CN103149262B - 新风胶囊水溶性蛋白分子量检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及中药类水溶性蛋白分子量的检测领域，具体是涉及一种新风胶囊水溶性蛋白分子量检测方法。本发明新风胶囊水溶性蛋白分子量检测方法，运用分子生物学和指纹图谱的原理与技术，将先进的生物技术与指纹图谱新思路相结合，运用SDS-PAGE电泳技术，对新风胶囊中水溶性蛋白成分分析，为今后建立该制剂电泳特征图谱提供依据。通过实验可知，新风胶囊水溶性蛋白共分离出成分深浅不一的35条蛋白带，蛋白质大小在12.5kDa～200kDa范围内均有分布，其中主带有2条，其分子量分别为16.38kDa、17.07kDa左右，这2条主带，可作为新风胶囊水溶性蛋白成分特征指标。
Description
技术领域
本发明涉及中药类水溶性蛋白分子量的检测领域，具体是涉及一种新风胶囊水溶性蛋白分子量检测方法。
背景技术
新风胶囊系安徽中医学院第一附属医院的医院制剂(皖药制Z20050062)，该药由黄芪、薏苡仁、雷公藤和蜈蚣4味中药组成，具有益气健脾，化湿通络之功效，具有广阔的开发前景。
随着分子生物学的快速发展及应用，为中药的质量控制提供了新的思路。由于中药主要来源于动植物等生物体，其细胞内都含有受遗传基因调控、代表其品种特征性的蛋白质分子，不同蛋白质的分子大小、空间结构和电荷数目上的差异，可以通过电泳得到分离。因此，应用现代分子生物学的原理和方法，将中药制剂质量评价技术从形态、组织、细胞推进到分子水平，对中药制剂中蛋白质成分分析，可以解决目前中药制剂鉴定以及内在质量评价的难题。
发明内容
针对现有技术中存在的技术问题，本发明提供了一种新风胶囊水溶性蛋白分子量检测方法，将SDS-PAGE电泳方法应用于新风胶囊中水溶性蛋白成分测定，为建立该制剂电泳特征图谱提供依据。
为了实现上述目的，采用的技术方案如下：
新风胶囊水溶性蛋白分子量检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
①、试剂的配制
电极缓冲液，称取甘氨酸5.0g、三羟甲基氨基甲烷3.0g，十二烷基磺酸钠1.0g，加适量双蒸水溶解后，用1mol/l盐酸调pH至8.3，然后加双蒸水至1000ml，置于4℃保存；
固定液，称取三氯醋酸5.0g，加双蒸水200ml溶解后，加甲醇200ml，再加双蒸水至500ml；
考马斯亮蓝脱色液，量取乙醇400ml、冰醋酸100ml与双蒸水500ml，混匀；
1％琼脂糖溶液，称取琼脂糖0.2g，加电极缓冲液20ml，加热溶解成澄清溶液；
10％过硫酸铵溶液，称取过硫酸铵0.1g，加1ml双蒸水溶解至澄清；
②、供试品溶液的制备
取新风胶囊内容物5.0g，于研钵中研成细粉，加6ml 1M Tris-HCl缓冲液溶解，研匀，静置5min，4000r/min离心20min，吸取上清液900μl，加300μl 4×蛋白质上样缓冲液混合，沸水浴5min，以12000r/min离心20min，冷却后吸取上清液分装，每管分装20μl，-20℃贮存；
③、电泳槽的安装
电泳槽的各部件在组装前均需清洗干净，选择水平操作台面，首先将白色内芯放入黑色内槽中，然后将电泳玻璃采取凹形玻璃板在白色内芯内侧、矩形玻璃板在白色内芯外侧的方向，顺着白色内芯一侧的胶条小心放入内芯；
当两侧的玻璃全部放入到白色内芯后，确认凹、平板的底部边缘均与黑色内槽密封槽平齐，旋紧紧固旋钮；
用移液枪吸取1％琼脂糖溶液，沿密封槽一端灌入封闭玻璃板，为防止留存气泡，稍抬起一端赶去气泡，琼脂糖溶液需进入胶室0.9～1.1cm，凝固5～7min后进行灌胶操作；
④、凝胶的制备
