CN103320466B - 一种含有血管内皮生长因子活性多肽的植物油体护肤乳液 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种含有血管内皮生长因子活性多肽的植物油体护肤乳液，利用镶嵌于油体表面的油体蛋白与血管内皮细胞生长因子的融合表达产物可直接作为活性成分用于护肤品的开发，简化了血管内皮生长因子与乳化剂（或保护剂）混合的加工工艺，降低了生产成本。同时可以保护血管内皮细胞生长因子蛋白的生物活性，将血管内皮细胞生长因子活性多肽利用油体蛋白的特性，通过植物油体包裹，定位在油体表面，通过乳化均质技术，可以使血管内皮细胞生长因子蛋白很均匀地分布在护肤乳液中，通过油体的透皮吸收作用，使其容易发挥作用。本发明工艺简单，功效显著，成本降低。

Description

一种含有血管内皮生长因子活性多肽的植物油体护肤乳液

技术领域

本发明属于生物技术领域及化妆品技术领域，具体涉及含有血管内皮生长因子活性多肽的植物油体和一种含有血管内皮生长因子活性多肽的植物油体护肤乳液。

背景技术

近年来，生物基因工程技术长足发展并且影响到了生命科学的方方面面，同时也给美容化妆品行业都带来了全新的发展机遇，化妆品已经从传统的化学美容、植物美容向生物美容与基因美容发展。例如，传统的皮肤护理仅局限于油膜覆盖与保持水分等物理方法，而现在美容护肤理念开始转向细胞水平的护理，因此含高亲和力的生物因子物质的化妆品应运而生。如今，国际上越来越多的医药及生物工程技术专家投身于该研究领域，许多国家也都瞄准生物化妆品这一巨大市场，开发生物美容产品。将以生物工程技术制得的生长因子、透明质酸和核酸等应用于化妆品，这一新的研究动态也使人们认识到生物化妆品将给化妆品品质带来根本性的变化。

研究发现，VEGF可有效提高局部血管通透性，从而丰富的血运为成纤维细胞的增殖及胶原的合成提供充足的营养物质和其他生长因子，进一步促进细胞的分裂、增殖，改善皮肤微循环，使蜡黄、无光泽、不健康的皮肤变得红润有光泽。同时还能有效清除一些代谢障碍的细胞，如胞浆中导致皮肤黑斑的过氧化脂质沉着，从而使细胞中各种有害的代谢产物不容易积累形成暗疮和黑斑、黄褐斑，在皮肤的美白红润方面有着独到作用。

    VEGF作为一种生物活性多肽与其他细胞因子的协同作用可以有效促进新生毛细血管的生成，从而提高真皮微血管的数目，改善皮肤的新城代谢，起到延缓衰老的作用，在美容护肤领域中具有良好的效果。现代科学技术的飞速发展和广泛应用 , 给美容化妆品行业都带来了全新的发展机遇 , 护肤品已经从化学美容、植物美容向生物美容与基因美容发展。生物护肤品的主要成分生物活性多肽大部分是细胞生长因子,它们在体内含量极微,但生物活性极高, 对多种细胞生理功能和代谢活动发挥生物调节作用,直接或间接地影响多种类型细胞的生长、分裂、分化、增殖和迁移, 在美容护 肤、整形外科、烧伤溃疡以及各种皮肤病的伤口修复与愈合中有重要作用。近年来研究发现, 多种活性多肽在体内皆可诱导血管形成, 它们可直接与上皮细胞膜表面特异性受体结合而刺激血管上皮游走和有丝分裂, 也可间接通过巨噬细胞介导分泌活性物质促进内皮细胞复制和趋化游走, 诱导血管增生。

由于多学科的交叉发展, 现代美容模式已呈现出多元化、多层次、整体性的发展势头。现代 生物工程技术的飞速发展, 以及生物工程技术向医学整形及美容化妆品制造领域的渗透和广泛应用, 给整形科学、美容学、化妆品学都带来了全新的发展机遇。现代高新技术尤其是生物工程高科技成果 在美容学中的综合应用, 使其发展出现几大融合趋势。美容学与医学的结合, 使美容更接近于自然人体；美容学与医药学的结合, 使美容产品更安全、更完善；美容学与生物学的结合, 使美容品更适宜于人体细胞, 发挥更完美的作用；美容学与动植物学的结合, 使得具有特 殊功效的物质能充分发挥其作用, 特别是对植物有效成分单体研究的深入, 更能给美容护肤品的发展带来机遇。

