CN102228701A - 一种双重靶向肿瘤的钆喷酸葡胺纳米脂质体及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物医药领域，更具体地，本发明公开了一种双重靶向肿瘤的钆喷酸葡胺纳米脂质体，含有ARYCRGDCFDATWLPPR多肽和钆喷酸葡胺。本发明还公开了所述的双重靶向肿瘤的钆喷酸葡胺纳米脂质体的制备方法及其作为造影剂的用途。

Description

一种双重靶向肿瘤的钆喷酸葡胺纳米脂质体及其制备方法

技术领域

本发明属于医药领域，更具体地，本发明公开了一种双重靶向肿瘤的纳米脂质体及其制备方法。

背景技术

“世界癌症报告”报道，2010年肿瘤将跃居为全球的首要死因。报道表明，从1975年到2000年，全球肿瘤病例数增长了一倍。据估计每年有1200万新发肿瘤病例，并且有超过700万肿瘤患者死亡。到2020年，这个数字还将再翻倍，到2030年，肿瘤患者人数将为现在的三倍，新发病例的数字将增加到2000到2600万。虽然近些年来肿瘤的诊断及治疗方面取得了长足的进展，然而治愈率仍然不理想，其成因机理尚不明了。因此，肿瘤成因机理、诊断及其治疗仍然是研究的热点。

大多数肿瘤患者在诊断明确时已是晚期，错过了最佳治疗期而导致最终疗效欠佳，因此肿瘤的早期发现和诊断是治疗的关键。由于肿瘤早期体积较小，且无明显症状，临床发现比较困难，其诊断主要依靠影像学如CT（Computed tomography）、SPECT（Single photon emission computed tomography）、PET（Positron emission tomography）、MRI及超声波等技术（Gwyther S J. New imaging techniques in cancer management.[J]. Ann Oncol. 2005, 16 Suppl 2: i63-i70.，Rudin M, Weissleder R. Molecular imaging in drug discovery and development.[J]. Nat Rev Drug Discov. 2003, 2(2): 123-131），这些措施可发现较早期的临床型肿瘤，而对于早期直径小于1cm的肿瘤目前仍缺少有效的诊断方法，且特异性不理想。因此，迫切需要研究出敏感性高、特异性强的早期诊断方法，如分子显像技术在亚临床状态早期诊断肿瘤，并予以及早治疗，从而达到治愈肿瘤的目的。

分子影像学被定义为“对分子或细胞层面生物过程的可视观察及特征描述”，借助分子显像剂在体外观察活体内部分子水平的生物学变化，从而达到对生物体内进行的各种生理或病理过程观察的目的（Mankoff D A. A definition of molecular imaging.[J]. J Nucl Med. 2007, 48(6): 18N, 21N.）。分子影像方法学上采用类似于体外免疫细胞化学或原位杂交技术的方法，其主要特点是以疾病实际发病机制相关的或发病过程相关的分子为靶点，它能发现疾病在体内时间与空间上的特征：即疾病发生的部位、演变过程、参与分子及对治疗的反应等生物过程，是活体状态在细胞和分子水平应用影像学方法对生物过程进行定性和定量研究（Nichol C, Kim E E. Molecular imaging and gene therapy.[J]. J Nucl Med. 2001, 42(9): 1368-1374.）。传统影像学主要依赖非特异性的成像手段进行疾病的检查,如不同组织的物理学特性(例如组织的散射、密度等)的不同，或者从生理学角度(如血流速度的变化)来鉴定疾病,但不能显示具体分子病理和疾病的关系。因此,只有当机体发生明显的病理或解剖结构的改变时才能发现异常，这时往往已错过了治疗的最佳时机。然而在特异的分子探针的帮助下,分子显像可以从分子水平层面的变化发现疾病,真正达到早期诊断的目的。因此,分子影像学不仅可以更加早期发现并诊断，还可以无创、实时、连续多次为临床提供“原位靶向”,进而更有效地指导治疗,改善患者预后。早期直接评价靶向治疗和化疗效果也是分子影像学重要的研究应用领域。

