CN1362967A - 含有D－氨基酸的β－淀粉样肽聚集的调节因子 - Google Patents

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Abstract

提供了调节天然β－淀粉样肽聚集的化合物。本发明的调节因子含有一种肽,上述肽优选地基于β－淀粉样肽,完全由D－氨基酸组成。优选地,该肽含有3－5个D－氨基酸残基,并包括至少两个独立地选自D－亮氨酸,D－苯丙氨酸和D－缬氨酸的氨基酸。在一个特别优选的实施方案中,该肽是β－淀粉样肽的逆反异构体(Retro－Inverso Isomer),优选地为Aβ17－21的逆反异构体。在某些实施方案中,该肽在氨基端,或羧基端,或两端同时进行修饰。优选的氨基酸修饰基团为烷基基团。优选的羧基端修饰基团包括酰胺基团,乙酰基团,烷基酰胺基团,芳基酰胺基团或羟基基团。还公开了含有本发明的化合物的药用组合物,以及利用本发明的化合物诊断和治疗淀粉样原性疾病的方法。

Description

含有D-氨基酸的β-淀粉样肽聚集的调节因子
发明背景
1907年由巴伐利亚精神病医生Alois Alzheimer第一次描述的阿尔茨海默氏病(AD)，是一种渐进的神经紊乱，它首先是短期记忆消失，并发展为方向知觉的丧失，判断力和推理能力的损害，并且最后成为痴呆。上述疾病的进程通常在开始后的4年到12年之间在一种严重虚弱的，不能移动的状态中导致死亡。据估计AD折磨着65岁以上的5％至11％的人群，并且折磨着多达47％的85岁以上人群。治疗AD的社会费用每年在800亿美元以上，主要是由于AD病人需要全面的监管护理(custodial care)。而且，当20世纪40年代和50年代人口爆炸期间出生的人接近AD更普遍的年龄时，AD的控制和治疗将成为更为重要的健康护理问题。目前没有显著地延缓上述疾病发展的治疗方法。对于AD的综述，参见Selkoe，D.J.Sci.Amer.，1991年11月，68-78页；以及Yankner，B.A.etal.(1991)N.Eng.J.Med.325：1849-1857。
最近有报道(Games et al.(1995)Nature 373：523-527)已经在转基因小鼠中建立了阿尔茨海默氏型神经病理学。上述转基因小鼠表达高水平的人突变体淀粉样蛋白前体并且逐渐发展出许多与AD相关的的病情。
病理学上，AD的特征是病人脑中存在独特的损伤。这些脑损伤包括称为神经原纤维缠结(NTFs)的异常细胞内纤维，以及在衰老，或淀粉样，斑块中的淀粉样原性蛋白的细胞外沉积物。淀粉样沉积物也存在于AD病人的大脑血管壁内。淀粉样斑块的主要蛋白组分已经被确认为4kd的肽，称为β-淀粉样肽(β-AP)(Glenner，G.G.和Wong，C.W.(1984)Biochem.Biophys.Res.Commun.120：885-890；Masters.C.et al(1985)Proc.Natl.Acad.SciUSA82：4245-4249)。扩散的β-AP沉积物经常在正常成人的脑中观察到，而AD脑组织的特征是更密集的中心致密的β-淀粉样斑块。(参见例如，Davies，L.etal.(1988)Neurology 38：1688-1693)。这些观察表明β-AP沉积先于并且参与AD中神经元的破坏。对β-AP的直接病原性作用的进一步支持是，已经表明β-淀粉样在培养物中和在体内都对成熟神经元有毒性。Yankner，B.A.et al(1989)Science245：417-420；Yankner，B.A.et al(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA87：9020-9023；Roher，A.E.et al.(1991)Biochem.Biophys.Commun.174：572-579；Kowall，N.W.etal(1991)Proc.Natl.Acad.Dci.USA 88：7247-7251。此外，具有荷兰型淀粉样变性病(HCHWA-D)的遗传性脑出血病人已经被表明具有一个点突变，该点突变导致在β-AP中的一个氨基酸的替换，上述荷兰型淀粉样变性病的特征是在大脑皮层和脑血管(cerebrovasculature)内的扩散的β-淀粉样沉积物。Levy，E.etal.(1990)Science 248：1124-1126。这个发现表明β-AP序列的一个特定的改变可以使β-淀粉样被沉淀。
天然的β-AP源自更大蛋白的水解，上述更大的蛋白称为淀粉样前体蛋白(APP)。Kang，j.et al.(1987)Nature 325：733；Goldgaber，D.et al.(1987)Science 235：877；Robakis，N.K.et al.(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：4190；Tanzi，R.E.et al.(1987)Science 235：880。上述APP基因图谱定位于染色体21，从而为在Down’s综合症个体的早年时期所见到的β-淀粉样沉积物提供了一个解释，上述Down’s综合症是由染色体21的三体性引起的。Mann，D.M.et al.(1989)Neropathol.Appl.Neruobiol.15：317；Rumble，B.et al.(1989)N.Eng.J.Med.320：1446。APP基因包含一个单一的跨膜结构域，其具有很长的延伸到细胞外环境的氨基酸末端区域(大约是蛋白的三分之二)和伸到细胞质的较短的羧基端区域。APP信使RNA的差异剪切产生至少5种形式的APP，由563个氨基酸(APP-563)，695个氨基酸(APP-695)，714个氨基酸(APP-714)，751个氨基酸(APP-751)或770个氨基酸(APP-770)组成。
在APP中，天然存在的β-淀粉样肽开始于APP-770的672位的天冬氨酸残基。源自APP蛋白水解的β-AP的长度为39至43个氨基酸残基，这取决于羧基端的终止位点，而显示了异质性。在AD病人和正常成人的血液和脑脊液中，β-AP的主要循环形式都是β1-40(“短β”)。Seubert，P.et al.(1992)Nature 359：325；Shoji，M.et al.(1992)Science 258：126。但是，β1-42和β1-43(“长β”)也是β-淀粉样斑块中的形式。Masters，C.et al.(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：4245；Miller，D.et al.(1993)Arch.Biochem.Biophys.301：41；Mori，H.et al.(1992)J.Biol.Chem.267：17082。尽管导致β-APP聚集并沉淀的精确分子机制还不清楚，但是上述过程已经被比作晶核形成依赖性聚合，例如蛋白结晶，微管形成和肌动蛋白聚合。参见，例如，J.T.和Lansbury，P.T.(1993)Cell 73：1055-1058。在这样的过程中，单体组分的聚合直到晶核形成后才发生。因此，这些过程的特征是在聚集发生之前有一个滞后时间，然后在晶核形成后迅速聚合。可以通过加入“晶种”或预先形成的晶核加速晶核形成，上述过程导致迅速的聚合。长β形式的β-AP被表明是作为晶种，从而同时加速长和短β-AP形式的聚合。Jarrett，J.T.et al.(1993)Biochemi stry 32：4693。
在一项研究中，在β-AP中进行了氨基酸替换，该研究报道了当突变形式的肽和非突变形式的肽混合时，两种β肽的突变体影响未突变的β-AP的聚合。Hilbich.C.et al.(1992)J.Mol.Biol.228：460-473。等摩尔量的突变体和非突变体(即天然的)β-淀粉样肽被用于观察这种效应，并且据报道该突变肽为不适合体内使用。Hilbich，C et al.(1992)，supra。
发明概述
本发明涉及能够与天然β淀粉样肽(amyloid peptide)(β-AP)结合，调节天然β-AP的聚集和/或抑制天然β-AP神经毒性的化合物及其药用组合物。该化合物以一种方式修饰，该方式允许提高生物稳定性和延长升高的血浆水平。本发明的β-淀粉样调节因子(modulator)化合物包括一种肽结构，该肽结构优选地基于β-淀粉样肽，该肽结构完全由D-氨基酸组成。在各种实施方案中，该调节因子化合物的肽结构含有一段D-氨基酸序列，该D-氨基酸序列相应于在天然β-AP中发现的L-氨基酸序列，或一段D-氨基酸序列，该D-氨基酸序列为在天然β-AP中发现的L-氨基酸序列的反异构体(inverso isomer)，或一段D-氨基酸序列，该D-氨基酸序列为在天然β-AP中发现的L-氨基酸序列的逆反异构体(retro-inversoisomer)，或一段D-氨基酸序列，该D-氨基酸序列为在天然β-AP中发现的L-氨基酸序列的拼凑或替换形式。优选地，上述调节因子的D-氨基酸肽结构的设计是基于天然β-AP 17-21位的亚区域(分别为Aβ17-20和Aβ17-21)，该亚区域具有氨基酸序列Leu-Val-Phe-Phe-Ala(SEQ ID NO：4)。在一个优选的实施方案中，本发明上述化合物中的一个苯丙氨酸被替换为一个苯丙氨酸类似物，该类似物更稳定，并更不易于，例如，氧化代谢，或允许升高该化合物的脑水平。
在另一个实施方案中，本发明的调节因子化合物包括由D-氨基酸，L-氨基酸或两者组成的β-淀粉样肽，β-淀粉样肽反异构体，或与肼部分连接的β-淀粉样肽的逆反异构体，其中，当该化合物与天然β-淀粉样肽接触时，该化合物与天然β-淀粉样肽结合，或调节其聚集或抑制天然β-淀粉样肽的神经毒性。
本发明的调节因子化合物优选地含有3-20个D-氨基酸，更优选地含有3-10个D-氨基酸，并且甚至更优选地含有3-5个D-氨基酸。上述调节因子的D-氨基酸肽结构可以具有游离氨基，羧基或酰胺末端。替代地，上述氨基末端，羧基末端或两者都可以被修饰。例如，可以利用N末端修饰基团增强化合物抑制Aβ聚集的能力。而且，可以修饰上述肽的氨基和/或羧基末端以改变上述化合物的药物动力学性质(例如稳定性，生物利用度如，增强上述化合物通过血脑屏障的运送以及进入脑中，等等)。优选的氨基末端修饰基团包括烷基，例如，甲基，乙基，或异丙基。优选的羧基末端修饰基团包括酰胺基团，烷基或烷基酰胺基团(例如苯乙基酰胺)，羟基基团(即，肽酸还原的产物，生成肽醇)，酰基酰胺基团，以及乙酰基基团。更进一步地，可以修饰调节因子化合物用上可探测的物质(例如，放射性标记)标记该化合物。
在某些优选的实施方案中，本发明提供了一种化合物，该化合物具有如下结构：
N，N-二甲基-(Gly-D-Ala-D-Phe-D-Phe-D-Val-D-Leu)-NH2；N，N-二甲基-(D-Ala-D-Phe-D-Phe-D-Val-D-Leu)-NH2；N-二甲基-(Gly-D-Ala-D-Phe-D-Phe-D-Val-D-Leu)-NH2；N-乙基-(Gly-D-Ala-D-Phe-D-Phe-D-Val-D-Leu)-NH2；N-异丙基-(Gly-D-Ala-D-Phe-D-Phe-D-Val-D-Leu)-NH2；H-(D-Leu-D-Val-D-Phe-D-Phe-D-Ala)-异丙基酰胺；H-(D-Leu-D-Val-D-Phe-D-Phe-D-Ala)-二甲基酰胺；N，N-二乙基(Gly-D-Ala-D-Phe-D-Phe-D-Val-D-Leu)-NH2；N，N-二甲基-(D-Ala-D-Phe-D-Phe-D-Val-D-Leu)-NH2；N，N-二甲基-(D-Leu-D-Val-D-Phe-D-Phe-D-Leu)-NH2；N，N-二甲基-(D-Leu-D-Val-D-Phe-D-Phe-D-Leu)-NH2；N，N-二甲基-(D-Leu-D-Phe-D-Phe-D-Val-D-Leu)-NH2；H-(Gly-D-Leu-D-Val-D-Phe-D-Phe-D-Leu)-NH2；N-乙基-(Gly-D-Leu-D-Val-D-Phe-D-Phe-D-Leu)-NH2；N-乙基-(Gly-D-Leu-D-Phe-D-Phe-D-Val-D-Leu)-NH2；N-甲基-(D-Leu-D-Phe-D-Phe-D-Val-D-Leu)-NH2；N-乙基-(D-Leu-D-Val-D-Phe-D-Phe-D-Leu)-NH2；N-丙基-(D-Leu-D-Val-D-Phe-D-Phe-D-Leu)-NH2；N，N-二乙基-(Gly-D-Leu-D-Val-D-Phe-D-Phe-D-Leu)-NH2；H-(D-Ile-D-Val-D-Phe-D-Phe-D-Ile)-NH2；H-(D-Ile-D-Val-D-Phe-D-Phe-D-Ala-)-NH2；H-(D-Ile-D-Ile-D-Phe-D-Phe-D-Ile)-NH2；H-(D-Nle-D-Val-D-Phe-D-Phe-D-Ala-)-NH2；H-(D-Nle-D-Val-D-Phe-D-Phe-D-Nle)-NH2；1-哌啶-乙酰基-(D-Leu-D-Val-D-Phe-D-Phe-D-Leu)-NH2；1-哌啶-乙酰基-(D-Leu-D-Phe-D-Phe-D-Val-D-Leu)-NH2；H-D-Leu-D-Val-D-Phe-D-Phe-D-Leu-异丙基酰胺；H-D-Leu-D-Phe-D-Phe-D-Val-D-Leu-异丙基酰胺；H-(D-Leu-D-Val-D-Phe-D-Phe-D-Leu)-甲酰胺；H-(D-Leu-D-Phe-D-Phe-D-Val-D-Leu)-甲酰胺；H-(D-Leu-D-Val-D-Phe-D-Phe-D-Leu)-OH；N-甲基-(D-Leu-D-Val-D-Phe-D-Phe-D-Leu)-NH2；H-(D-Leu-D-Val-D-Phe-D-Cha-D-Leu)-NH2；H-(D-Leu-D-Val-D-Phe-D-[p-F]Phe-D-Leu)-NH2；H-(D-Leu-D-Val-D-Phe-D-[F5]Phe-D-Leu)-NH2；H-(D-Leu-D-Phe-D-Cha-D-Val-D-Leu)-NH2；H-(D-Leu-D-Phe-D-[p-F]Phe-D-Val-D-Leu)-NH2；H-(D-Leu-D-Phe-D-[F5]Phe-D-Val-D-Leu)-NH2；H-(D-Leu-D-Phe-D-Lys-D-Val-D-Leu)-NH2；H-(D-Leu-D-Cha-D-Phe-D-Val-D-Leu)-NH2；H-(D-Leu-D-[p-F]Phe-D-Phe-D-Val-D-Leu)-NH2；H-(D-Leu-D-[F5]Phe-D-Phe-D-Val-D-
Leu)-NH2；H-(D-Leu-D-Lys-D-Phe-D-Val-D-Leu)-NH2；H-(D-Leu-D-Cha-D-Cha-D-
Val-D-Leu)-NH2；H-(D-Leu-D-[p-F]Phe-D-[p-F]Phe-D-Val-D-Leu)-NH2；H-(D-Leu-D-
[F5]Phe-D-[F5]Phe-D-Val-D-Leu)-NH2；H-(D-Leu-D-Lys-D-Lys-D-Val-D-Leu)-NH2；
N-甲基-(D-Leu-D-Val-D-Phe-D-Cha-D-Leu)-NH2；N-甲基-(D-Leu-D-Val-D-Phe-
D-[p-F]Phe-D-Leu)-NH2；N-甲基-(D-Leu-D-Val-D-Phe-D-[F5]Phe-D-Leu)-NH2；H-
D-Leu-D-Val-D-Phe-NH-(H-D-Leu-D-Val-D-Phe-)NH；H-D-Leu-D-Val-D-Phe-NH-
NH-COCH3；和H-D-Leu-D-Val-D-Phe-NH-NH2.