发明内容

本发明目的是提供植物油体特异表达载体pOBT-VEGF。

一种表达载体质粒pOBT-VEGF，它是由下述方法制备的：

1）以p1301为基本骨架，将其T-DNA区进行改造，除了保留有T-DNA区的NOS基因外其余基因均被35S和Bar基因替换，以pEGAD质粒为模板，利用35S-F上游引物cggggtaccAtccgtcaacatggtggagcacgacacgcttgtctact和Bar-R下游引物cggaattcactagttcagatctcggtgacgggcaggaccggacggggcggaacc进行PCR，扩增得到35S-Bar基因，利用kpnI和SpeI酶切位点将其插入到pCAMBIA1301载体T-DNA区的NOS基因前，构建了p1301-35S-Bar-NOS基本质粒，简写为pO质粒；

2）用pstI和NcoI分别酶切并连接pO质粒和序列表SEQ ID NO.2所示基因，得中间载体pOB；

3）用HindⅢ和kpnI分别酶切并连接中间载体pOB和序列表SEQ ID NO.3所示基因，得植物特异表达载体pOBT；

4）用NcoI与HindⅢ分别酶切并连接植物特异表达载体pOBT和序列表SEQ ID NO.5所示基因，得表达载体质粒pOBT-VEGF。

本发明的另一个目的是提供一种含有血管内皮生长因子活性多肽的植物油体。

一种含有血管内皮生长因子活性多肽的植物油体，它是将其碱基序列如序列表SEQ ID NO.5所示的基因插入植物表达载体中，获得的表达载体质粒，转化至油料作物中，收获种子提取油体；

所述的表达载体质粒为表达载体质粒pOBT-VEGF；

所述的油料作物为拟南芥；

本发明的又一目的是提供一种含有血管内皮生长因子活性多肽的植物油体护肤乳液及其制备方法。

一种含有血管内皮生长因子活性多肽的植物油体护肤乳液，它是由下述组份的重量百分比组成：5%-25%红花油体，10%甘油，10%-25%羧乙基纤维素，1.5%-4% PEG600，0.05%-0.5%防腐剂，1%-10%含有血管内皮生长因子蛋白的拟南芥油体和5%维生素C，余量为去离子水；

优选为：10%红花油体，10%甘油，10%羧乙基纤维素，3% PEG600，0.25%防腐剂，6%含有血管内皮生长因子蛋白的拟南芥油体，5%维生素C。

所述的防腐剂为尼泊金甲酯和尼泊金丙酯混合液。

一种含有血管内皮生长因子活性多肽的植物油体护肤乳液的制备方法，包括以下步骤：首先将将水加入到红花油体中，混合均匀；然后逐级加入甘油和乳化剂羧乙基纤维素，偶合剂PEG600，搅拌均匀，高剪切在1000rpm-30000rpm下乳化，在均质机中乳化10-20min；搅拌均匀后再加入防腐剂、一种含有血管内皮生长因子活性多肽的植物油体和维生素C，搅拌均匀。

本发明是利用镶嵌于油体表面的油体蛋白与血管内皮细胞生长因子的融合表达产物可直接作为活性成分用于护肤品的开发，简化了血管内皮生长因子与乳化剂（或保护剂）混合的加工工艺，降低了生产成本。同时可以保护血管内皮细胞生长因子蛋白的生物活性，将血管内皮细胞生长因子活性多肽利用油体蛋白的特性，通过植物油体包裹，定位在油体表面，通过乳化均质技术，可以使血管内皮细胞生长因子蛋白很均匀地分布在护肤乳液中，通过油体的透皮吸收作用，使其容易发挥作用。本发明工艺简单，功效显著，成本降低。