分子影像技术可将基因表达、生物传递等复杂的过程通过影像直观的表现出来，从而更好地在分子水平上了解疾病的发生机制及特征，其次能够发现疾病早期的分子变化及病理改变过程，并可在活体上连续观察药物或基因治疗的机理和效果。它可以反映特殊细胞与分子的活动,包括基因表达与蛋白质之间的相互作用等;可以监视同类分子的变化;跟踪目标细胞;评价药物与基因治疗效果;在分子病理水平评估疾病的进展,尤为重要的是,它以快速、无创、数字化的方式来实现上述目标（Herschman H R. Molecular imaging: looking at problems, seeing solutions.[J]. Science. 2003, 302(5645): 605-608. Massoud T F, Gambhir S S. Molecular imaging in living subjects: seeing fundamental biological processes in a new light.[J]. Genes Dev. 2003, 17(5): 545-580. Sullivan D C, Kelloff G. Seeing into cells. The promise of in vivo molecular imaging in oncology.[J]. EMBO Rep. 2005, 6(4): 292-296.）。

由于分子显像中所观察的分子其表达水平往往较低，仅有10^-9-10^-13mol/g（Strijkers G J, Mulder W J, Van Heeswijk R B, et al. Relaxivity of liposomal paramagnetic MRI contrast agents.[J]. MAGMA. 2005, 18(4): 186-192.），所以分子显像的关键是将标记分子的生物信号通过分子显像剂尽可能放大从而得到清晰的分子影像。Weissleder R等（Weissleder R, Mahmood U. Molecular imaging.[J]. Radiology. 2001, 219(2): 316-333.）指出了分子影像学研究的3个关键问题：高度敏感和特异的显像探针、合适的扩增方法以及高分辨率的成像系统。总体来说，目前常用的分子影像模式包括分子MRI、光学分子成像及靶向PET、SPECT和超声等，许多研究也采用混合两种或以上的方法进行显像（ Massoud T F, Gambhir S S. Molecular imaging in living subjects: seeing fundamental biological processes in a new light.[J]. Genes Dev. 2003, 17(5): 545-580）。放射性核素成像是应用最早也是目前应用最广泛的分子影像技术,它利用放射性核素对分子探针进行标记,借助PET或SPECT进行扫描与显像,反映病变部位特定的生理病理活动，具有敏感性高等优势。放射核医学研究较多主要有代谢显像(metabolism imaging)、受体显像(receptor imaging)、反义基因显像(antisense imaging)、放射免疫显像（Radioimuno-Imaging，RII）、凋亡显像(apoptosis imaging)等。其中代谢显像作为一项较为成熟的技术已经广泛应用于临床，常见的代谢显像剂如特异显示葡萄糖代谢的18氟-脱氧葡萄糖([18F]2- fluoro-2 -deoxy-D-glucose， 18F–FDG )等。受体显像是用放射性核素标记配体后靶向显像受体,它可以用于观察细胞间和细胞内的分子生物学过程,特别是观察执行基因编码指令的蛋白质的变化过程。反义基因显像以显示癌基因为基础，肿瘤放射免疫显像RII是利用放射性核素标记某一肿瘤的特异抗体或其片断技术，作为恶性肿瘤诊断、治疗的工具。目前已经有了一些肿瘤的特异性标记物，例如前列腺癌中的雄激素受体显像剂11-c胆碱，二氢睾酮,Goldenberg和陈伟等利用¹³¹I同位素标记CEA抗体及p53-PET显像等均取得了一定的结果（Goldenberg D M, Sharkey R M, Ford E. Anti-antibody enhancement of iodine-131 anti-CEA radioimmunodetection in experimental and clinical studies.[J]. J Nucl Med. 1987, 28(10): 1604-1610. 陈伟. 磁共振单克隆抗体靶向对比剂实验研究[D]. 第三军医大学, 2001.）。对活体组织的凋亡细胞进行显像则是近年发展起来的新技术,目前研究主要用于肿瘤治疗效果监测、心脏移植排异反应监测、急性心肌梗死与心肌炎的评价等。但是，作为核医学主要显像工具的PET其空间分辨率较低，同时具有放射性可能对患者造成损伤，使其应用受到了很大的限制。

