protilátek, jež se specificky váží k epitopu v rámci zbytků 3 - 7 Αβ. v ještě jiném ohledu vynález uvádí podávání protilátek, jež se váží k epitopu obsahujícímu volný N-koncový zbytek Αβ. v ještě jiném ohledu vynález uvádí podávání protilátek, jež se váží specificky k epitopu v rámci zbytků 1 - 10 Αβ, přičemž zbytek 1 nebo zbytek 7 Αβ jsou kyselina asparagová. V ještě jiném ohledu vynález uvádí podávání protilátek, jež se váží specificky k Αβ peptidu bez vazby na amyloidní prekursorový protein (APP) plné délky. V ještě jiném ohledu je protilátka isotypu lidského igGl.
V ještě jiném ohledu vynález uvádí podávání protilátek, jež se váží k amyloidnímu peptidu u pacienta a vyvolávají odstraňovači odezvu proti amyloidnímu depositu. Takováto odstraňovači odezva může být například prováděna fagocytosou zprostředkovanou Fc receptorem.
Terapeutická činidla podle vynálezu jsou typicky v podstatě prosta nežádoucích příměsí, znamená to, že činidlo je přinejmenším o 50 % (hmotn./hmotn.) čistotě, jakož i v podstatě prosta interferujících bílkovin a příměsí. Někdy mají činidla přinejmenším 80 % (hmotn./hmotn.), výhodně přinejmenším 90 nebo asi 95 % (hmotn./hmotn.) čistoty. S použitím konvenčních metod purifikace bílkovin však lze získat homogenní peptidy s přinejmenším 99 % (hmotn./hmotn.) či stoty.
Způsoby podle vynálezu lze použít jak u asymptomatických pacientů, tak u těch, jež vykazují symptomy choroby. Protilátky používané u takovýchto způsobů mohou být lidské, humanizované, chimérické nebo ne-lidské protilátky nebo jejich fragmenty (např. antigen vážící fragmenty) a mohou být monoklonální nebo polyklonální, jak je zde popsáno. V ještě jiném ohledu vynález uvádí podávání protilátek připravených z člověka, imunizovaného Αβ, přičemž tímto člověkem může být pacient, jenž má být léčen touto protilátkou.
- £9:V jiném ohledu vynález uvádí podávání protilátky s farmaceutickým nosičem jako farmaceutického prostředku. Alternativně může být protilátka podávána pacientovi podáváním polynukleotidu kódujícího přinejmenším jeden řetězec protilátky. Polynukleotid je exprimován za produkce řetězce protilátky v pacientovi. Polynukleotid případně kóduje těžký a lehký řetězec protilátky. Polynukleotid je exprimován za produkce těžkého a lehkého řetězce protilátky v pacientovi, v typických provedeních je pacient monitorován co do hladiny podávané protilátky v krvi pacienta.
Vynález tudíž naplňuje dlouhodobou potřebu terapeutických rozvrhů pro prevenci nebo zlepšování neuropatologie a, u některých pacientů, zlepšování kognitivních poruch spojených s Alzheimerovou chorobou.
A. Pacienti vhodní k léčbě
Pacienti vhodní k léčbě zahrnují jednotlivce s risikem onemocnění, ale nevykazující příznaky, jakož i pacienty příznaky již vykazující. V případě Alzheimerovy choroby je téměř u každého risiko, že bude trpět Alzheimerovou chorobou, pokud bude žít dostatečně dlouho, uváděné způsoby mohou být proto dávány profylakticky obecné populaci bez nutnosti zjišťování risika u předmětného pacienta. Uváděné způsoby jsou obzvlášť užitečné pro jednotlivce, u nichž je známo genetické risiko Alzheimerovy choroby. Takovíto jednotlivci zahrnují ty, jež mají příbuzné, kteří zažili tuto chorobu, a ty, u nichž je risiko stanoveno analýzou genetických nebo biochemických markérů. Genetické markéry risika k Alzheimerově chorobě zahrnují mutace APP genu, konkrétně mutace v posici 717 a v posicích 670 a 671, na něž se odkazuje jako na Hardyho respektive švédskou mutaci (viz Hardy, shora), línými markéry risika jsou mutace v genech presenilinu (PSi a PS2) a ApoE4, rodinná historie AD, hypercholesterolemie nebo aterosklerosa. Jednotlivci trpící Alzheimerovou chorobou mohou být rozeznáni podle charakteristické demence, jakož i přítomnosti risikových faktorů popsaných shora. Navíc je dostupná řada diagnostických • * • « « » testů pro identifikaci jednotlivců, kteří mají AD. Tyto testy zahrnují měření hladin CSF tau a Αβ42. zvýšené hladiny tau a snížené hladiny Αβ42 ukazují na přítomnost AD. Jednotlivci trpící Alzheimerovou chorobou mohou být diagnostikováni rovněž kriterii ADRDA, jak je rozebráno v sekci Příkladů.
U asymptomatických pacientů může léčba začít v jakémkoli věku (např. 10, 20, 30). Obvykle však není zapotřebí začínat léčbu dokud pacient nedosáhne 40, 50, 60 nebo 70. Léčba typicky zahrnuje více dávek během určitého časového úseku. Léčbu lze monitorovat stanovováním hladin protilátek v čase. Když odezva upadá, indikována je booster dávkování, v případě potenciálních pacientů s Downovým syndromem může léčba začít buď antenatálně podáváním léčebného činidla matce, anebo krátce po narození.
B. Léčebné režimy a dávkování
V profylaktických aplikacích jsou farmaceutické prostředky nebo medikamenty podávány pacientovi vnímavému k Alzheimerově chorobě, nebo jinak v risiku Alzheimerovy choroby, v množství dostatečném k eliminaci nebo snížení risika, zmenšení závažnosti, nebo oddálení nástupu choroby, včetně biochemických, histologických nebo behaviorálních příznaků choroby, jejich komplikací a intermediárních patologických fenotypů projevujících se během vývoje choroby. V terapeutických aplikacích jsou farmaceutické prostředky nebo medikamenty podávány pacientovi s podezřením na chorobu nebo již trpícímu takovouto chorobou v množství dostatečném k léčbě nebo alespoň k částečnému zastavení symptomů choroby (biochemických, histologických nebo behaviorálních) včetně komplikací a intermediárních patologických fenotypů během vývoje choroby.
Podávání činidla u některých způsobů snižuje nebo eliminuje myokognitivní poruchy u pacientů, u nichž se ještě nevyvinula charakteristická patologie Alzheimerovy choroby. Množství adekvátní uskutečnění terapeutické nebo profylaktické léčby je definováno jako terapeticky nebo profylakticky účinná •« · * ·« ·· • · · ♦ · · · *· · • -»··· · · · · · · ·
- <51·-* · · ·· · * ·· · dávka. Jak u profylaktických, tak u terapeutických režimů, je činidlo obvykle podáváno v několika dávkách dokud se nedosáhne dostatečné imunitní odezvy, výraz imunitní odezva nebo imunologická odezva zahrnuje vývoj humorálni (protilátkami zprostředkované) nebo buněčné odezvy (zprostředkované τ buňkami specifickými k antigenu a jejich sekrečními produkty) namířené proti antigenu v osobě recipienta.
Takovouto odezvou může být aktivní odezva, tj. indukovaná podáváním imunogenu, nebo pasivní odezva, tj. indukovaná podáváním imunoglobulinu nebo protilátky nebo vybuzených T buněk.
Imunogenní činidlo nebo imunogen je schopen indukce imunologické odezvy proti sobě za podávání savci, případně ve spojení s adjuvans. Typicky se imunitní odezva monitoruje a dávají se opakované dávky, když imunitní odpověď začíná klesat.
Účinné dávky prostředků podle vynálezu pro léčbu shora popsaných stavů kolísají v závislosti na mnoha různých faktorech, včetně prostředků podávání, cílového místa, fyziologického stavu pacienta, skutečnosti, zda pacient je člověk nebo zvíře, podávání jiných medikamentů, a toho, zda léčba je profylaktická nebo terapeutická. Obvykle jde o lidské pacienty, ale lze rovněž léčit ne-lidská zvířata včetně transgenních zvířat. Léčebné dávkování je zapotřebí titrovat k optimalizaci bezpečnosti a účinku.
Pro pasivní imunizaci protilátkou je dávka v rozsahu od asi 0,0001 do 100 mg/kg a obvykleji od 0,01 do 5 mg/kg tělesné hmotnosti hostitele. Například: Dávkování může být 1 mg/kg tělesné hmotnosti nebo 10 mg/kg tělesné hmotnosti nebo v rozsahu 1-10 mg/kg, s výhodou alespoň 1 mg/kg. Subjektům mohou být takovéto dávky podávány denně, v alternativní dny, týdenně nebo podle jakéhokoli jiného rozvrhu stanoveného empirickou analýzou. Typická léčba zahrnuje podávání ve více dávkách po delší období, například přinejmenším šesti měsíců. Další typické léčebné režimy zahrnují podávání jednou za každé dva týdny nebo jednou měsíčně nebo jednou za každé 3 měsíce nebo 6 měsíců. Typické rozvrhy dávkování zahrnují 1-10 mg/kg nebo 15 mg/kg v po sobě následujících dnech, 30 mg/kg ·*·€
99 « * · • ' < ·>·> · » 4 * * 9 ·· · » · · « · · — *62··· · · · · · · 9 · · ·· * · 99 9 Λ · * ·« v alternativních dnech nebo 60 mg/kg týdně. U některých způsobů jsou dvě nebo více monoklonálnich protilátek s odlišnou vazebnou spécifitou podávány současně, přičemž v tomto případě spadá do uvedeného rozsahu dávkování každé podávané protilátky.
Protilátka je obvykle podávána ve více případech, intervaly mezi jednotlivými podáváními mohou být týdenní, měsíční nebo roční, intervaly mohou být rovněž nepravidelné jak ukáže měření krevní hladiny protilátky k Αβ v pacientovi. U některých způsobů je podávání nastavováno k dosažení plasmatické koncentrace protilátky 1 - 1000 pg/ml a u některých způsobů 25 - 300 pg/ml. Alternativně může být protilátka podávána ve formulaci k trvalému uvolňování, přičemž v tomto případě je zapotřebí méně časté podávání. Dávka a frekvence kolísají v závislosti na poločase protilátky v pacientovi. Obecně vykazují nejdelší poločas lidské protilátky, následované humanizovanými protilátkami, chimérickými protilátkami a ne-lidskými protilátkami.
Dávka a frekvence mohou kolísat v závislosti na tom, zda léčba je profylaktická nebo terapeutická. U profylaktických aplikací jsou prostředky obsahující protilátky nebo jejich směsi podávány pacientovi dosud ne v chorobném stavu k podpoře pacientovy odolnosti. Takovéto množství je definováno jako profylaktická účinná dávka. U tohoto použití závisí přesné množství opět na pacientově zdravotním stavu a celkové imunitě, ale obecně je v rozsahu 0,1 až 25 mg na dávku, speciálně 0,5 až 2,5 mg na dávku. Podáváno je poměrně nízké dávkování v poměrně málo frekventovaných intervalech po dlouhé časové období. U některých pacientů pokračuje podávání po zbytek jejich života.
U terapeutických aplikací je někdy potřebné relativně vysoké dávkování (např. od 1 do 20 mg protilátky na dávku, s dávkováním od 5 do 25 mg používaným obvykleji) v relativně krátkých časových intervalech, dokud se nezastaví nebo neredukuje postup nemoci, nebo s výhodou dokud pacient nevykazuje částečné nebo úplné zlepšení příznaků nemoci. Pak může být pacientovi podáván profylaktický režim.
• · • · • ·
- 63 Dávky pro nukleové kyseliny kódující protilátky jsou v rozsahu od asi 10 ng do 1 g, 100 ng do 100 mg, 1 pg do 10 mg nebo 30 - 300 pg DNA na jednoho pacienta. Dávky pro infekční virové vektory kolísají od 10 - 100 nebo více virionů na dávku.
Terapeutická činidla pro profylaktické nebo terapeutické působení mohou být podávána parenterálním, místním, nitrožilním, orálním, podkožním, intraarteriálním, intrakraniálním, intraperitoneálním, intranasálním nebo nitrosvalovým způsobem. Nejtypičtější cesta podávání imunogenního činidla je podkožní, i když jiné cesty mohou být stejně účinné. Druhou nejběžnější cestou je nitrosvalová injekce. Tento typ injekce se nejtypičtěji provádí do svalů paže nebo nohy. U některých způsobů jsou činidla injikována přímo do konkrétní tkáně, kde se akumulují deposity, například interkraniální injekcí. Pro podávání protilátky je nejvýhodnější nitrosvalová injekce nebo nitrožilní infuze. U některých způsobů se konkrétní terapeutické protilátky injikují přímo do lebky, u některých způsobů jsou protilátky podávány jako prostředek nebo přístroj k trvalému uvolňování, jako je přístroj Medipad™.
Činidla podle vynálezu mohou případně být podávána v kombinaci s jinými činidly, jež jsou přinejmenším částečně účinná v léčbě amyloidogenních onemocnění. v případě Alzheiměrová a Downova syndromu, u nichž se amyloidní deposity vyskytují v mozku, činidla podle vynálezu mohou být podávána spolu s jinými činidly, jež ulehčují průchod činidel podle vynálezu přes barieru krev/mozek.
C. Farmaceutické prostředky
Činidla podle vynálezu jsou často podávána jako farmaceutické prostředky obsahující aktivní terapeutické činidlo a různé jiné farmaceuticky přijatelné složky, viz Remingnton's Pharmaceutical Science (15. vyd., Mack Publishing Company, Easton, Pensylvania (1980)). Výhodná forma závisí na zamýšleném způsobu podávání a therapeutické aplikaci, • · • · • · • · «
- 64 Prostředky rovněž obsahují, v závislosti na žádané formulaci, farmaceuticky přijatelné, netoxické nosiče nebo ředidla, jež jsou definovány jako vehikly běžně používané k formulaci farmaceutických prostředků pro podávání zvířatům a lidem. Ředidlo je vybráno tak, aby neovlivňovalo biologickou aktivitu kombinace. Příklady takovýchto ředidel jsou destilovaná voda, fyziologický roztok soli pufrovaný fosfátem, Ringerovy roztoky, roztok sacharosy a Hankův roztok.Farmaceutické prostředky nebo formulace mohou navíc obsahovat rovněž jiné nosiče, adjuvans, nebo netoxické, neterapeutické neimunogenní stabilizátory a podobně.
Farmaceutické prostředky mohou rovněž obsahovat velké, pomalu metabolizované molekuly, jako jsou bílkoviny, polysacharidy jeko je chitosan, kyseliny polymléčné, kyseliny polyglykolové a kopolymery (jako je latexem funkcionalizovaná sepharosa™, agarosa, celulosa, a podobně), polymerní aminokyseliny, kopolymery aminokyselin, a lipidové agregáty (jako jsou olejové kapičky nebo liposomy). Tyto nosiče mohou navíc působit jako imunostimulační činidla (tj. adjuvans).
Pro parenterální podávání mohou být činidla podle vynálezu podávána jako injikovatelné dávky roztoku nebo substance ve fyziologicky přijatelném ředidle s farmaceutickým nosičem, což může být sterilní kapalina, jako je voda, oleje, solný roztok, glycerol nebo ethanol. Navíc mohou být v prostředku přítomny pomocné substance jako jsou zvlhčovači a emulgační činidla, povrchově aktivní látky, pH pufrující substance a podobně.Jinými složkami farmaceutických prostředků jsou složky ropného, živočišného, rostlinného nebo syntetického původu, například podzemnícový olej, sojový olej, a minerální olej. Obecně jsou výhodnými kapalnými složkami, obzvlášť pro injekční roztoky, propylenglykol a polyethylenglykol. Protilátky mohou být podávány ve formě depotní injekce nebo implantátového přípravku, jež mohou být formulovány takovým způsobem, aby umožňovaly trvalé uvolňování aktivní složky. Prostředek obsahuje, jako typický příklad, monoklonální protilátku 5 mg/ml, formulovanou ve vodném pufru setávajícím z 50 mM L-histidinu, 150 mM Nad, nastaveném na pH 6,0 pomocí HCl.
• · • ·
- 65 Typicky jsou prostředky připravovány jako injikováte!né, buď jako kapalné roztoky, nebo jako suspense; připravovány mohou být rovněž pevné formy, vhodné k rozpuštění nebo suspendování v kapalných vehiklech před injekcí. Prostředek může být rovněž pro zesílený adjuvanční účinek emulgován nebo uzavřen do liposomú nebo mikročástic, jako polylaktid, polyglykolid nebo kopolymer, jak je rozebráno shora (viz Langer, Science 249:1527 (1990) a Hanes, Advanced Drug
Delivery Reviews 28:97 (1997)). činidla podle vynálezu mohou být podávána ve formě depotní injekce nebo implantátového přípravku, jež mohou být formulovány takovým způsobem, aby umožňovaly trvalé uvolňování aktivní složky.
Další formulace vhodné pro jiné způsoby podávání zahrnují orální, intranasální a pulmonární formulace, čípky a transdermální aplikace. Pro čípky, vazebná činidla a nosiče zahrnují například polyalkylenglykoly nebo triglyceridy; takovéto čípky lze tvarovat ze směsí obsahujících aktivní složku v rozsahu 0,5 % až 10 %, s výhodou 1 % - 2 %. Orální formulace obsahují excipienty, jako manitol, laktosu, škrob, stearát hořečnatý, sodnou sůl sacharinu, celulosu a uhličitan hořečnatý, ve farmaceutické čistotě. Tyto prostředky mají formu roztoků, suspensí, tablet, pilulek, kapslí, formulací k trvalému uvolňování nebo prášků a obsahují 10 % - 95 % aktivní složky, s výhodou 25 % - 70 %.
Místní aplikace mohu vést k transdermálnímu nebo intradermálnímu dodávání. Místní podávání může být ulehčeno současným podáním činidla s choleratoxinem nebo jeho detoxifi kovanými deriváty nebo podjednotkami nebo podobnými bakteriálními toxiny (viz Glenn et al. , Nátuře 391:851 (1998)).Společného podávání lze dosáhnou použitím složek jako směsi, nebo provázaných molekul získaných chemickým křížovým provázáním nebo expresí jako fúzního proteinu.
Alternativně lze transdermálního dodávání dosáhnout použitím náplasti na kůži nebo použitím transferosomů (Paul et al., Eur. J. immunol. 25:3521 (1995); Cevc et al., Biochem. Biophys. Acta 1368:201-215 (1998)).
- 66 • · · · « · · • · · · · » · · 4 » · · 4 • · · · • · · · • · 4 • · · • · 4 lil. Monitorování průběhu léčby
Vynález poskytuje způsoby monitorování léčby u pacienta trpícího Alzheiměrovou chorobou nebo k ní vnímavého, tj. monitorování průběhu léčby podávané pacientovi. Způsoby lze používat jak u terapeutické léčby symptomatických pacientů, tak profylaktické léčby nesymptomatických pacientů. Obzvlášť jsou tyto způsoby užitečné pro monitorování pasivní imunizace (např. měření hladiny podávané protilátky).
Některé způsoby zahrnují stanovení hodnoty základní čáry, například hladinu protilátky profilu pacienta před podáním dávky činidla, a srovnání s hodnotou pro profil nebo hladinu po léčbě, významný nárůst (tj. větší než typická hranice experimentální chyby v opakovaných měřeních stejného vzorku, vyjádřená jako jedna standardní odchylka od průměru takovýchto měření) v hodnotě hladiny nebo profilu signalizuje positivní výsledek léčby (tj., že podávání činidla dosáhlo žádoucí odezvy). Když se hodnota pro imunitní odezvu významně nezmění, nebo klesne, indikuje to negativní výsledek léčby.
U jiných způsobů je kontrolní hodnota (tj. průměr a standardní odchylka) hladiny nebo profilu stanovována pro kontrolní populaci. Jednotlivci kontrolní populace typicky nedostaly předcházející léčbu. Měřené hodnoty hladiny nebo profilu u pacienta po podávání terapeutického činidla jsou pak porovnávány s touto kontrolní hodnotou. Významný nárůst v porovnání s kontrolní hodnotou (tj. větší než jedna standardní odchylka od průměru) signalizuje positivní nebo dostatečný výsledek léčby. Nepřítomnost významného rozdílu nebo snížení signalizuje negativní nebo nedostatečný výsledek léčby, v podávání činidla se obecně pokračuje dokud se hladina zvyšuje v porovnání s kontrolní hodnotou. Jako dříve, dosažení plato v porovnání s kontrolní hodnotou je ukazatelem, že podávání nebo léčba mohou být přerušeny nebo sníženy co do dávek nebo frekvence.
U jiných způsobů je kontrolní hodnota (tj. průměr a standardní odchylka) hladiny nebo profilu stanovována pro kontrolní populaci jednotlivců, kteří se podrobili léčbě terapeutickým činidlem a jejichž hladiny nebo profily dosáhly • · • · · · • ·
- 67 plato v odezvě na léčbu. Měřené hodnoty hladiny nebo profilu u pacienta jsou pak porovnávány s touto kontrolní hodnotou. Když hladina u pacienta změřená není významně odlišná (tj. více než jedna standardní odchylka) od kontrolní hodnoty, léčba může být přerušena. Když je hladina u pacienta významně pod kontrolní hodnotou, je oprávněno pokračující podávání činidla. Když hladina u pacienta zůstává pod kontrolní hodnotou, pak může být indikována změna léčby.
U jiných způsobů je pacient, jenž v daný čas nedostává léčbu, ale podrobil se předešlému léčebné kúře, monitorován na hladiny nebo profily protilátky ke stanovení, zda je potřebné obnovení léčby. Hladina nebo profil měřené u pacienta mohou být porovnány s hodnotou dosaženou u pacienta dříve po předešlé kúře. významný pokles ve srovnání s předešlým měřením (t j. větší než typická hranice chyby v opakovaných měřeních stejného vzorku) je indikací, že léčba má být znovu nasazena. Alternativně může být hodnota měřená u pacienta porovnána s kontrolní hodnotou (průměr plus standardní odchylka) stanovenou v populaci pacientů po podrobení se léčebné kúře. Alternativně může být hodnota měřená u pacienta porovnána s kontrolní hodnotou z populace profylakticky léčených pacientů, kteří zůstávají bez symptomů choroby, nebo populace terapeuticky léčených pacientů, kteří vykazují zlepšení charakteristik choroby, ve všech těchto případech je významné snížení v porovnání s kontrolní hladinou (tj. víc než standardní odchylka) indikací, že léčba musí být u pacienta znovu nasazena.
Vzorek tkáně pro analýzu je typicky krev, plasma, sérum, slizničná tekutina nebo cerebrospinální tekutina z pacienta. Vzorek je analyzován například na hladiny nebo profily protilátek k Αβ peptidu, např. hladiny nebo profily humanizovaných protilátek. Metody ELISA k detekci protilátek specifických k Αβ jsou popsány v sekci Příkladů. U některých způsobů je hladina nebo profil podávané protilátky stanovována s použití testu odstraňování, například v in vitro testu fagocytosy, jak je zde popsáno, v takovýchto metodách se vzorek tkáně z testovaného pacienta uvede do kontaktu s amyloidními deposity (např. z PDAAP myši) a fagocytickými • · • · • · · · · · • · · · · · * • ·· ·«· ·· buňkami nesoucími Fc receptory. Pak se monitoruje následné odstraňování amyloidního depositu. Existence a rozsah odstraňovači odezvy poskytuje indikaci existence a hladiny protilátek účinných v odstraňování Αβ ve vzorku tkáně testovaného pacienta.
Profil protilátky po pasivní imunizaci typicky vykazuje okamžitý vrchol v koncentraci protilátky následovaný exponenciálním úbytek. Bez dalších dávek se úbytek přibližuje hladině před léčbou v období dnů až měsíců v závislosti na poločase podávané protilátky. Poločas některých lidských protilátek je například řádu 20 dnů.
U některých způsobů se měří hodnota základní čáry protilátky k Αβ u pacienta před podáváním, druhé měření se provede brzy potom k stanovení vrcholu hladiny protilátky a jedno nebo více dalších měření se provádí v intervalech k monitorování úbytku hladiny protilátky. Když se hladina protilátky sníží k základní čáře nebo předem určenému procentu vrcholu s odečtenou základní čarou (např. 50 %, 25 % nebo 10 %) podává se další dávka protilátky. U některých způsobů jsou hodnoty vrchlu nebo dalších měřených hladin bez pozadí porovnávány s referenčními hladinami dříve určenými tak, že zakládají prospěšný profylaktický nebo terapeutický léčebný režim u jiných pacientů. Když je měřená hladina významně nižší než referenční hladina (např. nižší než průměr mínus jedna standardní odchylka referenční hodnoty v populaci pacientů, jimž léčba prospívá), je indikováno podávání další dávky protilátky.
Další metody zahrnují monitorování, v průběhu léčby, jakéhokoli fyziologického symptomu uznávaného v oboru (např. tělesného nebo mentálního symptomu), na nějž se rutinně výzkumník nebo lékař spoléhá při diagnóze nebo monitorování amyloidogenního onemocnění (např. Alzheimerovy choroby). Lze například monitorovat kognitivní poruchy. Jmenované poruchy jsou symptomem Alzheimerovy choroby a Downova syndromu, ale mohou se rovněž vyskytovat bez jiných charakteristik těchto chorob. Kognitivní poruchy lze například monitorovat stanovení pacientových výsledků počas celého průběhu léčby v testu Mini-Menta! State Exam v souladu s konvencí.
• · · · • · · · • ·
- 69 C. Soupravy
Vynález dále poskytuje soupravy pro provádění monitorovacích metod popsaných shora. Takovéto soupravy typicky obsahují činidlo, jež se specificky váže k protilátkám k Αβ. Souprava může rovněž zahrnovat značení. Pro detekci protilátek k Αβ je značkou typicky forma značených anti-idiotypových protilátek. Pro detekci protilátek může být činidlo dodáváno navázané k pevné fázi, jak jsou jamky mi krotitrační destičky, soupravy typicky obsahují rovněž štítek poskytující návod k použití soupravy. Štítek může rovněž zahrnovat graf nebo jinou odpovídající pomůcku ke korelaci měřeného značení s hladinami protilátek k Αβ. výraz štítek odkazuje na jakýkoli psaný nebo zaznamenaný materiál, jenž je připojen k soupravě, nebo ji jinak doprovází, vždy po dobu její výroby, dopravy, prodeje nebo použití. Výraz štítek například zahrnuje reklamní letáčky a brožury, obalové materiály, instrukce, audio- a videokazety, počítačové disky, jakož i text tištěný přímo na soupravě.
Vynález poskytuje rovněž diagnostické soupravy, například výzkumné, detekční nebo diagnostické soupravy (např. pro provádění in vivo zobrazování). Takovéto soupravy typicky obsahují protilátku k vazbě na některý epitop Αβ, s výhodou v rozsahu zbytků 1 - 10. S výhodu je protilátka značená nebo je v soupravě zahrnut sekundární značící reagens. S výhodou je souprava označena instrukcemi pro provádění zamýšlené aplikace, například pro provádění in vivo zobrazovacího testu. Typickými příklady protilátek jsou protilátky zde popsané.
D. in vivo zobrazování
Vynález poskytuje způsoby k in vivo zobrazování amyloidních depositů u pacienta. Takovéto způsoby jsou užitečné k diagnose nebo potvrzovací diagnose Alzheiměrový choroby nebo vnímavosti k ní. Tyto způsoby mohou například být použity u pacienta majícího příznaky demence. Když pacient má abnormální amyloidní deposity, je pravděpodobné, že trpí • · · ·
- 70 « · • · · · · · • · a · a a - -
Alzheimerovou chorobou. Tyto způsoby lze použít rovněž u nesymptomatických pacientů. Přítomnost abnormálních depositů amyloidu indikuje vnímavost k budoucí symptomatické chorobě. Tyto způsoby jsou rovněž užitečné pro monitorování postupu choroby nebo odezvy k léčbě u pacientů, kteří byly předem diagnostikováni na Alzheimerovu chorobu.
Tyto způsoby pracují s podáváním reagens, jako je protilátka, jež se váže k Αβ, pacietovi a s následnou detekcí činidla poté, co se navázalo. Výhodné protilátky se váží k Αβ depositům v pacientovi, aniž by se vázaly k APP polypeptidů plné délky. Obzvlášť výhodné jsou protilátky vážící se k epitopu Αβ v rámci aminokyselin 1 - 10. U některých způsobů se protilátka váže k epitopu v rámci aminokyselin 1 - 7 Αβ. Takovéto protilátky typicky vážou Αβ a indukují k němu odstraňovači odezvu. Odstraňovači odezvě však lze předejít použitím fragmentů protilátek, jimž chybí konstantní oblast plné délky, jako jsou Fab. Protilátky vážící se k epitopům směrem k C-konci od zbytku 10 Αβ obecně nevykazují tak silný signál jako protilátky vážící se k epitopům v rámci zbytků 1 10, pravděpodobně proto, že C-terminální epitopy jsou nepřístupné v amyloidních depositech. V souladu s tím jsou takovéto protilátky méně výhodné.
Diagnostická reagens mohou být podávána nitrožilní injekcí do těla pacienta, nebo do mozky intrakraniální injekcí nebo vyvrtáním otvoru v lebce. Dávkování reagens by mělo být stejné jako pro léčebné metody. Typicky je reagens značené, i když u některých způsobů je primární reagens s afinitou pro Αβ neznačené a k vazbě na primární činidlo se použije sekundární značící činidlo. Výběr značení závisí na prostředcích detekce. Pro tomografickou detekci bez chirurgického zásahu je vhodné použití paramagnetického značení. S použitím PET nebo SPÉCT lze rovněž detekovat radioaktivní značky.
Diagnosa se provede porovnáním počtu, velikosti nebo intensity označených míst s odpovídajícími hodnotami základní čáry. Hodnoty základní čáry mohou representovat průměrné hladiny u populace jednotlivců, kteří nemají nemoc. Hodnoty základní čáry mohou representovat rovněž dřívější hladiny stanovené u téhož pacienta. Hodnoty základní čáry mohou být například stanoveny u pacienta před začátkem léčby, a měřené hodnoty potom porovnávány s hodnotami základní čáry. Pokles hodnot v poměru k signálům základní čáry signalizuje positivní odezvu na léčbu.
vynález bude úplněji popsán následujícími neomezujícími příklady.
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1
Terapeutická účinnost anti-Αβ protilátek mAb 2h3, mAb 10D5, mAb 266, mAb 21F12 a mAb Αβ1-42
Tento příklad testuje kapacitu různých monoklonálnich a polyklonálních protilátek k Αβ v inhibici akumulace Αβ v mozku heterozygotních transgenních myší.
A. Uspořádání studie
Šedesát heterozygotních PDAPP myší, samců a samic, stáří 8,5 až 10,5 měsíce, bylo získáno z Charles River Laboratory. Myši byly rozděleny do šesti skupin k působení různými protilátkami proti Αβ. Zvířata byla rozdělena tak, aby ve skupinách jak jen možno co nejvěrněji odpovídalo pohlaví, stáří, předkové a zdroj zvířat. Tabulka 2 zobrazuje experimentální uspořádání.
• « • · • · · ·
Tabulka 2. Experimentální uspořádání
Skupí na působení Počet3 Působení protilátkou Spécifi ta protilátky Isotyp protilátky
1 9 žádnou (jen PBS) ŇA6 NA
2 10 polyklonál ní Αβ1-42 směsný
3 0 mAbd 2h3 Αβ1-12 IgGl
4 8 mAb 10D5 ~ Áj33^7 IgGl
5 6 mAb 266 Αβ13-28 IgGl
6 8 mAb 21F12 Αβ33-42 lgG2a
a. Počet myší ve skupině při ukončení pokusu, všechny skupiny začínaly s 10 zvířaty na skupinu.
b. NA: nehodí se
c. myší polyklonál proti agregovanému Αβ42
d. mAb: monoklonální protilátka
Jak je ukázáno v Tabulce 2, protilátky zahrnovaly čtyři myší Αβ-specifické monoklonální protilátky, 2h3 (namířené proti Αβ zbytkům 1 - 12), 10D5 (namířené proti Αβ zbytkům 3 7), 266 (namířené proti Αβ zbytkům 13 - 28 a vážící se k rozpustnému, ale ne agregovanému AN1792), 21Π2 (namířené proti Αβ zbytkům 33 - 42). Na pátou skupinu se působilo frakcí Αβ-specifické polyklonální protilátky (získané imunizací agregovaným AN1792). Skupina negativní kontroly dostala ředidlo PBS samotné, bez protilátky.