附图说明

图1  油体表达血管内皮生长因子基因的载体示意图

图2  红花油体显微图

图3  含有血管内皮生长因子蛋白的拟南芥油体的直观图

图4  含有血管内皮生长因子蛋白的拟南芥油体的活性检测

图5  含有VEGF植物油体的乳液直观图

具体实施方式

实施例1  血管内皮生长因子蛋白在植物油体中表达

根据植物密码子的偏好性对从GENBANK中找到的血管内皮生长因子的核苷酸序列进行改造，将植物中含量较少的稀有氨基酸密码子替换成植物偏好的密码子。根据密码子的简并性消除在本实验中所用到的酶切位点，送去上海生工生物工程有限公司进行人工合成重组血管内皮生长因子基因（SEQ ID NO.1）。

实施例2：克隆菜豆种子特异启动子与终止子

克隆菜豆启动子和终止子基因，为了从菜豆基因组序列中克隆种子特异启动子与终止子，利用引物，采用标准的多聚酶链式反应（PCR），从菜豆基因组DNA中扩增得到1548bp和1220bp的DNA片段，扩增的片段经限制性内切酶消化，克隆到pUC57克隆载体中，保存备用。经测序，其碱基序列如序列表SEQ ID NO.2和3所示。

菜豆启动子引物

Primer5F:  GAATTCATTGTACTCCCAG 

Primer5R：AGTAGAGTAGTATTGAATATGAG

菜豆终止子引物

tem5F: AATAAGTATGAACTAAAATGC

tem5R: TTAGTTGGTAGGGTGCTAGGAA

实施例3：构建植物特异表达载体pOBT

将pUC57-菜豆启动子的克隆载体用限制性内切酶pstI和NcoI消化，回收目的片段菜豆启动子序列，同时用pstI和NcoI消化基本质粒pO（以p1301为基本骨架，将其T-DNA区进行改造，除了保留有T-DNA区的NOS基因外其余基因均被35S和Bar基因替换，以pEGAD质粒为模板，利用35S-F上游引物47bp cggggtaccAtccgtcaacatggtggagcacgacacgcttgtctact和Bar-R下游引物54bp cggaattcactagttcagatctcggtgacgggcaggaccggacggggcggaacc进行PCR，扩增得到35S-Bar基因，利用kpnI和SpeI酶切位点将其插入到pCAMBIA1301载体T-DNA区的NOS基因前，构建了p1301-35S-Bar-NOS基本质粒，简写为pO质粒），将菜豆启动子（用来启动油体蛋白与血管内皮生长因子的融合基因）与基本质粒pO连接，转化大肠杆菌，获得pOB中间载体；将pUC57-终止子的克隆载体用HindIII和kpnI消化，回收目的片段菜豆终止子，同时用这两个酶消化pOB中间载体，将终止子与酶切后的pOB载体连接，转化大肠杆菌，获得植物特异表达载体pOBT。

实施例4：拟南芥油体蛋白基因的克隆

取拟南芥种子，提取DNA基因组，用引物：

1：CCATGGCGGATACAGCTAGAGG

2：CACCGGGTGGAGTAGTGTGCTGG

进行扩增拟南芥油体蛋白基因，经测序，其碱基序列如序列表SEQ ID NO.4所示；扩增的片段经限制性内切酶（NcoI酶和EcoRI酶）消化，克隆到pUC57克隆载体中，保存备用。

实施例5：构建含有拟南芥油体蛋白与血管内皮生长因子融合基因的植物油体特异表达载体pOBT-VEGF

以克隆得到的拟南芥油体蛋白基因和血管内皮生长因子基因为模板，设计融合基因引物，通过融合PCR技术，获得oleosin-VEGF融合基因，经测序，其碱基序列如序列表SEQ ID NO.5所示。将融合基因用限制性内切酶NcoI与HindIII进行酶切，同时用这两个酶对pOBT载体进行酶切，然后将融合基因与酶切后的pOBT载体连接，转化大肠杆菌，产生pOBT-VEGF植物油体表达载体。

