KR20220109351A - 신규한 재조합 뉴캣슬바이러스벡터 및 이를 포함하는 백신 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 고병원성 조류 인플루엔자의 헤마글루티닌 유전자를 포함하는 재조합 뉴캣슬바이러스 벡터 및 이를 이용한 백신 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 기존의 뉴캣슬바이러스 벡터 백신의 주요 타겟이 닭이었던 것에 반해 오리를 포함한 광범위한 가금류에서의 백신 효과도 기대할 수 있다.

Description

신규한 재조합 뉴캣슬바이러스벡터 및 이를 포함하는 백신 조성물{Novel Recombinant Newcastle Disease Virus and An Vaccine Composition Comprising the Same}

본 발명은 고병원성 조류 인플루엔자의 헤마글루티닌 유전자를 포함하는 재조합 뉴캣슬바이러스 벡터 및 이를 이용한 백신 조성물에 관한 것이다

인플루엔자 바이러스는 Orthomyxoviridae에 속하는 RNA 바이러스이며 그 타입에 따라 A형, B형, C형으로 나뉜다. 이 중 A타입은 사람, 돼지, 조류 등에 감염이 가능하며 특히 감염 및 전염성이 높은 야생조류와 가금류는 조류인플루엔자 전파의 주요 요인으로 작용한다. 인플루엔자의 유전자는 여덟 부분(8 segment)으로 나누어져 있으며 이 중 두 구조단백질인 헤마글루티닌(HA)과 뉴라미니다제(NA)의 특성에 따라 H1에서 H16까지 16종, N1에서 N9까지 9종의 아형으로 나뉘어진다. 이 두 단백질의 조합을 통해 이론적으로 144개의 아형이 존재할 수 있다.

조류 인플루엔자바이러스(Avian influenza Virus, 이하, "AIV")는 그 병원성에 따라 고병원성 조류인플루엔자 바이러스(Highly Pathogenic Avian Influenza, 이하, "HPAIV")와 저병원성 조류인플루엔자 바이러스(Low Pathogenic Avian Influenza 이하, "LPAIV")로 나뉘어지며 현재까지 HPAIV는 H5형 또는 H7형에 한해서 발생하였다. HPAIV는 닭에서 100%에 달하는 폐사율을 나타내는 질병이며, 국제수역사무국(OIE)에서 A 질병으로 분류하였으며 국내에서 제1종 가축 전염병으로 분류하였다. H5형 HPAIV는 그 항원성에 따라서 클래이드(Clade)가 나뉜다. 국내에선 2014년에서 2018년까지 clade 2.3.4.4 HPAIV가 유행을 하였으며 2020년에도 국내 철새 분변에서 clade 2.3.4.4 H5N8 HPAIV가 분리되었다. HPAIV는 종숙주인 물새류(waterfowl)에서 전파가 일어나다가 철새를 통해 오리농장, 양계농장 순으로 전파가 이루어진다. HPAIV는 가금류에서 전염성이 높고 폐사율이 높아 발병시 오리 및 양계 농장에서 막대한 경제적 손실을 야기한다. 현재 국내에선 HPAIV에 대한 백신을 실시하지 않고 살처분 정책을 통해 고병원성 조류인플루엔자에 대한 대응을 하고 있으나 양계 및 오리 농장에 대한 살처분 보상금 및 환경문제, 윤리적 문제가 끊이지 않고 제기되고 있다. 따라서 HPAIV에 대한 백신 개발의 필요성이 대두되고 있다.

HPAIV에 대한 백신은 사독 백신(inactivated AIV vaccine), 약독화 백신(attenuated vaccine), 벡터백신(Viral vector vaccine)이 있다. 벡터 백신은 체액성 면역반응을 유도할 뿐만이 아니라 바이러스 감염 시 면역반응에 중요하게 작용하는 세포독성 T 세포(Cytotoxic lymphocyte)을 유도할 수 있다. 뉴캣슬병 바이러스(NDV; Newcastle disease virus), 칠면조 허피스 바이러스(turkey herpesvirus) 마렉병 바이러스(Marek's disease virus)가 조류 인플루엔자에 대한 재조합 벡터 백신으로 사용될 수 있다.

뉴캣슬병은 NDV에 의해 발생되는 닭의 질병으로 대부분의 조류에 대하여 감수성을 가지며 닭에서 침울, 녹변, 사경, 결막염등의 임상증상을 유발한다. NDV는Paramyxoviridae Avulavirus에 속하는 Avian Paramyxovirus Type-1 (APMV-1) 바이러스이며 비-분절형 단일가닥 RNA 바이러스(non-segmented ssRNA virus)이다. NDV는 NP(nucleoprotein), P(phosphoprotein), M(matrix), F(Fusion), HN (Hemagglutinin-neuraminidase), L(Large) 단백질로 구성되어 있다. NDV는 병원성에 따라 약독주(lentogenic), 중간독주(mesogenic), 강독주(velogenic)로 나누어지며, 이 중 약독주는 병원성이 낮고 복제가 호흡기계 내에서 제한적으로 일어나 벡터 백신으로 사용된다.

뉴캣슬 벡터 백신은 역유전학 시스템(reverse genetic system)으로 바이러스의 유전자를 조작하여 만들어지며 유전자 조작 과정에서 외부 유전자를 삽입하여 제작한다. 외부 유전자는 뉴캣슬의 여섯가지 유전자 중 P 유전자와 M 유전자 사이에 삽입이 되었을 때 가장 안정적이며 단백질 형성이 많이 되는 것으로 알려져 있다. 현재 벡터백신으로 가장 많이 사용되는 NDV는 LaSota 균주이다.

HPAIV는 겨울철 철새를 통해 국내로 유입이 되며 오리농장에서 양계농장으로 순차적으로 전파되기 시작한다. 현재 산란계 및 육계에 적용할 수 있는 NDV 벡터백신은 개발이 되어있으나 오리에 적용될 수 있는 NDV 벡터백신의 개발연구는 부족한 실정이다. 본 발명자들은 이러한 문제점을 해결하고자 노력한 결과, 역유전자법을 이용하여 야생오리에서 분리된 K148/08 NDV(KCTC 11570BP)를 사용하여 바이러스 벡터를 제작하고 HPAIV H5N6 혈청형 바이러스의 HA 유전자를 삽입하여 벡터 백신을 제작하고 상기 벡터 백신의 효과가 우수함을 확인하여 본 발명을 완성하게 되었다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

특허문헌 1. 대한민국 공개특허공보 제10-2013-0126549호

본 발명의 목적은 HA 항원 단백질 또는 이의 기능적 일부를 인코딩하는 핵산 분자를 포함하는 재조합 뉴캣슬병 바이러스 벡터를 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 HA 항원 단백질을 발현하는 재조합 뉴캣슬병 바이러스를 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 바이러스 벡터를 유효성분으로 포함함으로써 체액성 면역반응과 세포성 면역반응을 동시에 유발하는 고병원성 조류인플루엔자 바이러스에 대한 효율적인 백신 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 백신 조성물을 대상체, 구체적으로는 조류, 보다 구체적으로는 가금류, 가장 구체적으로는 닭 또는 오리에 투여하는 단계를 포함하는 고병원성 조류인플루엔자의 예방 또는 치료 방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 조류인플루엔자 유래 헤마글루티닌(HA) 단백질 또는 이를 암호화하는 핵산 분자를 포함하는 재조합 뉴캣슬병 바이러스 벡터를 제공한다.

본 발명은 닭 뿐만 아니라 오리와 같은 가금류에도 광범위하게 적용가능한 재조합 뉴캣슬병 바이러스 백신을 개발하기 위하여, 역유전자법을 이용하여 야생오리에서 분리된 K148/08 NDV(KCTC 11570BP) 벡터 시스템을 이용하고, HPAIV H5N6 혈청형 바이러스의 HA 유전자를 삽입하여 고병원성 조류인플루엔자 바이러스에 대해 효과적인 방어가 가능한 혁신적인 백신을 개발하고자 하였다.

상기 뉴캣슬병 바이러스 벡터는 5'에서 3' 방향으로 순차적으로 NP, P, M, F, HN 및 L 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 것이며, 상기 HA 단백질을 암호화하는 유전자는 상기 뉴캣슬병 바이러스 벡터의 P(phosphoprotein) 유전자와 M(matrix) 유전자 사이에 삽입 또는 위치하는 것일 수 있다. 구체적 구현예에 따르면, 상기 헤마글루티닌(HA) 단백질 또는 이를 암호화하는 핵산 분자가 뉴캣슬병 바이러스 벡터에 삽입된 일 예를 도 1에 나타내었다.