本发明的特别优选的化合物在实施例中提出。
本发明的另一方面涉及药用组合物。通常，药用组合物含有治疗有效量的本发明调节因子化合物以及药用可接受的载体。
本发明的另一方面涉及抑制天然β-淀粉样肽聚集的方法。这些方法包括将天然β-淀粉样肽与本发明的调节因子化合物接触，以便抑制天然β-淀粉样肽的聚集。
本发明的另一方面涉及在生物样品中检测天然β-淀粉样肽存在与否的方法。这些方法包括将生物样品与本发明的化合物接触，其中上述化合物用可探测的物质标记，并检测与天然β-淀粉样肽结合的上述化合物，从而在生物样品中检测天然β-淀粉样肽存在与否。
本发明的另一方面涉及具有与β-淀粉样变性病相关病症的病人的治疗方法。这些方法包括将治疗有效量的本发明的调节因子化合物施用于病人，以便治疗病人的与β-淀粉样变性病相关的病症。优选地，上述病症是阿尔茨海默氏疾病。本发明的调节因子在治疗与β-淀粉样变性病相关的疾病中的应用或在用于治疗上述疾病的药物制造中的应用也包括在本发明中。
附图简述
图1是描述脑摄取检测结果的表。
图2是描述实施例2中所描述的纤丝结合检测结果的图。
发明详述
本发明涉及可以与天然β-淀粉样肽结合，调节天然β-淀粉样肽(β-AP)的聚集和/或抑制天然β-APs的神经毒性的化合物及其药用组合物。上述化合物以一种方式被修饰，该方式允许提高生物稳定性以及延长升高的血浆水平。本发明的调节天然β-AP聚集的化合物与天然β-AP接触时，改变天然β-AP的聚集，在本文中上述调节天然β-AP聚集的化合物可以和β淀粉样调节因子化合物、β淀粉样调节因子或仅仅是调节因子互换使用。因此，本发明的化合物通过改变β-AP的天然聚集过程或速率，从而破坏该过程。优选地，上述化合物抑制β-AP的聚集。本发明的化合物的特征在于包含完全由D-氨基酸残基组成的肽结构。上述肽结构优选地基于β-淀粉样肽并且可以包含，例如，一段D-氨基酸序列，该D-氨基酸序列相应于在天然β-AP中发现的L-氨基酸序列，或一段D-氨基酸序列，该D-氨基酸序列为在天然β-AP中发现的L-氨基酸序列的逆反异构体，或一段D-氨基酸序列，该D-氨基酸序列为在天然β-AP中发现的L-氨基酸序列的逆反异构体(retro-inverso isomer)，或一段D-氨基酸序列，该D-氨基酸序列为在天然β-AP中发现的L-氨基酸序列的拼凑或替换形式。在优选的实施方案中，本发明的化合物中苯丙氨酸被替换为苯丙氨酸类似物，该类似物更稳定，并更不易于，例如，氧化代谢。
本发明包括含有D-氨基酸肽结构的调节因子化合物，上述肽结构具有游离氨基，羧基或羧酰胺末端，还包括肽结构的氨基末端，羧基末端，和/或侧链被修饰的调节因子化合物。
可以根据本发明的β淀粉样调节因子化合物与天然β-淀粉样肽结合的能力，体外调节天然β-AP聚集的能力和/或抑制培养细胞的天然β-AP纤丝的神经毒性的能力(利用本文所描述的检测方法，例如，神经毒性检测，晶核形成检测，或纤丝结合检测)对上述β淀粉样调节因子化合物进行选择。优选的调节因子化合物抑制天然β-AP的聚集和/或抑制天然β-AP的神经毒性。但是，根据上述一种或两种性质选择的调节因子化合物在体内可以具有附加的性质，这些性质可能有利于治疗淀粉样变性病(J.S.Pachter et al.(1998)“Aβ-40Induced neurocytophathic activation of human monocytes Isblocked by Aβpeptide aggregation Inhibitors“Aβ1诱导的人单核神经细胞病变的激活被Aβ肽聚集抑制剂阻滞。”Neruobiologyof Aging(Abstracts：The 6th International Conference onAlzheimer’s Disease and Related Disorders，Amsterdam，18-23 July 1998)19，S128(Abstract 540)；R.Weltzein，A.et al.(1998))″Phagocytosis of Beta-Amyloid：A Possible Requisitefor Neurotoxicity.″“β-淀粉样的噬菌作用：神经毒性的一个可能要素。”J.Neuroimmunology(Special Issue：Abstracts of theInternational Society of Neuroimmunology Fifth InternationalCongress，Montreal，Canada，23-27 August 1998)1998，90，32(Abstract 162))。例如，调节因子化合物可以在体内干扰天然β-AP的加工(通过直接或间接的蛋白酶抑制)或通过调节产生β-AP，或其它APP片段的步骤。替代地，可以根据后者的性质选择调节因子化合物，而不是根据在体外对Aβ聚集的抑制。此外，通过与天然β-AP的相互作用选择的本发明的调节化合物也可以与APP或其它APP片段相互作用。更进一步地，本发明的调节因子化合物的特征可以是与β-淀粉样纤丝结合(该能力可以通过，例如，以下方法被确定：放射性标记上述化合物，将上述化合物与β-淀粉样斑块接触并计数或检测，例如通过影像技术，与β-AP的病理学形式，例如斑块，结合的上述化合物。)，而不显著地改变β-淀粉样纤丝的聚集能力。上述与β-淀粉样纤丝有效结合而不显著改变β-淀粉样纤丝聚集的化合物可以用于，例如，检测β-淀粉样纤丝(例如，如本文进一步所描述的，用于诊断目的)。但是，应当理解，特定化合物与β-淀粉样纤丝结合和/或调节其聚集的能力可以根据上述化合物的浓度而不同。因此，在低浓度时与β-淀粉样纤丝结合不改变其聚集的化合物，在较高浓度时可能抑制上述纤丝的聚集。所有上述具有与β-淀粉样纤丝结合和/或调节该纤丝聚集性质的化合物将包括在在本发明中。
在本文使用时，β-淀粉样聚集的“调节因子”用来指一种剂，该剂与β-淀粉样肽接触时，改变天然β-淀粉样肽的聚集。术语“β-淀粉样肽的聚集”是指一个过程，在该过程中上述肽相互结合形成多聚体，大部分是不溶的复合体。术语“聚集”进一步用来包括β-淀粉样纤丝的形成，还包括β-淀粉样斑块。
在本文中互换使用的术语“天然β-淀粉样肽”，“天然β-AP”以及“天然Aβ肽”包括β-淀粉样前体蛋白(APP)的天然存在的蛋白水解切割产物，上述前体蛋白与β-AP聚集和β-淀粉样变性病有关。这些天然肽包括具有39-43个氨基酸的β-淀粉样肽(即，Aβ1 -39，Aβ1-40，Aβ1-41，Aβ1-42和Aβ1-43)。天然β-AP的氨基末端氨基酸残基相应于770氨基酸残基形式(“APP-770”)的淀粉样前体蛋白的672位天冬氨酸残基。天然β-AP的43氨基酸形式具有氨基酸序列DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIAT(也在SEQID NO：1中列出)，而较短的形式在羧基末端被除去了1-4个氨基酸残基。APP-770从672位(即，天然β-AP的氨基末端)到C-末端终点(103氨基酸)的氨基酸序列在SEQ ID NO：2中列出。本文所描述的用于聚集检测的天然β-AP的优选形式为Aβ1-40或Aβ1-42。
在存在本发明的调节因子的情况下，天然β-淀粉样肽的聚集被“改变”或“调节”。术语“改变”或“调节”的各种形式将包括对β-AP聚集的抑制和对β-AP聚集的促进。与无调节因子的情况相比，当β-AP聚集的量和/或速率在存在调节因子的情况下降低时，天然β-AP的聚集被“抑制”。术语“抑制”的各种形式将包括对β-AP聚集的完全的和部分的抑制。利用实施例部分所描述的聚集检测方法，可以通过聚集滞后时间增加的倍数或聚集的整体平台水平(即，聚集的总量)的降低，对聚集的抑制作用进行定量。在各种实施方案中，本发明的调节因子使聚集滞后时间增加至少1.2倍，1.5倍，1.8倍，2倍，2.5倍，3倍，4倍或5倍，例如，当上述化合物与β-AP摩尔比为1时。在其它的各种实施方案中，本发明的调节因子对聚集的平台水平的抑制至少10％，20％，30％，40％，50％，75％或100％。
抑制β-AP聚集的调节因子(“抑制性调节因子化合物”)可以被用于阻止或延缓β-淀粉样沉积的开始。优选地，本发明的抑制性调节因子化合物抑制天然Aβ肽神经毒性聚集物的形成和/或活性(即，上述抑制化合物可以用于抑制β-AP的神经毒性)。此外，本发明的抑制化合物可以减少预先形成的β-AP聚集物的神经毒性，这意味着上述异质性调节因子可以与预先形成的Aβ纤丝或可溶性的聚集物结合并调节它们固有的神经毒性，或者上述调节因子能够干扰单体和聚集形式的β-AP之间的平衡，并有利于无神经毒性的形式。
替代地，在另一个实施方案中，本发明的调节因子化合物促进天然Aβ肽的聚集。术语“促进”的各种形式指与无调节因子时β-AP的聚集量和/或速率相比，β-AP聚集的量和/或速率在存在调节因子的情况下升高了。上述促进Aβ聚集的化合物被称为刺激性调节因子化合物。刺激性调节因子化合物可以用于捕获β-淀粉样肽，例如在β-AP的聚集无害的生物区隔(biological compartment)中捕获β-AP，从而耗尽β-AP的聚集有害的生物区隔中的β-AP。进而，刺激性调节因子化合物可以被用来促进体外聚集检测中的Aβ聚集(例如，在实施例2中所描述的检测)，例如在可能抑制或逆转Aβ聚集的待测化合物的筛选检测中(即，刺激性调节因子化合物可以作为“晶种”促进Aβ聚集的形成)。
在一个优选的实施方案中，本发明的调节因子在与摩尔量过量的β-AP接触时能够改变β-AP的聚集。“摩尔量过量的β-AP”指天然β-AP的在摩尔浓度比上述调节因子的摩尔浓度大。例如，如果调节因子和β-AP的浓度都为1μM，它们被称为是“等摩尔”的，如果调节因子的浓度为1μM而β-AP的浓度为5μM，β-AP被称为是上述调节因子的5倍摩尔量过量。在优选的实施方案中，当天然β-AP至少是调节因子浓度的2倍，3倍或5倍摩尔量过量时，本发明的调节因子能有效地改变天然β-AP的聚集。在其他的实施方案中，当天然β-AP至少是调节因子浓度的10倍，20倍或33倍，50倍，100倍，500倍或1000倍摩尔量过量时，本发明的调节因子能有效地改变天然β-AP的聚集。
在本文中使用时，在本发明的调节因子中所使用的术语“完全由D-氨基酸组成的β-淀粉样肽”用于包括具有与APP中的天然序列完全相同的氨基酸序列，以及具有在天然序列上可接受的氨基酸替换的，但由D氨基酸，而不是天然β-AP中所存在的天然L-氨基酸，组成的肽。可接受的氨基酸替换为不影响和/或可能改善含D-氨基酸的肽改变天然β-AP聚集能力的氨基酸替换。并且，特定的氨基酸替换可能进一步贡献上述肽改变天然β-AP聚集的能力，和/或可能赋予该肽其他的有利特性(例如，提高可溶性，降低与其它淀粉样蛋白的结合，等等)。和亲本肽具有相同的氨基酸序列，但其中所有的L-氨基酸都被所有的D-氨基酸取代的肽也被称为“反”化合物。例如，如果亲本肽是Thr-Ala-Tyr，其反形式为D-Thr-D-Ala-D-Tyr。
在本文中使用时，用于本发明的调节因子的术语“β-淀粉样肽的逆反异构体”是用来包括如下肽，在这些肽中氨基酸序列和天然β-AP中的序列相比是逆向的，并且所有的L-氨基酸都被置换成D-氨基酸。例如，如果亲本肽是Thr-Ala-Tyr，其逆反形式是D-Tyr-D-Ala-D-Thr。与亲本肽相比，逆反肽具有逆向的骨架，而基本上保留了侧链的原始空间构象，使得逆反异构体的拓扑学和亲本肽的非常相似。参见Goodman et al.″Perspectives In PeptideChemistry″pp283-294(1981)。“逆反”肽的进一步描述也参见Sisto的美国专利第4,522,752号。
本发明的调节因子的各种其它方面及其应用，在以下的分部中详细描述。I.调节因子化合物
在一个实施方案中，本发明的调节因子化合物含有β-淀粉样肽，该β-淀粉样肽完全由D-氨基酸组成，其中该化合物与天然β-淀粉样肽接触时与天然β-淀粉样肽结合或调节其聚集或抑制天然β-淀粉样肽的神经毒性。优选地，上述调节因子的β-淀粉样肽由3-20个D-氨基酸组成，更优选地3-10个D-氨基酸，甚至更为优选地，3-5个D-氨基酸。在优选的实施方案中，本发明上述化合物中的一个苯丙氨酸被替换为一个苯丙氨酸类似物，该类似物更稳定，并更不易于，例如，氧化代谢。
在一个实施方案中，上述调节因子的β-淀粉样肽是进行氨基末端修饰的，例如，被含有烷基基团如C1-C6的低级烷基基团的修饰基团修饰，上述低级烷基基团如甲基，乙基或丙基基团；或环形的，杂环形的多环形的或分枝的烷基基团。适当的N末端修饰基团的例子在分部II里进一步描述。在另一个实施方案中，上述调节因子的β-淀粉样肽是羧基末端修饰的，例如该调节因子可以含有肽酰胺，烷基肽或芳基酰胺(例如，肽苯乙基酰胺)或肽醇。适当的C-末端修饰基团的例子进一步在下文的分部II和III里描述。上述调节因子的β-淀粉样肽可以被修饰以增强该调节因子改变β-AP聚集或神经毒性的能力。另加地或替代地，上述调节因子的β-淀粉样肽可以被修饰，以改变该调节因子的药物动力学和/或用可探测的物质标记该调节因子(在下文的分部III里进一步描述)。
在另一个实施方案中，本发明的调节因子化合物含有β-淀粉样肽的逆反异构体，其中该化合物与天然β-淀粉样肽接触时与天然β-淀粉样肽结合或调节其聚集或抑制天然β-淀粉样肽的神经毒性。优选地，上述β-淀粉样肽的逆反异构体由3-20个D-氨基酸组成，更优选地3-10个D-氨基酸，甚至更为优选地，3-5个D-氨基酸。在优选的实施方案中，本发明上述化合物中的苯丙氨酸被替换为苯丙氨酸类似物，这些类似物更稳定，并更不易于，例如，氧化代谢。
在一个实施方案中，上述逆反异构体是进行氨基末端修饰的，例如，被含有烷基基团如C1-C6的低级烷基基团的修饰基团修饰，上述低级烷基基团如甲基，乙基或丙基基团；或环形的，杂环形的多环形的或分枝的烷基基团。适当的N末端修饰基团的例子在分部II里进一步描述。在另一个实施方案中，上述逆反异构体是羧基末端修饰的，例如可以酰胺，烷基或芳基酰胺(例如，苯乙基酰胺)或羟基(即肽酸的还原产物，生成肽醇)修饰。适当的C-末端修饰基团的例子进一步在下文的分部II和III里描述。上述逆反异构体可以被修饰以增强该调节因子改变β-AP聚集或神经毒性的能力。另加地或替代地，上述逆反异构体可以被修饰，以改变该调节因子的药物动力学和/或用可探测的物质标记该调节因子(在下文的分部III里进一步描述)。
在另一个实施方案中，本发明的调节因子化合物包括含有完全或部分D-氨基酸的β-淀粉样肽，β-淀粉样肽的反异构体，或与肼部分连接的β-淀粉样肽的逆反异构体，其中，当该化合物与天然β-淀粉样肽接触时，该化合物与天然β-淀粉样肽结合，或调节其聚集或抑制天然β-淀粉样肽的神经毒性。优选地，本发明的调节因子化合物由1-20个与肼部分连接的D-氨基酸组成，更优选地1-10个与肼部分连接的D-氨基酸，甚至更优选地1-5个与肼部分连接的D-氨基酸，最优选地2-4个与肼部分连接的D氨基酸。
在一个实施方案中，含有肼部分的本发明的调节因子化合物是进行氨基末端修饰的，例如，被含有烷基基团如C1-C6的低级烷基基团的修饰基团修饰，上述低级烷基基团如甲基，乙基或丙基基团。适当的N末端修饰基团的例子在分部II里进一步描述。在另一个实施方案中，上述含有肼部分的本发明的调节因子化合物用如乙酰基进行羧基末端修饰。适当的C-末端修饰基团的例子进一步在下文的分部II和III里描述。上述含有肼部分的本发明的调节因子化合物可以被修饰以增强该调节因子改变β-AP聚集或神经毒性的能力。另加地或替代地，上述含有肼部分的本发明的调节因子化合物可以被修饰，以改变该调节因子的药物动力学和/或用可探测的物质标记该调节因子(在下文的分部III里进一步描述)。
本发明的调节因子优选地是根据天然β-AP的亚区域的氨基酸序列设计的。术语“天然β-淀粉样肽的亚区域”将包括去除了氨基末端和/或羧基末端部分的天然β-AP。术语“天然β-AP的亚区域”不包括全长的天然β-AP(即，“亚区域”不包括Aβ1-39，Aβ1-40，Aβ1 -41，Aβ1-42，Aβ1-43)。优选的天然β-淀粉样肽的亚区域是“Aβ聚集核心结构域”(ACD)。在本文使用时，术语“Aβ聚集核心结构域”是指天然β-淀粉样肽的一个亚区域，当L-氨基酸形式的上述亚区域被适当修饰(例如，在氨基末端修饰)时，足以调节天然β-APs的聚集，如美国专利申请系列号08/548,998和美国专利申请系列号08/616,081中所详细描述，上述每项申请的全部内容明确地在此引入作为参考。优选地，上述ACD所仿效的天然β-AP亚区域的长度少于15个氨基酸，并且更优选地长度为3-10个氨基酸。在各种实施方案中，上述ACD所仿效的β-AP亚区域的长度为10，9，8，7，6，5，4或3个氨基酸。在一个实施方案中，ACD所仿效的β-AP亚区域是β-AP的内部或羧基末端区域(即在1位氨基酸的氨基末端的下游)。在另一个实施方案中，ACD所仿效的β-AP亚区域是疏水性的。如本文所描述，优选的Aβ聚集核心区域含有天然β-AP氨基酸残基17-20或17-21(分别为Aβ17-20和Aβ17-21)或其类似物。Aβ17-20和Aβ17-21的氨基酸序列分别为Leu-Val-Phe-Phe(SEQ ID NO：3)和Leu-Val-Phe-Phe-Ala(SEQ ID NO：4)。
如实施例中所显示，根据Aβ17-20和Aβ17-21的氨基酸序列设计的含D-氨基酸的调节因子是Aβ聚集的特别有效的抑制剂，并表现出增强的生物稳定性和延长的升高的血浆水平。这些调节因子可以含有一段D-氨基酸序列，该D-氨基酸序列相应于Aβ17-20和Aβ17-21的L-氨基酸序列，或一段D-氨基酸序列，该D-氨基酸序列为Aβ17-20和Aβ17-21的L-氨基酸序列的反异构体，或一段D-氨基酸序列，该D-氨基酸序列为Aβ17-20和Aβ17-21的L-氨基酸序列的逆反异构体，或一段D-氨基酸序列，该D-氨基酸序列为Aβ17-20和Aβ17-21的L-氨基酸序列的拼凑或替换形式。在优选的实施方案中，根据Aβ17-20和Aβ17-21的氨基酸序列设计的调节因子中的一个苯丙氨酸被替换为一个苯丙氨酸类似物，该类似物更稳定，并更不易于，例如，氧化代谢。在其它优选的实施方案中，上述根据Aβ17-20和Aβ17-21的氨基酸序列设计的调节因子进而含有肼部分。