拟南芥油体蛋白与血管内皮生长因子融合基因引物

1：CCATGGCGGATACAGCTAGAGG 

2：TCCCTCAGCCAT AGTAGTGTGCTGGCC

3：GGCCAGCACACTACT ATGGCTGAGGGAGGAGGG

4：TTATCTTCTTGGCTTATCGCATCTG

实施例6：Flora dip方法进行的遗传转化

首先，侵染前一天将野生型拟南芥和亚麻芥植株浇水浇透；将农杆菌工程菌株接种至50ml含有三抗（100 μg/ml Rif、50 μg/ml Str和50 μg/ml Kan)的YEP液体培养基中，进行预培养（180rpm/min，28℃）；取预培养的农杆菌7ml加入到含有三抗的YEP液体培养基中，进行扩大培养，直至OD5900=1.0~1.2；把农杆菌菌液移到离心管中，20℃，4000rpm离心20min，收集菌体，去除三抗培养基。用Flora-Dip Buffer重悬菌体，使其OD590达到0.8~0.9。转化前剪掉种荚、开花和露白的花芽。在钵体四周插上适当高度的竹签，以便支撑倒过来进行侵染的钵体。将拟南芥的茎部和叶片基部浸入重悬的农杆菌菌液中，静置7分钟，然后吸弃过多的菌液。平放转化后的钵体，用塑料薄膜等保湿过夜，第二天可稍露一小缝，第三天正常放置。一周后可进行第二次侵染。待种子成熟后，可隔天采摘发黄成熟的荚，收获种子。

实施例7：筛选表达量高的转基因株系

转基因株系在温室或大田经生长与发育，然后开花结籽，形成转基因T1代种子，当T1代种子收获后，每株转基因植株取200-1000mg，在提取液中抽提油体蛋白与血管内皮生长因子的融合蛋白，经酶联免疫技术检测重组血管内皮生长因子的表达量，筛选出高表达的转基因株系，高表达的株系表达量达到71.58ng/ml。

实施例8：含有血管内皮生长因子活性多肽的油体制备

从含有血管内皮生长因子蛋白的转基因油料作物种子中提取含有血管内皮生长因子蛋白的油体，保存备用，具体方法如下：（1）取0.1mg转基因种子， 放入研钵中，加入1ml PBS，用研棒充分研磨。直至溶液变浑浊，看不见种粒。放入离心机10000rpm ，4℃，离心10min；（2）离心后溶液分为三层，即表层为白色油状层，中间层液体，和底层沉淀。将上层油体部分和液体部分混合均匀，全部吸出，注意不要吸出底层沉淀，将吸出的液体转移至另一离心管中，加PBS，离心10000rpm，4℃，10min，重复1、2步骤，3~4次。（3）将重复1、2步骤离心后吸出的液体加500μl的PBS混匀，在离心机中4℃， 10000rpm，离心10min。（4）此时离心后分为两层，为上层油脂部分和下层液体部分，将下层液体吸出，弃掉。再重复3、4步骤，3~4次。

实施例9 油体中血管内皮生长因子蛋白的含量测定

转基因株系在温室或大田经生长与发育，然后开花结籽，形成转基因T1代种子，当T1代种子收获后，每株转基因植株取200-1000mg，在提取液中抽提油体蛋白与血管内皮生长因子蛋白的融合蛋白，采用ELISA法，按照ELISA试剂盒（长春百金生物科技有限公司）说明书操作，检测油体中血管内皮生长因子蛋白的表达量，经计算，拟南芥油体中血管内皮生长因子的表达量为71.58ng/ml。

实施例10油体中血管内皮生长因子蛋白的活性检测

1、收集对数期细胞NIH3T3细胞使用细胞计数板计数，96孔平底板中每孔加入100ul细胞液，细胞数为6000个左右。

2、37℃，5%CO2培养24h，置显微镜下观察细胞单层铺满孔底。此时，轻倒出96孔板中的完全培养基，每孔加入100ul的饥饿培养基。

3、5%CO2，37℃培养24小时，设7个梯度加药，每孔100ul，设2个复孔。同时使用纯品蛋白bFGF作为阳性对照，野生型拟南芥种子油体作为阴性对照。

4、5%CO2，37℃培养48小时，每孔加25ul浓度为0.5%的MTT溶液。

5、5%CO2，37℃继续培养4h后终止培养，弃培养液。

6、每孔加入120ulDMSO，低速振荡10min，紫色结晶充分溶解后用酶联免疫检测仪在570nm波长下测定，结果见图4。

实施例11  红花油体的提取

（1）取200~1000mg野生型红花种子， 放入研钵中，加入1ml Buffer A，用研棒充分研磨。直至溶液变浑浊，看不见种粒。放入离心机12000rpm，4℃，离心30min； 

