ES2299232T3

ES2299232T3 - Moleculas que migran hacia un organo o tejido seleccionado in vivo.

Info

Publication number: ES2299232T3
Application number: ES99250432T
Authority: ES
Inventors: Erkki I. Ruoslahti; Renata Pasqualini
Original assignee: Sanford Burnham Prebys Medical Discovery Institute
Current assignee: Sanford Burnham Prebys Medical Discovery Institute
Priority date: 1995-09-11
Filing date: 1996-09-10
Publication date: 2008-05-16
Anticipated expiration: 2016-09-10
Also published as: JP2007204483A; DE69609585D1; AU693723B2; JP2003155296A; EP0987275A2; EP0987275B1; DE69609585T2; EP0876611A1; JPH10502674A; HK1027820A1; CA2204535A1; AU6973996A; DE69637395T2; CA2204535C; EP0773441A1; DE773441T1; ATE382630T1; DE69637395D1; JP3900305B2; EP0773441B1

Abstract

La presente invención se refiere a un procedimiento in vivo para identificar moléculas que se dirigen hacia un órgano o tejido seleccionados. La invención se refiere también a péptidos que se dirigen hacia un órgano o tejidos seleccionados. Por ejemplo, la invención se refiere a péptidos que se dirigen selectivamente hacia u órgano como el cerebro o el riñón o hacia un tejido como un tejido tumoral. La invención se refiere además a procedimientos para utilizar una moléculas que se dirigen a órganos, por ejemplo, para dirigir un agente como un medicamento hacia un órgano seleccionado o para identificar la molécula diana expresada por el órgano seleccionado.

Description

Moléculas que migran hacia un órgano o tejido seleccionado in vivo.

Fundamentos de la invención Campo de la invención

La presente invención se refiere en general a los campos de la medicina molecular y el suministro de fármacos y, más específicamente, a moléculas que migran hacia tumores de mama, péptidos que tienen la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 48, 49 ó 50.

Información sobre los fundamentos

Aunque el efecto de una patología particular se manifiesta frecuentemente por todo el cuerpo de la persona aquejada, en general, la patología subyacente puede afectar sólo a un único órgano o tejido. En muchos casos, los fármacos son el tratamiento preferido para un paciente que sufre una enfermedad en particular. Es poco común, sin embargo, que un fármaco se dirija sólo al tejido u órgano enfermo. Más comúnmente, el tratamiento con fármacos da como resultado efectos secundarios no deseados debidos, por ejemplo, a efectos tóxicos generalizados por todo el cuerpo del paciente. Las nauseas, pérdida del cabello y caída del recuento sanguíneo que se presentan como resultado de tratar a un paciente con cáncer con agentes quimioterapéuticos son ejemplos de efectos secundarios no deseables que pueden presentarse debido al tratamiento con fármacos.

Los efectos secundarios no deseables que pueden presentarse cuando se usan fármacos para tratar una enfermedad se deben la mayoría de las veces a la incapacidad del fármaco para dirigirse específicamente hacia el órgano o tejido enfermo. Por ejemplo, un agente quimioterapéutico contra el cáncer que se dirige hacia células que proliferan rápidamente sería útil para destruir las células cancerosas que se están dividiendo rápidamente. Sin embargo, tal agente destruye también células hematopoyéticas y epiteliales que están proliferando normalmente. Por tanto, la dosis de tal fármaco que puede administrarse a un paciente es limitada debido a su efecto tóxico sobre células normales.

Se han realizado esfuerzos para aumentar la especificidad de diana de varios fármacos. En algunos casos, un tipo particular de células presente en un tejido u órgano enfermo puede expresar un marcador (en inglés "marker") de superficie celular único. En tal caso, puede producirse un anticuerpo frente al marcador de superficie celular único y puede enlazarse un fármaco al anticuerpo. Tras la administración del complejo fármaco/anticuerpo al paciente, la unión del anticuerpo al marcador de superficie celular da como resultado el suministro de una concentración relativamente alta del fármaco al tejido u órgano enfermo. Pueden usarse métodos similares cuando un tipo particular de células en el órgano enfermo expresa un único receptor de superficie celular o un ligando para un receptor particular. En estos casos, el fármaco puede enlazarse al ligando específico o al receptor, respectivamente, proporcionando así medios para suministrar una concentración relativamente alta del fármaco al órgano enfermo.

Aunque enlazar un fármaco a una molécula que migra hacia un tipo particular de células presente en un órgano o tejido enfermo proporciona ventajas significativas para el tratamiento sobre el uso del fármaco solo, el uso de este método está severamente limitado. En particular, se han descrito muy pocos anticuerpos específicos frente a un tipo celular y puede ser difícil y llevar demasiado tiempo tratar de obtener un anticuerpo que se dirija a un órgano en un paciente particular que sufre una patología. Además, se han descrito pocos marcadores de superficie específicos de un tipo celular. Incluso cuando se han descrito tales marcadores, las células que expresan los marcadores pueden estar distribuidas entre varios órganos o tejidos, limitando de ese modo su utilidad como dianas. Por tanto, es importante identificar marcadores específicos de células diana que se expresen en sólo uno o algunos tejidos u órganos e identificar moléculas que interactúen específicamente con tales marcadores.

Varios tipos de células pueden expresar marcadores únicos, y por lo tanto, proporcionar dianas potenciales para moléculas que migran hacia órganos. Las células endoteliales, por ejemplo, que recubren las superficies internas de los vasos sanguíneos, pueden tener distintas morfologías y marcadores bioquímicos en tejidos diferentes. Los vasos sanguíneos del sistema linfático, por ejemplo, expresan varias proteínas de adhesión que sirven para guiar la migración de los linfocitos. Además, las células endoteliales presentes en los nódulos linfáticos expresan un marcador de superficie celular que es un ligando para la L-selectina y las células endoteliales en las vénulas de las placas de Peyer expresan un ligando para la integrina \alpha_{4}\beta_{7}. Estos ligandos están implicados en la migración específica de los linfocitos hacia sus respectivos órganos linfoides. Por tanto, enlazar un fármaco a la L-selectina o a la integrina \alpha_{4}\beta_{7} puede proporcionar medios para dirigir el fármaco hacia los nódulos linfáticos o placas de Peyer enfermos, respectivamente, siempre que estas moléculas no se unan a ligandos similares presentes en un número importante de otros
órganos.

El documento WO 95/14714 describe péptidos que se unen selectivamente a integrinas.

Aunque las moléculas migratorias presentes en los vasos sanguíneos de tejidos no linfoides no se han definido con claridad, la capacidad de los linfocitos para retornar al órgano en el que se estimularon por primera vez indica que existen marcadores endoteliales específicos de órgano. Similarmente, la migración o metástasis de tipos particulares de células tumorales hacia órganos específicos proporciona una evidencia adicional de que existen marcadores específicos de órgano. Sin embargo, permanece la necesidad de identificar otros marcadores celulares específicos de órgano y las moléculas que se unen a ellos.

Actualmente hay métodos disponibles para producir grandes poblaciones de moléculas y para someter a escrutinio bibliotecas de moléculas para identificar aquéllas de interés. Por ejemplo, las bibliotecas de péptidos expresados en fagos pueden usarse para expresar un gran número de péptidos que pueden someterse a escrutinio in vitro con una molécula diana particular o una célula de interés para identificar los péptidos que se unen específicamente a la molécula diana o la célula. El escrutinio de tales bibliotecas de expresión en fagos se ha usado, por ejemplo, para identificar ligandos que se unen específicamente a varios anticuerpos y receptores de superficie celular.

El escrutinio de una biblioteca de expresión en fagos implica generalmente el reconocimiento y selección (en inglés "panning") in vitro de la biblioteca usando una molécula diana purificada. Los fagos que se unen a la molécula diana pueden recuperarse, pueden clonarse fagos individuales y puede determinarse el péptido expresado por un fago clonado. Tal péptido puede ser útil para el suministro de un fármaco enlazado al péptido a las células que expresan la molécula diana.

Desafortunadamente, se han identificado muy pocas moléculas diana que sean expresadas por solo uno o algunos tipos celulares. Además, incluso cuando se conoce tal molécula diana, es incierto si un péptido que se une específicamente a la molécula diana, según se determina por un método de reconocimiento y selección in vitro, se unirá a la molécula diana in vivo. Como resultado, la identificación de un péptido a partir de una biblioteca de expresión en fagos usando un método de reconocimiento y selección in vitro representa esencialmente sólo un punto de partida para determinar si el péptido identificado puede ser útil para un procedimiento in vivo. Por tanto, existe la necesidad de desarrollar métodos in vivo para someter a escrutinio un gran número de moléculas tales como péptidos para identificar aquéllas que pueden migrar hacia uno o más órganos o tejidos seleccionados. La presente invención satisface esta necesidad y proporciona asimismo ventajas relacionadas.

Compendio de la invención

La presente invención proporciona péptidos que migran selectivamente hacia un órgano o tejido seleccionado. La invención proporciona los péptidos que migran hacia tumores CGRECPRLCQSSC (SEC ID Nº 48), CGEACGGQ
CALPC (SEC ID Nº 49) y CNGRCVSGCAGRC (SEC ID Nº 50), que migran hacia un tumor de mama. Tales moléculas que migran hacia un órgano o tejido se denominan en la presente memoria, por conveniencia, moléculas que "migran hacia órganos". Una "molécula que migra hacia un tumor" es un ejemplo de una molécula que migra hacia un órgano. Una molécula que migra hacia un órgano de la invención es útil, por ejemplo, para dirigir un componente (en inglés "moiety") tal como un fármaco hacia un tumor de mama in vitro, para preparar una composición farmacéutica para dirigir un componente hacia un tumor de mama, o para identificar la presencia de una molécula diana en una muestra.

La información acerca de moléculas adicionales que migran hacia órganos y los métodos usados para identificar las moléculas se incluye como antecedentes técnicos.

Descripción detallada de la invención

Para identificar las moléculas de la invención, la presente invención empleó un método para identificar una molécula que migra específicamente hacia un cáncer de mama, sometiendo a escrutinio una biblioteca usando reconocimiento y selección in vivo (véase Pasqualini y Rouslahti, Nature 380:364-366 (1996)). Las moléculas que migran hacia órganos identificadas son útiles, por ejemplo, para dirigir un componente deseado tal como un fármaco, una toxina o un marcador (en inglés "label") detectable, que pueden enlazarse a la molécula, hacia el órgano o tejido seleccionado. El reconocimiento y selección in vivo proporciona medios directos para identificar moléculas que migran selectivamente hacia un órgano o tejido seleccionado y, por lo tanto, proporciona una ventaja significativa sobre métodos anteriores, que requieren que una molécula identificada usando un método de escrutinio in vitro se examine subsiguientemente para determinar si mantiene su especificidad in vivo.

Tal como se usa en la presente memoria, el término "biblioteca" significa una colección de moléculas. Una biblioteca puede contener pocas o un número grande de moléculas diferentes, que varían desde aproximadamente diez moléculas hasta varios billones de moléculas o más. Si se desea, puede enlazarse un molécula a una etiqueta (en inglés "tag"), que puede ser una etiqueta común o una etiqueta específica que puede facilitar la recuperación o identificación de la molécula.

Tal como se usa en la presente memoria, el término "molécula" se usa ampliamente para significar un producto químico orgánico tal como un fármaco; un péptido, incluyendo una variante o péptido modificado o moléculas de tipo péptido tales como un peptidomimético o un peptoide; o una proteína tal como un anticuerpo o un receptor de factor de crecimiento o un fragmento de los mismos tal como un fragmento Fv, Fd o Fab de un anticuerpo, que contiene un dominio de unión. Por conveniencia, el término "péptido" se usa ampliamente en la presente memoria para significar péptidos, proteínas, fragmentos de proteínas y similares. Una molécula puede ser una molécula no existente en la naturaleza, que no existe en la naturaleza, pero que se produce como resultado de métodos in vitro, o puede ser una molécula existente en la naturaleza tal como una proteína o fragmento de la misma expresada a partir de una genoteca de cADN.

Los métodos para preparar bibliotecas que contengan diversas poblaciones de varios tipos de moléculas tales como péptidos, peptoides y peptidomiméticos son bien conocidos en la técnica y están comercialmente disponibles (véanse, por ejemplo, Ecker y Crooke, Biotechnology 13:351-360 (1995), y Blondelle et al., Trends Anal. Chem. 14:83-92 (1995), y las referencias citadas en ellos, cada una de las cuales se incorpora a la presente memoria por referencia; véase, también, Goodman y Ro, Peptidomimetics for Drug Design, en "Burger's Medicinal Chemistry and Drug Discovery" Vol. 1 (ed. M.E. Wolff; John Wiley & Sons 1995), páginas 803-861, y Gordon et al., J. Med. Chem. 37:1385-1401 (1994)). Cuando una molécula es un péptido, proteína o fragmento de la misma, la molécula puede producirse in vitro directamente o puede expresarse a partir de un ácido nucleico, que se produce in vitro. Los métodos de química de péptidos sintéticos y ácidos nucleicos son bien conocidos en la técnica.

Una biblioteca de moléculas puede producirse también, por ejemplo, construyendo una genoteca de expresión de cADN a partir de mARN recogido de una célula, tejido, órgano u organismo de interés. Los métodos para producir tales genotecas son bien conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A laboratory manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989)). Preferiblemente, el péptido codificado por el cADN se expresa sobre la superficie de una célula o un virus que contiene el cADN. Por ejemplo, el cADN puede clonarse en un vector fágico tal como el fuse 5 (véase el Ejemplo I), en el que, tras la expresión, el péptido codificado se expresa como una proteína de fusión sobre la superficie del fago.

Además, una biblioteca de moléculas puede comprender una biblioteca de moléculas de ácido nucleico. Las moléculas de ácido nucleico que se unen, por ejemplo, a un receptor de superficie celular son conocidas en la técnica (véanse O'Connell et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 93:5883-5887 (1996); Tuerk y Gold, Science 249:505-510 (1990); Gold et al., Ann. Rev. Biochem. 64:763-797 (1995)). Por tanto, puede administrarse una biblioteca de moléculas de ácido nucleico a un sujeto que tiene un tumor y las moléculas que migran hacia el tumor pueden identificarse por reconocimiento y selección in vivo como se describe en la presente memoria. Si se desea, las moléculas de ácido nucleico pueden ser análogos de ácidos nucleicos que, por ejemplo, son menos susceptibles al ataque por nucleasas (véanse, por ejemplo, Jelinek et al., Biochemistry 34:11363-11372 (1995); Latham et al., Nucl. Acids Res. 22:2817-2822 (1994); Tam et al., Nucl. Acids Res. 22:977-986 (1994); Reed et al., Cancer Res. 59:6565-6570 (1990)).

