CN101392018B - 沙冬青蛋白质双向电泳技术 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种沙冬青的蛋白质双向电泳技术，是针对极端环境中生存的植物蛋白采用双向电泳技术制备，采用本技术方案对极端环境下生存的新疆沙冬青进行的实验取得了好的效果。目前，经反复实验证明：实验样品制备全、重复性好、图谱清晰、结果可靠，可为逆境胁迫下植物蛋白质组学研究提供技术范例，是一套适用于新疆沙冬青蛋白质组分析的双向电泳技术。
Description
技术领域
本发明涉及一种沙冬青的蛋白质双向电泳技术，是生存极端环境下的新疆沙冬青的蛋白质组学研究，该技术可直接应用于极端条件下生存的高抗逆植物研究。
背景技术
抗逆性是植物在系统进化过程中，为适应不良环境获得的一种对策。在植物的生存环境中一些非生物因子胁迫，对植物的生长发育和生存都会产生严重的影响，为了应对外界环境的不利影响，植物在进化过程中形成了完整的防御机制。
沙冬青(Ammopiptanthus Cheng f.)为泛北极区亚洲中部戈壁荒漠区唯一生存的特有常绿豆科阔叶灌木类群。新疆沙冬青为沙冬青属中的一个种，能够耐受多年高温、大气干旱胁迫与低温胁迫，不仅能在-20—-25℃的低温条件下正常生存，还能耐受47.6℃的高温条件，保持着正常的生长发育过程，具有高抗寒性；因此，成了抗逆性研究中一种优秀的指示植物材料。
但由于极端环境下的植物材料，体内含有极端条件下产生的多种次生代谢物(色素、酚类、醌类等)，众多干扰使得作为蛋白质组研究的核心技术-双向电泳成为挑战，常规方法不能成功制备纯度高的蛋白，在电泳过程中，合理的参数设定可有效的除盐，聚焦等。以沙冬青植物叶片为材料，进行叶片总蛋白的制备，建立适用于沙冬青叶片蛋白质组分离的双向电泳技术，可为极端环境下植物材料抗逆性蛋白质组学研究提供实验基础和参考。
本发明的突破点就是建立极端环境下的高抗逆植物新疆沙冬青的双向电泳技术体系，利用该技术可对新疆沙冬青进行蛋白质组学研究分析。
发明内容
本发明目的在于提供一种沙冬青的蛋白质双向电泳技术，是针对极端环境中生存的植物蛋白采用双向电泳技术制备，该技术经反复实验证明样品制备全、重复性好、图谱清晰，是一套适用于新疆沙冬青蛋白质组分析的双向电泳技术。
本发明所述的一种沙冬青的蛋白质双向电泳技术，按下列步骤进行：
a、采集沙冬青叶片，用液氮罐装运回，在实验室-80℃以下保存备用；
b、定量称取完整沙冬青叶片样品，去除脂类、腊质杂质，用捣碎机液氮粉碎样品；
c、将3倍的弱碱性三羟甲基氨基甲烷缓冲液，1mmol/L蛋白酶抑制剂在离心管中摇匀，4℃静置1小时，温度4℃，20000×g离心，漂去上层脂质，澄清滤液备用；
d、将步骤c沉淀杂质中加入1-1.5倍8-10mol/L尿素，2mol/L硫脲，4％3-[3-(胆酰胺基丙基)二甲氨基]丙磺酸盐，65mmol/L二硫苏糖醇，1％两性电解质载体，在离心管中摇匀，18℃静置1小时，在温度18℃，20000×g离心，进行二次提取，澄清滤液备用；
e、将步骤c和d的澄清滤液混合，加入10％(重量体积比)聚乙烯吡咯烷酮，搅拌后温度18℃，20000×g离心5分钟，取上清液，加入4倍体积，-20℃预冷的10％(重量体积比)丙酮-三氯乙酸溶液，-20℃沉降3小时，弃上清；