（2）离心后溶液分为三层，即表层为白色油状层，中间层液体，和底层沉淀。将上层油体部分和液体部分混合均匀，全部吸出，注意不要吸出底层沉淀，将吸出的液体转移至另一离心管中，加BufferB，离心18000rpm，4℃，10min，重复1、2步骤，3~4次。

（3）将重复1、2步骤离心后吸出的液体加500μl的Buffer C混匀，在离心机中4℃， 18000rpm，离心10min。

（4）此时离心后分为两层，为上层油脂部分和下层液体部分，将下层液体吸出，弃掉。再重复3、4步骤，3~4次。

Buffer A：0.6M Sucrose，0.5M NaCl，0.05M Tris-HCl(pH=8.0)；

Buffer B：0.4M Sucrose，0.5M NaCl，0.05M Tris-HCl(pH=8.0)；

Buffer C：20 mM Na₂HPO₄，20 mM NaCl(pH=8.0)。

实施例12  护肤乳液配方筛选

一种含有血管内皮细胞生长因子活性多肽的护肤乳液，由以下重量份的原料制成：5%-25%保湿剂（红花油体），10%甘油，10%-25%乳化剂（羧乙基纤维素），1.5%-6%偶合剂（PEG600），0.05%-0.5%防腐剂（尼泊金甲酯和尼泊金丙酯混合液），1%-10%营养添加剂（含有血管内皮细胞生长因子蛋白的拟南芥油体）和5%-20%维生素C，适量香精，其余为去离子水，本发明设计了正交实验，通过稳定性实验和活性检测，确定出最佳的乳液配方为油性原料（红花油体）10%，甘油10%，乳化剂10%，偶合剂3%，防腐剂0.25%，香精0.5%，营养添加剂（含有VEGF的拟南芥油体）6%，维生素C5%。

实施例13  护肤乳液制备方法

  本发明制备一种含有血管内皮细胞生长因子活性多肽护肤乳液的制备方法，包括以下步骤进行制备：首先将植物油体提取出来，然后将水加入到油体中，混合均匀；然后逐级加入甘油和乳化剂羧乙基纤维素，偶合剂PEG600，搅拌均匀，高剪切在1000rpm-30000rpm下乳化，在均质机中乳化10-20min；最后，搅拌均匀后再加入防腐剂尼泊金甲酯和尼泊金丙酯的混合液和营养添加剂含有血管内皮细胞生长因子活性多肽的植物油体和维生素C以及藏红花香精，搅拌均匀后即成本发明品。

实施例14  护肤乳液稳定性实验

（1）在40℃ 电热恒温培养箱中放置30-50天，恢复室温后观察，并没有分层现象，稳定性良好；

（2）24小时之内，在 0℃-50℃ 之 间来回频繁变化,如此反复操作15-30天，恢复室温后观察，没有分层现象，稳定性良好；

（3）在-5℃ 冰箱和40℃ 的电热恒温培养箱中各放1天，如此反复操作5-7天，恢复室温后观察，没有出现分层现象，稳定性良好；

（4）在40℃的电热恒温培养箱中放置5-7天，然后在0℃-5℃ 冰箱中放置5-7天，接下来再放入40℃-50℃ 的电热恒温培养箱中放置30天，恢复室温后观察，稳定性良好。

通过上述实验观察，10%油性原料（红花油体），10%甘油，10%乳化剂，3%偶合剂，0.25%防腐剂，0.5%香精，6%营养添加剂（含有VEGF的拟南芥油体），5%维生素C，这一乳液配方的稳定性较好。

实施例15 含有血管内皮细胞生长因子油体的护肤品功效

首先对护肤乳液进行抗氧化功效检测，选用邻苯三酚法检测对超氧阴离子自由基的清除作用，结晶紫法检测对轻自由基的清除作用，DPH法检测对总自由基的清除作用。

然后对美白功效进行检测，采用酪氨酸酶抑制法，取4支试管分别编号为C 1、C2、T1、T2，按照表1的顺序在各管中加入相应的试剂，C1、T1 在加入酪氨酸酶之前先放入37℃水浴锅内10min，然后再加入酪氨酸酶, 然后将C1、C2、T1、T2共同放入共同放入37 ℃水浴锅内10min，取出分别测定C1、C2、T1、T2各管在475nm处的吸光度值，做三次平行。