Tal como se describe en la presente memoria, el reconocimiento y selección in vivo comprende administrar una biblioteca a un sujeto, recoger un órgano o tejido seleccionado e identificar una molécula que migra hacia un órgano. Una molécula que migra hacia un órgano puede identificarse usando varios métodos bien conocidos en la técnica. Generalmente, la presencia de una molécula que migra hacia un órgano en un órgano o tejido seleccionado se identifica basándose en una o dos características comunes a las moléculas presentes en la biblioteca, y a continuación se identifica la estructura de una molécula particular que migra hacia un órgano. Por ejemplo, puede usarse un método de detección muy sensible tal como espectrometría de masas, bien sola o en combinación con un método tal como cromatografía de gases, para identificar moléculas que migran hacia órganos en un órgano o tejido seleccionado. Por tanto, cuando una biblioteca comprende diversas moléculas basadas generalmente en la estructura de una molécula orgánica, la presencia de una molécula que migra hacia un órgano tal como un fármaco puede identificarse detectando la presencia de un pico parental para la molécula particular.

Si se desea, el órgano o tejido seleccionado puede recogerse, y procesarse a continuación usando un método tal como HPLC (del inglés "High Performance Liquid Chromatography", cromatografía de líquidos de alta eficiencia), que puede proporcionar una fracción enriquecida en moléculas que tienen un intervalo definido de pesos moleculares o características polares o no polares, o similares. Las condiciones para el HPLC dependerán de la química de la molécula en particular y son bien conocidas por los expertos en la técnica. Similarmente, los métodos para la eliminación masiva de materiales celulares que potencialmente interfieren tales como ADN, ARN, proteínas, lípidos o carbohidratos son bien conocidos en la técnica como lo son los métodos para enriquecer una fracción que contiene una molécula orgánica usando, por ejemplo, métodos de extracción selectiva. Por ejemplo, cuando una biblioteca comprende una población de diversas moléculas químicas orgánicas cada una enlazada a una etiqueta de oligonucleótidos específica, de tal forma que la molécula particular se identifica determinando la secuencia de oligonucleótidos usando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR, del inglés "Polymerase Chain Reaction"), puede eliminarse el ADN genómico de la muestra del órgano recogido para reducir las posibilidades de reacciones de PCR de fondo. Además, una biblioteca puede comprender una población de diversas moléculas tales como moléculas químicas orgánicas cada una enlazada a una etiqueta coincidente, común. Basándose en la presencia y propiedades de la etiqueta común, las moléculas de la biblioteca que migran selectivamente hacia un órgano o tejido pueden aislarse sustancialmente de una muestra del órgano o tejido. Éstos y otros métodos pueden ser útiles para enriquecer la muestra del órgano recogido en la molécula particular que migra hacia un órgano, eliminado así materiales potencialmente contaminantes de la muestra de órgano recogido y aumentando la sensibilidad de detección de la molécula.

La evidencia proporcionada en la presente memoria indica que un número suficiente de moléculas que migran hacia órganos migra selectivamente hacia un órgano o tejido seleccionado durante el reconocimiento y selección in vivo, de tal forma que las moléculas pueden identificarse fácilmente. Por ejemplo, se identificaron varios fagos independientes que expresaban el mismo péptido en un tumor formado a partir de células implantadas de carcinoma de mama (Tabla 3). Específicamente, un péptido que migró hacia al tumor de mama constituía aproximadamente un 43% de los péptidos secuenciados que migraban hacia el tumor de mama (véase el Ejemplo III).

Aunque una fracción sustancial de las moléculas que migran hacia órganos identificadas tiene la misma estructura, se determinaron los insertos peptídicos de sólo un pequeño número de fagos aislados. Debe reconocerse, sin embargo, que se recuperaron entre cientos de miles y millones de péptidos que migran hacia órganos expresados en fagos tras varios reconocimientos y selecciones in vivo para detectar moléculas que migran hacia órganos. Estos resultados indican que las moléculas que migran hacia órganos específicas estarán presentes en cantidades sustanciales en un órgano tras la migración in vivo, aumentando así la facilidad con la que pueden identificarse las moléculas.

La facilidad de identificación de una molécula que migra hacia un órgano, particularmente una molécula sin etiqueta, depende de varios factores, incluyendo la presencia de material celular de fondo potencialmente contaminante. Por tanto, cuando la molécula que migra hacia un órgano es un péptido sin etiqueta, un número mayor debe migrar hacia el órgano para identificar los péptidos específicos frente al fondo de proteína celular. Por el contrario, es identificable un número mucho más pequeño de una molécula química orgánica sin etiqueta que migra, porque tales moléculas están normalmente ausentes o están presentes sólo en cantidades pequeñas en el cuerpo. En tal caso, puede usarse un método muy sensible tal como espectrometría de masas para identificar una molécula que migra hacia un órgano. El experto en la técnica reconocerá que el método de identificación de una molécula dependerá, en parte, de la química de la molécula particular.

Cuando una molécula que migra hacia un órgano es un ácido nucleico o posee como etiqueta una molécula de ácido nucleico, un ensayo tal como la PCR puede ser particularmente útil para identificar la presencia de la molécula porque, en principio, la PCR puede detectar la presencia de una única molécula de ácido nucleico (véase, por ejemplo, Erlich, PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification (Stockton Press 1989)). Estudios preliminares han demostrado que, después de la inyección intravenosa de 10 ng de un plásmido de aproximadamente 6000 pares de bases a un ratón y 2 minutos en la circulación, el plásmido era detectable por PCR en una muestra de pulmón. Estos resultados indican que los ácidos nucleicos son suficientemente estables cuando se administran a la circulación de tal forma que puede usarse el reconocimiento y selección in vivo para identificar moléculas de ácido nucleico que migran selectivamente hacia un órgano seleccionado.

Las moléculas de una biblioteca pueden etiquetarse, lo cual puede facilitar la recuperación o identificación de la molécula. Tal como se usa en la presente memoria, el término "etiqueta" significa un componente físico, químico o biológico tal como una microperla plástica, un oligonucleótido o un bacteriófago, respectivamente, que está enlazado a una molécula de la biblioteca. Los métodos para añadir una etiqueta a una molécula son bien conocidos en la técnica (Hermanson, Bioconjugate Techniques, (Academic Press 1996)).

Una etiqueta, que puede ser una etiqueta común o una etiqueta específica, puede ser útil para identificar la presencia o estructura de una molécula de la biblioteca. Tal como se usa en la presente memoria, el término "etiqueta común" significa un componente físico, químico o biológico que es común a cada molécula en una biblioteca. La biotina, por ejemplo, puede ser una etiqueta común que se enlaza a cada molécula en una biblioteca. Una etiqueta común puede ser útil para identificar la presencia de una molécula de la biblioteca en una muestra y también puede ser útil para aislar sustancialmente las moléculas de una muestra. Por ejemplo, cuando la etiqueta común es biotina, las moléculas etiquetadas con biotina en una biblioteca pueden aislarse sustancialmente por unión a estreptavidina o su presencia puede identificarse por unión a una estreptavidina marcada. Cuando una biblioteca es una biblioteca de expresión en fagos, los fagos que expresan los péptidos son otro ejemplo de etiqueta común, puesto que cada péptido de la biblioteca está enlazado a un fago. Además, un péptido tal como el antígeno de la hemaglutinina puede ser una etiqueta común que está enlazada a cada molécula en la biblioteca, permitiendo así el uso de un anticuerpo específico para el antígeno de la hemaglutinina para aislar sustancialmente moléculas de la biblioteca de una muestra de un órgano o tejido seleccionado.

Una etiqueta común puede ser también una secuencia de ácido nucleico que puede ser útil para identificar la presencia de moléculas de la biblioteca en una muestra o para aislar sustancialmente moléculas de una biblioteca de una muestra. Por ejemplo, cada una de las moléculas de una biblioteca puede enlazarse a la misma secuencia de nucleótidos seleccionada, que constituye la etiqueta común. Puede usarse a continuación una columna de afinidad que contenga una secuencia de nucleótidos que sea complementaria a la etiqueta común para hibridar las moléculas de la biblioteca que contienen la etiqueta común, aislando así sustancialmente las moléculas de una muestra de órgano o tejido. Puede usarse también una secuencia de nucleótidos complementaria a una porción de la etiqueta de secuencia de nucleótidos común como cebador de PCR de tal forma que la presencia de moléculas que contienen la etiqueta común pueda identificarse en una muestra por PCR.

Una etiqueta puede ser también una etiqueta específica. Tal como se usa en la presente memoria, el término "etiqueta específica" significa una etiqueta física, química o biológica que está enlazada a una molécula particular en una biblioteca y es única para esa molécula particular. Una etiqueta específica es particularmente útil si es fácilmente identificable. Una secuencia de nucleótidos que sea única para una molécula particular de una biblioteca es un ejemplo de etiqueta específica. Por ejemplo, el método de sintetizar péptidos etiquetados con una secuencia de nucleótidos única proporciona una biblioteca de moléculas, que contiene cada una una etiqueta específica, de tal forma que determinando la secuencia de nucleótidos, se conoce la identidad del péptido (véase Brenner y Lerner, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 89:5381-5383 (1992)). El uso de una secuencia de nucleótidos como etiqueta específica para un péptido u otro tipo de molécula proporciona medios simples para identificar la presencia de la molécula en una muestra porque puede usarse un método sumamente sensible tal como la PCR para determinar la secuencia de nucleótidos de la etiqueta específica, identificando así la secuencia de la molécula enlazada a ella. Similarmente, la secuencia de ácido nucleico que codifica un péptido expresado sobre un fago es otro ejemplo de etiqueta específica, puesto que la secuenciación de la etiqueta específica identifica la secuencia de aminoácidos del péptido expresado.

La presencia de una etiqueta común o una etiqueta específica puede proporcionar medios para identificar o recuperar una molécula que migra hacia un órgano de la invención después del reconocimiento y selección in vivo. Además, la combinación de una etiqueta común y una etiqueta específica puede ser particularmente útil para identificar una molécula que migra hacia un órgano. Por ejemplo, una biblioteca de péptidos puede prepararse de tal forma que cada uno esté enlazado a una etiqueta de secuencia de nucleótidos específica (véase, por ejemplo, Brenner y Lerner, ut supra, 1992), en la que cada etiqueta de secuencia de nucleótidos específica ha incorporado a ella una etiqueta común tal como biotina. Tras la migración hacia un órgano, los péptidos particulares que migran hacia el órgano pueden aislarse sustancialmente de una muestra del órgano basándose en la etiqueta común y los péptidos específicos pueden identificarse, por ejemplo, por PCR de la etiqueta específica (véase Erlich, ut supra, 1989).

Una etiqueta puede servir también como soporte. Tal como se usa en la presente memoria, el término "soporte" significa una etiqueta que tiene una superficie definida a la que puede ligarse una molécula. En general, una etiqueta útil como soporte es una etiqueta común. Por ejemplo, un soporte puede ser una etiqueta biológica tal como un virus o partícula de tipo virus tal como un bacteriófago ("fago"); una bacteria tal como E. coli; o una célula eucariota tal como una célula de levadura, insecto o mamífero; o puede ser una etiqueta física tal como un liposoma o una microperla, que puede estar compuesta de plástico, agarosa, gelatina u otro material. Si se desea, una etiqueta común útil como soporte puede tener enlazada a ella una etiqueta específica. Por tanto, puede considerarse que las bibliotecas de expresión en fagos usadas en los métodos ejemplificados consisten en el fago, el cual es una etiqueta común que es también un soporte, y la secuencia de nucleótidos que codifica el péptido expresado, siendo la secuencia de nucleótidos una etiqueta específica.

En general, un soporte debería tener un diámetro inferior que aproximadamente 10 \mum hasta aproximadamente 50 \mum en su dimensión más corta, de tal forma que el soporte pueda pasar relativamente sin impedimento a través de los lechos capilares presentes en el sujeto y no ocluya la circulación. Además, un soporte puede ser no tóxico, a fin de que no perturbe la expresión normal de moléculas de superficie celular o la fisiología normal del sujeto, y biodegradable, particularmente cuando el sujeto usado para el reconocimiento y selección in vivo no se sacrifica para recoger un órgano o tejido seleccionado.

Cuando una molécula está enlazada a un soporte, la molécula etiquetada comprende la molécula ligada a la superficie del soporte, de tal forma que la parte de la molécula bajo sospecha de ser capaz de interaccionar con una diana en una célula en el sujeto esté colocada para ser capaz de participar en la interacción. Por ejemplo, cuando la molécula está bajo sospecha de ser un agonista \beta adrenérgico, la porción de unión de la molécula ligada a un soporte se coloca de forma que pueda interaccionar con un receptor \beta adrenérgico sobre una célula en el órgano o tejido seleccionado. Similarmente, cuando la molécula está bajo sospecha de ser un ligando para un receptor de factor de crecimiento, la molécula se coloca sobre el soporte de forma que pueda unirse al receptor. Si se desea, puede colocarse una molécula espaciadora apropiada entre la molécula y el soporte de tal forma que la capacidad de la molécula potencial que migra hacia un órgano para interaccionar con la molécula diana no se vea impedida. Una molécula espaciadora puede contener también un grupo reactivo, que proporciona medios convenientes y eficientes de unir una molécula a un soporte y, si se desea, puede contener una etiqueta, que puede facilitar la recuperación o identificación de la molécula (véase Hermanson, ut supra, 1996).

Tal como se ejemplifica en la presente memoria, un péptido bajo sospecha de ser capaz de migrar hacia un órgano o tejido seleccionado tal como el cerebro se expresó como el extremo N-terminal de una proteína de fusión, en la que el extremo C-terminal consistía en una proteína de revestimiento de fago. Tras la expresión de la proteína de fusión, la proteína de revestimiento C-terminal enlazó la proteína de fusión a la superficie de un fago de tal forma que el péptido N-terminal estaba en posición para interactuar con una molécula diana en un órgano. Por tanto, se formó una molécula que tenía una etiqueta común por enlazamiento de un péptido a un fago, en la que el fago proporcionaba un soporte biológico, la molécula peptídica está enlazada como una proteína de fusión, la porción codificada por el fago de la proteína de fusión actúa como una molécula espaciadora, y el ácido nucleico que codifica el péptido proporcionaba una etiqueta específica que permitía la identificación de un péptido que migra hacia un órgano.

Tal como se usa en la presente memoria, el término "reconocimiento y selección in vivo" significa un método para someter a escrutinio una biblioteca administrando la biblioteca a un sujeto e identificando una molécula que migra selectivamente hacia uno o algunos órganos o tejidos seleccionados. El término "administrando a un sujeto", cuando se usa haciendo referencia a una biblioteca de moléculas o una porción de la misma, se usa en su sentido más amplio para significar que la biblioteca se suministra a un órgano o tejido seleccionado, incluyendo, cuando se desee, un tumor, de tal forma que las moléculas de la biblioteca se ponen en contacto con el órgano o tejido seleccionado.

