CN102198291B - 一种具有连续梯度性能的多糖基神经修复支架材料及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种具有连续梯度性能的多糖基神经修复支架材料，是由一种以上的多糖构成，并且沿一个方向具有连续的梯度性。所述支架材料的制备方法为将多糖溶液A及多糖溶液B在梯度混合仪中等体积混合，然后低温冷冻干燥，得到具有梯度性的神经修复支架材料。两多糖溶液的成分与浓度中至少有一个不同，或者在多糖溶液A或多糖溶液B中加入重量体积百分比0.05～1％的交联剂或神经生长因子或神经营养因子。本发明通过调节梯度混合仪两容器中的多糖的成分、浓度和负载神经生长因子或神经营养因子的载体体系的含量和种类，得到具有连续梯度功能化的多糖基神经修复支架材料，使得该材料的性能适合神经修复的自身生长规律。
Description
技术领域
本发明涉及到生物医学材料领域，具体涉及到一种具有连续梯度性能的多糖基神经修复支架材料及其制备方法。
背景技术
越来越多的天然材料如肝素、甲壳素、壳聚糖、透明质酸等被用于制备神经损伤的修复支架材料。例如，壳聚糖是甲壳素经脱乙酰基而得到的一种天然阳离子多糖，是自然界中唯一的带正电的多糖，因此可以和细胞表面带负电的基团相互作用，与细胞膜发生非特异性吸附；同时壳聚糖又具有较高的亲水性，能促进细胞在材料表面的吸附和铺展，因此，壳聚糖材料有利于神经细胞在其表面的黏附和细胞骨架的形成。另外，壳聚糖分子与细胞基底膜和细胞外基质中的糖氨聚糖分子结构相似，这可能有利于其与细胞外黏附分子(如层粘连蛋白、纤维连接蛋白、肝素蛋白等)的结合，进一步促进神经细胞的贴壁和生长。此外，壳聚糖还能促进血管内皮细胞的生长，从而有利于神经再生中血管的再生，为再生神经提供营养，促进轴突生长和髓鞘的形成。透明质酸和硫酸软骨素等天然多糖都是来自于细胞外基质，具有天然的细胞亲和性，逐渐的被用于神经修复支架材料的制备。
在周围神经自然修复过程中，周围神经的再生是从近端向远端逐渐生长的，所以，越来越多的定向孔支架材料被用于神经的修复，所制备的定向多孔支架可以引导轴突从一端向另外一端伸展，最终达到修复的目的。但是现有的这些修复支架材料都是均相的，从材料的一端到另外一端，无论从结构还是成分上都是均匀的，最终也导致了功能上的均一性。这些特点和神经自身的修复生长是不相匹配的，使得支架材料在神经修复过程中的降解速度不能与神经本身的生长的速度同步，同时复合的神经生长因子的释放速度在整个支架体系中保持恒定，也不能满足神经生长的需要。在此基础上，有人提出了半连续的梯度材料用于神经的修复，在这类材料中虽然提出了梯度的概念，但是与神经生长的连续梯度性也没有完全匹配。基于上述研究现状和背景，我们提出了连续梯度神经修复的概念，并且通过梯度混合的方法成功的制备了多糖基的连续梯度神经修复材料。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺点和不足，提供一种具有连续梯度性能的多糖基神经修复支架材料。该支架材料沿着一个方向显示出各种性质的变化，这些性质包括成分、结构和功能。该修复支架适合外周神经和脊柱神经的修复。
本发明的另一个目的在于提供上述支架材料的制备方法。
本发明的目的通过以下技术方案实现：
一种具有连续梯度性能的多糖基神经修复支架材料，所述支架材料是由一种以上的多糖构成，并且沿一个方向具有连续的梯度性；
所述连续的梯度性为成分的连续梯度性、结构的连续梯度性和功能的连续梯度性中的一种或多种；
成分的连续梯度性是指其构成神经修复支架材料的多糖成分为两种以上，其中一种多糖成分从支架材料的一端到另一端逐渐减少或增加，另一种或多种多糖成分从支架材料的一端到另一端逐渐增加或减少；
结构的连续梯度性是指神经修复支架材料中的多孔结构的尺寸和孔隙率从支架材料的一端到另一端逐渐增加或减少；