光学分子成像用于活体分子表达显像的光学成像方法较多,主要有扩散光学成像、表面聚焦成像及近红外线荧光成像等。用于光学基因表达显像的标志基因有绿色荧光蛋白、基质金属蛋白酶等。特定的光源激发荧光分子物质,发出有不同光谱特征的信号,从而成像。荧光探针仅在高水平表达时才由肿瘤产生的特异蛋白酶溶解时释放荧光,能再现肿瘤的生长和浸润及血管生成。以绿荧光蛋白、虫荧光素酶为标志基因的基因表达显像研究也可以发现微小肿瘤病灶（Weissleder R. Molecular imaging: exploring the next frontier.[J]. Radiology. 1999, 212(3): 609-614. Pomper M G. Molecular imaging: an overview.[J]. Acad Radiol. 2001, 8(11): 1141-1153.。光学成像具有无创或微创、非离子低能量辐射、高敏感性、荧光染料激发和信号探测模式的灵活等优点。但光学成像技术的穿透力有限,为数毫米到数厘米,仅用于小动物模型的研究,这是光学成像技术目前难以应用于临床研究的最大限制（Bremer C, Tung C H, Weissleder R. In vivo molecular target assessment of matrix metalloproteinase inhibition.[J]. Nat Med. 2001, 7(6): 743-748. Weissleder R. A clearer vision for in vivo imaging.[J]. Nat Biotechnol. 2001, 19(4): 316-317.）。

超声分子成像技术将特异性配体连接到超声造影剂表面，进入血液循环后特异性地积聚于靶组织，观察靶组织在分子或细胞水平的特异性显像，从而反映病变组织在分子基础上的变化。利用靶向肿瘤细胞及其新生血管表面高表达的受体设计合成超声分子靶向造影剂，用于体内靶向超声成像显示肿瘤或肿瘤治疗疗效的检测。Willmann等将抗VEGFR2（Vascular endothelial growth factor receptor2，血管生长因子受体2）连接到超声微泡表面，建立裸鼠血管肉瘤模型，注入靶向微泡后发现肿瘤显像明显增强（Rebuzzi L, Willmann M, Sonneck K, et al. Detection of vascular endothelial growth factor (VEGF) and VEGF receptors Flt-1 and KDR in canine mastocytoma cells.[J]. Vet Immunol Immunopathol. 2007, 115(3-4): 320-333.）。靶向超声微泡(球)造影剂的应用大大促进了超声造影在分子影像学的发展。

相比以上几种成像技术而言，磁共振成像以其高分辨率及成像模式的多元性在分子影像的研究方面占有重要优势。MRI具有高度空间分辨率，能够同时观察生物与解剖信息进行功能及解剖成像。与其他方法相比具有无放射性、不受半衰期的影响和空间解析度高等优势（Barrett T, Brechbiel M, Bernardo M, et al. MRI of tumor angiogenesis.[J]. J Magn Reson Imaging. 2007, 26(2): 235-249.）。其基本原理是对原子核自旋的射频激发以及对随后弛豫过程中的射频信号的采集和处理，MRI图像中的数值的含义（即对比度）由於MRI激发和采集模式的不同而不同，常用的对比度有T1信号值（T1 value，Longitudinal relaxation time，纵向弛豫时间），T2信号值（T2 value，Transverse relaxation time，横向弛豫时间）等。人体不同器官的正常组织与病理组织的T1和T2值是相对固定的，而且它们之间有一定的差别，通过MRI成像就可以清晰显示人体组织的解剖结构。MR分子成像则利用MRI技术来直接或间接地反映目标分子的情况，与传统MRI相比,MR分子成像是基于组织的物理、生理特性并以特殊分子作为成像依据,为靶向性分子成像，是理想的分子影像方法之一（Weissleder R, Moore A, Mahmood U, et al. In vivo magnetic resonance imaging of transgene expression.[J]. Nat Med. 2000, 6(3): 351-355）。但是MRI的敏感性较低，只能达到微摩尔水平，为了显示体内的分子靶点，需要合适的分子探针和扩增系统特异性增强信号。