f、然后用冷丙酮重复洗沉淀2次，每次-20℃沉降30分钟离心，浓缩为干粉；
g、蛋白质定量：采用考马斯亮蓝染色法测定蛋白质含量；
h、第一向等电聚焦电泳：蛋白质定量后取样，用上样水化液8-10mol/L尿素、4％3-[3-(胆酰胺基丙基)二甲氨基]丙磺酸盐、2％IPG缓冲液，0.01mg溴酚蓝，用前加入二硫苏糖醇1.2mg配成120ul溶液，倾入IPG胶条槽中，将IPG胶条胶面向下放入槽中，除去胶面与泡胀液间的气泡，将胶面与溶液充分接触润湿，用矿物油覆盖胶条，进行等电聚焦；
i、胶条平衡：按照常规方法，等电聚焦完成后将IPG胶条在平衡液6—9mol/L尿素，2—5％十二烷基硫酸钠，0.375mol/LpH8.0-8.9三羟甲基氨基甲烷盐酸盐，20—30％甘油，1.5％二硫苏糖醇及6—9mol/L尿素，2—5％十二烷基硫酸钠，0.375mol/L pH8.0—8.9三羟甲基氨基甲烷盐酸盐，20—30％甘油，2.5％碘乙酰胺中分别在摇床上平衡10—15分钟；
j、第二向SDS-PAGE电泳
使用垂直电泳，将十二烷基硫酸钠凝胶储液为30％丙烯酰胺，0.8％甲叉双丙烯酰胺，十二烷基硫酸钠凝胶缓冲液为3mol/L pH8.9三羟甲基氨基甲烷盐酸盐，10％十二烷基硫酸钠，10％过硫酸铵和1％四甲基乙二胺分别进行配制，然后混合再配制成12.5％的凝胶备用；
电极缓冲液：按0.1％十二烷基硫酸钠，0.025-0.05mol/L三羟甲基氨基甲烷，0.192-0.384mol/L甘氨酸进行配制；再将配制的凝胶和电极缓冲液按电压80V，0.5小时；120V，2-3小时参数进行电泳，整个过程以循环水，将环境温度控制在15—20℃；
k、再按常规染色考马斯亮蓝R250方法进行染色即可。
步骤c中的蛋白酶抑制剂为苯甲基磺酰氟。
步骤j中配制后的电极缓冲液体系pH为8.0-8.3。
步骤j中配制12.5％的凝胶所用的含量为体积比：凝胶储液:凝胶缓冲液:十二烷基硫酸钠:过硫酸铵:四甲基乙二胺＝16.7:10:0.4:0.2:0.02。
步骤d两性电解质载体是：脂肪族多氨基多羧酸，是具有相近等电点的多氨基多羟基两性化合物的混合物。(市售)
具体实施方式
实施例1
采用Eppendorf超速离心机、双向电泳PROTEAN II Xi/XL Cell(美国BIO-RAD公司)
a、采集吐鲁番沙漠植物园的新疆沙冬青叶片，用液氮罐装运回，在实验室-80℃以下保存备用；
b、称取5g完整沙冬青叶片样品，-20℃预冷乙醚淋洗叶片2次，去除脂类、腊质杂质后低温下挥干，用捣碎机液氮粉碎样品；
c、取1克样品将3倍的弱碱性25mmol/L pH8.9三羟甲基氨基甲烷缓冲液，1mmol/L蛋白酶抑制剂苯甲基磺酰氟在离心管中摇匀，4℃静置1小时，温度4℃，20000×g离心，漂去上层脂质，分装澄清滤液备用，该步骤可全面提取叶片总蛋白，并可有效的避免蛋白被降解；
d、将步骤c沉淀杂质中加入1倍8mol/L尿素，2mol/L硫脲，4％(重量体积比)3-[3-(胆酰胺基丙基)二甲氨基]丙磺酸盐，65mmol/L二硫苏糖醇，(体积比)1％两性电解质载体，脂肪族多氨基多羧酸，具有相近等电点的多氨基多羟基两性化合物的混合物，在离心管中摇匀，温度18℃静置1小时，在温度18℃，20000×g离心，进行二次提取，澄清滤液备用，保证膜蛋白和疏水蛋白的提取完全；