基于D-氨基酸的调节因子可以具有未修饰的氨基和/或羧基末端和/或酰胺末端，或替代地，其氨基末端，羧基末端或两者可以被修饰(下文进一步描述)。有效调节因子的肽结构通常为疏水性的，其特征为存在至少两个独立选自D-亮氨酸结构，D-苯丙氨酸结构和D-丙氨酸结构的D-氨基酸结构。如本文中所使用，术语“D-氨基酸结构”(如“D-亮氨酸结构”，“D-苯丙氨酸结构”或“D-丙氨酸结构”)是用来包括保持该化合物功能活性的D-氨基酸，及其D-氨基酸的类似物，衍生物和模拟物(下文详细描述)。例如，术语“D-苯丙氨酸结构”用来包括D-苯丙氨酸以及D-环己基丙氨酸[D-Cha]，D-4-氟苯丙氨酸(对-氟苯丙氨酸){[p-F]f或D-[p-F]Phe}，D-五氟苯丙氨酸{[F5]f或D-[F5]Phe}，氯苯丙氨酸，溴苯丙氨酸，硝基苯丙氨酸，D-吡啶基丙氨酸，D-高苯丙氨酸，甲基酪氨酸，和苯甲基丝氨酸，以及用D-赖氨酸结构，D-缬氨酸结构，或D-亮氨酸结构取代的取代物。术语“D-亮氨酸结构”用来包括D-亮氨酸，以及用D-缬氨酸，D-异亮氨酸，或其它天然或非天然的具有脂肪族侧链的氨基酸，例如，D-正亮氨酸，或D-正缬氨酸取代的取代物。术语“D-缬氨酸结构”用来包括D-缬氨酸，以及用D-亮氨酸或其它天然或非天然的具有脂肪族侧链的氨基酸取代的取代物。
在其它实施方案中，调节因子的肽结构包括至少两个独立地选自D-亮氨酸结构，D-苯丙氨酸结构，D-缬氨酸结构，D-丙氨酸结构，D-酪氨酸结构，D-碘酪氨酸结构，D-赖氨酸结构的D-氨基酸结构。在另一个实施方案中，上述肽结构包括至少三个独立地选自D-亮氨酸结构，D-苯丙氨酸结构和D-缬氨酸结构的D-氨基酸结构。在另一个实施方案中，肽结构包括至少三个独立地选自D-亮氨酸结构，D-苯丙氨酸结构和D-缬氨酸结构，D-丙氨酸结构，D-酪氨酸结构，D-碘酪氨酸结构，和D-赖氨酸结构的D-氨基酸结构。在另一个实施方案中，肽结构包括至少四个独立地选自D-亮氨酸结构，D-苯丙氨酸结构和D-缬氨酸结构的D-氨基酸结构。在另一个实施方案中，肽结构包括至少四个独立地选自D-亮氨酸结构，D-苯丙氨酸结构和D-缬氨酸结构的D-氨基酸结构。在优选的实施方案中，肽结构包括至少一个苯丙氨酸类似物，该类似物比苯丙氨酸更稳定，并更不易于，例如，氧化代谢。
在一个实施方案中，本发明提供了β-淀粉样调节因子化合物，该化合物含有公式(I)：
Figure A0080719200201
其中，Xaa1，Xaa2，Xaa3，Xaa4各为D-氨基酸结构，并且Xaa1，Xaa2，Xaa3，Xaa4中至少有两个独立地选自D-亮氨酸结构，D-苯丙氨酸结构，例如，D-环己基丙氨酸，D-4-氟苯丙氨酸(对-氟苯丙氨酸)，D-五氟苯丙氨酸，氯苯丙氨酸，溴苯丙氨酸，硝基苯丙氨酸，D-高苯丙氨酸，和D-缬氨酸结构；
Y，可以存在或不存在，它是具有公式(Xaa)a的结构，其中，Xaa是任何D-氨基酸结构并且a为1-15的整数；
Z，可以存在或不存在，它是具有公式(Xaa)b的结构，其中，Xaa是任何D-氨基酸结构并且b为1-15的整数；
A，可以存在或不存在，它是直接或间接与化合物连接的修饰基团；并且
n为1-15的整数；
其中，对Xaa1，Xaa2，Xaa3，Xaa4，Y，Z，A和n进行选择，以便当化合物与天然β-淀粉样肽接触时，化合物与β-淀粉样肽结合或调节天然β-淀粉样肽的聚集或抑制其神经毒性，并且化合物更不易于被代谢，例如，氧化代谢。
在此公式的一个亚实施方案中，第五个氨基酸残基，Xaa5，被限定在Xaa4的C末端，并且Z，Z可以存在或不存在，具有公式(Xaa)b的结构，其中，Xaa是任何D-氨基酸结构并且b为1-14的整数。因此，本发明提供了β-淀粉样调节因子化合物，其包含公式(II)：
Figure A0080719200211
其中，b为1-14的整数。
在一个优选的实施方案中，公式(I)中的Xaa1，Xaa2，Xaa3，Xaa4的选择是根据Aβ17-20，或其可接受的取代物的序列。因此，在优选的实施方案中，Xaa1是D-丙氨酸结构或D-亮氨酸结构，Xaa2是D-缬氨酸结构或D-苯丙氨酸结构，Xaa3是D-苯丙氨酸结构，例如，D-环己基丙氨酸，D-4-氟苯丙氨酸(对-氟苯丙氨酸)，D-五氟苯丙氨酸，氯苯丙氨酸，溴苯丙氨酸，硝基苯丙氨酸和D-高苯丙氨酸，D-酪氨酸结构，D-碘酪氨酸结构或D-赖氨酸结构，Xaa4是D-苯丙氨酸结构，例如，D-环己基丙氨酸，D-4-氟苯丙氨酸(对-氟苯丙氨酸)，D-五氟苯丙氨酸，氯苯丙氨酸，溴苯丙氨酸，硝基苯丙氨酸和D-高苯丙氨酸，D-酪氨酸结构，D-碘酪氨酸结构或D-赖氨酸结构。
在另一个优选的实施方案中，公式(II)中的Xaa1，Xaa2，Xaa3，Xaa4，Xaa5的选择是根据Aβ17-21，或其可接受的取代物的序列。因此，在优选的实施方案中，Xaa1是D-丙氨酸结构或D-亮氨酸结构，Xaa2是D-缬氨酸结构，Xaa3是D-苯丙氨酸结构，例如，D-环己基丙氨酸，D-4-氟苯丙氨酸(对-氟苯丙氨酸)，D-五氟苯丙氨酸，氯苯丙氨酸，溴苯丙氨酸，硝基苯丙氨酸和D-高苯丙氨酸，D-酪氨酸结构，D-碘酪氨酸结构或D-赖氨酸结构，Xaa4是D-苯丙氨酸结构，例如，D-环己基丙氨酸，D-4-氟苯丙氨酸(对-氟苯丙氨酸)，D-五氟苯丙氨酸，氯苯丙氨酸，溴苯丙氨酸，硝基苯丙氨酸，D-吡啶丙氨酸和D-高苯丙氨酸，D-酪氨酸结构，D-碘酪氨酸结构或D-赖氨酸结构，Xaa5是D-丙氨酸结构或D-亮氨酸结构。
在另一个优选的实施方案中，公式(I)中的Xaa1，Xaa2，Xaa3，Xaa4的选择是根据Aβ17-20的逆反异构体或其可接受的取代物。因此，在优选的实施方案中，Xaa1是D-丙氨酸结构D-亮氨酸结构或D-苯丙氨酸结构，例如，D-环己基丙氨酸，D-4-氟苯丙氨酸(对-氟苯丙氨酸)，D-五氟苯丙氨酸，氯苯丙氨酸，溴苯丙氨酸，硝基苯丙氨酸和D-高苯丙氨酸，D-酪氨酸结构，D-碘酪氨酸结构，D-亮氨酸结构，D-缬氨酸结构或D-赖氨酸结构；Xaa2是D-苯丙氨酸结构，例如，D-环己基丙氨酸，D-4-氟苯丙氨酸(对-氟苯丙氨酸)，D-五氟苯丙氨酸，氯苯丙氨酸，溴苯丙氨酸，硝基苯丙氨酸D-吡啶丙氨酸和D-高苯丙氨酸，D-酪氨酸结构，D-碘酪氨酸结构，或D-赖氨酸结构；Xaa3是D-苯丙氨酸结构，例如，D-环己基丙氨酸，D-4-氟苯丙氨酸(对-氟苯丙氨酸)，D-五氟苯丙氨酸，氯苯丙氨酸，溴苯丙氨酸，硝基苯丙氨酸，D-吡啶丙氨酸，和D-高苯丙氨酸，D-酪氨酸结构，D-碘酪氨酸结构或D-赖氨酸结构；Xaa4是D-缬氨酸结构或D-亮氨酸结构。
在另一个优选的实施方案中，公式(II)中的Xaa1，Xaa2，Xaa3，Xaa4，Xaa5的选择是根据Aβ17-21的逆反异构体，或其可接受的取代物。因此，在优选的实施方案中，Xaa1是D-丙氨酸结构或D-亮氨酸结构或D苯丙氨酸结构，例如，D-环己基丙氨酸，D-4-氟苯丙氨酸(对-氟苯丙氨酸)，D-五氟苯丙氨酸，氯苯丙氨酸，溴苯丙氨酸，硝基苯丙氨酸，D-吡啶丙氨酸，和D-高苯丙氨酸，D-酪氨酸结构，D-碘酪氨酸结构或D-赖氨酸结构；Xaa2是D-苯丙氨酸结构，例如，D-环己基丙氨酸，D-4-氟苯丙氨酸(对-氟苯丙氨酸)，D-五氟苯丙氨酸，氯苯丙氨酸，溴苯丙氨酸，硝基苯丙氨酸，D-吡啶丙氨酸，和D-高苯丙氨酸，D-酪氨酸结构，D-碘酪氨酸结构或D-赖氨酸结构；Xaa3是D-苯丙氨酸结构，例如，D-环己基丙氨酸，D-4-氟苯丙氨酸(对-氟苯丙氨酸)，D-五氟苯丙氨酸，氯苯丙氨酸，溴苯丙氨酸，硝基苯丙氨酸，D-吡啶丙氨酸，和D-高苯丙氨酸，D-酪氨酸结构，D-碘酪氨酸结构或D-赖氨酸结构；Xaa4是D-缬氨酸结构或D亮氨酸结构；Xaa5是D-亮氨酸结构。
在另一个优选的实施方案中，本发明提供了含有公式(III)的β-淀粉样调节因子化合物：
其中Xaa1和Xaa2各为D-氨基酸结构，并且Xaa1和Xaa2中至少两个独立地选自D-亮氨酸结构，D-苯丙氨酸结构，例如，D-环己基丙氨酸，D-4-氟苯丙氨酸(对-氟苯丙氨酸)，D-五氟苯丙氨酸，氯苯丙氨酸，溴苯丙氨酸，硝基苯丙氨酸，D-高苯丙氨酸，D-酪氨酸结构，D-碘酪氨酸结构，D-赖氨酸结构或D-缬氨酸结构；
NH-NH是肼结构；
Y，可以存在或不存在，它是具有公式(Xaa)a的结构，其中，Xaa是任何D-氨基酸结构并且a为1-15的整数；
Xaa1’，Xaa2’，Xaa3’，可以存在或不存在，各为D-氨基酸或L-氨基酸结构并且Xaa1’，Xaa2’，Xaa3’中至少有两个独立地选自D-或L-亮氨酸结构，D-或L-苯丙氨酸结构，例如，D-环己基丙氨酸，D-4-氟苯丙氨酸(对-氟苯丙氨酸)，D-五氟苯丙氨酸，氯苯丙氨酸，溴苯丙氨酸，硝基苯丙氨酸，和D-高苯丙氨酸，D-或L-酪氨酸结构，D-或L-碘酪氨酸结构，D-或L-赖氨酸结构或D-或L-缬氨酸结构；
Z，可以存在或不存在，它是具有公式(Xaa)b的结构，其中，Xaa是任何D-氨基酸结构并且b为1-15的整数；
A，可以存在或不存在，它是直接或间接与化合物连接的修饰基团；并且
n为1-15的整数；
其中，对Xaa1，Xaa2，Xaa1’，Xaa2’，Xaa3’，Y，Z，A和n进行选择，以便当化合物与天然β-淀粉样肽接触时，化合物与β-淀粉样肽结合或调节天然β-淀粉样肽的聚集或抑制其神经毒性，并且化合物更不易于被代谢，例如，氧化代谢。
具有以上公式(I)，(II)，或(III)的本发明的调节因子中，一个可选的修饰基团(“A”)直接或间接地与调节因子的肽结构连接。(在本文使用时，术语“调节基团”和“修饰基团”可以互换使用，用于描述直接或间接地与肽结构连接的化学基团)。例如，修饰基团可以通过共价偶联直接与肽结构连接或通过稳定的非共价结合间接地与肽结构连接。在本发明的一个实施方案中，修饰基团与调节因子的氨基末端连接。替代地，在本发明的另一个实施方案中，修饰基团与调节因子的羧基末端连接。在其它实施方案中，修饰基团同时与调节因子的氨基和羧基末端连接。在另一个实施方案中，修饰基团与调节因子肽结构的至少一个氨基酸残基的侧链连接(例如，通过赖氨酸残基的ε-氨基，通过天冬氨酸残基或谷氨酸残基的羧基，通过酪氨酸残基，丝氨酸残基或苏氨酸残基的羟基或其它在氨基酸侧链的合适的反应基团)。
在存在修饰基团的情况下，对修饰基团进行选择，以便当化合物与天然β-淀粉样肽接触时化合物抑制天然β-淀粉样肽的聚集。因此，由于化合物的β-AP肽从其天然状态被修饰，本文所使用的修饰基团“A”不包括氢。在本发明的调节因子中，单个修饰基团或多个修饰基团可以与肽结构连接。选择修饰基团的数目，以便当化合物与天然β-淀粉样肽接触时，化合物抑制天然β-淀粉样肽的聚集。但是，n优选地为1-60之间的整数，更优选地为1-30之间的整数，并且甚至更优选地为1-10或1-5之间的整数。在一个优选的实施方案中，A是含有环状的，杂环的，多环的，直线的或分枝的烷基的氨基末端修饰基团，并且n＝1。在其它优选的实施方案中，A是含有氨基，烷基，芳基氨基或羟基的羧基末端修饰基团，并且n＝1。在下文的II和III分部进一步描述合适的修饰基团。
在特定的优选实施方案中，本发明提供了一种含有肽结构的β-淀粉样调节因子化合物，上述肽结构选自：
(D-Leu-D-Val-D-Phe-D-Cha-D-Leu)(SEQ ID NO：5)；(D-Leu-D-Val-D-Cha-D-Phe-
D-Leu)(SEQ ID NO：6)；(D-Leu-D-Val-D-Phe-D-[p-F]Phe-D-Leu)(SEQ ID NO：7)；(D-
Leu-D-Val-D-[P-F]Phe-D-Phe-D-Leu)(SEQ ID NO：8)；(D-Leu-D-Val-D-Phe-D-[F-
5]Phe-D-Leu)(SEQ ID NO：9)；(D-Leu-D-Val-D-[F5]Phe-D-Phe-D-Leu)(SEQ ID
NO：10)；(D-Leu-D-Phe-D-Cha-D-Val-D-Leu)(SEQ ID NO：11)；(D-Leu-D-Phe-D-[p-
F]Phe-D-Val-D-Leu)(SEQ ID NO：12)；D-Leu-D-Phe-D-[F5]Phe-D-Val-D-Leu)(SEQ
ID NO：13)；(D-Leu-D-Phe-D-Lys-D-Val-D-Leu)(SEQ ID NO：14)；(D-Leu-D-Cha-D-
Phe-D-Val-D-Leu)(SEQ ID NO：15)；(D-Leu-D-[p-F]Phe-D-Phe-D-Val-D-Leu)(SEQ
ID NO：16)；(D-Leu-D-[F5]Phe-D-Phe-D-Val-D-Leu)(SEQ ID NO：17)；(D-Leu-D-Lys-
D-Phe-D-Val-D-Leu)(SEQ ID NO：18)；(D-Leu-D-Cha-D-Cha-D-Val-D-Leu)(SEQ ID
NO：19)；(D-Leu-D-Val-D-Cha-D-Cha-D-Leu)(SEQ ID NO：20)；(D-Leu-D-[p-F]Phe-D-
[p-F]Phe-D-Val-D-Leu)(SEQ ID NO：21)；(D-Leu-D-Val-D-[p-F]Phe-D-[p-F]Phe-D-
Leu)(SEQ ID NO：22)；(D-Leu-D-[F5]Phe-D-[F5]Phe-D-Val-D-Leu)(SEQ ID NO：23)；
(D-Leu-D-Val-D-[F5]Phe-D-[F5]Phe-D-Leu)(SEQ ID NO：24)；(D-Leu-D-Val-D-Phe)
(SEQ D NO：25).
任何上述特定的肽结构可以是氨基末端和/或羧基末端被修饰的，并且在下文的II和/或III分部被进一步描述。
本发明的特别优选的调节因子包括如下：N，N-二甲基-(Gly-D-Ala-D-Phe-D-Phe-D-Val-D-Leu)-NH2；N，N-二甲基-(D-Ala-D-Phe-D-Phe-D-Val-D-Leu)-NH2；N-甲基-(Gly-D-Ala-D-Phe-D-Phe-D-Val-D-Leu)-NH2；N-乙基-(Gly-D-Ala-D-Phe-D-Phe-D-Val-D-Leu)-NH2；N-异丙基-(Gly-D-Ala-D-Phe-D-Phe-D-Val-D-Leu)-NH2；H-(D-Leu-D-Val-D-Phe-D-Phe-D-Ala)-异丙酰胺；H-(D-Leu-D-Val-D-Phe-D-Phe-D-Ala)-二甲酰胺；N，N-二乙基-(Gly-D-Ala-D-Phe-D-Phe-D-Val-D-Leu)-NH2；N，N-二乙基-(D-Ala-D-Phe-D-Phe-D-Val-D-Leu)-NH2；N，N-二甲基-(D-Leu-D-Val-D-Phe-D-Phe-D-Leu)-NH2；N，N-二甲基-(D-Leu-D-Val-D-Phe-D-Phe-D-Leu)-NH2；N，N-二甲基-(D-Leu-D-Phe-D-Phe-D-Val-D-Leu)-NH2；H-(Gly-D-Leu-D-Val-D-Phe-D-Phe-D-Leu)-NH2；N-乙基-(Gly-D-Leu-D-Val-D-Phe-D-Phe-D-Leu)-NH2；N-乙基-(Gly-D-Leu-D-Phe-D-Phe-D-Val-D-Leu)-NH2；N-甲基-(D-Leu-D-Phe-D-Phe-D-Val-D-Leu)-NH2；N-乙基-(D-Leu-D-Val-D-Phe-D-Phe-D-Leu)-NH2；N-丙基-(D-Leu-D-Val-D-Phe-D-Phe-D-Leu)-NH2；N，N-二乙基-(Gly-D-Leu-D-Val-D-Phe-D-Phe-D-Leu)-NH2；H-(D-Ile-D-Val-D-Phe-D-Phe-D-Ile)-NH2；H-(D-Ile-D-Val-D-Phe-D-Phe-D-Ala-)-NH2；H-(D-Ile-D-Ile-D-Phe-D-Phe-D-Ile)-NH2；H-(D-Nle-D-Val-D-Phe-D-Phe-D-Ala-)-NH2；H-(D-Nle-D-Val-D-
Phe-D-Phe-D-Nle)-NH2；1-哌啶-乙酰基-(D-Leu-D-Val-D-Phe-D-Phe-D-Leu)-NH2；
1-哌啶-乙酰基-(D-Leu-D-Phe-D-Phe-D-Val-D-Leu)-NH2；H-D-Leu-D-Val-D-Phe-
D-Phe-D-Leu-异丙酰胺；H-D-Leu-D-Phe-D-Phe-D-Val-D-Leu-异丙酰胺；
H-(D-Leu-D-Val-D-Phe-D-Phe-D-Leu)-甲酰胺；H-(D-Leu-D-Phe-D-Phe-D-Val-
D-Leu)-甲酰胺；H-(D-Leu-D-Val-D-Phe-D-Phe-D-Leu)-OH；N-甲基-(D-Leu-
D-Val-D-Phe-D-Phe-D-Leu)-NH2；H-(D-Leu-D-Val-D-Phe-D-Cha-D-Leu)-NH2；H-(D-
Leu-D-Val-D-Phe-D-[p-F]Phe-D-Leu)-NH2；H-(D-Leu-D-Val-D-Phe-D-[F5]Phe-D-
Leu)-NH2；H-(D-Leu-D-Phe-D-Cha-D-Val-D-Leu)-NH2；H-(D-Leu-D-Phe-D-[p-F]Phe-
D-Val-D-Leu)-NH2；H-(D-Leu-D-Phe-D-[F5]Phe-D-Val-D-Leu)-NH2；H-(D-Leu-D-
Phe-D-Lys-D-Val-D-Leu)-NH2；H-(D-Leu-D-Cha-D-Phe-D-Val-D-Leu)-NH2；H-(D-
Leu-D-[p-F]Phe-D-Phe-D-Val-D-Leu)-NH2；H-(D-Leu-D-[F5]Phe-D-Phe-D-Val-D-
Leu)-NH2；H-(D-Leu-D-Lys-D-Phe-D-Val-D-Leu)-NH2；H-(D-Leu-D-Cha-D-Cha-D-
Val-D-Leu)-NH2；H-(D-Leu-D-[p-F]Phe-D-[p-F]Phe-D-Val-D-Leu)-NH2；H-(D-Leu-D-
[F5]Phe-D-[F5]Phe-D-Val-D-Leu)-NH2；H-(D-Leu-D-Lys-D-Lys-D-Val-D-Leu)-NH2；
N-甲基-(D-Leu-D-Val-D-Phe-D-Cha-D-Leu)-NH2；N-甲基-(D-Leu-D-Val-D-Phe-
D-[p-F]Phe-D-Leu)-NH2；N-甲基-(D-Leu-D-Val-D-Phe-D-[F5]Phe-D-Leu)-NH2；H-
D-Leu-D-Val-D-Phe-NH-(H-D-Leu-D-Val-D-Phe-)NH；H-D-Leu-D-Val-D-Phe-NH-
NH-COCH3；和H-D-Leu-D-Val-D-Phe-NH-NH2.