与其他分子成像方法相比，MRI的优势在于具有较高的分辨率，且能同时获得活体内的解剖与生理信息。磁共振成像技术的快速发展,高磁场和梯度场的应用提高了信噪比和分辨率,已经达到近似显微镜的分辨水平(几十个微米)（Ruff J, Wiesmann F, Hiller K H, et al. Magnetic resonance microimaging for noninvasive quantification of myocardial function and mass in the mouse.[J]. Magn Reson Med. 1998, 40(1): 43-48. Dodd S J, Williams M, Suhan J P, et al. Detection of single mammalian cells by high-resolution magnetic resonance imaging.[J]. Biophys J. 1999, 76(1 Pt 1): 103-109.）,利用不同的脉冲序列及靶向分子探针获得肿瘤发生发展、血管发生及基因突变等信息（Jasanoff A. Functional MRI using molecular imaging agents.[J]. Trends Neurosci. 2005, 28(3): 120-126. Winter P M, Caruthers S D, Wickline S A, et al. Molecular imaging by MRI.[J]. Curr Cardiol Rep. 2006, 8(1): 65-69.）。然而由于MRI的敏感性较低，因此需要适当的分子探针及信号扩增系统放大信号，增强其敏感性。分子探针（molecular probes）指的是对某一特定生物分子如蛋白质、DNA（Deoxyribonucleic acid，脱氧核糖核酸）、RNA（Ribonucleic acid，核糖核酸）具有特异性、靶向性并能够进行体内和(或)体外示踪的标记化合物分子,这些标记化合物分子能够在体内和(或)离体反映其靶生物分子的量和(或)功能（Tanabe K, Zhang Z, Ito T, et al. Current molecular design of intelligent drugs and imaging probes targeting tumor-specific microenvironments.[J]. Org Biomol Chem. 2007, 5(23): 3745-3757.）。MR特异性分子探针由靶向载体和对比剂构成。常见的载体包括纳米高分子、脂质体、乳剂及多聚体等，载体表面可以偶联靶向性的配体，如抗体、多肽或抗体片段等。载体通过荷载磁共振造影剂选择性改变两种组织间的核磁共振的T1或T2信号值差，达到增强对比度、提高磁共振成像的效果从而靶向识别病变组织的目的。

常见的造影剂有两类：一类是顺磁性造影剂，此类探针主要有Mn(II)、Mn(III)、Gd(III)离子的大分子螯合物。其中Gd(III)离子应用最广泛；另一类是超顺磁性氧化铁(superparamatic iron oxide，SPIO)微粒，SPIO是由葡聚糖包裹铁离子（Fe²⁺和Fe³⁺）而成的MRI阴性造影剂，可以有效的缩短MR的横向弛豫时间（T₂）从而达到增强T2信号值的目的（Aime S, Barge A, Gianolio E, et al. High relaxivity contrast agents for MRI and molecular imaging.[J]. Ernst Schering Res Found Workshop. 2005(49): 99-121.）。

在顺磁性造影剂中，钆喷酸葡胺（Gd-DTPA）是临床广泛应用的造影剂（Watanabe S.[Gd-DTPA enhanced MRI][J]. Nippon Rinsho. 2003, 61 Suppl 4: 280-286.）。Gd³⁺具有很强的顺磁作用，但由于毒性大不能以离子形式注入生物活体内，而DTPA与Gd³⁺螯合后可降低Gd³⁺的毒性。Gd-DTPA稳定性很高，配合常数为10²³。在生物体内无Gd³⁺与DTPA配体分离的现象。Gd-DTPA制剂可采用静脉注入人体，毒性低，具备优越的药动学参数，经肾排出的半衰期只有20分钟。Gd-DTPA主要是通过改变氢质子的弛豫时间,产生对比增强作用，在低浓度（0.1-0.2mmol/kg体重）时主要通过缩短T1获得高MRI信号，对T2影响较小。特异性分子探针制备最直接的方法是Gd-DTPA与靶向性配体连接，靶向性配体与靶结构的受体结合后，靶结构即可显像；也可以通过大分子物质把Gd-DTPA与靶向性配体连接在一起,靶向性配体与靶结构上的受体结合后,靶结构亦可显像。如Wiener等用一种新型的纳米结构材料繁枝体将叶酸与Gd-DTPA连接构成特异性分子探针,并观察到叶酸受体高表达的肿瘤细胞能与其特异性结合并聚集在胞内,从而应用于肿瘤组织的MRI特异性显像（Konda S D, Aref M, Wang S, et al. Specific targeting of folate-dendrimer MRI contrast agents to the high affinity folate receptor expressed in ovarian tumor xenografts.[J]. MAGMA. 2001, 12(2-3): 104-113.）。另一种Gd³⁺类特异性分子探针制备方法是用各种纳米载体(如脂质体)等与靶向性配体连接并包裹Gd³⁺类造影剂,所制备的靶向顺磁性造影剂可以对肿瘤部位特异显像（Mulder W J, Strijkers G J, Van Tilborg G A, et al. Lipid-based nanoparticles for contrast-enhanced MRI and molecular imaging.[J]. NMR Biomed. 2006, 19(1): 142-164.