e、将步骤c和d的澄清滤液混合，加入重量比10％(重量体积比)聚乙烯吡咯烷酮，用来吸附酚、醌类物质，搅拌后温度18℃，20000×g离心5分钟，取上清液，加入4倍体积，-20℃预冷的10％(重量体积比)丙酮-三氯乙酸溶液，-20℃沉降3小时，弃上清液；
f、然后用冷丙酮重复洗沉淀2次，每次-20℃沉降30分钟离心，浓缩为干粉；
g、蛋白质定量：采用考马斯亮蓝染色法测定蛋白质含量；使用核酸蛋白分析仪DU800(美国Backman公司)，考马斯亮蓝染色法，将蛋白质定量标准梯度稀释后用考马斯亮蓝G-250染色，波长595nm测定吸收度，做标准曲线，并测定蛋白质含量；
h、第一向等电聚焦电泳：蛋白质定量后取样用上样水化液8mol/L尿素、4％(重量体积比)3-[3-(胆酰胺基丙基)二甲氨基]丙磺酸盐、2％(体积比)IPG缓冲液，0.01mg溴酚蓝，用前加入二硫苏糖醇1.2mg配成120ul溶液，倾入IPG胶条槽中，将IPG胶条胶面向下放入槽中，除去胶面与泡胀液间的气泡，将胶面与溶液充分接触润湿，用矿物油覆盖胶条，进行等电聚焦；(参数设置见表1)
表1 IEF参数设置
| 步骤 | 电压(V) | 时间(h) |
| 水化 | 50 | 12 |
| 1 | 250 | 0.5 |
| 2 | 500 | 1 |
| 3 | 1000 | 0.5 |
| 4 | 4000 | 3 |
| 5 | 4000 | 20000vh |
| 6 | 500 | 任意时间 |
i、胶条平衡：等电聚焦完成后将IPG胶条在平衡液6mol/L尿素，2％，十二烷基硫酸钠，0.375mol/L pH8.8三羟甲基氨基甲烷盐酸盐，20％甘油，1.5％(重量体积比)二硫苏糖醇及尿素6mol/L，2％十二烷基硫酸钠，0.375mol/L pH8.8三羟甲基氨基甲烷盐酸盐，20％甘油，2.5％(重量体积比)碘乙酰胺中分别平衡10分钟；
j、第二向SDS-PAGE电泳
使用垂直电泳，将十二烷基硫酸钠凝胶储液为30％丙烯酰胺、0.8％甲叉双丙烯酰胺，十二烷基硫酸钠凝胶缓冲液为3mol/L pH8.9三羟甲基氨基甲烷盐酸盐，10％十二烷基硫酸钠，10％过硫酸铵和1％四甲基乙二胺分别进行配制，然后混合，按体积比凝胶储液:凝胶缓冲液:十二烷基硫酸钠:过硫酸铵:四甲基乙二胺＝16.7:10:0.4:0.2:0.02再配制成12.5％的凝胶备用；
电极缓冲液：按0.1％十二烷基硫酸钠，0.025mol/L三羟甲基氨基甲烷，0.192mol/L甘氨酸进行配制，使电极缓冲液体系pH为8.0，再将配制的凝胶和电极缓冲液按电压80V，0.5小时及120V，2小时参数进行电泳，整个过程以循环水，将环境温度控制在15℃；
k、再按常规染色考马斯亮蓝R250方法进行染色即可。
实施例2
采用Eppendorf超速离心机、双向电泳PROTEAN II Xi/XL Cell(美国BIO-RAD公司)
a、采集沙冬青叶片，用液氮罐装运回，在实验室-80℃以下保存备用；
b、定量称取完整沙冬青叶片样品，-20℃预冷乙醚淋洗叶片2次，去除脂类、腊质杂质，用捣碎机液氮粉碎样品；
c、将3倍的弱碱性25mmol/L pH8.9三羟甲基氨基甲烷缓冲液，1mmol/L蛋白酶抑制剂苯甲基磺酰氟在离心管中摇匀，4℃静置1小时，温度4℃，20000×g离心，漂去上层脂质，澄清滤液备用；该步骤可全面提取叶片总蛋白，并可有效的避免蛋白被降解；