Una biblioteca puede administrarse a un sujeto, por ejemplo, inyectando la biblioteca en la circulación del sujeto de tal forma que las moléculas puedan pasar a través del órgano o tejido seleccionado; después de un periodo de tiempo apropiado, se pone fin a la circulación sacrificando al sujeto o retirando una muestra del órgano (véase el Ejemplo I). Alternativamente, puede insertarse una cánula en un vaso sanguíneo del sujeto, de tal forma que la biblioteca se administra por perfusión durante un periodo de tiempo apropiado, después del cual la biblioteca puede retirarse de la circulación a través de la cánula o el sujeto puede sacrificarse o puede tomarse una muestra del órgano para poner fin a la circulación. Similarmente, una biblioteca puede llevarse a través de uno o algunos órganos por canulación de los vasos sanguíneos apropiados del sujeto. Es reconocido que una biblioteca puede administrarse también a un órgano perfundido aislado. Tal reconocimiento y selección en un órgano prefundido aislado puede ser útil para identificar moléculas que se unen al órgano y, si se desea, puede usarse como escrutinio inicial de una biblioteca. Por ejemplo, si se desea una molécula que migre hacia el riñón, puede perfundirse una biblioteca a través de un riñón aislado, y a continuación las moléculas que se unieron al riñón perfundido pueden escrutarse por reconocimiento y selección in vivo para identificar una molécula que migra hacia el riñón.

El método de reconocimiento y selección in vivo se ejemplifica en la presente memoria por escrutinio de una biblioteca de expresión de péptidos en fagos en ratones e identificación de péptidos específicos que migran selectivamente hacia el cerebro, riñón o un tumor (véanse los Ejemplos II y III).

La tecnología de expresión en fagos proporciona medios para expresar una población diversa de péptidos al azar o selectivamente distribuidos al azar. En la técnica son bien conocidos varios métodos de expresión en fagos y métodos para producir diversas poblaciones de péptidos. Por ejemplo, Ladner et al. (Patente de los EE.UU. Nº 5.223.409, otorgada el 29 de junio, 1993) describe métodos para preparar diversas poblaciones de dominios de unión sobre la superficie de un fago. En particular, Ladner et al. describen vectores fágicos útiles para producir una biblioteca de expresión en fagos, así como métodos para seleccionar dominios de unión potenciales y producir dominios de unión mutados al azar o selectivamente.

Similarmente, Smith y Scott (Meth. Enzymol. 217:228-257 (1993) véase, también, Scott y Smith, Science 249:386-390 (1990)) describen métodos para producir bibliotecas de expresión de péptidos en fagos, incluyendo vectores y métodos para diversificar la población de los péptidos que se expresan (véase, también, Huse, WO 91/07141 y WO 91/07149, véase, también, el Ejemplo I). La tecnología de expresión en fagos puede ser particularmente potente cuando se usa, por ejemplo, con un método de mutagénesis basado en codones, que puede usarse para producir péptidos al azar o péptidos obtenidos con codones preferentes aleatoriamente o de manera deseada (véase, Huse, Patente de los EE.UU. Nº 5.264.563, ut supra, 1993). Estos u otros métodos bien conocidos pueden usarse para producir una biblioteca de expresión en fagos, que puede someterse al método de reconocimiento y selección in vivo empleado en la invención para identificar un péptido que migra hacia uno o algunos órganos o tejidos seleccionados.

Además de para someter a escrutinio una biblioteca de expresión en fagos, el reconocimiento y selección in vivo puede usarse para someter a escrutinio otros tipos diversos de bibliotecas, incluyendo, por ejemplo, una genoteca de ARN o cADN o una biblioteca química. Si se desea, la molécula que migra hacia un órgano puede etiquetarse, lo que puede facilitar la recuperación de la molécula de un órgano o tejido seleccionado o la identificación de la molécula en el órgano o tejido. Por ejemplo, cuando una biblioteca de moléculas orgánicas, que contiene cada una una etiqueta común, se somete a escrutinio, la etiqueta puede ser un componente tal como biotina, que puede estar enlazado directamente a la molécula o puede enlazarse a un soporte que contiene las moléculas. La biotina proporciona una etiqueta común útil para recuperar la molécula de un órgano o tejido seleccionado usando una matriz de afinidad de avidina o estreptavidina. Además, puede enlazarse una molécula o un soporte que contiene una molécula a una etiqueta común tal como el hapteno, 4-etoximetilen-2-fenil-2-oxazolin-5-ona (phOx), que puede unirse a un anticuerpo anti-phOx enlazado a una perla magnética como medio para recuperar la molécula etiquetada. Los métodos para purificar moléculas etiquetadas con biotina o phOx son bien conocidos en la técnica y los materiales para realizar estos procedimientos están comercialmente disponibles (p.ej., Invitrogen; La Jolla, CA; y Promega Corp.; Madison WI). En el caso en el que se somete a escrutinio una biblioteca de fagos, los fagos pueden recuperarse usando métodos tales como los descritos en el Ejemplo I.

El reconocimiento y selección in vivo proporciona un método para identificar directamente moléculas que pueden migrar hacia uno o algunos órganos o tejidos seleccionados. Tal como se usa en la presente memoria, el término "migrar" o "migrar selectivamente" significa que una molécula particular se une relativamente específicamente a una molécula diana presente en uno o algunos órganos o tejidos seleccionados después de la administración a un sujeto. En general, la migración selectiva se caracteriza, en parte, detectando al menos una unión específica dos veces (2x) mayor de la molécula al órgano o tejido seleccionado en comparación con un órgano o tejido control.

Debe reconocerse que, en algunos casos, una molécula puede localizarse no específicamente en un órgano o tejido. Por ejemplo, el reconocimiento y selección in vivo de una biblioteca de expresión en fagos dio como resultado un gran número de fagos localizados en órganos tales como riñón, pulmón o bazo, que contienen componentes (en inglés "components") del sistema reticuloendotelial (RES, del inglés "Reticuloendothelial System"). La migración selectiva en tales tejidos puede distinguirse de la unión inespecífica detectando diferencias, por ejemplo, en las capacidades de fagos individuales diferentes para migrar hacia un órgano o tejido seleccionado, incluyendo un órgano que contiene un componente del RES. Por ejemplo, la migración selectiva puede identificarse combinando una supuesta molécula que migra hacia un órgano tal como un péptido expresado sobre un fago con un gran exceso de fagos no infectivos o con aproximadamente un exceso de cinco veces de fagos que expresan péptidos no seleccionados, inyectando la mezcla a un sujeto y recogiendo una muestra del órgano o tejido seleccionado. En este último caso, por ejemplo, siempre que el número de fagos inyectados que expresan péptidos que migran hacia los órganos sea suficientemente bajo como para ser no saturante para la molécula diana, una determinación de que más del 20% de los fagos en el órgano o tejido seleccionado expresan la supuesta molécula que migra hacia un órgano es un indicio concluyente de que el péptido expresado por el fago es una molécula que migra hacia un órgano específica. Además, la localización no específica puede distinguirse de la migración selectiva realizando experimentos de competición como se describe en los Ejemplos II.D. y IV.

Puede haber varios métodos útiles para prevenir la unión no específica de una molécula a un órgano que contiene un componente del RES. Por ejemplo, una molécula que migre selectivamente a tal órgano puede obtenerse bloqueando primero el RES usando un material tal como partículas de látex de poliestireno o sulfato de dextrano (véanse Kalin et al., Nucl. Med. Biol. 20:171-174 (1993); Illum et al., J. Pharm. Sci. 75:16-22 (1986); Takeya et al., J. Gen. Microbiol. 100:373-379 (1977)), y administrando a continuación la biblioteca al sujeto. Por tanto, Illum et al. administraron sulfato de dextrano 500 o microesferas de poliestireno antes de la administración de una sustancia objeto de ensayo para bloquear la absorción no específica de la sustancia objeto de ensayo por las células de Kupffer, que son el componente del RES del hígado (Illum et al., ut supra, 1986). Además, Takeya et al. publicaron que el RES en el hígado podría bloquearse usando partículas de carbono, sulfato de dextrano 500 (DS-500) o sílice (Takeya et al., ut supra, 1977). También, Kalin et al. publicaron que el bloqueo del RES puede efectuarse usando un coloide gelatinoso (Kalin et al., ut supra, 1993). Éstos y otros agentes diversos útiles para bloquear la absorción no específica por el RES son conocidos y usados rutinariamente.

La unión no deseada de fagos al RES o a otros sitios puede prevenirse también inyectando conjuntamente a los ratones una biblioteca de expresión en fagos específica junto con el mismo fago preparado deficiente en la replicación (véase Smith et al., ut supra, 1990, 1993). Además, un péptido que migra hacia un órgano que contiene un componente del RES puede identificarse preparando una biblioteca de expresión en fagos usando fagos que muestran una baja unión de fondo a tales órganos. Por ejemplo, Merrill et al. (Proc. Natl. Acad. Sci., USA 93:3188-3192 (1996)) seleccionaron fagos de tipo lambda que no son absorbidos por el RES y, como resultado, permanecen en la circulación durante un periodo de tiempo prolongado. Puede seleccionarse una variante de fago filamentoso usando métodos similares.

Tal como se describe en la presente memoria, la absorción de fagos que expresan péptidos por el RES en el hígado, por ejemplo, se bloqueó por administración conjunta de fagos no infectivos, que no son amplificables. Se inyectaron fagos que expresaban una biblioteca CX_{9} en ratones, bien solos o con un exceso de fagos no infectivos (véase el Ejemplo II.E.). La administración conjunta de fagos no infectivos con la biblioteca de fagos redujo sustancialmente la cantidad de fagos recuperados en el hígado y, en menor medida en el bazo, mientras que se observó una pequeña o inexistente diferencia en el número de fagos recuperados del cerebro, riñón o pulmón. Estos resultados indican que la absorción de fagos por órganos tales como el hígado y el bazo, que, al menos en parte pueden ser no específicos debido al componente del RES de estos órganos, puede bloquearse por administración conjunta de fagos no infectivos con una biblioteca de expresión en fagos.

Se realizaron experimentos adicionales para determinar si los fagos que estaban presentes en el hígado tras la administración conjunta con fagos no infectivos habían migrado selectivamente hacia el hígado. Se administró una biblioteca de fagos conjuntamente con fagos no infectivos, y a continuación los fagos recuperados del hígado después de una primera ronda de reconocimiento y selección in vivo se amplificaron in vitro y se usaron para una segunda ronda de reconocimiento y selección in vivo (véase el Ejemplo II.E.). Se recuperaron fagos del hígado y del cerebro (órgano control) y se cuantificaron después de cada ronda de reconocimiento y selección in vivo. Se recuperaron más fagos que migraban hacia el hígado en comparación con el cerebro después de la segunda ronda de reconocimiento y selección in vivo y la población de fagos recuperados del hígado después de la primera ronda de reconocimiento y selección in vivo estaba enriquecida con fagos que migraban selectivamente hacia el hígado. Estos resultados demuestran que el componente del RES de un órgano tal como el hígado puede bloquearse, permitiendo así el uso del método de reconocimiento y selección in vivo para identificar una molécula que migra selectivamente hacia tal órgano.

Tal como se observó para el hígado, se observó una gran cantidad de localización de fagos en el pulmón. Sin embargo, la absorción de fagos por el pulmón no es no específica debida, por ejemplo, a la absorción por los fagotitos alveolares, que constituyen un componente del RES en el pulmón. Específicamente, la recuperación de fagos fue prácticamente la misma sin tener en cuenta si una biblioteca de fagos se inyectaba sola o se administraba conjuntamente con fagos no infectivos (véase el Ejemplo II.E.). Por tanto, la alta absorción de fagos observada en el pulmón (Pasqualini y Ruoslahti, ut supra, 1996) se debe probablemente a la gran cantidad de vascularización en los
pulmones.

La migración selectiva puede demostrarse determinando la especificidad de una molécula que migra hacia un órgano por el órgano o tejido seleccionado en comparación con un órgano o tejido control. Por ejemplo, se observó una relación de migración hacia cerebro frente a riñón de hasta 9:1 para péptidos que migraban hacia cerebro (esto es, una unión 9 veces mayor al órgano seleccionado en comparación con el órgano control; véase el Ejemplo II.A.).

La migración selectiva puede demostrarse también mostrando que las moléculas que migran hacia un órgano seleccionado, tal como se identifican por una ronda de reconocimiento y selección in vivo, están enriquecidas en moléculas que migran hacia el órgano en una ronda subsiguiente de reconocimiento y selección in vivo. Por ejemplo, se aislaron fagos que expresaban péptidos que migran selectivamente hacia cerebro por reconocimiento y selección in vivo, y a continuación se sometieron a rondas adicionales de reconocimiento y selección in vivo. Como se demuestra en el Ejemplo II.A., los fagos recuperados del cerebro después de una primera ronda de escrutinio mostraron un enriquecimiento de 8 veces en la migración hacia el cerebro en comparación con el riñón después de una segunda ronda de escrutinio y un enriquecimiento de 13 veces después de una tercera ronda de reconocimiento y selección in vivo. Cuando un péptido que migra selectivamente hacia el cerebro se enlazó a un componente, esto es, un glóbulo rojo (RBC, del inglés "Red Blood Cell"), el complejo péptido/RBC migró selectivamente hacia el cerebro (véase el Ejemplo II.D.).

Debido a la naturaleza conservada de los receptores celulares y de los ligandos que se unen a un receptor particular, el experto en la técnica reconocería que una molécula que migra hacia un órgano identificada usando, por ejemplo, reconocimiento y selección in vivo en un ratón, se uniera también a la molécula diana correspondiente en el órgano o tejido seleccionado de un humano u otras especies. Por ejemplo, un péptido que contiene RGD que puede unirse específicamente a una integrina expresada por una célula en un sujeto humano puede unirse también a integrinas expresadas en una variedad de especies, incluyendo integrinas expresadas en células mamíferas tales como células murinas y bovinas así como en células de especies más distantes evolutivamente tales como Drosophila. La capacidad de una molécula que migra hacia un órgano identificada usando reconocimiento y selección in vivo en un animal experimental tal como un ratón puede examinarse fácilmente con respecto a la capacidad para unirse al órgano o tejido correspondiente en un sujeto humano demostrando, por ejemplo, que la molécula puede unirse también específicamente in vitro a una muestra del órgano o tejido seleccionado obtenida de un sujeto humano. Por tanto, pueden usarse métodos rutinarios para confirmar que una molécula que migra hacia un órgano identificada usando reconocimiento y selección in vivo en una animal experimental puede unirse también a una molécula diana específica en un sujeto humano. Además, tal puesta en contacto in vitro de una molécula que migra hacia un órgano con una muestra bajo sospecha de contener un órgano o tejido seleccionado puede identificar la presencia del órgano o tejido seleccionado en la muestra.