B. Monitorování průběhu léčby
Monoklonální protilátky byly injikovány v dávce asi 10 mg/kg (s předpokladem, že myši mají hmotnost 50 g). Titry protilátek byly monitorovány po 25 týdnů působení, injekce byly podávány intraperitoneálně v průměru každých sedm dnů, aby se udržely titry anti-Αβ nad 1000. I když s mAb 266 byly měřeny nižší titry, protože se dobře neváže k agregovanému AN1792 použitému v testu jako záchytný antigen, zůstal pro tuto skupinu stejný dávkovači rozvrh, se skupinou, jež dostávala monoklonální protilátku 2H3, se po třech týdnech « ·
- 73 nepokračovalo, protože tato protilátka byla in vivo odstraňována příliš rychle.
Ke stanovení titrů protilátky byl z každé skupiny náhodně vybrána podskupina tří myší a odebrány vzorky krve těsně před každou intraperitoneální injekcí, celkem 30 odebrání vzorků. Titry protilátek byly měřeny jako ΑβΙ-42-vážící protilátka s použitím sendvičové ELISA s plastovými mul ti-jamkovými destičkami pokrytými Αβ1-42 jak je podrobně popsáno v sekci Obecné materiály a metody. Střední hodnoty pro každý odběr jsou uvedeny pro polyklonální protilátku a monoklonály 10D5 a 21F12 v Tabulce 3.
Tabulka 3
Týdny 21F12 21F12 Týdny 10D5 10D5 Týdny póly poiy
0,15 500 0,15 3000 0,15 1600
0,5 800 0,5 14000 0,5 4000
1 2500 1 5000 1 4500
1,5 1800 1,1 5000 1,5 3000
2 1400 1,2 1300 2 1300
3 6000 2 3000 3 1600
3,5 550 3 4000 3,5 650
4 1600 3,5 500 4 1300
5 925 4 2400 5 450
6 3300 5 925 6 2100
7 4000 6 1700 7 1300
8 1400 7 1600 8 2300
9 1900 8 4000 9 700
10 1700 9 1800 10 600
11 1800 10 1800 11 600
12 1000 11 2300 12 1000
13 1500 12 2100 13 900
14 1300 13 2800 14 1900
15 1000 14 1900 15 1200
16 1700 15 2700 16 700
17 1700 16 1300 17 2100
18 5000 17 2200 18 1800
19 900 18 2200 19 1800
20 300 19 2500 20 1200
22 1750 20 980 22 1000
23 1600 22 2000 23 1200
24 1000 23 1000 24 675
25 1100 24 850 25 850
26 2250 25 600 26 1600
27 28 1400 26 27 28 1100 1450 27 28 1900
• ·
Titry v tomto časovém období byly v průměru kolem 1000 pro preparát polyklonální protilátky a lehce nad touto hladinou pro zvířata, ne něž se působilo 10D5 a 21F12.
Působení pokračovalo po více než šestiměsíční období po celkem 196 dnů. zvířata byla utracena jeden týden po poslední dávce.
C. Hladiny Αβ a app v mozku
Po asi šestiměsíčním působení různými preparacemi anti-Αβ protilátek byly po propláchnutí solným roztokem ze zvířat vyňaty mozky. Jedna polokoule byla připravena pro imunohistochemickou analýzu a druhá byla použita ke kvantifikaci hladin Αβ a APP. K měření koncentrací různých forem beta amyloidního peptidů a amyloidního prekursorového proteinu (APP) byla polokoule rozřezána a homogenáty hipokampální, kortikální a cerebelární oblasti byly preparovány v 5 M guanidinu. Ty byly seriál ně ředěny a hladina amyloidního peptidů nebo app byla kvantifikována srovnáním se sérií ředění standardů Αβ peptidů nebo APP o známé koncentraci ve formátu ELISA.
Hladiny celkového Αβ a Αβ1-42 měřené ELISA v homogenátech kortexu a hipokampu a hladina celkového Αβ v cerebelu jsou ukázány v Tabulkách 4, 5 respektive 6. Mediánová koncentrace celkového Αβ pro kontrolní skupinu (inoku!ovanou PBS) byla 3,6-krát vyšší v hipokampu než v kortexu (medián 63 389 ng/g tkáně hipokampu ve srovnání s 17 818 ng/g pro kortex). Mediánová hladina pro cerebelum kontrolní skupiny (30.6 ng/g tkáně) byla víc než 2000-krát nižší než v hypokampu. Tyto hladiny jsou podobné těm, jež byly dříve udávány pro heterozygotní PDAPP transgenní myši tohoto stáří (lohnson-Wood et al., shora).
Pro kortex měla jedna léčená skupina medián Αβ hladiny, měřený jako Αβ1-42, jenž se významně lišil od kontrolní skupiny (p < 0,05), tedy zvířata, jež dostávala polyklonální anti-Αβ protilátku, jak ukazuje Tabulka 4. Medián Αβ hladiny Αβ1-42 byl snížen o 63 % ve srovnání s kontrolou pro tuto léčenou skupinu. Medián Αβ hladin Αβ1-42 byl rovněž významně • · • »
- 75 snížen o 55 % ve srovnání s kontrolou v jedné další skupině, tedy u zvířat, jež dostávala dávky mAb 10D5 (p = 0,0433).
Tabulka
KORTEX Průměry ΓΜ sř cd < ELISA hodnota 12621 ±7456 4454 ±3347 6943 ±3351 7489 ±6921 11005 ±6324
Celkový Αβ ELISA hodnota 16150 ±7456® 5912 ±4492 9695 ±6929 9204 ±9293 12481 ±7082
Médi ány C\l sť Cd < % změny NA -65 -55 -39 f\J 1
P hodnota NA 0,0071 0,0433 0,1255 0,7003
ELISA hodnota 13802 1 1 4892 6214 8481 | 13578
Celkový Αβ % změny NA -65 -56 -49 LTí 1
u μ Q- c Ί3 O -C □ < z 0,0055 0,1019 0,1255 0,2898
ELISA hodnotab 17818 6160 7915 9144 15158
fd μ φ -u o CL cn 10 00 <£> OO
Skupí na PBS polyklon. anti-Αβ42 mAb 10D5 LO LO ΓΜ -Ω < E mAb 21F12
=3 in
O
CL
U c
o (ť c
C
ΙΟ.
Lať w
nJ μ
rt >!_ 'r· >
N μ
φ >u o
o.
ng/q tkáně
Analýza Mann whitney NA: nehodí se Standardní odchylka (tiXi U3 φ • · • · • · · · • ·
- π Ν hipokampu nebyla procentuální redukce celkového Αβ (50 %, p = 0,0055) spojená s působením polyklonální anti-Αβ protilátky tak velká, jak bylo pozorováno v kortexu (65 %) (Tabulka 5). Absolutní velikost redukce však byla téměř 3-krát větší v hipokampu než v kortexu, čistá redukce o 31683 ng/g tkáně v hipokampu versus 11658 ng/g tkáně v kortexu. Při měření jako hladiny silněji amylogenní formy Αβ, Αβ1-42, místo jako celkového Αβ, redukce dosažená s polyklonální protilátkou byla významná (p = 0,0025). Mediánové hladiny ve skupinách, na něž se působilo mAb 10D5 a mAb 266, byly redukovány o 33 % respektive 21%.
• · • · · · · · • · · · · · ·
Tabu!ka
LT>
HIPOKAMPUS Průměry ΓΜ CÍL < ELISA hodnota 52801 ±14701 24853 ±18262 36465 ±17146 32919 ±25372 50305 ±23927
Celkový Αβ ELISA hodnota 58351 ±13308® 30058 ±22454 44581 ±18632 36419 ±27304 57327 ±28927
c >ttí •r- T3 Φ Σ ztdv % změny NA os- -33 -21 -12
P hodnota 1 VN 0,0025 0,0543 0,0990 0,8099
ELISA hodnota 54429 27127 L.............. 36290 43034 47961
Celkový Αβ % změny VN o LT) 1 -26 m f\l 1 -19
u rt P CL C 13 O -C σ < z 0,0055 0,0675 0,0990 0,7728
ELISA hodnota5 63389 31706 46779 48689 51563
nj p Φ >u o CL σ> 10 00 id 00
Skupí na PBS polyklon. anti-Αβ42 LT) Q O i—1 O < E ID <D CM D < E ΓΜ r—1 LL r-1 r\j -Ω < E
ΙΛ
O
CL
U c
o
Lsť nJ c
c •γΟ. >
Φ JZ C (Λ +-J r—
Π3 -C c 3
Φ
P C (Λ Π5 C >1_>φ fO '1'i- C >'rt o NJZ rdJC p n φ P '> C Φ cnr— >u\ rti O D1C< Q. C<Z
Standardní odchylka nJ-Q UO Φ ·· ♦· » · · * · · · · * · · 4 * · · « • · · «
- 79 Celkový Αβ byl měřen rovněž v cerebelu (Tabulka 6). Skupiny, jež dostávaly dávky polyklonálního anti-Αβ a protilátky 266 vykazvaly významnou redukci hladin celkového Αβ (43 % resp. 46 %, p = 0,0033 resp. p = 0,0184) a skupina, na niž se působilo 10D5 měla téměř významné snížení (29 %, p = 0,0675)
Tabulka 6
Skupí na Počeť Mediány Průměry
Celkový Αβ Celkový Αβ
ELISA hodnota15 P hodnotac % změny ELISA hodnota
PBS 9 30,64 ŇA3 NA 40,00±31,89e
póly klon. anti-Αβ42 10 17,61 0,0033 -43 18,15±4,36
mAb 10D5 8 21,68 0,0675 -29 27,29±19,43
mAb266 6 16,59 0,0184 -46 19,59±6,59
mAb 21F12 8 29,80 >0,9999 -3 32,88±9,90
a. Počet zvířat na skupinu na konci pokusu
b. ng/a tkáně
c. Analýza Mann whitney
d. na: nehodí se
e. Standardní odchylka
Stanovena byla pomocí ELISA rovněž koncentrace APP v kortexu a cerebelu myší, na něž se působilo protilátkami a PBS (kontrola). Byly použity dva různé testy na APP. První, označovaný APP-<x/FL, rozeznává jak APP-alfa (a, secernovanou formu APP, jež byla rozštěpena uvnitř Αβ sekvence), tak formu APP plné délky (FL), zatímco druhý rozeznává jen APP-α. Na rozdíl od snížení Αβ spojeného s působením v podskupinách skupin, na něž se působilo, hladiny APP byly téměř nezměněné ve srovnání s kontrolními zvířaty ve všech skupinách, na něž • ·
- 80 ·· 4 « se působilo. Tyto výsledky ukazují, že imunizace s Αβ protilátkami odstraňuje Αβ bez odstraňování APP.
V souhru: Αβ hladiny byly významně sníženy v kortexu, hipokampu a cerebelu u zvířat, na něž se působilo polyklonální protilátkou vyvinutou proti AN1792. V menším rozsahu též protilátky k aminokoncové oblasti Αβ1-42, konkrétně aminokyselinám 1 - 16 a 13 - 28 vykazovaly významné léčebné účinky.
D. Histochemické analýzy plaků a s připomínají
Morfologie Αβ-imunoreaktivních plaků v podskupinách mozků z myší ze skupin, ne něž se působilo PBS, polyklonálem Αβ42, 21F12, 266 a 10D5 byla kvalitativně porovnána s morfologií z předešlých studií, u nichž byly sledovány standardní postupy imunizace s Αβ42.
Největší změny jak v rozsahu, tak ve vzhledu amyloidních plaků nastaly u zvířat imunizovaných polyklonální Αβ42 protilátkou. Redukce amyloidní zátěže, erodovaná morfologie buňkami asociovaná Αβ imunoreaktivita blízce účinky produkované standardní imunizační procedurou. Tato pozorování podporují výsledky ELISA, v nichž bylo podáváním polyklonální Αβ45 protilátky dosaženo významného snížení jak celkového Αβ, tak Αβ45.
V podobném kvalitativním hodnocení byly amyloidní plaky v 10D5 skupině rovněž redukovány v počtu a vzhledu, s určitým průkazem s buňkami asociované Αβ imunoreaktivity. v porovnání s kontrolními zvířaty, polyklonální ig frakce proti Αβ a jedna z monoklonálnich protilátek (10D5) redukovaly plakovou zátěž z 93 % respektive 81 % (p < 0,005). U 21F12 se ukázalo, že má poměrně skromný účinek na plakovou zátěž. Mikrografy mozku po působení pAbA31_42 ukazují difusní deposity a nepřítomnost větších kompaktních plaků ve skupině, na niž se působilo pAbAβ1_42 ve srovnání se zvířaty s kontrolním působením.
- 81 *··
E. Lymfoprol iferativní odezvy
Αβ-závislá lymfoproliferace byla měřena s použitím slezinných buněk sebraných osm dnů po konečné infusi protilátky. Čerstvě sklizené buňky, 105 na jamku, byly kultivovány po pět dní v přítomnosti Αβ1-40 v koncentraci 5 μΜ ke stimulaci. Jako positivní kontrola byly další buňky kultivovány s mitogenem T buněk, pha, a jsko negativní kontrola byly buňky kultivovány bez přidaného peptidu.
Splenocyty ze starších PDAPP myší pasivně imunizovaných různými anti-Αβ protilátkami byly stimulovány in vitro s AN1792 a byly měřeny proliferativní a cytokinové odezvy. Smyslem tohoto testu bylo stanovit, zda pasivní imunizace umožňuje presentaci antigenu, a tedy nastartování odezvy T buněk specifických pro AN1792. v myších pasivně imunizovaných anti-Αβ protilátkami nebyly pozorovány žádné ANl792-specifické prolifertivní nebo cytokinové odezvy.
Příklad 2
Léčebná účinnost anti-Αβ protilátek: mAb 2H3, mAb 10D5, mAb266, mAb2lFl2, mAb 3D6, mAb 16C11 a pAb Αβ1-42
Ve druhé studii bylo opakováno působení s 10D8 a byly testovány dvě další anti-Αβ protilátky, monoklonály 3D6 (Αβ1-5) a 16cll (Αβ33-42). Kontrolní skupiny dostávaly buď PBS, anebo irelevantní isotypem odpovídající protilátku (TM2a). Myši byly starší (11,5 - 12 měsíců staré heterozygoty) než v předešlé studii, jinak bylo experimentální uspořádání stejné. Ještě jednou znovu, po šesti měsících působení 10D5 redukovala plakovou zátěž víc než 80 % v porovnání jak s PBS, tak s isotypem odpovídající proti látkovou kontrolu (p = 0,003). Jedna z dalších protilátek proti Αβ, 3D6, byla stejně účinná, produkující 86 % redukce (p = 0,003). Na druhé straně, třetí protilátka pro danému peptidu, 16C11, neměla žádný účinek na plakovou zátěž. Podobné výsledky byly získány ELISA měřením s Αβ42.
• ·
- 82 • · · • · · · · • · · • · · • · · ·
Tyto výsledky ukazují, že proti látková odezva proti Αβ peptidu, v nepřítomnosti T-buňkové imunity, je dostatečná ke snížení amyloidní deposice v PDAPP myších, ale že ne všechny anti-Αβ protilátky jsou stejně účinné. Protilátky směrované k epitopům obsahujícím aminokyseliny 1-5 nebo 3-7 jsou obzvlášť účinné, v souhrnu lze ukázat, že pasivní podávání protilátek proti Αβ (t j. pasivní imunizace) redukuje rozsah deposice plaků v myším modelu Alzheiměrový choroby.
Příklad 3
Monitorování vazby protilátky v CNS
Tento příklad ukazuje, že když se udržují na mírné koncentraci v séru (25 - 70 pg/ml), protilátky získají přístup k CNS v hladinách dostačujících k dekorování β-amyloidních plaků.
Ke stanovení, zda by protilátky proti Αβ muhly působit přímo uvnitř CNS, mozky vzaté z myší perfundovaných solným roztokem na konci Příkladu 2 byly zkoumány na přítomnost periferálně podávaných protilátek. Nefixované kryostatové mozkové řezy byly vystaveny fluorescentnímu reagens proti myším imunoglobulinům (kozí anti-myší lgG-Cy3). Plaky v mozcích skupin 10D5 a 3D6 byly silně dekorovány protilátkou, zatimco ve skupině 16C11 nebylo žádné zbarvení. K zjištění plného rozsahu plakové deposice byly seriál ní řezy každého mozku napřed podrobeny imunoreakci s anti-Αβ protilátkou a pak se sekundárním reagens. 10D5 a 3D6 po periferálním podávání získaly přístup k většině plaků v CNS. Plaková zátěž byla u těchto skupin působení velmi redukována ve srovnání s 16C11 skupinou. Vstup protilátky do CNS nebyl zapříčiněn abnormálním pronikáním přes barieru krev/mozek protože zde nebyl žádný vzrůst vaskulární permeability, jak bylo změřeno u pdapp myší pomocí Evansovy modře. Navíc koncentrace protilátky v mozkovém parenchymu starších pdapp myší byla stejná jako u netransgenních myší, a představovala 0,1 % koncentrace v séru (bez ohledu na isotyp).
• · • · · ·
- 83 Tato data ukazují, že periferálně podávané protilátky mohou vstupovat do CNS, kde mohou přímo spouštět odstraňování amyloidu. Je pravděpodobné, že 16C11 měla rovněž přístup k plakům, ale neměla schopnost vazby.
Příklad 4
Ex vivo hodnotící test na aktivitu protilátky proti amyloidním depositům
Ke zkoumání účinku protilátek na odstraňování plakú jsme založili ex vivo test, v němž se primární mikrogliální buňky kultivují s nefixovanýmy kryostatovými řezy mozků buď z myších PDAPP nebo lidských AD. Mikrogliální byly získávány z cerebrálních kortexů neonatálních DBA/2N myší (1-3 dny). Kortexy byly mechanicky disociovány v HBSS (Hank's Balanced salt Solution, sigma) s 50 pg/ml DNasy I (sigma). Disoci ováné buňky byly zfiltrovány s 100 pm buněčným sítem (Falcon) a centrifugovány při 1000 rpm po 5 minut. Peleta byla resuspendována v růstovém médiu (DMEM s vysokou glukosou, 10 % FBS, 25 ng/ml rmGM-CSF) a buňky byly naneseny s hustotou 2 mozků na T-75 plastovou kultivační láhev. Po 7 - 9 dnech se láhve daly rotovat na orbitální třepačku s 200 rpm po 2 hodiny při 37 °C. Buněčná suspence byla centrifugována při 1000 rpm a resuspendována v testovacím médiu.
10-pm kryostatové řezy PDAPP myších nebo AD lidských mozků (post-mortem interval < 3 hod.) a naneseny s rozmrznutím na okrouhlá skleněná krycí sklíčka pokrytá polylysinem a umístěny do jamek 24 jamkové destičky pro táňové kultury. Krycí sklíčka byla promyta dvakrát testovacím médiem, setávajícím z H-SFM (Hybridoma-serum free medium, Gibco BRL) s 1 % FBS, glutaminem, penicilinem/streptomycinem, a 5 ng/ml rmGM-CSF (R&D). Byly přidány kontrolní a anti-Αβ protilátky v dvojnásobné koncentraci (finálně 5 pg/ml) po jednu hodinu. Pak byly naočkovány mikrogliální buňky v hystotě 0,8 x 106 buněk/ml testovacího média. Kultury byly drženy ve zvlhčovaném inkubátoru (37 °C, 5 % CO2) po 24 hod. nebo déle. Na konci inkubace byly kultury fixovány 4 % paraformaldehydu a • · · · permeabilizovány 0,1 % Tritonem. Řezy byly barveny biotinylovanou 3D6 následovanou konjugátem streptavidin/Cy3 (Jackson immunoResearch). Exogenní mikrogliální buňky byly vizualizovány jaderným barvivém (DAPI). Kultury byly pozorovány inversním fluorescenčním mikroskopem (Nikon, te300) a mikrofotografie byly snímány digitální kamerou SPOT s použitím SPOT software (Diagnostic instruments). Pro analýzu Western blot byly kultury extrahovány 8 M močovinou, zředěnou 1 : 1 redukujícím tri cínovým vzorkovým pufrem a naneseny na 16 %-ní tri cínový gel (Novex). Po přenosu na immobilon byl přenesený materiál vystaven 5 pg/ml pAbAg42 a následně HRP-konjugované proti-myší protilátce a vyvolán s ECL (Amersham).
Když se tento test prováděl v přítomnosti 16C11 (jednou z protilátek proti Αβ, jež nebyly účinné in vivó) β-amyloidní plaky zůstávaly intaktní a nebyla pozorována žádná fagocytosa. Naproti tomu, když přilehlé řezy byly kultivovány v přítomnosti 10D5, amyloidní deposity z větší části zmizely a mikrogliální buňky vykazovaly četné fagocytické věsí kuly obsahující Αβ. Identické výsledky byly získány s AD mozkovými řezy; 10D5 indukovala fagocytosu AD plaků, zatímco 16C11 byla neúčinná. Navíc test poskytoval srovnávací výsledky když se prováděl buď s myšími, nebo s lidskými mikrogliálními buňkami a myšími, králičími nebo primátími protilátkami proti Αβ.
Tabulka 7 porovnává Αβ vazby versus fagocytosu pro několik různých proti látkových vazebných spéci fit. Lze shledat, že protilátky vážící se k epitopům v rámci aminokyselin 1 - 7 se jak váží, tak odstraňují amyloidní deposity, zatímco protilátky vážící se k epitopům v rámci aminokyselin 4 - 10 se váží bez odstraňování amyloidních depositů. Protilátky vážící se k epitopům ležícím C-terminálním směrem od zbytku 10 se ani neváží, ani neodstraňují amyloidní deposity.
• · • ·
- 85 Tabulka 7: Analýza epitopové spécifity
Protilátka
EDÍtOD Isotyp Barvení Faqocvtosa
N-konc. mAb
3D6 1-5 lgG2b + +
10D5 3-7 igGl + +
22C8 3-7 lgG2a + +
6E10 5-10 igGl + -
14A8 4-10 potk. igGl + -
zb. 13-28
18G11 10-18 potk. igGl - -
266 16-24 igGl - -
22D12 18-21 lgG2b - -
C-konc.
2g3 -40 igcl - -
16C11 -40/42 igGl - -
21F12 -42 lgG2a -
Imunní séra
králičí (cfa) 1-6 + +
myší (CFA) 3-7 + +
myší (QS-21) 3-7 + +
opičí (QS-21) 1-5 + +
myší (MAPI-7) + +
Tabulka 8 ukazuje výsledky získané s několika
proti látkami proti Αβ, přičemž se porovnávají schopnosti
indukovat fagocytosu v ex vivo testu a redukovat in vivo plakovou zátěž ve studiích s pasivním přenosem. I když se 16C11 a 21F12 váží k agregovanému syntetickému Αβ peptidu s vysokou aviditou, tyto protilátky nebyly schopné reagovat s β-amyloidními plaky v nefixovaných mozkových řezech, nespouštěly fagocytosu v ex vivo testu a nebyly účinné in vivo. 10D5, 3d6 a polyklonální protilátka proti Αβ byly aktivní ve všech třech ohledech. Tyto výsledky ukazují, že • ·
- 86 účinnost in vivo je způsobována protilátkami zprostředkovaným přímým odstraňováním plaků v CNS, a že ex vivo test je prediktivní pro in vivo účinnost.
Tabulka 8: Ex vivo test jako prediktivní test pro in vivo účinnost
Protilátka isotyp Avidita pro agregovaný βΑβ a(PM) Vazba k -amyloid. plakům EX VÍVO účinnost In vivo účinnost
monoklonální
3D6 lgG2b 470 + + +
10D5 igGi 43 + + +
16C11 igGi 90 - - -
21F12 lgG2a 500 - - -
TM2a igGi - - - -
polyklonální
1-42 mix + + +
Stejný test byl použit k testování odstraňovači aktivity protilátky proti fragmentu synukleinu, na nějž se odkazuje jako na NAC. Pro synuklein bylo ukázáno, že je bílkovinou asociovanou s amyloidními plaky. Protilátka k NAC byla uvedena do kontaktu se vzorkem mozkové tkáně obsahující amyloidní plaky a mikrogliální buňky jako dříve. Jako kontrola bylo použito králičí sérum. Následné monitorování ukázalo značnou redukci počtu a velikosti plaků, indikativní pro odstraňovači aktivitu protilátky.
Pro potvrzení, že Αβ byl internalizován v průběhu ex vivo testu byla použita konfokální mikroskopie. V přítomnosti kontrolních protilátek zůstaly exogenní mikrogliální buňky v konfokální rovině nad tkání, nevyskytovaly se žádné fagocytické vesikuly obsahující Αβ, a plaky zůstával uvnitř řezu intaktní. V přítomnosti 10D5 téměř veškerý plakový • · • · • · · · materiál byl obsažen ve vesikulích uvnitř exogenních mikrogliálních buněk. Ke stanovení osudu internalizovaného peptidu byly kultury, na něž se působilo 10D5, extrahováný 8 M močovinou v různých časových bodech a zkoumány analýzou western blot. V časovém bodu jedné hodiny, kdy ještě žádná fagocytosa nenastala, reakce s polyklonální protilátkou proti Αβ ukázal silný 4 kD pás (odpovídající Αβ peptidu). Αβ imunoreaktivita se snížila v den 1 a nebyla přítomna v den 3. Protilátkou zprostředkovaná fagocytosa Αβ vede tedy k jeho degradaci.
Ke stanovení, zda byla fagocytosa v ex vivo testu zprostředkovaná Fc, byl připraven F(ab')2 fragment anti-Αβ protilátky 3d6. I když si F(ab')2 fragmenty udržely plnou schopnost reagovat s plaky, nebyly schopné spouštět fagocytosu mikrogliálními buňkami. Navíc může být fagocytosa celou protilátkou blokována pomocí reagens proti myším Fc receptorům (anti-CD16/32). Tato data ukazují, že in vivo odstraňování Αβ nastává skrze fagocytosu zprostředkovanou Fc receptory.
Příklad 5
Průnik protilátek přes bariéru krev/mozek
Tanto příklad stanovuje koncentraci protilátky dodané do mozku po nitrožilní injekci do peiferní tkáně buď normální, nebo PDAPP myši. Po působení byly PDAPP nebo kontrolní normální myši perfundovány 0,9 % NaCl. Oblasti mozku (kortex nebo hipokampus) byly rozřezány a rychle zmraženy. Mosky byly homogenizovány v 0,1 % tritonu + proteasových inhibitorech, imunoglobulin v extraktech byl detekován pomocí elisa. ria destičky byly pokryty F(ab')2 kozího proti-myšího igG jako záchytným reagens. Sérum nebo extrakty mozku byly inkubovány po 1 hodinu, isotypy byly detekovány s anti-myší igGl-HRP, nebo lgG2a-HRP, nebo lgG2b-HRP (Caltag). Protilátky, bez ohledu na isotyp, byly přítomné v CNS v koncentraci, jež je 1 : 1000 koncentrace nalezené v krvi. Například: Když je krevní koncentrace igGl třikrát vyšší než lgG2a, je třikrát vyšší než lgG2a také v mozku, přičemž obě jsou přítomné
v 0,1 % své hladiny v krvi. Tento výsledek byl pozorován jak u taransgenních, tak u netransgenních myší, což ukazuje, že PDAPP nemají unikátní netěsnost bariéry krev/mozek.
Příklad 6
Klonování a sekvenování variabilních oblastí myší 3D6
Klonováni a analýza sekvence 3d6 vh. vh variabilní oblast těžkého řetězce 3D6 byla klonována RT-PCR s použitím mRNA z hybridomových buněk dvěma nezávislými způsoby. V prvním z nich se použily konsensus primery k VH oblasti zaváděcího peptidu pokrývajícího translační iniciační kodon jako 5' primer (DNA čís.3818-3829) a g2b (DNA čís.3823) jako ke konstantní oblasti specifický 3' primer. Sekvence PCR amplifikovaného produktu jakož i z několika nezávisle odvozených klonů byly mezi sebou v plném souladu. Jako další prověření sekvence 3D6 VH oblasti byly tyto výsledky potvrzeny sekvenování VH fragmentu získaného 5’ RACE rt-pcr metodikou a 3' g2b (DNA čís.3823) specifickým primerem. Znovu: Sekvence byla odvozena z PCR produktu jakož i několika nezávisle isolovaných klonů. Obě sekvence byly v plném vzájemném souladu (s výjimkou V8I substituce v zaváděcí oblasti z 5' RACE produktu), což ukazovalo, že tyto sekvence jsou odvozeny z mRNA kódující VH oblast 3D6. Nukleotidová sekvence (SEKV. ID. č. 3) a aminokyselinová sekvence (SEKV. ID. Č. 4) VH oblasti 3d6 jsou načrtnuty v Tabulce 9A respektive obrázku 2.
• ·
Tabulka 9A: Nukleotidová sekvence 3D6 VH
ATGAACTTCGGGCTCAGCTTGATTTTCCTTGTCCTTGTTTTAAAAGGTGTCCAGTGTGA
AGTGAAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTAGTGAAGCCTGGAGCGTCTCTGAAACTCT CCTGTGCAGCCTCTGGATTCACTTTCAGTAACTATGGCATGTCTTGGGTTCGCCAGAAT TCAGACAAGAGGCTGGAGTGGGTTGCATCCATTAGGAGTGGTGGTGGTAGAACCTACTA TTCAGACAATGTAAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGAGAATGCCAAGAACACCCTGT ACCTGCAAATGAGTAGTCTGAAGTCTGAGGACACGGCCTTGTATTATTGTGTCAGATAT GATCACTATAGTGGTAGCTCCGACTACTGGGGCCAGGGCACCACT (SEKV. ID. Č. 3)
Zaváděcí peptid je podtržen
Klonováni a analýza sekvence 3d6 vl. VL variabilní oblast lehkého řetězce 3D6 byla klonována analogickým způsobem jako VH oblast. U prvního pokusu byl soubor konsensus primerů pro amplifikací myší VL oblasti navržen jak následuje: 5' primery (DNA čís.3806-3816) byly navrženy k hybridizací VL oblasti pokrývající translační iniciační kodon, a 3' primer (DNA čís.3817 byl specifický pro murinní Ck oblast dolů po proudu od V-J spojovací oblasti. DNA sekvenční analýza PCR fragmentu, jakož i nezávisle odvozených isolovaných klonů s použitím tohoto souboru konsensus primerů pro lehký řetězec, ukázaly, že získaná cDNA byla odvozena z nefunkčně rearanžované zprávy, protože sekvence obsahovala mutaci s posunem čtecího rámce mezi spojením V-J oblasti.
U druhého pokusu byla použita 5' race ke klonování cdna kódující druhou VL. Analýza DNA sekvence tohoto produktu /konsensus 11) ukázala, že kóduje funkční mRNA. Lze tedy uzavřít, že sekvence kóduje správnou mRNA lehkého řetězce 3D6. Nukleotidová sekvence (SEKV. ID. Č. 1) a aminokyselinová sekvence (SEKV. ID. Č. 2) VH oblasti 3D6 jsou načrtnuty v Tabulce 9B respektive obrázku 1.