性能的连续梯度性是指支架材料的力学性能、降解速率从支架材料的一端到另一端逐渐减小或增加；或该支架材料的所负载的神经营养因子或神经生长因子的释放量或释放速率从支架材料的一端到另一端逐渐减小或增加。
所述多糖为甲壳素、壳聚糖、透明质酸、硫酸软骨素、肝素、海藻酸钠和葡聚糖中的一种或多种。
上述一种具有连续梯度性能的多糖基神经修复支架材料的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
将多糖溶液A与多糖溶液B在梯度混合仪中等体积混合，然后低温冷冻干燥，得到具有梯度性的神经修复支架材料；
所述两种多糖溶液A与多糖溶液B的成分与浓度中至少有一个不同；
所述多糖溶液A选自甲壳素溶液、壳聚糖溶液、透明质酸溶液、硫酸软骨素溶液、肝素溶液、海藻酸钠溶液和葡聚糖溶液中的一种以上；
多糖溶液B选自甲壳素溶液、壳聚糖溶液、透明质酸溶液、硫酸软骨素溶液、肝素溶液、海藻酸钠溶液和葡聚糖溶液中的一种以上。
所述多糖溶液A为壳聚糖溶液，多糖溶液B为透明质酸的水溶液；
所述壳聚糖溶液的制备方法如下：将壳聚糖盐酸溶液倒入饱和的NH4HCO3溶液中，在20℃静置5天，形成壳聚糖氨基甲酸盐溶液。
所述多糖溶液A或多糖溶液B的质量浓度为1～3％。
所述多糖溶液A或多糖溶液B在80mTorr的真空下脱气。
所述多糖溶液A或多糖溶液B中加入重量体积百分比0.05～1％的交联剂或神经生长因子或神经营养因子。
所述低温冷冻温度为-20～-80℃。
当多糖溶液A的浓度与多糖溶液B的浓度相同，成分不同，得到具有成分梯度性的神经修复支架材料。
当多糖溶液A的成分与多糖溶液B的成分相同，浓度不同，然后在冻干机中冷冻干燥，得到具有结构梯度性的神经修复支架材料。
当多糖溶液A与多糖溶液B的成分与浓度都不相同，然后在冻干机中冷冻干燥，得到成分与结构都具有梯度性的神经修复支架材料。
当多糖溶液A与多糖溶液B的成分与浓度至少一个不相同，在多糖溶液A或多糖溶液B中加入交联剂或神经生长因子或神经营养因子，得到具有连续梯度功能化的多糖基神经修复支架材料。
本发明通过调节梯度混合仪两容器中的多糖的成分、浓度和负载神经生长因子或神经营养因子的载体体系的含量和种类，得到具有连续梯度功能化的多糖基神经修复支架材料，使得该材料的性能适合神经修复的自身生长规律。
附图说明
图1为梯度混合仪示意图
图2为染色后成分梯度材料图片
图3为结构梯度材料的大孔端冷冻干燥后的SEM图片
图4为结构梯度材料的小孔端冷冻干燥后的SEM图片
图5为梯度材料中蛋白绝对释放量曲线
图6为梯度材料中蛋白相对释放量曲线
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1壳聚糖/肝素连续梯度神经修复支架材料的制备
分别配制2w/v％(w/v％表示重量体积百分比，下同)的壳聚糖醋酸溶液，(溶剂为重量体积比为1w/v％醋酸水溶液)和2w/v％的肝素醋酸溶液(溶剂为重量体积比为1w/v％醋酸水溶液)，两者在4℃搅拌过夜，然后分别在80mTorr的真空下脱气。
在梯度混合仪(如图1所示)中，在活塞1和活塞2关闭的条件下，A容器中加入10ml的壳聚糖溶液，加入0.5w/v％甲苯胺蓝蓝色染料，B中加入10ml的肝素溶液，加入0.5w/v％甲基橙黄色染料，在B中加入磁力搅拌子4，在活塞2的末端连接蠕动泵3，在搅拌的条件下，打开两个活塞，开启蠕动泵，将混合溶液缓慢的引入到管状的接受器中，-80℃低温冷冻干燥，然后在0.05w/v％的戊二醛水溶液中进行交联处理2min，然后在1w/v％的氨水溶液中浸泡脱酸20min，然后用蒸馏水洗至中性，得到具有成分连续梯度性的神经修复支架材料，染色后成分梯度材料图片如图2所示。由图2可以看出，从左到右，黄色染料的浓度逐渐降低，蓝色染料的浓度逐渐升高，同时浓度的变化显示出具有连续的梯度性。
实施例2壳聚糖/透明质酸连续梯度性神经修复支架材料的制备