Además, con respecto a moléculas que migran hacia tumores, el experto en la técnica reconocería que una molécula que migra hacia un tumor identificada usando, por ejemplo, reconocimiento y selección in vivo en un ratón que tiene un tumor murino de un tipo histológico definido tal como un melanoma, se uniera también a la molécula diana correspondiente en un melanoma en un humano u otras especies de mamíferos. Además, una molécula que migra hacia un tumor que se une a una molécula diana presente en la vascularización en un tumor crecido en un ratón puede unirse probablemente también a la molécula diana correspondiente en la vascularización de un tumor en un humano u otro sujeto mamífero. Una molécula que migra hacia un tumor identificada usando reconocimiento y selección in vivo en un animal experimental puede examinarse fácilmente con respecto a la capacidad para unirse a un tumor correspondiente en un paciente humano demostrando, por ejemplo, que la molécula puede unirse también específicamente in vitro a una muestra del tumor obtenida del paciente. Por tanto, pueden usarse métodos rutinarios para confirmar que una molécula que migra hacia un tumor identificada usando reconocimiento y selección in vivo en una animal experimental puede unirse también a una molécula diana en un tumor humano.

Los pasos de administrar la biblioteca al sujeto, recoger un órgano o tejido seleccionado e identificar las moléculas que migran al órgano o tejido seleccionado, comprenden una única ronda de reconocimiento y selección in vivo. Aunque no se requiere, se realizan generalmente uno o más rondas adicionales de reconocimiento y selección in vivo. Cuando se realiza una ronda adicional de reconocimiento y selección in vivo, las moléculas recuperadas del órgano o tejido seleccionado en la ronda previa se administran al sujeto, que puede ser el mismo sujeto usado en la ronda previa, cuando se haya recogido sólo una parte del órgano o tejido seleccionado.

Realizando una segunda ronda de reconocimiento y selección in vivo, puede determinarse la selectividad relativa de unión de las moléculas recuperadas de la primera ronda administrando las moléculas identificadas a un sujeto, recogiendo el órgano o tejido seleccionado, y determinando si se recupera más fago del órgano o tejido en comparación con la primera ronda de reconocimiento y selección. Además, si se desea, puede recogerse un órgano o tejido seleccionado control y usarse como base para comparar las moléculas recuperadas del órgano seleccionado con las recuperadas del órgano control. Una ronda adicional de reconocimiento y selección in vivo puede indicar también si las moléculas identificadas del órgano o tejido seleccionado inicialmente pueden migrar también a órganos o tejidos adicionales, definiéndose así una familia de órganos o tejidos seleccionados. Pueden realizarse rondas adicionales de reconocimiento y selección según se desee.

Idealmente, no se recuperan moléculas de un órgano o tejido control tras una segunda o subsiguiente ronda de reconocimiento y selección in vivo. Generalmente, sin embargo, habrá una proporción de moléculas presentes también en un órgano o tejido control. En este caso, puede determinarse la relación entre las moléculas en el órgano seleccionado en comparación con el órgano control (seleccionado:control). Como se ha descrito anteriormente, por ejemplo, los fagos que migraron hacia el cerebro después de una primera ronda de reconocimiento y selección in vivo demostraron un enriquecimiento de 13 veces en la migración hacia el órgano seleccionado en comparación con el órgano control, riñón, después de dos rondas adicionales de reconocimiento y selección (Ejemplo II).

Las rondas adicionales de reconocimiento y selección in vivo pueden usarse para determinar si una molécula particular migra sólo hacia el órgano o tejido seleccionado o puede reconocer una diana sobre el órgano seleccionado que se expresa también en otro u otros órganos o tejidos seleccionados diferentes o es suficientemente similar a la diana en el órgano o tejido seleccionado originariamente. Cuando se encuentra que una molécula dirige la migración hacia órganos o tejidos adicionales al órgano seleccionado originariamente, se considera que los órganos o tejidos constituyen una familia de órganos o tejidos seleccionados. Usando el método de reconocimiento y selección in vivo, pueden definirse las moléculas que migran hacia sólo un único órgano o tejido seleccionado y las moléculas que migran hacia una familia de órganos o tejidos seleccionados. Tal identificación se acelera recogiendo varios órganos o tejidos durante rondas subsiguientes de reconocimiento y selección in vivo.

Tal como se usa en la presente memoria, el término "órgano o tejido seleccionado" se usa en su sentido más amplio para significar un órgano o tejido al que una molécula migra selectivamente. Además, el término "órgano o tejido" se usa ampliamente para significar un órgano, tejido o tipo celular, incluyendo una célula cancerígena, en cuyo caso el órgano o tejido seleccionado puede ser un tumor tal como un tumor primario o una lesión metastásica. En general, un órgano o tejido seleccionado contiene una célula que expresa una molécula diana particular, tal como un receptor de superficie celular al que una molécula que migra hacia el órgano puede unirse. Realizando al menos dos rondas de reconocimiento y selección in vivo, puede determinarse la selectividad de migración de la molécula hacia el órgano o tejido seleccionado (véase el Ejemplo II). Como se ha discutido anteriormente, sin embargo, en algunos casos una molécula que migra hacia un órgano puede migrar selectivamente hacia más de un órgano o tejido seleccionado, en cuyo caso se considera que la molécula es capaz de migrar selectivamente hacia una familia de órganos o tejidos seleccionados.

El término "órgano o tejido control" se usa para significar un órgano o tejido distinto del órgano o tejido seleccionado. Un órgano o tejido control se caracteriza por la incapacidad de la molécula que migra hacia un órgano para migrar hacia el órgano o tejido control. Un órgano o tejido control es útil para identificar la unión no específica de una molécula. Un órgano o tejido control puede recogerse, por ejemplo, para identificar la unión no específica de la molécula o para determinar la selectividad de migración de la molécula (véanse los Ejemplos I y II). Además, la unión no específica puede determinarse administrando, por ejemplo, una molécula control, que se sabe que no migra hacia un órgano o tejido pero que es químicamente similar a una molécula que migra hacia un órgano potencial. Alternativamente, cuando las moléculas administradas están enlazadas a un soporte, la administración de los soportes, solos, puede usarse para identificar la unión no específica. Por ejemplo, un fago que expresa la proteína del gen III, sola, pero que no contiene una proteína de fusión con el péptido, puede someterse a escrutinio por reconocimiento y selección in vivo para determinar el nivel de unión no específica del soporte fágico.

En algunos casos, puede llevar varias rondas de reconocimiento y selección in vivo identificar un órgano o tejido control, puesto que una molécula que migra selectivamente hacia un órgano o tejido seleccionado originariamente puede tener también la capacidad para migrar selectivamente hacia órganos o tejidos adicionales, definiendo así una familia de órganos o tejidos seleccionados. La capacidad de una molécula para migrar hacia uno o hacia una familia de órganos o tejidos seleccionados permite la preparación de paneles de moléculas que migran hacia órganos, en los que moléculas individuales migran de manera variada a un órgano o tejido seleccionado o a cualquiera de una familia de órganos o tejidos seleccionados con selectividad variable.

Además, puede ser útil determinar si una molécula que migra selectivamente hacia un tipo particular de tumor migra también selectivamente hacia el tejido normal del que deriva el tumor. Puede ser deseable, por ejemplo, determinar si una molécula que migra hacia un tumor de mama migra también hacia tejido de mama normal. Por tanto, cuando se usa reconocimiento y selección in vivo para identificar una molécula que migra hacia un tumor, puede examinarse una muestra del tejido normal equivalente al tumor para determinar si la migración de la molécula es selectiva para una molécula diana expresada sólo por las células tumorales o el tejido vascular presente en el tumor, o es selectiva para una molécula diana que se expresa normalmente en el órgano o tejido del que deriva el tumor.

En general, se prepara una biblioteca de moléculas, que contiene una población diversa de moléculas de interés al azar o distribuidas selectivamente al azar, y a continuación se administra al sujeto. A un tiempo seleccionado después de la administración, el sujeto se sacrifica y se recoge un órgano o tejido seleccionado o parte del órgano o tejido de tal forma que las moléculas presentes en el órgano o tejido seleccionado puedan identificarse. Por ejemplo, se inyectó a un ratón una biblioteca de péptidos expresados en fagos, a continuación, después de aproximadamente 1 a 4 minutos, el ratón se anestesió, se congeló en nitrógeno líquido para poner fin a la circulación de los fagos, se recogió un órgano (cerebro o riñón; véanse los Ejemplos I y II) o tejido seleccionado (tumor de mama o melanoma; véase el Ejemplo III), se recuperaron los fagos presentes en el órgano seleccionado y se identificaron los péptidos que migraban selectivamente hacia el órgano o tejido seleccionado.

En los ejemplos proporcionados, los animales se sacrificaron para recoger el órgano o tejido seleccionado. Debe reconocerse, sin embargo, que sólo se necesita recoger una parte del órgano seleccionado para recuperar una molécula que migra hacia ese órgano. Por ejemplo, puede recogerse una parte del órgano o tejido seleccionado por biopsia, de tal forma que una molécula tal como un péptido expresado por un fago, pueda administrarse al mismo sujeto una segunda vez o más, según se desee. Cuando la molécula que se va a administrar una segunda vez al mismo sujeto está enlazada, por ejemplo, a un soporte o a una etiqueta, el soporte o etiqueta debe ser no tóxico y debería ser biodegradable, para no interferir con rondas subsiguientes de escrutinio.

El escrutinio in vitro de bibliotecas de fagos se ha usado previamente para identificar péptidos que se unen a anticuerpos o a receptores de superficie celular (Smith y Scott, ut supra, 1993). Por ejemplo, se ha usado el escrutinio in vitro de bibliotecas de péptidos expresados en fagos para identificar péptidos novedosos que se unían específicamente a receptores de adhesión de integrina (Koivunen et al., J. Cel. Biol. 124:373-380 (1994a)) y al receptor de la uroquinasa humano (Goodsen et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 91:7129-7133 (1994)). Sin embargo, tales estudios in vitro no proporcionan avances sobre si un péptido que puede unirse específicamente a un receptor seleccionado in vitro se unirá también al receptor in vivo o si el péptido de unión o el receptor son únicos de un órgano específico en el cuerpo. Además, los métodos in vitro se realizan usando moléculas diana definidas, bien caracterizadas, en un sistema artificial. Por ejemplo, Goodson et al., utilizaron células que expresan un receptor de uroquinasa recombinante. Por tanto, los métodos in vitro requieren un conocimiento anterior de la molécula diana y proporcionan muy poca, si acaso alguna, información acerca de la utilidad in vivo. Por el contrario, el método de reconocimiento y selección in vivo descrito en la presente memoria no requiere un conocimiento anterior o disponibilidad de una molécula diana y, por lo tanto, proporciona una ventaja significativa sobre métodos previos identificando moléculas que migran selectivamente in vivo y la molécula diana presente en un órgano o tejido.

Aunque el mecanismo por el cual el método descrito de reconocimiento y selección in vivo funciona no se ha definido completamente, una posibilidad es que una molécula tal como un péptido expresado en un fago reconozca y se una a una molécula diana presente sobre las células endoteliales que recubren los vasos sanguíneos en un órgano seleccionado. La evidencia indica, por ejemplo, que los tejidos vasculares en varios órganos difieren unos de otros y que tales diferencias pueden estar implicadas en la regulación del tráfico celular en el cuerpo. Por ejemplo, los linfocitos migran hacia los nódulos linfáticos u otros tejidos linfoides debido, en parte, a la expresión de moléculas de "domicilio" (en inglés "address") específicas por la célula endotelial en esos tejidos (Salmi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:11436-11440 (1992)). Similarmente, varios leucocitos pueden reconocer sitios de inflamación debido, en parte, a la expresión de marcadores de células endoteliales inducidos por señales inflamatorias (véanse Butcher y Picker, Science 272:60-66 (1996); Springer, Cell 76:301-314 (1994)). Además, el endotelio presente en los glomérulos del riñón contiene una proteína de unión para el péptido natriurético atrial (véase Lewicki y Protter, en "Hypertension, Pathophysiology, Diagnosis and Management" 2ª ed (Raven Press 1995), capítulo 61). Por tanto, los marcadores de células endoteliales proporcionan una diana potencial para dirigir, por ejemplo, un fármaco hacia un órgano particular en un sujeto.

En algunos casos, la metástasis de células cancerosas en órganos específicos puede deberse también al reconocimiento por parte de la célula tumoral de un marcador específico de órgano, incluyendo marcadores específicos de células endoteliales (Fidler y Hart, Science 217:998-1003 (1982)). El patrón de metástasis de muchos cánceres puede explicarse suponiendo que las células tumorales en circulación quedan atrapadas de forma preferencial en el primer lecho vascular que encuentran. Por tanto, los pulmones y el hígado son los sitios más frecuentes de metástasis cancerosa. Sin embargo, algunos cánceres muestran patrones de metástasis que no se explican por la vía circulatoria. La metástasis de tales cánceres puede deberse, en cambio, a la presencia de moléculas de domicilio expresadas selectivamente tales como moléculas de superficie de células endoteliales expresadas en el órgano en el cual el cáncer produce la metástasis (véanse Goetz et al., Intl. J. Canc. 65:192-199 (1996); Zhu et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 88:9568-9572 (1991); Pauli et al., Canc. Metast. Rev. 9:175-189 (1990); Nicolson, Biochim. Biophys. Acta 948:175-224 (1988)). La identificación de moléculas que se unen a tales marcadores de células endoteliales específicos de órgano puede proporcionar medios de prevenir la metástasis de células tumorales en el órgano particular.

Se seleccionó un tumor de mama como órgano o tejido seleccionado para identificar fagos que expresan péptidos que migran selectivamente hacia este órgano o tejido seleccionado porque los vasos sanguíneos en este órgano tienen características únicas. Además, la vascularización en un tumor experimenta generalmente angiogénesis activa, dando como resultado la formación continua de nuevos vasos sanguíneos para apoyar al tumor en crecimiento. Tales vasos sanguíneos angiogénicos se distinguen de la vascularización madura en que la vascularización angiogénica expresa marcadores de superficie de células endoteliales únicos, incluyendo la integrina \alpha_{v}\beta_{3} (Brooks, Cell 79:1157-1164 (1994)) y receptores para factores de crecimiento angiogénico (Mustonen y Alitalo, J. Cell Biol. 129:895-898 (1995); Lappi, Semin. Canc. Biol. 6, 279-288 (1995)). Además, la vascularización tumoral se distingue histológicamente de los vasos sanguíneos en general en que la vascularización tumoral está fenestrada (Folkman, Nat. Med. 1:27-31 (1995); Rak et al., Anticancer Drugs 6:3-18 (1995)). Por tanto, las características únicas de la vascularización tumoral la hacen una diana particularmente atractiva para determinar si una molécula que migra específicamente hacia un tumor puede identificarse por reconocimiento y selección in vivo. Tal molécula que migra hacia un tumor puede ser útil para dirigir un agente tal como un fármaco quimioterapéutico hacia un tumor, a la vez que se reduce la probabilidad de que el agente tenga un efecto tóxico sobre los órgano o tejidos normales, sanos. Además, una molécula que migra selectivamente hacia la vascularización tumoral puede tener uso también en dirigirse hacia otros tipos de neovascularizaciones tales como las presentes en tejidos inflamatorios, en regeneración o heridos.