- 90 Tabulka 9B: Nukleotidová sekvence 3D6 VL
ATGATGAGTCCTGCCCAGTTCCTGTTTCTGTTAGTCCTCTGGATTCGGGAAACCAACGG
TTATGTTGTGATGACCCAGACTCCACTCACTTTGTCGGTTACCATTGGACAACCAGCCT CCATCTCTTGCAAGTCAAGTCAGAGCCTCTTAGATAGTGATGGAAAGACATATTTGAAT TGGTTGTTACAGAGGCCAGGCCAGTCTCCAAAGCGCCTAATCTATCTGGTGTCTAAACT GGACTCTGGAGTCCCTGACAGGTTCACTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTTACACTGA AAATCAGCAGAATAGAGGCTGAGGATTTGGGACTTTATTATTGCTGGCAGGGTACACAT TTTCCTCGGACGTTCGGTGGAGGCACCAACCTGGAAATCAAA (SEKV. ID. Č. 1)
Zaváděcí peptid je podtržen
Primery použité pro klonování 3D6 VL CDA jsou načrtnuty v Tabulce 10.
Tabulka 10
DNA dél ka kóduj. vlákno dna sekvence Poznámky
3806 40 Ano ACT.AGT.CGA.CAT.GAA.GTT.GCC.TGT.TA G.GCT.GTT.GGT.GCT.G (SEKV. ID. Č. 39) myší kapa variabilní primer 1 MKV PRIMER 1, MRC soubor; % A + T = 50,00 [20]; % G + C = 50,00 [20] Davis, Botstein, Roth Teplota tání 72,90 *C
3807 39 Ano ACT.AGT.CGA.CAT.GGA.GWC.AGA.CAC.AC T.CCT.GYT.ATG.GGT (SEKV. ID. Č. 40) myši kapa variabilní primer 2 MKV PRIMER 2, MRC soubor; % A + T = 46,15 [18]; % G + C = 48,72 [19] Davis, Botstein, Roth Teplota tání 72,05 °C
3808 40 Ano ACT.AGT.CGA.CAT.GAG.TGT.GCT.CAC.TC A.GGT.CCT.GGS.GTT.G (SEKV. ID. Č. 41) myši kapa variabilní primer 3 MKV PRIMER 3, MRC soubor; % A + T = 45,00 [18]; % G + C = 52,50 [21] Davis, Botstein, Roth Teplota tání 73,93 °C
3809 43 Ano ACT.AGT.CGA.CAT.GAG.GRC.CCC.TGC.TC A.GWT.TYT.TGG.MWT.CTT.G (SEKV. ID. Č. 42) myší kapa variabilní primer 4 MKV primer 4, MRC soubor; % A + T = 41,86 [18]; % G + C = 46,51 [20] Davis, Botstein, Roth Teplota tání 72,34 °C
3810 40 Ano ACT.AGT.CGA.CAT.GGA.TTT.WCA.GGT.GC A.GAT.TWT.CAG.CTT.C (SEKV. ID. Č. 43) myši kapa variabilní primer 5 MKV primer 5, MRC soubor; % A + T = 52,50 [21]; % G + C = 42,50 [17] Davis, Botstein, Roth Teplota tání 69,83 C
- 91 • ·
3811 37 Ano ACT.AGT.CGA.CAT.GAG.GTK.CYY.TGY.TS A.GYT.YCT.GRG.C (SEKV. ID. Č. 44) myši kapa variabilní primer 6 MKV PRIMER 6, MRC soubor; % A + T = 37,84 [14]: % G + C = 40,54 [15] Davis, Botstein, Roth Teplota tání 68,01 “C
3812 41 Ano ACT.AGT.CGA.CAT.GGG.CWT.CAA.GAT.GG A.GTC.ACA.KWY.YCW.GG (SEKV. ID. Č. 45) myší kapa variabilní primer 7 MKV PRIMER 7, MRC soubor; % A + T = 39,02 [16]; % G + C = 46,34 [19] Davis, Botstein, Roth Teplota tání 71,70 °C
3813 41 Ano ACT.AGT.CGA.CAT.GTG.GGG.AYC.TKT.TT Y.CMM.TTT.TTC.AAT.TG (SEKV. ID. Č. 46) myši kapa variabilní primer 8 MKV PRIMER 8, MRC soubor; % A + T = 53,66 [22]; % G + C = 35,15 [14] Davis, Botstein, Roth Teplota tání 66,70 °C
3814 35 Ano ACT.AGT.CGA.CAT.GGT.RTC.CWC.ASC.TC A.GTT.CCT.TG (SEKV. ID. Č. 47) myši kapa variabilní primer 9 MKV PRIMER 9, MRC soubor; % A + T = 45,71 [16]; % G + C = 45,71 [16] Davis, Botstein, Roth Teplota tání 69,36 °C
3815 37 Ano ACT.AGT.CGA.CAT.GTA.TAT.ATG.TTT.GT T.GTC.TAT.TTC.T (SEKV. ID. Č. 48) myší kapa variabilní primer 10 mkv primer 10, MRC soubor; % A + T = 70,27 [26]; % G + C = 29,73 [11] Davis, Botstein, Roth Teplota tání 63,58 °C
3816 38 Ano ACT.AGT.CGA.CAT.GGA.AGC.CCC.AGC.TC A.GCT.TCT.CTT.CC (SEKV. ID. Č. 49) myši kapa variabilní primer 11 MKV PRIMER 11, MRC soubor; % A + T = 44,74 [17]; % G + C = 55,26 [21] Davis, Botstein, Roth Teplota tání 74,40 °C
3817 27 Ne GGA.TCC.CGG.GTG.GAT.GGT.GGG.AAG.AT G (SEKV. ID. Č. 50) reversní primer na myši kapa lehký řetězec, ak 116-122; primer Ck konstantní oblasti; MRC soubor + Smál místo, % A + T = 47,06 [8]; % G + C = 52,94 [9] Davis, Botstein, Roth Teplota tání 57,19 °C
3818 37 Ano ACT.AGT.CGA.CAT.GAA.ATG.CAG.CTG.GG T.CAT.STT.CTT.C (SEKV. ID. Č. 51) myši těžký variabilní primer 1 mhv primer 1, MRC soubor;
3819 36 Ano ACT.AGT.CGA.CAT.GGG.ATG.GAC.CTR.TA T.CAT.SYT.CTT (SEKV. ID. Č. 52) myši těžký variabilní primer 2 mhv primer 2, MRC soubor;
3820 37 Ano ACT.AGT.CGA.CAT.GAA.GWT.GTG.GTT.AA A.CTG.GGT.TTT.T (SEKV. ID. Č. 53) myši těžký variabilní primer 3 MHV primer 3, MRC soubor;
3821 35 Ano ACT.AGT.CGA.CAT.GRA.CTT.TGG.GYT.CA G.CTT.GRT.TT (SEKV. ID. Č. 54) myši těžký variabilní primer 4 MHV primer 4, MRC soubor;
3822 40 Ano ACT.AGT.CGA.CAT.GGA.CTC.CAG.GCT.CA A.TTT.AGT.TTT.CCT.T (SEKV. ID. Č. 55) myší těžký variabilní primer 5 MHV primer 5, MRC soubor;
• ·
3823 37 Ano ACT.AGT.CGA.CAT.GGC.TGT.CYT.RGS.GC T.RCT.CTT.CTG.C (SEKV. ID. Č. 56) myši těžký variabilní primer 6 mhv primer 6, MRC soubor;
3824 36 Ano ACT.AGT.CGA.CAT.GGR.ATG.GAG.CKG.GR T.CTT.TMT.CTT (SEKV. ID. Č. 57) myši těžký variabilní primer 7 MHV primer 7, MRC soubor;
3825 33 Ano ACT.AGT.CGA.CAT.GAG.AGT.GCT.GAT.TC T.TTT.GTG (SEKV. ID. Č. 58 myši těžký variabilní primer 8 MHV primer 8, MRC soubor;
3826 40 Ano ACT.AGT.CGA.CAT.GGM.TTG.GGT.GTG.GA M.CTT.GCT.ATT.CCT.G (SEKV. ID. Č. 59) myší těžký variabilní primer 9 MHV primer 9, MRC soubor;
3827 37 Ano ACT.AGT.CGA.CAT.GGG.CAG.ACT.TAC.AT T.CTC.ATT.CCT.G (SEKV. ID. Č. 60) myši těžký variabilní primer 10 MHV primer 10, MRC soubor;
3828 38 Ano ACT.AGT.CGA.CAT.GGA.TTT.TGG.GCT.GA T.TTT.TTT.TAT.TG (SEKV. ID. Č. 61) myši těžký variabilní primer 11 MHV primer 11, MRC soubor;
3829 37 Ano ACT.AGT.CGA.CAT.GAT.GGT.GTT.AAG.TC T.TCT.GTA.CCT.G (SEKV. ID. Č. 62) myší těžký variabilní primer 12 mhv primer 12, MRC soubor;
3832 27 Ne GGA.TCC.CGG.GAG.TGG.ATA.GAC.tGA.TG G (SEKV. ID. Č. 63) reversní primer na myši lgG2b těžký řetězec ak posice 119-124, MRC soubor;
Od N-konce k C-konci, obsahují jak lehký, tak těžký řetězec domény FRl, CDRl, FR2, CDR2,FR3, CDR3 a FR4. Přiřazení aminokyselin ke všem doménám je v souladu s číslovací koncencí Kabata et al., shora.
Exprese chimérické 3D6 protilátky, variabilní oblasti těžkého a lehkého řetězce byly re-inženýrovány ke kódování sestřihových donorových sekvencí po porudu dolů od příslušných VDJ a VJ spojení a klonovány do savčích vektorů exprese, pCMV-hyl pro těžký řetězec a pCMV-hKl pro lehký řetězec. Tyto vektory kódují lidské oblasti yl a Ck konsstantní jako exonové fragmenty dolů po proudu od vložené kasety variabilní oblastí. Po ověření sekvence byly vektory exprese těžkého řetězce a lehkého řetězce ko-transfekovány do COS buněk. K potvrzení reprodukovatelnosti výsledků byly dva různé klony těžkého řetězce (H2.2 a H3.2) nezávisle ko-transformovány s 3 různými klony chimérického lehkého řetězce (L3, L4 a LlO). Jako positivní kontrola pro vektory byla provedena transfekce chimérické 21.6 protilátky. Kondicionovaná média byla sebrána 48 hodin po transfekci a testována analýzou Western blot na produkci protilátek nebo ELISA na vazbu k Αβ.
Všechny dané četné transfektanty exprimovaly kombinaci těžký řetězec + lehký řetězec, jež byly rozoznávány kozí protilátkou proti lidskému IgG(H+L) ve Western blot.
• ·
Přímá vazba protilátky 3D6 a chimérické 3D6 (PK1614) k Αβ byla testována ELISA analýzou. Pro chimérickou 3D6 byla nalezena vazba k Αβ s vysokou aviditou, podobnou, jak je prokázána pro 3D6 (Obrázek 3A). Navíc competitvní inhibiční test založený na ELISA ukázal, že chimérická 3D6 a myší 3d6 protilátka kompetují stejně s vazbou biotinylované 3D6 k Αβ (Obrázek 3b). Chimérická protilátka vykazovala vazebné vlastnosti neodlišitelné od 3d6 referenčního vzorku.
Tabulka 11
Konc. (pg/ml) 3D6 PK1614 IgGl
0,037 119,3
0,11 118,6 118,9
0,33 99,7 71,25
1 98,63 84,53 134,4
Navíc jak 3D6, tak PK1614 byly účinné v odstraňování Αβ plaků. Ex vivo test ukazuje, že jak se zvyšuje koncentrace protilátky, tak se snižuje množství Αβ podobným způsobem pro myší i chimericku 3D6 protilátku. Může být tudíž učiněn závěr, že dané sekvence kódují funkční 3D6 těžký řetězec respektive lehký řetězec.
Příklad 7
Humanizace
Homologie/Molekulárni modelováni. K identifikaci klíčových strukturních zbytků rámcové soustavy v myší 3D6 protilátce byl vygenerován model založený na nejbližších myších protilátkách pro těžký a lehký řetězec Pro tento účel byla jako templát pro modelování lehkého řetězce 3D6 vybrána protilátka označovaná 1CR9 (PDB ID.: 1CR9, Kanyo et al., shora) a jako templát pro modelování těžkého řetězce byla vybrána protilátka označovaná 1OPG (PDB ID.: lOPG, Kodandapani et al., shora). (Viz rovněž tabulku 1.) Porovnání • · · · • * · « • · · · 9 « • · · · · « • · · · · • · 9 9 aminokyselinových sekvencí 3d6 s lehkým a těžkým řetězcem těchto protilátek ukázalo, že s výjimkou CDR3 těžkého řetězce sdílejí protilátky 1CR9 a 10PG významnou sekvenční homologii s 3D6. Navíc smyčky CDR vybraných protilátek spadají do stejných kanonických strukturních tříd jako CDR smyčky 3D6, opět s výjimkou CDR3 těžkého řetězce. 1CR9 a 1OPG byly proto na začátku vybrány jako protilátky s vyřešenou strukturou k homolognímu modelování 3D6.
První homologní model 3D6 variabilní oblasti založený na těchto protilátkách byl zkonstruován s použitím balíku software Look & SegMod Modul es GeneMine (v3.5). Toto software bylo pořízeno v rámci trvalé licence od Molecular Application Group (Palo Alto, CA). Toto software od autorů Dr. Michaela Levitta a Dr. Chrise Leeho umožňovalo postup molekulárního modelování automatizací kroků strukturního modelování primární struktury na templátu o známé struktuře založeného na sekvenční homologii. Při práci na pracovní stanici Silicon Graphics IRIS v prostředí UNIX je modelovaná struktura automaticky upřesňována sérií kroků minimalizace energie k odstranění nevýhodných kontaktů atomů a optimalizaci elektrostatických a vad der Waalsovských interakcí.
Dále upřesněný model byl budován s použitím modelovacích kapacit Quanta®. Prohledání PDB databáze s CDR3 těžkého řetězce 3D6 identifikovalo lqkz jako mající nejvyšší homologii a identický počet zbytků s 3d6. CDR3 těžkého řetězce 3D6 byla tudíž modelována s použitím krystalové struktury lqkz jeko templátu. Alfa-uhlíková representace hlavního řetězce 3D6 modelu je ukázána v obrázku 4. VH doména je ukázána tečkovanou čarou a VL je ukázána plnou čarou, a CDR smyčky jsou ukázány páskovou formou.
výběr sekvencí lidské akceptorové protilátky. Jak se poznamenává shora, humanizované protilátky podle vynálezu obsahují variabilní oblasti rámcové soustavy v podstatě z lidského imunoglobulinu (akceptorového imunoglobulinu) a oblasti určující komplementaritu v podstatě z myšího imunoglobulinu (donorového imunoglobulinu) nazývaného 3d6. Po identifikaci oblastí určujících komplementaritu 3D6 a vhodných • · · ·
- 95 lidských akceptorových imunoglobulinů je dalším krokem stanovení které zbytky z těchto složek, pokud vůbec, mají být substituovány k optimalizaci vlastností výsledné humanizované protilátky. Pro výběr zbytků k substituci se používala kriteria popsaná shora.
Obrázky 1 a 2 zobrazují přiložení původních myších 3D6 VL a VH k odpovídajícím versi 1 humanizované sekvence, odpovídající sekvenci lidské rámcové soustavy a nakonec k sekvenci v oblasti lidské zárodečné linie, přičemž je ukázána nejvyšší homologie k sekvenci rámcové soustavy. stínované zbytky aminokyseliny (plné stínování), noniové aminokyseliny (čárkovaný rámec), balící aminokyseliny (tučně) a neobvyklé aminokyseliny (tučná kursiva), a jsou vyznačeny v obrázku. Hvězdičky ukazují zbytky zpětně mutované na myší zbytky v sekvenci akceptorové lidské rámcové soustavy, a CDR oblasti jsou označeny plnou čarou shora. Souhrn záměn zahrnutých do verse 1 humanizovaných 3D6 VH a VL je uveden v Tabulce 12.
akceptorové lidské ukazují kanonické
- 96 • ·
Tabulka 12. Souhrn záměn v humanizované 3D6.vl
Záměny VL (112 zbytků) VH (119 zbytků)
Hu>Mu: Ráme.soustava 47Ϊ12 3/119 (1 kanonický, 1 balicí)
CDRl 67Ϊ6 3/5
CDR2 4/7 7ΤΪ4
CDR3 5/8 4710
HU>MU 19/112 (17 %) 17/119 (14 %)
Hu>Mu: Ráme.soustava 13/112 14/119
Poznámky ke zpětným mutacím 1. I2v, jenž je v kanón. posici 4. S49A, jenž je noniový/ pod oblastmi CDR
2. Y36L, jenž je v balící zbytek a rovněž leží pod oblastmi CDR 5. A03v, jenž je balící zbytek a zbytek noniové zóny
3. L46R, jenž je balící zbytek a leží pod oblastmi CDR 6. K94R, jenž je kanonický zbytek
Poznámky k akceptoru 7. KABID 019230/přistup. č. Genbank S40342 11. KABID 045919/přistup. č. Genbank AF115110
8. Hk lc podskupina li 12. Hu HC podskupima lil
9. CDR ze stejné kanón, strukt. skupiny jako donor (m3D6) Ll = třída 4 L2 = třída 1 L3 = třída 1 10. Neznámá specifita 13. CDR ze stejné kanón, strukt. skupiny jako donor (m3D6) Hl = třída 1 H2 = třída 3 14. Rozeznává kapsulárni polysacharid Neisseria meningitidis
Zárodečná linie akceptoru 15. VH3-23 16. A3 a A19
Tabulky 13 a 14 načrtávají klíček ke Kabatovu číslování pro různé lehké respektive těžké řetězce.
• « • · · ·
- 97 • · — · · • · · · • · ·· • · · · · · • · · · · ·
Tabulka 13: Klíč ke Kabatovu číslování pro lehký řetězec
KAB Č. č. XYB myší lidská KABID A19-
3D6 VL 3D6VL 019230 zárod. linie Poznámka
1 1 FRl Y Y D D Neobvyklý myší, může být
v kont. s CDR
2 2 v v I I Kánoni cký/ CDR kontakt
3 3 v v V V
4 4 M M M M
5 5 T T T T
6 6 Q Q Q Q
7 7 T s s s
8 8 P P P P
9 9 L L L L
10 10 T s s s
11 11 L L L L
12 12 P P P P
13 13 V V V V
14 14 T T T T
15 15 I P P P
16 16 G G G G
17 17 Q E E E
18 18 P P P P
19 19 A A A A
20 20 S S S S
21 21 I I I I
22 22 s s s s
23 23 c c c c
24 24 CDRl K K R R
25 25 s s S S
26 26 s s S S
27 27 Q Q Q Q
27 A 28 s s s s
27B 29 L L L L
27 C 30 L L L L
27D 31 D D H H
* ·
FR2
CDR2
61
FR3
S
D
G
K
T
Y
L
N
S
D
G
K
T
Y
L
N
S
N
G
Y N
Y L D
S
N
G
Y N
Y L D
W
L
L
Q
R
P
G
Q
S
P
K
R
L
I
Y w
L
L
Q κ
P
G
Q s
P
Q
R
L
I
Y w
Y L
Q
K
P
G
Q s
P
Q
L
L
I
Y w
Y L
Q κ
P
G
Q s
P
Q
L
L
I
Y
Balící zbytek
Balící zbytek
L
V
S
K
L
D
S
L
V
S
K
L
D
S
L
G
S
N
R
A
S
L
G
S
N
R
A
S
G
V
P
D
R
G
V
P
D
R
G
V
P
D
R
G
V
P
D
R ♦ · ·
# · • 4 • « · » « * · · • ♦ · · * · · · ·· «·
81 82
F F F
T S S
G G G
S S S
G G G
S S S
G G G
T T T
D D D
F F F
T T T
L L L
K K K
III S S S
R R R
I V V
E E E
A A A
E E E
D D D
L V V
G G G
L V V
Y Y Y
Y Y Y
C C C
CDR3 W
Q
G
T
H
F
100 P
101 R
102 T
F
S
G
S
G
S
G
T
D
F
T
L
K
I s
R
V E A E D
V G
V
V
V C
W
Q
A
T
Q τ
P
-100 • · 4·
4 4
4 · * 9 • · · 4
4 4 4
44
Μ 4« • * 9 4 • * 44 • 4 4 4 • >4 4 ·« 44 • 4 · 44 · » 4 « • 4 · •44 · • ·4 4 • 4 ΑΑ
103 FR4 F
104 G
105 G
106 G
107 Τ
108 Κ
109 L
110 Ε
111 I
112 Κ
·· ·· ·· ·· ·· ···*
14: Klíč ke Kabatovu číslování pro těžký řetězec
č. typ myší lidská KABID A19-
3D6 VL 3D6VL 019230 zárod. Poznámka
linie
1 FRl E E E E
2 V V V V
3 K K K K
4 L L L L
5 V L L L
6 E E E E
7 S S S S
8 G G G G
9 G G G G
10 G G G G
11 L L L L
12 V V V V
13 K Q Q Q
14 P P P P
15 G G G G
16 A G G G
17 S S S S
18 L L L L
19 K R R R
20 L L L L
21 S S S S
22 C C C C
23 A A A A
24 A A A A
25 S S S S
26 G G G G
27 F F F F
28 T T T T
29 F F F F
30 S S S S
31 CDRl N N s s
32 Y Y Y Y
33 G G A A
• · · ·
102
FR2
CDR2
61 62
FR3
W
V R
Q
N
S
D
K
R
L
E
W
V A
S
I
R
S
G
G
G
R
T
V
V S D N
V K G R F
W
V R
Q
A
S
G
K
G
L
E
W
V A
S
I
R
S
G
G
G
R
T
V
V s D N
V K G R F
W
V R
Q
A
S
G
K
G
L
E
W
V s
A
I s
G
S
G
S
R
T
V
V A D S
V K G R F
W
V R
Q
A
S
G
K
G
L
E
W
V s
A
I s
G
S
G
S
R
T
V
V A D S
V K G R F
Neobvyklý myší nahrad lidským
Neobvyklý myší nahrad lidským
CDR kontakt/ noni us • · · ·
-10369
81 82
CDR3
100 101 102
103
104
T
I s
R
E
N
A
K
N
T
L
Y L Q M S S L K s E D T A L
Y
Y c v
R
Y D H
Y S G
T
I s
R
D
N
A
K
N
S
L
Y L
Q
M
S
S
L
R
A
E
D
T
A
L
Y
Y c v
R
Y D H
Y S G
T
I s
R
D
N
A
K
N
S
L
Y L
Q
M
S
S
L
R
A
E
D
T
A
L
Y
Y C A
K
D
N
Y D F W
T
I s
R
D
N
S
K
N
T
L
Y L
Q
M
S
S
L
R
A
E
D
T
A
Y
Y
Y C A
K
Balící zbytek, použij myší Kanonický, použij myší • · • · • · · ·
-104-
100A 105 S S s
100B 106 S S G
100C 107 - - T
100D 108 - - F
101 109 D D D
102 110 Y Y Y
103 111 FR4 W W W
104 112 G G G
105 113 Q Q Q
106 114 G G G
107 115 T T T
108 116 T L L
109 117 V V V
110 118 T T T
111 119 v v v
112 120 s s s
113 121 s s s
Humanizované protilátky s výhodou vykazují specificlou
vazebnoL i afinitu k Αβ o přinejmenším 107, 108, 109 nebo 101θ M1.
Obvykle je horní hranice vazebné afinity humanizovaných
protilátek pro Αβ v rozmezí s faktorem tři, čtyři nebo pět
k afinitě 3D6 (tj. , ~109 M'1 ). Často je rovněž dolní hranice
vazebné afinity v rozmezí s faktorem tři, čtyři nebo pět
k afinitě 3D6.
Sestaveni a exprese humanizovaných 3D6 VH a VL, verse 1. Ve stručnosti: Pro každou v oblast byly syntetizovány 4 velké překrývající se oligonukleotidy. Navíc byly pro každou v oblast syntetizovány 4 krátké PCR primery k dalšímu ulehčení sestavení konkrétní V oblasti. DNA sekvence oligonukleotidú použitých pro tento účel jsou ukázány v Tabulce 15 • · • · • · • · · ·
-105Tabulka 15: DNA oligonukleotidy
DNA délka kóduj . vlákno DNA sekvence Poznámky
4060 136 Ano tccgc aagct tgccg ccacc ATGGA CATGC GCGTG CCCGC CCAGC TGCTG GGCCT GCTGA TGCTG TGGGT GTCCG GCTCC TCCGG CTACG TGGTG ATGAC CCAGT CCCCC CTGTC CCTGC CCGTG ACCCC CGGCG A (SEKV. ID. Č. 17) hum 3D6 vl-a
4061 131 Ne CTGGG GGGAC TGGCC GGGCT TCTGC AGCAG CCAGT TCAGG TAGGT CTTGC CGTCG GAGTC CAGCA GGGAC TGGGA GGACT TGCAG GAGAT GGAGG CGGGC TCGCC GGGGG TCACG GGCAG GGACA GGGGG G (SEKV. ID. Č. 18) hum 3D6 VL-B
4062 146 Ano ACCTG AACTG GCTGC TGCAG AAGCC CGGCC AGTCC CCCCA GCGCC TGATC TACCT GGTGT CCAAG CTGGA CTCCG GCGTG CCCGA CCGCT TCTCC GGCTC CGGCT CCGGC ACCGA CTTCA CCCTG AAGAT CTCCC GCGTG GAGGC C (SEKV. ID. Č. 19) hum 3D6 VL-C
4063 142 Ne aattc tagga tccac tcacg CTTGA TCTCC ACCTT GGTGC CCTGG CCGAA GGTGC GGGGG AAGTG GGTGC CCTGC CAGCA GTAGT ACACG CCCAC GTCCT CGGCC TCCAC GCGGG AGATC TTCAG GGTGA AGTCG GTGCC GG (SEKV. ID. Č. 20) hum 3d6 vl-d
4064 16 Ne CTGGG GGGAC TGGTC C (SEKV. ID. Č. 21) hum 3d6 VL a+b zpětný % A + T = 18,75 [3] ; % G + C = 81,25 [13] Davis, Botstein, Roth Teplota tání 66,96 °C
4065 22 Ano ACCTG AACTG GCTGC TGCAG AA (SEKV. ID. Č. 22) hum 3D6 VL C+D dopředu % A + T = 45,45 [10]; % G + C = 54,55 [12] Davis, Botstein, Roth Teplota tání 64,54 c
4066 138 Ano acaga aagct tgccg ccacc ATGGA GTTTG GGCTG AGCTG GCTTT TTCTT GTGGC TATTT TAAAA GGTGT CCAGT GTGAG GTGCA GCTGC TGGAG TCCGG CGGCG GCCTG GTGCA GCCCG GCGGC TCCCT GCGGC TGT (SEKV. ID. Č. 23) hum 3D6 vh-A
4067 135 Ne GCCGC CGGAG CGGAT GGAGG CCACC CACTC CAGGC CCTTG CCGGG GGCCT GGCGC ACCCA GGACA TGCCG TAGTT GGAGA AGGTG AAGCC GGAGG CGGCG CAGGA CAGGC GCAGG GAGCC GCCGG GCTGC ACCAG (SEKV. ID. Č. 24) hum 3D6 VH-B
-106-
4068 142 Ano CTGGA GTGGG TGGCC TCCAT CCGCT CCGGC GGCGG CCGCA CCTAC TACTC CGACA ACGTG AAGGG CCGCT TCACC ATCTC CCGCG ACAAC GCCAA GAACT CCCTG TACCT GCAGA TGAAC TCCCT GCGCG CCGAG GACAC CG (SEKV. ID. Č. 25) hum 3d6 vh-c
4069 144 Ne ctgca aggat ccact caccG GAGGA CACGG TCACC AGGGT GCCCT GGCCC CAGTA GTCGG AGGAG CCGGA GTAGT GGTCG TAGCG CACGC AGTAG TACAG GGCGG TGTCC TCGGC GCGCA GGGAG TTCAT CTGCA GGTAC AGGG (SEKV. ID. Č. 26) hum 3D6 Vh-D
4070 16 Ne GCCGC CGGAG CGGAT G (SEKV. ID. Č. 27) hum 3d6 VH A+B zpětný % A + T = 18,75 [3]; % G + C = 81,25 [13] Davis, Botstein, Roth Teplota tání 66,96 °c
4071 20 Ano CTGGA GTGGG TGGCC TCCAT (SEKV. ID. Č. 28) hum 3D6 VH C+D dopředu % A + T = 35,00 [7]; % G + C = 65,00 [13] Davis, Botstein, Roth Teplota tání 66,55 °C
4072 19 Ano tcc gca agc ttg ccg cca c (SEKV. ID. č. 29) hum 3D6 VL A+B dopředu % A + T = 31,58 [6]; % G + C = 68,42 [13] Davis, Botstein, Roth Teplota tání 66,64 °C
4073 29 Ne aat tet agg atc cac tea cgC TTG ATC TC (SEKV. ID. Č. 30) hum 3D6 VL C+D zpětný % A + T = 55,17 [16]; % G + C = 44,83 [13] Davis, Botstein, Roth Teplota tání 66,04 °C
4074 20 Ano aca gaa agc ttg ccg cca cca tg (SEKV. ID. Č. 31) hum 3D6 VH A+B dopředu % a + T = 43,48 [10]; % G + C = 5Ž, 52 [13] Davis, Botstein, Roth Teplota tání 66,33 ’C
4075 22 Ne ctg caa gga tcc act cac cGG A (SEKV. ID. Č. 32) hum 3D6 VH C+D zpětný % A + T = 40,91 [9]; % G + C = 59,09 [13] Davis, Botstein, Roth Teplota tání 66,40 °C
Humanizovaný lehký řetězec byl sestaven s použitím PCR. Analýza DNA sekvencí více než dvou tuctů klonů ukázala roztroušené bodové mutace a delece vzhledem k očekávané sekvenci po celé délce VL oblasti. Analýza sekvencí ukázal, že klon 2.3 lze podrobit opravě 2 nedalekých jednoduchých nukleotidových delecí v aminokoncové oblasti.Byl a tudíž provedena řízená mutagenesa na klonu pCRShum3D6vl2.3
-107«« ·« ·· ···« • · · · · · < • · · · · · · s použitím oligonukleotidu, náprava bodových mutací byla potvrzena analýzou dna sekvence a VL insert byl klonován do vektoru exprese lehkého řetězce, pCMV-cK.
Sestavování humanizovaného VH s použitím metod založených na PCR vedlo ke klonům z hrubými delecemi v 5' polovině sekvence. Snaha o další optimalizaci PCR podmínek se setkala s částečným úspěchem. Klony sestavené za optimalizovaných podmínek PCR měly stále 10 - 20 nt delece v oblasti ležící v překrytu A+B fragmentů, v důsledku toho byla pro sestavení VH použita alternativní strategie, používající extensi překrytu DNA polymerasou (T4, Klenow a Sequenase), s následným působením T4 DNA ligasy pro kovalentní spojení překrývajících se konců. Analýza sekvencí DNA podskupiny klonů vzešlých ze skládání VH posledně jmenovaným přístupem ukázala roztrušené bodové mutace a delece v těchto klonech. Analýza více než dvou tuctů klonů ukázala v podstatě stejný typ jaký se ukázal v předešlých klonech. Podobné výsledky pozorované při prvním běhu sestavování VH a VL klonů napovídají, že pozorované chyby sekvence DNA pocházejí z chyb automatizovaného syntetizátoru při syntéze dlouhých DNA používaných k sestavování.
Pro nápravu třech zjištěných nukleotidových delecí pomocí řízené mutagenesy byl vybrán humanizovaný VH klon 2.7.