采用上述这种方法测定以下不同配方的护肤品的超氧阴离子自由基的清除率、羟自由基清除率、总自由基清除率、酪氨酸酶抑制率。

组成1（本发明）：油性原料（红花油体）10%，甘油10%，乳化剂（羧乙基纤维素）10%，偶合剂（PEG600）3%，防腐剂（尼泊金甲酯和尼泊金丙酯混合液）0.25%，香精（藏红花香精）0.5%，营养添加剂（含有429.48ng血管内皮生长因子蛋白的拟南芥油体）6%，维生素C5%；

组成2：油性原料（红花油体）10%，甘油10%，乳化剂（羧乙基纤维素）10%，偶合剂（PEG600）3%，防腐剂（尼泊金甲酯和尼泊金丙酯混合液）0.25%，香精（藏红花香精）0.5%，维生素C5%；

组成3：油性原料（甘油）20%，乳化剂（羧乙基纤维素）10%，偶合剂（PEG600）3%，防腐剂（尼泊金甲酯和尼泊金丙酯混合液）0.25%，香精（藏红花香精）0.5%，营养添加剂（含有429.48ng血管内皮生长因子蛋白的拟南芥油体）6%，维生素C5%；

组成4：油性原料（甘油）20%，乳化剂（羧乙基纤维素）10%，偶合剂（PEG600）3%，防腐剂（尼泊金甲酯和尼泊金丙酯混合液）0.25%，香精（藏红花香精）0.5%，营养添加剂（429.48ngEGF冻干粉）6%，维生素C5%；

比较这四种组成配方的护肤品对超氧阴离子自由基的清除率、羟自由基清除率、总自由基清除率、酪氨酸酶抑制率，结果见表3。

实施例16 含有血管内皮细胞生长因子油体护肤品的透皮吸收速率

先将磁搅拌子放在接受池内，再将制备的离体鼠皮平放在接受池上端，角质层面向上，然后将释放池用夹子固定于接受池上。取检测药品0.2ml均匀涂抹在皮肤角质层上，用注射器通过取样管接受液注入接受池，排净空气，使皮肤另一面与接受液紧密接触。将低频电磁复合脉冲仪的电极固定于仪器组和促透组的鼠皮表面。定速搅拌，分别于1、2、4、8、16h抽取接受液1.0ml，再补加1.0ml新鲜接受液。实验中所用扩散池的容积为7.0ml，取样量为1.0ml，渗透面积为2.92cm²，根据测得的透皮接受液中各组成配方的油体含量和VEGF含量，依照下列公式计算累计渗透量（Q）：

<110> 吉林农业大学

 

<120>一种含有血管内皮生长因子活性多肽的植物油体护肤乳液

 

<160>  1    

 

<210>  1

<211>  492

<212>  DNA

<213>  人工

 

<400>  1

atggctgagg gaggagggca gaaccatcat gaagtggtga agttcatgga tgtctaccag     60

aggtcttact gccatccaat cgagaccctt gtggacatct tccaggagta cccagacgag    120

atcgagtaca tcttcaagcc atcctgcgtt ccacttatga ggtgcggggg ctgctgcaac    180

gatgagggac ttgagtgcgt gccaactgag gagtctaaca ttaccatgca aattatgagg    240

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ccaagaagat aa                                                        492 

 

<210>  2

<211>  1548

<212>  DNA

<213>  人工

 

<400>  2

 

gaattcattg tactcccagt atcattatag tgaaagtttt ggctctctcg ccggtggttt    60

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atttatggtg gactaatttt catatatttc ttattgcttt taccttttct tggtatgtaa  1020

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ctactactat aataccccaa cccaactcat attcaatact actctact               1548

 

<210>  3

<211>  1220

<212>  DNA

<213>  人工

 