본 발명에 사용가능한 뉴캣슬병 바이러스 벡터는 뉴캣슬병 바이러스 벡터의 5'에서 3'방향으로 순차적으로 NP, P, M, F, HN 및 L 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 것일 수 있으며, 또한 상기 NP 단백질의 암호화 유전자의 5'-말단에 연결된 T7 promoter, 리더 서열 및 3' UTR 서열과, 상기 L 단백질의 암호화 유전자의 3'-말단에 5'UTR, 트레일러 서열 및 T7 terminator 서열을 추가로 포함하는 것일 수 있다.

본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 본 발명에 사용가능한 뉴캣슬병 바이러스 벡터는 약독화 균주(lentogenic) 벡터일 수 있으며, 보다 구체적으로는 선형의 플라스미드 백터일 수 있으며, 가장 구체적으로는 기탁번호 KCTC 11570BP로 기탁된 NDV K148/08 뉴캣슬병 바이러스 벡터일 수 있다.

본 발명의 바람직한 재조합 뉴캣슬병 바이러스 벡터는 하기 도 1에 개시된 플라스미드 벡터일 수 있으며, 서열번호 43로 표시되는 것을 특징으로 하는 pK148/ES2-HA 벡터일 수 있다.

본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 HA 단백질은 HPAIV(Highly Pathogenic Avian Influenza virus)의 H5N6 혈청형 HA 단백질일 수 있으며, 보다 구체적으로는 clade 2.3.4.4e H5N6 A/Duck/Korea/ES2/16(ES2) HPAIV의 HA 단백질일 수 있다. 상기 HA 단백질은 헤마글루티닌(hemagglutinin: HA) 단백질로, 적혈구응집 단백질 또는 혈구응집소라고도 불린다. 상기 HA 단백질의 암호와 유전자는 서열번호 42로 표시되는 것일 수 있다.

상기 헤마글루티닌 단백질의 절단 부위(cleavage site)는 돌연변이된 것일 수 있다. 상기 돌연변이는 삽입, 절단, 결실, 치환, 점 돌연변이, 또는 격자이동 돌연변이된 것일 수 있다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 재조합 뉴캣슬병 바이러스 벡터를 도입한 재조합 뉴캣슬병 바이러스를 제공한다.

본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 재조합 뉴캣슬병 바이러스는 키메라 바이러스일 수 있고, 이는 clade 2.3.4.4e H5N6 A/Duck/Korea/ES2/16(ES2) HPAIV의 HA 단백질을 발현하는 것일 수 있다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 전술한 재조합 뉴캣슬병 바이러스 벡터 또는 재조합 뉴캣슬병 바이러스를 유효성분으로 포함하는 백신 조성물을 제공한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 전술한 재조합 뉴캣슬병 바이러스 벡터 또는 재조합 뉴캣슬병 바이러스를 유효성분으로 포함하는 고병원성 조류인플루엔자의 감염증 예방용 조류 면역화용 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 재조합 뉴캣슬병 바이러스 벡터 또는 재조합 뉴캣슬병 바이러스 및 적어도 하나의 수의학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 포함하는 백신 조성물 또는 면역원성 조성물이 제공된다.

본 발명에 따른 재조합 뉴캣슬병 바이러스 벡터 또는 재조합 뉴캣슬병 바이러스는 전술한 바와 같다.

본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 백신 조성물은 생독 백신, 사독 백신, 서브유니트 백신, 벡터 백신, 키메라 백신 및 DNA 백신을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 백신 조성물 또는 면역원성 조성물은 독감 또는 조류 독감을 예방하기 위한 것일 수 있다. 상기 백신 조성물은 조류(예, 닭, 오리) 또는 포유류(예, 사람, 돼지, 개, 고양이, 말, 소, 양, 마우스, 낙타)에 투여하기 위한 것일 수 있다. 상기 예방은 상기 백신 조성물의 투여에 의해 인플루엔자 바이러스에 의해 유발되는 질환(예, 독감, 조류 독감)의 발생을 억제하거나 그의 발병을 지연시키는 모든 행위를 말한다.

상기 면역원성 조성물은 고병원성 조류인플루엔자로부터 발현되는 관심의 항원 또는 면역원에 대해 면역 반응을 유발시키는 임의의 조성물을 의미하는 것으로, 예를 들면, 대상에 투여될 후 관심의 표적 면역원 또는 항원에 대해 면역 반응을 유발시킬 수 있는 조성물을 포함한다.

상기 백신 조성물은 관심의 항원에 대하여 방어 면역 반응을 유도하거나 또는 그 항원에 대해 효과적으로 방어하는 조성물을 의미하는 것으로, 예를 들면, 대상에 투여하거나 주사된 후 표적 항원 또는 면역원에 대해 방어 면역 반응을 유발시키거나 또는 고병원성 조류인플루엔자, 바람직하게는 본 발명에 따른 인플루엔자 바이러스에 의해 유발되는 질환(예, 독감, 조류 독감)에 대해 효과적인 방어를 제공하는 임의의 조성물을 포함한다.

상기 백신 조성물이 투여되는 대상은 조류 또는 포유류에 속하는 동물을 포함하나, 바람직하게는 조(Aves) 강에 속하는 임의의 모든 가내 및 야생 조류를 의미하는 것으로, 신조상목 및 치조상목을 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다. 신조상목은 기러기목, 칼새목, 부세로포메스, 쏙독새목, 도요목, 황새목, 쥐새목, 비둘기목, 파랑새목, 뻐꾸기목, 매목, 갈벌리포메스, 닭목, 아미목, 두루미목, 무소파기포메스, 오피스토코미포메스, 참새목, 다라새목, 홍학목, 딱다구리목, 논병아리목, 바다제비목, 앵무목, 펭귄목, 올빼미목, 벌새목, 비단날개새목, 세가락메추라기목 및 후투티목 등을 포함할 수 있다. 치조상목은 키위새목, 화식조목, 공조목, 레아목, 타조목 및 티니아미포메스 등을 포함하며, 보다 바람직하게는 오리, 닭, 거위, 칠면조, 기니아 파울(guinea fowl) 또는 메추리일 수 있고, 더욱 바람직하게는 닭 또는 오리일 수 있다. 상기 조류 대상은 성숙 조류, 조류 새끼 및 조류 배아/난을 포함할 수 있다.

상기 조성물은 발육종란내(In Ovo), 비강내, 기관내, 경구, 피내, 근육내, 복막내, 정맥내, 결막 및 피하로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 경로를 통해 투여될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 조성물은 1마리 이상의 개체, 구체적으로 조류 대상에게 동시 접종되는 것일 수 있다. 상기 동시 접종은 분무 또는 점안 접종되는 것일 수 있다. 상기 조성물은 1마리 이상의 개체에 대하여 동시 투여할 수 있다. 상기 동시 접종용 조성물은 분무 접종법, 점안 접종법, 또는 음수 투여법에 의해 투여될 수 있다. 동시 접종용 조성물은 개별 접종용 백신 조성물에 비하여 일회 투여에 의한 백신 투여 개체의 수가 현저히 증가될 수 있다. 상기 백신 조성물은 약 10 마리 이상의 개체에 대하여 동시 투여할 수 있다. 상기 백신 조성물은 약100 마리 이상의 개체에 대하여 동시 투여할 수 있다. 상기 백신 조성물은 약 1,000 마리 이상의 개체에 대하여 동시투여할 수 있다. 상기 백신 조성물은 약 10,000 마리 이상의 개체에 대하여 동시투여할 수 있다. 상기 백신 조성물은 약 50,000마리 이상의 개체에 대하여 동시투여할 수 있다. 상기 백신 조성물은 약 100,000 마리 이상의 개체에 대하여 동시투여할 수 있다. 상술한 접종 방법은 상기 백신 조성물의 효용성 평가에 중요한 요소일 수 있다.

상기 백신 조성물 또는 면역원성 조성물은 상기 재조합 뉴캣슬병 바이러스 벡터 또는 재조합 뉴캣슬병 바이러스를 유효한 양으로 포함할 수 있다. 용어 "유효한 양"은 예방 또는 치료를 필요로 하는 개체에게 투여되는 경우 예방 또는 치료의 효과를 나타내기에 충분한 양을 말한다.