Usando reconocimiento y selección in vivo, se identificaron fagos que expresaban varios péptidos que migraban selectivamente hacia un tumor de mama (véase la Tabla 3). Debido al gran tamaño de los fagos (300 nm) y el corto tiempo que se dejó circular a los fagos, es improbable que un número sustancial de fagos hubieran abandonado el sistema circulatorio. Por tanto, las moléculas que migran hacia órganos que se identificaron migraron probablemente hacia y se unieron principalmente a marcadores de células endoteliales que se expresan de manera específica de órgano (véase, por ejemplo, Springer, Cell 76:301-314 (1994)). Estos resultados indican que el reconocimiento y selección in vivo puede usarse para identificar y analizar las especificidades de las células endoteliales.

Aunque las condiciones en las cuales se realizaron los reconocimientos y selecciones in vivo identificaron péptidos que migran hacia órganos que se unen generalmente a marcadores de células endoteliales, la unión específica de fagos que expresan péptidos que migran hacia tumores se observó también en el parénquima tumoral, indicando que pueden identificarse también moléculas diana expresadas sobre células específicas en un órgano o tejido (véase el Ejemplo III). Estos resultados indican que los fagos que expresan los péptidos pueden atravesar o salirse de los vasos sanguíneos en el tumor, debido posiblemente a la naturaleza fenestrada de los vasos sanguíneos. Varios órganos normales tal como el hígado contienen también una vascularización que permite, por ejemplo, que los fagos que expresan los péptidos contacten con ciertas células del parénquima. Por tanto, el reconocimiento y selección in vivo puede ser útil para identificar moléculas que migran hacia células o tipos de tejido particulares en un órgano así como hacia células endoteliales.

Las bibliotecas de péptidos expresados en fagos se construyeron esencialmente como se describe en Smith y Scott (ut supra, 1993; véase, también, Koivunen et al., Biotechnology 13:265-270 (1995)). Se sintetizaron oligonucleótidos que codificaban péptidos que tenían secuencias de aminoácidos sustancialmente aleatorios basándose en un codón "NNK", en el que "N" es A, T, C ó G y "K" es G ó T. "NNK" codifica 32 tripletes, que codifican los veinte aminoácidos y un codón de terminación ámbar (Scott y Smith, ut supra, 1990). Se incluyó también al menos un codón que codificaba cisteína en cada oligonucleótido para que pudieran formarse péptidos cíclicos a través de puentes disulfuro (véase el Ejemplo I). Los oligonucleótidos se insertaron en el marco de lectura de la secuencia que codifica la proteína del gen III (gIII) en el vector fuse 5 de tal forma que pueda expresarse una proteína de fusión péptido-gIII. Después de la expresión, la proteína de fusión se expresa sobre la superficie del fago que contiene el vector (Smith y Scott, ut supra, 1993; Koivunen et al., ut supra, 1994b).

Sorprendentemente, después del reconocimiento y selección in vivo, los fagos que migraban selectivamente hacia tumores expresaron sólo unas pocas secuencias peptídicas diferentes (véanse la Tabla 3 y el Ejemplo III). En algunos casos, péptidos que tenían la misma secuencia de aminoácidos estaban codificados por fagos que tenían diferentes secuencias de oligonucleótidos que codificaban el péptido. Estos resultados demuestran que es el péptido expresado por el fago, más que alguna propiedad mutante casual del fago, el que dirige la migración hacia el órgano o tejido seleccionado.

Las secuencias de los motivos que migran hacia tumores no revelan similitud significativa alguna con ligandos conocidos para los receptores de células endoteliales, ni se parecen a secuencia alguna de las relacionadas en varios bancos de datos.

Se usó reconocimiento y selección in vivo para identificar las moléculas que migran selectivamente hacia un tumor. Se inyectó una biblioteca de fagos a ratones portadores de un tumor de mama y se recuperaron los fagos que migraron hacia el tumor de mama y se determinaron los péptidos para 14 fagos (véase el Ejemplo III.A.). Los 14 fagos expresaban cuatro péptidos diferentes, incluyendo el péptido CGRECPRLCQSSC (SEC ID Nº 48), que fue expresado por seis de los 14 fagos.

La identificación de péptidos que migran hacia tumores de mama que contienen motivos potenciales de unión a integrina tales como "RE" y "NGR" indica que el reconocimiento y selección in vivo puede ser útil para identificar péptidos que se unen a integrina (véase Koivunen et al., ut supra, 1995). La integrina \alpha_{v}\beta_{3}, por ejemplo, se expresa en los vasos sanguíneos que experimentan angiogénesis pero no en células endoteliales en reposo. La unión de un péptido o antagonista de tipo anticuerpo a la integrina \alpha_{v}\beta_{3} induce la apoptosis de los vasos angiogénicos, posiblemente interrumpiendo una señal transducida dentro de las células endoteliales que están proliferando como resultado de la unión de la integrina \alpha_{v}\beta_{3} a la matriz extracelular (Brooks, et al., ut supra, 1994).

Puesto que la integrina \alpha_{v}\beta_{3} es expresada por las células endoteliales en la vascularización angiogénica, se realizaron experimentos para determinar si la vascularización tumoral que está experimentando angiogénesis puede alcanzarse como diana in vivo usando métodos como los descritos en la presente memoria. Se inyectaron fagos que expresan el péptido CDCRGDCFC (SEC ID Nº 57; "fagos RGD"; véase Koivunen et al., ut supra, 1995), que se sabe que se une a la integrina \alpha_{v}\beta_{3}, en ratones portadores de tumores formados a partir de células de carcinoma de mama humano, células de melanoma humano o células de melanoma de ratón (véase el Ejemplo IV). Los fagos RGD migraron selectivamente hacia cada uno de los tumores, mientras que tal migración no tuvo lugar con los fagos control. Por ejemplo, en ratones portadores de tumores formados por implantación de células de carcinoma de mama humano, un número de veinte a ochenta veces mayor de fagos RGD,

\hbox{en
comparación con fagos control no seleccionados, se acumularon en el
tumor.}

La tinción de tejidos para detectar los fagos mostró acumulación de los fagos RGD en los vasos sanguíneos del tumor, mientras que no se observó tinción en el cerebro o riñón (órganos control). La especificidad de la migración hacia los tumores de los fagos RGD se demostró por experimentos de competición, en los que la inyección conjunta del péptido que contenía RGD redujo enormemente la migración hacia los tumores de los fagos RGD, mientras que la inyección conjunta de un péptido control que no contenía RGD no tuvo efecto sobre la migración de los fagos RGD (véase el Ejemplo IV). Estos resultados demuestran que la molécula diana \alpha_{v}\beta_{3} se expresa sobre la superficie del conducto de células endoteliales en un tumor y que un péptido que se une a una integrina que contiene \alpha_{v} puede unirse selectivamente a esta integrina y, por tanto, a la vascularización que experimenta angiogénesis. A la vista de estos resultados, el experto en la técnica reconocerá que un péptido RGD o un anticuerpo que se une a una integrina \alpha_{v}, tal como el anticuerpo monoclonal LM609, que se une a una integrina \alpha_{v}\beta_{3} (véase Brooks, et al., ut supra, 1994), puede usarse para hacer diana en un órgano o tejido que contiene vascularización angiogénica, incluyendo un tumor que contiene vascularización angiogénica.

La capacidad de una molécula que migra hacia un tumor particular para migrar selectivamente hacia otro tumor del mismo o similar tipo histológico puede determinarse usando, por ejemplo, tumores humanos crecidos en ratones carentes de sistema inmune o tumores de ratones crecidos en ratones singénicos para estos experimentos. Por ejemplo, varias líneas celulares de cáncer de mama humano, incluyendo el carcinoma de mama MDA-MB-435 (Price et al., Cancer Res. 50:717-721 (1990)), SKBR-1-II y SKBR-3 (Fogh et al., J. Natl. Cancer Inst. 59:221-226 (1975)), y líneas de tumor mamario de ratón, incluyendo EMT6 (Rosen et al., Intl. J. Cancer 57:706-714 (1994)) y C3-L5 (Lala y Parhar, Intl. J. Cancer 54:677-684 (1993)), están fácilmente disponibles y se usan comúnmente como modelos para cáncer de mama humano. Usando tales modelos de tumor de mama, por ejemplo, puede obtenerse información relativa a la especificidad de una molécula identificada que migra hacia un tumor de mama con respecto a diversos tumores de mama y pueden identificarse las moléculas que migran hacia una amplia gama de tumores de mama diferentes o que proporcionan los perfiles de especificidad más favorables. Además, tales análisis pueden proporcionar nueva información, por ejemplo, acerca del estroma tumoral, puesto que la expresión génica en las células del estroma, igual que la de las células endoteliales, puede ser modificada por el tumor de formas que no pueden reproducirse in vitro.

La migración selectiva de una molécula tal como un péptido o proteína hacia un órgano o tejido seleccionado puede deberse al reconocimiento específico por parte del péptido de una molécula diana de una célula particular tal como un receptor de superficie celular presente sobre una célula en el órgano o tejido. La selectividad de la migración depende de que la molécula diana particular se exprese en sólo uno o algunos tipos celulares diferentes, de tal forma que la molécula migra sólo hacia uno o algunos órganos o tejidos. Como se ha discutido anteriormente, los péptidos identificados que migran hacia tumores, al menos en parte, reconocen probablemente marcadores de superficie de células endoteliales en los vasos sanguíneos presentes en estos órganos o tejidos. Sin embargo, los tipos celulares más diferentes, particularmente los tipos celulares que son únicos para un órgano o tejido, pueden expresar moléculas diana únicas. Por tanto, en órganos tales como el hígado, el bazo o el nódulo linfático, donde la sangre circula a través de sinusoides formados por las células específicas del órgano, el reconocimiento y selección in vivo puede ser útil para identificar moléculas que migran hacia el órgano particular.

Los péptidos de la invención pueden usarse para dirigir un componente hacia un tumor de mama enlazando el componente a la molécula. Tal como se usa en la presente memoria, el término "componente" (en inglés "moiety") se usa ampliamente para significar un material físico, químico o biológico que se enlaza a una molécula que migra hacia un órgano. Por ejemplo, un componente puede ser un agente tal como un fármaco o puede ser un microdispositivo con una cámara, que puede contener un agente. Además, un componente puede ser una molécula tal como una proteína o ácido nucleico, a la que se injerta una molécula que migra hacia un órgano con el propósito de dirigir la proteína o ácido nucleico hacia un órgano o tejido seleccionado. Por ejemplo, una molécula peptídica que migra hacia un órgano puede expresarse como una proteína de fusión con una proteína deseada de tal forma que el péptido dirija la proteína hacia un órgano seleccionado.

Un componente puede ser un marcador detectable tal como un radiomarcador o puede ser una gente citotóxico, incluyendo una toxina tal como una ricina o un fármaco tal como un agente quimioterapéutico o puede ser un material físico, químico o biológico tal como un liposoma, microcápsula, microbomba u otro microdispositivo con cámara, que puede usarse, por ejemplo, como sistema de suministro de un fármaco. Generalmente, tales microdispositivos deberían ser no tóxicos y, si se desea, biodegradables. Existen varios componentes, incluyendo microcápsulas, que pueden contener un agente, y métodos para unir un componente o microdispositivo con cámara a una molécula de la invención bien conocidos en la técnica y comercialmente disponibles (véanse, por ejemplo, "Remington's Pharmaceutical Sciences" 18ª ed. (Mack Publishing Co. 1990), capítulos 89-91; Harlow y Lane, Antibodies: A laboratory manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press 1988); véase, también, Hermanson, ut supra, 1996).

El enlazamiento de un componente a una molécula que migra hacia un órgano con el propósito de dirigir la migración del componente hacia el órgano o tejido seleccionado se ejemplifica por el enlazamiento de un péptido que migra hacia cerebro a un RBC, en el que el péptido dirigió la migración del RBC al cerebro (véase el Ejemplo II.D.). Estos resultados indican que una molécula que migra hacia un órgano de la invención puede enlazarse a otros tipos celulares o a un sistema de suministro físico, químico o biológico tal como un liposoma u otro dispositivo de encapsulamiento, que puede contener un agente tal como un fármaco, para dirigir el tipo celular o el sistema de suministro a un órgano o tejido seleccionado. Por ejemplo, una molécula que migra hacia un tumor identificada por reconocimiento y selección in vivo puede enlazarse a un glóbulo blanco (WBC, del inglés "White Blood Cell") tal como una célula T citotóxica o una célula destructora, en la que tras la administración del complejo molécula que migra hacia un tumor/WBC, la molécula dirige la migración del WBC al tumor, donde el WBC puede ejercer su función efectora. Similarmente, puede unirse una molécula que migra hacia un órgano a un liposoma o a una microcápsula que comprende, por ejemplo, una membrana permeable o semipermeable, en la que un agente tal como un fármaco para ser suministrado a un órgano o tejido seleccionado está contenido dentro del liposoma o
microcápsula.

En una realización, se enlaza una molécula que migra hacia un órgano a un componente que es detectable de manera externa al sujeto para realizar un estudio diagnóstico por adquisición de imágenes in vivo. Por ejemplo, la adquisición de imágenes in vivo usando un péptido que migra hacia cerebro marcado de forma detectable puede identificar una región en el cerebro donde la circulación está ocluida. Para tales estudios, puede enlazarse un radionucleido emisor de radiación gamma tal como indio-111 o tecnecio-99 a una molécula que migra hacia cerebro y, después de la administración a un sujeto, puede detectarse usando un detector de centelleo sólido. Alternativamente, puede enlazarse a la molécula un radionucleido emisor de positrones tal como carbono-11 o un marcador de espín paramagnético tal como carbono-13 y, después de la administración a un sujeto, puede detectarse la localización del componente/molécula usando tomografía transaxial de emisión de positrones o adquisición de imágenes de resonancia magnética, respectivamente.

Tales métodos de adquisición de imágenes in vivo pueden usarse también para identificar la presencia de cáncer en un sujeto enlazando un componente apropiado a una molécula que migra hacia un tumor, que pueda reconocer una diana única expresada por las células tumorales o por los vasos sanguíneos formados por angiogénesis en el tumor. Tales métodos pueden identificar un tumor primario así como una lesión metastásica, que puede no ser detectable usando otros métodos. Habiendo identificado la presencia de tal cáncer, en otra realización de la invención, la molécula que migra hacia un tumor puede enlazarse a un agente citotóxico tal como ricina o un agente quimioterapéutico contra el cáncer para dirigir el componente al tumor o puede enlazarse a un microdispositivo con cámara, que puede contener, por ejemplo, un fármaco quimioterapéutico u otro agente citotóxico. Tal método puede permitir la destrucción selectiva del tumor, a la vez que no tocar sustancialmente los tejidos normales.

Cuando se administra a un sujeto, el complejo molécula/componente se administra como una composición farmacéutica que contiene, por ejemplo, el complejo y un portador farmacéuticamente aceptable. Los portadores farmacéuticamente aceptables son bien conocidos en la técnica e incluyen, por ejemplo, soluciones acuosas tales como agua o solución salina tamponada fisiológicamente u otros disolventes o vehículos tales como glicoles, glicerol, aceites tales como aceite de oliva o ésteres orgánicos inyectables.