<400>  3

 

aataagtatg aactaaaatg catgtaggtg taagagctca tggagagcat ggaatattgt    60

atccgaccat gtaacagtat aataactgag ctccatctca cttcttctat gaataaacaa   120

aggatgttat gatatattaa cactctatct atgcacctta ttgttctatg ataaatttcc   180

tcttattatt ataaatcatc tgaatcgtga cggcttatgg aatgcttcaa atagtacaaa   240

aacaaatgtg tactataaga ctttctaaac aattctaact ttagcattgt gaacgagaca   300

taagtgttaa gaagacataa caattataat ggaagaagtt tgtctccatt tatatattat   360

atattaccca cttatgtatt atattaggat gttaaggaga cataacaatt ataaagagag   420

aagtttgtat ccatttatat attatatact acccatttat atattatact tatccactta   480

tttaatgtct ttataaggtt tgatccatga tatttctaat attttagttg atatgtatat   540

gaaagggtac tatttgaact ctcttactct gtataaaggt tggatcatcc ttaaagtggg   600

tctatttaat tttattgctt cttacagata aaaaaaaaat tatgagttgg tttgataaaa   660

tattgaagga tttaaaataa taataaataa taaataacat ataatatatg tatataaatt   720

tattataata taacatttat ctataaaaaa gtaaatattg tcataaatct atacaatcgt   780

ttagccttgc tggacgactc tcaattattt aaacgagagt aaacatattt gactttttgg   840

ttatttaaca aattattatt taacactata tgaaattttt tttttttatc ggcaaggaaa   900

taaaattaaa ttaggaggga caatggtgtg tcccaatcct tatacaacca acttccacag   960

gaaggtcagg tcggggacaa caaaaaaaca ggcaagggaa attttttaat ttgggttgtc  1020

ttgtttgctg cataatttat gcagtaaaac actacacata acccttttag cagtagagca  1080

atggttgacc gtgtgcttag cttcttttat tttatttttt tatcagcaaa gaataaataa  1140

aataaaatga gacacttcag ggatgtttca acccttatac aaaaccccaa aaacaagttt  1200

cctagcaccc taccaactaa                                              1220

 

 

<210>  4

<211>  762

<212>  DNA

<213>  人工

 

<400>  4

 

atggcggata cagctagagg aacccatcac gatatcatcg gcagagacca gtacccgatg    60

atgggccgag accgagacca gtaccagatg tccggacgag gatctgacta ctccaagtct   120

aggcagattg ctaaagctgc aactgctgtc acagctggtg gttccctcct tgttctctcc   180

agccttaccc ttgttggaac tgtcatagct ttgactgttg caacacctct gctcgttatc   240

ttcagcccaa tccttgtccc ggctctcatc acagttgcac tcctcatcac cggttttctt   300

tcctctggag ggtttggcat tgccgctata accgttttct cttggattta caagtaagca   360

cacatttatc atcttacttc ataattttgt gcaatatgtg catgcatgtg ttgagccagt   420

agctttggat caattttttt ggtcgaataa caaatgtaac aataagaaat tgcaaattct   480

agggaacatt tggttaacta aatacgaaat ttgacctagc tagcttgaat gtgtctgtgt   540

atatcatcta tataggtaaa atgcttggta tgatacctat tgattgtgaa taggtacgca   600

acgggagagc acccacaggg atcagacaag ttggacagtg caaggatgaa gttgggaagc   660

aaagctcagg atctgaaaga cagagctcag tactacggac agcaacatac tggtggggaa   720

catgaccgtg accgtactcg tggtggccag cacactactt aa                      762

 

<210>  5

<211>  1251

<212>  DNA

<213>  人工

 

<400>  5

 