按4ml 1.5M Tris-HCl缓冲液、6.7ml 30％丙烯酰胺、1.6ml 1％十二烷基磺酸钠、0.1ml 10％四甲基乙二胺、0.1ml 10％过硫酸铵和3.3ml双蒸水配制12.5％分离胶溶液，然后开始灌胶，并防止气泡产生，水封室温下聚合；
待分离胶溶液聚合后，用滤纸吸取上面的水层，再灌入4.5％浓缩胶溶液，并插上样品梳，4.5％浓缩胶溶液按1.35ml 30％丙烯酰胺、0.9ml 1％十二烷基磺酸钠、0.07ml 10％四甲基乙二胺、0.07ml 10％过硫酸铵、2.25ml 1M Tris-HCl缓冲液和4.33ml双蒸水配制；
⑤、上样与电泳
待浓缩胶溶液聚合后，双手轻取出梳子，提住白色把手将黑色内槽放入外槽中，用微量注射器吸取样品提取液5μl，缓缓注入加样孔中，动作要轻，不能破坏胶面；
在黑色内槽内部和外部分别加注电极缓冲液，内部液面高度要高过凹板下沿10mm，外部液面高度为外槽的1/3；
盖上安全盖，接通电泳仪，80v电压1小时后，待溴酚蓝示踪指示剂前沿到达分离胶上沿时，把电压调至100v，待示踪指示剂行至距琼脂层0.9～1.1cm时，关闭电源，停止电泳，整个电泳过程需要3～4个小时；
⑥、染色与脱色
电泳结束后，打开电泳槽，取出凝胶，切去浓缩胶，保留分离胶并标记溴酚蓝前沿，置固定液中固定半小时后，取凝胶放入适量考马斯亮蓝染色液中，确保染色液可以充分覆盖凝胶，置于水平摇床上缓慢摇动，室温染色1.5～2.5小时；
倒出染色液，加入适量考马斯亮蓝脱色液，确保考马斯亮蓝脱色液可以充分覆盖凝胶，置于水平摇床上缓慢摇动，室温脱色3.5～4.5小时；
更换考马斯亮蓝脱色液2～4次，直至蓝色背景全部被脱去，并且蛋白条带染色效果达到预期，完成脱色后，把凝胶保存在含20％甘油的水中，进行拍照；
对拍射照片进行光密度积分值分析；
⑦、蛋白质分子量的测定
根据样品迁移距离/指示剂迁移距离计算相对迁移率，以标准蛋白质分子量对数对其相对迁移率作标准曲线，根据待测样品相对迁移率查该曲线，计算其分子量。
本发明新风胶囊水溶性蛋白分子量检测方法，运用分子生物学和指纹图谱的原理与技术，将先进的生物技术与指纹图谱新思路相结合，运用SDS-PAGE电泳技术，对新风胶囊中水溶性蛋白成分分析，为今后建立该制剂电泳特征图谱提供依据。
附图说明
为了便于本领域技术人员理解，下面结合附图对本发明作进一步的说明。
图1是含Marker的新风胶囊水溶性蛋白SDS-PAGE电泳图。
图2是宽分子量标准蛋白曲线。
具体实施方式
一、仪器与材料
1、仪器
SYZ-B型石英亚沸高纯水蒸馏器(江苏金坛市环宇科学仪器厂)。
PHS-25型实验室pH计(上海今迈仪器仪表有限公司)。
BP211D型十万分之一电子天平(德国赛多利斯公司)。
HH-S型水浴锅(郑州长城科工贸有限公司)。
手动移液器(BIOHIT)。
80-2离心沉淀器(上海手术器械厂)。
KDC-16H高速离心机(科大创新股份有限公司中佳分公司)。
JY-JX系列垂直电泳槽、JY-C系列电泳仪(北京君意东方电泳设备有限公司)。
WD-9405B脱色摇床(北京六一仪器厂)。
2、材料
新风胶囊(由安徽省中医院制剂中心提供，批号：20120112、20111025)。
甘氨酸Glycine(Solarbio；Cat#G8200)。
十二烷基磺酸钠SDS(Sigma；20110105488)。
三羟甲基氨基甲烷TRIS(Sigma)。
三氯醋酸(天津市光复精细化工研究所；批号：2010.6.17)。
琼脂糖(GENE COMPANY LTO；LOT No.111860)。
1M Tris-HCl缓冲液(Solarbio；Cat.No.T1020 Lot.No.20110307)。