상기 유효한 양은 당업자가 선택되는 세포 또는 개체에 따라 적절하게 선택할 수 있다. 질환의 중증도, 환자의 연령, 체중, 건강, 성별, 환자의 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 사용된 조성물과 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 상기 백신 조성물은 약 10⁵EID₅₀ 내지 10¹⁰EID₅₀를 포함한 양으로 투여될 수 있다. 상기 투여는 1일 1회, 1일 2회 내지 24회, 1주일에 1회 내지 6회, 1개월에 1회 내지 3회, 또는 1년에 1회 내지 12회 투여될 수 있다.

상기 백신 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 백신 조성물을 개체에 투여하는 단계;를 포함하는 독감 또는 조류 독감의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.

본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 본 발명에 따른 면역원성 조성물 또는 백신 조성물을 조류 대상에 투여하는 단계를 포함하는, 조류 대상의 접종 방법 또는 면역화 방법이 제공될 수 있다.

상기 방법을 통해 고병원성 조류인플루엔자, 바람직하게는 본 발명에 따른 인플루엔자 바이러스에 의해 유발되는 질환(예, 독감, 조류 독감)에 대해 효과적인 방어를 제공하여, 독감 또는 조류 독감을 예방하거나 치료하거나, 면역화할 수 있다.

상기 개체는 조류 또는 포유류(예, 사람, 돼지, 개, 고양이, 말, 소, 양, 마우스, 낙타)에 속하는 동물을 포함하나, 바람직하게는 조(Aves) 강에 속하는 임의의 모든 가내 및 야생 조류를 의미하는 것으로, 신조상목 및 치조상목을 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다. 신조상목은 기러기목, 칼새목, 부세로포메스, 쏙독새목, 도요목, 황새목, 쥐새목, 비둘기목, 파랑새목, 뻐꾸기목, 매목, 갈벌리포메스, 닭목, 아미목, 두루미목, 무소파기포메스, 오피스토코미포메스, 참새목, 다라새목, 홍학목, 딱다구리목, 논병아리목, 바다제비목, 앵무목, 펭귄목, 올빼미목, 벌새목, 비단날개새목, 세가락메추라기목 및 후투티목 등을 포함할 수 있다. 치조상목은 키위새목, 화식조목, 공조목, 레아목, 타조목 및 티니아미포메스 등을 포함하며, 보다 바람직하게는 오리, 닭, 거위, 칠면조, 기니아 파울(guinea fowl) 또는 메추리일 수 있고, 더욱 바람직하게는 닭 또는 오리일 수 있다. 상기 조류 대상은 성숙 조류, 조류 새끼 및 조류 배아/난을 포함할 수 있다.

상기 조성물은 발육종란내(In Ovo), 비강내, 기관내, 경구, 피내, 근육내, 복막내, 정맥내, 결막 및 피하로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 경로를 통해 투여될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 조성물은 1마리 이상의 개체, 구체적으로 조류 대상에게 동시 접종되는 것일 수 있다.

상기 조성물의 투여량은 당업자가 선택되는 세포 또는 개체에 따라 적절하게 선택할 수 있다. 질환의 중증도, 환자의 연령, 체중, 건강, 성별, 환자의 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 사용된 조성물과 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 상기 백신 조성물은 약 10⁵EID₅₀ 내지 10¹⁰EID₅₀를 포함한 양으로 투여될 수 있다. 상기 투여는 1일 1회, 1일 2회 내지 24회, 1주일에 1회 내지 6회, 1개월에 1회 내지 3회, 또는 1년에 1회 내지 12회 투여될 수 있다.

본 발명에 따른 재조합 뉴캣슬병 바이러스의 생산방법은 다음과 같다.

상기 재조합 뉴캣슬병 바이러스 벡터를 숙주 세포주에 접종하고, 상기 숙주 세포주를 배양한 다음, 상기 숙주 세포주의 배양물로부터 재조합 뉴캣슬병 바이러스를 수득할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 재조합 바이러스 pK148/ES2-HA는 통상의 바이러스 작출 방법을 통해 회수할 수 있다. HA 단백질 발현을 위한 감염성 클론 cDNA 서열을 제작 완료한 후 3종의 Supporting Plasmid(NP, P, L)를 Hep-2 세포주에 주입하여 배양한 후 재조합 바이러스를 회수하는 절차는 통상적인 방법에 따라 실시하였다. 세포주에 주입방법은 lipofectamine 3,000을 이용한 transfection을 실시하였다. 3~4일 배양 후 재조합 바이러스를 회수하여 8에서 10일령 SPF 유정란 allantoic cavity에 접종하여 바이러스를 배양한 후 allantoic fluid를 회수하여 다시 같은 방법으로 유정란에 blind passage를 최소 2대 이상 배양하여 바이러스 역가를 높이는 작업을 수행하였다. 이후 allantoic fluid로부터 통상의 정제 방법을 통해 정제하여 사용할 수 있다. 재조합 바이러스의 정제는 통상의 정제방법이라면 특별히 제한되지 않으나, 크로마토그래피나 ultrafiltration 방법을 통해 추출을 포함하여 공지된 방법을 통해 정제 가능하다. 크로마토그래피를 이용한 정제 방법은 친화성, 이온 교환, 크기별 배제 그리고 소수성 등의 결합력 차이를 통해 적절한 resin과 buffer의 조합을 통해 바이러스 정제가 가능하다.

본 발명에 따른 백신 조성물 생산방법은 다음과 같다.

SPF 발육란에 rK148/ES2-HA 바이러스를 접종하고, 접종 후 24시간마다 검란을 실시하여 중사란을 확인한다. 접종 72시간 후 접종란을 4 ℃에 냉장한 후 요막강액(Allantoic Fluid)을 채취하여 닭 적혈구 응집반응을 통해 바이러스의 배양을 확인한다. 배양이 확인된 바이러스는 9-11일령 SPF 발육란에 십진 희석 후 접종하여 바이러스 역가(EID50)를 측정한다. 상기 바이러스를 사용하여 생백신으로 사용할 수 있으며, 또는 포르말린을 최종함량 0.05 내지 0.1%(v/v)가 되도록 첨가하고 37 ℃ 온도에서 24시간 교반하여 바이러스를 불활화하여 사독백신으로 사용할 수 있다.

또한, 상기 불활화된 바이러스는 오일 어쥬번트(Seppic ISA70)과 3:7 중량비로 혼합하여 사독백신을 제조할 수 있다.

상기 백신 조성물은 상기 수의학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제를 더 포함할 수 있으며, 상기 수의학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제는 당업계에 잘 알려져 있는 것으로, 예를 들면, 살균수, 식염수 용액 또는 인산염 완충액을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 따른 백신 조성물을 제조하기 위하여, 상기 재조합 바이러스 벡터 또는 재조합 바이러스는 그 자체로 사용할 수도 있지만, 수의학으로 수용 가능한 매개체 내에 장입할 수 있고, 부형제로서 선택적으로 어쥬번트(adjuvant)를 보충할 수 있다. 본 발명의 특별한 구현양태에서, 조성물은 면역원성 조성물 및 항원보강제를 포함하고, 이들로 필수적으로 구성되고/되거나 구성된다. 본 발명의 항원보강제의 비제한적인 예는 알루미늄 유래 항원보강제, 사포닌, 미네랄 겔, 다가음이온, 플루로닉 폴리올, 사포닌 유도체, 리소레시틴 및 다른 유사한 표면 활성 물질, 글리코시드, 모든 유형의 오일 및 이들의 조합을 포함한다. 본 발명의 특별한 구현양태에서, 조성물은 수-중-유-중-수 에멀젼을 포함할 수 있다.

상기 매개체로는 아데노바이러스, 허피스바이러스, 폭스바이러스 등과 같은 전달매개체를 사용할 수 있으나 이에만 한정되는 것은 아니다. 또한 어쥬번트로서 수산화알루미늄을 사용하거나, 아크릴산 또는 메타크릴산의 중합체, 말레산 무수물 및 알케닐 유도체의 중합체 등을 사용할 수 있고, 백신을 O/W(oil-in-water) 에멀젼 형태로 제형화할 수 있다. 상기 아크릴산 또는 메타크릴산의 중합체는 특히 당 또는 폴리알코올의 폴리알케닐 에테르로 가교결합되어 있다. 이들 화합물은 카보머(carbomer)라는 명칭으로 알려져 있다. 또한, 상기 말레산 무수물 및 알케닐 유도체의 공중합체 중에서 말레산 무수물과 에틸렌의 공중합체로는 선형 또는 예를 들면 디비닐에테르와 가교결합된 EMA(R) 공중합체(Monsanto사)가 사용될 수 있다. 최종 백신 조성물에서의 중합체 농도는 0.01% 내지 1.5%(w/v), 보다 구체적으로는 0.05% 내지 1%(w/v), 바람직하게는 0.1% 내지 0.4%(w/v)일 수 있다.