王秩秋, 单良, 王颂平, et al. 转铁蛋白导向脂质体核磁造影剂纳米粒子(TfNTR-LipNBD-Magnevist)——一种肿瘤靶向磁共振造影剂[J]. 生物物理学报. 2008, 24(4).袁正, 刘士远, 肖湘生, et al. 磁共振肿瘤靶向对比剂叶酸-PL-Gd-DTPA的实验研究[J]. 中华医学杂志. 2007, 87(10).）。

肿瘤的生长常伴有新生血管的增多，Folkman等的研究发现，肿瘤生长必须依赖新生血管形成。肿瘤的生长分为2个阶段，即血管前期和血管期。血管前期肿瘤主要通过弥散作用获得营养和氧，并运走代谢产物；而当肿瘤体积增至1-2mm³以上时则需要新生血管的滋养才能继续生长（Folkman J. Tumor angiogenesis: therapeutic implications.[J]. N Engl J Med. 1971, 285(21): 1182-1186.）。新生血管不仅为肿瘤组织提供足够的营养和氧，还提供大量的生长因子，促使肿瘤迅速生长。肿瘤血管生成过程中新生血管上某些特征性标记物水平上调，将MRI对比剂与一些配体连接可与这些标记物特异性结合，利用这种体内免疫原理成像可用于肿瘤及其新生血管显像。由于肿瘤新生血管内皮细胞增值活跃，其表面出现许多相对特异性的标记分子，如VEGF受体、整合素αv受体等，而正常成熟组织毛细血管内皮细胞处于静止状态，这些分子标志的表达较正常静止内皮细胞高50倍以上（Bergers G, Benjamin L E. Tumorigenesis and the angiogenic switch.[J]. Nat Rev Cancer. 2003, 3(6): 401-410.Ferrara N. VEGF and the quest for tumour angiogenesis factors.[J]. Nat Rev Cancer. 2002, 2(10): 795-803.）。因而，这些标记分子可以成为肿瘤早期诊断显像及治疗的理想靶点（Folkman J. Angiogenesis: an organizing principle for drug discovery?[J]. Nat Rev Drug Discov. 2007, 6(4): 273-286. 张琨. VEGF靶向分子探针在体外大肠癌细胞的MRI应用研究[D]. 山西医科大学, 2009.）。相比于以肿瘤细胞为靶点，以肿瘤新生血管为靶点的显像具有以下优势：内皮细胞能直接与静脉注射进入血液循环的药物结合；新生血管显像诊断适用于不同种类的实体瘤；肿瘤显像的效果直接为肿瘤的抗血管治疗提供有力依据。

肿瘤血管生成是指新生血管在肿瘤现有血管基础上形成的过程，肿瘤是血管生成依赖性疾病,它的发生、发展及转移都明显依赖于肿瘤血管生成，因此在临床对肿瘤的诊断和治疗检测中针对肿瘤血管生成的应用越来越多。为了在分子或者细胞水平特征性地显示肿瘤血管生成，利用高亲和力的分子探针与肿瘤血管生成过程中表达的特异性靶分子结合从而成像。

发明内容

本发明将钆喷酸葡胺包封于双重靶向肿瘤的纳米脂质体中，两个靶分子能维持各自原有的生物学活性，在功能上产生协同效应。

本发明公开了一种双重靶向肿瘤的钆喷酸葡胺纳米脂质体，含有ARYCRGDCFDATWLPPR多肽和钆喷酸葡胺。

本发明公开的双重靶向肿瘤的钆喷酸葡胺纳米脂质体，主要由三部分组成：ARYCRGDCFDATWLPPR多肽，脂质连接物和脂质体纳米粒。

本发明还公开了双重靶向肿瘤的钆喷酸葡胺纳米脂质体的制备方法，首先合成双重靶向肿瘤的ARYCRGDCFDATWLPPR多肽，然后合成多肽接枝物，最后制备双重靶向肿瘤纳米脂质体。