1.5MTris-HCl缓冲液(Solarbio；Cat.No.T1010 Lot.No.20110307)。
PageRulerTM Unstained Protein ladder (Thermo Scientific，赛默飞世尔科技Lot#000961)。
4×蛋白质上样缓冲液(Solarbio；Cat.No.P1015 Lot.No.20110222)。
30％丙烯酰胺(29∶1)(30％Arc-Bis)(Solarbio；Cat.No.A1010Lot.No.20101020)。
四甲基乙二胺TEMED(Beyot ime；ST728)。
过硫酸铵Ammonium Persulfate(Sigma A6761)。
考马斯亮蓝染色液(Beyotime；P0017B)碧云天生物技术研究所。
H2O为双蒸水，余试剂为分析纯。
二、新风胶囊水溶性蛋白分子量检测方法
①、试剂的配制
电极缓冲液，称取甘氨酸5.0g、三羟甲基氨基甲烷3.0g，十二烷基磺酸钠1.0g，加适量双蒸水溶解后，用1mol/l盐酸调pH至8.3，然后加双蒸水至1000ml，置于4℃保存。
固定液，称取三氯醋酸5.0g，加双蒸水200ml溶解后，加甲醇200ml，再加双蒸水至500ml。
考马斯亮蓝脱色液，量取乙醇400ml、冰醋酸100ml与双蒸水500ml，混匀。
1％琼脂糖溶液，称取琼脂糖0.2g，加电极缓冲液20ml，加热溶解成澄清溶液。
10％过硫酸铵溶液，称取过硫酸铵0.1g，加1ml双蒸水溶解至澄清。
②、供试品溶液的制备
取新风胶囊内容物5.0g，于研钵中研成细粉，加6ml 1M Tris-HCl缓冲液溶解，研匀，静置5min，4000r/min离心20min，吸取上清液900μl，加300μl 4×蛋白质上样缓冲液混合，沸水浴5min，以12000r/min离心20min，冷却后吸取上清液分装，每管分装20μl，-20℃贮存。
③、电泳槽的安装
电泳槽的各部件在组装前均需清洗干净，选择水平操作台面，首先将白色内芯放入黑色内槽中，然后将电泳玻璃采取凹形玻璃板在白色内芯内侧、矩形玻璃板在白色内芯外侧的方向，顺着白色内芯一侧的胶条小心放入内芯。
当两侧的玻璃全部放入到白色内芯后，确认凹、平板的底部边缘均与黑色内槽密封槽平齐，旋紧紧固旋钮。
用移液枪吸取1％琼脂糖溶液，沿密封槽一端灌入封闭玻璃板，为防止留存气泡，稍抬起一端赶去气泡，琼脂糖溶液需进入胶室1cm，凝固5～7min后进行灌胶操作。
④、凝胶的制备
按4ml 1.5M Tris-HCl缓冲液、6.7ml 30％丙烯酰胺、1.6ml 1％十二烷基磺酸钠、0.1ml 10％四甲基乙二胺、0.1ml 10％过硫酸铵和3.3ml双蒸水配制12.5％分离胶溶液，然后开始灌胶，并防止气泡产生，水封室温下聚合。
待分离胶溶液聚合后，用滤纸吸取上面的水层，再灌入4.5％浓缩胶溶液，并插上样品梳，4.5％浓缩胶溶液按1.35ml 30％丙烯酰胺、0.9ml 1％十二烷基磺酸钠、0.07ml 10％四甲基乙二胺、0.07ml 10％过硫酸铵、2.25ml 1M Tris-HCl缓冲液和4.33ml双蒸水配制。
⑤、上样与电泳
待浓缩胶溶液聚合后，双手轻取出梳子，提住白色把手将黑色内槽放入外槽中，用微量注射器吸取样品提取液5μl，缓缓注入加样孔中，动作要轻，不能破坏胶面。
在黑色内槽内部和外部分别加注电极缓冲液，内部液面高度要高过凹板下沿10mm，外部液面高度为外槽的1/3。
盖上安全盖，接通电泳仪，80v电压1小时后，待溴酚蓝示踪指示剂前沿到达分离胶上沿时，把电压调至100v，待示踪指示剂行至距琼脂层1cm时，关闭电源，停止电泳，整个电泳过程需要3～4个小时。
⑥、染色与脱色