本发明的甚至更优选的化合物包括PPI-1319：H-(D-Leu-D-Phe-[p-F]D-Phe-D-Val-D-Leu)-NH2以及PPI：1019：N-methyl-(D-Leu-D-Val-D-Phe-D-Phe-D-Leu)-NH2.(如上文所述，D-Cha代表D-环己基丙氨酸；[p-F]f或D-[p-F]Phe代表D-4-氟苯丙氨酸(也即对-氟苯丙氨酸)；[F5] f或D-[F5]Phe代表D-五氟苯丙氨酸；以及D-Nle代表D-正亮氨酸)。
本发明调节因子的D-氨基酸肽结构进一步用来包括其它，如本文所描述，保持了调节因子改变天然β-AP聚集的能力的肽修饰，包括类似物，衍生物和模拟物。例如，可以对本发明调节因子的D-氨基酸肽结构进一步修饰以增加稳定性，生物药效率，以及溶解性。本文所使用的术语“类似物”，“衍生物”和“模拟物”用来包括模仿D-肽结构的化学结构并保持D-肽结构的功能性的分子。设计肽类似物，衍生物和模拟物的方法在本领域众所周知。例如，参见Farmer，P.S.in Drug Design(E.J.Ariens，ed.)Academic Press，NewYork，1980，vol.10，pp.119-143；Ball.J.B.and Alewood，P.F.(1990)J.Mol.Recognition 3：55；Morgan，B.A.and Gainor，J.A.(1989)Ann.Rep.Med.Chem.24：243；and Feidinger，R.M.(1989)Trends Pharmacol.Sci.10：270。也参见Sawyer，T.K.(1995)″Peptidomimetic Design and Chemical Approaches to PeptideMetabolism″in Taylor，M.D.and Amidon，G.L.(eds.)Peptide-based Drug Design：Controlling Transport andMetabolism，Chapter 17；Smith，A.B.3rd，et al.(1995)J.Am.Chem.Soc.117：11113-11123；Smith，A.B.3rd，et al.(1994)J.Am Chem.Soc.116：9947-9962；and Hirschman，R.，et al.(1993)J.Am.Chem.Soc.115：12550-12568。
在本文使用时，化合物X(例如，肽或氨基酸)的“衍生物”是指X的一种形式，在该形式中，化合物的一个或多个反应基团被取代基团衍生化。肽衍生物的例子包括氨基酸侧链，肽主链，或氨基或羧基末端被衍生化的肽(例如，甲基化酰胺连接的肽化合物)。在本文使用时的化合物X的“类似物”是指一种化合物，该化合物保持X的功能活性所必需的化学结构并含有某些与X不同的化学结构。天然肽的类似物的例子是包括一个或多个非天然存在的氨基酸的肽。在本文使用时，化合物X的“模拟物”是指一种化合物，在该化合物中，X的功能活性所必需的化学结构被其它模拟X构象的化学结构取代。肽模拟物的例子包括肽主链被一个或多个苯二氮杂分子取代的肽化合物(参见例如，James，G.L.et al.(1993)Science 260：1937-1942)。
本发明的调节因子化合物的类似物用来包括一个或多个D-氨基酸被同源的氨基酸取代并保持原始调节因子的性质的化合物。优选地，保守氨基酸取代在一个或多个氨基酸残基进行。“保守氨基酸取代”是指氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基取代。在本领域中，已经定义了具有相似侧链的氨基酸残基家族，包括碱性侧链(例如，赖氨酸，精氨酸，组氨酸)，酸性侧链(例如，天冬氨酸，谷氨酸)，中性极性侧链(例如，甘氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺，丝氨酸，苏氨酸，酪氨酸，半胱氨酸)，非极性侧链(例如，丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，脯氨酸，苯丙氨酸，甲硫氨酸，色氨酸)，β-分枝侧链(例如，苏氨酸，缬氨酸，异亮氨酸)以及芳香族侧链(例如，酪氨酸，苯丙氨酸，色氨酸，组氨酸)。在本发明调节因子的肽结构中，可以进行同源取代的非限制性例子包括用D-酪氨酸，D-吡啶丙氨酸或D-高苯丙氨酸取代D-苯丙氨酸，用D-缬氨酸或其它天然或非天然的具有脂肪族侧链的氨基酸取代D-亮氨酸，和/或用D-亮氨酸或其它天然或非天然的具有脂肪族侧链的氨基酸取代D-缬氨酸。
术语模拟物，特别是，肽模拟物，用来包括同电子排列体。在本文使用时，术语“同电子排列体(isostere)”用来包括一种化学结构，该化学结构可以被第二种化学结构取代，因为其立体构象符合第二种结构的特异性结合位点。上述术语特别地包括本领域技术人员众所周知的肽主链修饰(即，酰胺键模拟物)。这些修饰包括酰胺氮，α-碳，酰胺碳的修饰，酰胺键的完全取代，以及延伸，切除或主链交联。已知几种肽主链修饰，包括ψ[CH2S]，ψ[CH2NH]，ψ[CSNH2]，ψ[NHCO]，ψ[COCH2]和ψ[(E)或(Z)CH＝CH]。在以上所用的术语中，ψ表示酰胺键不存在。取代酰胺基团的结构列在括号中。
其它可能的修饰包括N-烷基(或芳基)取代(ψ[CONR])，或主链交联以形成内酰胺以及其它环状结构。本发明调节因子化合物的其它衍生物包括C-末端羟甲基衍生物；O-修饰的衍生物(例如，C-末端羟甲基苯甲基醚)；N-末端修饰的衍生物，包括被取代的酰胺例如烷基酰胺和肼酰胺；以及C-末端苯丙氨酸残基被苯乙基酰胺类似物取代的化合物(例如，Val-Phe-苯乙基酰胺作为三肽Val-Phe-Phe的类似物)。
本发明的调节因子化合物可以被掺入药物组合物中(在下文V分部进一步描述)，并且如下文VI分部所进一步的描述，可以被用于检测和治疗的方法中。II.修饰基团
在某些实施方案中，本发明的调节因子化合物直接或间接地与至少一个修饰基团(简写为MG)偶联。术语“修饰基团”用来包括直接与D-氨基酸肽结构连接的结构(例如，通过共价偶联)，以及间接与肽结构连接的结构(例如，通过稳定的非共价结合或通过与另加的氨基酸残基，或其模拟物，类似物或衍生物共价偶联，上述另加的氨基酸残基，或其模拟物，类似物或衍生物可以与Aβ-衍生的D-氨基酸肽结构侧面相连)。例如，修饰基团可以与Aβ-衍生的D-氨基酸肽结构的氨基末端或羧基末端偶联，或与核心结构域侧面的肽或模拟肽区域偶联。替代地，修饰基团可以与Aβ-衍生的D-氨基酸肽结构至少一个D-氨基酸残基的侧链偶联，或与核心结构域侧面的肽或模拟肽区域偶联(例如，通过赖氨酰残基的ε-氨基基团，通过天冬氨酸残基或谷氨酸残基的羧基，通过酪氨酸残基，丝氨酸残基或苏氨酸残基的羟基或氨基酸侧链上其它合适的反应基团)。可以通过本领域众所周知的连接化学结构的手段和方法，连接D-氨基酸肽结构共价偶联的修饰基团，上述化学结构包括，例如，酰胺，烷基氨基，氨基甲酸盐，脲或酯键。
术语“修饰基团”用来包括不与自然状态的天然Aβ肽天然偶联的基团。因此，术语“修饰基团”不包括氢。选择修饰基团以便当调节因子化合物与天然β-淀粉样肽接触时其改变，优选地抑制，天然β-淀粉样肽的聚集；或者当其与天然β-淀粉样肽接触时它抑制天然β-淀粉样肽的神经毒性。尽管无意于在机制上进行限制，在含有修饰基团的调节因子的实施方案中，该修饰基团被认为是作为增强该调节因子破坏Aβ聚集的能力的关键药效基团起作用的。
在优选的实施方案中，该修饰基团含有烷基基团。在本文中使用时，术语“烷基”指具有1至10个碳原子的直链或支链的碳氢基团。典型的烷基基团包括甲基，乙基，二甲基，二乙基，n-丙基，异丙基，n-丁基，异丁基，2-丁基，叔丁基，n-戊基，和n-己基。烷基基团可以是未取代的，或可以在一个或多个位置被取代，例如用以下基团取代：卤素，烷基，环烷基，烯基，炔基，芳基，杂环，羟基，氨基，硝基，硫醇，胺，亚胺，酰胺，膦酸酯，膦，羰基，羧基，甲硅烷基，醚，硫醚，磺酰基，硒酯(selenoethers)，酮，醛，酯，-CF3，-CN等等。优选的烷基是甲基，乙基，二甲基，二乙基，n-丙基，异丙基。
在另一个实施方案中，一个修饰基团，例如甲基基团，与另一个修饰基团偶联。在另一个实施方案中，用两个修饰基团修饰本发明调节因子化合物中的D-氨基酸。因此，优选的修饰基团包括1-哌啶乙酰基基团。
在一个优选的实施方案中，修饰基团包括环状的，杂环的，多环的或分枝的烷基基团。在本文中使用时，术语“环状基团”用来包括环状的饱和或不饱和(即，芳香族的)基团，该基团具有大约3-10个，优选地大约4-8个，并且更优选地大约5-7个碳原子。典型的环状基团包括环丙基，环丁基，环戊基，环己基和环辛基。环状基团可以是未取代的或在一个或多个环位置被取代。因此，环状基团可以被取代，例如用以下基团取代：卤素，烷基，环烷基，烯基，炔基，芳基，杂环，羟基，氨基，硝基，硫醇，胺，亚胺，酰胺，膦酸酯，膦，羰基，羧基，甲硅烷基，醚，硫醚，磺酰基，硒酯(selenoethers)，酮，醛，酯，-CF3，-CN等等。
术语“杂环基团”用来包括环状的饱和或不饱和(即，芳香族的)基团，该基团具有大约3-10个，优选地大约4-8个，并且更优选地大约5-7个碳原子，其中，环结构包括大约1-4个杂环原子。杂环基团包括吡咯烷，oxolane，thiolane，咪唑，恶唑，哌啶，哌嗪，吗啉和嘧啶。杂环的环可以在一个或多个位置被取代，例如用这些取代物取代：卤素，烷基，环烷基，烯基，炔基，芳基，其它杂环，羟基，氨基，硝基，硫醇，胺，亚胺，酰胺，膦酸酯，膦，羰基，羧基，甲硅烷基，醚，硫醚，磺酰基，硒酯(selenoethers)酮，醛，酯，-CF3，-CN等等。如下文所描述，杂环可以与其它环状基团桥接或融合。
在本文中使用时，术语“多环基团”用来指两个或多个饱和或不饱和(即，芳香族的)的环，在上述环中，两个相邻的环共用两个或多个碳原子，例如，环是“融合的环”。通过非相邻的原子连接的环被称为“桥接”环。多环基团的各个环可以用上文所描述的取代物取代，作为例子如：卤素，烷基，环烷基，烯基，炔基，羟基，氨基，硝基，硫醇，胺，亚胺，酰胺，膦酸酯，膦，羰基，羧基，甲硅烷基，醚，硫醚，磺酰基，硒酯(selenoethers)酮，醛，酯，-CF3，-CN等等。
优选的多环基团是含有顺式十氢化萘结构的基团。尽管无意于在机制上进行限制，但是由于顺式十氢化萘结构的存在所导致的修饰基团的“弯曲”的构象，被认为是参与了修饰基团破坏Aβ聚集的功效。因此，其它模拟顺式十氢化萘“弯曲构象”的结构也可以被用作修饰基团。含有可以被用作修饰基团结构的顺式十氢化萘的例子是胆烷酰基结构，例如cholyl基团。例如，通过聚集核心结构域与胆酸，一种胆汁酸的反应，可以在调节因子化合物的氨基末端修饰上cholyl基团。此外，根据本领域已知的方法可以在调节因子化合物的羧基末端修饰上cholyl基团(参见例如，Wess，G.et al.(1993)Tetrahedron Letters，34：817-822；Wess，G.et al.(1992)Tetrahedron Letters 33：195-198；and Kramer，W.et al.(1992)J.Biol.Chem.267：18598-18604)。Cholyl的衍生物和类似物也可以用作修饰基团。例如，优选的Cholyl的衍生物是具有游离氨基基团的Aic(3-(O-氨乙酸-异)-Cholyl)，上述游离氨基基团可以被进一步用于修饰调节因子化合物(例如，可以通过Aic的游离氨基基团引入一种螯合99mTc的基团)。在本文中使用时，术语“胆烷酰基结构”用来包括cholyl基团及其衍生物和类似物，特别是那些保留了四环的顺式十氢化萘构型的结构。胆烷酰基结构的例子包括源自其它胆汁酸的基团，例如脱氧胆酸，石胆酸，熊脱氧胆酸，鹅脱氧胆酸，和猪脱氧胆酸，以及其它相关的结构，例如胆烷酸，蟾蜍灵和resibufogenin(尽管后两种化合物不是优选地用作修饰基团)。其它含有顺式十氢化萘的化合物的例子是5β-胆烷-3α-ol((+)-二氢胆固醇的顺式十氢化萘异构体)。胆汁酸和其它类固醇结构和命名法的描述参见New，W.R and McKean，M.L.Biochemistry of Steroidsand Other Isopentanoids，University Park Press，Baltimore，MD，Chapter 2。
除了含有顺式十氢化萘的基团外，其他多环基团也可以被用作修饰基团。例如，源自类固醇或β-内酰胺的修饰基团是合适的修饰基团。在一个实施方案中，修饰基团是“生物素基(biotinyl)结构”，该结构包括生物素基基团及其类似物和衍生物(例如2-亚氨基生物素基基团)。在另一个实施方案中，修饰基团可以包括“含有荧光素的基团”，例如源自Aβ-衍生的肽结构与5-(和6-)-羧基荧光素，琥珀酰亚胺酯或荧光素异硫氰酸酯反应的基团。在其它各种实施方案中，修饰基团包括N-乙酰神经氨基团，反式-4-可铁宁(cotinine)羧基基团，2-亚氨基-1-咪唑烷乙酰基基团，(S)-(-)-indoline-2-羧基基团，薄荷氧乙酰基团，2-降冰片烷乙酰基团，γ-氧-5-二氢苊丁酰基基团(-)-2-氧络-4-四氢噻唑羧基基团，四氢-3-呋喃甲酰基团，2-亚氨生物素基基团，二乙烯基三胺五乙酰基基团，4-吗啉羰基基团，2-硫苯乙酰基基团或2-硫苯磺酰基。
除了以上说讨论的环状，杂环和多环基团外，其它类型的修饰基团也可以用于本发明的调节因子。例如，疏水基团和分枝烷基基团可以是适当的修饰基团。例子包括乙酰基基团，苯基乙酰基基团，二苯基乙酰基基团三苯基乙酰基基团，异丁酰基基团，4-甲基戊酰基基团，反式-肉桂酰基基团，丁酰基基团和1-金刚烷羰基基团。
另一种类型的修饰基团是含有作为β-转角模拟物的非天然氨基酸的化合物，例如在Tsang，K.Y.et al.(1994)J.Am.Chem.Soc.116：3988-4005；Diaz，H and Kelly，J.W.(1991)TetrahedronLetters 41：5725-5728；and Diaz.H et al.(1992)J.Am.Chem.Soc.114：8316-8318中所描述的基于二苯并呋喃的氨基酸。这样的基团的一个例子是肽-氨基乙基二苯并呋喃基-proprionic酸(Adp)基团(例如DDIIL-Adp)(SEQ ID NO：31)。这种类型的修饰基团可以进一步含有一个或多个N-甲基肽键，以便在这种类型的化合物和天然β-AP相互作用时引入对天然β-AP聚集的空间位阻。
另一种类型的修饰基团是NH-OR基团，其中R可以是任何本文描述的修饰的或未修饰的烷基或环烷基基团。
适当修饰基团的非限制性例子，以及它们相关的修饰试剂在以下列出：修饰基团                      修饰试剂甲基-                         甲胺，Fmoc-D-[Me]-Leu-OH，
                          甲胺和溴乙酰基肽乙基-                         乙胺，乙醛，氰氢硼化钠(sodium
                          cyanoborohydride)，乙胺和溴乙酰
                          基肽丙基-                         丙胺，丙醛和氰氢硼化钠，丙胺和溴
                          乙酰基肽异丙基-                        异丙胺，异丙胺和溴乙酰基肽哌啶-                          哌啶和溴乙酰基肽乙酰基-                        乙酐，醋酸二甲基-                        甲胺，甲醛和氰硼化氢钠二乙基-                        乙醛和氰硼化氢钠胆酸基-                        胆酸石胆酸基-                      石胆酸猪脱氧胆酸基-                  猪脱氧胆酸鹅脱氧胆酸基-                  鹅脱氧胆酸熊脱氧胆酸基-                  熊脱氧胆酸3-羟基肉桂酰基                 3-羟基肉桂酸4-羟基肉桂酰基                 4-羟基肉桂酸2-羟基肉桂酰基                 2-羟基肉桂酸3-羟基-4-甲氧基肉桂酰基        3-羟基-4-甲氧基肉桂酸4-羟基-3-甲氧基肉桂酰基        4-羟基-3-甲氧基肉桂酸2-羧基肉桂酰基                 2-羧基肉桂酸3-甲酰基苯甲酰基               3-甲酰基苯甲酐4-甲酰基苯甲酰基               4-甲酰基苯甲酐3，4-二羟基氢化肉桂酰基        3，4-二羟基氢化肉桂酸3，7-二羟基-2-萘酚基           3，7-二羟基-2-萘甲酸4-甲酰基肉桂酰基               4-甲酰基肉桂酸2-甲酰基苯氧乙酰基             2-甲酰基苯氧乙酰酸8-甲酰基-1-萘酚基              1，8-napthaldehydic acid4-(羟甲基)苯甲酰基             4-(羟甲基)苯甲酸4-羟苯基乙酰基                 4-羟苯基乙酸3-羟基苯甲酰基                 3-羟基苯甲酸4-羟基苯甲酰基                 4-羟基苯甲酸5-乙内酰脲甲酰基               5-乙内酰脲甲酸L-hydroorotyl                  L-hydroorotic acid4-甲基戊酰                     4-甲基戊酸2，4-二羟基苯甲酰基            2，4-二羟基苯甲酸3，4-二羟基肉桂酰基            3，4-二羟基肉桂酸3，5-二羟基-2-萘酚基        3，5-二羟基-2-萘甲酸3-苯甲酰基丙烷基            3-苯甲酰基丙烷酸反式-肉桂酰基               反式-肉桂酸苯乙酰基                    苯乙酸联苯乙酰基                  联苯乙酸三苯乙酰基                  三苯乙酸2-羟苯基乙酰基              2-羟苯基乙酸3-羟苯基乙酰基              3-羟苯基乙酸4-羟苯基乙酰基              4-羟苯基乙酸(±)-扁桃基                 (±)-扁桃酸(士)-2，4-二羟基-3，3-二    (±)-全内酯甲基丁酰基丁酰基                       丁酰酐异丁酰基                     异丁酰酐己酰基                       己酰酐丙酰基                       丙酰酐3-羟基丁酰基                 β-丁酸内酯4-羟基丁酰基                 γ-丁酸内酯3-羟基丙酰基                 β-丙酸内酯2，4-二羟基丁酰基            α-羟基-β-丁酸内酯1-金刚烷羰基                 1-金刚烷羧酸乙醇酰基                     乙醇酸DL-3-(4-羟苯基)乙酰基        DL-3-(4-羟苯基)乙酸3-(2-羟苯基)丙酰基           3-(2-羟苯基)丙酸4-(2-羟苯基)丙酰基           4-(2-羟苯基)丙酸D-3-苯基乳酰基               D-3-苯基乳酸氢化肉桂酰基                 氢化肉桂酸3-(4-羟苯基)丙酰基           3-(4-羟苯基)丙酸L-3-苯基乳酰基               L-3-苯基乳酸4-甲基戊酰                   4-甲基戊酸3-吡啶基乙酰基               3-吡啶基乙酸4-吡啶基乙酰基               4-吡啶基乙酸异烟酰基4-喹啉羧基               4-喹啉羧酸1-异喹啉羧基             1-异喹啉羧酸3-异喹啉羧基             3-异喹啉羧酸
优选的修饰基团包括含有甲基的基团，含有乙基的基团，含有丙基的基团和含有哌啶的基团，例如，1-哌啶-乙酰基基团。III.Aβ调节因子的另加的化学修饰
本发明的Aβ-淀粉样调节因子化合物可以被进一步的修饰，以改变化合物特定的性质而保留化合物改变Aβ聚集和抑制Aβ神经毒性的能力。例如，在一个实施方案中，该化合物被进一步的修饰以改变化合物的药效动力学性质，例如体内稳定性或半衰期。在另一个实施方案中，化合物被进一步的修饰以便用可探测的物质标记该化合物。在另一个实施方案中，化合物被修饰以便化合物与另加的治疗部分偶联。示意地，本发明的的调节因子可以表示为MG-ACD，其中上述调节因子含有直接或间接与至少一个修饰基团偶联的D-氨基酸Aβ聚集核心结构域；而被进一步修饰以改变调节因子性质的化合物可以表示为MG-ACD-CM，其中，CM代表附加的化学修饰。