상기 O/W 에멀젼은 특히 액체 파라핀 경유(유럽 약전 타입); 스쿠알란, 스쿠알렌과 같은 이소프레노이드 오일; 이소부텐 또는 데센의 존재 하에 알켄의 올리고머화로 얻어지는 오일; 선형 알킬기를 함유하는 산 또는 알코올의 에스테르, 특히 식물유, 에틸올레이트, 프로필렌글리콜 디(카프릴레이트/카프레이트), 글리세릴트리(카프릴레이트/카프레이트), 프로필렌글리콜 디올레이트; 분지형 지방산 알코올 또는 산의 에스테르, 특히 이소스테아르산의 에스테르 등을 기본으로 할 수 있다. 에멀젼을 형성하기 위해 상기 오일은 유화제와 혼합하여 사용된다.

바람직한 유화제로는 비이온성 계면활성제, 특히 소르비탄, 만나이드, 글리세롤, 폴리글리세롤 또는 프로필렌글리콜의 에스테르; 및 선택적으로 에톡시화되어 있는 올레산, 이소스테아르산, 리신올레산 또는 하이드록시스테아르산의 에스테르, 또는 폴리옥시프로필렌-폴리옥시에틸렌 블록 공중합체 등을 들 수 있다.

본 발명의 재조합 바이러스 벡터는 NDV와 함께 clade 2.3.4.4e H5N6 A/Duck/Korea/ES2/16(ES2) HPAIV의 HA 유전자를 포함함으로써 고병원성 조류인플루엔자에 대한 백신을 제조할 수 있다.

또한 본 발명에 따른 백신 조성물은 비강 또는 분무 접종 시에도 우수한 예방 효과를 갖는 생백신 개발이 가능하며, 양계 농장에서의 고병원성 조류인플루엔자에 대한 피해 저감하고, 양계 백신 수입을 대체하여 백신접종비용을 절감하며, 생산량을 증대시키는 효과를 갖는다.

도 1은 pK148/ES2-HA 벡터의 구조 및 제작 과정을 보여주는 모식도이다.
도 2는 P 유전자와 M 유전자 사이의 untranslated regtion(UTR)에 ES2-HA 유전자가 삽입된 rK148/ES2-HA의 PCR 분석결과(A)와 ES2-HA 단백질 발현을 확인한 웨스턴블롯 분석 결과(B)로, 도 2A는 9-11일령 SPF 닭의 알에서 2회의 순차적 증식과 rescue후, rK148/ES2-HA 바이러스를 수확하고, ES2-HA 유전자의 삽입을 확인한 PCR 분석결과이다. 2개의 유전자 특이적 프라이머가 측면에 있는 ES2 HA 유전자를 포함하는 유전자 단편(fragment)을 증폭하고 겔 전기영동을 사용하여 분석하였다. 도 2B는 ES2-HA 단백질의 발현을 측정한 것으로, 닭 ansti-clade 2.3.4.4 c e H5 AIV 혈청 및 HRP-결합된 goat anti-chicken lgY 항체를 사용한 웨스턴 블롯 분석을 사용하였다. 모노클로날 항-NDV HN 항체를 사용하여 NDV의 HN 단백질의 대략적인 크기가 70 kDa인 것을 확인하였다. lane 1은 rK148 고농도 시료이고, lane 2는 rK148 저농도 시료이며, lane 3은 rK148/ES2-HA 고농도 시료이며, lane 4는 rK148/ES2-HA 저농도 시료이다.
도 3은 10일된 SPF 종란에서 K148 바이러스(A)와 rK148/ES2-HA 바이러스(B)의 증식성을 비교한 결과이다. 바이러스 증식성(Viral growth kinetics)은 10일령 SPF 종란에 4회의 연속 용량(10¹, 10², 10³ 및 10⁴ EID50)을 접종하여 수행되었고, 접종 후 12시간마다 혈구응집 단위를 측정하여 분석하였다.
도 4는 오리(실험군 1 내지 4)와 닭(실험군 5 내지 7)에서의 고병원성 조류인플루엔자에 대한 혈청 HI 항체가(도 4A, 도 4B)와 오리와 닭에서의 NDV에 대한 혈청 HI 항체가(도 4C, 도 4D)를 나타낸 결과이다. 구체적으로 백신을 접종한 오리와 닭의 혈청 샘플에 대한 혈구응집 억제를 분석한 결과로, 각 군에 rK148/ES2-HA(ON), rK148/ES2-HA(Spray), K148(ON) 및 PBS 백신을 10⁷ EID50 농도로 접종하고 3주에 부스터 백신을 접종을 하였다. 면역화후 매주 혈액 샘플을 수집하고, clade 2.3.4.4e H5N6 HPAIV(도 4A 및 도 4B)와 K148 NDV(도 4C 및 도 4D)에 대한 혈청 혈구응집 억제(HI) 역가를 측정하였다. 4log2보다 낮은 HI 항체 역가를 갖는 오리와 닭은 혈청음성으로 간주하였다.
도 5는 오리(A; 실험군 1 내지 4)와 닭(B; 실험군 5 내지 7)에서 고병원성 조류인플루엔자 공격접종 이후 각 백신 그룹별 생존률을 나타낸 그래프이다. 구체적으로 실험군 1 내지 7에 H5N6 HPAIV(A/duck/Korea/ES2/2016)을 공격접종한 후, 12일까지의 생존율을 분석한 결과이다.
도 6은 오리에서 고병원성 조류인플루엔자 공격접종 이후 Oropharynx와 Cloaca Swab에서의 바이러스 배출양을 2dpc(A,B), 4dpc(C,D) 6dpc (E,F) 8dpc(G,H) 별로 측정한 결과이다. 구체적으로 H5N6 HPAIV 공격 후 백신접종한 각 그룹(실험군 1 내지 4)에서의 바이러스성 쉐딩 역가(viral shedding titers)이다. 1차 백신 접종 3주 후 두 번째 백신을 접종하고, 1차 백신 접종 6주 후 H5N6 HPAIV(A/duck/Korea/ES2/2016)을 공격접종한 후, 2일(도 6A, B), 4일(도 6C, D), 6일(도 6E, F) 및 8일(도 6G, H)에 구강인두(Oropharynx) 및 배설강 스왑(cloaca swab)을 수집하였다. 상기 수집된 구강인두(Oropharynx) 및 배설강 스왑(cloaca swab)의 rRT-PCR을 사용하여 바이러스 RNA를 정량화하여 바이러스성 쉐딩 역가(viral shedding titers)를 모니터링하였다(*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001 using ANOVA with post-hoc Tukey's test compared with other groups).
도 7은 닭에서 고병원성 조류인플루엔자 공격접종 이후 Oropharynx와 Cloaca Swab에서의 바이러스 배출양을 2dpc(A,B), 4dpc(C,D)로 나타낸 그래프이다. 구체적으로 도 7은 H5N6 HPAIV 공격 후 백신접종한 각 그룹(실험군 5 내지 7)에서의 바이러스성 쉐딩 역가(viral shedding titers)이다. chd 18마리의 닭을 3개의 군으로 나누어 rK148/ES2-HA virus(ON route, 실험군 6), K148 virus(ON route, 실험군 5) 및 PBS(mock645 vaccinated group, 실험군 7)을 준비하였다. 상기 각 군에 2차 백신접종을 실시하고(부스터 백신 접종), 100 BLD50의 H5N6 HPAIV를 공격 접종한 후, 바이러스성 쉐딩(viral shedding)을 모니터링하였다(*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001 using ANOVA with post-hoc Tukey's test compared with other groups).
도 8은 실험군 1 내지 7에서의 임상증상을 분석하여 나타낸 그래프이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

<실시예 1> K148 NDV 벡터 고병원성 조류인플루엔자 백신의 제조 및 확인

1-1. 사용된 세포 및 바이러스

8%의 Fetal bovine serum과 항생제로 보충된 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium, CCL-81; ATCC)에서 CEF(Chicken embryo fibroblast)와 Hep-2 세포주를 배양하였다. K148 NDV(newcastle disease virus)(KCTC 11570BP)가 야생 조류 배설물로부터 분리하는 것은 이전 실험에서 설명되었다[대한민국 공개특허공보 제10-2011-0045605호]. T7 역전사효소 공급을 위한 수정된 Vaccinia Ankara T7 재조합 바이러스(MVA-T7)는 Bernard Moss(미국국립보건소; NIH)가 제공해 주었다. MVA-T7 바이러스는 향후 사용을 위해 CEF 세포에서 배양되었다. H5 아형HPAIV 2.3.4.4e, H5N6 A/Duck/Korea/ES2/16(ES2)(GISAID EpiFlu Isolate ID EPI_ISL_239262)은 한국의 농림축산검역본부에서 제공하였다.