碱化壳聚糖溶液的制备：将10g的1w/v％的壳聚糖盐酸溶液(1w/v％)倒入40ml饱和的NH4HCO3溶液中，在20℃静置5天，形成壳聚糖氨基甲酸盐(Chitosan-NHCO2 -NH4 +)溶液(因为壳聚糖是聚阳离子，碱化处理后才能不和透明质酸形成聚电解质)，然后在80mTorr的真空下脱气。配制1w/v％的透明质酸的水溶液，4℃搅拌过夜，然后在80mTorr的真空下脱气。
在梯度混合仪(如图1所示)中，在活塞1和活塞2关闭的条件下，A容器中加入10ml的碱化壳聚糖溶液，B中加入10ml的透明质酸水溶液，在B中加入磁力搅拌子4，在活塞2的末端连接蠕动泵3，在搅拌的条件下，打开两个活塞，开启蠕动泵，将混合溶液缓慢的引入到管状的接受器中，-20℃低温冷冻干燥，然后在120度真空处理30分钟，在0.05w/v％的戊二醛溶液中进行交联处理2min，然后在1w/v％的盐酸溶液中浸泡20min，然后用蒸馏水洗至中性，得到具有成分连续梯度性的神经修复支架材料。
实施例3壳聚糖结构连续梯度神经修复支架材料的制备
分别配制1w/v％和3w/v％的壳聚糖醋酸溶液(溶剂为重量体积比为1w/v％醋酸水溶液)，两者在4℃搅拌过夜，然后分别在80mTorr的真空下脱气。
在梯度混合仪(如图1所示)中，在活塞1和活塞2关闭的条件下，A容器中加入10ml的1w/v％壳聚糖醋酸溶液，B中加入10ml的3w/v％的壳聚糖醋酸溶液，在B中加入磁力搅拌子4，在活塞2的末端连接蠕动泵3，在搅拌的条件下，打开两个活塞，开启蠕动泵，将混合溶液缓慢的引入到管状的接受器中，-80℃低温冷冻干燥，然后在0.05w/v％的戊二醛溶液中进行交联处理2min，然后在1w/v％的氨水溶液中浸泡脱酸20min，然后用蒸馏水洗至中性，得到具有结构连续梯度性的神经修复支架材料。从支架材料的一端到另一端材料的尺寸从2mm到50um，孔隙率从75％到95％逐渐变化。材料两端的多孔结构如图3、图4所示。
实施例4壳聚糖力学性能连续梯度神经修复支架材料的制备
分别配制2w/v％壳聚糖醋酸溶液(溶剂为重量体积比为1w/v％醋酸水溶液)和加入0.05w/v％的戊二醛的2w/v％的壳聚糖醋酸溶液(溶剂为重量体积比为1w/v％醋酸水溶液)，两者在4℃搅拌过夜，然后分别在80mTorr的真空下脱气。
在梯度混合仪(如图1所示)中，在活塞1和活塞2关闭的条件下，A容器中加入10ml的壳聚糖醋酸溶液，B中加入10ml的含戊二醛的壳聚糖醋酸溶液，在B中加入磁力搅拌子4，在活塞2的末端连接蠕动泵3，在搅拌的条件下，打开两个活塞，开启蠕动泵，将混合溶液缓慢的引入到管状的接受器中，-80℃低温冷冻干燥，然后在1w/v％的氨水溶液中浸泡脱酸20min，然后用蒸馏水洗至中性，得到具有交联密度连续梯度性的神经修复支架材料，该材料具有力学性能随着交联度的减小，压缩模量逐渐减小，显示出力学性能的梯度性。结果如下：
将12cm支架材料均匀切割成8段(直径1.5cm，高度1.5cm)，依次编号，在力学试验机上测量(传感器为50N，压缩速率为2mm/min)，所测得的力学性能如下：
| Samples | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 |
| 压缩模量/Kpa | 85.2 | 79.1 | 63.2 | 59.3 | 55.4 | 53.8 | 49.2 | 45.6 |
实施5负载蛋白的壳聚糖连续梯度神经修复支架材料的制备
分别配制2w/v％壳聚糖醋酸溶液(溶剂为重量体积比为1w/v％醋酸水溶液)和含1w/v％牛血清白蛋白的2w/v％壳聚糖醋酸溶液(溶剂为重量体积比为1w/v％醋酸水溶液)，两者在4℃搅拌过夜，然后分别在80mTorr的真空下脱气。
在梯度混合仪(如图1所示)中，在活塞1和活塞2关闭的条件下，A容器中加入10ml的壳聚糖醋酸溶液，B中加入10ml的含牛血清白蛋白(sigma)(作为神经生长因子的模板蛋白)的壳聚糖醋酸溶液，在B中加入磁力搅拌子4，在活塞2的末端连接蠕动泵3，在搅拌的条件下，打开两个活塞，开启蠕动泵，将混合溶液缓慢的引入到管状的接受器中，-80℃低温冷冻干燥，然后在1％的氨水溶液中浸泡脱酸20min，然后用蒸馏水洗至中性，得到负载牛血清白蛋白连续梯度性的神经修复支架材料。