Un portador farmacéuticamente aceptable puede contener compuestos fisiológicamente aceptables que actúan, por ejemplo, para estabilizar o para aumentar la absorción del complejo. Tales compuestos fisiológicamente aceptables incluyen, por ejemplo, carbohidratos, tales como glucosa, sacarosa o dextranos, antioxidantes, tales como ácido ascórbico o glutatión, agentes quelantes, proteínas de bajo peso molecular u otros estabilizadores o excipientes. El experto en la técnica sabrá que la elección de un portador farmacéuticamente aceptable, incluyendo un compuesto fisiológicamente aceptable, depende, por ejemplo, de la vía de administración de la composición. La composición farmacéutica puede contener también un agente tal como un agente terapéutico contra el cáncer.

Un experto en la técnica sabrá que una composición farmacéutica que contiene una molécula que migra hacia un órgano puede administrarse a un sujeto por varias vías, incluyendo, por ejemplo, vía oral o parenteral, tal como por vía intravenosa. La composición puede administrarse por inyección o por entubación. La composición farmacéutica puede ser también una molécula que migra hacia un órgano enlazada a liposomas u otras matrices poliméricas, que pueden tener incorporado a ellos, por ejemplo, un fármaco tal como un agente quimioterapéutico (Gregoriadis, Liposome Technology, Vol. 1 (CRC Press, Boca Raton, FL 1984)). Los liposomas, por ejemplo, que consisten en fosfolípidos u otros lípidos son no tóxicos, fisiológicamente aceptables y portadores que se metabolizan que son relativamente fáciles de preparar y administrar.

Para los métodos diagnósticos o terapéuticos descritos en la presente memoria, debe administrarse al sujeto una cantidad eficaz del complejo molécula/componente. Tal como se usa en la presente memoria, el término "cantidad eficaz" significa la cantidad del complejo que produce el efecto deseado. Una cantidad eficaz dependerá a menudo del componente enlazado a la molécula que migra hacia un órgano. Por tanto, puede requerirse una cantidad inferior de la molécula radiomarcada para la adquisición de imágenes en comparación con la cantidad de un complejo fármaco/molécula administrado para propósitos terapéuticos. Una cantidad eficaz de una molécula/componente particular para un propósito específico puede determinarse usando métodos bien conocidos por los expertos en la técnica.

La vía de administración de una molécula que migra hacia un órgano dependerá, en parte, de la estructura química de la molécula. Los péptidos, por ejemplo, no son particularmente útiles cuando se administran por vía oral porque pueden ser degradados en el tracto digestivo. Sin embargo, los métodos para modificar químicamente los péptidos para hacerlos menos susceptibles a la degradación por proteasas endógenas o más absorbibles a través del tracto alimentario son bien conocidos (véanse, por ejemplo, Blondelle et al., ut supra, 1995; Ecker y Crooke, ut supra, 1995; Goodman y Ro, ut supra, 1995). Tales métodos pueden realizarse con péptidos identificados por reconocimiento y selección in vivo. Además, los métodos para preparar bibliotecas de análogos peptídicos tales como péptidos que contienen D-aminoácidos; peptidomiméticos que consisten en moléculas orgánicas que mimetizan la estructura del péptido; o peptoides tales como peptoides vinílogos, son conocidos en la técnica y pueden usarse para identificar moléculas que migran hacia un órgano o tejido seleccionado y son estables para administración oral.

Las moléculas que migran hacia órganos obtenidas usando los métodos descritos en la presente memoria pueden ser útiles también para identificar la presencia de una molécula diana tal como un receptor de superficie celular o un ligando para un receptor, que es reconocido por el péptido que migra hacia un órgano, o para aislar sustancialmente la molécula diana. Por ejemplo, un péptido que migra hacia un órgano puede enlazarse a un soporte sólido tal como una matriz cromatográfica. El péptido enlazado puede usarse a continuación para cromatografía de afinidad pasando una muestra procesada apropiadamente de un órgano o tejido seleccionado por la columna para unir una molécula diana particular. La molécula diana, que forma un complejo con la molécula que migra hacia un órgano, puede eluirse a continuación de la columna y recogerse en forma sustancialmente aislada. La molécula diana sustancialmente aislada puede caracterizarse usando métodos bien conocidos. Una molécula que migra hacia un órgano puede enlazarse también a un componente detectable tal como un radionucleido, una molécula fluorescente, una enzima o biotina y puede usarse, por ejemplo, para someter a escrutinio una muestra para detectar la presencia de la molécula diana o para seguir la molécula diana durante varios pasos de aislamiento.

Los métodos descritos se usaron para identificar péptidos que migran selectivamente hacia un órgano o tejido seleccionado. Por tanto, la presente invención proporciona péptidos que migran hacia órganos, a saber, los péptidos que migran hacia un tumor de mama CGRECPRLCQSSC (SEC ID Nº 48), CGEACGGQCALPC (SEC ID Nº 49) y CNGRCVSGCAGRC (SEC ID Nº 50).

Debe reconocerse que se incluyeron restos de cisteína en los péptidos de tal forma que pudiera efectuarse la ciclación de los péptidos. En realidad, los péptidos que contienen al menos dos restos de cisteína se ciclan espontáneamente. Sin embargo, tales péptidos cíclicos pueden ser activos también cuando están presentes en forma lineal (véase, por ejemplo, Koivunen et al., J. Biol. Chem. 268:20205-20210 (1993)). Por tanto, en algunos casos uno o ambos restos de cisteína en un péptido pueden suprimirse sin afectar significativamente la actividad de migración hacia un órgano de un péptido de la invención. Similarmente, los restos de aminoácido N-terminal y C-terminal respecto al primer y último restos de cisteína, respectivamente, en un péptido pueden ser prescindibles sin alterar sustancialmente la actividad de migración del péptido. Los métodos para determinar la necesidad de un resto de cisteína o de restos de aminoácido N-terminal o C-terminal respeto a un resto de cisteína para la actividad de migración hacia un órgano de un péptido de la invención son rutinarios y bien conocidos en la técnica.

Un péptido que migra hacia un órgano es útil, por ejemplo, para dirigir un componente deseado hacia el órgano o tejido seleccionado como se ha discutido anteriormente. Además, un péptido que migra hacia un órgano puede usarse para identificar la presencia de una molécula diana en una muestra. Tal como se usa en la presente memoria, el término "muestra" se usa en su sentido más amplio para significar una célula, tejido, órgano o porción del mismo que se aísla del cuerpo. Una muestra puede ser, por ejemplo, una sección histológica o un espécimen obtenido por biopsia o células que se colocan o se adaptan a un cultivo de tejido. Si se desea, una muestra puede procesarse, por ejemplo, por homogeneización, que puede ser un paso inicial para aislar la molécula diana a la que se une una molécula que migra hacia un órgano.

Un péptido que migra hacia un órgano puede usarse para identificar la molécula diana.

El método de reconocimiento y selección in vivo descrito puede usarse para detectar cuatro clases diferentes de moléculas diana en tumores. Primero, porque la vascularización de un tumor sufre angiogénesis activa, pueden identificarse moléculas diana que son características de vascularización angiogénica, en general, o vascularización tumoral angiogénica, en particular. Segundo, pueden identificarse moléculas diana vasculares que son características del tejido de origen del tumor. Tercero, pueden identificarse moléculas diana que se expresan en la vascularización de un tipo particular de tumor. Cuarto, pueden identificarse moléculas diana del estroma tumoral o de células tumorales debido a la naturaleza fenestrada de la vascularización tumoral, que permite a las moléculas que migran hacia órganos potenciales abandonar la circulación y contactar el parénquima tumoral.

Como alternativa a usar una muestra de órgano o tejido, pueden usarse extractos de células endoteliales cultivadas como material de partida para intensificar la concentración del receptor en la muestra. La presencia del receptor puede establecerse usando ensayos de unión de fagos y fijación de células (véase, por ejemplo, Barry et al., Nat. Med. 2:299-305 (1996)).

Puede identificarse una línea celular que expresa un receptor particular y usarse la yodación de la superficie de las células para marcar el receptor. Las células pueden entonces someterse a extracción con octilglucósido y el extracto puede fraccionarse por cromatografía de afinidad usando un péptido que migra hacia cerebro (véase la Tabla 1) acoplado a una matriz tal como Sepharose^{TM}. Pueden usarse extractos preparados a partir de células HUVEC (células endoteliales de la vena umbilical humana, del inglés "Human Umbilical Vein Endothelial Cells") como control para las células endoteliales derivadas de cerebro. El receptor purificado puede ser microsecuenciado y pueden prepararse anticuerpos. Si se desea, pueden prepararse sondas de oligonucleótidos y usarse para aislar clones de cADN que codifiquen el receptor. Alternativamente, puede usarse un anticuerpo anti-receptor para aislar un clon de cADN de una biblioteca de expresión (véase Argraves et al., J. Cell Biol. 105:1183-1190 (1987), que se incorpora a la presente memoria por referencia).

Como alternativa a aislar el receptor, puede aislarse un ácido nucleico que codifique el receptor usando un sistema de clonación de expresión en células de mamífero tal como el sistema de células COS. Puede preparase una biblioteca apropiada, por ejemplo, usando mARN de células endoteliales de cerebro primarias (Lathey et al., Virology 176:266-273 (1990)). Los ácidos nucleicos pueden clonarse en el vector pcDNAI (Invitrogen), por ejemplo. Las células que expresan un cADN que codifica el receptor pueden seleccionarse por unión al péptido. El fago purificado puede usarse como portador del péptido y puede fijarse a perlas magnéticas revestidas, por ejemplo, con anticuerpos anti-M13 (Pharmacia). Las células que se unen al revestimiento de péptido pueden recuperarse usando un imán y los plásmidos pueden aislarse. Las preparaciones de plásmidos recuperadas pueden dividirse a continuación en combinados y examinarse en transfecciones de células COS. El procedimiento puede repetirse hasta que obtengan plásmidos únicos que puedan conferir a las célula COS la capacidad de unir el péptido.

Los siguientes ejemplos pretender ilustrar pero no limitar la presente invención.

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Ejemplo I

Reconocimiento y selección in vivo (fundamentos técnicos)

Este ejemplo demuestra métodos para preparar una biblioteca de fagos y someter a escrutinio la biblioteca usando reconocimiento y selección in vivo para identificar fagos que expresan péptidos que migran hacia un órgano o tejido seleccionado.

A. Preparación de bibliotecas de fagos

Se construyeron bibliotecas de expresión en fagos usando el vector fuse 5 como se describe en Koivunen et al. (ut supra, 1995; véase, también, Koivunen et al. Meth. Enzymol. 245:346-369 (1994b), que se incorpora a la presente memoria por referencia). Se prepararon seis bibliotecas que codificaban los péptidos designados CX_{5}C (SEC ID Nº 36), CX_{6}C (SEC ID Nº 37), CX_{7}C (SEC ID Nº 38), CX_{9} (SEC ID Nº 39), X_{2}CX_{14}CX_{2} (SEC ID Nº 40) y X_{2}CX_{18} (SEC ID Nº 41), donde "C" indica cisteína y "X_{N}" indica el número dado de aminoácidos individualmente seleccionados. Estas bibliotecas pueden expresar péptidos cíclicos cuando hay al menos dos restos de cisteína presentes en el
péptido.

Los oligonucleótidos se construyeron de tal forma que "C" estaba codificado por el codón TGT y "X_{N}" estaba codificado por NNK, donde "N" es mezclas molares iguales de A, C, G y T, y donde "K" es mezclas molares iguales de G y T. Por tanto, el péptido representado por CX_{5}C (SEC ID Nº 36) puede estar representado por un oligonucleótido que tiene la secuencia TGT(NNK)_{5}TGT (SEC ID Nº 42). Los oligonucleótidos se prepararon de cadena doble mediante 3 ciclos de amplificación por PCR, se purificaron y se ligaron al ácido nucleico que codifica la proteína del gen III en el vector fuse 5 de tal forma que, tras la expresión, el péptido está presente como una proteína de fusión en el extremo N-terminal de la proteína del gen III.

Los vectores se usaron para transfectar por electroporación células MC1061. Las bacterias se cultivaron durante 24 h en presencia de 20 \mug/ml de tetraciclina, y a continuación los fagos se recogieron del sobrenadante por precipitación dos veces usando polietilenglicol. Cada biblioteca contenía aproximadamente de 5 x 10^{9} a 5 x 10^{14} unidades de transducción (TU, del inglés "Transducing Units"; fagos recombinantes individuales).

B. Reconocimiento y selección in vivo de los fagos

Se diluyó una mezcla de bibliotecas de fagos que contenía 1 x 10^{14} TU en 200 \mul de DMEM y se inyectó en la vena de la cola de ratones BALB\c anestesiados (hembras de 2 meses de edad; Jackson Laboratories; Bar Harbor ME); se usó Avertin^{TM} (0,015 ml/g) como anestésico (véase Pasqualini y Ruoslahti, ut supra, 1996). Después de 1-4 minutos, los ratones se congelaron instantáneamente en nitrógeno líquido. Para recuperar los fagos, las carcasas se dejaron descongelar parcialmente a temperatura ambiente durante 1 h, se recogieron y pesaron los órganos, y a continuación se trituraron en 1 ml de DMEM-PI (DMEM que contenía inhibidores de proteasas (PI, del inglés "Protease Inhibitors"); fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF, del inglés "phenylmethylsulfonyl fluoride"; 1 mM), aprotinina (20 \mug/ml), leupeptina (1 \mug/ml)).

Las muestras de los órganos se lavaron 3 veces con DMEM-PI enfriado en hielo que contenía albúmina de suero bovino (BSA, del inglés "Bovine Serum Albumin") al 1%, y a continuación se incubaron directamente con 1 ml de bacterias K91-kan durante 1 h. Se añadieron 10 ml de medio NZY que contenía 0,2 \mug/ml de tetraciclina (NZY/tet) al cultivo bacteriano, la mezcla se incubó en un agitador a 37ºC durante 1 h, y a continuación se dispusieron alícuotas de 200 \mul en placas de agar que contenían 40 \mug/ml de tetraciclina (tet/agar).

Las colonias individuales que contenían fagos recuperados de cerebro o riñón se crecieron durante 16 h en 5 ml de NZY/tet. Los cultivos bacterianos obtenidos a partir de las colonias individuales se combinaron y los fagos se purificaron y se reinyectaron en ratones como se ha descrito anteriormente para una segunda ronda de reconocimiento y selección in vivo. Se realizó también una tercera ronda de reconocimiento y selección. Se purificó el ADN de los fagos de colonias bacterianas individuales obtenidas de la segunda y la tercera ronda de reconocimiento y selección in vivo y se determinaron las secuencias de ADN que codificaban los péptidos expresados por los fagos seleccionados (véase Koivunen et al., ut supra, 1994b).