1-2. RNA 준비

분리된 K148 NDV(newcastle disease virus) 균주는 37 ℃에서 72시간 동안 10일령 SPF(Specific pathogen free) 수정란에 접종되었다. 접종된 종란에서 요막공간액(Allantoic fluid)(또는 요수라고도 한다)을 채취하고 RNeasy 키트(Qiagen, Valencia, CA)를 사용하여 수확된 요막공간액에서 바이러스 RNA를 추출하였다. ES2 HPAI 바이러스의 감염 및 RNA 추출은 BSL3(Biosafety level 3) 시설에서 수행되었다. K148 NDV 전장 지놈과 ES2 HPAIV HA 유전자의 cDNA는 SuperScript IV first-Strand system(Thermo Fisher scientific, California)을 사용하여 합성되었다.

1-3. K148 바이러스의 전장 cDNA 클로닝

K148 NDV 바이러스의 cDNA는 인접한 조각들 간에 약 300 bp의 뉴클레오티드가 중첩되어 있는 6개의 절편으로 나뉘었다(도 1). 6개 절편 모두 유전자별 프라이머 6세트를 사용하여 PCR을 통해 증폭하고, RBC TA cloning vector(RBC Bioscience, Taipei, Taiwan)로 cloning 하였다(표 1). 각 절편은 In-Fusionㄾ PCR 복제 키트(Clontech, Mountain View, CA)를 사용하여 pBluescript 벡터에 순차적으로 삽입되었다. pfuUltraTM II fusion HS DNA polymerase(Stratagene, La Jolla, CA)는 각 절편의 증폭 및 벡터 선형화에 사용되었다. 벡터 플라스미드는 각각의fragment의 삽입 이전에 선형화되었다. Supporting Plasmid를 제작하기 위해Nucleoprotein(NP), Polymerase(P) 및 Large polymerase(L) 유전자는 발현 플라스미드에 클로닝(cloning) 되었다. 벡터 선형화 및 각 fragment의 삽입에 사용되는 프라이머는 표 2에 요약하였다. K148 바이러스의 전장 지놈 cDNA 클론(pK148)은 HIT-DH5αcompetent cell에 형질전환되었고, 37 ℃에서 18시간 동안의 배양 이후 PureLink™HiPure plasmid midiprep kit(Thermo Fisher Scientific, California, USA)을 사용하여 플라스미드를 분리 및 정제하였다.

K148 cDNA의 여섯개 절편과 NP, P, L 유전자 증폭에 사용된 프라이머

번호	서열	프라이머
1	5'-ACCAAACAGAGAATCTGTAAGG-3'	F1_F
2	5'-TCAGTACCCCCAGTCGG-3'	F1_R
3	5'-GTGACCAGATGAGCTTTGC-3'	F2_F
4	5'-TTAGCCATTCAGTGCAAGG-3'	F2_R
5	5'-GTGCATTGATCATGTCACG-3'	F3_F
6	5'-GTCAGTTTGACATTGACCTTG-3'	F3_R
7	5'-GATAGAAGAACTTGACACCTC-3'	F4_F
8	5'-GAGCCATGCAAACTTGGCTG-3'	F4_R
9	5'-ATGGCGRGCTCCGGTCC-3'	F5_F
10	5'-AACAGCATTGCATGCATGC-3'	F5_R
11	5'-GACTAACCTTCAATACTCAAG-3'	F6_F
12	5'-ACCAAACAAAGATTTGGTGAATG-3'	F6_R
13	5'-ATGTCTTCTGTATTCGATGAG-3'	NP_F
14	5'-TCAGTACCCCCAGTCGG-3'	NP_R
15	5'-ATGGCCACCTTYACAGATG-3'	P_F
16	5'-TTAGCCATTCAGTGCAAGG-3'	P_R
17	5'-ATGGCGRGCTCCGGTCC-3'	L_F
18	5'-TTAAGAGTCACAGTTACTRTAATATC-3'	L_R

K148 cDNA의 여섯개 절편과 NP, P, L 유전자 증폭에 사용된 프라이머

번호	서열	프라이머
19	5'-ACCAAACAGAGAATCTGTAAGGTACG-3'	F1-F
20	5'-gatttggtgaatgacCTCTCATCAAATCCAAAAATTG-3'	F1-up-trailer
21	5'-TGGATTTGATGAGAGCGGTGGCAAATAGC-3'	F2-F
22	5'-gatttggtgaatgacTTAGCCATTCAGTGCAAGGC-3'	F2-up-trailer
23	5'-TGTCACGCCCTATGCATCCGAGCTCC-3'	F3-F
24	5'-gatttggtgaatgacGAGATATCGAGATTGCCTGTC-3'	F3-up-trailer
25	5'-CAATCTCGATATCTCGACTGAGCTTGG-3'	F4-F
26	5'-gatttggtgaatgacAGCCGATTCAAGTATTTTCTTCC-3'	F4-up-trailer
27	5'-ATACTTGAATCGGCTTCTCCTGACAC-3'	F5-F
28	5'-gatttggtgaatgacCTTCCTCCTACCTACGGAGCTTG-3'	F5-up-trailer
29	5'-GTAGGTAGGAGGAAGCAGATTCAGG-3'	F6-F
30	5'-gatttggtgaatgacAGAACTACACTCAAGAACAATTAC-3'	F6-up-trailer
31	5'-GATTCTCTGTTTGGTccctatagtgagtcgtattagc-3'	F1-up
32	5'-CTCTCATCAAATCCAaaaattgggtctc-3'	F2-up
33	5'-GCATAGGGCGTGACAtgatcaatgcac-3'	F3-up
34	5'-GAGATATCGAGATTGcctgtcacgattac-3'	F4-up
35	5'-AGCCGATTCAAGTATtttcttccattgtcg-3'	F5-up
36	5'-CTTCCTCCTACCTACggagcttgcttc-3'	F6-up
37	5'-gtcattcaccaaatctttgtttg-3'	Trailer-down
38	5‘-TTAGCCATTCAGTGCAAGGCGC-3’	Insertion-up
39	5‘-TCACCACTGCAGCTCGCAG-3’	Insertion-down
40	5′-cactgaatggctaaTCACCACTGCAGCTC-3′	UTR-HA_F
41	5′-gagctgcagtggtgaTAATTGCAATTTGAG-3′	UTR-HA_R

1-4. ES2 HPAI 바이러스의 HA 유전자를 포함하는 K148 clone의 구축

ES2 HPAIV 바이러스의 HA 유전자와 K148 전장 지놈 cDNA clone의 P 유전자와 M 유전자 사이에 있는 untranslated regtion(UTR)의 cDNA 조각을 삽입할 수 있도록 pK148을 선형화하였다. 서열번호 42로 표시되는 ES2 HA 유전자와 UTR은 PCR에 의해 증폭되어 RBC TA cloning Vector(RBC Bioscience, Taipei, Taiwan)로 복제되었다. ES2 HA 유전자의 발현을 향상시키기 위해 Muta-directTM site-directed Mutagenesis kit(iNtRON Biotechnology, Korea)를 이용하여 HA 유전자의 상류에 Kozak sequence(ACC)를 삽입하였다. UTR과 HA 유전자의 cDNA는 위에서 설명한 infusion PCR을 통하여 pK148의 P와 M 유전자 사이에 삽입되었고 최종적으로 pK148/ES2-HA clone(서열번호 43)이 제작되었다(도 1). pK148/ES2-HA clone은 37 ℃에서 18시간 동안 HIT-DH5αcompetent cell에서 증폭되어 PureLink™HiPure plasmid midiprep kit를 사용하여 정제되었다.