为了进一步对上述化合物进行化学修饰，例如改变化合物的药效动力学性质，可以对反应基团进行衍生化。例如，当修饰基团与聚集核心结构域的氨基末端终点连接时，化合物的羧基末端可以被进一步修饰。优选的C-末端修饰包括那些降低化合物作为羧肽酶底物活性的修饰。优选的C-末端修饰物的例子包括酰胺基团(即，肽酰胺)，烷基或芳基酰胺基团(即，乙基酰胺基团或苯乙基酰胺基团)，羟基基团(即，肽醇)和各种非天然氨基酸，例如D-氨基酸β-丙氨酸。替代地，当修饰基团与聚集核心结构域的羧基末端连接时，化合物的氨基末端可以被进一步修饰，例如，以便降低化合物作为氨肽酶底物的活性。
通过化合物与可探测物质的反应，调节因子化合物可以被进一步修饰以对化合物进行标记。合适的可探测物质包括各种酶，互补基团，荧光物质，发光物质和放射性物质。合适的酶的例子包括辣根过氧化酶，碱性磷酸酶，β-半乳糖苷酶，乙酰胆碱酯酶；合适的互补基团的例子包括链亲和素/生物素和亲和素/生物素；合适的荧光物质的例子包括繖形酮，荧光素，荧光素异硫氰酸盐，若丹明，dichlorotriazinylamine荧光素，丹酰氯化物或藻红蛋白；发光物质的例子包括发光氨；以及合适的放射性物质的例子包括14C，123I，124I，125I，131I，99mTc，35S或3H。在一个优选的实施方案中，调节因子化合物是用14C放射性标记的，标记是通过将14C掺入到调节因子化合物的修饰基团或者一个或多个氨基酸结构进行的。标记的调节因子可以用于评测化合物的体内药效动力学，以及检测Aβ聚集，例如用于诊断目的。利用标记的调节因子化合物可以在源自病人的体内或在体外样品中检测Aβ聚集。
优选地，作为体内诊断制剂使用时，本发明的调节因子化合物用放射性的锝或碘标记。因此，在一个实施方案中，本发明提供了用锝，优选地99mTc，标记的调节因子化合物。用锝标记肽化合物的方法在本领域中是已知的(参见例如，美国专利号5,443,815，5,225,180和5,405,597，all by Dean et al.；Stepniak-Biniakiewicz，D.，et al.(1992)J.Med.Chem.35：274-279；Frirzberg，A.R.，etal.(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：4025-4029；Baidoo，K.E.，et al.(1990)Cancer Res.Suppl.50：799s-803s；and Tegan，L.and Smith，C.K.(1995)Science 270：980-982)。可以选择修饰基团，上述修饰基团提供了可以引入99mTc的螯合基团的位点，例如具有游离氨基基团的胆酸的Aic衍生物。在另一个实施方案中，本发明提供了用放射性碘标记的调节因子化合物。例如，Aβ序列内的苯丙氨酸残基(如Phe19和Phe20)可以被放射性的碘酪氨酸残基取代。几种碘放射性同位素中的任何一种都可以被掺入以制造诊断制剂。优选地，123I(半衰期＝13.2小时)被用于全身闪烁图(whole bodysintigraphy)，124I(半衰期＝4天)用于正电子发射断层摄影(PET)125I(半衰期＝60天)(PET)被用于代谢周转研究和131I(半衰期＝8天)被用于全身计数和延迟低分辨率影像研究。
进而，本发明调节因子化合物的另加修饰可以赋于该化合物另加的治疗特性。即，另加的化学修饰可以含有另加的功能部分。例如，一种降解或溶解淀粉样斑块的功能部分可以被偶联到该调节因子化合物上。以在这种形式，本发明的MG-ACD部分负责将该化合物引导到Aβ肽并破坏Aβ肽的聚集，而另加的功能部分在该化合物被引导到这些位点后负责降解或溶解淀粉样斑块。
在一种替代的化学修饰中，本发明的β-淀粉样化合物是以“前药”的形式制备的，其中该化合物自身不调节Aβ的聚集，但是在体内代谢时它能够被转化成本文定义的β-淀粉样调节因子化合物。例如，在这种类型的化合物中，上述调节基团是以前药的形式存在的，该形式在代谢时能够被转化为活性调节基团。这样的前药形式的修饰基团在本文中称为“次级修饰基团”。在本领域中已知有许多制备限制代谢的肽前药的策略，以便优化运送基于肽的药物的活性形式(参见，例如，Moss，J.(1995)in Peptide-Based Drug Design：Controlling Transport and Metabolism，Taylor，M.D.and Amidon，G.L.(eds)，Chapter 18)。特地调整了另加的策略，以便达到基于“顺序代谢”的CNS运送(参见，例如，Bodor，N.，et al.(1992)Science257：1698-1700；Prokai，L.，et al.(1994)J.Am.Chem.Soc.116：2643-2644；Bodor，N.and Prokai，L.(1995)inPeptide-Based Drug Design：Controlling Transport andMetabolism，Taylor，M.D.and Amidon.G.L.(eds)，Chapter 14)。在本发明调节因子的前药形式的一个实施方案中，修饰基团含有烷基酯以促进血脑屏障的通透性。
可以通过本领域中已知的常规技术制备本发明的调节因子化合物。调节因子的肽组分可以用常规技术合成，例如在Bodansky，M.Principles of Peptide Synthesis，Springer Verlag，Berlin(1993)and Grant，G.A.(ed)，Synthetic Peptides：A User’sGuide，W.H.Freeman and Company，New York(1992)中所描述的技术。自动化肽合成仪可以通过商业途径获得(例如，Advanced ChemTech Model 396；Milligen/Bioseach 9600)。此外，可以通过常规的方法，将一种或多种修饰基团与源自Aβ的肽组分(例如，Aβ聚集核心结构域)连接，上述常规方法如通过氨基基团(例如，肽氨基末端的α-氨基基团)，羧基基团(例如，肽的羧基末端)，羟基基团(例如，酪氨酸，丝氨酸苏氨酸残基上)或氨基酸侧链上的其它适合的反应基团(参见，例如，Greene，T.W and Wuts，P.G.M.Protective Groups in Organic Synthesis，John Wiley and Sons，Inc.，New York(1991))。D-氨基酸β-淀粉样调节因子合成的示例在实施例1中进一步描述。IV.筛选检测
本发明的另一方面涉及选择β-淀粉样聚集的调节因子的方法。在该方法中，待测化合物与天然β-淀粉样肽接触，根据待测化合物改变天然β-AP聚集(例如，已知或促进聚集)的能力，测量天然β-AP的聚集然后选出调节因子。在一个优选的实施方案中，待测化合物与摩尔过量的天然β-AP接触。通过指示β-AP聚集的适当检测指标，可以确定在待测化合物存在的情况下天然β-AP聚集的量和/或速率，如本文所描述(参见，例如，实施例2)。
在优选的检测中，在待测化合物存在的情况下天然β-AP被溶解成溶液并在晶核形成检测(参见实施例2)中评测天然β-AP的聚集，晶核形成检测是通过测量溶液在405nm的表观吸收而评测溶液随着时间的浑浊度变化(在实施例2中进一步描述，也参见Jarret et al.(1993)Biochemistry 32：4693-4697)。在无β-淀粉样调节因子的情况下，在含有β-AP的溶液中，在滞后时间内溶液的A405nm通常保持相对稳定，但是随后，当β-AP聚集并从溶液中析出时，溶液的A405nm迅速地增加，最后到达一个平台水平(即，溶液的A405nm随时间显示S形动力学)。相反，在抑制β-AP聚集的待测化合物存在的情况下，溶液的A405nm与无调节因子时相比降低了。因此，与无调节因子时相比，在抑制调节因子存在的情况下，溶液可能表现出滞后时间增加，聚集斜率减小和/或平台水平降低。类似地，上述筛选β-淀粉样聚合调节因子的方法可以用于筛选促进β-AP聚集的调节因子。因此，与无调节因子时相比，在促进β-AP聚集的调节因子存在的情况下，溶液的A405nm增加了(例如，与无调节因子时相比，溶液可能表现出滞后时间减少，聚集斜率增加和/或平台水平升高)。
另一个适用于本发明筛选方法的检测，晶种延伸检测，也在实施例2中进一步描述。在上述检测中，在存在或不存在待测化合物的情况下，β-AP单体和聚集的β-AP“晶种”被结合在一起，并且根据染料甲基脱硫氢对甲苯胺磺酸与β-纤丝接触时，该染料的发射增加对β-纤丝形成的量进行检测。而且，在存在或不存在调节因子的情况下，通过对β-AP制备物的电子显微技术(EM)分析可以检测β-AP聚集。例如，在抑制β-AP聚集的调节因子存在的情况下，通过EM检测，β淀粉样纤丝的形成减少了(即，在调节因子存在时，β-纤丝的量或数目减少了)，而在促进β-AP聚集的调节因子存在的情况下，β纤丝的形成增加了(即，在调节因子存在时，β-纤丝的量或数目增加了)。
另一个用于筛选合适调节因子的本发明的优选筛选方法是实施例3中所描述神经毒性检测。筛选出抑制神经毒性Aβ聚集的形成和/或抑制预先形成的Aβ纤丝的神经毒性的化合物。这种神经毒性检测被认为是对体内神经毒性的预测。因此，调节因子化合物在体外神经毒性检测中的抑制活性是对该化合物在体内的类似神经毒性抑制活性的预测。V.药用组合物
本发明的另一方面涉及本发明的β-淀粉样调节因子化合物的药用组合物。在一个实施方案中，上述组合物含有在治疗或预防上足以改变，并优选地抑制，天然β-淀粉样肽聚集的有效量的β淀粉样调节因子化合物，以及药用上可接受的载体。在另一个实施方案中，组合物含有在治疗或预防上足以抑制天然β-淀粉样肽的神经毒性的有效量的β淀粉样调节因子化合物，以及药用上可接受的载体。“治疗有效量”是指一个量，该量在所需要的剂量和时间内能有效地达到合乎需要的治疗效果，例如减少或逆转β-淀粉样沉积物和/或减少或逆转Aβ神经毒性。调节因子的治疗有效量可能根据一些因素而改变，例如疾病状态，年龄，性别和个体体重，以及调节因子在个体中产生所需反应的能力。可以调整剂量服法以便提供最佳的治疗反应。治疗有效量也可以是调节因子在治疗上的有益作用超过其毒性或损害作用的有效量。利用实施例6所描述的基于细胞的检测可以检测本发明的调节因子的潜在神经毒性，并且可以选出不表现出显著的神经毒性的治疗有效调节因子。在一个优选的实施方案中，治疗有效量的调节因子足以改变，优选地抑制，摩尔过量的天然β-淀粉样肽的聚集。“预防有效量”是指一个量，该量在所需要的剂量和时间内能有效地达到合乎需要的治疗效果，例如防止β-淀粉样沉积或抑制β-淀粉样沉积率和/或倾向于形成β-淀粉样沉积物的病人中的Aβ神经毒性。可以如上文所述的对治疗有效量的确定那样，对预防有效量进行确定。通常，由于预防剂量在病人疾病之前或疾病的较早期使用，预防有效量将少于治疗有效量。
在确定β-淀粉样调节因子的治疗或预防有效量时，可能考虑的一个因素是病人生物区隔中，例如病人脑脊液(CSF)中，天然β-AP的浓度。据估计CSF中天然β-AP的浓度为3nM(Schwartzman，(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：8368-8372)。β淀粉样调节因子的治疗或预防有效量的一个非限制性范围是0.01nM-10μM。应当注意剂量值可能随待减轻的疾病的严重性而不同。进而，应当理解，对于任何特定的病人，必须根据个体的需要以及管理或监督上述组合物给药的专业人员的判断，随时间调整特定的剂量服法，并且，本文提出的剂量范围仅仅是示例性的，并不用来限制所要求的组合物的范围或实践。
组合物中的活性化合物的量可能根据一些因素而改变，例如疾病状态，年龄，性别，和个体的体重，上述各个因素可能影响个体中天然β-AP的量。可以调整剂量服法以便提供最佳的治疗反应。例如，可以施用单一快速浓注，随时间施用几次分开的剂量，或根据治疗状况的紧急事件的预示，可以按比例减少或增加剂量。为了给药的简易性和剂量的一致性，以剂量单元的形式配制注射用的组合物是特别有用的。在本文中使用时，剂量单元形式是指物理上分离的单元，该单元是对被治疗的哺乳动物接受体适合的单位剂量；每个单位包含预先确定数量的活性化合物以及必需的药用载体，该化合物数量是经过计算的以便产生所需的治疗效果。本发明的剂量单位形式的规定是直接取决于(a)活性化合物的独特性和所获得的特定的治疗效果，和(b)在组合这样的活性化合物以治疗个体的敏感性领域的内在局限。
在本文中使用时，“药用上可接受的载体”包括任何和所有的生理上可兼容的溶剂，分散介质，涂层，抗细菌剂和抗真菌剂，等渗的和吸收延迟剂，等等。在一个实施方案中，载体是适合于非肠道给药。优选地，载体适合于对中枢神经系统(例如，脊柱内或大脑内)给药。替代地，载体适合于静脉内，腹膜内或肌肉给药。在另一个实施方案中，载体适合于口服给药。药用上可接受的载体包括无菌水溶液或分散剂以及用于临时制备无菌注射溶液或分散剂的无菌粉末。这些介质和制剂在药用活性物质中的应用在本领域中是众所周知的。除了任何与活性化合物不相容的常规介质或制剂外，可考虑在本发明的药用组合物中其它介质或制剂使用。辅助的活性化合物也可以被掺入到组合物中。
通常，治疗组合物在制造和储存的条件下必须是无菌并稳定的。组合物可以被配制成溶液，微滴乳状液，脂质体，或其它适合于高药物浓度的有序结构。载体可以是溶剂或分散介质包括，例如，水，乙醇，多羟基化合物(例如，甘油，丙烯甘油，和液态聚乙二醇，等等)，和它们的适当混合物。可以保持适当的流动性，例如，通过使用涂层剂如卵磷脂，在分散剂的情况通过保持所需的颗粒大小，以及通过使用表面活性剂。在许多情况下，在组合物中包含等渗制剂，例如，糖，多醇类如甘露醇，山梨醇，或氯化钠是优选的。可以通过在组合物中包括延迟吸收的制剂，例如，一硬脂酸盐和凝胶，延长可注射组合物的吸收。而且，可以在延时释放的制剂中施用调节因子，例如在包含缓慢释放的聚合体的组合物中。活性化合物可以与防止化合物快速释放的载体一起制备，上述载体例如控制释放的制剂，包括植入式运送系统和微囊密封的运送系统。可以利用生物可降解的，生物适合的聚合体，例如乙烯醋酸乙烯酯，聚酐，聚乙醇酸，胶原蛋白，polyorthoesters，聚乳酸和聚乳酸，聚乙醇酸共聚物(PLG)。制备上述制剂的许多方法已授与专利的，或对于本领域的技术人员通常是已知的。
无菌注射溶液可以通过以下方法制备：在合适的溶剂中掺入所需量的活性化合物(例如，β-淀粉样调节因子)以及按照需要掺入上文列举的一种成分或几种成分的组合，然后无菌过滤。通常，通过将活性化合物掺入到含有基础分散介质和其它上文列举的所需成分的无菌载体中，可以制备分散剂。对于用于制备无菌注射溶液的无菌粉末的情况，优选的制备方法是真空干燥和冻干，该方法从先前无菌过滤的溶液中产生活性成分加上另加的所需成分的粉末。
本发明的调节因子化合物可以与一种或多种另加的提高调节因子化合物溶解性的化合物一起配制。加入到制剂中以提高调节因子的溶解性的优选化合物是环糊精衍生物，优选地为羟基丙基-γ-环糊精。含有用于将肽运送到中枢神经系统的环糊精衍生物的运送载体在Bodor，N.，et al.(1992)Science 257：1698-1700中有所描述。对于本文所描述的β-淀粉样调节因子，在制剂中包含浓度为50-200mM的羟基丙基-γ-环糊精能够增加该化合物的水溶性。除了提高溶解性外，在制剂中包含环糊精衍生物可能具有其它有利的效应，因为有报道表明β-环糊精自身能够与Aβ肽反应并在体外抑制纤丝的形成(Camileri，P.，et al.(1994)FEBS Leters 341：256-258)。因此，结合使用本发明的调节因子化合物和环糊精衍生物对Aβ聚集的抑制可能比单独使用调节因子自身更强。环糊精的化学修饰在本领域中是已知的(Hanessian.S.，et al.(1995)J.Org.Chem.60：4786-4797)。除了在含有本发明的调节因子的药用组合物中作为添加剂外，环糊精衍生物自身也可以用作修饰基团，并因此也可以与Aβ肽化合物共价偶联形成本发明的调节因子化合物。
增强调节因子化合物的脑摄取的另一个优选制剂在盐溶液中含有吐温-80，聚乙烯乙二醇(PEG)和乙醇。上述的优选制剂的一个非限制性例子是在盐溶液中含有0.16％吐温-80，1.3％PEG-3000和2％乙醇。
在另一个实施方案中，含有本发明调节因子化合物的药用组合物被配制得能够使该调节因子跨过血脑屏障(BBB)运送。本领域中已知的提高跨BBB运送的各种策略可以被改造以适用于本发明的调节因子，从而增强该调节因子跨BBB的运送(这些策略的综述参见，例如，Pardidge，W.M.(1994)Trends in Biotechnol.12：239-245；Van Bree，J.B.et al(1993)Pharm.World Sci.15：2-9；和Padridge，W.M.et al.(1992)Pharmacol Toxicol.71：3-10)。在一种途径中，调节因子被化学修饰以形成增强跨膜运送的前药。适当的化学修饰包括脂肪酸与调节因子通过酰胺或酯连接的共价连接(参见，例如，Shashoua的美国专利4,933,324和PCT PublicationWO 89/07938；Hesse et al.；的美国专利5,284,876；Toth et al.(1994)J.Drug Target.2：217-239 and Shashoua，V.E et al.(1984)J.Med.Chem.27：659-664)和该调节因子的糖基化(参见，例如，Poduslo et al的美国专利5,260,308)。可以在调节因子中使用N-酰基氨基酸衍生物以形成“脂性的”前药(参见，例如，Hashimoto et al.的5,112,863)。
在另一个增强跨BBB运送的途径中，肽或肽模拟物调节因子与第二种肽或蛋白连接，从而形成嵌合蛋白，其中第二种肽或蛋白通过吸附介导的或受体介导的胞吞转运作用而通过BBB。因此，通过调节因子与第二种肽或蛋白的偶联，嵌合蛋白跨过BBB转运。第二种肽或蛋白可以是脑毛细管内皮细胞受体的配基。例如，一种优选的配基是特异地与脑毛细管内皮细胞运铁蛋白受体结合的单克隆抗体(参见例如，美国专利号5,182,107和5,154,924和PCT Publications WO93/10819和WO95/02421，all by Friden et al.)。其它合适的可以介导跨过BBB的肽或蛋白包括组蛋白(参见例如，美国专利号4,902,505 by Pardridge and Schimmel)以及配基例如生物素，叶酸，烟酸，泛酸，核黄素，硫胺，吡哆醛和抗坏血酸(参见，例如，Heinstein的美国专利5,416,016和5,108,921)。此外有报道表明葡萄糖转运体GLUT-1能够转运糖肽([Met5]脑啡肽的L-丝氨酰-β-D-葡萄糖苷类似物)跨过BBB(Polt，R.et al.(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：7114-1778)。因此，调节因子化合物可以与这样的糖肽偶联以使调节因子锚定GLUT-1葡萄糖转运体。例如，在氨基末端用调节基团Aic(3-(O-氨基乙基-异)-cholyl，一种具有游离氨基的胆酸衍生物)可以利用常规方法通过Aic的氨基基团与糖肽偶联。嵌合蛋白可以通过重组DNA技术(例如，通过形成编码融合蛋白的嵌合基因)形成，或通过调节因子与第二种肽或蛋白的化学交联形成嵌合蛋白。多种化学交联制剂在本领域中是已知的(例如，可以通过商业途径从Pierce，Rocord IL获得)。可以选择化学交联制剂，以便允许上述调节因子与第二种肽或蛋白的高效偶联，并允许随后对连接基团的水解以释放具有生物活性的调节因子。例如，可以使用基于生物素-亲和素的连接系统。
在另一种增强跨BBB转运的途径中，上述调节因子被装入到载体(carrier vector)中，上述载体介导跨BBB的运送。例如，上述调节因子可以被包入到脂质体中，如带正电荷的单层脂质体(参见，例如，Faden的PCT Publications WO 88/07851 and WO 88/07852)或被包入到多价的球体中(参见，例如Khan et al.，的美国专利5,413,797；Mathiowitz et al.等人的美国专利5,271,961和Gombotzet al等人的5,019,400)。进而，可以修饰载体以使其定向于跨BBB转运。例如，载体(如脂质体)可以用一种分子共价修饰，上述分子能够被活跃地转运跨过BBB，或者用脑内皮细胞受体的配基修饰，如与转铁蛋白受体特异性结合的单克隆抗体(参见，例如，PCTpublication WO91/04014 by Collins and WO 94/01278 by Greiget al.)。
在另一种增强调节因子跨BBB转运的途径中，上述调节因子与另一种剂同时给药，上述剂的功能为透化BBB。这样的BBB“透化剂”的例子包括缓激肽和缓激肽激活剂(参见，例如，Malroy-Camine的美国专利5,112,596)和Kozarich等人的美国专利5,268,164中所公布的肽化合物。
体外测量上述调节因子化合物在脑脊液(CSF)中的稳定性的方法，以及在动物模型中测量该调节因子化合物的脑吸收程度的方法，可以被用作对该化合物的体内效力的预测。测量CSF稳定性和脑吸收的适当检测方法分别在实施例7和8中描述。
本发明的调节因子化合物可以被配制成药用组合物，其中该调节因子化合物是唯一的活性化合物或，替代地，该药用组合物可以含有另加的活性化合物。例如，可以联合使用两种或多种调节因子化合物。进而，本发明的调节因子化合物可以与一种或多种其他具有抗淀粉源性特性的剂组合。例如，调节因子化合物可以与非特异性的胆碱酯酶抑制剂塔克林(tacrine)(COGNEX，Parke-Dayis)组合。