Příklad 13 charakterizace humanizované 3d6v2 protilátky
Drhá verse humanizované 3D6 byla vytvořena tak, že měla všechny substituce ukázané pro versi 1, s výjimkou D~»Y substituce u zbytku 1. ve versi 1 byla substituce u tohoto zbytku provedena, protože tento zbytek byl identifikován jako interagující s CDR. Substituce však deletovala zbytek, jenž je v této posici neobvyklý u lidských imunoglobulinů. Byla tudíž vytvořena verse bez této substituce. Navíc zbytky zárodečné linie byly použity k substituci zbytků lišících se od zbytků zárodečné linie v těžkém řetězci, jmenovitě h74=S, H77=T a H89=v. Kabatovo číslování pro versi 2 lehkého a těžkého
108· řetězce je stejné, jak je zobrazeno v Tabulkách 13 respektive 14, s výjimkou toho, že zbytek 1 verse 2 lehkého řetězce je asp (D), zbytek 74 těžkého řetězce je ser (s), zbytek 77 těžkého řetězce je thr (τ) a zbytek 89 těžkého řetězce je val (V). Nukleotidové sekvence lehkého a těžkého řetězce humanizované 3D6 verse 1 jsou načrtnuty v SEKV. ID. Č. 34 respektive 36. Nukleotidové sekvence lehkého a těžkého řetězce humanizované 3D6 verse 2 jsou načrtnuty v SEKV. ID. č. 35 respektive 37.
Příklad 9
Vazba humanizované 3D6vl k agregovanému Αβ. Funkční testování humanizované 3D6vl bylo prováděno s použitím kondicionovaných médií z transientně transfekovaných COS buněk. Buňky byly transfekovány plně chimérickou protilátkou, směsí buď chimérický těžký řetězec + humanizovaný lehký řetězec nebo chimérický lehký řetězec + humanizovaný těžký řetězec nebo nakonec plně humanizovanou protilátkou. Kondicionovaná média byla testována na vazbu k agregovanému Αβ1-41 ELISA testem. Humanizovaná protilátka vykazovala dobrou aktivitu v rámci experimentální chyby, a vykazovala vazebné vlastnosti nerozeznatelné od referenčního vzorku chimérické 3D6. výsledky jsou ukázány v Tabulce 16.
• ·
-109Tabulka 16
ng/ml Chimérická hu VH/Ch VL Ch VH/hu VL hu VH/hu VL
690 0,867
600 0,895
260 0,83
230 0,774
200 0,81
190 0,811
87 0,675
77 0,594
67 0,689
63 0,648
29 0,45
25 0,381
22 0,496
21 0,438
9,6 0,251
8,5 0,198
7,4 0,278
7 0,232
3,2 0,129
2,3 0,124
Pro porovnání vazebných aktivit humanizovaných protilátek 3D6vl a 3d6v2 byla provedena analýza ELISA s použitím agregovaného Αβ jako antigenu. Výsledky ukazují, že jak 3D6vl (HlLl), tak 3D6v2 (H2L2) mají skoro identické Αβ vazebné vlastnosti (Obrázek 5).
Nahrazovací NET (rNET) analýza h3D6v2. rNET test epitopové mapy poskytuje informaci o příspěvku jednotlivých zbytků v rámci epitopu k celkové vazebné aktivitě protilátky. rNET analýza používá peptidové analogy syntetizované systematicky s jednou substitucí. Vazba testované protilátky je stanovována proti nativnímu peptidu (nativnímu antigenu) a proti 19 alternativním jednoduše substituovaným peptidům, přičemž každý peptid je substituován v první posici jednou • ·
-110z 19 aminokyselin ne-nativních pro tuto posici. Vytvoří se profil odrážející účinek substitucí této posice různými ne-nativními aminokyselinami. Profily jsou podobně generovány v následných posicích podél antigenního peptidu. Kombinovaný profil, nebo epitopová mapa, odrážející substituce 19 ne-nativními zbytky v každé posici může být pak porovnána s mapou generovanou podobně pro druhou protilátku, v podstatě stejné nebo identické mapy indikují, že porovnávané protilátky mají stejnou nebo podobnou epitopovou spécifi tu.
Tato analýza byla provedena pro 3D6 a humanizovanou 3d6, verse 2. Protilátky byly testovány na vazbu proti nativnímu peptidu Αβ DAEFRHDSGY (SEKV. id. č. 33). zbytky 1-8 byly systematicky substituovány každým z 19 zbytků, jež nejsou pro danou posici nativní. Podle tohoto byly vytvořeny mapy pro 3D6 a h3D6v2. Výsledky jsou předvedeny v Tabulce 17.
Tabulka 17: Náhrazovací NET epitopové (rNET) mapování Αβ wt3D6 a humanizované 3D6
Substituce 3d6 div. typu (OD) humanizov. 3D6 (OD) Substituce 3D6 typu div. (OD) humanizov. 3D6 (OD)
zbytek 1 = A 0,464 0,643 zbytek 5 = A 0,275 0,435
c 0,450 0,628 C 0,359 0,635
D 0,577 0,692 D 0,080 0,163
E 0,576 0,700 E 0,115 0,187
F 0,034 0,062 F 0,439 0,569
G 0,569 0,738 G 0,485 0,679
H 0,054 0,117 H 0,577 0,680
I 0,048 0,118 I 0,510 0,671
K 0,033 0,057 K 0,573 0,693
L 0,073 0,148 L 0,517 0,691
M 0,039 0,072 M 0,418 0,611
N 0,587 0,757 N 0,587 0,757
P 0,069 0,144 P 0,093 0,198
Q 0,441 0,689 Q 0,388 0,567
R 0,056 0,155 R 0,613 0,702
S 0,569 0,762 S 0,487 0,633
T 0,450 0,702 T 0,530 0,639
V 0,057 0,190 v 0,493 0,562
W 0,031 0,070 w 0,393 0,461
Y 0,341 0,498 Y 0,278 0,230
• · • · • · • · • » · • · ·
-111- :
zbytek 2 = A 0,548 0,643 zbytek 6 = A 0,587 0,707
c 0,553 0,694 c 0,585 0,703
D 0,119 0,222 D 0,384 0,701
E 0,563 0,702 E 0,579 0,702
F 0,577 0,717 F 0,586 0,704
G 0,527 0,720 G 0,592 0,709
H 0,534 0,741 H 0,596 0,688
I 0,522 0,722 I 0,602 0,708
K 0,548 0,722 K 0,585 0,691
L 0,482 0,705 L 0,584 0,688
M 0,535 0,705 M 0,583 0,687
N 0,526 0,735 N 0,580 0,686
P 0,445 0,707 P 0,587 0,705
Q 0,567 0,756 Q 0,570 0,695
R 0,562 0,719 R 0,576 0,686
S 0,587 0,705 S 0,573 0,689
T 0,552 0,712 T 0,573 0,700
V 0,530 0,702 V 0,588 0,715
w 0,553 0,701 w 0,576 0,696
Y 0,547 0,704 Y 0,595 0,708
Zbytek 3 = A 0,038 0,061 Zbytek 7= A 0,580 0,688
c 0,222 0,410 C 0,559 0,676
D 0,019 0,027 D 0,573 0,681
E 0,542 0,689 E 0,565 0,677
F 0,034 0,060 F 0,546 0,668
G 0,016 0,060 G 0,546 0,668
H 0,016 0,020 H 0,557 0,675
I 0,019 0,024 I 0,537 0,675
K 0,053 0,090 K 0,565 0,685
L 0,019 0,026 L 0,566 0,701
M 0,019 0,027 M 0,562 0,697
N 0,024 0,032 N 0,573 0,688
P 0,017 0,020 P 0,582 0,678
Q 0,153 0,406 Q 0,563 0,679
R 0,015 0,023 R 0,551 0,677
S 0,016 0,021 S 0,563 0,674
T 0,015 0,019 T 0,560 0,685
V 0,016 0,021 v 0,563 0,687
W 0,149 0,304 w 0,547 0,685
Y 0,016 0,020 Y 0,560 0,682
zbytek 4 = A 0,016 0,020 Zbytek 8 = A 0,573 0,687
c 0,020 0,023 c 0,583 0,700
D 0,017 0,020 D 0,586 0,697
E 0,016 0,021 E 0,601 0,701
F 0,557 0,703 F 0,586 0,687
G 0,016 0,020 G 0,569 0,681
H 0,470 0,723 H 0,559 0,683
I 0,119 0,360 I 0,568 0,686
K 0,015 0,018 K 0,557 0,698
L 0,559 0,716 L 0,580 0,686
M 0,549 0,725 M 0,571 0,693
N 0,085 0,089 N 0,573 0,700
P 0,030 0,056 P 0,574 0,694
Q 0,065 0,110 Q 0,590 0,703
R 0,016 0,019 R 0,589 0,699
S 0,026 0,031 S 0,599 0,719
T 0,016 0,021 T 0,586 0,689
V 0,213 0,494 v 0,576 0,688
w 0,291 0,568 w 0,567 0,687
Y 0,529 0,730 Y 0,574 0,680
Je pozoruhodné, že se profily pro 3d6 a h3D6v2 jeví jako identické, když se podíváme na substituce ve všech posicích (tj. že hodnoty fluktuují identickým způsobem při porovnávání • ·
-112· • · • <· dat ve sloupci 1 (3D6) proti sloupci 2 (h3D6v2)). Tato data ukazují, že spécifita h3D6v2 je zachována, protože h3D6v2 rNET epitopová mapa se zdá být identická s m3D6 při použití jak Αβ zbytků 1-4, tak 5-8.
Imunohistochemie na PDAPP mozkových řezech ukazuje na specifitu h3D5v2 protilátky. Humanizovaná protilátka 3D6vl rozeznává Αβ v kryostatově preparovaných mozkových řezech z PDAPP myší. Humanizovaná 3D6vl a PK1614 se obě vážou k PDAPP plakům se stejným způsobem závislosti na dávce, jak je měřeno množstvím fluorescence (kvantifikovaném jako pixely) na jeden řez proti množství protilátky použité k barvení tkáně (Obrázek 6). v tomto pokusu byly použity stejné proti-lidské sekundární protilátky. Preparace řezů, barvení a zobrazovací postupy byly popsány dříve. V identických pokusech ukázal analýza obrazu h3D6 barvení na PDAPP a AD mozkových řezech, že h3D6v2 rozeznává Αβ plaky podobným způsobem jako 3D6vl (např. vysoce dekorované plaky).
Kompetitivní analýza vazby h3D6. Schopnost 3D6 protilátek vl a v2 kompetovat s myší 3D6 byla měřena ELISA s použitím biotinylované 3D6 protilátky. Kompetitivní analýza vazby ukázala, že všechny protilátky h3D6vl, h3D6v2 a chimérická PK1614 mohou kompetovat s m3D6 ve vazbě k Αβ (Obrázek 7). h3D6vl a h3D6v2 byly identické ve schopnosti kompetovat s 3D6 k Αβ. Protilátka 10D5 byla použita jako negativní kontrola, protože má jiný vazebný epitop než 3D6. BlAcore analýza rovněž ukázala vysokou afinitu h3D6vl a h3D6v2 pro Αβ (Tabulka 18).
Tabulka 16: Měření afinity Αβ protilátek s použitím BlAcore technologie.
Protilátka kal (1/Ms) kdl (1/S) Kd (nM)
Myší 3D6 4,06E+05 3,75E-04 0,88
Chimér. 3D6 4,58E+05 3,86E-04 0,84
Hu 3D6vl 1,85E+O5 3,82e-04 2,06
Hu 3D6v2 l,70E+05 3,78E-04 2,24
• ·· ·«· ·· ·♦· · ·
-113- *<9**··* *9·**·· ·» ·♦ v porovnání s 3D6, jež má Kd 0,88 nM, jak h3D6vl, tak h3D6v2 měly asi 2- až 3-krát menší vazebnou afinitu, změřenou jako 2,06 nM a 2,24 nM pro h3D6vl resp. h3D6v2. Test kompetitivní vazby ELISA ukázal pro h3D6vl a h3D6v2 přibližně 6-krát menší vazebnou afinitu. Humanizované protilátky ztrácejí typicky vazebnou afinitu s faktorem 3 - 4 v porovnání se svými myšími protějšky, ztráta asi 3-krát (průměr výsledků BlAcore a ELISA) pro h3D6vl a h3D6v2 spadá tudíž do přijatelného rozsahu.
Ex vivo test s použitím h3D6v2 protilátky, schopnost h3D6v2 stimulovat mikrogliální buňky byla testována pomocí ex vivo testu fagocytosy (obrázek 8). h3D6v2 byla v indukci fagocytosy agregátů Αβ z mozkové tkáně PDAPP myší tak účinná jako chimérická 3D6, Jako negativní kontrola v tomto pokusu byl použit igG, protože nemá schopnost vazby Αβ a nemůže proto indukovat fagocytosu.
in vivo mozková lokalizace h3D6. Každá z protilátek h3D6v2, m3D6 a DAE13 značených 125I byla v separátních experimentech iv-injikována do 14 jednotlivých PDAPP myší. Myši byly utraceny v den 7 a perfundovány pro další analýzy. Jejich mozkové oblasti byly odříznuty a měřeny na 125i aktivitu ve specifických oblastech mozku. Radioaktivně označená aktivita v mozku byla porovnána s aktivitou ve vzorcích séra. Výsledky jsou načrtnuty v Tabulkách 19 a 20 pro sérum a respektive mozkové oblasti.
-114 • ·
Tabulka 19
m3D6 DAE13 Hu3D6
30389,1 17463,9 40963,8
12171 13200,6 24202,2
3418,2 36284,7 12472,4
18678,9 421,3 33851,8
27241 19702 27187,3
26398,8 24855,8 29016,9
27924,8 29287,4 33830,7
12008,4 12733,1 26734,9
29487,8 27722,5 30144,5
25498,6 30460,7 35126,9
9652 23320,1 28414,8
24599,3 7119,1 16956,1
29240 28093,5 18190,7
11922,7 17443,1 24659,7 26748,9 25671,4
Tabulka 20
m3D6 DAE13 Hu3D6 (H2L2)
cere kort hipo cere kort hipo cere kort hipo
1991,9 1201,1 4024 1277,5 2522,9 5711,9 2424,6 3759,4 11622
238,9 746,1 2523 502,5 2123,5 6965,8 1509,8 2274,9 7018,2
645,9 603 1241,1 2325 3528,2 7801,6 500 2265,9 5316,3
1000 2508,2 4644,2 232,7 849,8 1891,9 2736,2 5703,7 10395,5
1266,9 3737,9 7975,8 891,6 2621 8245,2 1192,2 3188 10170
1422 2398,7 7731,1 1102,6 2087,5 7292,3 2269,4 3481,4 9621,6
1700,4 2154,4 7124,1 1650,6 3488,4 10284,8 1526,7 3028 8331,3
542,5 812,4 2456,8 712,9 2318,5 6643,3 1538,1 4194,1 11244,8
1309 3010,5 8693,5 1172,9 1953,6 7363 1245,7 1699,4 6831,2
1372,2 997,5 2425,4 1067,9 3697,2 12280,7 2708,8 2789 7887,4
778,6 1291,9 5654,4 1952,2 2120,7 6412,7 2251,3 3897,5 11121,5
1199,3 1683,4 4887,3 1005,2 1852,5 5121,4 1529,6 1772,2 7986,9
1021,8 3234,5 8036,2 961,5 3382,9 8473,1 644,1 1663,4 5056,5
742,1 1273,7 1056.7 1320.8 3405,2 4262,6 852,3 997,5 1943,2 3065,7 6717,4 10213,1 1516,4 1516,4 9888
• · •· ·· ·· · · « « ♦ · ♦ · ·· · · · · · · ·
Data ukazují, že h3D6v2 se lokalizuje v mozku a je obzvlášť koncentrována v hipokampální oblasti, o níž se ví, že tam Αβ agreguje. Mozkové hodnoty pro m3D6 a DAE13 byly srovnatelné s h3D6v2. všechny tři protilátky byly schopné prostoupit krevní bariérou jak je doloženo vazbou k Αβ plakům in vivo.
Příklad 10
Klonování a sekvenování variabilních oblastí myší 10D5
Klonováni a analýza sekvence 3d6 VH. VH a VL oblasti 10D5 z hybridomových buněk byly klonovány RT-PCR s použitím postupů 5' RACE. Nukleotidová sekvence (SEKV. ID. č. 13) a dedukovaná aminokyselinová sekvence (SEKV. ID. Č. 14) odvozené z dvou nezávislých cDNA klonů kódujících předpokládanou 10D5 VL doménu jsou načrtnuty v Tabulce 21 a Obrázku 9. Nukleotidová sekvence (SEKV. ID. Č. 15) a dedukovaná aminokyselinová sekvence (SEKV. ID. Č. 16) odvozené z dvou nezávislých cDNA klonů kódujících předpokládanou 10D5 VH doménu jsou načrtnuty v Tabulce 22 a Obrázku 10. sekvence 10D5 VL a VH splňují kriteria pro funkční V oblasti potud, že obsahují souvislý otevřený čtecí rámec od iniciátorového methioninu po C-oblast, a že sdílejí charakteristiku konservovaných zbytků genů
Tabulka 21: Sekvence DNA myší 10D5 VL
ATGAAGTTGCCTGTTAGGCTGTTGGTACTGATGTTCTGGATTCTTGCTTCCAGCAGTGA
TGTTTTGATGACCCAAACTCCACTCTCCCTGCCTGTCAGTCTTGGAGATCAAGCCTCCA TCTCTTGCAGATCTAGTCAGAACATTATACATAGTAATGGAAACACCTATTTAGAATGG TACCTGCAGAAACCAGGCCAGTCTCCAAAGCTCCTGATCTACAAAGTTTCCAACCGATT TTCTGGGGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACATTCAAGA TCAAGAAAGTGGAGGCTGAGGATCTGGGAATTTATTACTGCTTTCAAGGTTCACATGTT CCGCTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGGAA (SEKV. ID. Č. 13)
Zaváděcí peptid je podtržen • · * · · ·
-116Tabulka 22: Sekvence DNA myší 10D5 VH
ATGGACAGGCTTACTTCCTCATTCCTGCTGCTGATTGTCCCTGCATATGTCCTGTCCCA
GGCTACTCTGAAAGAGTCTGGCCCTGGAATATTGCAGTCCTCCCAGACCCTCAGTCTGA CTTGTTCTTTCTCTGGGTTTTCACTGAGCACTTCTGGTATGGGAGTGAGCTGGATTCGT CAGCCTTCAGGAAAGGGTCTGGAGTGGCTGGCACACATTTACTGGGATGATGACAAGCG CTATAACCCATCCCTGAAGAGCCGGCTCACAATCTCCAAGGATACCTCCAGAAAGCAGG TATTCCTCAAGATCACCAGTGTGGACCCTGCAGATACTGCCACATACTACTGTGTTCGA AGGCCCATTACTCCGGTACTAGTCGATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGT CACCGTCTCCTCA (SEKV. ID. Č. 15)
Zaváděcí peptid je podtržen
Příklad 11
Prevence a léčba lidských subjektů
Provádí se zkouška fáze I s jednotlivou dávkou ke stanovení bezpečnosti u lidí. Terapeutické činidlo je různým pacientům podáváno ve stoupajícím dávkování počínaje 0,01 hladiny s předpokládaným účinkem a zvyšováním s faktorem 3 dokud se nedosáhne asi desetinásobek dávkování účinného u myši.
zkouška fáze II se provádí ke stanovení terapeutické účinnosti. Jsou vybráni pacienti s rannou až střední Alzheimerovou chorobou definovanou s použitím kriterií pro pravděpodobnou AD Asociace pro Alzheimerovu chorobu a podobné poruchy (adrda). vhodní pacienti mají výsledek v rozsahu 12 26 v Mi ni-Menta! State Exam (MMSE). Dalšími kriterii výběru jsou pravděpodobnost, že pacient přežije trvání studie a nepřítomnost komplikujících záležitostí, jako je používání souběžné medikace, jež by mohla interferovat. Hodnocení základní čáry pacientské funkce se provádějí s použitím klasických psychometrických měření, jako je MMSE a ADAS, což je souhrnná stupnice pro hodnocení stavu a funkce pacientů • · ♦ · • ·
-117s Alzheimerovou chorobou. Tyto psychometrické stupnice poskytují měřítko postupu Azheimerovských stavů. Vhodné kvalitativní životní stupnice mohou být rovněž použity k monitorování léčby. Postup choroby lze rovněž monitorovat MRI. Rovněž lze monitorovat krevní profily pacientů včetně testů na imunogen-specifické protilátky a odezvy T-buněk.
Po měřeních základní čáry začnou pacienti dostávat léčbu. Jsou náhodně promícháni a léčeni buď terapeutickým činidlem nebo placebem v slepém uspořádání. Pacienti jsou monitorováni přinejmenším každých šest měsíců. Účinnost je stanovena významnou redukcí postupu u léčené skupiny relativně k placebové skupině.
Druhá fáze zkoušky II se provádí k hodnocení konverse pacientů z časné ztráty paměti ne-Alzheiměrový choroby, na niž se někdy odkazuje jako na poruchu paměti spojenou s věkem (aami) nebo mírnou kognitivní poruchu (MCI), k pravděpodobné Alzheimerově chorobě, jak je definována ADRDA kriterii. Pacienti s vysokým risikem konverse k Alzheimerově chorobě jsou vybráni z nekli nické populace podle hodnocení referenční populace na ranné známky ztráty paměti nebo jiné potíže spojené s pre-Alzheimerovskou symptomatologií, rodinné historie Alzheiměrový choroby, genetických risikových faktorů, věku, pohlaví, a jiných vlastností, u nichž se nalezlo předpovídání vysokého risika Alzheimerivy choroby. Shromažďují se výsledky základní čáry ve vhodném měřítku včetně MMSE a adas spolu s jinými měřítky navrženými k hodnocení normálnější populace. Tyto pacientské populace jsou rozděleny do vhodných skupin s placebovým srovnáním proti alternativám dávkování daným činidlem. Tyto pacientské populace jsou sledované v intervalech asi šesti měsíců, a konečným bodem u každého pacienta je, zda konvertoval nebo ne k pravděpodobné Alzheimerově chorobě jak je definována ADRDA kriterii na konci pozorování.
• · • ·
-118Obecné materiály a metody
A. Příprava polyklonálních a monoklonálnich Αβ protilátek
Anti-Αβ polyklonální protilátka byla připravena z krve sebrané ze dvou skupin zvířat. První skupina sestávala ze 100 samic Swiss Webster myší, stáří 6-8 týdnů. Myši byly imunizovány ve dnech 0, 15 a 29 se 100 pg AN1792 v kombinaci s CFA/IFA. Čtvrtá injekce byla dána v den 36 s poloviční dávkou AN1792. Zvířata byla vykrvácena při utracení v den 42, bylo připraveno sérum a séra byla slita za vytvoření celkově 64 ml. Druhá skupina sestával z 24 myší isogenních s PDAPP myšmi, ale netransgenních na lidský app gen, stáří 6 až 9 týdnů. Myši byly imunizovány ve dnech 0, 14, 28 a 56 se 100 pg AN1792 v kombinaci s CFA/IFA. Zvířata byla rovněž vykrvácena při utracení v den 63, bylo připraveno sérum a slito za vytvoření celkově 14 ml. Tyto dvě šarže séra byly slity. Proti látková frakce byla purifikována s použitím dvou následných kol přecipitáce s amonium sulfátem o 50 % nasycení. Konečná sraženina byla dialyzována proti PBS a testována na endotoxiny. Hladina endotoxinu byla méně než 1 EU/mg.
Anti-Αβ monoklonální protilátky byly připraveny z ascitických tekutin. Tekutina byla napřed delipidována přidáním koncentrovaného dextran sulfátu sodného k ledově chladné ascitické tekutině při míchání na ledu k dosažení konečné koncentrace 0,238 %. Pak byl za míchání přidáván koncentrovaný CaCl2 k dosažení konečné koncentrace 64 mM. Tento roztok byl centrifugován při 10 000 x g a peleta byla vyhozena. Supernatant byl míchán na ledu se stejným objemem nasyceného amonium sulfátu přidaného po kapkách. Tento roztok byl znovu centrifugován při 10 000 x g a supernatant byl vyhozen. Peleta byla resuspendována a dialyzována proti 20 mM Tris-HCl, 0,4 M NaCl, pH 7,5. Tato frakce byla nanesena na kolonu Pharmacia FPLC Sepharose Q a eluována reversním gradientem od 0,4 M do 0,275 M NaCl v 20 mM Tris-HCl, pH 7,5.
vrchol protilátky byl identifikován absorbancí při 280 nM a patřičné frakce byly spojeny. Purifikovaný preparát protilátky byl charakterizován měřením koncentrace bílkoviny s použitím BCA metody a čistoty s pužitím SDS-PAGE. Spojené frakce byly testovány rovněž na endotoxin. Hladina endotoxinu byla méně než 1 EU/mg.
B. Měření titrů protilátek
Myším byla krev odebírána malým řezem do ocasní žíly a sebráním asi 200 μΐ krve do mikrocentrifugační zkumavky. Morčatům bula krev odebrána po vyholení zdního kotníku s použitím jehly měrky 18 k napíchnutí metatarsální žíly a sebrání krve do mikrocentrifugačních zkumavek. Krev se nechala srazit po jednu hodinu za pokojové teploty (RT), pak byla protřepána a centrifugována při 14 000 x g po 10 minut k separaci séra od sraženiny. Sérum pak bylo přeneseno do čisté mikrocentrifugační zkumavky a drženo do titrace při 4 °C.
Titry protilátek byly měřeny ELISA. 96-jamkové mi krotítrační destičky (Costar EIA) byly pokryty se 100 pl roztoku obsahujícího bud 10 pg/ml buď Αβ42 nebo SAPP nebo jiné antigeny, jak se zaznamená u každého jednotlivého provedení, v pufru k pokrytí destiček (0,1 M fosfát sodný, pH 8,5, 0,1 % azid sodný) a byly drženy přes noc při RT. Jamky byly odsáty a do jamek byla přidána séra počínaje ředěním 1/100 v ředícím roztoku pro vzorky (0,014 M fosfát sodný, pH 7,4, 0,15 M Nad, 0,6% bovinní sérumalbumin, 0,05 % thimerosal). Přímo na destičkách bylo provedeno 7 seriál nich ředění s kroky třikrát k dosažení konečného ředění 1/218 700. Ředění byla inkubována v pokrytých jamkách po jednu hodinu při RT. Destičky byly myty čtyřikrát s PBS obsahujícím 0,05 % Tween 20. Do jamek byla přidána druhá protilátka, kozí anti-myší Ig konjugovaný s křenovou peroxidasou (získaná od Boehringer Mannheim) jako 100 μΐ 1/3000 ředěná v ředícím roztoku pro vzorky a destičky inkubovány po jednu hodinu při RT. Destičky byly znovu myty čtyřikrát s PBS Tween 20. K vyvolání chromogenu bylo do každé jamky přidáno 100 μΐ Slow TMB (3,3',5,5'-teramethylbenzidin) získaného od Pierce Chemicals, a destičky inkubovány po patnáct minut při RT. Reakce byla zastavena 2 5 μΐ 2 M H2SO4.
• · • · ·
-120r · ·
I · · · » • · · « • · · ‘ » · · 4 intensita zabarvení byla odečítána na zařízení Molecular Devices Vmax při (450 nm - 650 nm) .
Titry byly definovány jako převrácená hodnota ředění séra, jež dává jednu polovinu maximálního OD. Maximální OD bylo obecně bráno z iniciál ního ředění 1/100, kromě případů s velmi vysokými titry, kdy bylo pro stanovení maximálního OD potřebné vyšší inicální ředění. Když 50 %-ní bod spadal mezi dvě ředění, ke kalkulaci finálního titru se provedla lineární extrapolace. Ke kalkulaci geometrického průměru proti látkových
titrú byla titrům menším než 100 titru 25. arbitrárně přiřazena hodnota
C. Příprava mozkové tkáně
Po euthanasii byly mozky vyňaty a jedna polokoule
připravena k imunohistochemické analýze, zatímco z druhé
polokoule byly vyříznuty tři mozkové oblasti (hipokampus, kortex a cerebelum) a použity k měření koncentrace různých forem Αβ proteinů a APP s použitím ELISA (Johnson-Wood et al., shora).
Tkáně určené k ELISA byly homogenizovány v 10 objemech ledově chladného guanidinového pufru (5,0 M guanidin-HCl, 50 mM Tris-HCl, pH 8,0). Homogenáty byly jemně míchány s použitím zařízení Adams Nutator (Fisher) po tři až čtyři hodiny při RT, pak před kvantifikací Αβ a APP skladovány při - 20 °C. Předcházející pokusy ukázaly, že vzorky byly za těchto podmínek stabilní, a že syntetický Αβ protein (Bachem) může být kvantitativně získán zpět, když se přidá do kontrolních mozkových tkání z myší stejného vrhu (lohnson-Wood et al., shora) .
D. Měření hladin Αβ
Mozkové homogenáty byly zředěny 1:10 ledově chladným kaseinovým ředícím roztokem (0,25 % kaseinu, PBS, 0,05 % azid sodný, 20 pg/ml aprotininu, 5 mM EDTA pH 8,0, 10 pg/ml leupeptinu) a pak cent rif ugovány při 16 000 x g po « · • · • · · ·
-12120 min při 4 °C. Standardy syntetického Αβ proteinu (aminokyseliny 1 - 42) a APP byly připraveny tak, aby obsahovaly ve finální směsi 0,5 M guanidin a 0,1 % bovinní sérumalbumin (BSA). sendvičová ELISA celkového Αβ využívá monoklonální protilátku 266 specifickou pro Αβ aminokyseliny 13 - 28 (Seubert et al., shora) jako záchytnou protilátku, a biotinylovanou monoklonální protilátku 3D6, specifickou pro Αβ aminokyseliny 1-5 (Johnson-Wood et al., shora) jako reportérovou protilátku. Monoklonální protilátka 3D6 nerozeznává secernovaný APP nebo APP plné délky, ale detekuje jen Αβ species s amino-terminální kyselinou asparagovou. Toto stanovení má spodní hranici citlivosti ~ 50 ng/ml (11 nM) a nevykazuje křížovou reaktivitu s endogenním myším Αβ proteinem v koncentracích do 1 ng/ml (Johnson-Wood et al., shora).
Αβ1-42 specifická sendvičová ELISA využívá ηιΑβ 21F12, specifickou pro Αβ aminokyseliny 33 - 42 (Johnson-Wood et al., shora) jako záchytnou protilátku, v tomto stanovení, jež má spodní hranici citlivosti kolem 125 pg/ml, 28 pM, Johnson-Wood et al., shora) je biotinylovaná ηιΑβ 21F12 rovněž reportérovou protilátkou. Pro ELISA testy Αβ se jamky 96-jamkové destičky pro imunotesty (Costar) pokrývají 100 pl buď ηιΑβ 266 (při 10 pg/ml) nebo ηιΑβ 21F12 (při 5 pg/ml) a inkubují přes noc při RT. Roztok byl odstraněn odsátím a jamky byly blokovány přidáním 200 pl 0,25 % lidského sérumalbuminu v PBS pufru po alespoň 1 hodinu při rt. Blokovací roztok byl odstraněn a destičky do použití skladovány vysušené při 4 °C. Destičky byly před použitím rehydrovány mycím pufrem (Tris-pufrovaný solný roztok (0,15 M NaCl, 0,01 M Tris-HCl, pH 7,5) plus 0,05 % Tween). Vzorky a standardy byly přidány v triplikátových alikvotech o 100 pl na jamku a pak inkubovány přes noc při 4 °C. Destičky byly myty přinejmenším třikrát mycím pufrem mezi každým z kroků testu. Byla přidána biotinylovaná ηιΑβ 3D6, ředěná na 0,5 pg/ml v kaseinovém testovacím pufru (0,25 % kasein, PBS, 0,05 % Tween, pH 7,4) a inkubována v jamkách po 1 hodinu při RT. Do jamek byl na 1 hodinu při RT přidán konjugát avidin-křenová peroxidasa (Avidin-HRP získaný od společnosti Vector, Burlingame, CA) ředěný 1:4000 v kaseinovém testovacím pufru. Kolorimetrický • · • ·* • · substrát, Slow TMB-ELISA (Pierce), byl přidán a ponechán reagovat po 15 minut při RT, po čemž byla enzymatická reakce zastavena 25 pl 2 M H2SO4. Reakční produkt byl kvantifikován s použitím zařízení Molecular Devices Vmax, jež měří rozdíl absorbancí při 450 nm a 650 nm.