1-5. 바이러스 rescue 및 증식

두 전장 지놈 cDNA(pK148 또는 pK148/ES2-HA)를 encoding한 두 종류의 플라스미드와 세가지 supporting plasmid(N, P and L)를 Hep-2 세포로 Transfection하였다. T7 transcriptase를 공급하기 위해 6-well plate에 배양된 Hep-2 세포에 MVA-T7 바이러스를 감염시켰다.

pK148 또는 pK148/ES2-HA 8.8ug, pSupport_NP 1ug, pSupport_P 0.1ug, pSupport_L 0.1ug을 혼합하였고 Lipofectamine 3000((Thermo Fisher Scientific, California, USA)을 사용하여 Hep-2 세포로 형질감염하였다. 37 ℃ 인큐베이터에서 1시간 배양한 후 PBS로 3회 세척하였고, Opti-MEM media로 배지를 교체한 후 37 ℃, 5% CO₂ 조건에서 72시간 배양하였다. 이후 세포를 1회 얼렸다 녹이는 과정을 통해 K148과 rK148/ES2-HA 바이러스를 rescue하였다. 수확한 바이러스는 10일령 SPF 유정란에 접종되어 37℃에서 3일 동안 배양되었다. 배양 3일 후 접종된 종란을 4 ℃에서 1시간 동안 냉장하였고, rescue된 바이러스를 검출하기 위해 Allantoic Fluid를 Hemagglutination Assay(HA)에 사용하였다. HA 양성 시료는 0.2 ㅅm syringe filter(Ministart RC 15, Sartorius Stedim Biotech, Germany)를 통해 필터링한 후 10일령 SPF 유정란에 계대 접종하였다. 계대 후 종란의 Allantoic fluid를 채취 및 소분하였고, 추가 실험을 위해 - 80 ℃에서 저장되었다. 50% Egg infectious dose(EID50)를 결정하기 위해 rescue된 바이러스 또는 ES2 바이러스를 10배 연속 희석하고 10일령 SPF 유정란에 접종하였다. 37℃에서 3일 배양 후 Allantoic fluid를 채취하여 혈구응집반응을 확인하였다. EID50 역가는 Reed and Muench 방법으로 산출하였다.

1-6. 바이러스 정제 및 웨스턴 블롯팅

연속 계대 후 ES2 HA 단백질의 발현과 HA 유전자의 안정성을 조사하기 위해 10일령 SPF 유정란에 4회 계대된 rK148 또는 rK148/ES2-HA를 저원심분리(2000×g, 10분, 4℃)하였다. 이후 상층액을 0.1% 포르말린으로 불활화하였다. 불활화 후 원심분리(30,000×g, 1시간, 4℃)를 하여 상등액은 버리고 펠렛(Pellet)만을 회수하였다. 상기 펠렛을 PBS에 재현탁(resuspension)한 후 20-50% 비연속 Sucrose 구배에 로딩하고 정제를 위해 원심분리(150,000 ×g, 1.5시간, 4℃)를 진행하였다. 정제된 샘플의 단백질 농도는 Bradford protein Asaays(Pierce, USA)를 이용해 측정하였다. 고농도(2μg/well) 및 저농도(400ng)의 정제된 샘플을 Western blotting을 사용하여 분석하였다.

ES2 HA 단백질의 발현은 clade 2.3.4.4e H5 subtype AIV로 면역화된 닭의 항혈청 및 HRP-conjugated goat anti-chicken IgY 2차 항체(Invitrogen, California, USA)을 사용하여 검출하였다. NDV(newcastle disease virus)는 Bionote(한국, 수원)에서 제공한 anti-NDV HN mouse IgG 항체와 HRP-conjugated goat anti-mouse IgG antibody(Komabio, Seoul, Republic of Korea)를 통해 확인하였다.

rK148/ES2-HA의 ES2 HA 단백질 발현의 확인은 웨스턴 블롯 상에서 ~70kDa(HA0 단백질), ~55kDa(HA1 단백질), ~30kDA (HA2 단백질)크기의 밴드로 확인되었다(도 2b).

1-7. 바이러스 증폭 특성 분석

rK148/ES2-HA 바이러스와 K148 NDV를 0.1 mL의 10진 희석 바이러스(10¹, 10², 10³ 및 10⁴ EID50)와 함께 10일령 SPF 유정란에 접종하였다. 2가지 바이러스 각각의 10진 희석액을 10일 된 SPF 유정란 3개에 접종하였다. 접종 후 12시간, 24시간, 36시간, 48시간, 60시간, 72시간에 접종된 알의 allantoic fluid를 채취하여 HAU(Hemagglutination Unit) 단위로 바이러스 역가를 측정하였다. 10일령 SPF 유정란에서 배양 72시간 후 rK148/ES2-HA의 역가(10^9.5EID50/mL)는 Backbone 바이러스인 K148/08의 역가(10^9.7EID50/mL)보다 약간 낮았다. rK148/ES2-HA 및 K148/08 NDV의 바이러스 성장을 비교하기 위해 4개의 연속 10진 희석액(10¹-10⁴ EID50)을 10일령의 SPF 발육란에 접종하고 12시간마다 HAU(Hemagglutination Unit)으로 바이러스 역가를 측정하였다. rK148/ES2-HA 바이러스는 배양 72시간에서 가장 높은 평균 HAU(2^10.67)를 보였고, K148/08 NDV는 배양 72시간에서 가장 높은 평균 HAU(2¹¹)를 나타냈다. 즉, rK148/ES2-HA와 K148/08 NDV의 성장 곡선 간에는 유의적인 차이가 관찰되지 않았다(도 3).

1-8. 결과 확인

상술한 실험을 종합하면 K148/08 바이러스의 전장 유전자를 포함하는 플라스미드가 성공적으로 클로닝되었고, ES2 바이러스의 HA 유전자 또한 K148/08 바이러스의 P유전자 및 M유전자 사이에 성공적으로 삽입이 되었다는 것을 확인하였다.

또한, Hep-2 cell에 Transfection 이후 성공적으로 rK148 및 rK148/ES2-HA가 rescue되었고 삽입 유전자인 ES2바이러스의 HA 유전자가 rescue 이후에도 바이러스 유전자 내에 성공적으로 존재하는 것을 확인하였다(도 2A 참조).

또한, rK148/ES2-HA 바이러스에서 HA 단백질이 성공적으로 발현되는 것을 웨스턴 블롯을 통해 확인하였다(도 2B).

<실시예 2> K148 NDV 벡터 고병원성 조류인플루엔자 백신의 효능 확인

2-1. 백신 접종 및 챌린지 실험

시중에 판매되는 1일령된 Peckin duck 24마리를 모란식품사(Eumsung, Republic of Korea)에서 제공받았다. 1일령 SPF 닭 18마리를 남덕 SPF(대한민국 이천)에서 구입하였다.

하기 표 3에 설명된 대로 7개 그룹(n = 6)으로 나누어 실험을 수행하였다. 백신 접종 그룹은 비강(Oculonasal) 또는 10⁷EID₅₀ 용량의 rK148 또는 rK148/ES2-HA를 사용하여 스프레이 방법으로 백신 접종하였다. 분무 백신은 50-70μm의 에어로졸 입자를 생성하는 자동 분무 장치(SK-MO-2000, Threeshine Inc, Korea)를 사용하였다. Mock 백신 접종 그룹은 PBS로 백신 접종하였다. 추가 백신접종은 1차(Priming) 백신 접종 후, 3주 후에 부스터 백신을 접종하였다. 백신 접종된 닭 및 오리의 임상 징후를 매일 평가하였다. 혈청학적 분석을 위해 오리와 닭에서 혈액 샘플을 수집하여 분석하였다.

1차(Priming) 백신 접종하고 6주 후, 모든 개체에게 100 mean Bird Lethal dose 50(BLD₅₀)의 ES2 HPAI 바이러스로 비강내 공격 접종하였다. 본 발명의 백신의 방어 효과를 평가하기 위하여 임상 징후 및 사망률을 매일 기록하였다. 공격접종 실험체의 구강인두(Oropharynx) 및 배설강 스왑(cloaca swab) 샘플을 2, 4, 6, 8 및 12일마다 수집하였다.