牛血清白蛋白负载率(单位质量支架负载蛋白的质量)的测定：将12cm支架材料均匀切割成8段，(直径1.5cm，高度1.5cm)，按蛋白浓度的大小排序，将所得的8段支架重新用1w/v％的醋酸溶解，用BCA法(该方法是测量蛋白浓度的经典方法)测得蛋白的负载率如下：
| Samples | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 |
| 负载率(w/v％) | 2.3 | 5.4 | 10.2 | 16.7 | 22.1 | 28.8 | 32.2 | 36.6 |
另取取实施例5中的2，4和6部分进行体外释放实验：在37℃的磷酸缓冲液中(pH＝7.2)，摇床转速60rpm，蛋白绝对释放量曲线如图5所示，蛋白相对释放量曲线如图6所示，蛋白的释放性能呈现出连续的梯度变化。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (2)
1.一种具有连续梯度性能的多糖基神经修复支架材料的制备方法，其特征在于：所述制备方法包括以下步骤：
将多糖溶液A与多糖溶液B在梯度混合仪中等体积混合，然后低温冷冻干燥，得到具有梯度性的神经修复支架材料；
所述两种多糖溶液A与多糖溶液B的成分与浓度中至少有一个不同；
所述多糖溶液A选自甲壳素溶液、壳聚糖溶液、透明质酸溶液、硫酸软骨素溶液、肝素溶液、海藻酸钠溶液和葡聚糖溶液中的一种以上；
多糖溶液B选自甲壳素溶液、壳聚糖溶液、透明质酸溶液、硫酸软骨素溶液、肝素溶液、海藻酸钠溶液和葡聚糖溶液中的一种以上；
所述支架材料是由一种以上的多糖构成，并且沿一个方向具有连续的梯度性；
所述连续的梯度性为成分的连续梯度性、结构的连续梯度性和功能的连续梯度性中的一种或多种；
成分的连续梯度性是指其构成神经修复支架材料的多糖成分为两种以上，其中一种多糖成分从支架材料的一端到另一端逐渐减少或增加，另一种或多种多糖成分从支架材料的一端到另一端逐渐增加或减少；
结构的连续梯度性是指神经修复支架材料中的多孔结构的尺寸从支架材料的一端到另一端同时逐渐减小，孔隙率从支架材料的一端到另一端同时逐渐增加；
性能的连续梯度性是指支架材料的力学性能从支架材料的一端到另一端逐渐减小；或该支架材料的所负载的神经营养因子或神经生长因子的释放量从支架材料的一端到另一端逐渐增加，或释放速率从支架材料的一端到另一端逐渐增加。
2.根据权利要求1所述一种具有连续梯度性能的多糖基神经修复支架材料的制备方法，其特征在于：所述多糖为甲壳素、壳聚糖、透明质酸、硫酸软骨素、肝素、海藻酸钠和葡聚糖中的一种或多种。
3．根据权利要求1所述一种具有连续梯度性能的多糖基神经修复支架材料的制备方法，其特征在于：所述多糖溶液A为壳聚糖溶液，多糖溶液B为透明质酸的水溶液；
所述壳聚糖溶液的制备方法如下：将壳聚糖盐酸溶液倒入饱和的NH4HCO3溶液中，在20℃静置5天，形成壳聚糖氨基甲酸盐溶液。
4．根据权利要求1所述一种具有连续梯度性能的多糖基神经修复支架材料的制备方法，其特征在于：所述多糖溶液A或多糖溶液B的质量浓度为1～3%。
5．根据权利要求1所述一种具有连续梯度性能的多糖基神经修复支架材料的制备方法，其特征在于：所述多糖溶液A或多糖溶液B在80mTorr的真空下脱气。
6．根据权利要求1所述一种具有连续梯度性能的多糖基神经修复支架材料的制备方法，其特征在于：所述多糖溶液A或多糖溶液B中加入重量体积百分比0.05～1%的交联剂或神经生长因子或神经营养因子。
7．根据权利要求1所述一种具有连续梯度性能的多糖基神经修复支架材料的制备方法，其特征在于：所述低温冷冻温度为-20～-80℃。
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