atggcggata cagctagagg aacccatcac gatatcatcg gcagagacca gtacccgatg     60

atgggccgag accgagacca gtaccagatg tccggacgag gatctgacta ctccaagtct    120

aggcagattg ctaaagctgc aactgctgtc acagctggtg gttccctcct tgttctctcc    180

agccttaccc ttgttggaac tgtcatagct ttgactgttg caacacctct gctcgttatc    240

ttcagcccaa tccttgtccc ggctctcatc acagttgcac tcctcatcac cggttttctt    300

tcctctggag ggtttggcat tgccgctata accgttttct cttggattta caagtaagca    360

cacatttatc atcttacttc ataattttgt gcaatatgtg catgcatgtg ttgagccagt    420

agctttggat caattttttt ggtcgaataa caaatgtaac aataagaaat tgcaaattct    480

agggaacatt tggttaacta aatacgaaat ttgacctagc tagcttgaat gtgtctgtgt    540

atatcatcta tataggtaaa atgcttggta tgatacctat tgattgtgaa taggtacgca    600

acgggagagc acccacaggg atcagacaag ttggacagtg caaggatgaa gttgggaagc    660

aaagctcagg atctgaaaga cagagctcag tactacggac agcaacatac tggtggggaa    720

catgaccgtg accgtactcg tggtggccag cacactacta tggctgaggg aggagggcag    780

aaccatcatg aagtggtgaa gttcatggat gtctaccaga ggtcttactg ccatccaatc    840

gagacccttg tggacatctt ccaggagtac ccagacgaga tcgagtacat cttcaagcca    900

tcctgcgttc cacttatgag gtgcgggggc tgctgcaacg atgagggact tgagtgcgtg    960

ccaactgagg agtctaacat taccatgcaa attatgagga ttaagccaca ccaaggacag   1020

cacattggag agatgtcttt ccttcaacat aacaagtgcg agtgcagacc aaagaaggat   1080

agagctagac aagaaaaccc atgcggacca tgctctgaga gaagaaagca tcttttcgtt   1140

caagatccac aaacttgcaa gtgctcttgc aagaacactg attctagatg caaggctaga   1200

caacttgagc ttaacgagag aacttgcaga tgcgataagc caagaagata a            1251

Claims (7)

1.一种表达载体质粒pOBT-VEGF，它是由下述方法制备的：

1）以p1301为基本骨架，将其T-DNA区进行改造，除了保留有T-DNA区的NOS基因外其余基因均被35S和Bar基因替换，以pEGAD质粒为模板，利用35S-F上游引物CGGGGTACCATCCGTCAACATGGTGGAGCACGACACGCTTGTCTACT和Bar-R下游引物CGGAATTCACTAGTTCAGATCTCGGTGACGGGCAGGACCGGACGGGGCGGAACC进行PCR，扩增得到35S-Bar基因，利用kpnI和SpeI酶切位点将其插入到pCAMBIA1301载体T-DNA区的NOS基因前，构建了p1301-35S-Bar-NOS基本质粒，简写为pO质粒；

2）用pstI和NcoI分别酶切并连接pO质粒和序列表SEQ ID NO.2所示基因，得中间载体pOB；

3）用HindⅢ和kpnI分别酶切并连接中间载体pOB和序列表SEQ ID NO.3所示基因，得植物特异表达载体pOBT；

4）用NcoI与HindⅢ分别酶切并连接植物特异表达载体pOBT和序列表SEQ ID NO.5所示基因，得表达载体质粒pOBT-VEGF。

2.一种含有血管内皮生长因子活性多肽的植物油体，它是将权利要求1所述的一种表达载体质粒pOBT-VEGF，转化至油料作物中，收获种子提取油体。

3.根据权利要求2所述的一种含有血管内皮生长因子活性多肽的植物油体，其特征在于：所述的油料作物为拟南芥。

4.一种含有血管内皮生长因子活性多肽的植物油体护肤乳液，它是由下述组份的重量百分比组成：5%-25%红花油体，10%甘油，10%-25%羧乙基纤维素，1.5%-4% PEG600，0.05%-0.5%防腐剂，1%-10%权利要求3所述的含有血管内皮生长因子蛋白的拟南芥油体和5%维生素C，余量为去离子水。

5.根据权利要求4所述的一种含有血管内皮生长因子活性多肽的植物油体护肤乳液，其特征在于，其组份为：10%红花油体，10%甘油，10%羧乙基纤维素，3% PEG600，0.25%防腐剂，6%含有血管内皮生长因子蛋白的拟南芥油体，5%维生素C，余量为去离子水。

6.根据权利要求5所述的一种含有血管内皮生长因子活性多肽的植物油体护肤乳液，其特征在于：所述的防腐剂为尼泊金甲酯和尼泊金丙酯混合液。

7.一种含有血管内皮生长因子活性多肽的植物油体护肤乳液的制备方法，包括以下步骤：按权利要求4所述的一种含有血管内皮生长因子活性多肽的植物油体护肤乳液的配比，首先将水加入到红花油体中，混合均匀；然后逐级加入甘油和乳化剂羧乙基纤维素，偶合剂PEG600，搅拌均匀，高剪切在1000rpm-30000rpm下乳化，在均质机中乳化10-20min；搅拌均匀后再加入防腐剂、一种含有血管内皮生长因子活性多肽的植物油体和维生素C，搅拌均匀。