이 연구에서 수행된 모든 동물 실험은 건국대학교의 IACUC(Institutional Animal Care and Use Committee of Konkuk University)의 관찰 및 승인을 받은 후 진행되었다(허가번호: KU21045). 백신접종 실험은 BSL2 시설에서, 공격접종 연구는 건국대학교 ABSL3 시설에서 수행하였다.

백신 및 공격접종실험설계

		백신	마릿 수	백신 경로a	생백신 용량	공격접종 용량
실험군 1	오리	rK148	6	ONb	107EID50	100 BLD50 (106.0EID50)
실험군 2		rK148/ES2-HA	6	ON
실험군 3		rK148/ES2-HA	6	Spray
실험군 4		Mock (PBS)	6	ON
실험군 5	닭	rK148	6	ON	107EID50	100 BLD50 (105.8EID50)
실험군 6		rK148/ES2-HA	6	ON
실험군 7		Mock (PBS)	6	ON

^a: 각각의 동물은 1일령에 백신을 접종하였고 부스터 백신은 1차 백신 3주후에 접종하였다.

^bON: Oculonasal

2-2. 혈청 분석

rK148/ES2-HA 백신의 효과를 확인하기 위하여, 상기 백신 접종을 통한 닭과 오리에서의 항체 반응은 혈구응집능 억제반응(Hemagglutination inhibition; HI) 시험을 통해 측정하였다. AIV와 NDV 모두 혈구 응집반응(Hemagglutination)을 나타낼 수 있어 K148 바이러스와 2.3.4.4e H5 HPAIV 바이러스가 항원으로 사용되었다.

백신 후 1, 2, 3, 4, 5주에 채취한 혈청 샘플은 보체(complement) 불활화를 위하여 56℃에서 30분간 열처리를 하였다. 오리 혈청 샘플은 37 ℃에서 overnight로 receptor-destroying enzyme(Denka Seiken Co., Japan)처리하였다. 열처리 이후 각 혈청은 PBS에 2진 희석을 진행하였고 K148 바이러스와 clade 2.3.4.4e H5 HPAIV 항원 4HA Unit(HAU)과 상온에서 40분간 반응하였다. 반응 이후 각각의 시료는 96 well V-bottom plate에서 1% 닭 혈구와 상온에서 40분간 반응하였다. 반응 이후 각각의 샘플에 대한 HI 역가 측정을 진행하였다.

Oculonasal 경로를 통해 면역화된 오리(실험군 2)의 HPAIV에 대한 HI 항체 역가는 백신화 2주차부터 증가하기 시작하여 11.31의 기하 평균 역가(GMT)를 나타내었다. 스프레이법으로 접종한 오리(실험군 3)의 HI 역가는 2차 접종 1주 후(GMT: 3.18) 증가하였고, oculonasal 경로로 접종한 오리(실험군 2)는 백신 후 4주차에 스프레이 접종군(GMT: 3.18)보다 높은 HI 역가(GMT: 16)를 나타냈다. 백신 후 5주차에서 스프레이 백신을 접종한 오리(실험군 3)의 HI 역가는 감소한 반면(GMT: 7.11) oculonasal 경로로 백신을 접종한 오리(실험군 2)의 HI 역가는 증가했다(도 4A). 4HAU의 항원을 사용해서 HI assay를 실시했을 때 16배 이상 희석한 혈청에서 억제 반응이 나올시 HI 양성으로 판단하므로 대부분의 오리는 백신 접종 후 HPAIV에 대해 HI 음성이었고 Oculonasal 그룹에는 2마리, 스프레이 그룹은 3마리만 5주차에 HPAIV에 대해 양성 HI 항체 역가를 나타냈다(도 4A). rK148/ES2-HA 백신으로 면역화된 닭의 경우, ES2 바이러스에 대한 HI 역가는 백신 후 1 주차 GMT가 7.1로 면역이 일찍 형성된 것을 확인할 수 있다. 백신 후 3주차에서 추가 백신 접종 후, HI 역가는 평균 17.96으로 증가하였다. Oculonasal 경로를 통해 백신 접종한 닭(실험군 6)은 백신 후 4주차(GMT:17.96)에서 5 주차(GMT: 22.63)로 가면서 HI 역가의 증가를 보여주었다. 백신 후 5주차에서 rK148/ES2-HA 그룹의 모든 닭이 ES2 HPAIV에 대해 양성 HI 역가(≥4 log2)를 나타내었다(도 4B). rK148 또는 PBS로 백신 접종한 닭과 오리(실험군 1, 4, 5, 7)는 H5N6 HPAIV에 대한 HI 항체 역가를 나타내지 않았다(도 4A 및 4B).

2-3. 생존률 및 공격 접종 이후 바이러스 RNA 검출

바이러스 공격 접종 이후 바이러스의 생산성을 정량하기 위해 공격 접종 이후 2, 4, 6, 8, 12일째 구강인두(Oropharynx) 및 배설강 스왑(cloaca swab) 시료에 대하여 RNA 추출을 진행하였다. 각 배설강 스왑(cloaca swab) 시료 상층액 200μl를 Roche MagNa Pure 96 extraction system(Roche, Manheim, Germany)에 적용하여 RNA 추출을 진행하였다. 추출된 RNA 샘플은 matrix 유전자가 타겟인 reverse transcription polymerase chain reaction(rRT-PCR)을 통해 분석하였다. Cyclic threshold 값은 Standard curve를 이용하여 동등한 EID50/mL 값으로 치환되었다.

rK148/ES2-HA 백신의 고병원성 조류인플루엔자에 대한 방어능을 조사하기 위해 실험군 1 내지 7의 생존율을 측정하였고, 그 결과 오리 공격접종 실험에서 Oculonasal 백신 접종군의 생존율(100%)은 Mock 백신 접종군(33.3%)보다 유의하게 높았다(p=0.0195)(도 5A). 흥미롭게도 rK148을 접종한 실험군 1과 rK148/ES2-HA를 스프레이 접종한 실험군 3은 83%의 동일한 생존율을 갖는 것으로 확인되었다. 닭 공격접종 실험에서 rK148 백신을 접종한 실험군 5와 Mock 백신을 접종한 실험군 7은 3일째에 모두 폐사하였다. 반면 rK148/ES2-HA 백신을 접종한 실험군 6은 100% 생존율을 나타내었다(도 5B).

실험군 1 내지 4에서의 구강인두(Oropharynx) 및 배설강 스왑(cloaca swab) 샘플을 2일(도 6A, B), 4일(도 6C, D), 6일(도 6E, F) 및 8일(도 6G, H)마다 채취한 후, viral shedding을 rRT-PCR 방법으로 정향화하였다. 공격 접종 이후 2-6일 동안 실험군 2 및 3의 백신 접종 그룹의 구강인두(Oropharynx) 및 배설강 스왑(cloaca swab) 평균 바이러스 역가는 rK148을 접종한 실험군 1(10^1.49-^2.81EID50/ml) 및 Mock 백신을 접종한 실험군 4(10^{2.11- 2.88}EID50/ml)(p<0.01)의 역가보다 확연히 낮았다. 비강으로 백신을 접종한 실험군 2 또는 스프레이로 백신을 접종한 실험군 3에서 6마리 중 1마리만이 2일차에 구강인두(Oropharynx) 및 배설강 스왑(cloaca swab)에서 바이러스 배출을 나타내었으며, 평균 바이러스 역가(10^0.86 EID50/ml 및 10^0.56 EID50/ml)는 rK148(실험군 1)(10^1.49EID50/ml)과 Mock 백신 접종군(실험군 4)(10^2.11EID50/ml)보다 현저히 낮았다(각각 p<0.01 및 p<0.0001)(도 6A). 백신을 접종한 실험군 2 및 3에서는 구강인두(Oropharynx) 및 배설강 스왑(cloaca swab) 바이러스 배출은 4일 및 6일에 rK148 백신 접종(실험군 1) 및 Mock 백신 접종군(실험군 4)보다 유의하게 낮았다(p<0.05). 또한, rK148 백신접종군(실험군 1) 및 Mock 백신 접종군(실험군 4)에 의한 바이러스 배출은 6일차까지 관찰된 반면, rK148/ES2-HA 백신 접종군(실험군 2, 3)은 2일차 이후 바이러스 배출을 나타내지 않았다(도 6). Oculonasal 경로를 통해 rK148/ES2-HA 백신을 접종한 실험군 6은 rK148 백신 접종군(실험군 5) 및 Mock 백신 접종군(실험군 7)과 비교하여 더 낮은 바이러스 배출을 보여주었다(도 7).