E. Měření hladin APP
Používala se dvě rozdílná stanovení APP. První, označované ΑΡΡ-α/FL, rozeznává jak APP-alfa (a) formu, tak formu plné délky (fl). Druhé stanovení je specifické pro APP-α. Stanovení APP-<x/FL rozeznává secernovaný APP včetně prvních 12 aminokyselin Αβ. Protože reportérové protilátka (2H3) není specifická k a štěpícímu místu, vyskytujícímu se mezi aminokyselinami 612 a 613 APP695 (Esch et al., Science 248:1122-1124 (1990), toto stanovení rozeznává rovněž APP plné délky (app-FL) Předběžné pokusy s použitím imobilizovaných APP protilátek k cytoplasmatickému ocásku app-fl na depletování mozkových homogenátů APP-FL napovídají, že přibližně 30 - 40 % ΑΡΡ-α/FL je FL (data nejsou ukázána), záchytnou protilátkou jak pro ΑΡΡ-α/FL, tak pro APP-α stanovení je mAb 8E5, vytvořená proti aminokyselinám 444 až 592 APP695 formy (Games et al., shora). Reportérové protilátka pro ΑΡΡ-α/FL stanovení je mAb 2H3, specifická pro aminokyseliny 597 - 608 APP695 (Johnosn-Wood et al., shora) a reportérová protilátka pro ΑΡΡ-α/FL stanovení je biotinylovaný derivát mAb 16H9, vytvořené proti aminokyselinám 605 až 611 APP. Spodní hranici citlivosti stanovení ΑΡΡ-α/FL je asi 11 ng/ml (150 pM) (Johnson-wood et al., shora) a u APP-α specifického stanovení je asi 22 ng/ml (0,3 nM). Pro obě APP stanovení byly s mAb 8E5 pokryty jamky 96-jamkové EIA destičky jak je popsáno shora pro mAb 266. Jako referenční standard pro ΑΡΡ-α/FL a APP-a stanovení byl používán purifikovaný secernovaný rekombinantní APP-α (Esch et al., shora). Vzorky mozkových homogenátů v 5 M guanidinu byly zředěny 1:10 ELISA vzorkovým ředícím roztokem (0,014 M fosfátový pufr, pH 7,4, 0,6 % bovinní sérumalbumin, 0,05 % thimerosal, 0,5 M NaCl, 0,1 % NP40). Pak byly zředěny • · * · * » * ·
-123φ • r · • · · ··
1:4 vzorkovým ředícím roztokem obsahujícím 0,5 M guanidin. zředěné homogenáty byly pak centrifugovány při 16 000 x g po 15 vteřin při RT. Standardy APP a vzorky byly přidány na destičku v duplicitních alikvotecha inkubovány po 1,5 hodiny při RT. Biotinylovaná reportérové protilátka 2H3 nebo 16H9 byla inkubována se vzorky po 1 hodinu při RT. Streptavidinalkalická fosfatasa (Boehringer Mannheim), zředěná 1:1000 vzorkovým ředícím roztokem, byla inkubována v jamkách po 1 hodinu při RT. Byl přidán fluorescenční substrát 4-methylumbeliferyl-fosfát na 30 minut při RT a destičky byly odečteny na fluorimetru Cytofluor tm 2350 (Millipore) při 365 nm excitace a 450 nm emise.
F. imunohistochemie
Mozky byly fixovány po tři dny při 40 °C v 4 % paraformaldehydu v PBS a pak uloženy do rozřezání po jeden až sedm dní při 4 °C v 4 % paraformaldehydu, PBS. Na vibratomu při RT byly nařezány 40 mikronů tlusté řezy a před imunohistochemickým zpracování uschovávány v kryoprotektantu (30 % glycerol, 30 % ethylenglykol ve fosfátovém pufru) při - 20 °C. Z každého mozku se šest řezů z úrovně dorsálního hipokampu, vždy oddělených následným 240 pm intervalem, inkubovalo přes noc s jednou z následujících protilátek: 1) biotinylovanou anti-Αβ (mAb, 3d6, specifická na lidský Αβ) zředěnou na koncentraci 2 pg/ml v PBS a 1 % koňského séra;
nebo 2) biotinylovanou mAb specifickou k lidskému APP, 8E5, zředěnou na koncentraci 3 pg/ml v PBS a 1 % koňského séra;
nebo mAb specifickou pro gliální fibrilární kyselou bílkovinu (GFAP; sigma Chemical Co.) zředěnou 1:500 s 0,25 % Tritonem X-100 a 1 % koňského séra v Tris pufrovaném solném roztoku, pH 7,4 (TBS); nebo 4) nebo mAb specifickou pro CDllb, MAC-1 antigen (Chemicon International) zředěnou 1:100 s 0,25 %
Tritonem x-100 a 1 % králičího séra v TBS; nebo 5) mAb specifickou pro specifickou pro MHC-ll antigen (Pharmigen) zředěnou 1:100 s 0,25 % Tritonem X-100 a 1 % králičího séra v TBS; nebo 6) potkaní mAb specifickou pro CD43 (Pharmigen) • v • 9 9 9 99 • r » 9 9 <
» · ·· ·· «···
-124 zředěnou 1:100 s specifickou pro králičího séra specifickou pro králičího séra specifickou pro % králičího séra v PBS; nebo 7) potkaní mAb
CD45RA (Pharmigen) zředěnou 1:100 s 1 % v PBS; nebo 8) potkaní monoklonální Ab CD45RB (Pharmigen) zředěnou 1:100 s 1 % v PBS; nebo 9) potkaní monokl onál ní Ab CD45 (Pharmigen) zředěnou 1:100 s 1 % peroxidasy a noc při 4 králičího séra v PBS; 10) biotinylovanou polyklonální křeččí Ab specifickou pro CD3e (Pharmigen) zředěnou 1:100 s 1 % králičího séra v PBS; 11) potkaní mAb specifickou pro CD3 (Serotec) zředěnou 1:200 s 1 % králičího séra v PBS; nebo 12) roztokem PBS bez primární protilátky obsahující 1 % normálního koňského séra.
Na řezy uváděné do reakce s roztoky protilátek ze seznamu shora pod 1, 2 a 6 - 12 se předem působilo 1,0 % Tritonem X-100, 0,4 % peroxidem vodíku v PBS po 20 min. při RT k blokování endogenní peroxidasy. Následovala inkubace s primární protilátkou přes noc při 4 °C. Řezy po reakci s 3D6 nebo 8E5 nebo CD3e mAb byly pak ponechány reagovat po jednu hodinu při RT s komplexem křenová peroxidasa-avidin-biotin se složkami A a B soupravy zředěnými 1:75 v PBS (Vector Elitě Standardd Kit, Vector Labs, Burlingame, CA). Řezy po reakci s protilátkami specifickými pro CD45RA, CD45RB, CD45, CD3 a
PBS roztokem bez primární protilátky byly pak ponechány reagovat po jednu hodinu při RT s biotinylováným proti-potkaním igG (Vector) zředěným 1:75 v PBS respektive s biotinylováným proti-myším igG (Vector) zředěným 1:75 v PBS. Řezy pak byly ponechány reagovat po jednu hodinu při RT s komplexem křenová peroxidasa-avidin-biotin se složkami A a B soupravy zředěnými 1:75 v PBS (Vector Elitě Standardd Kit, Vector Labs, Burlingame, CA).
Řezy byly vyvinuty v 0,01 % peroxidu vodíku, 0,05 % 3,3'-diaminobenzidinu (DAB) při RT. Na řezy určené k inkubaci s GFAP-MAC-1 a MHC-ii-specifickými protilátkami se předem působilo 0,6 % peroxidem vodíku při RT k blokování endogenní následovala inkubace s primární protilátkou přes ’C. Řezy po reakci s GFAP protilátkou byly inkubovány po 1 hodinu při RT s biotinylováným koňským proti-myším igG (Vector Laboratories; Vectastain Elitě ABC ·· ····
Kit) zředěným 1:200 v TBS. Řezy inkubované s MAC-1 nebo MHC-ll-specifickou protilátkou jako primární protilátkou byly následně podrobeny reakci po 1 hodinu při RT s biotinylováným králičím proti-potkaním igG zředěným 1:200 v TBS, s následnou inkubací po 1 hodinu s komplexem avidin-biotin-peroxidasa zředěným 1:1000 v TBS. Řezy inkubované s GFAP-, MAC-1 nebo MHC-Il-specifickými protilátkami byly pak visualisovány působením při RT s 0,05 % DAB, 0,01 % peroxidu vodíku, 0,04 % chloridu nikelnatého, TBS pro 4 respektive 11 minut.
Imunoznačené řezy byly naneseny na skleněná podložní sklíčka (VWR, Superfrost slides), usušeny na vzduchu přes noc, ponořeny krátce v Proparu (Anatech) a překryty krycími sklíčky za použití Permountu (Fisher) jako nanášecího média.
Na proti barvení Αβ plaků byla podskupina GFAP-positivních řezů nanesena na Superfrost podložní sklíčka a inkubována ve vodném 1 % thioflavinu S (Sigma) po 7 minut po imunohistochemickém zpracování. Řezy byly pak dehydrovány a projasněny v Proparu, pak překryty krycími sklíčky nanášenými s Permountem.
G. Analýza obrazu
Pro kvantifikaci sklíček s imunoreaktivním materiálem byl použit systém videometric 150 image Analysis System (Oncor, lne., Geithersburg, MD) spojený s mikroskopem Nikon Microphot-FX přes CCD video kameru a monitor Sony Trinitron. Obraz řezu byl uložen ve video pufru, a k výběru a výpočtu celkové pixel plochy zabírané imunoznačenými strukturami byl stanoven práh založený na barvě a saturaci. Pro každý řez byl ručně ohraničen hipokampus a byla vypočtena celková pixel plocha zabraná hipokampem. Procentní amyloidní zátěž byla měřena jako: (frakce hipokampální plochy obsahující Αβ deposity imunoreaktivní s mAb 3D6) x 100. Podobně byla procentní neuritická zátěž měřena jako: (frakce hipokampální plochy obsahující distrofické neurity reaktivní s monoklonální protilátkou 8E5) x 100. Zařízení C-lmaging System (Compix, lne., Cranberry Township, pa) pracující s programem Simple 32 • · · · · ·
-126k · · · · * ··
Software Application byl spojen s mikroskopem Nikon Microphot-FX přes Optronics kameru a používán ke kvantifikaci procenta retrospeniálního kortexu zabíraného GFAP-positivními astrocyty a MAC-1 a MHC-ll-positivními mikrogliemi. Obraz řezu byl uložen ve video pufru, a k výběru a výpočtu celkové pixel plochy zabírané imunoznačenými buňkami byl stanoven monochromně založený práh. Pro každý řez byl ručně ohraničen retrospeniální kortex (RSC) a byla vypočtena celková pixel plocha (RSC) zabraná. Procento astrocytosy bylo definováno jako: (frakce RSC zabrané GFAP-reaktivními astrocyty) x 100. Podobně bylo procento mikrogliosy definováno jako: (frakce RSC zabrané MAC-1- nebo MHC II-reaktivními mikrogliemi) x 100. Pro všechny analýzy obrazu se pro každé zvíře kvantifikovalo šest řezů z úrovně dorsálního hipokampu, vždy oddělených následným 240 pm intervalem, v žádném případě nebyl pozorovateli znám léčebný status zvířat.
I když předcházející vynález byl detailně popsán pro účele jasnosti nebo pochopení, je samozřejmé, že v rámci rozsahu připojených nároků lze praktikovat určité modifikace, všechny zde citované publikace a patentové dokumenty, jakož i text, jenž se objevuje v obrázcích a seznamech sekvencí, jsou zde zahrnuty odkazem ve své úplnosti pro veškeré účele ve stejném rozsahu tak, jako by každá(ý) byl takto jednotlivě označen.
Z předcházejícího je zřejmé, že vynález poskytuje řadu použití. Například: Vynález poskytuje použití protilátek k Αβ popsaných shora v léčbě, profylaxi a diagnose amyloidogenních onemocnění, nebo ve výrobě medikamentů nebo diagnostických prostředků ke stejnému použití.

Claims (5)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Lehký řetězec humanizovaného imunoglobulinu obsahující 1) komplementaritu určující oblasti (CDR) ze sekvence variabilní oblasti lehkého řetězce imunoglobulinu 3d6 načrtnuté jako SEKV. ID. Č. 2, a 2) variabilní oblast rámcové soustavy ze sekvence lehkého řetězce lidského akceptorového imunoglobulinu, za předpokladu, že přinejmenším jeden zbytek rámcové soustavy je substituován aminokyselinovým zbytkem ze sekvence variabilní oblasti lehkého řetězce myší 3D6, přičemž zbytek rámcové soustavy je vybrán ze skupiny sestávající z
    a) zbytku, jenž přímo nekovalentně váže antigen;
    b) zbytku přilehlého k CDR;
    c) zbytku interagujícího s CDR; a
    d) zbytku participujícího na VL-VH styčné ploše.
  2. 2. Těžký řetězec humanizovaného imunoglobulinu obsahující 1) komplementaritu určující oblasti (CDR) ze sekvence variabilní oblasti lehkého řetězce imunoglobulinu 3d6 načrtnuté jako SEKV. ID. Č. 4, a 2) variabilní oblast rámcové soustavy ze sekvence těžkého řetězce lidského akceptorového imunoglobulinu, za předpokladu, že přinejmenším jeden zbytek rámcové soustavy je substituován aminokyselinovým zbytkem ze sekvence variabilní oblasti těžkého řetězce myší 3D6, přičemž zbytek rámcové soustavy je vybrán ze skupiny sestávající z
    a) zbytku, jenž přímo nekovalentně váže antigen;
    b) zbytku přilehlého k CDR;
    c) zbytku interagujícího s CDR; a
    d) zbytku participujícího na vl-vh styčné ploše.
  3. 3. Lehký řetězec podle Nároku 1, přičemž zbytek interagující s CDR je identifikován modelováním 3D6 lehkého řetězce založeným na vyřešené struktuře 1CR9.
    • · • · • ·
    -1284. Lehký řetězec podle Nároku 1, přičemž zbytek interagující s CDR je identifikován modelováním 3D6 lehkého řetězce založeným na vyřešené struktuře 1NLD.
    5. Těžký řetězec podle Nároku 1, přičemž zbytek interagující s CDR je identifikován modelováním 3D6 těžkého řetězce založeným na vyřešené struktuře 1OPG.
    6. Lehký řetězec humanizovaného imunogíobulinu obsahující 1) komplementaritu určující oblasti (CDR) ze sekvence variabilní oblasti lehkého řetězce imunogíobulinu 3D6 načrtnuté jako SEKV. ID. Č. 2, a 2) variabilní oblast rámcové soustavy ze sekvence lehkého řetězce lidského akceptorového imunogíobulinu, za předpokladu, že přinejmenším jeden zbytek rámcové soustavy je substituován aminokyselinovým zbytkem ze sekvence variabilní oblasti lehkého řetězce myší 3D6, přičemž zbytek rámcové soustavy je zbytek schopný ovlivnit konformaci nebo funkci variabilní oblasti lehkého řetězce, jak je identifikována analýzou trojrozměrného modelu variabilní oblasti lehkého řetězce imunogíobulinu 3D6.
    7. Těžký řetězec humanizovaného imunogíobulinu obsahující 1) komplementaritu určující oblasti (CDR) ze sekvence variabilní oblasti lehkého řetězce imunogíobulinu 3D6 načrtnuté jako SEKV. ID. Č. 4, a 2) variabilní oblast rámcové soustavy ze sekvence těžkého řetězce lidského akceptorového imunogíobulinu, za předpokladu, že přinejmenším jeden zbytek rámcové soustavy je substituován aminokyselinovým zbytkem ze sekvence variabilní oblasti těžkého řetězce myší 3D6, přičemž zbytek rámcové soustavy je zbytek schopný ovlivnit konformaci nebo funkci variabilní oblasti těžkého řetězce, jak je identifikována analýzou trojrozměrného modelu variabilní oblasti těžkého řetězce imunogíobulinu 3D6.
    • · • · · · · • · · · · *
    -129- ..
    8. Lehký řetězec podle Nároku 6, přičemž zbytek rámcové soustavy je vybrán ze skupiny sestávající ze zbytku schopného interakce s antigenem, zbytku blízkého vazebnému místu antigenu, zbytku schopného interakce s CDR, zbytku přilehlého k CDR, zbytku do vzdálenosti 6 Á od zbytku CDR, kanonického zbytku, zbytku noniové zóny, zbytku balení mezi řetězci, neobvyklého zbytku, a zbytku glykosylačního místa na povrchu strukturního modelu.
    9. Těžký řetězec podle Nároku 7, přičemž zbytek rámcové soustavy je vybrán ze skupiny sestávající ze zbytku schopného interakce s antigenem, zbytku blízkého vazebnému místu antigenu, zbytku schopného interakce s CDR, zbytku přilehlého k CDR, zbytku do vzdálenosti 6 Á od zbytku CDR, kanonického zbytku, zbytku noniové zóny, zbytku balení mezi řetězci, neobvyklého zbytku, a zbytku glykosylačního místa na povrchu strukturního modelu.
    10. Lehký řetězec podle Nároků 6 nebo 8, přičemž zbytek rámcové soustavy je identifikován modelováním 3d6 lehkého řetězce založeným na vyřešené struktuře 1CR9.
    11. Lehký řetězec podle Nároků 6 nebo 8, přičemž zbytek rámcové soustavy je identifikován modelováním 3D6 lehkého řetězce založeným na vyřešené struktuře 1NLD.
    12. Těžký řetězec podle Nároků 7 nebo 9, přičemž zbytek rámcové soustavy je identifikován modelováním 3D6 těžkého řetězce založeným na vyřešené struktuře 1OPG.
    13. Lehký řetězec humanizovaného imunoglobulinu obsahující 1) komplementaritu určující oblasti (CDR) ze sekvence variabilní oblasti lehkého řetězce imunoglobulinu 3d6 načrtnuté jako SEKV. ID. č. 2, a 2) variabilní oblast rámcové soustavy ze sekvence lehkého řetězce lidského akceptorového imunoglobulinu, za předpokladu, že přinejmenším jeden zbytek rámcové soustavy vybraný ze • · • ·
    -130skupiny sestávající z Ll, L2, L36 a L46 (Kabatova konvence číslování) je substituován odpovídajícím aminokyselinovým zbytkem ze sekvence variabilní oblasti lehkého řetězce myší 3D6.
    14. Těžký řetězec humanizovaného imunoglobulinu obsahující 1) komplementaritu určující oblasti (CDR) ze sekvence variabilní oblasti těžkého řetězce imunoglobulinu 3D6 načrtnuté jako SEKV. ID. Č. 2, a 2) variabilní oblast rámcové soustavy ze sekvence těžkého řetězce lidského akceptorového imunoglobulinu, za předpokladu, že přinejmenším jeden zbytek rámcové soustavy vybraný ze skupiny sestávající z Ll, L2, l36 a L46 (Kabatova konvence číslování) je substituován odpovídajícím aminokyselinovým zbytkem ze sekvence variabilní oblasti těžkého řetězce myší 3D6.
    15. Lehký řetězec podle kteréhokoli z Nároků 1, 3, 4, 6, 8, 10, 11 a 13, přičemž lidský akceptorový lehký řetězec je subtypu kapa II (Kabatova konvence).
    16. Těžký řetězec podle kteréhokoli z Nároků 2, 5, 7, 9, 12 a 14, přičemž lidský akceptorový těžký řetězec je subtypu lil (Kabatova konvence).
    17. Lehký řetězec podle Nároku 15, přičemž lidský akceptorový lehký řetězec je vybrán ze skupiny sestávající z Kabat ID 019230, Kabat ID 005131, Kabat ID 005058, Kabat ID 005057, Kabat ID 005059, Kabat ID U21040, a Kabat ID U41645.
    18. Lehký řetězec podle Nároku 15, přičemž lidský akceptorový lehký řetězec je Kabat ID 019230.
    19. Těžký řetězec podle Nároku 15, přičemž lidský akceptorový těžký řetězec je vybrán ze skupiny sestávající z Kabat ID 045919, Kabat ID 000459, Kabat ID 000553, Kabat ID 000386, a Kabat ID M23691.
    • ·
    -131• ·
    20. Lehký řetězec podle Nároku 15, přičemž lidský akceptorový lehký řetězec je Kabat ID 045919.
    21. Lehký řetězec podle kteréhokoli z Nároků 1, 3, 4, 6, 8,
    10, 11, 13, 15, 17 a 18, přičemž přinejmenším jeden neobvyklý zbytek lidské rámcové soustavy je substituován aminokyselinovým zbytkem, jenž je běžný v této posici pro lidské sekvence variabilní oblasti lehkého řetězce.
    22. Lehký řetězec podle kteréhokoli z Nároků 1, 3, 4, 6, 8,
    10, 11, 13, 15, 17 a 18, přičemž přinejmenším jeden neobvyklý zbytek lidské rámcové soustavy je substituován odpovídajícím aminokyselinovým zbytkem ze sekvence zárodečné linie variabilní oblasti lehkého řetězce.
    23. Lehký řetězec podle Nároku 22, přičemž sekvence zárodečné linie variabilní oblasti lehkého řetězce je vybrána ze skupiny sestávající z Al, A17, A18, A2 nebo A19.
    24. Těžký řetězec podle kteréhokoli z Nároků 2, 5, 7, 9, 12,
    14, 16, 19 a 20, přičemž přinejmenším jeden neobvyklý zbytek lidské rámcové soustavy je substituován aminokyselinovým zbytkem, jenž je běžný v této posici pro lidské sekvence variabilní oblasti těžkého řetězce.
    25. Těžký řetězec podle kteréhokoli z Nároků 2, 5, 7, 9, 12,
    14, 16, 19 a 20, přičemž přinejmenším jeden neobvyklý zbytek lidské rámcové soustavy je substituován odpovídajícím aminokyselinovým zbytkem ze sekvence zárodečné linie variabilní oblasti těžkého řetězce.
    26. Těžký řetězec podle Nároku 25, přičemž sekvence zárodečné linie variabilní oblasti těžkého řetězce je vybrána ze skupiny sestávající z VH3-48, VH3-23, VH3-7, VH3-21 a
    VH3-11.
    27. Těžký řetězec podle Nároku 25, přičemž sekvence zárodečné linie variabilní oblasti těžkého řetězce je VH3-23.
    • ·
    -13228. Lehký řetězec podle kteréhokoli z Nároků 21 - 23, přičemž neobvyklý zbytek rámcové soustavy je vybrán na základě výskytu v této posici u méně než 10 % sekvencí lidské variabilní oblasti lehkého řetězce v podskupině variabilních oblasti lehkého řetězce a běžný zbytek je vybrán na základě výskytu v této posici u více než 50 % sekvencí lidské variabilní oblasti lehkého řetězce v podskupině variabilních oblasti lehkého řetězce.
    29. Těžký řetězec podle kteréhokoli z Nároků 24 - 26, přičemž neobvyklý zbytek rámcové soustavy je vybrán na základě výskytu v této posici u méně než 10 % sekvencí lidské variabilní oblasti těžkého řetězce v podskupině variabilních oblasti těžkého řetězce a běžný zbytek je vybrán na základě výskytu v této posici u více než 50 % sekvencí lidské variabilní oblasti těžkého řetězce v podskupině variabilních oblasti těžkého řetězce.
    30. Lehký řetězec obsahující komplementaritu určující oblasti (CDR) a zbytky variabilní oblasti rámcové soustavy Ll, L2, L36 a L46 (Kabatova konvence číslování) z lehkého řetězce monoklonální protilátky 3D6, přičemž zbývající části lehkého řetězce jsou z lidského imunoglobulinu.
    31. Těžký řetězec obsahující komplementaritu určující oblasti (CDR) a zbytky variabilní oblasti rámcové soustavy H49, H93 a H94 (Kabatova konvence číslování) z těžkého řetězce monoklonální protilátky 3D6, přičemž zbývající části těžkého řetězce jsou z lidského imunoglobulinu.
    32. Humanizovaný imunoglobulin obsahující lehký řetězec podle kteréhokoli z Nároků 1, 3, 4, 6, 8, 10, 11, 13, 15, 17 a 18 a obsahující těžký řetězec podle kteréhokoli z Nároků 2, 5, 7, 9, 12, 14, 16, 19 a 20, nebo fragment řečeného imunoglobulinu vážící antigen.
    -13333. Imunoglobulin nebo antigen vážící fragment podle Nároku 32, jenž se specificky váže k beta amyloidnímu peptidu (Αβ) s vazebnou afinitou přinejmenším 107 NT1.
    34. imunoglobulin nebo antigen vážící fragment podle Nároku 32, jenž se specificky váže k beta amyloidnímu peptidu (Αβ) s vazebnou afinitou přinejmenším 108 M'1.
    35. imunoglobulin nebo antigen vážící fragment podle Nároku 32, jenž se specificky váže k beta amyloidnímu peptidu (Αβ) s vazebnou afinitou přinejmenším 109 M'1.
    36. imunoglobulin nebo antigen vážící fragment podle
    Nároku 32, jehož isotyp těžkého řetězce je yl.
    37. imunoglobulin nebo antigen vážící fragment podle
    Nároku 32, jenž se váže jak k rozpustnému beta amyloidnímu peptidu (Αβ), tak k agregovanému Αβ.
    38. Imunoglobulin nebo antigen vážící fragment podle Nároku 37, přičemž rozpustný beta amyloidní peptid (Αβ) je disagregovaný Αβ.
    39. imunoglobulin nebo antigen vážící fragment podle Nároku 32, jenž zprostředkovává fagocytosu beta amyloidního peptidu (Αβ).
    40. Imunoglobulin nebo antigen vážící fragment podle
    Nároku 32, jenž prochází bariérou krev/mozek subjektu.
    41. imunoglobulin nebo antigen vážící fragment podle
    Nároku 32, jenž u subjektu snižuje jak zátěž beta amyloidního peptidu (Αβ), tak neuritickou dystrofii.
    42. Humanizovaný imunoglobulin, obsahující humanizovaný těžký řetězec a humanizovaný lehký řetězec, jehož • ·
    134a) humanizovaný lehký řetězec obsahuje tři komplementaritu určující oblasti (CDRl, CDR2 a
    CDR3) mající z odpovídajících oblastí variabilní aminokyselinové sekvence komplementaritu určujících domény lehkého řetězce myšího 3d6 imunoglobulinu, označované SEKV. ID. č. 2, a sekvence variabilní oblasti rámcové soustavy lidského lehkého řetězce, za předpokladu, že přinejmenším jedna posice z první skupiny sestávající z Ll, L2, L36 a L46 (Kabatova konvence číslování) je obsazena stejným aminokyselinovým zbytkem, jaký je přítomen ve variabilní oblasti rámcové soustavy lehkého řetězce myšího 3d6 imunoglobulinu;
    b) humanizovaný těžký komplementaritu určující retezec oblasti obsahuje tři (CDRl, CDR2 a aminokyselinové sekvence komplementaritu určujících domény těžkého řetězce myšího 3D6 imunoglobulinu, označované SEKV. ID. Č. 4, a sekvence variabilní oblasti rámcové soustavy lidského lehkého řetězce, za předpokladu, že přinejmenším jedna posice z druhé skupiny sestávající z H49, H93 a H94 (Kabatova konvence číslování) je obsazena stejným aminokyselinovým zbytkem, jaký je přítomen ve variabilní oblasti rámcové soustavy těžkého řetězce myšího 3D6 imunoglobulinu zbytku přilehlého k CDR;
    CDR3) mající z odpovídajících oblastí variabilní přičemž humanizovaný imunoglobulin se specificky váže k beta amyloidnímu peptidu (Αβ) s vazebnou afinitou přinejmenším 108 M'1, přičemž 3D6 imunoglobulin má lehký řetězec s variabilní doménou označovanou SEKV. ID. Č. 2 a těžký řetězec s variabilní doménou označovanou SEKV. ID. Č. 4.
    • · ·· ·· · · · · · · · · • · · ···· · · · • · · · · · · · · · · · • ·· ··· · · ··· · · • ·· · · · · · · ·· ·
    -135- ............
    43. Humanizovaný imunoglobulin podle nároku 42, jehož variabilní oblast rámcové soustavy lidského lehkého řetězce je z kapa variabilní oblasti lehkého řetězce.
    44. Humanizovaný imunoglobulin podle nároku 42, jehož variabilní oblast rámcové soustavy lidského těžkého řetězce je z igGl variabilní oblasti těžkého řetězce.
    45. Humanizovaný imunoglobulin podle nároku 42, jehož variabilní oblast rámcové soustavy lidského lehkého řetězce je z lehkého řetězce vybraného ze skupiny sestávající z Kabat ID 019230, Kabat ID 005131, Kabat ID 005058, Kabat ID 005057, Kabat ID 005059, Kabat ID U21040, a Kabat ID U41645.
    46. Humanizovaný imunoglobulin podle nároku 42, jehož variabilní oblast rámcové soustavy lidského těžkého řetězce je z těžkého řetězce vybraného ze skupiny sestávající z Kabat ID 045919, Kabat ID 000459, Kabat ID 000553, Kabat ID 000386, a Kabat ID M23691.
    47. Humanizovaný imunoglobulin podle nároku 42, jehož variabilní oblast rámcové soustavy humanizovaného lehkého řetězce je identická se sekvencí variabilní oblasti rámcové soustavy lehkého řetězce Kabat ID 019230 s výjimkou posicí z první skupiny, a variabilní oblast rámcové soustavy humanizovaného těžkého řetězce je identická se sekvencí variabilní oblasti rámcové soustavy těžkého řetězce Kabat ID 000459.
    48. Humanizovaný imunoglobulin podle nároku 42, jehož humanizovaný lehký řetězec obsahuje komplementaritu určující oblasti identické s komplementaritu určujícími oblastmi myšího 3D6 lehkého řetězce a humanizovaný těžký řetězec obsahuje komplementaritu určující oblasti identické s komplementaritu určujícími oblastmi myšího 3d6 těžkého řetězce.
    β · • · · *·· · · · · ·· * • * · · · t ··· · · · • ·· ··· ·· ··» · · • ·· · · ·· · · · 9 · • 9 »· ·· «· ·· 9 9
    -13649. Humanizovaná protilátka obsahující komplementaritu určující oblasti (CDRl, CDR2 a CDR3) sekvence 3D6 variabilní oblasti lehkého řetězce načrtnuté jako SEKV. ID. Č. 2.
    50. Humanizovaná protilátka obsahující komplementaritu určující oblasti (CDRl, CDR2 a CDR3) sekvence 3D6 variabilní oblasti těžkého řetězce načrtnuté jako SEKV. ID. č. 4.
    51. Humanizovaná protilátka nebo její antigen vážící fragment, jež se specificky váže k beta amyloidnímu peptidu (Αβ) a obsahuje variabilní oblast obsahující komplementaritu určující oblasti (CDR) odpovídající komplementaritu určujícím oblastem myší 3D6 protilátky.
    52. Humanizovaná protilátka nebo její antigen vážící fragment, jež váže beta amyloidní peptid (Αβ) s afinitou přinejmenším 108 NT1 a obsahuje
    a) variabilní doménu lehkého řetězce obsahující aminokyselinové zbytky komplementaritu určující oblasti (CDR) myší 3D6 a aminokyselinové zbytky oblasti rámcové soustavy variabilní domény lidské VL podskupiny II (FR); a
    b) variabilní doménu těžkého řetězce obsahující aminokyselinové zbytky komplementaritu určující oblasti (CDR) myší 3D6 a aminokyselinové zbytky oblasti rámcové soustavy variabilní domény lidské vh podskupiny m (fr).