d、将步骤c沉淀杂质中加入1.2倍9mol/L尿素，2mol/L硫脲，4％(重量体积比)3-[3-(胆酰胺基丙基)二甲氨基]丙磺酸盐，65mmol/L二硫苏糖醇，(体积比)1％两性电解质载体，在离心管中摇匀，温度18℃静置1小时，在温度18℃，20000×g离心，进行二次提取，澄清滤液备用，保证膜蛋白和疏水蛋白的提取完全；
e、将步骤c和d的澄清滤液混合，加入10％(重量体积比)聚乙烯吡咯烷酮，用来吸附酚、醌类物质，搅拌后温度18℃，20000×g离心5分钟，取上清液，加入4倍体积，-20℃预冷的10％(重量体积比)丙酮-三氯乙酸溶液，-20℃沉降3小时，弃上清；
f、然后用冷丙酮重复洗沉淀2次，每次-20℃沉降30分钟离心，浓缩为干粉；
g、蛋白质定量：采用考马斯亮蓝染色法测定蛋白质含量；使用核酸蛋白分析仪DU800(美国Backman公司)，考马斯亮蓝染色法，将蛋白质定量标准梯度稀释后用考马斯亮蓝G-250染色，波长595nm测定吸收度，做标准曲线，并测定蛋白质含量；
h、第一向等电聚焦电泳：蛋白质定量后取样，用上样水化液9mol/L尿素、4％(重量体积比)3-[3-(胆酰胺基丙基)二甲氨基]丙磺酸盐、2％(体积比)IPG缓冲液，0.01mg溴酚蓝，用前加入1.2mg二硫苏糖醇配成120ul溶液，倾入IPG胶条槽中，将IPG胶条胶面向下放入槽中，除去胶面与泡胀液间的气泡，将胶面与溶液充分接触润湿，用矿物油覆盖胶条，进行等电聚焦；(参数设置见实施例的表1)
i、胶条平衡：等电聚焦完成后将IPG胶条在平衡液8mol/L尿素，3％十二烷基硫酸钠，0.375mol/L pH8.5三羟甲基氨基甲烷盐酸盐，25％甘油，1.5％(重量体积比)二硫苏糖醇及8mol/L尿素，3％十二烷基硫酸钠，0.375mol/L pH8.5三羟甲基氨基甲烷盐酸盐，25％甘油，2.5％(重量体积比)碘乙酰胺中分别在摇床上平衡13分钟；
j、第二向SDS-PAGE电泳
使用垂直电泳，将十二烷基硫酸钠凝胶储液为30％丙烯酰胺，0.8％甲叉双丙烯酰胺，十二烷基硫酸钠凝胶缓冲液为3mol/L pH8.9三羟甲基氨基甲烷盐酸盐，10％十二烷基硫酸钠，10％过硫酸铵和1％四甲基乙二胺分别进行配制，然后混合，按体积比凝胶储液:凝胶缓冲液:十二烷基硫酸钠:过硫酸铵:四甲基乙二胺＝16.7:10:0.4:0.2:0.02再配制成12.5％的凝胶备用；
电极缓冲液：按0.1％十二烷基硫酸钠，0.01mol/L三羟甲基氨基甲烷，0.25mol/L甘氨酸进行配制，使电极缓冲液体系pH为8.2，再将配制的凝胶和电极缓冲液按电压80V，0.5小时及120V，2.5小时参数进行电泳，整个过程以循环水，将环境温度控制在18℃；
k、再按常规染色考马斯亮蓝R250方法进行染色即可。
实施例3
采用Eppendorf超速离心机、双向电泳PROTEAN II Xi/XL Cell(美国BIO-RAD公司)
a、采集沙冬青叶片，用液氮罐装运回，在实验室-80℃以下保存备用；
b、称取5g完整沙冬青叶片样品，-20℃预冷乙醚淋洗叶片2次，去除脂类、腊质杂质后低温挥干，用捣碎机液氮粉碎样品；