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Ejemplo II

Caracterización de péptidos que migran hacia un órgano seleccionado

Este ejemplo demuestra que un péptido que migra hacia un órgano de la invención migra selectivamente hacia un órgano seleccionado y que un péptido que migra hacia un órgano identificado por reconocimiento y selección in vivo puede usarse para dirigir un componente hacia un órgano seleccionado.

A. El cerebro es el órgano seleccionado (fundamentos técnicos)

Se realizaron tres rondas de reconocimiento y selección in vivo en ratones. Se usó el riñón como órgano control. Se inyectaron a los ratones dos mezclas diferentes de bibliotecas de fagos. La primera mezcla contenía bibliotecas que codificaban los péptidos CX_{9} (SEC ID Nº 39), CX_{5}C (SEC ID Nº' 36), CX_{6}C (SEC ID Nº 37) y CX_{7}C (SEC ID Nº 38) (mezcla CX_{5-7}/CX_{9}; SEC ID Nos: 36-39). La segunda mezcla contenía bibliotecas que codificaban los péptidos X_{2}CX_{14}CX_{2} (SEC ID Nº 40) y X_{2}CX_{18} (SEC ID Nº 41) (mezcla X_{2}CX_{18}/X_{2}CX_{14}CX_{2}; SEC ID Nos: 40 y 41).

Las mezclas de bibliotecas de fagos se administraron a los ratones vía inyección en la vena de la cola. La entrada de fagos fue de 1 x 10^{16} TU de la mezcla CX_{5-7}/CX_{9} (SEC ID Nos: 36-39) ó 1 x 10^{14} TU de la mezcla X_{2}CX_{18}/X_{2}CX_{14}CX_{2} (SEC ID Nos: 40 y 41). Se recuperaron los fagos de los cerebros de los ratones inyectados, los fagos recuperados se amplificaron in vitro, y a continuación se realizó una segunda y una tercera ronda de reconocimiento y selección in vivo. Durante las rondas segunda y tercera de reconocimiento y selección, se recuperaron los fagos de cerebro y de riñón y se comparó el número de TU de cada órgano. Esta comparación reveló que se unieron a cerebro 6 veces más fagos de la mezcla CX_{5-7}/CX_{9} (SEC ID Nos: 36-39) que a riñón en la segunda ronda y que se unieron a cerebro 13 veces más de los fagos CX_{5-7}/CX_{9} (SEC ID Nos: 36-39) que a riñón en la tercera ronda de reconocimiento y selección. Después de la administración de la mezcla X_{2}CX_{18}/X_{2}CX_{14}CX_{2} (SEC ID Nos: 40 y 41), tuvo lugar un enriquecimiento de 11 veces y 8 veces en los fagos que migraban hacia el cerebro en comparación con el riñón durante las rondas segunda y tercera de reconocimiento y selección, respectivamente. Por tanto, se observó un enriquecimiento sustancial en los fagos que se unían a cerebro después de las rondas segunda y tercera de reconocimiento y selección in vivo.

Se determinaron las secuencias de aminoácidos para los insertos presentes en 73 fagos clonados que se recuperaron de cerebro durante las rondas segunda y tercera de reconocimiento y selección in vivo. Predominaron los péptidos que contenían un motivo SRL (36% de los clones secuenciados; véanse las SEC ID Nos: 1, 3 y 5), seguidos de los péptidos que contenían el motivo VLR (20,5% de los clones; véanse las SEC ID Nos: 4 y 16) y el péptido CENWWGDVC (SEC ID Nº2; 19% de los clones; véase la Tabla 1). Otros péptidos que tuvieron lugar mucho menos frecuentemente, pero que estuvieron presentes más de una vez, incluyeron CGVRLGC (SEC ID Nº6), CKDWGRIC (SEC ID Nº7), CLDW
GRIC (SEC ID Nº 8) y CTRITESC (SEC ID Nº 9). Otras ocho secuencias aparecieron sólo una vez cada una y no se caracterizaron adicionalmente. El motivo tripeptídico SRL estaba presente en varios contextos de secuencia diferentes, indicando que los ácidos nucleicos que codificaban los péptidos derivaban de varios fagos independientes. Estos resultados indican que la selección de los péptidos que contienen el motivo SRL representa la unión específica de varios fagos independientes que expresan péptidos con la secuencia SRL y no es un artefacto debido, por ejemplo, a la amplificación de los fagos. Además, en algunos casos, diferentes fagos expresaron péptidos que tenían la misma secuencia de aminoácidos, pero que estaban codificados por oligonucleótidos que tenían secuencias diferentes, confirmando por tanto que la migración de un

\hbox{fago particular a un órgano 
se debe al péptido específico expresado sobre el fago.}

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 1 Péptidos de fagos recuperados de cerebro

1

Para determinar la especificidad de la migración hacia cerebro de los motivos individuales identificados, los fagos que expresaban los motivos predominantes se amplificaron individualmente, se diluyeron al mismo título de entrada y se administraron a ratones. Después de la administración, se retiraron el cerebro y el riñón y se determinó el número de TU de fagos en cada órgano. La relación del enriquecimiento de los fagos recuperados del órgano seleccionado, cerebro, en comparación con el órgano control, riñón, reveló que los fagos que expresaban uno de los cuatro péptidos más recuperados, CNSRLHLRC (SEC ID Nº1), CENWWGDVC (SEC ID Nº 2), WRCVLREGPAGGCAWFNRHRL (SEC ID Nº16), CLSSRLDAC (SEC ID Nº 3), hacían diana cada uno selectivamente en cerebro en comparación con riñón. Específicamente, la relación de migración selectiva (cerebro:riñón) fue aproximadamente 8 para CNSRLHLRC (SEC ID Nº 1) y para CLSSRLDAC (SEC ID Nº 3), 4 para CENWWGDVC (SEC ID Nº 2) y 9 para WRCVLREG
PAGGCAWFNRHRL (SEC ID Nº 16). Dos fagos control mostraron baja unión tanto a cerebro como a riñón. Estos resultados demuestran que el reconocimiento y selección in vivo puede usarse para someter a escrutinio bibliotecas de expresión en fagos para identificar fagos que expresan péptidos que migran hacia un órgano seleccionado.

B. El riñón como órgano seleccionado (fundamentos técnicos)

La misma metodología usada para aislar fagos que expresan péptidos que migran hacia cerebro se usó para aislar fagos que expresan péptidos que migran hacia riñón. En estos experimentos, se usó el cerebro como órgano control. Se administró una mezcla de las bibliotecas CX_{5}C (SEC ID Nº 36) y CX_{6}C (SEC ID Nº 37) como se ha descrito anteriormente. Se obtuvo migración de los fagos hacia el riñón y se observó un enriquecimiento de aproximadamente 3 a 7 veces en los fagos que migraban hacia riñón

\hbox{después
de una segunda ronda de reconocimiento  y selección  in
vivo .}

Se determinaron las secuencias de aminoácidos para los insertos en 48 fagos clonados que migraron hacia riñón. Los péptidos expresados por estos fagos estaban representados por dos secuencias predominantes, CLPVASC (SEC ID Nº 21; 46% de los clones secuenciados) y CGAREMC (SEC ID Nº 22; 17% de los clones; véase la Tabla 2). Además, el péptido CKGRSSAC (SEC ID Nº 23) apareció tres veces y otros tres péptidos estuvieron presentes dos veces cada uno. Los fagos que expresaban un péptido CLPVASC (SEC ID Nº 21), CGAREMC (SEC ID Nº 22) ó CKGRSSAC (SEC ID Nº 23) mostraron cada uno migración selectiva hacia riñón; la relación de migración selectiva riñón:cerebro fue 7 para CLPVASC (SEC ID Nº 21), 3 para CGAREMC (SEC ID Nº 22) y 2 para CKGRSSAC (SEC ID Nº 23).

TABLA 2 Péptidos de fagos recuperados de riñón

2

Estos resultados demuestran que el método de reconocimiento y selección in vivo es un método aplicable en general para someter a escrutinio una biblioteca de fagos para identificar fagos que expresan péptidos que migran hacia un órgano seleccionado. Las búsquedas en bases de datos no revelaron ninguna homología significativa de los péptidos que migran hacia cerebro o que migran hacia riñón con ligandos conocidos para receptores de células endoteliales.

C. La migración de los péptidos es específica

Para confirmar la especificidad de un péptido para dirigir la migración hacia un órgano seleccionado, se realizaron experimentos de competición entre péptidos. Se sintetizó (Immunodynamics; La Jolla CA) el péptido cíclico, CLSSRLDAC (SEC ID Nº 3), que es uno de los péptidos que migra hacia cerebro (véase la Tabla 1) y se purificó por HPLC. Se examinó el efecto sobre la migración de los fagos que expresaban CLSSRLDAC (SEC ID Nº 3), CENWWGDVC (SEC ID Nº 2) ó WRCVLREGPAGGCAWFNRHRL (SEC ID Nº 16) hacia el cerebro para determinar si la administración conjunta del péptido sintético afectaba a la migración de los fagos.

Los fagos que expresaban CLSSRLDAC (SEC ID Nº 3), CENWWGDVC (SEC ID Nº 2) ó WRCVLREGPAGG
CAWFNRHRL (SEC ID Nº 16) se titularon hasta la misma concentración y se inyectaron 1x 10^{8} TU en ratones solos, o con 100 \mug del péptido cíclico sintético purificado CLSSRLDAC (SEC ID Nº 3). El péptido sintético CLSSRLDAC (SEC ID Nº 3) inhibió la migración de los fagos que expresaban CLSSRLDAC (SEC ID Nº 3) en aproximadamente un 60%. Este resultado demuestra que la migración de los fagos hacia el cerebro se debe específicamente a la expresión sobre los fagos del péptido CLSSRLDAC (SEC ID Nº 3).

El péptido sintético CLSSRLDAC (SEC ID Nº 3) inhibió también la migración de los fagos que expresaban el péptido WRCVLREGPAGGCAWFNRHRL (SEC ID Nº 16) en aproximadamente un 60%, pero no afectaron a la migración del fago CENWWGDVC (SEC ID Nº 2). Este resultado indica que los péptidos CLSSRLDAC (SEC ID Nº 3) y WRCVLREGPAGGCAWFNRHRL (SEC ID Nº 16) pueden reconocer la misma molécula diana en el cerebro, mientras que el péptido CENWWGDVC (SEC ID Nº 2) reconoce una diana diferente.

D. El péptido que migra hacia cerebro CLSSRLDAC (SEC ID Nº 3) dirige glóbulos rojos al cerebro (fundamentos técnicos)

El péptido cíclico sintético CLSSRLDAC (SEC ID Nº 3) (1 mg) se marcó con yodo-125 usando el reactivo de Bolton y Hunter (Amersham; Arlington Heights IL). El péptido marcado se purificó por HPLC de fase inversa en cartuchos Sep-Pak^{TM} (Waters, Millipore Corp.; Milford PA) y el ^{125}I-péptido (200 \mug) se acopló a 1 ml de RBC de oveja estabilizados con glutaraldehído (Sigma Chemical Co.; St. Louis MO) conforme a las instrucciones del fabricante.

Se inyectaron en la vena de la cola 50 \mul de ^{125}I-péptido/RBC (200.000 cpm), solos o con 10 mM de CLSSRLDAC (SEC ID Nº 3), que es un péptido que migra hacia cerebro, ó CVRLNSLAC (SEC ID Nº 43), que no tiene actividad de migración hacia cerebro, sin marcar. Después de 2 min, cada ratón se prefundió a través del corazón con 50 ml de DMEM y el cerebro y el riñón se retiraron y se ensayaron para detectar la radiactividad.

Aproximadamente dos veces más del complejo CLSSRLDAC/RBC (SEC ID Nº 3) migró hacia cerebro que hacia riñón. La administración conjunta de CLSSRLDAC (SEC ID Nº 3) sin marcar con el complejo inhibió prácticamente completamente la migración hacia el cerebro del complejo pero no tuvo efecto sobre la localización del complejo en el riñón, indicando que la localización del complejo en el riñón era no específica. La administración conjunta de CVRLNSLAC (SEC ID Nº 43) sin marcar no tuvo efecto sobre la migración selectiva del complejo hacia el cerebro y no tuvo efecto sobre la localización no específica del complejo en el riñón. Estos resultados demuestran que un péptido que migra hacia un órgano identificado usando reconocimiento y selección in vivo puede enlazarse a un componente tal como un glóbulo rojo y que dirige selectivamente la migración del componente enlazado hacia el órgano seleccionado.

E. Reconocimiento y selección in vivo para moléculas que migran selectivamente hacia un órgano que contiene un componente del sistema reticuloendotelial

Este ejemplo demuestra que la absorción intensificada de fagos que expresan péptidos por el RES en hígado y bazo puede bloquearse por administración conjunta de fagos no infectivos, permitiendo así la identificación de moléculas que migran selectivamente hacia un órgano que contiene RES.

Se inyectaron, por vía intravenosa, aproximadamente 1 x 10^{8} TU de fagos amplificados que expresaban una biblioteca de CX_{9} (SEC ID Nº 39) a ratones, bien solos o con un exceso de 1000 veces de fagos no infectivos, que no son amplificables. Después de 2 min, los ratones se sacrificaron y se rescataron los fagos del hígado, pulmón, riñón, cerebro y bazo, y se determinó el número de fagos (TU) por gramo (TU/g) de tejido recuperado.

La administración conjunta de fagos no infectivos con la biblioteca de fagos redujo sustancialmente la cantidad de fagos recuperados en hígado de aproximadamente 1300 TU/g a aproximadamente 200 TU/g y, en bazo, de aproximadamente 300 TU/g a aproximadamente 200 TU/g. Por el contrario, se observó poca o ninguna diferencia en el número de fagos recuperados de cerebro, riñón o pulmón cuando la biblioteca de fagos se administró sola o en combinación con los fagos no infectivos. Este resultado demuestra que la absorción no específica de fagos por órganos tales como el hígado y el bazo, que contienen un componente del RES, puede bloquearse por la administración conjunta de fagos no infectivos con una biblioteca de fagos.

Estos resultados demuestran también que la absorción de fagos por el pulmón era selectiva. Específicamente, la recuperación de fagos del pulmón fue esencialmente idéntica tanto si la biblioteca de fagos se inyectaba sola como si se administraba conjuntamente con fagos no infectivos. Por tanto, la alta absorción de fagos previamente observada en el pulmón (Pasqualini y Rouslahti, ut supra, 1996) se debe probablemente a la gran cantidad de vascularización en los pulmones y no es, por ejemplo, debida a la absorción de los fagos por los fagotitos alveolares, que constituyen un componente del RES en el pulmón.

Para demostrar que los fagos que migraban hacia hígado cuando se administraban conjuntamente con fagos no infectivos, migraban en realidad selectivamente hacia el hígado, se administró conjuntamente una biblioteca de fagos con fagos no infectivos, y a continuación los fagos recuperados del hígado después de una primera ronda de reconocimiento y selección in vivo se amplificaron in vitro y se usaron para una segunda ronda de reconocimiento y selección in vivo. Los fagos de hígado y de cerebro (órgano control) se recuperaron y se cuantificaron después de cada ronda de reconocimiento y selección in vivo.