在另一个实施方案中，本发明的药用组合物作为包装好的制剂提供。上述包装好的制剂可以包括盛于容器中的本发明的药用组合物并印刷说明书，用本发明的药用组合物治疗具有与β-淀粉样变性病相关的疾病，如阿尔茨海默氏病的病人的。VI.使用Aβ调节因子的方法
本发明的另一方面涉及改变β-淀粉样肽的聚集或抑制其活性的方法。在本发明的方法中，天然β淀粉样肽与β淀粉样调节因子接触，以便上述天然β-淀粉样肽的聚集被改变或该天然β-淀粉样肽的神经毒性被抑制。在一个优选的实施方案中，调节因子抑制天然β-淀粉样肽的聚集。在另一个实施方案中，调节因子促进天然β淀粉样肽的聚集。优选地，相对于调节因子的量而言，摩尔过量的β-AP的聚集在与上述调节因子接触时被改变。
在本发明的方法中，天然β淀粉样肽可以与调节因子在体内或体外接触。因此，术语“与......接触”用来包括调节因子与天然β-AP制备物在体外接触以及将上述调节因子运送到天然β-AP存在的部位。因为调节因子化合物与β-AP相互作用，调节因子化合物可以被用于在体内或体外探测天然β-AP。因此本发明调节因子化合物的一个用途是作为检测天然β-AP在生物样品中或在病人体内存在的诊断制剂。进而，利用本发明的调节因子化合物对天然β-AP的探测可以被用于诊断病人的淀粉样变性病。此外，由于本发明的调节因子化合物破坏了β-AP的聚集和抑制了β-AP的神经毒性，上述调节因子化合物可以被用于治疗或预防β-淀粉样变性病相关的疾病。因此本发明调节因子化合物的另一用途是作为改变天然β-AP聚集和/或神经毒性的治疗制剂。
在一个实施方案中，本发明的调节因子化合物在体外应用，例如，用于对样品(例如，生物液体的样品)中的β-AP进行探测和定量。为了便于探测，可以用可探测的物质修饰调节因子化合物。用于本方法的天然β-AP的来源可以是，例如，脑脊液的样品(例如，源自AD病人，和由于家族史而对AD敏感的成人，或正常成人)。将天然β-AP样品与本发明的调节因子接触，并测量β-AP的聚集，例如通过实施例2所描述的检测方法。然后β-AP样品的聚集程度可以和β-AP浓度已知的，同样与调节因子接触的对照样品的聚集程度进行比较，上述结果可以用于指示病人是否对β-淀粉样变性病敏感或具有与β-淀粉样变性病相关的疾病。而且，可以通过检测掺入到调节因子的调节基团检测β-AP。例如，利用可探测物质(例如，一种酶，如过氧化物酶)标记的链亲和素或亲和素探针可以检测如本文所描述的掺入生物素的化合物(例如，氨基末端生物素化的β-AP肽)的调节因子。
在另一个实施方案中，本发明的调节因子化合物用于体内检测，并且，如果需要的话，定量病人中的β-AP沉淀，例如，帮助在病人中诊断β淀粉样变性病。为了便于检测，调节因子化合物可以用可探测的物质标记，优选地可以在病人体内探测的99mTc或放射性碘(在上文进一步描述)。标记的β-淀粉样调节因子化合物被施用于病人，并且经过一段充分的时间以允许该调节因子在淀粉样沉淀部位的富集后，通过常规的影像技术探测标记的调节因子化合物。可以直接探测由标记的化合物产生的放射性信号(例如，通过全身计数)，或替代地，放射性信号可以被转化成自显影图或计算机扫描上的图，以允许对病人中的淀粉样沉积进行成像。利用放射性标记的蛋白对对淀粉样变性病进行成像的方法在本领域中是已知的。例如，用123I或99mTc标记血清淀粉样P组分(SAP)已经被用于对全身淀粉样变性病进行成像(参见，例如，Hawkins，P.N.and Pepys，M.B.(1995)Eur.J.Nucl.Med.22：595-599)。在各种放射性碘的同位素中，优选地123I(半衰期＝13.2小时)被用于全身闪烁图谱，124I(半衰期＝4天)被用于正电子发射断层摄影(PET)。125I(半衰期＝60天)被用于代谢周转研究，131I(半衰期＝8天)被用于全身计数和延迟低分辨率影像研究。类似于用放射性标记的SAP进行的研究，本发明的标记的调节因子化合物可以以单剂快速浓注的形式，例如含有100μg标记化合物，带有180MBq放射性的快速浓注，通过适当的途径(例如，静脉内，脊柱内，脑内)被输送到病人。
本发明提供了探测天然β-淀粉样肽在生物样品中存在或不存在的方法，该方法包括将生物样品与本发明的化合物接触，并探测该化合物与天然β-淀粉样肽的结合，从而探测天然β-淀粉样肽在生物样品中的存在或不存在。在一个实施方案中，β-淀粉样调节因子化合物和生物样品在体外接触。在另一个实施方案中，通过对病人施用β-淀粉样调节因子化合物而使β-淀粉样调节因子化合物和生物样品接触。对于体内给药，优选地该化合物是用放射性锝或放射性碘标记。
本发明还提供了探测天然β-淀粉样肽的方法以便于β-淀粉样原性疾病的诊断，该方法包括将生物样品与本发明的化合物接触并探测与天然β-淀粉样肽结合的上述化合物以便于对β-淀粉样源性疾病的诊断。在一个实施方案中，β-淀粉样调节因子化合物在体外接触。在另一个实施方案中，通过对病人施用β-淀粉样调节因子化合物而使β-淀粉样调节因子化合物和生物样品接触。对于体内给药，优选地该化合物是用放射性锝或放射性碘标记。优选地，上述方法的应用便于对阿尔茨海默氏疾病的诊断。
在另一个实施方案中，本发明提供了改变天然β-AP聚集或抑制β-AP神经毒性的方法，该方法可以用于预防，治疗或防止与β-淀粉样变性病相关的疾病，如阿尔茨海默氏疾病。本发明的调节因子化合物可以降低天然β-AP的聚集对培养的神经细胞的毒性。进而，上述调节因子化合物还具有降低预先形成的Aβ纤丝的神经毒性的能力。因此，本发明的调节因子化合物可以被用于已知或防止病人中神经毒性Aβ纤丝的形成(例如，在易于发生β-淀粉样沉积的病人中进行预防)，并可以被用于在已经表现出β-淀粉样沉积的病人中治疗性地逆转β-淀粉样变性病。
本发明的调节因子与病人中的(如，病人的脑脊液或大脑中的)天然β-淀粉样肽接触，从而改变天然β-AP的聚集和/或抑制天然β-AP的神经毒性。调节因子化合物可以单独施用于病人，或替代地，调节化合物可以与其他治疗性的活性制剂联合使用(例如在部分IV中所讨论的)。使用联合疗法时，上述治疗性制剂可以在单一的药用组合物中一起施用，在独立的药用组合物中共同施用，或依次施用。
可以通过任何适当的，能在病人中有效抑制天然β-AP聚集的途径施用上述调节因子，尽管在特定的优选方案中该调节因子是通过非肠道途径施用的，该途径对于病人的中枢神经系统是最为优选的。CNS施用的可能途径包括脊椎内施用和脑内施用(例如脑血管内施用)。替代地，该化合物可以，例如，口服施用，腹腔内施用，静脉内施用或肌肉内施用。对于非-CNS施用途径，该化合物可以在一种制剂中施用，该制剂允许跨BBB运送。某些调节因子可能不经任何另加的进一步修饰就可以跨BBB运送，而其它可能需要进一步修饰，如在IV部分中所描述。
将治疗化合物运送到病人的CNS的适当适当方式和设施在本领域中是已知的，包括脑血管库(cerebrovascular reservoirs)(例如，Ommya or Rikker库；参见，例如，Raney，J.P.et al.(1988)J.Neurosci.Nurs.20：23-29；Sundaresan，N.et al.(1989)Oncology 3：15-22)，鞘内运送的导管(例如Port-a-Cath，Y-导管等等；参见例如，Plummer，J.L.(1991)Pain44：215-220；Yaksh，T.L.et al.(1986)Pharmacol.Biochem.Behav.25：483-485)可注射的胸内库(例如，Sphinalgestic；参见例如，Brazenor，G.A.(1987)Neurosurgey 21：484-491)，可植入式灌注泵系统(例如，Infusaid；参见例如，Zierski，J.et al.(1988)Acad Neurochem.Suppl.43：94-99；Kanoff，R.B.(1994)J.Am.Osteopath.Assoc.94：487-493)和渗透泵(由Alza Corporation销售)。一种特别优选的施用方式是通过可植入式的，可通过外部编程的灌注泵。适当的灌注泵系统和库系统在Blomquist的美国专利5,368,562中和在Doan的美国专利4,731,058中有所描述，由Pharmacia Deltec Inc.开发。
本发明的改变β-AP体内聚集的方法，尤其是抑制β-AP聚集的方法，可以被用于治疗与不正常的β淀粉样聚集和沉积相关的疾病，从而降低β淀粉样沉积的速率和/或减少β淀粉样沉积的程度，从而减轻疾病的进程。在一个优选的实施方案中，该方法被用于治疗阿尔茨海默氏疾病(例如单个发生的或家族性的AD，包括表现出AD综合症的个体和易于发生家族性AD的个体)。该方法可以被用于预防或治疗其它临床发生的β-淀粉样沉积例如在Down’s综合症个体中的沉积和在具有Dutch型淀粉样变性病(HCHWA-D)的遗传性脑出血的病人中的沉积。对β-AP聚集的抑制是优选的治疗方法，但是通过将β-AP捕获于不导致神经损伤的位点，促进β-AP聚集的调节因子也可以被用于治疗。
此外，在单个发生的包含体肌炎(IBM)的病理学中涉及β-淀粉样前体蛋白在肌纤维中的不正常聚集(Askana，V.et al.(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：1314-1319；Askanas，V.et al.(1995)Current Opinion in Rheumatology 7：486-496)。因此本发明的调节因子可以被用于治疗或预防β-AP，或APP在非神经部位的不正常聚集的疾病，例如通过将上述调节因子运送到肌纤维而治疗IBM。
本发明在下文的实施例中进一步阐述，这些实施例不应该被认为是限制性的。调节因子在检测实验中改变天然β-淀粉样肽聚集和/或抑制天然β-淀粉样肽神经毒性的能力，预示该调节因子在体内执行相同功能。
本发明在下文的实施例中进一步阐述，这些实施例不应该被认为是限制性的。在本申请的全文中引用的所有参考文献，专利和发表的专利申请以及图都在此引入作为参考。实施例1含有D-氨基酸的β-淀粉样调节因子化合物的制备
可以通过固相肽合成，例如利用下文的基于Nα-9-芴基甲氧基羰基(FMOC)的保护策略，制备含D-氨基酸的β-淀粉样调节因子。从2.5毫摩尔的FMOC-Val-Wang树脂开始，利用4倍过量的保护氨基酸，1-羟基苯并三唑(HOBt)和二异丙基碳二亚胺(DIC)，依次加入各个氨基酸。偶联后，根据茚三酮试验的测定，如果需要的话进行重偶联。每次合成可以最简单地描述为一次3分钟去保护(25％哌啶/N-甲基-吡咯烷酮(NMP))，一次15分钟去保护，5次1分钟NMP洗涤，一次60分钟偶联循环，5次NMP洗涤和茚三酮测试。对于N-末端修饰，用N-末端修饰制剂代替FMOC-D-氨基酸并按照以上的方法与700mg完全合成(assemble)的肽-树脂偶联。通过三氟乙酸(TFA)(82.5％)，水(5％)，苯硫基甲烷(5％)，苯酚(5％)，乙硫醇(2.5％)处理2小时将上述肽从树脂上移走，然后在冷乙醚中将肽沉淀。离心使固相沉淀(2400rpm×10min)，将乙醚倒去。把该固体重新悬浮在乙醚中，沉淀，然后第2次倒去乙醚。将固体溶于10％乙酸中并冻干至干燥。为了进行制备纯化和随后的特征分析，将60mg固体溶于25％乙氰(ACN)/0.1％TFA，并上样到高效液相层析(HPLC)柱。
替代地，可以通过制造商建立的0.25毫摩尔水平合成的自动化方法，在Rainin PS3肽合成仪上合成含有D-氨基酸的β-淀粉样调节因子。在四倍过量的0.4M N-甲基吗啉(NMM)/二甲基甲酰胺(DMF)中，用2-(1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基-脲阳离子-六氟-磷酸(HBTU)/FMOC-D-氨基酸偶联60分钟。在偶联与偶联之间，通过与20％哌啶/DMF反应20分钟将FMOC基团除去。通过95％TFA/水处理将肽移去，并用乙醚沉淀。将沉淀重悬浮于40％乙氰/水悬浮并冻干。需要时用制备性HPLC将上述材料用15％-50％乙氰在Vydac C18层析柱(21-250mm)上层析60分钟纯化。
可以用常规方法合成各种N-末端修饰的β-淀粉样调节因子化合物。按上述方法在适当的树脂上制备完全保护的、与树脂结合的肽以最终得到羧基末端的肽酸。将小部分的各种肽树脂(例如，13-20μmole)等分到独立的反应容器中。以常规的方式，用NMM中的20％哌啶将各个样品中的N-末端FMOC保护基团除去，随后用DMF充分洗涤。各个肽树脂样品的未保护的N-末端α-氨基基团可以用以下方法中的一种修饰：
方法A，用含有游离羧基酸基团的修饰制剂偶联：修饰制剂(五当量)预先溶于NMP，DMSO或这两种溶剂的混合物。HOBT和DIC(各种制剂的五当量)被添加到溶解的修饰剂中，并将得到的溶液添加到一当量的游离氨基肽树脂中。偶联过夜进行，随后洗涤。如果在肽树脂小样的茚三酮测试表明偶联不完全，用1-羟基-7-azabenzotriazole(HOAt)代替HOBt。
方法B，以预活化形式得到修饰制剂的偶联：修饰制剂(五当量)预先溶于NMP，DMSO或这两种溶剂的混合物，并被添加到一当量的肽树脂中。二异丙基乙酰胺(DIEA；六当量)被添加到活化的修饰剂和肽树脂的悬浮物中。偶联过夜进行，随后洗涤。如果在肽树脂小样的茚三酮测试表明偶联不完全，重新偶联。
第二次偶联后(如果需要的话)，N-末端修饰的肽树脂在减压的条件下干燥，并如上文所述通过除去侧链保护基团将其从树脂上裂解下来。用分析型的反相HPLC确认在得到的粗肽中存在主要产物，并用Millipore Sep-Pak cartridges或制备型反相HPLC纯化。用质谱或高场核磁共振谱确认在该产物中存在合乎需要的化合物。
方法C，用溴乙酰基肽中间产物制备N-末端烷基取代的肽：用溶于DMF的1，3-二异丙基碳亚胺(DIC)(13当量)可以将树脂与溴乙酸(12当量)偶联。得到的溴乙酰基取代的肽与初级或次级胺反应时可以被修饰，上述初级或次级胺包括甲胺，乙胺丙胺，异丙胺和哌啶。反应在60％的DMSO/DMF中进行，并通常在24小时后完成。
方法D，通过还原烷基化制备N-末端烷基取代的肽：将肽溶解于(或部分溶解于)含0-10％甲醇的水中后，其与醛(5-8当量)和氰硼酸钠(10-16当量)反应。根据醛的类型和所需要的取代的程度调整当量数。用1M的HCl将的到的溶液的pH值调为2，并在2维持1小时。通过HPLC监控反应，并且反应通常在两小时后完成。在室温将混合物浓缩并用HPLC纯化。
方法E，C-末端修饰：用常规的Fmoc化学在2-氯三苯甲游基树脂上合成肽，但是最终的D-氨基酸基团的偶联是Boc保护的。用8/1/1的二氯甲烷(DCM)/乙酸/三氟甲醇将肽从树脂上移去，并将混合物浓缩。将残余的肽溶解于20％乙氰，冰冻并冻干过夜。用1-羟基-7-azobenzotriazole(HOAt)和DIC在碱性条件下(pH＝11，用DIEA调)将BOC粗保护的肽酸与一当量的胺偶联。过夜搅拌后反应完成，并用水沉淀肽。与DCM中的25％TFA反应1小时将BOC基团裂解，并用HPLC纯化肽。实施例2：β-淀粉样聚集检测
可以用下文描述的聚集检测方法的一种或两种，对β-淀粉样调节因子化合物和天然β-AP混合时调节天然β-AP聚集的能力(例如，抑制或促进)进行检测。用于聚集检测的天然β-AP(β-AP1-40)可以通过商业途径从Bachem(Torrance，CA)获得。
A.                   晶核形成检测
用晶核形成检测测定待测化合物改变(例如抑制)从单体β-AP形成β-AP纤丝过程的早期事件的能力。成核聚集机制的特征是在晶核形成之前观察到一个迟滞时间，随后肽迅速形成纤丝，表现为浑浊度的线性升高。通过光散射(浑浊度)，可以对β-AP单体聚集之前的时间延迟以及形成不溶纤丝的程度进行定量。当最大浑浊度达到一个平台后聚集达到平衡。通过测量溶液在405nm随时间的表观吸收值(A405nm)，确定在有或无各种浓度的β-AP淀粉样调节因子化合物时天然β-AP的浑浊度。测量浑浊度的敏感度阈值在15-20μM β-AP。与无调节因子时的浑浊度相比，存在调节因子时浑浊度随时间降低，意味着调节因子抑制单体β-AP形成β-AP纤丝。进行上述检测时可以利用搅拌或摇动以加速聚合，从而提高检测的速度。此外，可以调整上述检测以适合96孔板模式，以便筛选多种化合物。
为了进行晶核形成检测，首先将Aβ1-40肽溶于HFIP(1，1，1，3，3，3-六氟代-2-丙醇；Aldrich 10，522-8)，浓度为2mg肽/ml，并在室温温育30min。HFIP溶解的肽在水浴超声波仪最高设置值超声5min，然后在氩气流下蒸发至干燥。肽薄膜用无水二甲亚砜(DMSO)重新悬浮，浓度为6.9mg/ml(25×浓度)，如前所述超声5min，然后通过0.2微米尼龙注射过滤器(VWR cat.No.28196-050)过滤。将待测化合物以100×浓度溶于DMSO。在玻璃瓶中将4体积的溶于DMSO的25×Aβ1-40肽与1体积的溶于DMSO的待测化合物混合，并混匀以便使Aβ肽与待测化合物摩尔比为1∶1。对于不同的摩尔比，在加入Aβ1-40之前将待测化合物用DMSO稀释，以便使DMSO和Aβ1-40的最终浓度保持恒定。对照样品中不包含待测化合物。然后将10微升混合物加入到Corning Costar极低结合96孔板的孔底部(Corning Costar，Cambridge MA；cat.No.2500)。将90微升水加入孔中，将板在旋转摇动仪上以恒定速度在室温下摇动30秒，在孔中继续加入100μl的2×PTL缓冲液(20nM NaH2PO4，300mM NaCl，pH 7.4)，将板重新摇动30秒，并通过Bio-Rad Model 450Microplate Reader测量在405nm的表观吸收值从而取得基线(t＝0)浑浊度读数。然后将板放回摇动仪并继续摇动5小时。在15分钟的时间间隔取得浑浊度读数。
在无任何调节因子时，β-淀粉样聚集导致天然β-AP溶液的浑浊度升高(即，在405nm表观吸收值随时间增加)。因此，与无调节因子化合物的对照样品相比，包含有效抑制调节因子化合物的溶液显示出浑浊度降低(即，与对照样品相比，在405nm表观吸收值随时间更小)。
作为用浑浊度对β-淀粉样聚集进行定量的替代方法，硫黄素T(Th-T)荧光也可以用于在晶核形成检测中对β-淀粉样聚集进行定量(用于定量β-淀粉样聚集的Th-T荧光在下文晶种延伸检测中有进一步的描述)。
B.纤丝结合检测
纤丝结合检测需要以下材料：Millipore多槽过滤装置(Millipore multifilter apparatus)；12×75玻璃管；GF/F25mm玻璃滤膜；4℃的PBS/0.1％吐温20(PBST)；Aβ纤丝；放射性化合物；非放射性化合物；带加样头的Eppendorf重复加样器；标签；镊子；以及真空吸尘器。
在该检测中，每个样品以一式三份进行。首先，大约在8天前制备“老化的”Aβ纤丝，上述老化是通过将1ml的一小份溶于4％DMSO/PBS溶液中的200μM Aβ1-40肽在37℃摇动8天进行的。上述“老化的”Aβ肽可以直接在细胞上检测或在-80℃冷冻。
用PBST稀释上述200μM的Aβ纤丝以得到4μM的溶液(用PBST将320μl稀释到16ml)。用重复加样器在每管加入上述溶液的100μL的小样。
本发明β-淀粉样调节因子化合物的2μM-200fM稀释液的制备如下：
用DMSO 1∶3稀释5mM的储存液以得到1.667的储存液(用400μlDMSO稀释200μl)。
用DMSO 1∶3稀释1.667mM的储存液以得到0.5556的储存液(用400μl DMSO稀释200μl)。
用DMSO 1∶3稀释555.556μM的储存液以得到185.19的储存液(用400μl DMSO稀释200μl)。
用DMSO 1∶3稀释185.185μM的储存液以得到61.728的储存液(用400μl DMSO稀释200μl)。
用DMSO 1∶3稀释61.728μM的储存液以得到20.576的储存液(用400μl DMSO稀释200μl)。
用DMSO 1∶3稀释20.576μM的储存液以得到6.8587的储存液(用400μl DMSO稀释200μl)。
用DMSO 1∶3稀释6.859μM的储存液以得到2.2862的储存液(用400μl DMSO稀释200μl)。
用DMSO 1∶3稀释2.286μM的储存液以得到0.7621的储存液(用400μl DMSO稀释200μl)。
用DMSO 1∶3稀释762.079nM的储存液以得到254.03的储存液(用400μl DMSO稀释200μl)。
用DMSO 1∶3稀释254.026nM的储存液以得到84.675的储存液(用400μl DMSO稀释200μl)。
用DMSO 1∶3稀释84.675nM的储存液以得到28.225的储存液(用400μl DMSO稀释200μl)。
用DMSO 1∶3稀释28.225nM的储存液以得到9.4084的储存液(用400μl DMSO稀释200μl)。
用DMSO 1∶3稀释9.408nM的储存液以得到3.1361的储存液(用400μl DMSO稀释200μl)。
用DMSO 1∶3稀释3.136nM的储存液以得到1.0454的储存液(用400μl DMSO稀释200μl)。
用DMSO 1∶3稀释1.045nM的储存液以得到0.3485的储存液(用400μl DMSO稀释200μl)。
用DMSO 1∶3稀释348.459pM的储存液以得到116.15的储存液(用400μl DMSO稀释200μl)。