电泳结束后，打开电泳槽，取出凝胶，切去浓缩胶，保留分离胶并标记溴酚蓝前沿，置固定液中固定半小时后，取凝胶放入适量考马斯亮蓝染色液中，确保染色液可以充分覆盖凝胶，置于水平摇床上缓慢摇动，室温染色2小时。
倒出染色液，加入适量考马斯亮蓝脱色液，确保考马斯亮蓝脱色液可以充分覆盖凝胶，置于水平摇床上缓慢摇动，室温脱色4小时。
更换考马斯亮蓝脱色液2～4次，直至蓝色背景全部被脱去，并且蛋白条带染色效果达到预期，完成脱色后，把凝胶保存在含20％甘油的水中，进行拍照。
采用凝胶图像分析软件BandScan5.0对拍摄的照片进行光密度积分值分析。
⑦、蛋白质分子量的测定
根据样品迁移距离/指示剂迁移距离计算相对迁移率，以标准蛋白质分子量对数对其相对迁移率作标准曲线，根据待测样品相对迁移率查该曲线，计算其分子量。
三、检测结果
将样品与Thermo Scientific公司生产的宽分子量标准蛋白(分子量标准)加在同一块凝胶上电泳，结果请参阅图1，图1中，1、2为样品(批号分别为：20120112、20111025)；M为宽相对分子质量标准蛋白(自上至下相对分子质量分别为200，150，120，100，85，70，60，50，40，30，25，20，15，10kDa)。
通过图1可知，宽分子量标准蛋白在SDS-PAGE梯度凝胶上可见14条带，以各带的迁移率(Rf)为横坐标，相应的蛋白质分子量的对数值为纵坐标作图，通过SPSS16.0统计学软件，可得到分子量的标准曲线图，请参阅图2，其蛋白质分子量的对数值与相对迁移率(Rf)关系的标准曲线方程：Y＝-1.616X+5.202(r＝0.968；r2＝0.936)。
根据SDS-PAGE图谱上主要待测蛋白质点的纵向迁移率，便可从标准曲线上测定相应的分子量。新风胶囊水溶性蛋白成分共分离出深浅不一的35条蛋白带，蛋白质大小在12.5kDa～200kDa范围内均有分布，其中主带有2条，其分子量分别为16.38kDa、17.07kDa左右，每条轨道2主带的蛋白含量分别占各自轨道总蛋白的86.8％，84.9％。
四、结果分析
1、新风胶囊水溶性蛋白成分SDS-PAGE电泳图谱有2条特强的蛋白带，分子量分别为16.38kDa、17.07kDa。这2条蛋白带，可作为新风胶囊水溶性蛋白成分特征指标。
2、SDS-PAGE电泳最佳条件筛选
考马斯亮蓝染色目前广泛运用的是考马斯亮蓝R-250，其原理是利用考马斯亮蓝分子上的芳香苯环，与蛋白质的疏水区结合；同时其亚硫酸基团(-SO3 2-)与蛋白质的正电荷结合，可使蛋白质染出蓝色条带。该法简单、快速，是蛋白质电泳检测和定量分析常用的一种方法。但是该方法灵敏度相对不高，且背景较高。而且在试验过程中发现，由于蛋白质特性不同，碱性蛋白和低分子量蛋白在醇、酸固定及脱色时，如果时间控制不好，则容易从凝胶中洗脱下来。
中药复方制剂以水提工艺为主，制剂中可溶性蛋白质的种类较多，分子量变化范围大，且每种蛋白质的含量也不一样，为了获得较理想的电泳效果，要选择适当的凝胶浓度和上样量。其他条件如实验室的温湿度、试剂的配制新鲜与否、琼脂糖封底齐否、有无气泡产生、水封等因素，也影响试验结果。通过上述试验数据结果表明，分离胶浓度取12.5％、每槽上样量为5μl时，电泳效果最好。
以上内容仅仅是对本发明的构思所作的举例和说明，所属本技术领域的技术人员对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，只要不偏离发明的构思或者超越本权利要求书所定义的范围，均应属于本发明的保护范围。
Claims (1)
1.新风胶囊水溶性蛋白分子量检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
①、试剂的配制