c、取1g样品将3倍的弱碱性25mmol/L pH8.9三羟甲基氨基甲烷缓冲液，1mmol/L蛋白酶抑制剂苯甲基磺酰氟在离心管中摇匀，温度4℃静置1小时，温度4℃，20000×g离心，漂去上层脂质，澄清滤液备用；该步骤可全面提取叶片总蛋白，并可有效的避免蛋白被降解；
d、将步骤c沉淀杂质中加入1.5倍10mol/L尿素，2mol/L硫脲，4％(重量体积比)3-[3-(胆酰胺基丙基)二甲氨基]丙磺酸盐，65mmol/L二硫苏糖醇，(体积比)1％两性电解质载体，在离心管中摇匀，温度18℃静置1小时，在温度18℃，20000×g离心，进行二次提取，澄清滤液备用，保证膜蛋白和疏水蛋白的提取完全；
e、将步骤c和d的澄清滤液混合，加入重量比10％(重量体积比)聚乙烯吡咯烷酮，用来吸附酚、醌类物质，搅拌后温度18℃，20000×g离心5分钟，取上清液，加入4倍体积，-20℃预冷的10％(重量体积比)丙酮-三氯乙酸溶液，-20℃沉降3小时，弃上清；
f、然后用冷丙酮重复洗沉淀2次，每次-20℃沉降30分钟离心，浓缩为干粉；
g、蛋白质定量：采用考马斯亮蓝染色法测定蛋白质含量；使用核酸蛋白分析仪DU800(美国Backman公司)，考马斯亮蓝染色法，将蛋白质定量标准梯度稀释后用考马斯亮蓝G-250染色，波长595nm测定吸收度，做标准曲线，并测定蛋白质含量；
h、第一向等电聚焦电泳：蛋白质定量后取样，用上样水化液10mol/L尿素、4％(重量体积比)3-[3-(胆酰胺基丙基)二甲氨基]丙磺酸盐、2％(体积比)IPG缓冲液，0.01mg溴酚蓝，用前加入1.2mg二硫苏糖醇配成120ul溶液，倾入IPG胶条槽中，将IPG胶条胶面向下放入槽中，除去胶面与泡胀液间的气泡，将胶面与溶液充分接触润湿，用矿物油覆盖胶条，进行等电聚焦；(参数设置见实施例1的表1)
i、胶条平衡：等电聚焦完成后将IPG胶条在平衡液9mol/L尿素，5％十二烷基硫酸钠，0.375mol/L pH8.9三羟甲基氨基甲烷盐酸盐，30％甘油，1.5％(重量体积比)二硫苏糖醇及9mol/L尿素，5％十二烷基硫酸钠，0.375mol/L pH8.9三羟甲基氨基甲烷盐酸盐，30％甘油，2.5％(重量体积比)碘乙酰胺中分别在摇床上平衡15分钟；
j、第二向SDS-PAGE电泳
使用垂直电泳，将十二烷基硫酸钠凝胶储液为30％丙烯酰胺，0.8％甲叉双丙烯酰胺，十二烷基硫酸钠凝胶缓冲液为3mol/L pH8.9三羟甲基氨基甲烷盐酸盐，10％十二烷基硫酸钠，10％过硫酸铵和1％四甲基乙二胺分别进行配制，然后混合，按体积比凝胶储液:凝胶缓冲液:十二烷基硫酸钠:过硫酸铵:四甲基乙二胺＝16.7:10:0.4:0.2:0.02配制成12.5％的凝胶备用；
电极缓冲液：按0.1％十二烷基硫酸钠，0.05mol/L三羟甲基氨基甲烷，0.384mol/L甘氨酸进行配制，使电极缓冲液体系pH为8.3。；再将配制的凝胶和电极缓冲液按电压80V，0.5小时及120V，3小时参数进行电泳，整个过程以循环水，将环境温度控制在20℃；
k、再按常规染色考马斯亮蓝R250方法进行染色即可。
采用本技术方案对极端环境下生存的新疆沙冬青进行的实验取得了成功，目前，经反复实验，证明实验重复性好，结果可靠，可为逆境胁迫下植物蛋白质组学研究提供技术范例。
Claims (1)
1.一种沙冬青蛋白质双向电泳方法，其特征在于按下列步骤进行：