    53. Chimérický imunoglobulin obsahující komplementaritu určující oblasti (CDR) sekvencí 3d6 variabilní oblasti 3D6 imunogíobulinu načrtnuté jako SEKV. ID. Č. 2 a SEKV. ID. Č. 4 a variabilní oblasti rámcové soustavy lidského akceptorového imunogíobulinu.
    -13754. Imunoglobulin nebo jeho antigen vážící fragment, obsahující variabilní oblast těžkého řetězce jak je načrtnuta v SEKV. ID. č. 8 a variabilní oblast lehkého řetězce jak je načrtnuta SEKV. ID. Č. 5.
    55. Imunoglobulin nebo jeho antigen vážící fragment, obsahující variabilní oblast těžkého řetězce jak je načrtnuta v SEKV. ID. Č. 12 a variabilní oblast lehkého řetězce jak je načrtnuta SEKV. ID. č. 11.
    56. Imunoglobulin obsahující variabilní oblast těžkého řetězce jak je načrtnuta v SEKV. ID. Č. 8, variabilní oblast lehkého řetězce jak je načrtnuta SEKV. ID. č. 5 a konstantní oblasti z igGl.
    57. Imunoglobulin obsahující variabilní oblast těžkého řetězce jak je načrtnuta v SEKV. ID. Č. 12, variabilní oblast lehkého řetězce jak je načrtnuta SEKV. ID. č. 11 a konstantní oblasti z igGl.
    58. Způsob prevence nebo léčby amyloidogenního onemocnění u pacienta, vyznačující se tím, že se pacientovi podává účinná dávka humanizovaného imunoglobulinu podle kteréhokoli z Nároků 32 - 52.
    59. Způsob prevence nebo léčby Alzheimerovy choroby u pacienta, vyznačující se tím, že se pacientovi podává účinná dávka humanizovaného imunoglobulinu podle kteréhokoli z Nároků 32 - 52.
    60. Způsob podle Nároku 59, vyznačující se tím, že účinná dávka humanizovaného imunoglobulinu je 1 mg/kg tělesné hmotnosti.
    61. Způsob podle Nároku 59, v y z n a č u j í c í se tím, že účinná dávka humanizovaného imunoglobulinu je 10 mg/kg tělesné hmotnosti.
    • ·
    -13862. Farmaceutický prostředek vyznačující se t í m, že obsahuje imunoglobulin podle kteréhokoli z Nároků 32 - 52 a farmaceuticky přijatelný nosič.
    63. isolovaný polypeptid obsahující fragment SEKV. ID. Č. 2 vybraný ze skupiny sestávající z aminokyselin 24 - 39 SEKV. ID. Č. 2, aminokyselin 55 - 61 SEKV. ID. č. 2, aminokyselin 94 - 102 SEKV. ID. Č. 2.
    64. Isolovaný polypeptid obsahující aminokyseliny 24 - 39
    SEKV. ID. č. 2, aminokyseliny 55-61 SEKV. ID. Č. 2 a aminokyseliny 94 - 102 SEKV. ID. č. 2.
    65. isolovaný polypeptid obsahující fragment SEKV. ID. č. 4 vybraný ze skupiny sestávající z aminokyselin 31 - 35 SEKV. ID. Č. 4, aminokyselin 50 - 66 SEKV. ID. Č. 4, aminokyselin 99 - 107 SEKV. ID. Č. 4.
    66. isolovaný polypeptid obsahující aminokyseliny 31 - 35 SEKV. ID. č. 4, aminokyseliny 50 - 66 SEKV. ID. Č. 4 a aminokyseliny 99 - 107 SEKV. ID. č. 4.
    67. isolovaný polypeptid obsahující aminokyselinovou sekvenci SEKV. ID. Č. 2.
    68. isolovaný polypeptid obsahující aminokyselinovou sekvenci SEKV. ID. Č. 4.
    69. Variant polypeptidů obsahujícího aminokyselinovou sekvenci SEKV. ID. č. 2 obsahující přinejmenším jednu konservativní aminokyselinovou substituci, přičemž si zachovává schopnost směrovat specifickou vazbu k beta amyloidnímu peptidu (Αβ) s vazebnou afinitou přinejmenším 107 M'1.
    70. variant polypeptidů obsahujícího aminokyselinovou sekvenci SEKV. ID. č. 4 obsahující přinejmenším jednu konservativní aminokyselinovou substituci, přičemž si zachovává • · • · • ·
    I • · • · · ·
    -139schopnost směrovat specifickou vazbu k beta amyloidnímu peptidu (Αβ) s vazebnou afinitou přinejmenším 107 M'1.
    71. isolovaný polypeptid obsahující aminokyseliny 1 - 112 aminokyselinové sekvence sekv. id. č. 2, nebo aminokyseliny 1 - 119 aminokyselinové sekvence SEKV. ID.
    Č. 4.
    72. Isolovaná molekula nukleové kyseliny kódující lehký řetězec podle kteréhokoli z Nároků 1, 3, 4, 6, 8, 10, 11, 13, 15, 17 a 18.
    73. Isolovaná molekula nukleové kyseliny kódující těžký řetězec podle kteréhokoli z Nároků 2, 5, 7, 9, 12, 14, 16, 19 a 20.
    74. Isolovaná molekula nukleové kyseliny kódující polypeptid podle kteréhokoli z Nároků 64 - 71.
    75. Isolovaná molekula nukleové kyseliny kódující polypeptid podle kteréhokoli z Nároků 32 - 57.
    76. Vektor obsahující molekulu nukleové kyseliny podle kteréhokoli z Nároků 72 - 76.
    77. Vektor obsahující molekulu nukleové kyseliny podle kteréhokoli z Nároků 72 - 76.
    78. Hostitelská buňka obsahující molekulu nukleové kyseliny podle kteréhokoli z Nároků 72 - 76.
    79. Způsob produkce protilátky nebo jejího fragmentu vyznačující se tím, že způsob zahrnuje kultivaci hostitelských buněk podle Nároku 45 za takových podmínek, že takováto protilátka nebo fragment jsou produkovány, a isolaci řečené protilátky nebo fragmentu z hostitelské buňky nebo z kultury.
    • · • ·
    -14080. Způsob produkce protilátky nebo jejího fragmentu vyznačující se tím, že způsob zahrnuje kultivaci hostitelských buněk, jež exprimují molekulu nukleové kyseliny kódující řečené protilátky nebo fragmenty za takových podmínek, že takováto protilátka nebo fragment jsou produkovány, a isolaci řečené protilátky nebo fragmentu z hostitelské buňky nebo z kultury, přičemž řečená protilátka nebo fragment obsahuje aminokyseliny 24 - 39 SEKV. ID. Č. 2, aminokyseliny 55 - 61 SEKV. ID. Č. 2 a aminokyseliny 94 102 SEKV. ID. Č. 2.
    81. Způsob produkce protilátky nebo jejího fragmentu vyznačující se tím, že způsob zahrnuje kultivaci hostitelských buněk, jež exprimují molekulu nukleové kyseliny kódující řečené protilátky nebo fragmenty za takových podmínek, že takováto protilátka nebo fragment jsou produkovány, a isolaci řečené protilátky nebo fragmentu z hostitelské buňky nebo z kultury, přičemž řečená protilátka nebo fragment obsahuje aminokyseliny 31 - 35 SEKV. ID. Č. 4, aminokyseliny 50 - 66 SEKV. ID. Č. 4 a aminokyseliny 99 112 SEKV. ID. Č. 4.
    82. Způsob identifikace zbytků podléhajících substituci ve variabilní oblasti humanizované rámcové soustavy imunoglobulinu 3d6, vyznačující se t í m, že způsob zahrnuje modelování trojrozměrné struktury 3d6 variabilní oblasti založené na vyřešené imunoglobulinové struktuře a analýzu řečeného modelu co do zbytků, jež mohou ovlivnit konformaci nebo funkci variabilní oblasti imunoglobulinu 3D6 tak, že jsou identifikovány zbytky podléhaj i cích substi tuci.
    83. Použití sekvencí variabilních oblastí načrtnutých jako SEKV. id. č. 2 a SEKV. ID. č. 4, nebo jakékoli jejich části, k produkci trojrozměrného obrazu imunoglobulinu 3D6, řetězce imunoglobulinu 3D6, nebo jejich domén.
    -141• « * · • · · ·
    84. Lehký řetězec humanizovaného imunoglobulinu obsahující 1) komplementaritu určující oblasti (CDR) ze sekvence variabilní oblasti lehkého řetězce imunoglobulinu 10D5 načrtnuté jako SEKV. ID. Č. 14, a 2) variabilní oblast rámcové soustavy ze sekvence lehkého řetězce lidského akceptorového imunoglobulinu, za předpokladu, že přinejmenším jeden zbytek rámcové soustavy je substituován aminokyselinovým zbytkem ze sekvence variabilní oblasti lehkého řetězce myší 10d5, přičemž zbytek rámcové soustavy je vybrán ze skupiny sestávající z
    a) zbytku, jenž přímo nekovalentně váže antigen;
    b) zbytku přilehlého k CDR;
    c) zbytku interagujícího s CDR; a
    d) zbytku participujícího na vl-vh styčné ploše.
    85. Těžký řetězec humanizovaného imunoglobulinu obsahující 1) komplementaritu určující oblasti (CDR) ze sekvence variabilní oblasti lehkého řetězce imunoglobulinu 10D5 načrtnuté jako SEKV. ID. Č. 16, a 2) variabilní oblast rámcové soustavy ze sekvence těžkého řetězce lidského akceptorového imunoglobulinu, za předpokladu, že přinejmenším jeden zbytek rámcové soustavy je substituován aminokyselinovým zbytkem ze sekvence variabilní oblasti těžkého řetězce myší 10D5, přičemž zbytek rámcové soustavy je vybrán ze skupiny sestávající z
    a) zbytku, jenž přímo nekovalentně váže antigen;
    b) zbytku přilehlého k CDR;
    c) zbytku interagujícího s CDR; a
    d) zbytku participujícího na vl-vh styčné ploše.
    86. Lehký řetězec podle Nároku 84, jehož zbytek interagující s CDR je identifikován modelováním 10D5 lehkého řetězce založeným na vyřešené struktuře lehkého řetězce myšího imunoglobulinu, jenž sdílí přinejmenším 70 % sekvenční identity s lehkým řetězcem 10D5.
    -142Φ 4
    87. Lehký řetězec podle Nároku 84, jehož zbytek interagující s CDR je identifikován modelováním 10D5 lehkého řetězce založeným na vyřešené struktuře lehkého řetězce myšího imunoglobulinu, jenž sdílí přinejmenším 80 % sekvenční identity s lehkým řetězcem 10D5.
    88. Lehký řetězec podle Nároku 84, jehož zbytek interagující s CDR je identifikován modelováním 10D5 lehkého řetězce založeným na vyřešené struktuře lehkého řetězce myšího imunoglobulinu, jenž sdílí přinejmenším 90 % sekvenční identity s lehkým řetězcem 10D5.
    89. Těžký řetězec podle Nároku 85, jehož zbytek interagující s CDR je identifikován modelováním 10D5 těžkého řetězce založeným na vyřešené struktuře těžkého řetězce myšího imunoglobulinu, jenž sdílí přinejmenším 70 % sekvenční identity s těžkým řetězcem 10D5.
    90. Těžký řetězec podle Nároku 85, jehož zbytek interagující s CDR je identifikován modelováním 10D5 těžkého řetězce založeným na vyřešené struktuře těžkého řetězce myšího imunoglobulinu, jenž sdílí přinejmenším 80 % sekvenční identity s těžkým řetězcem 10D5.
    91. Těžký řetězec podle Nároku 85, jehož zbytek interagující s CDR je identifikován modelováním 10D5 těžkého řetězce založeným na vyřešené struktuře těžkého řetězce myšího imunoglobulinu, jenž sdílí přinejmenším 90 % sekvenční identity s těžkým řetězcem 10D5.
    92. Lehký řetězec humanizovaného imunoglobulinu obsahující
    1) komplementaritu určující oblasti (CDR) ze sekvence variabilní oblasti lehkého řetězce imunoglobulinu 10D5 načrtnuté jako SEKV. ID. Č. 14, a 2) variabilní oblast rámcové soustavy ze sekvence lehkého řetězce lidského akceptorového imunoglobulinu, za předpokladu, že přinejmenším jeden zbytek rámcové soustavy je substituován odpovídajícím aminokyselinovým zbytkem ze sekvence • · 0
    -143variabilní oblasti lehkého řetězce myší 10D5, přičemž zbytek rámcové soustavy je zbytek schopný ovlivnit konformaci nebo funkci variabilní oblasti lehkého řetězce, jak je identifikována analýzou trojrozměrného modelu variabilní oblasti lehkého řetězce imunoglobulinu 10D5.
    93. Těžký řetězec humanizovaného imunoglobulinu obsahující 1) komplementaritu určující oblasti (CDR) ze sekvence variabilní oblasti lehkého řetězce imunoglobulinu 10D5 načrtnuté jako SEKV. ID. č. 16, a 2) variabilní oblast rámcové soustavy ze sekvence těžkého řetězce lidského akceptorového imunoglobulinu, za předpokladu, že přinejmenším jeden zbytek rámcové soustavy je substituován aminokyselinovým zbytkem ze sekvence variabilní oblasti těžkého řetězce myší 10D5, přičemž zbytek rámcové soustavy je zbytek schopný ovlivnit konformaci nebo funkci variabilní oblasti těžkého řetězce, jak je identifikována analýzou trojrozměrného modelu variabilní oblasti těžkého řetězce imunoglobulinu 10D5.
    94. Lehký řetězec podle Nároku 92, jehož zbytek rámcové soustavy je vybrán ze skupiny sestávající ze zbytku schopného interakce s antigenem, zbytku blízkého vazebnému místu antigenu, zbytku schopného interakce s CDR, zbytku přilehlého k CDR, zbytku do vzdálenosti 6 Á od zbytku CDR, kanonického zbytku, zbytku noniové zóny, zbytku balení mezi řetězci, neobvyklého zbytku, a zbytku glykosylačního místa na povrchu strukturního modelu.
    95. Těžký řetězec podle Nároku 93, jehož zbytek rámcové soustavy je vybrán ze skupiny sestávající ze zbytku schopného interakce s antigenem, zbytku blízkého vazebnému místu antigenu, zbytku schopného interakce s CDR, zbytku přilehlého k CDR, zbytku do vzdálenosti 6 Á od zbytku CDR, kanonického zbytku, zbytku noniové zóny, zbytku balení mezi řetězci, neobvyklého zbytku, a zbytku glykosylačního místa na povrchu strukturního modelu.
  4. 4 4 ·4 44 ·* ··· 4 · 4 4 4 1 4 • · · »r «··· ·« ·
    4 4 « · 4 t ·· >♦» ♦ ·
    4 4 4 4 444 4 4 44 4
    44 ·· ·* » · · * ♦ «
    -14496. Lehký řetězec podle Nároku 92 nebo 94, jehož zbytek interagující s CDR je identifikován modelováním 10D5 lehkého řetězce založeným na vyřešené struktuře lehkého řetězce myšího imunoglobulinu, jenž sdílí přinejmenším 70 % sekvenční identity s lehkým řetězcem 10D5.
    97. Lehký řetězec podle Nároku 92 nebo 94, jehož zbytek interagující s CDR je identifikován modelováním 10D5 lehkého řetězce založeným na vyřešené struktuře lehkého řetězce myšího imunoglobulinu, jenž sdílí přinejmenším 80 % sekvenční identity s lehkým řetězcem 10D5.
    98. Lehký řetězec podle Nároku 92 nebo 94, jehož zbytek interagující s CDR je identifikován modelováním 10D5 lehkého řetězce založeným na vyřešené struktuře lehkého řetězce myšího imunoglobulinu, jenž sdílí přinejmenším 90 % sekvenční identity s lehkým řetězcem 10D5.
    99. Těžký řetězec podle Nároku 93 nebo 95, jehož zbytek interagující s CDR je identifikován modelováním 10D5 těžkého řetězce založeným na vyřešené struktuře těžkého řetězce myšího imunoglobulinu, jenž sdílí přinejmenším 70 % sekvenční identity s těžkým řetězcem 10d5.
    100. Těžký řetězec podle Nároku 93 nebo 95, jehož zbytek interagující s CDR je identifikován modelováním 10D5 těžkého řetězce založeným na vyřešené struktuře těžkého řetězce myšího imunoglobulinu, jenž sdílí přinejmenším 80 % sekvenční identity s těžkým řetězcem 10D5.
    101. Těžký řetězec podle Nároku 93 nebo 95, jehož zbytek interagující s CDR je identifikován modelováním 10D5 těžkého řetězce založeným na vyřešené struktuře těžkého řetězce myšího imunoglobulinu, jenž sdílí přinejmenším 90 % sekvenční identity s těžkým řetězcem 10D5.
    -14594
  5. 9 * 9 9 9 9 ·
    19·· 99 9
    102. Lehký řetězec podle kteréhokoli z Nároků 84, 86 - 88,
    92, 94 a 96 - 98, jehož přinejmenším jeden neobvyklý zbytek lidské rámcové soustavy je substituován aminokyselinovým zbytkem, jenž je běžný v této posici pro lidské sekvence variabilní oblasti lehkého řetězce.
    103. Lehký řetězec podle kteréhokoli z Nároků 84, 86 - 88,
    92, 94 a 96 - 98, jehož přinejmenším jeden neobvyklý zbytek lidské rámcové soustavy je substituován odpovídajícím aminokyselinovým zbytkem ze sekvence zárodečné linie variabilní oblasti lehkého řetězce.
    104. Lehký řetězec podle Nároku 103, jehož variabilní sekvence lehkého řetězce zárodečné linie je sekvence imunoglobulinu, jenž sdílí přinejmenším 70 % sekvenční identity s variabilní sekvencí lehkého řetězce.
    105. Lehký řetězec podle Nároku 103, jehož variabilní sekvence lehkého řetězce zárodečné linie je sekvence imunoglobulinu, jenž sdílí přinejmenším 80 % sekvenční identity s variabilní sekvencí lehkého řetězce.
    106. Lehký řetězec podle Nároku 103, jehož variabilní sekvence lehkého řetězce zárodečné linie je sekvence imunoglobulinu, jenž sdílí přinejmenším 90 % sekvenční identity s variabilní sekvencí lehkého řetězce.
    107. Těžký řetězec podle kteréhokoli z Nároků 85, 89 - 91, 93 a 99 - 101, jehož přinejmenším jeden neobvyklý zbytek lidské rámcové soustavy je substituován aminokyselinovým zbytkem, jenž je běžný v této posici pro lidské sekvence variabilní oblasti těžkého řetězce.
    108. Těžký řetězec podle kteréhokoli z Nároků 85, 89 - 91, 93 a 99 - 101, jehož přinejmenším jeden neobvyklý zbytek lidské rámcové soustavy je substituován odpovídajícím aminokyselinovým zbytkem ze sekvence zárodečné linie variabilní oblasti těžkého řetězce.
    υ· ··
    9 9 9 4
    9 9 99
    99 9999 • 9 9
    9 9 9
    146109. Těžký řetězec podle Nároku 108, jehož variabilní sekvence těžkého řetězce zárodečné linie je sekvence imunoglobulinu, jenž sdílí přinejmenším 70 % sekvenční identity s variabilní sekvencí těžkého řetězce SEKV. ID. Č. 16.
    110. Těžký řetězec podle Nároku 108, jehož variabilní sekvence těžkého řetězce zárodečné linie je sekvence imunoglobulinu, jenž sdílí přinejmenším 80 % sekvenční identity s variabilní sekvencí těžkého řetězce SEKV. ID. Č. 16.
    111. Těžký řetězec podle Nároku 108, jehož variabilní sekvence těžkého řetězce zárodečné linie je sekvence imunoglobulinu, jenž sdílí přinejmenším 90 % sekvenční identity s variabilní sekvencí těžkého řetězce SEKV. ID. Č. 16.
    112. Lehký řetězec podle kteréhokoli z Nároků 102 - 106, jehož neobvyklý zbytek rámcové soustavy je vybrán na základě výskytu v této posici u méně než 10 % sekvencí lidské variabilní oblasti lehkého řetězce v podskupině variabilních oblasti lehkého řetězce a běžný zbytek je vybrán na základě výskytu v této posici u více než 50 % sekvencí lidské variabilní oblasti lehkého řetězce v podskupině variabilních oblasti lehkého řetězce.
    113. Těžký řetězec podle kteréhokoli z Nároků 102 - 106, jehož neobvyklý zbytek rámcové soustavy je vybrán na základě výskytu v této posici u méně než 10 % sekvencí lidské variabilní oblasti těžkého řetězce v podskupině variabilních oblasti těžkého řetězce a běžný zbytek je vybrán na základě výskytu v této posici u více než 50 % sekvencí lidské variabilní oblasti těžkého řetězce v podskupině variabilních oblasti těžkého řetězce.
    • φ • * *·· · · »* ·· « • * * · · · r · · · · · · • ·· · » » · · · ·* · ·« 99 99 99 99
    -147114. Humanizovaný imunoglobuliη, obsahující lehký řetězec podle kteréhokoli z Nároků 84, 86-88, 92, 94 a 96 - 98, a těžký řetězec podle kteréhokoli z Nároků 85, 89 - 91, 93 a 99 - 101, nebo fragment řečeného imunoglobulinu vážící antigen.
    115. Imunoglobulin nebo antigen vážící fragment podle Nároku 114, jenž se specificky váže k beta amyloidnímu peptidu (Αβ) s vazebnou afinitou přinejmenším 107 M'1.
    116. imunoglobulin nebo antigen vážící fragment podle Nároku 114, jenž se specificky váže k beta amyloidnímu peptidu (Αβ) s vazebnou afinitou přinejmenším 108 M'1.
    117. Imunoglobulin nebo antigen vážící fragment podle Nároku 114, jenž se specificky váže k beta amyloidnímu peptidu (Αβ) s vazebnou afinitou přinejmenším 109 M1.
    118. Imunoglobulin nebo antigen vážící fragment podle
    Nároku 114, jehož isotyp těžkého řetězce je yl.
    119. imunoglobulin nebo antigen vážící fragment podle
    Nároku 114, jenž se váže k agregovanému beta amyloidnímu peptidu (Αβ).
    120. Imunoglobulin nebo antigen vážící fragment podle Nároku 114, jenž zprostředkovává fagocytosu beta amyloidního peptidu (Αβ).
    121. Imunoglobulin nebo antigen vážící fragment podle
    Nároku 114, jenž prochází bariérou krev/mozek subjektu.
    122. imunoglobulin nebo antigen vážící fragment podle
    Nároku 114, jenž u subjektu snižuje zátěž beta amyloidního peptidu (Αβ).
    123. Humanizovaný imunoglobulin, obsahující humanizovaný těžký řetězec a humanizovaný lehký řetězec, jehož
    148• · obsahuje tři (CDRl, CDR2 a sekvence určujících • · · • · • · · · • · ·
    a) humanizovaný lehký komplementaritu určující CDR3) mající z odpovídajících oblastí variabilní retezec oblasti aminokyselinové komplementaritu domény lehkého řetězce myšího 10D5 imunoglobulinu, označované SEKV. ID. Č. 14, a sekvence variabilní oblasti rámcové soustavy lidského lehkého řetězce, za předpokladu, že přinejmenším jeden zbytek rámcové soustavy vybraný ze skupiny sestávající z kanonického zbytku, noniového zbytku, balícího zbytku a neobvyklého zbytku je obsazen stejným aminokyselinovým zbytkem, jaký je přítomen ve variabilní oblasti rámcové soustavy lehkého řetězce myšího 10D5 imunoglobulinu;
    b) humanizovaný těžký komplementaritu určující řetězec oblasti obsahuje tři (CDRl, CDR2 a aminokyselinové sekvence komplementaritu určujících domény těžkého řetězce myšího 10D6 imunoglobulinu, označované SEKV. ID. Č. 16, a sekvence variabilní oblasti rámcové soustavy lidského lehkého řetězce, za předpokladu, že přinejmenším jeden zbytek rámcové soustavy vybraný ze skupiny sestávající z kanonického zbytku, noniového zbytku, balícího zbytku a neobvyklého zbytku je obsazen stejným aminokyselinovým zbytkem, jaký je přítomen ve variabilní oblasti rámcové soustavy těžkého řetězce myšího 10D5 imunoglobulinu;
    CDR3) mající z odpovídajících oblastí variabilní přičemž humanizovaný imunoglobulin se specificky váže k beta amyloidnímu peptidu (Αβ) s vazebnou afinitou přinejmenším 108 M’1, přičemž 10D5 imunoglobulin má lehký řetězec s variabilní doménou označovanou SEKV. ID. č. 14 a těžký řetězec s variabilní doménou označovanou SEKV. ID. č. 16.
    • ·
    -149124. Humanizovaný imunoglobulin podle nároku 123, jehož variabilní oblast rámcové soustavy lidského lehkého řetězce je z kapa variabilní oblasti lehkého řetězce.
    125. Humanizovaný imunoglobulin podle nároku 123, jehož variabilní oblast rámcové soustavy lidského těžkého řetězce je z IgGl variabilní oblasti těžkého řetězce.
    126. Humanizovaný imunoglobulin podle nároku 123, jehož variabilní oblast rámcové soustavy lehkého řetězce je z lehkého řetězce lidského imunoglobulinu majícího přinejmenším 70 % sekvenční identity se sekvencí lehkého řetězce imunoglobulinu 10D5.
    127. Humanizovaný imunoglobulin podle nároku 123, jehož variabilní oblast rámcové soustavy těžkého řetězce je z těžkého řetězce lidského imunoglobulinu majícího přinejmenším 70 % sekvenční identity se sekvencí těžkého řetězce imunoglobulinu 10D5.
    128. Humanizovaný imunoglobulin podle nároku 123, jehož humanizovaný lehký řetězec obsahuje komplementaritu určující oblasti identické s komplementaritu určujícími oblastmi myšího 10D5 lehkého řetězce a humanizovaný těžký řetězec obsahuje komplementaritu určující oblasti identické s komplementaritu určujícími oblastmi myšího 10D5 těžkého řetězce.
    129. Humanizovaná protilátka obsahující komplementaritu určující oblasti (CDRl, CDR2 a CDR3) sekvence 10D5 variabilní oblasti lehkého řetězce načrtnuté jako SEKV. ID. Č. 14.
    130. Humanizovaná protilátka obsahující komplementaritu určující oblasti (CDRl, CDR2 a CDR3) sekvence 10D5 variabilní oblasti těžkého řetězce načrtnuté jako SEKV. ID. č. 16.
    • · · ·
    -150131. Humanizovaná protilátka nebo její antigen vážící fragment, jež se specificky váže k beta amyloidnímu peptidu (Αβ) a obsahuje variabilní oblast obsahující komplementaritu určující oblasti (cdr) odpovídající komplementaritu určujícím oblastem myší 10D5 protilátky.
    132. chimérický imunoglobulin obsahující sekvence variabilní oblasti v podstatě jak jsou načrtnuty v SEKV. ID. č. 14 a SEKV. ID. Č. 16 a sekvence konstantní oblasti z lidského imunoglobulinů.
    133. Způsob prevence nebo léčby amyloidogenního onemocnění u pacienta, vyznačující se tím, že se pacientovi podává účinná dávka humanizovaného imunoglobulinů podle kteréhokoli z Nároků 114 - 131.
    134. způsob prevence nebo léčby Alzheimerovy choroby u pacienta, vyznačující se tím, že se pacientovi podává účinná dávka humanizovaného imunoglobulinů podle kteréhokoli z Nároků 114 - 131.
    135. Způsob podle Nároku 134, vyznačující se t i m, že účinná dávka humanizovaného imunoglobulinů je 1 mg/kg tělesné hmotnosti.
    136. Způsob podle Nároku 134, vyznačující se t í m, že účinná dávka humanizovaného imunoglobulinů je 10 mg/kg tělesné hmotnosti.
    137. Farmaceutický prostředek vyznačující se tím, že obsahuje imunoglobulin podle kteréhokoli z Nároků 114 - 131 a farmaceuticky přijatelný nosič.
    138. isolovaný polypeptid obsahující fragment SEKV. ID. Č. 2 vybraný ze skupiny sestávající z aminokyselin 24 - 39 • · ·· · · ·· ·· ···· • * · ···· ·· · • ···· · ··· · · ·
    -151SEKV. ID. č. 2, aminokyselin 55 - 61 SEKV. ID. č. 2, aminokyselin 94 - 102 SEKV. ID. Č. 2.
    139. Isolovaný polypeptid obsahující aminokyseliny 24 - 39 SEKV. ID. Č. 2, aminokyseliny 55 - 61 SEKV. ID. Č. 2 a aminokyseliny 94 - 102 SEKV. ID. Č. 2.
    140. Isolovaný polypeptid obsahující fragment SEKV. ID.
    Č. 4 vybraný ze skupiny sestávající z aminokyselin 31 - 37 SEKV. ID. č. 4, aminokyselin 52 - 67 SEKV. ID. č. 4, aminokyselin 100 - 112 SEKV. ID. č. 4.
    141, Isolovaný SEKV. ID. e. aminokyseliny polypeptid obsahující aminokyseliny 31 - 37 4, aminokyseliny 52 - 67 100 - 112 SEKV. ID. Č. 4. SEKV. ID. Č. 4 a 142, isolovaný polypeptid obsahující aminokyseli novou sekvenci SEKV . ID. č. 14. 143. Isolovaný polypeptid obsahující ami nokyseli novou sekvenci sekv . ID. Č. 16. 144. Variant polypeptidu obsahujícího ami nokyseli novou
    sekvenci SEKV. ID. č. 14 obsahující přinejmenším jednu konservativní aminokyselinovou substituci, přičemž si zachovává schopnost směrovat specifickou vazbu k beta amyloidnímu peptidu (Αβ) s vazebnou afinitou přinejmenším 10'7 M.
    145. Variant polypeptidu obsahujícího aminokyselinovou sekvenci SEKV. ID. č. 16 obsahující přinejmenším jednu konservativní aminokyselinovou substituci, přičemž si zachovává schopnost směrovat specifickou vazbu k beta amyloidnímu peptidu (Αβ) s vazebnou afinitou přinejmenším ΙΟ'7 M.
    146. Isolovaný polypeptid obsahující aminokyseliny 1 - 112 aminokyselinové sekvence SEKV. ID. Č. 14, nebo • · • « « · · ·
    -152aminokyseliny 1 - 123 aminokyselinové sekvence SEKV. ID. Č. 16.
    147. Isolovaná molekula nukleové kyseliny kódující lehký řetězec podle kteréhokoli z Nároků 84, 86-88, 92, 94 a 96 - 98.
    148. Isolovaná molekula nukleové kyseliny kódující těžký řetězec podle kteréhokoli z Nároků 85, 89 - 91, 93 a 99 101.
    149. isolovaná molekula nukleové kyseliny kódující polypeptid podle kteréhokoli z Nároků 139 - 146.
    150. Isolovaná molekula nukleové kyseliny kódující imunoglobulin podle kteréhokoli z Nároků 114 - 132.
    151. Isolovaná molekula nukleové kyseliny obsahující nukleotidovou sekvenci SEKV. ID. Č. 13 nebo 15.
    152. Vektor obsahující molekulu nukleové kyseliny podle kteréhokoli z Nároků 147 - 151.
    153. Hostitelská buňka obsahující molekulu nukleové kyseliny podle kteréhokoli z Nároků 147 - 151.
    154. způsob produkce protilátky nebo jejího fragmentu vyznačující se tím, že způsob zahrnuje kultivaci hostitelských buněk podle Nároku 153 za takových podmínek, že takováto protilátka nebo fragment jsou produkovány, a isolaci řečené protilátky z hostitelské buňky nebo z kultury.