用DMSO 1∶3稀释116.153pM的储存液以得到38.718的储存液(用400μl DMSO稀释200μl)。
用PBST 1∶25稀释185.185μM的储存液以得到7.4074的储存液(用1.2ml PBST稀释50μl)。
用PBST 1∶25稀释61.728μM的储存液以得到2.4691的储存液(用1.2ml PBST稀释50μl)。
用PBST 1∶25稀释20.576μM的储存液以得到0.823的储存液(用1.2ml PBST稀释50μl)。
用PBST 1∶25稀释6.859μM的储存液以得到0.2943的储存液(用1.2ml PBST稀释50μl)。
用PBST 1∶25稀释2.286μM的储存液以得到0.0914的储存液(用1.2ml PBST稀释50μl)。
用PBST 1∶25稀释762.079nM的储存液以得到30.483的储存液(用1.2ml PBST稀释50μl)。
用PBST 1∶25稀释254.026nM的储存液以得到10.161的储存液(用1.2ml PBST稀释50μl)。
用PBST 1∶25稀释84.675nM的储存液以得到3.387的储存液(用1.2ml PBST稀释50μl)。
用PBST 1∶25稀释28.225nM的储存液以得到1.129的储存液(用1.2ml PBST稀释50μl)。
用PBST 1∶25稀释9.408nM的储存液以得到0.3763的储存液(用1.2ml PBST稀释50μl)。
用PBST 1∶25稀释3.136nM的储存液以得到0.1254的储存液(用1.2ml PBST稀释50μl)。
用PBST 1∶25稀释1.045nM的储存液以得到0.0418的储存液(用1.2ml PBST稀释50μl)。
用PBST 1∶25稀释348.459pM的储存液以得到13.938的储存液(用1.2ml PBST稀释50μl)。
用PBST 1∶25稀释116.153pM的储存液以得到4.6461的储存液(用1.2ml PBST稀释50μl)。
然后将β-淀粉样调节因子化合物(200μl)加入到含有Aβ纤丝的合适的管中。
按照常规的放射性安全方法配制放射性标记的β-淀粉样调节因子化合物，用PBS/0.1％吐温-20溶液稀释以使最终浓度为20,000dpm每100μL。用重复加样器在每管中加入100μL小样的放射性标记的β-淀粉样调节因子化合物。上述样品用Parafilm膜覆盖并在塑料放射性袋中37℃温育过夜。
为了过滤样品，预先用小体积的PBST浸湿滤器。按照制造商的说明，在两个Millipore多槽过滤装置每个过滤槽装上GF/F滤膜。将上述样品从37℃温育中取出并且利用小体积(～5ml)的冷PBST缓冲液过滤。然后用另外两个5mL体积的冷PBST缓冲液洗涤样品管。在最后一次加入样品后，允许真空抽气大约2分钟将滤膜抽至半干燥，并将滤膜转移到标记的、用于碘记数(iodination counting)的管中。记录1分钟的计数，数据绘制成图，并按照制造商的说明用Prism程序(图PAD)分析上述图。
C.晶种延伸检测
可以用晶种延伸检测测定Aβ单体溶液中，加入多聚Aβ纤维“晶种”后Aβ纤维形成的速率。待测化合物防止单体Aβ进一步沉积到先前已沉积的淀粉样物质的能力，是通过利用荧光直接指示β-片形成而测定的。与晶核形成检测对比，晶种的添加使得晶核立即形成，并且预先形成的纤丝不需要持续混合即可继续生长，因此在开始聚合之前无滞后时间。由于上述检测利用稳态聚合条件，可以在此第二检测中在不同的条件下，和在加入另加的淀粉样结构探针的条件下，对阳性化合物在晶核形成检测中的活性进行确认。
在晶种延伸检测中，单体Aβ1-40在存在“晶种”核心的条件下温育(在控制的稳态条件下，大约允许百分之十摩尔的Aβ聚合)。然后将溶液的样品用硫代四羟酮醇(thioflavin)T(Th-T)稀释。Th-T与Aβ的聚合体特异性的结合产生一种荧光复合物，使得纤丝形成程度的测量成为可能(Levine，H(1993)Protein Science2：404-410)。具体而言，Th-T与聚集的β-AP的结合，而不是与单体的或松散结合的β-AP的结合，产生一个450nm(ex)的新激发峰，并增强了482nm(em)的发射，而与之相比游离染料分别为385(ex)和445(em)。将含有足量纤丝的聚集样品的小样与Th-T混合，使得通过重复取样检测反应混合物成为可能。在过量单体存在下观察线性增长曲线。对硫代四羟酮醇T响应的β-片纤丝的形成与晶核形成检测中观察到的浑浊度的升高相平行。
用于晶种延伸检测的Aβ单体溶液的是通过在1/25体积的二甲亚砜(DMSO)中溶解适当量的Aβ肽而制备，然后加入1/2体积的水和1/2体积的2×PBS(10×PBS：NaCl 137mM，KCl 2.7mM，Na2HPO4·7H2O4.3mM，KH2PO4 1.4mM pH 7.2)使最终浓度为200μM。为了制备晶种储存液，将1ml的Aβ单体制备物在37℃温育8天并依次通过18，23，26和30号的针头分别25，25，50和100次以进行剪切。通过30号针头每50次后取出2μl剪切材料的样品进行荧光测量，直到达到荧光单位(FU)平台。待测化合物的配制是通过将适当量的待测化合物溶于1×PBS中，使终浓度达到1mM(10×储存液)。如果不溶的话，上述化合物被溶于1/10体积的DMSO中并用1×PBS稀释至1mM。进一步配制1/10稀释液，以测试每种供选化合物在100μM和10μM的作用。
为了进行晶种延伸检测，每种样品被设置成50μl的200μM单体，125FU的剪切晶种(依赖于晶种的批次的一个可变量，通常为3-6μl)和10μl的10×调节因子溶液。然后用1×PBS将样品体积调到100μl的终体积。通常测试每种调节因子的两个浓度：100μM和10μM，相当于单体和调节因子的摩尔比为1∶1和1∶10。对照试验包括未加晶种的反应以确认新鲜的单体不含有晶种，以及在无任何调节因子的加入晶种的反应，作为与待选调节因子比较的参照。检测时在37℃温育6小时，每小时取出2μl样品进行荧光测量。为了测量荧光，2μl的Aβ样品被加入到400μl的硫代四羟酮醇-T溶液(50mM磷酸钾，10mM硫代四羟酮醇-T，pH 7.5)。样品用旋涡混合器混合后，在0.5ml的微量石英比色皿中读取EX450nm和EM482nm的数值(Hitachi4500荧光计)。
β-淀粉样聚集导致硫代四羟酮醇-T的发射增强。因此，含有有效抑制性调节因子化合物的样品，表现为与无上述调节因子化合物的样品相比发射降低。实施例3：β-淀粉样调节因子化合物的分析
在本实施例中，配制了在此描述的β-淀粉样调节因子化合物并利用实施例2中所描述的聚集检测测试了它们抑制天然β-淀粉样肽聚集的能力。第一系列实验的结果在下文的表1，II和III中总结。
                              表I
    PPI#        晶核形成检测Δlag5μM        2.5μM     1.25μM                     纤丝结合Kdcmpd          参照cmpd           参照Kd
    803     ＜1     ＜1     ＜1
    913     1     1     1
    968     ＞5     ＞5     2
    969     ＞5     ＞5     3   1.13×10-9 PPI-558     3.7×10-9
    970     ＞5     ＞5     1
    992 3     1     1   2.43×10-9 PPI-558     3.70×10-9
    993     1     1     1
    1005     3     3     1
    1006     1     1     1
    *1007     4     4     3   8.64×10-10 PPI-558     1.69×10-9
    #1007     1.5     1.5     1.5   6.27×10-10 PPI-558     2.75×10-9
    1008   1.75×10-9 PPI-558     1.00×10-9
    #1013     2     ＞3     2   2.47×10-10 PPI-558     1.69×10-9
    1017   3.89×10-10 PPI-558     2.42×10-9
    1018   7.01×10-10 PPI-558     2.42×10-9
    1020   6.01×10-10 PPI-558     2.42×10-9
    1022   1.50×10-10 PPI-558     1.00×10-9
    1025   4.30×10-10 PPI-558     1.00×10-9
    1028   4.90×10-10 PPI-558     1.00×10-9
    1038   6.52×10-10 PPI-558     3.76×10-9
    1039   2.44×10-9 PPI-558     3.76×10-9
    1040   4.08×10-10 PPI-558     2.4×10-9
    1041   1.61×10-9 PPI-558     2.4×10-9
    1042   2.34×10-10 PPI-558     2.4×10-9
    1088   3.40×10-9 PPI-558     1.93×10-9
表1(续)
    1089   5.7×10-10  PPI-558   3.3×10-9
    1093   1.02×10-9  PPI-558   1.93×10-9
    1094   3.7×10-9  PPI-558   3.5×10-9
    1179   6.04×10-10  PPI-558   1.93×10-9
    1180   3.3×10-10  PPI-558   3.5×10-9
    1261   1.12×10-8  PPI-558   3.34×10-9
*晶核形成检测数据的平均数是在3，1和0.3μM化合物测量得到的
#晶核形成检测数据的平均数是在2.5，1.25和0.6μM化合物测量得到的
                             表II
    PPI#     晶核形成检测3μM      1μM       0.3μM                         纤丝结合Kdcmpd               参照empd         参照Kd
  *1019   ＞2.5   ＞2.5     2.0     4.11×10-10   PPI-558   1.69×10-9
  1019     5.34×10-10   PPI-558   1.93×10-9
  1301     1.1×10-9   PPI-1318   1.4×10-9
  1302     2.2×10-10   PPI-1318   1.4×10-9
  1303     1.1×10-9   PPI-1318   1.4×10-9
  1318   ＞5   2     1     7.7×10-11   PPI-558   2.3×10-9
  1318     1.4×10-9
  1318     6.2×10-11
  1319    ＞5   ＞5     1
  1320    ＞5   3     1     1.4×10-9   PPI-1318   6.2×10-11
  1321    ＜1   ＜1     ＜1
  1322     1.2×10-9   PPI-1318   6.2×10-11
  1323
  1324
  1325     1.4×10-9   PPI-1318   1.4×10-9
表II(续)
  1326     5.6×10-10     PPI-1318   6.2×10-11
  1327     8.2×10-10     PPI-1318   1.4×10-9
  1328     2.4×10-9     PPI-1318   6.2×10-11
  1329
  *1125     ＞2.5     ＞2.5     2.0     1.27×10-9     PPI-558   2.08×10-9
  1125     1.34×10-9     PPI-558   5.05×10-9
  1133     3.18×10-7     PPI-558   2.08×10-9
  1155     1.24×10-7     PPI-558   2.08×10-9
*晶核形成检测数据的平均数是在2.5，1.25和0.6μM化合物测量得到的
在晶核形成检测中用5μM Aβ1-40和5μM，1.25μM，3μM，1μM或0.3μM待测化合物对上述调节因子化合物进行评测。延迟时间上的改变(Δlag)表示为在存在待测化合物(5μM，2.5μM，1.25μM，3μM，1μM或0.3μM)时观察到的延迟时间和对照的延迟时间的比率。
                               表III
    PPI#     结构     纤丝结合Kdcmpd
  PPI-504     TFA·H-(lv-[3-I]y-fa)-NH2
  PPI-1181     TFA·H-(lvffl)-NH-Et
  PPI-1465     TFA·H-lvffl-NH-CH2CH2-NH2  3.6×10-9
  PPI-1603     TFA·H-(GGClvffl)-NH2
  PPI-1604     TFA·H-(GGClvfyl)-NH2
  PPI-1605     TFA·H-(GGClvf-[3-I]y-l)-NH2
  PPI-1619     2TFA·H-LVF-NH-NH-FVL-H  3.5×10-8(1125的一种类似物)
表III(续)
  PPI-1621     2TFA·H-LVF-NH-NH-fvl-H     8.7×10-9(1125的一种类似物)
  PPI-1635     TFA·H-lff-(nvl)-l-NH2     1.4×10-9
  PPI-1636     TFA·H-lf-[pF]f-(nvl)-l-NH2     1.5×10-9
  PPI-1637     TFA·H-l-[pF]f-[pF]f-(nvl)-l-NH2     1.8×10-9
  PPI-1782     TFA·Me-lvyf--NH2
  PPI-1783     TFA·H-(lvyfl)-NH2
  PPI-1784     TFA·Me-(lv-[p-F]f-fl)-NH2     2.5×10-9
  PPI-1785     TFA·H-(lv-[p-F]f-fl)-NH2     2.8×10-9
  PPI-1786     TFA·H-(lvf-[p-F]f-l)-NH2
  PPI-1787     TFA·Me-lvff-[nvl])-NH2     5.8×10-9
  PPI-1788     TFA·Me-(lvff-[nle])-NH2     (～4×10-9)3-点检测
  PPI-1799     TFA·Me-lvffl)-OH
  PPI-1800     TFA·Me-(lvffl)-NH-OH     (～4×10-9)3-点检测
  PPI-1805     TFA·H-(lv-[p-F]f-f-(nvl))-NH2
  PPI-1806     TFA·Me-(l-v-[p-F]f-f-(nvl))-NH2
  PPI 1807     TFA·H-((nvl)-v-[p-F]f-f-nvl)-NH2
  PPI-1818     TFA·H-(l-(nvl)-[p-F]f-f-(nvl)-NH2
  PPI 1819     TFA·H-((nvl)-(nvl)-[p-F]f-f-(nvl))-NH2
  PPI 1820     TFA·Me-(l-(nvl)-[p-F]f-f-(nvl))-NH2
  PPI 1827     TFA·H-(lvff-(nvl))-NH2
  PPI 1828     Ac-(lvffl)-NH2
  PPI 1829     Ac-(lvffl)-OH
  PPI 1830     TFA·H-(lv-[3-I]y-fl)-NH2
(nvl)＝D-正缬氨酸
(nle)＝D-正亮氨酸
[3-I]y＝3-碘-D-酪氨酸
p-F]f＝对-氟-D-苯丙氨酸
PPI-1801是文献中报道的H-LPFFD-OH的乙酰胺类似物。配制上述化合物并测试其活性以进行比较。结果表明在本文所用的检测中，上述化合物与纤丝的结合很弱。
与之相比，表I，II，III所显示的结果以及图2表明本发明的β-淀粉样调节因子是Aβ聚集的有效抑制剂。
实施例6：神经毒性检测
利用大鼠或人的神经元来源的细胞系(分别为PC-12细胞或NT-2细胞)和活性指示剂3，(4，4-二甲基噻唑-基)2，5-二苯基-四唑溴化物(MTT)，可以在基于活细胞的检测中，在有或无β-淀粉样调节因子的条件下对天然β-淀粉样肽聚集的神经毒性进行检测(类似的基于细胞的活性检测的描述参见，例如，Shearman，M.S.et al.(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：1470-1474；Hansen，M.B.et al.(1989)J.Immun.Methods 119：203-210)。PC-12是一种大鼠嗜铬细胞瘤细胞系，可以从美国典型培养物保存中心，Rockville，MD(ATCC CRL 1721)获得。MTT(可以通过商业途径从Sigma Chemical Co.获得)是生色的底物，在活细胞中它从黄色被转化成蓝色，可以通过分光光度法探测。
为了检测天然β-淀粉样肽的神经毒性，首先配制新鲜的Aβ单体和老化的Aβ聚集物。从冻干的粉末中配制溶于100％DMSO的Aβ1-40并立即用H2O稀释到终体积的一半，然后用终体积一半的2×PBS稀释，以便得到最终浓度为200μM的肽，4％DMSO。用这种方式配制并立即在细胞上测试的肽被称为“新鲜”的Aβ单体。为了配制“老化”的Aβ聚集物，将肽溶液置于1.5ml的Eppendorf管中并在37℃温育八天以使得纤丝形成。这样“老化的”Aβ肽可以直接在细胞上测试或在-80℃冷冻。利用PC12和NT2细胞检测新鲜单体和老化聚集物神经毒性。PC12细胞通常在Dullbecco’s修正的Eagle’s培养基(DMEM)中培养，上述培养基含有10％的马血清，5％胎牛血清，4mM谷氨酸盐，和1％庆大霉素。NT2细胞通常在用10％胎牛血清，2mM谷氨酸盐和1％庆大霉素补充的OPTI-MEM培养基(GIBCO BRL CAT.#31985)中培养。在处理之前3-4小时将每孔10-15,000细胞放入96孔组织培养板中，每孔90μl的新鲜培养基。然后用组织培养基1∶10直接稀释新鲜或老化的Aβ肽溶液(10μl)，以便使最终浓度在1-10μM肽之间。细胞在含有肽的条件下37℃温育48小时，不更换培养基。在细胞暴露于β-AP制备物的最后3小时，在培养基中加入MTT以使最终浓度为1mg/ml并在37℃继续温育。在与MTT温育2小时后，去除培养基并且将细胞在100μL异丙醇/0.4N HCl中振动使之裂解。在每孔中加入等体积的PBS并将板继续振动10分钟。利用微量板读数仪在570nm测量每孔的吸收，以测定活细胞数量。
利用上述检测，确认了单独的老化(5到8天)Aβ1-40聚集物，而不是单独的新鲜Aβ1-40单体，的神经毒性。实验表明将神经细胞与渐增的新鲜Aβ1-40温育对细胞无显著的毒性，而将神经细胞与渐增的5天或8天Aβ1-40聚集物的温育导致渐增的神经毒性。老化的Aβ1-40聚集物对于PC12细胞和NT2细胞的毒性的EC50都是1-2μM。
为了确定β-淀粉样调节因子化合物对Aβ1-40聚集物的神经毒性的影响，调节因子化合物与Aβ1-40单体在如实施例2所描述的常规晶核检测条件下预先温育，并且在温育后特定的时间间隔取出β-AP/调节因子溶液的小样，并且1)评估溶液的浑浊度作为对聚集的测量以及2)将溶液加入到培养的神经细胞中48小时，在该时间利用MTT评估细胞的生存能力以确定溶液的神经毒性。另外，可以检测β-淀粉样调节因子化合物减少预先形成的Aβ1-40聚集物的神经毒性的能力。在这些实验中，在无任何调节因子的条件下温育单体预先形成Aβ1-40聚集物。然后将调节因子化合物与预先形成的Aβ1-40聚集物在37℃温育24小时，之后收集β-AP/调节因子溶液并且如上文所述评定其神经毒性。
实施例7：检测调节因子化合物在脑脊液中稳定性
调节因子化合物在脑脊液中的稳定性可以通过下文所述的体外检测进行检测。制备含有75％恒河猴CSF(可通过商业途径从Northern Biomedical Research获得)，23％无菌磷酸盐缓冲液和2％二甲亚砜(v/v)(Aldrich Chemical Co.，Catalog No.27，685-5)的CSF溶液。将待测调节因子化合物加入到CSF溶液中以使最终浓度为40μM或15μM。所有的样品处理都是在层流罩(laminarflow hood)中进行，并且在检测中待测溶液维持在37℃。24小时后，通过加入终浓度为25％(v/v)的乙腈而抑制溶液的酶活性。用反相型HPLC在室温下分析样品(在0时间点和24小时时间点)。使用微孔柱子以达到最大的灵敏度。用于分析型HPLC的参数如下：