Después de la segunda ronda de reconocimiento y selección in vivo, más fagos migraron hacia el hígado (350 TU/g) en comparación con el cerebro (200 TU/g). Además, se recuperaron aproximadamente 150 TU/g de hígado después de la primera ronda, mientras que se recuperaron aproximadamente 350 TU/g de hígado después de la segunda ronda, indicando que la población de fagos recuperados del hígado después de la primera ronda de reconocimiento y selección in vivo estaba enriquecida en fagos que migran selectivamente hacia hígado. Estos resultados demuestran que el componente del RES de un órgano tal como el hígado puede bloquearse, permitiendo así el uso del método de reconocimiento y selección in vivo para identificar una molécula que migra selectivamente hacia tal órgano.

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Ejemplo III

Caracterización de péptidos que migran hacia un tejido tumoral seleccionado

Este ejemplo demuestra que el reconocimiento y selección in vivo puede usarse para identificar péptidos que migran hacia un tumor de mama o hacia un melanoma.

A. Péptidos que migran hacia un tumor de tipo carcinoma de mama humano implantado en un ratón carente de sistema inmune

Se inocularon células de carcinoma de mama 435 humano (Price et al., Cancer Res. 50:717-721 (1990)) en el relleno graso de la mama de ratones carentes de sistema inmune. Cuando los tumores alcanzaron un diámetro de aproximadamente 1 cm, se realizó un experimento con fagos dirigidos, en el que se administraron al ratón portador del tumor fagos que expresaban un péptido específico, o bien se realizó reconocimiento y selección in vivo.

Se inyectaron a los ratones portadores del tumor de mama 1 x 10^{9} fagos que expresaban una biblioteca de péptidos CX_{3}CX_{3}CX_{3}C (SEC ID Nº 47), donde X_{3} indica tres grupos de aminoácidos aleatorios seleccionados independientemente. Se dejó circular a los fagos durante 4 min, y a continuación los ratones se anestesiaron, se congelaron instantáneamente en nitrógeno líquido mientras estaban bajo el efecto de la anestesia, y el tumor se retiró. Se aislaron los fagos del tumor y se sometieron a dos rondas adicionales de reconocimiento y selección in vivo.

Después de la tercera ronda de reconocimiento y selección, los fagos se cuantificaron y se determinaron las secuencias peptídicas expresadas por 14 fagos clonados diferentes. Los 14 fagos clonados expresaban 4 péptidos diferentes (Tabla 3). Estos resultados demuestran que el método de reconocimiento y selección in vivo puede identificar moléculas que migran selectivamente hacia tejido tumoral de mama.

TABLA 3 Péptidos de fagos recuperados de cáncer de mama humano

3

B. Péptidos que migran hacia células de melanoma de ratón B16 implantadas en un ratón (fundamentos técnicos)

La aplicabilidad general del método de reconocimiento y selección in vivo para identificar péptidos que migran selectivamente hacia un tumor se examinó realizando reconocimiento y selección in vivo en ratones portadores de un tumor de tipo melanoma de ratón implantado.

Los ratones portadores de melanoma se produjeron por implantación de células de melanoma de ratón B16B15b, que producen tumores con mucha vascularización. Las células de melanoma de ratón B16B15b se inyectaron por vía subcutánea en el relleno graso de la mama de ratones carentes de sistema inmune (2 meses de edad) y los tumores se dejaron crecer hasta que el diámetro fue de aproximadamente 1 cm. El reconocimiento y selección in vivo se realizó como se ha descrito anteriormente. Se inyectaron, por vía intravenosa, aproximadamente 1 x 10^{12} unidades de transducción de los fagos que expresaban la biblioteca CX_{5}C (SEC ID Nº 36), CX_{6}C (SEC ID Nº 37) ó CX_{5}C (SEC ID Nº 38) y se dejaron en circulación durante 4 min. Los ratones se congelaron a continuación instantáneamente en nitrógeno líquido mientras estaban bajo el efecto de la anestesia, se retiró el tejido tumoral y el cerebro (órgano control), y se aislaron los fagos como se ha descrito anteriormente. Se realizaron tres rondas de reconocimiento y selección in vivo.

Se determinaron la secuencias de aminoácidos para los insertos en 89 fagos clonados recuperados de los tumores B16B15b. Los péptidos expresados por estos fagos estaban representados por dos secuencias predominantes, CLSGSLSC (SEC ID Nº 55; 52% de los clones secuenciados) y WGTGLC (SEC ID Nº 52; 25% de los clones; véase la Tabla 4). La re-infección de los fagos que expresaban uno de los péptidos seleccionados dio como resultado aproximadamente un enriquecimiento de tres veces en la migración de los fagos hacia el tumor en relación con el cerebro.

TABLA 4 Péptidos de fagos recuperados de melanoma B16B15b de ratón

4

La localización de los fagos que expresan un péptido que migra hacia un tumor en los órganos del ratón se examinó por tinción inmunohistoquímica del tumor y algunos otros tejidos. Se inyectaron, por vía intravenosa, 1 x 10^{9} pfu de un fago control (sin inserto) o un fago que expresaba el péptido que migra hacia un tumor, CLSGSLSC (SEC ID Nº 50), a ratones portadores de un tumor y se dejaron en circulación durante 4 min. El ratón se prefundió a continuación con DMEM y varios órganos, incluyendo el tumor, se retiraron y fijaron en solución de Bouin. Se prepararon secciones histológicas y se tiñeron usando anticuerpos anti-M13 (fago) (véase Pasqualini y Ruoslahti, ut supra, 1996).

Resultó evidente una fuerte inmunotinción en el melanoma obtenido de un ratón al que se había inyectado el fago que expresa el péptido que migra hacia un tumor CLSGSLSC (SEC ID Nº 50). La tinción del melanoma se localizó generalmente en los vasos sanguíneos del tumor, aunque también había algo de tinción presente en el parénquima tumoral. No se observó tinción prácticamente en un tumor obtenido de un ratón al que se había inyectado el fago control sin inserto o en muestras de piel o de riñón obtenidas de los ratones a los que se había inyecto cualquiera de los fagos. Sin embargo, se detectó inmunotinción en los sinusoides del hígado y en bazo, indicando que los fagos pueden quedar atrapados no específicamente en órganos que contienen RES.

Estos resultados demuestran que el método de reconocimiento y selección in vivo es un método aplicable en general para someter a escrutinio una biblioteca de fagos para identificar fagos que expresan péptidos que migran hacia un órgano o tejido seleccionado, incluyendo un tumor.

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Ejemplo IV

Dirección in vivo de un fago que expresa un péptido RGD hacia un tumor

Se inocularon células de carcinoma de mama 435 humano en el relleno graso de la mama de ratones carentes de sistema inmune. Cuando los tumores alcanzaron un diámetro de aproximadamente 1 cm, se administraron fagos que expresaban un péptido específico que contenía un RGD al ratón portador del tumor. Resultados similares a los descritos abajo se obtuvieron también con ratones carentes de sistema inmune portadores de tumores formados por implantación de células C8161 de melanoma humano o por implantación de células de melanoma B16 de ratón.

Se inyectaron por vía intravenosa (iv) 1 x 10^{9} fagos que expresaban el péptido que contiene RGD, CDCRGDCFC (SEC ID Nº 57; véase Koivunen et al., ut supra, 1995) o fagos control (sin inserto) a los ratones y se dejaron en circulación durante 4 min. Los ratones se congelaron a continuación instantáneamente en nitrógeno líquido mientras estaban bajo el efecto de la anestesia, y se retiraron varios órganos, incluyendo el tumor, el cerebro y el riñón, y se cuantificaron los fagos presentes en los órganos (véase Pasqualini y Ruoslahti, ut supra, 1996).

Se detectaron aproximadamente 2-3 veces más fagos que expresaban el péptido CDCRGDCFC (SEC ID Nº 57) en el tumor de mama en comparación con el cerebro y el riñón, indicando que el péptido CDCRGDCFC (SEC ID Nº 57; fago RGD) dio como resultado una migración selectiva de los fagos hacia el tumor de mama. En un estudio paralelo, se inyectaron fagos no seleccionados, que expresan varios péptidos diversos, a ratones portadores de tumores y se examinaron varios órganos para detectar la presencia de fagos. Había muchos más fagos presentes en riñón y, en menor medida, en cerebro, en comparación con el tumor. Por tanto, los fagos que expresaban RGD en una cantidad 80 veces mayor que los fagos no seleccionados se concentraron en el tumor. Estos resultados indican que los fagos que expresan el péptido que contiene RGD migran hacia un tumor, debido posiblemente a la expresión de la integrina \alpha_{v}\beta_{3} sobre los vasos sanguíneos que se forman en el tumor.

La especificidad del péptido que migra hacia un tumor de mama se demostró por experimentos de competición, en los que la inyección conjunta de 500 \mug de péptido libre, ACDCRGDCFCG (SEC ID Nº 58) con los fagos que expresan el péptido que migra hacia el tumor redujo la cantidad de fagos en el tumor en aproximadamente 10 veces, mientras que la inyección conjunta de un péptido control inactivo, GRGESP (SEC ID Nº 59) no tuvo prácticamente efecto. La tinción inmunohistoquímica para detectar los fagos que migraban hacia los tumores de mama mostró acumulación de los fagos RGD en los vasos sanguíneos del tumor, mientras que no se observó tinción en cerebro o riñón (órganos control). Estos resultados demuestran que los fagos que expresan un péptido que puede unirse a una integrina expresada sobre la vascularización angiogénica pueden migrar selectivamente in vivo hacia un órgano o tejido tal como un tumor que contiene tal vascularización.

<110> La Jolla Cancer Research Foundation

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<120> Moléculas que migran hacia un órgano o tejido seleccionado in vivo y métodos para identificar a las mismas

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<130> P052211

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<140>

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<141>

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\vskip0.400000\baselineskip

<150> US 08/526,708

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<151> 1995-09-11

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<150> US 08/526,710

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<151> 1995-09-11

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<160> 59

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<170> PatentIn versión 2.1

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<210> 1

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<211> 9

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de Secuencia Artificial: Péptido

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<400> 1

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\hskip1cm

5

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<210> 2

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<211> 9

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de Secuencia Artificial: Péptido

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<400> 2

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6

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<210> 3

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<211> 9

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de Secuencia Artificial: Péptido

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<400> 3

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7

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<210> 4

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<211> 8

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de Secuencia Artificial: Péptido

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<400> 4

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8

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<210> 5

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<211> 9

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de Secuencia Artificial: Péptido

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<400> 5

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<210> 6

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<211> 7

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<212> PRT

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<213> Descripción de Secuencia Artificial: Péptido

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<220>

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<223> Descripción de Secuencia Artificial: Péptido

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<400> 6

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<210> 7

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<211> 8

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de Secuencia Artificial: Péptido

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<400> 7

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11

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<210> 8

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<211> 8

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de Secuencia Artificial: Péptido

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<400> 8

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12

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<210> 9

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<211> 8

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de Secuencia Artificial: Péptido

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<400> 9

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13

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<210> 10

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<211> 7

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de Secuencia Artificial: Péptido

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<400> 10

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14

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<210> 11

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<211> 8

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de Secuencia Artificial: Péptido

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<400> 11

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15

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de Secuencia Artificial: Péptido

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<400> 12

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16

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<210> 13

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<211> 9

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Péptido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Péptido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Péptido

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 15

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Péptido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 16

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Péptido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 17

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Péptido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 18

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Péptido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 19

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Péptido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 20

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Péptido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 21

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Péptido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 22

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Péptido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 23

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Péptido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 24

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

28

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Péptido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 25

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

29

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Péptido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 26

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Péptido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 27

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

31

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Péptido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 28

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Péptido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 29

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

33

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Péptido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 30

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

34

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Péptido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 31

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

35

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Péptido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 32

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

36

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Péptido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 33

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

37

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Péptido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 34

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

38

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Péptido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 35

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

39

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Péptido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 36

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

40

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Péptido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 37

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

41

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 38

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Péptido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 38

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

42

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 39

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Péptido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 39

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

43

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 40

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Péptido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 40

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

44

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 41

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Péptido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 41

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

45

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 42

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

46

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Péptido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 43

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

47

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 44

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Péptido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 44

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

48

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 45

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Péptido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa en posición 1 es de aproximadamente 1 a aproximadamente 10 aminoácidos seleccionados independientemente

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa en posición 4 es de aproximadamente 1 a aproximadamente 10 aminoácidos seleccionados independientemente

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 45

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

49

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 46

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Péptido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa en posición 1 está ausente o es de aproximadamente 1 a aproximadamente 10 aminoácidos seleccionados independientemente

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<223> Xaa en posición 5 es de aproximadamente 1 a aproximadamente 20 aminoácidos seleccionados independientemente

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 46

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

50

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 47

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Péptido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 47

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

51

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 48

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Péptido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 48

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

52

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 49

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Péptido

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 49

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

53

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 50

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Péptido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 50

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

54

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 51

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Péptido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 51

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

55

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 52

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Péptido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 52

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

56

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 53

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Péptido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 53

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

57

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 54

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Péptido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 54

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

58

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 55

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Péptido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 55

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

59

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 56

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Péptido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 56

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

60

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 57

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

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<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Péptido

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 57

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

61

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 58

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<223> Descripción de Secuencia Artificial: Péptido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 58

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

62

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 59

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Péptido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 59

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

63

\vskip1.000000\baselineskip

Claims

1. Una molécula que migra selectivamente hacia un tumor de mama, la cual es un péptido que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en CGRECPRLCQSSC (SEC ID Nº 48), CGEACGGQCALPC (SEC ID Nº 49) y CNGRCVSGCAGRC (SEC ID Nº 50).

2. Un método in vitro para dirigir un componente hacia un tumor de mama, que comprende los pasos de:

a. enlazar el componente a una molécula de la reivindicación 1 para formar un complejo que comprende dicho componente y dicha molécula; y

b. poner en contacto dicho complejo con el tumor de mama, en el que dicha molécula de la reivindicación 1 se une selectivamente al tumor de mama, dirigiendo así dicho componente hacia dicho tumor de mama.

3. El método de la reivindicación 2, en el que dicho componente comprende un marcador detectable.

4. El método de las reivindicaciones 2 ó 3, en el que dicho componente comprende un agente citotóxico.

5. El método de las reivindicaciones 2 a 4, en el que dicho componente es un liposoma, una microcápsula o una microbomba.

6. El uso de una molécula según la reivindicación 1 para preparar una composición farmacéutica para dirigir un componente hacia un tumor de mama.

7. El uso de la reivindicación 6, en el que dicho componente comprende un marcador detectable.

8. El uso de las reivindicaciones 6 ó 7, en el que dicho componente comprende un agente citotóxico.

9. El uso de las reivindicaciones 6 a 8, en el que dicho componente es un liposoma, una microcápsula o una microbomba.