    155. Způsob produkce protilátky nebo jejího fragmentu vyznačující se tím, že způsob zahrnuje kultivaci hostitelských buněk, jež exprimují molekulu nukleové kyseliny kódující řečené protilátky nebo fragmenty za takových podmínek, že takováto protilátka • · • · · · · · ··· v • · · ··· ·· ··· • · · · · ·· · ·
    -153- ........
    nebo fragment jsou produkovány, a isolaci řečené protilátky nebo fragmentu z hostitelské buňky nebo z kultury, přičemž řečená protilátka nebo fragment obsahuje aminokyseliny 24 - 39 SEKV. id. Č. 2, aminokyseliny 55 - 61 SEKV. ID. Č. 2 a aminokyseliny 94 102 SEKV. ID. Č. 2.
    156. Způsob produkce protilátky nebo jejího fragmentu vyznačující se tím, že způsob zahrnuje kultivací hostitelských buněk, jež exprimují molekulu nukleové kyseliny kódující řečené protilátky nebo fragmenty za takových podmínek, že takováto protilátka nebo fragment jsou produkovány, a isolaci řečené protilátky nebo fragmentu z hostitelské buňky nebo z kultury, přičemž řečená protilátka nebo fragment obsahuje aminokyseliny 31 - 37 sekv. id. č. 4, aminokyseliny 52 - 67 SEKV. ID. Č. 4a aminokyseliny 100 112 SEKV. ID. Č. 4.
    157. způsob identifikace zbytků podléhajících substituci ve variabilní oblasti humanizované rámcové soustavy imunoglobulinu 10D5, vyznačující se tím, že způsob zahrnuje modelování trojrozměrné struktury 10D5 variabilní oblasti založené na vyřešené imunoglobulinové struktuře a analýzu řečeného modelu co do zbytků, jež mohou ovlivnit konformaci nebo funkci variabilní oblasti imunoglobulinu 3D6 tak, že jsou identifikovány zbytky podléhajících substituci.
    158. Použití sekvencí variabilních oblastí načrtnutých jako SEKV. ID. č. 14 a SEKV. ID. Č. 16, nebo jakékoli jejich části, k produkci trojrozměrného obrazu imunoglobulinu 10D5, řetězce imunoglobulinu 10D5, nebo jejich domén.
CZ20031601A 2000-12-06 2001-12-06 Humanizované protilátky rozeznávající beta-amyloidní peptid CZ20031601A3 (cs)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US25189200P 2000-12-06 2000-12-06

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CZ20031601A3 true CZ20031601A3 (cs) 2003-12-17

Family

ID=22953834

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ20031601A CZ20031601A3 (cs) 2000-12-06 2001-12-06 Humanizované protilátky rozeznávající beta-amyloidní peptid

Country Status (39)

Country Link
US (2) US7189819B2 (cs)
EP (2) EP2045267A3 (cs)
JP (6) JP4166569B2 (cs)
KR (2) KR20070004139A (cs)
CN (4) CN100448893C (cs)
AR (1) AR035402A1 (cs)
AT (1) ATE414719T1 (cs)
AU (2) AU2592102A (cs)
BG (1) BG66292B1 (cs)
BR (1) BR0115978A (cs)
CA (1) CA2430772C (cs)
CY (1) CY1108740T1 (cs)
CZ (1) CZ20031601A3 (cs)
DE (1) DE60136651D1 (cs)
DK (1) DK1358213T3 (cs)
EA (2) EA010469B1 (cs)
EC (1) ECSP034685A (cs)
EE (1) EE05309B1 (cs)
ES (1) ES2317953T3 (cs)
GE (1) GEP20084339B (cs)
HK (1) HK1070904A1 (cs)
HR (1) HRP20030547A8 (cs)
HU (1) HU229681B1 (cs)
IL (2) IL156030A0 (cs)
IS (1) IS2620B (cs)
MX (1) MXPA03005048A (cs)
MY (2) MY162171A (cs)
NO (1) NO339290B1 (cs)
NZ (3) NZ546621A (cs)
PE (1) PE20020574A1 (cs)
PL (1) PL211761B1 (cs)
PT (1) PT1358213E (cs)
SI (1) SI1358213T1 (cs)
SK (1) SK288209B6 (cs)
TW (1) TWI255272B (cs)
UA (1) UA87093C2 (cs)
UY (1) UY27062A1 (cs)
WO (1) WO2002046237A2 (cs)
ZA (1) ZA200305169B (cs)

Families Citing this family (188)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7179892B2 (en) * 2000-12-06 2007-02-20 Neuralab Limited Humanized antibodies that recognize beta amyloid peptide
US20080050367A1 (en) * 1998-04-07 2008-02-28 Guriq Basi Humanized antibodies that recognize beta amyloid peptide
US6913745B1 (en) * 1997-12-02 2005-07-05 Neuralab Limited Passive immunization of Alzheimer's disease
US6787523B1 (en) 1997-12-02 2004-09-07 Neuralab Limited Prevention and treatment of amyloidogenic disease
US6743427B1 (en) 1997-12-02 2004-06-01 Neuralab Limited Prevention and treatment of amyloidogenic disease
US7964192B1 (en) 1997-12-02 2011-06-21 Janssen Alzheimer Immunotherapy Prevention and treatment of amyloidgenic disease
TWI239847B (en) * 1997-12-02 2005-09-21 Elan Pharm Inc N-terminal fragment of Abeta peptide and an adjuvant for preventing and treating amyloidogenic disease
US6761888B1 (en) * 2000-05-26 2004-07-13 Neuralab Limited Passive immunization treatment of Alzheimer's disease
US7790856B2 (en) * 1998-04-07 2010-09-07 Janssen Alzheimer Immunotherapy Humanized antibodies that recognize beta amyloid peptide
US20050059802A1 (en) * 1998-04-07 2005-03-17 Neuralab Ltd Prevention and treatment of amyloidogenic disease
US20030147882A1 (en) * 1998-05-21 2003-08-07 Alan Solomon Methods for amyloid removal using anti-amyloid antibodies
IL151378A0 (en) 2000-02-24 2003-04-10 Univ Washington Humanized antibodies that sequester amyloid beta peptide
PE20020574A1 (es) * 2000-12-06 2002-07-02 Wyeth Corp Anticuerpos humanizados que reconocen el peptido amiloideo beta
US7700751B2 (en) 2000-12-06 2010-04-20 Janssen Alzheimer Immunotherapy Humanized antibodies that recognize β-amyloid peptide
ES2437875T3 (es) 2001-04-30 2014-01-14 Eli Lilly And Company Anticuerpos humanizados que reconocen el péptido beta-amiloide
ES2312569T3 (es) 2001-04-30 2009-03-01 Eli Lilly And Company Anticuerpos humanizados.
WO2003014162A1 (en) † 2001-08-03 2003-02-20 Medical & Biological Laboratories Co., Ltd. ANTIBODY RECOGNIZING GM1 GANGLIOSIDE-BOUND AMYLOID β-PROTEIN AND DNA ENCODING THE ANTIBODY
JP2005500389A (ja) * 2001-08-17 2005-01-06 イーライ・リリー・アンド・カンパニー Ａβに関連する病態および疾患を治療するための、可溶性Ａβに高い親和性を有する抗体の使用
AU2002329775C1 (en) 2001-08-17 2011-04-07 Eli Lilly And Company Assay method for alzheimer's disease
US7521053B2 (en) 2001-10-11 2009-04-21 Amgen Inc. Angiopoietin-2 specific binding agents
US7658924B2 (en) 2001-10-11 2010-02-09 Amgen Inc. Angiopoietin-2 specific binding agents
AR038568A1 (es) 2002-02-20 2005-01-19 Hoffmann La Roche Anticuerpos anti-a beta y su uso
MY139983A (en) * 2002-03-12 2009-11-30 Janssen Alzheimer Immunotherap Humanized antibodies that recognize beta amyloid peptide
GB2392792B (en) * 2002-09-07 2004-12-15 Matsushita Electric Ind Co Ltd Improvements to television and radio programme control
TW200509968A (en) * 2002-11-01 2005-03-16 Elan Pharm Inc Prevention and treatment of synucleinopathic disease
US20080014194A1 (en) * 2003-10-31 2008-01-17 Elan Pharmaceuticals, Inc. Prevention and Treatment of Synucleinopathic and Amyloidogenic Disease
US9034337B2 (en) * 2003-10-31 2015-05-19 Prothena Biosciences Limited Treatment and delay of outset of synucleinopathic and amyloidogenic disease
US8506959B2 (en) * 2002-11-01 2013-08-13 Neotope Biosciences Limited Prevention and treatment of synucleinopathic and amyloidogenic disease
US8697082B2 (en) * 2002-11-01 2014-04-15 Neotope Biosciences Limited Prevention and treatment of synucleinopathic and amyloidogenic disease
GB0300571D0 (en) * 2003-01-10 2003-02-12 Imp College Innovations Ltd Modification of feeding behaviour
DE10303974A1 (de) 2003-01-31 2004-08-05 Abbott Gmbh & Co. Kg Amyloid-β(1-42)-Oligomere, Verfahren zu deren Herstellung und deren Verwendung
JP2006516639A (ja) * 2003-02-01 2006-07-06 ニユーララブ・リミテツド 可溶性Ａ−βに対する抗体を生成させるための能動免疫
EP1596809B1 (en) 2003-02-10 2010-05-26 Applied Molecular Evolution, Inc. Abeta binding molecules
WO2005028511A2 (en) * 2003-03-28 2005-03-31 Centocor, Inc. Anti-amyloid antibodies, compositions, methods and uses
US7732162B2 (en) 2003-05-05 2010-06-08 Probiodrug Ag Inhibitors of glutaminyl cyclase for treating neurodegenerative diseases
US7358331B2 (en) * 2003-05-19 2008-04-15 Elan Pharmaceuticals, Inc. Truncated fragments of alpha-synuclein in Lewy body disease
EP1480041A1 (en) * 2003-05-22 2004-11-24 Innogenetics N.V. Method for the prediction, diagnosis and differential diagnosis of Alzheimer's disease
PE20050627A1 (es) * 2003-05-30 2005-08-10 Wyeth Corp Anticuerpos humanizados que reconocen el peptido beta amiloideo
CN1898266B (zh) * 2003-10-27 2011-09-21 惠氏公司 使用羟磷灰石层析除去高分子量聚集体
US7674599B2 (en) 2003-11-08 2010-03-09 Elan Pharmaceuticals, Inc. Methods of using antibodies to detect alpha-synuclein in fluid samples
PE20050925A1 (es) * 2003-11-10 2005-11-29 Schering Corp Anticuerpo recombinante humanizado anti-interleuquina 10
WO2005082939A2 (en) 2004-02-23 2005-09-09 Eli Lilly And Company Anti-abeta antibody
US20050225165A1 (en) * 2004-04-13 2005-10-13 Naik Sanjeev M Brake by-wire control system
AT500483B1 (de) * 2004-07-13 2006-01-15 Mattner Frank Dr Set zur vorbeugung oder behandlung der alzheimer'schen erkrankung
KR20070040824A (ko) * 2004-07-30 2007-04-17 리나트 뉴로사이언스 코퍼레이션 아밀로이드-베타 펩티드에 대해 지시된 항체 및 이의 사용방법
MX2007001679A (es) 2004-08-09 2007-05-23 Elan Pharm Inc Prevencion y tratamiento de la enfermedad sinucleinopatica y amiloidogenica.
US7300773B2 (en) 2004-08-27 2007-11-27 Wyeth Research Ireland Limited Production of TNFR-Ig
US7335491B2 (en) * 2004-08-27 2008-02-26 Wyeth Research Ireland Limited Production of anti-abeta
TWI384069B (zh) 2004-08-27 2013-02-01 Pfizer Ireland Pharmaceuticals 多胜肽之製法
MX2007003906A (es) * 2004-10-05 2007-05-21 Wyeth Corp Metodos y composiciones para mejorar la produccion de proteinas recombinantes.
WO2006066049A2 (en) * 2004-12-15 2006-06-22 Neuralab Limited Humanized antibodies that recognize beta amyloid peptide
PE20061329A1 (es) * 2004-12-15 2006-12-08 Neuralab Ltd Anticuerpos ab humanizados para mejorar la cognicion
JP2008524247A (ja) * 2004-12-15 2008-07-10 エラン ファーマ インターナショナル リミテッド 認知の改善における使用のためのアミロイドβ抗体
WO2006081171A1 (en) 2005-01-24 2006-08-03 Amgen Inc. Humanized anti-amyloid antibody
GT200600031A (es) 2005-01-28 2006-08-29 Formulacion anticuerpo anti a beta
JP2008528638A (ja) * 2005-01-28 2008-07-31 ワイス ポリペプチドの安定化液体処方
UY29504A1 (es) 2005-04-29 2006-10-31 Rinat Neuroscience Corp Anticuerpos dirigidos contra el péptido amiloide beta y métodos que utilizan los mismos.
AU2006259298B2 (en) * 2005-06-17 2012-06-14 Wyeth Llc Methods of purifying Fc region containing proteins
US9133267B2 (en) * 2005-11-22 2015-09-15 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Antibody treatment of Alzheimer's and related diseases
CN117903302A (zh) 2005-11-30 2024-04-19 Abbvie 公司 抗-Aβ球聚体抗体，其相关产品，生产所述抗体的方法，所述抗体的应用以及使用方法
PL1976877T5 (pl) 2005-11-30 2017-09-29 Abbvie Inc Przeciwciała monoklonalne przeciwko białku amyloidu beta oraz ich zastosowania
RU2551782C2 (ru) 2005-12-12 2015-05-27 Ац Иммуне Са Специфические в отношении амилоида бета (а бета) 1-42 моноклональные антитела, обладающие терапевтическими свойствами
KR101401159B1 (ko) 2005-12-12 2014-05-29 에프. 호프만-라 로슈 아게 가변 부위에 글리코실화를 가지는 아밀로이드 베타에 대한 항체
US8784810B2 (en) 2006-04-18 2014-07-22 Janssen Alzheimer Immunotherapy Treatment of amyloidogenic diseases
JP2009538924A (ja) * 2006-06-01 2009-11-12 エラン ファーマシューティカルズ，インコーポレイテッド Ａｐｐの神経活性断片
WO2008011348A2 (en) * 2006-07-14 2008-01-24 Ac Immune S.A. Humanized antibody against amyloid beta
RU2009111138A (ru) * 2006-10-12 2010-11-20 Вайет (Us) Способы и композиции с уменьшенной опалесценцией
US8188046B2 (en) 2006-10-16 2012-05-29 University Of South Florida Amyloid beta peptides and methods of use
US8455626B2 (en) 2006-11-30 2013-06-04 Abbott Laboratories Aβ conformer selective anti-aβ globulomer monoclonal antibodies
IL199534A (en) 2007-01-05 2013-01-31 Univ Zuerich An isolated human antibody capable of detecting a neoepitope in a disease-related protein, a polynucleotide encoding an antibody, a vector containing the polynucleotide, a host cell containing the polynucleotide or vector, a preparation containing the antibody and related methods and uses.
CA2764852C (en) 2007-01-05 2018-09-18 University Of Zurich Method of providing disease-specific binding molecules and targets
KR101160385B1 (ko) 2007-01-18 2012-07-10 일라이 릴리 앤드 캄파니 페길화된 Ａβ ＦＡＢ
US8147833B2 (en) * 2007-02-23 2012-04-03 Neotope Biosciences Limited Prevention and treatment of synucleinopathic and amyloidogenic disease
PT3067066T (pt) 2007-02-23 2019-06-17 Univ California Prevenção e tratamento da doença sinucleinopática e amiloidogénica
PL2118300T3 (pl) * 2007-02-23 2015-11-30 Prothena Biosciences Ltd Zapobieganie i leczenie synukleinopatii i amyloidozy
EP2486928A1 (en) 2007-02-27 2012-08-15 Abbott GmbH & Co. KG Method for the treatment of amyloidoses
WO2008106657A2 (en) * 2007-03-01 2008-09-04 Intezyne Technologies, Inc. Encapsulated amyloid-beta peptides
MX2009009234A (es) 2007-03-01 2009-12-01 Probiodrug Ag Uso nuevo de inhibidores de ciclasa de glutaminilo.
CA2684323A1 (en) * 2007-04-18 2008-10-30 Janssen Alzheimer Immunotherapy Prevention and treatment of cerebral amyloid angiopathy
EP2865670B1 (en) 2007-04-18 2017-01-11 Probiodrug AG Thiourea derivatives as glutaminyl cyclase inhibitors
US8003097B2 (en) 2007-04-18 2011-08-23 Janssen Alzheimer Immunotherapy Treatment of cerebral amyloid angiopathy
US7931899B2 (en) 2007-05-14 2011-04-26 Medtronic, Inc Humanized anti-amyloid beta antibodies
EP2152309B1 (en) 2007-05-14 2013-07-10 Medtronic, Inc. Methods and device to neutralize soluble toxic agents in the brain
US8323654B2 (en) * 2007-05-14 2012-12-04 Medtronic, Inc. Anti-amyloid beta antibodies conjugated to sialic acid-containing molecules
WO2008146854A1 (ja) * 2007-05-28 2008-12-04 National Institute Of Advanced Industrial Science And Technology 抗モータリン抗体のパラトープ及びエピトープ
JP5142265B2 (ja) 2007-05-28 2013-02-13 独立行政法人産業技術総合研究所 抗モータリン抗体のパラトープ及びエピトープ
TW201518320A (zh) * 2007-06-12 2015-05-16 Ac Immune Sa 特異性結合β-類澱粉蛋白之抗體及相關核酸分子、表現載體、細胞、組合物、套組、方法及用途
US8613923B2 (en) * 2007-06-12 2013-12-24 Ac Immune S.A. Monoclonal antibody
US8048420B2 (en) 2007-06-12 2011-11-01 Ac Immune S.A. Monoclonal antibody
WO2009002562A2 (en) 2007-06-27 2008-12-31 Marine Polymer Technologies, Inc. Complexes of il-15 and il-15ralpha and uses thereof
PL2182983T3 (pl) 2007-07-27 2014-10-31 Janssen Alzheimer Immunotherap Leczenie chorób amyloidowych z wykorzystaniem humanizowanych przeciwciał specyficznych względem Abeta
GB0718737D0 (en) * 2007-09-25 2007-11-07 Glaxo Group Ltd Antibodies
EP2586795B1 (en) * 2007-10-05 2018-05-16 Genentech, Inc. Use of anti-amyloid beta antibody in ocular diseases
JO3076B1 (ar) 2007-10-17 2017-03-15 Janssen Alzheimer Immunotherap نظم العلاج المناعي المعتمد على حالة apoe
US8445649B2 (en) 2007-10-29 2013-05-21 Tao Health Life Pharma Co., Ltd. Antibody and use thereof
NZ583632A (en) 2007-11-16 2012-05-25 Univ Rockefeller Antibodies specific for the protofibril form of beta-amyloid protein
WO2009070648A2 (en) * 2007-11-27 2009-06-04 Medtronic, Inc. Humanized anti-amyloid beta antibodies
WO2009079566A2 (en) 2007-12-18 2009-06-25 Acumen Pharmaceuticals, Inc. Novel addl receptor polypeptides, polynucleotides and host cells for recombinant production
US8414893B2 (en) * 2007-12-21 2013-04-09 Amgen Inc. Anti-amyloid antibodies and uses thereof
AU2015249034B2 (en) * 2007-12-28 2017-07-27 Prothena Biosciences Limited Treatment and prophylaxis of amyloidosis
JO2913B1 (en) 2008-02-20 2015-09-15 امجين إنك, Antibodies directed towards angiopoietin-1 and angiopoietin-2 proteins and their uses
AR072001A1 (es) 2008-06-03 2010-07-28 Abbott Lab Inmunoglobulina con dominio variable dual y usos de la misma
MX2011000875A (es) * 2008-07-21 2011-04-05 Probiodrug Ag Ensayo de anticuerpo de diagnostico.
US9067981B1 (en) 2008-10-30 2015-06-30 Janssen Sciences Ireland Uc Hybrid amyloid-beta antibodies
ES2699434T3 (es) * 2008-10-31 2019-02-11 Wyeth Llc Purificación de proteínas ácidas utilizando cromatografía de hidroxiapatita cerámica
US20110313134A1 (en) * 2008-11-06 2011-12-22 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Engineered antibodies with reduced immunogenicity and methods of making
SI2370466T1 (sl) 2008-12-19 2015-11-30 Biogen International Neuroscience Gmbh Človeška avtoprotitelesa proti alfa-sinukleinu
US8614297B2 (en) * 2008-12-22 2013-12-24 Hoffmann-La Roche Inc. Anti-idiotype antibody against an antibody against the amyloid β peptide
WO2010120561A1 (en) * 2009-04-01 2010-10-21 Genentech, Inc. Anti-fcrh5 antibodies and immunoconjugates and methods of use
FR2945538B1 (fr) 2009-05-12 2014-12-26 Sanofi Aventis Anticorps humanises specifiques de la forme protofibrillaire du peptide beta-amyloide.
EP3381937A3 (en) 2009-08-13 2018-10-31 The Johns Hopkins University Methods of modulating immune function
GB0914691D0 (en) * 2009-08-21 2009-09-30 Lonza Biologics Plc Immunoglobulin variants
ES2548913T3 (es) 2009-09-11 2015-10-21 Probiodrug Ag Derivados heterocíclicos como inhibidores de glutaminil ciclasa
NZ623607A (en) 2009-10-23 2016-07-29 Millennium Pharm Inc Anti-gcc antibody molecules and related compositions and methods
TWI509246B (zh) 2009-12-11 2015-11-21 Araclon Biotech Sl 用於改良偵測澱粉樣β肽類之方法與試劑
CN102781962B (zh) 2010-03-03 2014-12-10 阿布林克斯公司 双互补位A-β结合多肽
ES2586231T3 (es) 2010-03-03 2016-10-13 Probiodrug Ag Inhibidores de glutaminil ciclasa
AU2011226074B2 (en) 2010-03-10 2015-01-22 Vivoryon Therapeutics N.V. Heterocyclic inhibitors of glutaminyl cyclase (QC, EC 2.3.2.5)
CA2796339C (en) 2010-04-15 2020-03-31 Abbott Laboratories Amyloid-beta binding proteins
EP2560953B1 (en) 2010-04-21 2016-01-06 Probiodrug AG Inhibitors of glutaminyl cyclase
CN103179981B (zh) 2010-07-30 2017-02-08 Ac免疫有限公司 安全和功能性的人源化抗β‑淀粉样蛋白抗体
NZ707327A (en) 2010-08-02 2017-01-27 Regeneron Pharma Mice that make binding proteins comprising vl domains
AR082461A1 (es) 2010-08-03 2012-12-12 Abbott Lab Inmunoglobulinas con dominio variable dual y usos de las mismas
CA2808187A1 (en) 2010-08-14 2012-02-23 Abbvie Inc. Amyloid-beta binding proteins
KR20130139884A (ko) 2010-08-26 2013-12-23 애브비 인코포레이티드 이원 가변 도메인 면역글로불린 및 이의 용도
DE12192727T1 (de) 2011-02-25 2013-07-11 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. ADAM6 Mäuse
US8530670B2 (en) 2011-03-16 2013-09-10 Probiodrug Ag Inhibitors
EP2511296A1 (en) 2011-04-12 2012-10-17 Araclón Biotech, S. L. Antibody, kit and method for determination of amyloid peptides
DK2723379T3 (en) 2011-06-23 2018-10-15 Biogen Int Neuroscience Gmbh ANTI-ALPHA SYNUCLEIN BINDING MOLECULES
PT3572517T (pt) 2011-08-05 2021-06-23 Regeneron Pharma Murganhos da cadeia leve universal humanizada
JP2012034697A (ja) * 2011-09-16 2012-02-23 Janssen Alzheimer Immunotherapy βアミロイドペプチドを認識するヒト化抗体
PL2627773T3 (pl) 2011-10-17 2017-11-30 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Ograniczony łańcuch ciężki immonoglobuliny pochodzącej od myszy
PE20141568A1 (es) * 2011-10-28 2014-11-21 Neotope Biosciences Ltd Anticuerpos humanizados que reconocen la alfa-sinucleina
SI2793567T1 (sl) 2011-12-20 2019-05-31 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Humanizirane lahkoverižne miši
CA2861610A1 (en) 2011-12-30 2013-07-04 Abbvie Inc. Dual specific binding proteins directed against il-13 and/or il-17
SG11201406347TA (en) 2012-04-05 2014-11-27 Ac Immune Sa Humanized tau antibody
SG11201406855TA (en) 2012-04-27 2014-11-27 Millennium Pharm Inc Anti-gcc antibody molecules and use of same to test for susceptibility to gcc-targeted therapy
ME03551B (me) 2012-06-12 2020-07-20 Regeneron Pharma Humanizovane nehumane živoтinje sa ograničenim lokusima imunoglobulinskog тeškog lanca
CN105579061A (zh) * 2012-07-03 2016-05-11 杨森阿尔茨海默氏症免疫治疗公司 C端和中央表位的Aβ抗体
UA118441C2 (uk) 2012-10-08 2019-01-25 Протена Біосаєнсиз Лімітед Антитіло, що розпізнає альфа-синуклеїн
KR20210111353A (ko) 2012-11-01 2021-09-10 애브비 인코포레이티드 항-ｖｅｇｆ／ｄｌｌ4 이원 가변 도메인 면역글로불린 및 이의 용도
WO2014130690A1 (en) 2013-02-20 2014-08-28 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals with modified immunoglobulin heavy chain sequences
JP2016522793A (ja) 2013-03-15 2016-08-04 アッヴィ・インコーポレイテッド ＩＬ−１βおよび／またはＩＬ−１７に対して指向された二重特異的結合タンパク質
SG11201509566RA (en) 2013-05-20 2015-12-30 Genentech Inc Anti-transferrin receptor antibodies and methods of use
AR096687A1 (es) 2013-06-24 2016-01-27 Genentech Inc Anticuerpos anti-fcrh5
WO2015004633A1 (en) 2013-07-12 2015-01-15 Neotope Biosciences Limited Antibodies that recognize islet-amyloid polypeptide (iapp)
US9850302B2 (en) 2013-07-12 2017-12-26 Prothena Biosciences Limited Antibodies that recognize IAPP
BR122021025087B1 (pt) 2013-12-17 2023-04-04 Genentech, Inc Anticorpo anti-cd3, célula hospedeira procariótica, método de produção do anticorpo biespecífico, imunoconjugado, composição, uso do anticorpo biespecífico e kit
KR20160131082A (ko) 2014-03-12 2016-11-15 프로테나 바이오사이언시즈 리미티드 Lg1-3에 특이적인 항-라미닌4 항체
WO2015136472A1 (en) 2014-03-12 2015-09-17 Prothena Biosciences Limited Anti-laminin4 antibodies specific for lg4-5
SG10201808083VA (en) 2014-03-21 2018-10-30 Regeneron Pharma Vl antigen binding proteins exhibiting distinct binding characteristics
CN106255410B (zh) 2014-03-21 2020-01-10 瑞泽恩制药公司 产生单结构域结合蛋白的非人动物
WO2015155694A1 (en) 2014-04-08 2015-10-15 Prothena Biosciences Limited Blood-brain barrier shuttles containing antibodies recognizing alpha-synuclein
WO2015165961A1 (en) 2014-04-29 2015-11-05 Affiris Ag Treatment and prevention of alzheimer's disease (ad)
WO2015191934A2 (en) 2014-06-11 2015-12-17 Abbvie Inc. Blood-brain barrier (bbb) penetrating dual specific binding proteins for treating brain and neurological diseases
CN107001473B (zh) 2014-11-19 2021-07-09 豪夫迈·罗氏有限公司 抗-运铁蛋白受体抗体及使用方法
EP3221361B1 (en) 2014-11-19 2021-04-21 Genentech, Inc. Anti-transferrin receptor / anti-bace1 multispecific antibodies and methods of use
MA41115A (fr) 2014-12-02 2017-10-10 Biogen Int Neuroscience Gmbh Procédé de traitement de la maladie d'alzheimer
AU2015360579A1 (en) 2014-12-10 2017-05-18 Genentech, Inc. Blood brain barrier receptor antibodies and methods of use
WO2016094881A2 (en) 2014-12-11 2016-06-16 Abbvie Inc. Lrp-8 binding proteins
TWI786505B (zh) 2015-01-28 2022-12-11 愛爾蘭商普羅佘納生物科技有限公司 抗甲狀腺素運送蛋白抗體
TWI781507B (zh) 2015-01-28 2022-10-21 愛爾蘭商普羅佘納生物科技有限公司 抗甲狀腺素運送蛋白抗體
TWI711631B (zh) 2015-01-28 2020-12-01 愛爾蘭商普羅佘納生物科技有限公司 抗甲狀腺素運送蛋白抗體
CA2979702A1 (en) 2015-03-19 2016-09-22 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals that select for light chain variable regions that bind antigen
US20160314288A1 (en) * 2015-04-22 2016-10-27 Qualcomm Incorporated Method and apparatus for write restricted storage
TW201710286A (zh) 2015-06-15 2017-03-16 艾伯維有限公司 抗ｖｅｇｆ、ｐｄｇｆ及／或其受體之結合蛋白
AU2016280102B2 (en) 2015-06-16 2022-06-16 Genentech, Inc. Humanized and affinity matured antibodies to FcRH5 and methods of use
BR112017024610A2 (pt) 2015-06-24 2018-07-31 F. Hoffmann-La Roche Ag anticorpos para receptor antitransferrina com afinidade especificada
RU2753390C1 (ru) 2015-10-02 2021-08-13 Ф. Хоффманн-Ля Рош Аг Биспецифические антитела к человеческому cd20/человеческому рецептору трансферрина и способы их применения
AR106189A1 (es) 2015-10-02 2017-12-20 Hoffmann La Roche ANTICUERPOS BIESPECÍFICOS CONTRA EL A-b HUMANO Y EL RECEPTOR DE TRANSFERRINA HUMANO Y MÉTODOS DE USO
JP7452829B2 (ja) * 2015-11-09 2024-03-19 ザ・ユニバーシティ・オブ・ブリティッシュ・コロンビア アミロイドベータのエピトープおよびそれに対する抗体
KR20180088828A (ko) 2015-11-09 2018-08-07 더 유니버시티 오브 브리티쉬 콜롬비아 아밀로이드 베타에서의 n-말단 에피토프 및 이에 형태적으로-선택적인 항체
CN108350052A (zh) 2015-11-09 2018-07-31 英属哥伦比亚大学 淀粉样蛋白β中间区域中的表位及其构象选择性抗体
EP3452508A1 (en) 2016-05-02 2019-03-13 Prothena Biosciences Limited Antibodies recognizing tau
CA3022765A1 (en) 2016-05-02 2017-11-09 Prothena Biosciences Limited Antibodies recognizing tau
WO2018007922A2 (en) 2016-07-02 2018-01-11 Prothena Biosciences Limited Anti-transthyretin antibodies
WO2018007924A2 (en) 2016-07-02 2018-01-11 Prothena Biosciences Limited Anti-transthyretin antibodies
JP7016470B2 (ja) 2016-07-02 2022-02-07 プロセナ バイオサイエンシーズ リミテッド 抗トランスサイレチン抗体
US20180125920A1 (en) 2016-11-09 2018-05-10 The University Of British Columbia Methods for preventing and treating A-beta oligomer-associated and/or -induced diseases and conditions
KR20200030029A (ko) 2017-05-02 2020-03-19 프로테나 바이오사이언시즈 리미티드 타우 인식 항체
CA3073066A1 (en) 2017-08-22 2019-02-28 Biogen Ma Inc. Pharmaceutical compositions containing anti-beta amyloid antibodies
DK3461819T3 (da) 2017-09-29 2020-08-10 Probiodrug Ag Inhibitorer af glutaminylcyklase
US20220031867A1 (en) 2018-10-04 2022-02-03 University Of Rochester Glymphatic delivery by manipulating plasma osmolarity
TW202035442A (zh) 2018-12-20 2020-10-01 美商建南德克公司 經修飾之抗體Fc及其使用方法
PE20212324A1 (es) 2019-03-03 2021-12-14 Prothena Biosciences Ltd Anticuerpos que reconocen tau
TW202216760A (zh) 2020-07-23 2022-05-01 愛爾蘭商歐薩爾普羅席納有限公司 抗類澱粉β (ABETA)抗體
TW202300517A (zh) 2021-03-12 2023-01-01 美商美國禮來大藥廠 抗類澱粉β抗體及其用途
WO2022251048A1 (en) 2021-05-24 2022-12-01 Eli Lilly And Company Anti-amyloid beta antibodies and uses thereof

Family Cites Families (193)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4704362A (en) 1977-11-08 1987-11-03 Genentech, Inc. Recombinant cloning vehicle microbial polypeptide expression
CH652145A5 (de) 1982-01-22 1985-10-31 Sandoz Ag Verfahren zur in vitro-herstellung von hybridomen welche humane monoklonale antikoerper erzeugen.