a、采集沙冬青叶片，用液氮罐装运回，在实验室-80℃以下保存备用；
b、定量称取完整沙冬青叶片样品，去除脂类、腊质杂质，用捣碎机液氮粉碎样品；
c、将3倍的弱碱性三羟甲基氨基甲烷缓冲液，1mmol/L蛋白酶抑制剂苯甲基磺酰氟在离心管中摇匀，4℃静置1小时，温度4℃，20000×g离心，漂去上层脂质，澄清滤液备用；
d、将步骤c沉淀杂质中加入1-1.5倍8-10mol/L尿素，2mol/L硫脲，4％3-[3-(胆酰胺基丙基)二甲氨基]丙磺酸盐，65mmol/L二硫苏糖醇，1％两性电解质载体，在离心管中摇匀，18℃静置1小时，在温度18℃，20000×g离心，进行二次提取，澄清滤液备用；
e、将步骤c和d的澄清滤液混合，加入10％(重量体积比)聚乙烯吡咯烷酮，搅拌后温度18℃，20000×g离心5分钟，取上清液，加入4倍体积，-20℃预冷的10％(重量体积比)丙酮-三氯乙酸溶液，-20℃沉降3小时，弃上清；
f、然后用冷丙酮重复洗沉淀2次，每次-20℃沉降30分钟离心，浓缩为干粉；
g、蛋白质定量：采用考马斯亮蓝染色法测定蛋白质含量；
h、第一向等电聚焦电泳：蛋白质定量后取样，用上样水化液8-10mol/L尿素、4％3-[3-(胆酰胺基丙基)二甲氨基]丙磺酸盐、2％IPG缓冲液，0.01mg溴酚蓝，用前加入二硫苏糖醇1.2mg配成120ul溶液，倾入IPG胶条槽中，将IPG胶条胶面向下放入槽中，除去胶面与泡胀液间的气泡，将胶面与溶液充分接触润湿，用矿物油覆盖胶条，进行等电聚焦；其中电压参数设置共分六步进行：50V电压水化12-16h；250V除盐0.5h；500V除盐1h；1000V除盐0.5h；4000V升压3h；维持4000V直至20000vh；500v任意时间；
i、胶条平衡：按照常规方法，等电聚焦完成后将IPG胶条在平衡液6-9mol/L尿素，2-5％十二烷基硫酸钠，0.375mol/L pH8.0-8.9三羟甲基氨基甲烷盐酸盐，20-30％甘油，1.5％二硫苏糖醇及6-9mol/L尿素，2-5％十二烷基硫酸钠，0.375mol/L pH8.0-8.9三羟甲基氨基甲烷盐酸盐，20-30％甘油，2.5％碘乙酰胺中分别在摇床上平衡10-15分钟；
j、第二向SDS-PAGE电泳
使用垂直电泳，将十二烷基硫酸钠凝胶储液为30％丙烯酰胺，0.8％甲叉双丙烯酰胺，十二烷基硫酸钠凝胶缓冲液为3mol/L pH8.9三羟甲基氨基甲烷盐酸盐，10％十二烷基硫酸钠，10％过硫酸铵和1％四甲基乙二胺分别进行配制，然后混合再配制成12.5％的凝胶备用，配制12.5％的凝胶所用的含量为体积比：凝胶储液∶凝胶缓冲液∶十二烷基硫酸钠∶过硫酸铵∶四甲基乙二胺＝16.7∶10∶0.4∶0.2∶0.02；
电极缓冲液：按0.1％十二烷基硫酸钠，0.025-0.05mol/L三羟甲基氨基甲烷，0.192-0.384mol/L甘氨酸进行配制；再将配制的凝胶和电极缓冲液按电压80V，0.5小时；120V，2-3小时参数进行电泳，整个过程以循环水，将环境温度控制在15-20℃，配制后的电极缓冲液体系pH为8.0-8.3；
k、再按常规染色考马斯亮蓝R250方法进行染色即可。
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