电极缓冲液，称取甘氨酸5.0g、三羟甲基氨基甲烷3.0g，十二烷基磺酸钠1.0g，加适量双蒸水溶解后，用1mol/l盐酸调pH至8.3，然后加双蒸水至1000ml，置于4℃保存；
固定液，称取三氯醋酸5.0g，加双蒸水200ml溶解后，加甲醇200ml，再加双蒸水至500ml；
考马斯亮蓝脱色液，量取乙醇400ml、冰醋酸100ml与双蒸水500ml，混匀；
1％琼脂糖溶液，称取琼脂糖0.2g，加电极缓冲液20ml，加热溶解成澄清溶液；
10％过硫酸铵溶液，称取过硫酸铵0.1g，加1ml双蒸水溶解至澄清；
②、供试品溶液的制备
取新风胶囊内容物5.0g，于研钵中研成细粉，加6ml 1M Tris-HCl缓冲液溶解，研匀，静置5min，4000r/min离心20min，吸取上清液900μl，加300μl 4×蛋白质上样缓冲液混合，沸水浴5min，以12000r/min离心20min，冷却后吸取上清液分装，每管分装20μl，-20℃贮存；
③、电泳槽的安装
电泳槽的各部件在组装前均需清洗干净，选择水平操作台面，首先将白色内芯放入黑色内槽中，然后将电泳玻璃采取凹形玻璃板在白色内芯内侧、矩形玻璃板在白色内芯外侧的方向，顺着白色内芯一侧的胶条小心放入内芯；
当两侧的玻璃全部放入到白色内芯后，确认凹、平板的底部边缘均与黑色内槽密封槽平齐，旋紧紧固旋钮；
用移液枪吸取1％琼脂糖溶液，沿密封槽一端灌入封闭玻璃板，为防止留存气泡，稍抬起一端赶去气泡，琼脂糖溶液需进入胶室0.9～1.1cm，凝固5～7min后进行灌胶操作；
④、凝胶的制备
按4ml 1.5M Tris-HCl缓冲液、6.7ml 30％丙烯酰胺、1.6ml 1％十二烷基磺酸钠、0.1ml 10％四甲基乙二胺、0.1ml 10％过硫酸铵和3.3ml双蒸水配制12.5％分离胶溶液，然后开始灌胶，并防止气泡产生，水封室温下聚合；
待分离胶溶液聚合后，用滤纸吸取上面的水层，再灌入4.5％浓缩胶溶液，并插上样品梳，4.5％浓缩胶溶液按1.35ml 30％丙烯酰胺、0.9ml 1％十二烷基磺酸钠、0.07ml 10％四甲基乙二胺、0.07ml 10％过硫酸铵、2.25ml 1M Tris-HCl缓冲液和4.33ml双蒸水配制；
⑤、上样与电泳
待浓缩胶溶液聚合后，双手轻取出梳子，提住白色把手将黑色内槽放入外槽中，用微量注射器吸取样品提取液5μl，缓缓注入加样孔中，动作要轻，不能破坏胶面；
在黑色内槽内部和外部分别加注电极缓冲液，内部液面高度要高过凹板下沿10mm，外部液面高度为外槽的1/3；
盖上安全盖，接通电泳仪，80v电压1小时后，待溴酚蓝示踪指示剂前沿到达分离胶上沿时，把电压调至100v，待示踪指示剂行至距琼脂层0.9～1.1cm时，关闭电源，停止电泳，整个电泳过程需要3～4个小时；
⑥、染色与脱色
电泳结束后，打开电泳槽，取出凝胶，切去浓缩胶，保留分离胶并标记溴酚蓝前沿，置固定液中固定半小时后，取凝胶放入适量考马斯亮蓝染色液中，确保染色液可以充分覆盖凝胶，置于水平摇床上缓慢摇动，室温染色1.5～2.5小时；
倒出染色液，加入适量考马斯亮蓝脱色液，确保考马斯亮蓝脱色液可以充分覆盖凝胶，置于水平摇床上缓慢摇动，室温脱色3.5～4.5小时；
更换考马斯亮蓝脱色液2～4次，直至蓝色背景全部被脱去，并且蛋白条带染色效果达到预期，完成脱色后，把凝胶保存在含20％甘油的水中，进行拍照；
对拍射照片进行光密度积分值分析；
⑦、蛋白质分子量的测定
根据样品迁移距离/指示剂迁移距离计算相对迁移率，以标准蛋白质分子量对数对其相对迁移率作标准曲线，根据待测样品相对迁移率查该曲线，计算其分子量。
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