JPS58210302A (ja) * 1982-05-31 1983-12-07 Ngk Insulators Ltd セラミツクロ−タ−
GB8308235D0 (en) 1983-03-25 1983-05-05 Celltech Ltd Polypeptides
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4634666A (en) 1984-01-06 1987-01-06 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Human-murine hybridoma fusion partner
US5208036A (en) 1985-01-07 1993-05-04 Syntex (U.S.A.) Inc. N-(ω, (ω-1)-dialkyloxy)- and N-(ω, (ω-1)-dialkenyloxy)-alk-1-yl-N,N,N-tetrasubstituted ammonium lipids and uses therefor
US4666829A (en) 1985-05-15 1987-05-19 University Of California Polypeptide marker for Alzheimer's disease and its use for diagnosis
US5618920A (en) 1985-11-01 1997-04-08 Xoma Corporation Modular assembly of antibody genes, antibodies prepared thereby and use
JPS63501765A (ja) 1985-11-01 1988-07-21 インタ−ナショナル、ジェネティック、エンジニアリング　インコ−ポレ−テッド 抗体遺伝子のモジュ−ル組立体、それにより産生された抗体及び用途
US4713366A (en) 1985-12-04 1987-12-15 The Ohio State University Research Foundation Antigenic modification of polypeptides
US5096706A (en) 1986-03-25 1992-03-17 National Research Development Corporation Antigen-based treatment for adiposity
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
US6548640B1 (en) * 1986-03-27 2003-04-15 Btg International Limited Altered antibodies
US5278049A (en) 1986-06-03 1994-01-11 Incyte Pharmaceuticals, Inc. Recombinant molecule encoding human protease nexin
US5231170A (en) 1986-08-27 1993-07-27 Paul Averback Antibodies to dense microspheres
US5187153A (en) 1986-11-17 1993-02-16 Scios Nova Inc. Methods of treatment using Alzheimer's amyloid polypeptide derivatives
US5220013A (en) 1986-11-17 1993-06-15 Scios Nova Inc. DNA sequence useful for the detection of Alzheimer's disease
US5389677B1 (en) * 1986-12-23 1997-07-15 Tristrata Inc Method of treating wrinkles using glycalic acid
EP0832981A1 (en) 1987-02-17 1998-04-01 Pharming B.V. DNA sequences to target proteins to the mammary gland for efficient secretion
US4912206A (en) 1987-02-26 1990-03-27 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services CDNA clone encoding brain amyloid of alzheimer's disease
WO1988007089A1 (en) 1987-03-18 1988-09-22 Medical Research Council Altered antibodies
US4883666A (en) 1987-04-29 1989-11-28 Massachusetts Institute Of Technology Controlled drug delivery system for treatment of neural disorders
US5258498A (en) 1987-05-21 1993-11-02 Creative Biomolecules, Inc. Polypeptide linkers for production of biosynthetic proteins
US5245015A (en) 1991-04-26 1993-09-14 Tanox Biosystems, Inc. Monoclonal antibodies which neutralize HIV-1 through reaction with a conformational epitope in vitro
US5057540A (en) 1987-05-29 1991-10-15 Cambridge Biotech Corporation Saponin adjuvant
US5583112A (en) 1987-05-29 1996-12-10 Cambridge Biotech Corporation Saponin-antigen conjugates and the use thereof
US5571499A (en) 1987-06-24 1996-11-05 Autoimmune, Inc. Treatment of autoimmune diseases by aerosol administration of autoantigens
US5571500A (en) 1987-06-24 1996-11-05 Autoimmune, Inc. Treatment of autoimmune diseases through administration by inhalation of autoantigens
US5849298A (en) 1987-06-24 1998-12-15 Autoimmune Inc. Treatment of multiple sclerosis by oral administration of bovine myelin
US5869054A (en) 1987-06-24 1999-02-09 Autoimmune Inc. Treatment of multiple sclerosis by oral administration of autoantigens
US5641474A (en) 1987-06-24 1997-06-24 Autoimmune, Inc. Prevention of autoimmune diseases by aerosol administration of autoantigens
US5645820A (en) 1987-06-24 1997-07-08 Autoimmune, Inc. Treatment of autoimmune diseases by aerosol administration of autoantigens
US5004697A (en) 1987-08-17 1991-04-02 Univ. Of Ca Cationized antibodies for delivery through the blood-brain barrier
US5677425A (en) 1987-09-04 1997-10-14 Celltech Therapeutics Limited Recombinant antibody
US5231000A (en) 1987-10-08 1993-07-27 The Mclean Hospital Antibodies to A4 amyloid peptide
US5089603A (en) * 1989-06-21 1992-02-18 Tanox Biosystems, Inc. Antigenic epitopes present on membrane-bound but not secreted iga
US5576184A (en) 1988-09-06 1996-11-19 Xoma Corporation Production of chimeric mouse-human antibodies with specificity to human tumor antigens
IL162181A (en) 1988-12-28 2006-04-10 Pdl Biopharma Inc A method of producing humanized immunoglubulin, and polynucleotides encoding the same
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US5227159A (en) * 1989-01-31 1993-07-13 Miller Richard A Anti-idiotype antibodies reactive with shared idiotopes expressed by B cell lymphomas and autoantibodies
US5399346A (en) 1989-06-14 1995-03-21 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Gene therapy
US5633076A (en) 1989-12-01 1997-05-27 Pharming Bv Method of producing a transgenic bovine or transgenic bovine embryo
GB8928874D0 (en) * 1989-12-21 1990-02-28 Celltech Ltd Humanised antibodies
US5859205A (en) 1989-12-21 1999-01-12 Celltech Limited Humanised antibodies
EP1690935A3 (en) 1990-01-12 2008-07-30 Abgenix, Inc. Generation of xenogeneic antibodies
US5279833A (en) 1990-04-04 1994-01-18 Yale University Liposomal transfection of nucleic acids into animal cells
US5264618A (en) 1990-04-19 1993-11-23 Vical, Inc. Cationic lipids for intracellular delivery of biologically active molecules
EP0527823A1 (en) 1990-04-24 1993-02-24 The Regents Of The University Of California Purification, detection and methods of use of protease nexin-2
US5753624A (en) 1990-04-27 1998-05-19 Milkhaus Laboratory, Inc. Materials and methods for treatment of plaquing disease
EP0526511B1 (en) 1990-04-27 1997-05-28 MCMICHAEL, John Method and composition for treatment of central nervous systems disease states associated with abnormal amyloid beta protein
US5427908A (en) 1990-05-01 1995-06-27 Affymax Technologies N.V. Recombinant library screening methods
US5593970A (en) 1990-06-11 1997-01-14 Biochem Pharma Inc. Heterocyclic anthracycline analogs
ES2217250T3 (es) 1990-06-15 2004-11-01 Scios Inc. Mamifero transgenico, no humano que muestra la patologia de formacion amiloides de la enfermedad de alzheimer.
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
DK0585287T3 (da) 1990-07-10 2000-04-17 Cambridge Antibody Tech Fremgangsmåde til fremstilling af specifikke bindingsparelementer
US5780587A (en) 1990-08-24 1998-07-14 President And Fellows Of Harvard College Compounds and methods for inhibiting β-protein filament formation and neurotoxicity
US5661016A (en) 1990-08-29 1997-08-26 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5633425A (en) 1990-08-29 1997-05-27 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
WO1993012227A1 (en) 1991-12-17 1993-06-24 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5877397A (en) 1990-08-29 1999-03-02 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5770429A (en) 1990-08-29 1998-06-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5625126A (en) 1990-08-29 1997-04-29 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5814318A (en) 1990-08-29 1998-09-29 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5789650A (en) 1990-08-29 1998-08-04 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
DK0546073T3 (da) 1990-08-29 1998-02-02 Genpharm Int Frembringelse og anvendelse af transgene, ikke-humane dyr, der er i stand til at danne heterologe antistoffer
US5874299A (en) 1990-08-29 1999-02-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5702906A (en) 1990-09-25 1997-12-30 Genentech, Inc. Antibodies to neurotrophic factor-4 (NT-4)
ES2236682T5 (es) 1991-01-21 2011-03-31 Elan Pharmaceuticals, Inc. Ensayo y modelo para la enfermedad de alzheimer.
US5192753A (en) 1991-04-23 1993-03-09 Mcgeer Patrick L Anti-rheumatoid arthritic drugs in the treatment of dementia
US5858657A (en) 1992-05-15 1999-01-12 Medical Research Council Methods for producing members of specific binding pairs
US5871907A (en) 1991-05-15 1999-02-16 Medical Research Council Methods for producing members of specific binding pairs
DK0590058T3 (da) * 1991-06-14 2004-03-29 Genentech Inc Humaniseret heregulin-antistof
WO1994004679A1 (en) 1991-06-14 1994-03-03 Genentech, Inc. Method for making humanized antibodies
US5434050A (en) 1991-08-13 1995-07-18 Regents Of The University Of Minnesota Labelled β-amyloid peptide and methods of screening for Alzheimer's disease
US5283185A (en) 1991-08-28 1994-02-01 University Of Tennessee Research Corporation Method for delivering nucleic acids into cells
US5565332A (en) 1991-09-23 1996-10-15 Medical Research Council Production of chimeric antibodies - a combinatorial approach
US5837268A (en) 1991-10-16 1998-11-17 University Of Saskatchewan GnRH-leukotoxin chimeras
US5679348A (en) 1992-02-03 1997-10-21 Cedars-Sinai Medical Center Immunotherapy for recurrent HSV infections
CA2129899C (en) 1992-02-11 2011-01-04 James J. Mond Dual carrier immunogenic construct
US5714350A (en) * 1992-03-09 1998-02-03 Protein Design Labs, Inc. Increasing antibody affinity by altering glycosylation in the immunoglobulin variable region
US5733743A (en) 1992-03-24 1998-03-31 Cambridge Antibody Technology Limited Methods for producing members of specific binding pairs
US5441870A (en) 1992-04-15 1995-08-15 Athena Neurosciences, Inc. Methods for monitoring cellular processing of β-amyloid precursor protein
US5604102A (en) 1992-04-15 1997-02-18 Athena Neurosciences, Inc. Methods of screening for β-amyloid peptide production inhibitors
US5851787A (en) 1992-04-20 1998-12-22 The General Hospital Corporation Nucleic acid encoding amyloid precursor-like protein and uses thereof
WO1993022332A2 (en) 1992-04-24 1993-11-11 Board Of Regents, The University Of Texas System Recombinant production of immunoglobulin-like domains in prokaryotic cells
WO1993025210A1 (en) * 1992-06-18 1993-12-23 President And Fellows Of Harvard College Diphtheria toxin vaccines
US5766846A (en) 1992-07-10 1998-06-16 Athena Neurosciences Methods of screening for compounds which inhibit soluble β-amyloid peptide production
US5837672A (en) 1992-07-10 1998-11-17 Athena Neurosciences, Inc. Methods and compositions for the detection of soluble β-amyloid peptide
BR9306984A (pt) 1992-08-27 1999-01-12 Deakin Res Ltd Análogo de antígeno de peptídeo de um antígeno de peptídeo nativo vacina anticorpo processo para vacinar um hospedeiro necessitando deste tratamento estojo diagnóstico processos para preparar um análogo de um antiígeno de um antígeno de peptídeo nativo para preparar uma vacina para analisar uma amostra para um antígeno de peptídeo nativo e para analisar uma amostra para um anticorpo
US5958883A (en) 1992-09-23 1999-09-28 Board Of Regents Of The University Of Washington Office Of Technology Animal models of human amyloidoses
US5605811A (en) 1992-10-26 1997-02-25 Athena Neurosciences, Inc. Methods and compositions for monitoring cellular processing of beta-amyloid precursor protein
US6210671B1 (en) * 1992-12-01 2001-04-03 Protein Design Labs, Inc. Humanized antibodies reactive with L-selectin
WO1994012629A1 (en) 1992-12-02 1994-06-09 Baylor College Of Medicine Episomal vectors for gene therapy
DK0672142T3 (da) 1992-12-04 2001-06-18 Medical Res Council Multivalente og multispecifikke bindingsproteiner samt fremstilling og anvendelse af disse
EP0683234B2 (en) 1993-01-25 2007-06-06 Takeda Chemical Industries, Ltd. Antibody against beta-amyloid or their derivative and use thereof
US5955317A (en) 1993-01-25 1999-09-21 Takeda Chemical Industries, Ltd. Antibodies to β-amyloids or their derivatives and use thereof
DE614989T1 (de) 1993-02-17 1995-09-28 Morphosys Proteinoptimierung Verfahren für in vivo Selektion von Ligandenbindende Proteine.
EP0689551B1 (en) * 1993-03-17 2008-02-20 THE GOVERNMENT OF THE UNITED STATES OF AMERICA, as represented by THE SECRETARY, DEPARTMENT OF HEALTH AND HUMAN SERVICES Immunogenic chimeras comprising nucleic acid sequences encoding endoplasmic reticulum signal sequence peptides and at least one other peptide, and their uses in vaccines and disease treatments
CN1087176C (zh) 1993-03-23 2002-07-10 史密斯克莱·比奇曼生物公司 含有3－o脱酰基单磷酰脂a的疫苗制剂
IT1270939B (it) 1993-05-11 1997-05-26 Angeletti P Ist Richerche Bio Procedimento per la preparazione di immunogeni e reagenti diagnostici,e immunogeni e reagenti diagnostici cosi' ottenibili.
US5464823A (en) 1993-07-20 1995-11-07 The Regents Of The University Of California Mammalian antibiotic peptides
AU705889B2 (en) 1993-08-26 1999-06-03 Regents Of The University Of California, The Method, compositions and devices for administration of naked polynucleotides which encode antigens and immunostimulatory peptides
US5652334A (en) 1993-09-08 1997-07-29 City Of Hope Method for design of substances that enhance memory and improve the quality of life
US5385887A (en) * 1993-09-10 1995-01-31 Genetics Institute, Inc. Formulations for delivery of osteogenic proteins
DK0735893T3 (da) 1993-09-14 2009-03-09 Pharmexa Inc PAN DR-bindende peptider til styrkelse af immunsvaret
US5470951A (en) 1993-09-29 1995-11-28 City Of Hope Peptides for antagonizing the effects of amyloid βprotein
US5858981A (en) * 1993-09-30 1999-01-12 University Of Pennsylvania Method of inhibiting phagocytosis
JP3504963B2 (ja) * 1993-10-22 2004-03-08 智靖 羅 抗ヒト高親和性ＩｇＥ受容体モノクローナル抗体に係るアミノ酸配列をコードするＤＮＡ断片
US5744368A (en) 1993-11-04 1998-04-28 Research Foundation Of State University Of New York Methods for the detection of soluble amyloid β-protein (βAP) or soluble transthyretin (TTR)
US5827690A (en) 1993-12-20 1998-10-27 Genzyme Transgenics Corporatiion Transgenic production of antibodies in milk
US5434170A (en) 1993-12-23 1995-07-18 Andrulis Pharmaceuticals Corp. Method for treating neurocognitive disorders
US5877218A (en) 1994-01-10 1999-03-02 Teva Pharmaceutical Industries, Ltd. Compositions containing and methods of using 1-aminoindan and derivatives thereof and process for preparing optically active 1-aminoindan derivatives
WO1995020666A2 (en) 1994-01-27 1995-08-03 Regents Of The University Of Minnesota Transgenic non-human mammals with progressive neurologic disease
US5877399A (en) 1994-01-27 1999-03-02 Johns Hopkins University Transgenic mice expressing APP-Swedish mutation develop progressive neurologic disease
AU692237B2 (en) 1994-02-03 1998-06-04 Picower Institute For Medical Research, The Compositions and methods for advanced glycosylation endproduct-mediated modulation of amyloidosis
CA2122573A1 (en) * 1994-04-13 1995-10-14 John M. Pratt Dynamic electronic mail facility for applications executing in an integrated operating environment
US6372716B1 (en) * 1994-04-26 2002-04-16 Genetics Institute, Inc. Formulations for factor IX
US5505947A (en) 1994-05-27 1996-04-09 The University Of North Carolina At Chapel Hill Attenuating mutations in Venezuelan Equine Encephalitis virus
US5622701A (en) 1994-06-14 1997-04-22 Protein Design Labs, Inc. Cross-reacting monoclonal antibodies specific for E- and P-selectin
US6417178B1 (en) * 1994-07-19 2002-07-09 University Of Pittsburgh Amyloid binding nitrogen-linked compounds for the antemortem diagnosis of alzheimer's disease, in vivo imaging and prevention of amyloid deposits
US6114133A (en) 1994-11-14 2000-09-05 Elan Pharmaceuticals, Inc. Methods for aiding in the diagnosis of Alzheimer's disease by measuring amyloid-β peptide (x-≧41)
US5589154A (en) 1994-11-22 1996-12-31 Rutgers, The State University Of New Jersey Methods for the prevention or treatment of vascular hemorrhaging and Alzheimer's disease
US5688651A (en) 1994-12-16 1997-11-18 Ramot University Authority For Applied Research And Development Ltd. Prevention of protein aggregation
WO1996024369A1 (en) * 1995-02-06 1996-08-15 Genetics Institute, Inc. Formulations for il-12
US5786180A (en) 1995-02-14 1998-07-28 Bayer Corporation Monoclonal antibody 369.2B specific for β A4 peptide
US5624937A (en) * 1995-03-02 1997-04-29 Eli Lilly And Company Chemical compounds as inhibitors of amyloid beta protein production
US6303567B1 (en) 1995-03-14 2001-10-16 Praecis Pharmaceuticals, Inc . Modulators of β-amyloid peptide aggregation comprising D-amino acids
US5854215A (en) 1995-03-14 1998-12-29 Praecis Pharmaceuticals Incorporated Modulators of β-amyloid peptide aggregation
US5817626A (en) 1995-03-14 1998-10-06 Praecis Pharmaceuticals Incorporated Modulators of beta-amyloid peptide aggregation
CA2214247C (en) 1995-03-14 2004-02-10 Praecis Pharmaceuticals Incorporated Modulators of amyloid aggregation
US6121022A (en) 1995-04-14 2000-09-19 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US5869046A (en) 1995-04-14 1999-02-09 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US7153510B1 (en) 1995-05-04 2006-12-26 Yale University Recombinant vesiculoviruses and their uses
EP0750907B1 (en) 1995-06-30 2002-03-20 American Cyanamid Company Stable macrolide and macrolide vaccine compositions
US5824322A (en) 1995-08-21 1998-10-20 Cytrx Corporation Compositions and methods for growth promotion
AU707484B2 (en) * 1995-09-14 1999-07-08 Regents Of The University Of California, The Antibodies specific for native PrPsc
US5731284A (en) * 1995-09-28 1998-03-24 Amgen Inc. Method for treating Alzheimer's disease using glial line-derived neurotrophic factor (GDNF) protein product
US5985242A (en) 1995-10-27 1999-11-16 Praecis Pharmaceuticals, Inc. Modulators of β-amyloid peptide aggregation comprising D-amino acids
US5750361A (en) 1995-11-02 1998-05-12 The Regents Of The University Of California Formation and use of prion protein (PRP) complexes
AU1072897A (en) 1995-12-12 1997-07-03 Karolinska Innovations Ab Peptide binding the klvff-sequence of amyloid beta
US5770700A (en) * 1996-01-25 1998-06-23 Genetics Institute, Inc. Liquid factor IX formulations
EP0787764B1 (en) * 1996-02-03 2003-04-09 Mitsubishi Gas Chemical Company, Inc. Oxygen-absorbing resin composition and packing material, multi-layered packing material, package and packing method using the same
US6150091A (en) 1996-03-06 2000-11-21 Baylor College Of Medicine Direct molecular diagnosis of Friedreich ataxia
US6284533B1 (en) 1996-05-01 2001-09-04 Avant Immunotherapeutics, Inc. Plasmid-based vaccine for treating atherosclerosis
TW373320B (en) * 1996-05-27 1999-11-01 United Microelectronics Corporaiton Structure and production method of capacitor of dynamic RAM
US6057367A (en) 1996-08-30 2000-05-02 Duke University Manipulating nitrosative stress to kill pathologic microbes, pathologic helminths and pathologically proliferating cells or to upregulate nitrosative stress defenses
US6022859A (en) 1996-11-15 2000-02-08 Wisconsin Alumni Research Foundation Inhibitors of β-amyloid toxicity
US6218506B1 (en) 1997-02-05 2001-04-17 Northwestern University Amyloid β protein (globular assembly and uses thereof)
US20030068316A1 (en) * 1997-02-05 2003-04-10 Klein William L. Anti-ADDL antibodies and uses thereof
US6277375B1 (en) 1997-03-03 2001-08-21 Board Of Regents, The University Of Texas System Immunoglobulin-like domains with increased half-lives
US5798102A (en) 1997-03-04 1998-08-25 Milkhaus Laboratory, Inc. Treatment of cardiomyopathy
US20020086847A1 (en) * 1997-04-09 2002-07-04 Mindset Biopharmaceuticals (Usa) Recombinant antibodies specific for beta-amyloid ends, DNA encoding and methods of use thereof
US8173127B2 (en) * 1997-04-09 2012-05-08 Intellect Neurosciences, Inc. Specific antibodies to amyloid beta peptide, pharmaceutical compositions and methods of use thereof
US6787319B2 (en) * 1997-04-16 2004-09-07 American Home Products Corp. β-amyloid peptide-binding proteins and polynucleotides encoding the same
US6339068B1 (en) * 1997-05-20 2002-01-15 University Of Iowa Research Foundation Vectors and methods for immunization or therapeutic protocols
US6175057B1 (en) * 1997-10-08 2001-01-16 The Regents Of The University Of California Transgenic mouse model of alzheimer's disease and cerebral amyloid angiopathy
US6710226B1 (en) * 1997-12-02 2004-03-23 Neuralab Limited Transgenic mouse assay to determine the effect of Aβ antibodies and Aβ Fragments on alzheimer's disease characteristics
TWI239847B (en) * 1997-12-02 2005-09-21 Elan Pharm Inc N-terminal fragment of Abeta peptide and an adjuvant for preventing and treating amyloidogenic disease
US6750324B1 (en) * 1997-12-02 2004-06-15 Neuralab Limited Humanized and chimeric N-terminal amyloid beta-antibodies
US7964192B1 (en) * 1997-12-02 2011-06-21 Janssen Alzheimer Immunotherapy Prevention and treatment of amyloidgenic disease
US6743427B1 (en) * 1997-12-02 2004-06-01 Neuralab Limited Prevention and treatment of amyloidogenic disease
US20080050367A1 (en) * 1998-04-07 2008-02-28 Guriq Basi Humanized antibodies that recognize beta amyloid peptide
US6787523B1 (en) * 1997-12-02 2004-09-07 Neuralab Limited Prevention and treatment of amyloidogenic disease
US6913745B1 (en) * 1997-12-02 2005-07-05 Neuralab Limited Passive immunization of Alzheimer's disease
US7179892B2 (en) * 2000-12-06 2007-02-20 Neuralab Limited Humanized antibodies that recognize beta amyloid peptide
US6528624B1 (en) * 1998-04-02 2003-03-04 Genentech, Inc. Polypeptide variants
US6194551B1 (en) 1998-04-02 2001-02-27 Genentech, Inc. Polypeptide variants
US20050059591A1 (en) * 1998-04-07 2005-03-17 Neuralab Limited Prevention and treatment of amyloidogenic disease
US20050059802A1 (en) * 1998-04-07 2005-03-17 Neuralab Ltd Prevention and treatment of amyloidogenic disease
JP2002512776A (ja) * 1998-04-28 2002-05-08 スミスクライン・ビーチャム・コーポレイション 免疫原性の低下したモノクローナル抗体
US20030147882A1 (en) * 1998-05-21 2003-08-07 Alan Solomon Methods for amyloid removal using anti-amyloid antibodies
US6727349B1 (en) * 1998-07-23 2004-04-27 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Recombinant anti-CCR2 antibodies and methods of use therefor
CA2354862A1 (en) * 1998-10-19 2000-04-27 Yeda Research And Development Co. Ltd. Treatment of systemic lupus erythematosus by down-regulating the autoimmune response to autoantigens
US6441870B1 (en) * 1998-12-22 2002-08-27 Gateway, Inc. Automatic gamma correction for multiple video sources
DK1409654T3 (da) * 1999-06-16 2008-12-08 Boston Biomedical Res Inst Immunologisk styring af beta-amyloid-niveauer in vivo
US6264335B1 (en) * 1999-06-25 2001-07-24 James C. Bass, Sr. Light-reflective marking clip
US6756378B2 (en) * 1999-06-30 2004-06-29 Pharmacopeia Drug Discovery, Inc. VLA-4 inhibitor compounds
US6294171B2 (en) 1999-09-14 2001-09-25 Milkhaus Laboratory, Inc. Methods for treating disease states comprising administration of low levels of antibodies
US20020094335A1 (en) * 1999-11-29 2002-07-18 Robert Chalifour Vaccine for the prevention and treatment of alzheimer's and amyloid related diseases
US6399314B1 (en) 1999-12-29 2002-06-04 American Cyanamid Company Methods of detection of amyloidogenic proteins
IL151378A0 (en) * 2000-02-24 2003-04-10 Univ Washington Humanized antibodies that sequester amyloid beta peptide
JP2003534351A (ja) * 2000-05-22 2003-11-18 ニュー・ヨーク・ユニヴァーシティー アミロイドβ及びアミロイド沈着物に対する免疫応答誘導のための、アミロイドβと相同的な、合成の、免疫原性だが非アミロイド原性ペプチド
US20020009445A1 (en) * 2000-07-12 2002-01-24 Yansheng Du Human beta-amyloid antibody and use thereof for treatment of alzheimer's disease
US20030092145A1 (en) * 2000-08-24 2003-05-15 Vic Jira Viral vaccine composition, process, and methods of use
PE20020574A1 (es) * 2000-12-06 2002-07-02 Wyeth Corp Anticuerpos humanizados que reconocen el peptido amiloideo beta
ES2312569T3 (es) * 2001-04-30 2009-03-01 Eli Lilly And Company Anticuerpos humanizados.
ES2437875T3 (es) * 2001-04-30 2014-01-14 Eli Lilly And Company Anticuerpos humanizados que reconocen el péptido beta-amiloide
US6906169B2 (en) * 2001-05-25 2005-06-14 United Biomedical, Inc. Immunogenic peptide composition comprising measles virus Fprotein Thelper cell epitope (MUFThl-16) and N-terminus of β-amyloid peptide
US6733547B2 (en) * 2001-12-10 2004-05-11 Delphi Technologies, Inc. Method of making a paste composition for lead acid battery
MY139983A (en) * 2002-03-12 2009-11-30 Janssen Alzheimer Immunotherap Humanized antibodies that recognize beta amyloid peptide
PE20050627A1 (es) * 2003-05-30 2005-08-10 Wyeth Corp Anticuerpos humanizados que reconocen el peptido beta amiloideo

Also Published As

Publication number Publication date
CN101081868A (zh) 2007-12-05
JP4166569B2 (ja) 2008-10-15
EA200602015A1 (ru) 2007-02-27
WO2002046237A2 (en) 2002-06-13
KR20030066695A (ko) 2003-08-09
JP2009159981A (ja) 2009-07-23
SK288209B6 (sk) 2014-07-02
HUP0302589A2 (hu) 2003-10-28
CA2430772C (en) 2010-11-30
IL156030A0 (en) 2003-12-23
HK1070904A1 (en) 2005-06-30
CN101081867A (zh) 2007-12-05
NO20032549D0 (no) 2003-06-05
US7582733B2 (en) 2009-09-01
ZA200305169B (en) 2004-07-09
JP4944149B2 (ja) 2012-05-30
AU2002225921B8 (en) 2008-07-31
NZ526813A (en) 2006-10-27
CY1108740T1 (el) 2014-04-09
PE20020574A1 (es) 2002-07-02
DE60136651D1 (de) 2009-01-02
MXPA03005048A (es) 2004-09-10
PL366341A1 (en) 2005-01-24
DK1358213T3 (da) 2009-03-02
US7189819B2 (en) 2007-03-13
MY162171A (en) 2017-05-31
KR100996936B1 (ko) 2010-11-29
JP2008073051A (ja) 2008-04-03
WO2002046237A3 (en) 2003-09-04
NO339290B1 (no) 2016-11-21
IS2620B (is) 2010-05-15
US20050009150A1 (en) 2005-01-13
CA2430772A1 (en) 2002-06-13
HU229681B1 (en) 2014-04-28
EA011450B1 (ru) 2009-02-27
AR035402A1 (es) 2004-05-26
AU2592102A (en) 2002-06-18
JP5059541B2 (ja) 2012-10-24
HRP20030547A8 (en) 2010-05-31
AU2002225921B2 (en) 2008-07-10
NO20032549L (no) 2003-08-05
SI1358213T1 (sl) 2009-04-30
EP2045267A2 (en) 2009-04-08
ES2317953T3 (es) 2009-05-01
MY163362A (en) 2017-09-15
EE05309B1 (et) 2010-06-15
BG107850A (bg) 2004-02-27
ATE414719T1 (de) 2008-12-15
IL156030A (en) 2009-06-15
NZ546621A (en) 2008-09-26
PL211761B1 (pl) 2012-06-29
UY27062A1 (es) 2002-07-31
EP1358213A2 (en) 2003-11-05
GEP20084339B (en) 2008-03-25
JP2005500808A (ja) 2005-01-13
HRP20030547A2 (en) 2005-06-30
NZ546620A (en) 2008-04-30
CN100448893C (zh) 2009-01-07
IS6848A (is) 2003-06-16
EP1358213B1 (en) 2008-11-19
EP2045267A3 (en) 2010-12-08
JP2008099694A (ja) 2008-05-01
US20030165496A1 (en) 2003-09-04
EA010469B1 (ru) 2008-08-29
CN1541225A (zh) 2004-10-27
JP2008073052A (ja) 2008-04-03
CN101081869A (zh) 2007-12-05
HUP0302589A3 (en) 2008-03-28
ECSP034685A (es) 2003-09-24
EA200300637A1 (ru) 2004-06-24
BR0115978A (pt) 2005-05-03
KR20070004139A (ko) 2007-01-05
TWI255272B (en) 2006-05-21
JP2012147797A (ja) 2012-08-09
PT1358213E (pt) 2009-01-28
SK8502003A3 (en) 2004-03-02
UA87093C2 (ru) 2009-06-25
BG66292B1 (en) 2013-02-28
EE200300264A (et) 2003-10-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US7189819B2 (en) Humanized antibodies that recognize beta amyloid peptide
US7700751B2 (en) Humanized antibodies that recognize β-amyloid peptide
US7893214B2 (en) Humanized antibodies that recognize beta amyloid peptide
US7179892B2 (en) Humanized antibodies that recognize beta amyloid peptide
US7790856B2 (en) Humanized antibodies that recognize beta amyloid peptide
US20050249725A1 (en) Humanized antibodies that recognize beta amyloid peptide
AU2002225921A1 (en) Humanized antibodies that recognize beta amyloid peptide
AU2007231637B8 (en) Humanized antibodies that recognize beta amyloid peptide