溶剂系统
A：0.1％三氟乙酸(TFA)水溶液(v/v)
B：0.085％TFA/乙腈，1％H2O(v/v)
注射和梯度
注射：100-250μL的待测样品
运行：10％的B 5min.，然后10-70％B大于60min。
利用Hewlett Packard 1090系列II HPLC进行色谱分析。用于分离的柱子是C4，5μm，1×250mm(Vydac#214TP51)。流动速率是50μL/min并且在214，230，260和280nm监测待测化合物的洗脱情况。
实施例8：脑提取检测
对大鼠进行静脉给药后，测定了我们的Aβ衍生肽的脑水平。在开他敏/甲苯噻嗪麻醉下，通过插入在左颈静脉中的导管使雄性Sprague-Dawley鼠(219-302g)接受静脉注射(4mL/kg的剂量体积施用1分钟以上)。每种测试化合物的实际施用剂量列在图1中。
在给药后60分钟，将导管插入左颈主动脉以便能够进行左前脑的灌注从而去除脑血液。如(Triguero et al.(1990)J.Neurochem.54：1882-1888)所描述由于毛细血管损耗(capillary depletion)左前脑血液被排空。这种确立的技术将脑脉管系统从软组织中分离出来，并因此，允许精确测定研究中的化合物穿过血脑屏障的浓度，。通过LC/MS/MS测定了存在于脑中的亲本化合物的量。
上述检测被用于测量脑对以下调节因子的吸收：化合物                                                   剂量PPI     结构                             分子量  浓度    mg/kg
                                             (mg/mL) IV1324    TFA.H-(l-[F5]f-fvl)-NH2           841    1.20    4.91318    TFA.H-(lf-D-Cha-vl)-NH2           757    0.29    1.01319    TFA.H-(lf-[p-F]f-vl)-NH2          769    1.70    6.61327    TFA.H-(l-[p-F]f-[p-F]f-vl)-NH2    787    0.98    4.01301    TFA.H-(lvf-D-Cha-l)-NH2           757    0.70    2.91302    TFA.H-(lvf-[p-F]f-l)-NH2          769    0.19    0.71328    TFA.H-(l-[F5]f-[F5]f-vl)-NH2    931    0.29    1.21322    TFA.H-(l-D-Cha-fvl)-NH2           757    0.03    0.11303    TFA.H-(lvf-[F5]f-l)-NH2          841    0.27    1.01326    TFA.H-(l-D-Cha-D-Cha-vl)-           763    0.05    0.2
               NH21320    TFA.H-(lf-[F5]f-vl)-NH2          841    0.70    3.0
*小写字母注释指D-构型结果总结于图1中。本文所描述的β-淀粉样调节因子化合物在下面的表格中总结。
                            表IV
    PPI#     描述   SEQ ID NO
    803     TFA·N，N-二甲基-(Gaffvl)-NH2
    913     TFA·N，N-二甲基-(affvl)-NH2
    918     TFA·H-(l-[Me]v-ffa)-NH2
    968     TFA·N-甲基-(Gaffvl)-NH2
    969     TFA·N-乙基-(Gaffvl)-NH2
    970     TFA·N-异丙基-(Gaffvl)-NH2
    992     TFA·H-(lvffa)-异丙酰胺
    993     TFA·H-(lvffa)-二甲酰胺
    1005     TFA·N，N-二乙基(Gaffvl)-NH2
    1006     TFA·N，N-二乙基(affvl)-NH2
    1007     TFA·N，N-二甲基-(lvffl)-NH2
    1008     TFA·N，N-二甲基-(lffvl)-NH2
    1013     TFA·H-(Glvffl)-NH2
    1017     TFA·N-乙基-(Glvffl)-NH2
    1018     TFA·N-乙基-(Glfffvl)-NH2
    1020     TFA·N-甲基-(lffvl)-NH2
    1022     TFA·N-乙基-(lvffl)-NH2
    1025     TFA·N-丙基-(lvffl)-NH2
    1028     TFA·N，N-二乙基-(Glvffl)-NH2
    1038     TFA·H-(ivffi)-NH2
    1039     TFA·H-(ivffa)-NH2
    1040     TFA·H-(iiffi)-NH2
    1041     TFA·H-(D-Nle-vffa)-NH2
    1042     TFA·H-(D-Nle-vff-D-Nle)-NH2
    1088     TFA·1-哌啶-乙酰-(lvffl)-NH2
    1089     TFA·1-哌啶-乙酰-(lffvl)-NH2
    1093     TFA·H-lvffl-异丙酰胺
    1094     TFA·H-lffvl-异丙酰胺
    1179     TFA·H-(lvffl)-甲酰胺
    1180     TFA·H-(lffvl)-甲酰胺
    1261     TFA·H-(lvffl)-OH
    1019     TFA·N-甲基-(lvffl)-NH2
    1301     TFA·H-(lvf-D-Cha-l)-NH2
    1302     TFA·H-(lvf-[p-F]f-l)-NH2
    1303     TFA·H-(lvf-[F5]f-l)-NH2
    1306     N-甲基-(lvf-D-Cha-l)-NH2
    1307     N-甲基-(lvf-[p-F]f-l)-NH2
    1308     N-甲基-(lvf-[F5]f-l)-NH2
    1318     TFA·H-(lf-D-Cha-vl)-NH2
    1319     TFA·H-(lf-[p-F]f-vl)-NH2
    1320     TFA·H-(lf-[F5]f-vl)-NH2
    1321     2TFA·H-(lfkvl)-NH2
    1322     TFA·H-(l-D-Cha-fvl)-NH2
    1323     TFA·H-(l-[p-F]f-fvl)-NH2
    1324     TFA·H-(l-[F5]f-fvl)-NH2
    1325     2TFA·H-(lkfvl)-NH2
    1326     TFA·H-(l-D-Cha-D-Cha-vl)-NH2
    1327     TFA·H-(l-[p-F]f-[p-F]f-vl)-NH2
    1328     TFA·H-(l-[F5]f-[F5]f-vl)-NH2
    1329     3TFA·H-(lkkvl)-NH2
    1125     2TFA·H-lvf-NH-NH-fvl-H
    1133     TFA·H-lvf-NH-NH-Acetyl
    1155     TFA·H-lvf-NH-NH2
对等实施例
本领域的技术人员将认识到，或仅仅利用常规实验就能确认本文所描述的本发明的特定实施方案的许多对等实施例。上述的对等实施例将被包括在下面的权利要求中。
                              序列表<110>Praecis Pharmaceuticals，Inc.<120>MODULATORS OF β-淀粉样肽聚集调节分子<130>PPI-068CPPC<140>PCT/US00/05574<141>2000-03-03<150>USSN 60/122,736<151>1999-03-04<160>4<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>43<212>PRT<213>Homo sapiens<214>智人<400>1Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys1               5                  10                  15Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile
         20                  25                  30Gly Leu Het Val Gly Gly Val Val Ile Ala Thr
     35                  40<210>2<211>103<212>PRT<213>Homo sapiens<214>智人<400>2Glu Val Lys Met Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val1               5                  10                  15His His Gln Lys Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys
         20                  25                  30Gly Ala Ile Ile Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala Thr Val
     35                  40                  45Ile Val Ile Thr Leu Val Met Leu Lys Lys Lys Gln Tyr Thr Ser Ile
 50                  55                  60His His Gly Val Val Glu Val Asp Ala Ala Val Thr Pro Glu Glu Arg65                  70                  75                  80His Leu Ser Lys Met Gln Gln Asn Gly Tyr GLu Asn Pro Thr Tyr Lys
             85                  90                  95Phe Phe Glu Gln Met Gln Asn
        100<210>3<211>4<212>PRT<213>Artificial Sequence<214>人工序列<220><223>人工序列的描述：淀粉样沉积抑制肽<400>3Leu Val Phe Phe<210>4<211>5<212>PRT<213>Artificial Sequence<214>人工序列<220><223>人工序列的描述：淀粉样沉积抑制肽<400>4Leu Val Phe Phe Ala1               5

Claims (14)

1.一种含有以下结构的化合物：
Figure A0080719200021
其中Xaa1和Xaa2各为D-氨基酸结构，并且Xaa1和Xaa2中至少两个独立地选自D-亮氨酸结构，D-苯丙氨酸结构，D-酪氨酸结构，D-碘酪氨酸结构，D-赖氨酸结构或D-缬氨酸结构；
NH-NH是肼结构；
Y，可以存在或不存在，它是具有公式(Xaa)a的结构，其中，Xaa是任何D-氨基酸结构并且a为1-15的整数；
Xaa1’，Xaa2’，Xaa3’，可以存在或不存在，各为D-氨基酸或L-氨基酸结构并且Xaa1’，Xaa2’，Xaa3’中至少有两个独立地选自D-或L-亮氨酸结构，D-或L-苯丙氨酸结构，D-或L-酪氨酸结构，D-或L-碘酪氨酸结构，D-或L-赖氨酸结构或D-或L-缬氨酸结构；
Z，可以存在或不存在，它是具有公式(Xaa)b的结构，其中，Xaa是任何D-氨基酸结构并且b为1-15的整数；
A，可以存在或不存在，它是直接或间接与化合物连接的修饰基团；并且
n为1-15的整数；
其中，对Xaa1，Xaa2，Xaa1’，Xaa2’，Xaa3’，Y，Z，A和n进行选择，以便当所述的化合物与天然β-淀粉样肽接触时，该化合物与β-淀粉样肽结合或调节天然β-淀粉样肽的聚集或抑制其神经毒性，并且该化合物更不易于被代谢。
2.一种含有如下结构的化合物，该结构选自：H-D-Leu-D-Val-D-Phe-NH-(H-D-Leu-D-Val-D-Phe-)NH；H-D-Leu-D-Val-D-Phe-NH-NH-COCH3；and H-D-Leu-D-Val-D-Phe-NH-NH2.
3.一种含有如下结构的化合物：
Figure A0080719200031
其中，Xaa1，Xaa2，Xaa3，Xaa4各为D-氨基酸结构，并且Xaa1，Xaa2，Xaa3，Xaa4中至少有两个独立地选自D-亮氨酸结构，D-环己基丙氨酸，D-4-氟苯丙氨酸(对-氟苯丙氨酸)，D-五氟苯丙氨酸，氯苯丙氨酸，溴苯丙氨酸，硝基苯丙氨酸，D-高苯丙氨酸，D-赖氨酸，和D-缬氨酸结构；
Y，可以存在或不存在，它是具有公式(Xaa)a的结构，其中，Xaa是任何D-氨基酸结构并且a为1-15的整数；
Z，可以存在或不存在，它是具有公式(Xaa)b的结构，其中，Xaa是任何D-氨基酸结构并且b为1-15的整数；
A，可以存在或不存在，它是直接或间接与所述的化合物连接的修饰基团；并且
n为1-15的整数；
其中，对Xaa1，Xaa2，Xaa3，Xaa4，Y，Z，A和n进行选择，以便当所述的化合物与天然β-淀粉样肽接触时，该化合物与天然β-淀粉样肽结合或调节天然β-淀粉样肽的
聚集或抑制其神经毒性，并且该化合物更不易于被代谢。
4.一种含有如下结构的化合物，该结构选自：N，N-二甲基-(Gly-D-Ala-D-Phe-D-Phe-D-Val-D-Leu)-NH2；N，N-二甲基-(D-Ala-D-Phe-D-Phe-D-Val-D-Leu)-NH2；N-甲基-(Gly-D-Ala-D-Phe-D-Phe-D-Val-D-Leu)-NH2；N-乙基-(Gly-D-Ala-D-Phe-D-Phe-D-Val-D-Leu)-NH2；N-异丙基-(Gly-D-Ala-D-Phe-D-Phe-D-Val-D-Leu)-NH2；H-(D-Leu-D-Val-D-Phe-D-Phe-D-Ala)-
异丙酰胺；H-(D-Leu-D-Val-D-Phe-D-Phe-D-Ala)-二甲酰胺；N，N-二乙基-(Gly-D-Ala-D-Phe-D-Phe-D-Val-D-Leu)-NH2；N，N-二乙基-(D-Ala-D-Phe-D-Phe-D-Val-D-Leu)-NH2；N，N-二甲基-(D-Leu-D-Val-D-Phe-D-Phe-D-Leu)-NH2；N，N-二甲基-(D-Leu-D-Val-D-Phe-D-Phe-D-Leu)-NH2；N，N-二甲基-(D-Leu-D-Phe-D-Phe-D-Val-D-Leu)-NH2；H-(Gly-D-Leu-D-Val-D-Phe-D-Phe-D-Leu)-NH2；N-乙基-(Gly-D-Leu-D-Val-D-Phe-D-Phe-D-Leu)-NH2；N-乙基-(Gly-D-Leu-D-Phe-D-Phe-D-Val-D-Leu)-NH2；N-甲基-(D-Leu-D-Phe-D-Phe-D-Val-D-Leu)-NH2；N-乙基-(D-Leu-D-Val-D-Phe-D-Phe-D-Leu)-NH2；N-丙基-(D-Leu-D-Val-D-Phe-D-Phe-D-Leu)-NH2；N，N-二乙基-(Gly-D-Leu-D-Val-D-Phe-D-Phe-D-Leu)-NH2；H-(D-Ile-D-Val-D-Phe-D-Phe-D-Ile)-NH2；H-(D-Ile-D-Val-D-Phe-D-Phe-D-Ala-)-NH2；H-(D-Ile-D-Ile-D-Phe-D-Phe-D-Ile)-NH2；H-(D-Nle-D-Val-D-Phe-D-Phe-D-Ala-)-NH2；H-(D-Nle-D-Val-D-Phe-D-Phe-D-Nle)-NH2；1-哌啶-乙酰-(D-Leu-D-Val-D-Phe-D-Phe-D-Leu)-NH2；1-哌啶-乙酰-(D-Leu-D-Phe-D-Phe-D-Val-D-Leu)-NH2；H-D-Leu-D-Val-D-Phe-D-Phe-D-Leu-异丙酰胺；H-D-Leu-D-Phe-D-Phe-D-Val-D-Leu-异丙酰胺；H-(D-Leu-D-Val-D-Phe-D-Phe-D-Leu)-甲酰胺；H-(D-Leu-D-Phe-D-Phe-D-Val-D-Leu)-甲酰胺；H-(D-Leu-D-Val-D-Phe-D-Phe-D-Leu)-OH；N-甲基-(D-Leu-D-Val-D-Phe-D-Phe-D-Leu)-NH2；H-(D-Leu-D-Val-D-Phe-D-Cha-D-Leu)-NH2；H-(D-Leu-D-Val-D-Phe-D-[p-F]Phe-D-Leu)-NH2；H-(D-Leu-D-Val-D-Phe-D-[F5]Phe-D-Leu)-NH2；H-(D-Leu-D-Phe-D-Cha-D-Val-D-Leu)-NH2；H-(D-Leu-D-Phe-D-[p-F]Phe-D-Val-D-Leu)-NH2；H-(D-Leu-D-Phe-D-[F5]Phe-D-Val-D-Leu)-NH2；H-(D-Leu-D-Phe-D-Lys-D-Val-D-Leu)-NH2；H-(D-Leu-D-Cha-D-Phe-D-Val-D-Leu)-NH2；H-(D-Leu-D-[p-F]Phe-D-Phe-D-Val-D-Leu)-NH2；H-(D-Leu-D-[F5]Phe-D-Phe-D-Val-D-Leu)-NH2；H-(D-Leu-D-Lys-D-Phe-D-Val-D-Leu)-NH2；H-(D-Leu-D-Cha-D-Cha-D-Val-D-Leu)-NH2；H-(D-Leu-D-[p-F]Phe-D-[p-F]Phe-D-Val-D-Leu)-NH2；H-(D-Leu-D-[F5]Phe-D-[F5]Phe-D-Val-D-Leu)-NH2；H-(D-Leu-D-Lys-D-Lys-D-Val-D-Leu)-NH2；N-甲基-(D-Leu-D-Val-D-Phe-D-Cha-D-Leu)-NH2；N-甲基-(D-Leu-D-Val-D-Phe-
D-[p-F]Phe-D-Leu)-NH2；N-甲基-(D-Leu-D-Val-D-Phe-D-[F5]Phe-D-Leu)-NH2；H-
D-Leu-D-Val-D-Phe-NH-(H-D-Leu-D-Val-D-Phe-)NH；H-D-Leu-D-Val-D-Phe-NH-
NH-COCH3；和H-D-Leu-D-Val-D-Phe-NH-NH2.
5.一种具有结构化合物：
H-(D-Leu-D-Phe-[p-F]D-Phe-D-Val-D-Leu)-NH2.
6.一种具有结构化合物：
N-甲基-(D-Leu-D-Val-D-Phe-D-Phe-D-Leu)-NH2
7.一种药用组合物，其含有权利要求1，2，3，4，5或6任何一项中的治疗有效量的化合物以及药用上可接受的载体。
8.一种抑制天然β-淀粉样肽聚集的方法，该方法包括将天然β-淀粉样肽与权利要求1，2，3，4，5，或6任何一项中的化合物接触，以便抑制天然β-淀粉样肽的聚集。
9.一种在生物样品中检测天然β-淀粉样肽存在与否的方法，该方法包括：
将生物样品与任何权利要求1，2，3，4，5，或6的化合物接触，其中上述化合物用可探测的物质标记；并且
检测化合物与天然β-淀粉样肽的结合从而检测生物样品中天然β-淀粉样肽存在与否。
10.根据权利要求9的方法，其中β-淀粉样调节因子化合物和生物样品是在体外接触。
11.根据权利要求9的方法，其中通过在病人中施用β-淀粉样调节因子化合物将β-淀粉样调节因子化合物与生物样品接触。
12.根据权利要求9的方法，其中所述的化合物用放射性锝或放射性碘标记。
13.一种治疗具有与β-淀粉样变性病相关病症的病人的方法，包括：
在病人中施用任何权利要求1，2，3，4，5，或6的化合物的治疗有效量，以便治疗与具有β-淀粉样变性病相关病症的病人。
14.根据权利要求13的方法，其中所述病症是阿尔茨海默氏病。
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