2-4. 임상증상 스코어링

실험군 1 내지 7과 같이 제조된 공격 접종된 오리와 닭을 준비하였다. 이들을 모니터링하고 14dpi가 될 때까지 24시간마다 임상증상에 따라 스코어링을 수행하였다. 건강 상태에 따라 다음과 같이 스코어링하였다: 0(정상); 1(아픔); 2(중증) 및 3(사망). "아픔"은 임상 징후 중 하나를 보인 경우이고, "중증"은 호흡기 관련 증상, 헝클어진 깃털, 혼수, 식욕부진, 탈진, 두부 종창, 녹색 설사와 같은 임상 징후 중 하나 이상을 나타낸 경우이다.

rK148/ES2-HA 백신을 Oculonasal 및 Spray로 접종한 실험군 2 및 3은 어떠한 임상 징후도 나타내지 않았다. 다만 실험군 3은 5일차에 1마리가 사망하여 임상증상 점수가 실험군 2보다 더 높은 것을 확인할 수 있다. K148/08 백신 접종한 실험군 1에서는 오리 한 마리가 3일째에 탈진을 보이고 4일째에 폐사하였다. 같은 그룹의 3마리의 오리는 5일과 7일째부터 헝클어진 깃털과 무기력증을 보였다. 대조군인 실험군 4에서는 4마리의 오리가 폐사 1~2일 전부터 혼수상태, 탈진 및 사경을 나타내기 시작하였고, 생존한 오리 2마리는 혼수상태와 헝클어진 깃털과 같은 중증증상을 갖는 것으로 확인되었다. rK148/ES2-HA 백신을 접종한 실험군 6은 공격접종 후 어떠한 임상 징후도 나타내지 않았다. Mock 백신 접종군(실험군 7) 및 rK148 백신 접종군(실험군 5)는 공격접종 2일과 3일 째에 급사하였다.

2-5. 통계분석

바이러스 배출 및 혈청 HI 항체 역가는 Tukey-Kramer post-hoc test를 이용한One-way 또는 Two-way ANOVA를 통해 진행하였고, 각 실험그룹의 생존률 곡선 간의 유의성을 검토하기위하여 long-rank test를 진행하였다. p값이 ≤0.05 일 경우에 통계적 유의성이 있는 것으로 판정하였다.

상술한 결과를 통해, 닭 및 오리에 rK148/ES2-HA 백신을 접종한 결과 혈액 내 항체역가가 대조군에 비하여 유의적으로 현저히 높은 것을 확인하였다(도 4).

또한, rK148/ES2-HA 백신을 접종한 닭 및 오리는 고병원성 조류인플루엔자 공격접종에도 사망하지 않고, 우수한 생존율을 나타낸다는 것을 확인하였다. 구체적으로 100% 생존률(실험군 2), 83.3% 생존률(실험군 3), 100% 생존률(실험군 6)을 확인하였다. 이에 반해 rK148이나 PBS로 백신화한 닭 또는 오리의 경우 생존율이 30%로 현저히 낮거나, 대부분 사망하는 것으로 확인되었으며, 생존하더라도 중증 이상의 증상을 갖고 있는 것으로 확인되었다. 이러한 결과를 통해, 본 발명의 재조합 NDV 바이러스 벡터로 제조된 rK148/ES2-HA 백신은 생백신 벡터로도 유용하게 사용될 수 있음을 알 수 있다.

또한, rK148/ES2-HA 백신을 접종한 그룹(실험군 2, 3, 5)은 고병원성 조류인플루엔자 바이러스 공격접종 후 rK148 접종 또는 Mock 대조군에 비해 바이러스 배출양이 현저히 감소하였음 확인할 수 있다(도6, 도7)

본 발명에 따른 rK148/ES2-HA 백신은 닭 또는 오리와 같은 가금류에서 2016년 발생한 clade 2.3.4.4e H5N6 바이러스에 의한 폐사를 방어함과 동시에 바이러스 배출을 억제할 수 있으며, Oculonasal 백신과 더불어 Spray 백신으로 닭 또는 오리와 같은 가금류에 유용하게 사용가능함을 확인하였다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> Konkuk University Industrial Cooperation Corp <120> Novel Recombinant Newcastle Disease Virus and An Vaccine Composition Comprising the Same <130> HPC10503 <160> 43 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F1_F <400> 1 accaaacaga gaatctgtaa gg 22 <210> 2 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F1_R <400> 2 tcagtacccc cagtcgg 17 <210> 3 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F2_F <400> 3 gtgaccagat gagctttgc 19 <210> 4 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F2_R <400> 4 ttagccattc agtgcaagg 19 <210> 5 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F3_F <400> 5 gtgcattgat catgtcacg 19 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F3_R <400> 6 gtcagtttga cattgacctt g 21 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F4_F <400> 7 gatagaagaa cttgacacct c 21 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F4_R <400> 8 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catgaccaaa atcccttaac 20040 gtgagttttc gttccactga gcgtcagacc ccgtagaaaa gatcaaagga tcttcttgag 20100 atcctttttt tctgcgcgta atctgctgct tgcaaacaaa aaaaccaccg ctaccagcgg 20160 tggtttgttt gccggatcaa gagctaccaa ctctttttcc gaaggtaact ggcttcagca 20220 gagcgcagat accaaatact gttcttctag tg 20252

Claims (13)

1. 조류인플루엔자 유래 헤마글루티닌(HA) 단백질 또는 이를 암호화하는 핵산 분자를 포함하는 재조합 뉴캣슬병 바이러스 벡터.
2. 제1항에 있어서,
   상기 HA 단백질은 HPAIV(Highly Pathogenic Avian Influenza virus)의 H5N6 혈청형 HA 단백질인 것을 특징으로 하는 재조합 뉴캣슬병 바이러스 벡터.
3. 제1항에 있어서,
   상기 HA 단백질은 clade 2.3.4.4e H5N6 A/Duck/Korea/ES2/16(ES2) HPAIV의 HA 단백질인 것을 특징으로 하는 재조합 뉴캣슬병 바이러스 벡터.
4. 제1항에 있어서,
   상기 HA 단백질의 암호화 핵산분자는 서열번호 42로 표시되는 유전자인 것을 특징으로 하는 재조합 뉴캣슬병 바이러스 벡터.
5. 제1항에 있어서,
   상기 HA 단백질은 기탁번호 KCTC 11570BP로 기탁된 NDV K148/08 뉴캣슬병 바이러스의 P(phosphoprotein) 영역과 M(matrix) 영역 사이에 삽입된 것을 특징으로 하는 재조합 뉴캣슬병 바이러스 벡터.
6. 제1항에 있어서,
   상기 재조합 뉴캣슬병 바이러스 벡터는 서열번호 43로 표시되는 것을 특징으로 하는 pK148/ES2-HA 벡터인 것을 특징으로 하는 재조합 뉴캣슬병 바이러스 벡터.
7. 제1항 내지 제6항 중에서 어느 한 항에 따른 재조합 뉴캣슬병 바이러스 벡터를 도입한 재조합 뉴캣슬병 바이러스.
8. 제7항에 있어서,
   상기 재조합 뉴캣슬병 바이러스는 clade 2.3.4.4e H5N6 A/Duck/Korea/ES2/16(ES2) HPAIV의 HA 단백질을 발현하는 것을 특징으로 하는 재조합 뉴캣슬병 바이러스.
9. 제1항 내지 제6항 중에서 선택되는 어느 한 항의 재조합 뉴캣슬병 바이러스 벡터를 유효성분으로 포함하는 백신 조성물.
10. 제9항에 있어서,
    상기 백신 조성물은 고병원성 조류인플루엔자 바이러스에 대한 백신 조성물인 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
11. 제9항에 있어서,
    상기 백신 조성물은 생백신, 사독 백신, 서브유닛 백신, 벡터 백신, 키메라 백신 및 DNA 백신으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
12. 제9항에 있어서,
    상기 백신 조성물은 발육종란내(In Ovo), 비강내, 기관내, 경구, 피내, 근육내, 복막내, 정맥내, 결막 및 피하로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 경로를 통해 투여되는 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
13. 제9항에 따른 백신 조성물을 개체에 투여하는 단계;를 포함하는 독감 또는 조류 독감의 예방 방법.

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