    本发明最后公开了上述双重靶向肿瘤的钆喷酸葡胺纳米脂质体作为造影剂的用途。

本发明提供的双重靶向肿瘤的纳米脂质体主要由三部分组成，双重靶向肿瘤的多肽，脂质连接物和脂质体纳米粒。

首先，本发明采用固相合成法获得双重靶向肿瘤的多肽，所述多肽的氨基酸序列如下：ARYCRGDCFDATWLPPR。其中ARYCRGDCFDG ：其核心结构为RGD三肽，即精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（Arg-Gly-Asp）序列，针对靶点是整合素αV家族。αⅤ整合素为细胞黏附分子家族的重要成员之一,通过参与内皮细胞的激活和迁移、介导内皮细胞增殖、抑制内皮细胞凋亡、参与碱性成纤维细胞生长因子和VEGF诱导的血管生成、诱导环加氧酶2的产生等多种途径促进新生血管化和肿瘤的发生发展。αⅤ整合素在生理状态下静止的血管内皮细胞和正常组织器官内呈低表达，但高表达于活化的肿瘤血管内皮细胞和肿瘤细胞表面。药物载体连接含RGD序列的短肽后可显著增强其靶向肿瘤新生血管的能力。ATWLPPR序列是针对的靶点为VEGFR2的共受体神经内皮素-1（Neuropilin-1, NRP-1）。VEGFR-2（Vascular Endothelial Growth Factor Receptor-2）是VEGF/VEGFR家族成员，主要识别低分子量的VEGF，在血管内皮细胞迁移、增殖、存活及血管通透性调节中起重要作用。NRP-1是一种非酪氨酸跨膜糖蛋白，是VEGFR-2的辅助受体，和VEGFR-2的共表达可显著促进VEGF165与VEGFR-2的结合，增强VEGF165介导的生物学作用，促进血管内皮的增殖。NRP-1亦高表达于活化的肿瘤血管内皮细胞和肿瘤细胞表面，在生理状态下静止的血管内皮细胞和正常组织器官内呈低表达。

本发明采用Fmoc固相合成法合成了靶向多肽－6-氨基己酸（6-aminohexanoic acid, C6）－棕榈酸（palmitic acid, Pal）联结物，连接新型多肽和钆喷酸葡胺纳米脂质体。

本发明采用薄膜超声分散法制备钆喷酸葡胺纳米脂质体，挤压过滤法或高压均质法控制脂质体粒径在60-200nm。小粒径的纳米粒作为药物载体有其独特优势。恶性肿瘤的侵袭性生长和转移有赖于血管的生成，虽然相对于正常血管来说，肿瘤组织中血管对药物的选择性渗透力较弱，但最大直径仍不超过400nm。大粒径的脂质体在脾脏的截留更多，从血液中清除更快，到达肿瘤组织的脂质体明显减少。因此小粒径长循环药物脂质体更易透过血管间隙发挥到达肿瘤局部的作用。

细胞学研究证实，本发明的含有RGD及ATWLPPR序列的双重靶向肿瘤新生血管的多肽修饰钆喷酸葡胺纳米脂质体，因新型多肽分子量小，核心载药颗粒粒径控制在60-200nm，故易穿透内皮细胞屏障进入肿瘤组织。研究证实，RGD及ATWLPPR序列连接后空间构象互不影响，能维持序列各自原有的生物学活性，从而产生协同效应。相较于只含有RGD或ATWLPPR序列的单靶向钆喷酸葡胺纳米脂质体，研发的双重靶向肿瘤的钆喷酸纳米脂质体有显著为优的与新生血管内皮细胞及肿瘤细胞的特异性结合力。与无靶向及单靶向肿瘤的钆喷酸葡胺纳米脂质体相比，双重靶向肿瘤的钆喷酸葡胺纳米脂质体有更强的与新生血管内皮细胞及肿瘤细胞特异性结合能力，可被进一步应用于恶性肿瘤的早期诊断领域。

附图说明

图1：双重靶向肿瘤的钆喷酸葡胺纳米脂质体透射电镜图

图2：双重靶向肿瘤的钆喷酸葡胺纳米脂质体粒径分布图

图3：注射各组药物后不同时间点信号增强率（SER）比较。A：游离钆喷酸葡胺注射液，B：非靶向钆喷酸葡胺纳米脂质体， C：双重靶向肿瘤的钆喷酸葡胺纳米脂质体，D和E：两组单靶向钆喷酸葡胺纳米脂质体。

 

具体实施方式

实验材料

1. 细胞和试剂

HUVEC （人脐静脉内皮细胞），ATCC No.: CRL-2873；A549细胞 （肺腺癌细胞系）ATCC No.: CCL-185； DMEM（Dulbecco's Modified Eagle Media ，高糖细胞培养基) 购自Invitrogen公司；新生牛血清购自奥地利PAA公司； Coulter Isoton Ⅲ 稀释液购自美国BECKMAN公司；青霉素、链霉素、胰蛋白酶等购自华美公司；荧光标记多肽委托吉尔生化（上海）有限公司合成。

2. 溶液配制

PBS液(0.01 M, pH7.4)：NaCl 8.0g；KCl 0.2g；Na2HP04·12H20 1.44g；KH2PO4 0.24g；超纯水800m1；调节pH值至7.4，定容至1L后高压灭菌，4℃保存。

0.25%胰酶消化液（1L）：胰酶 2.5g；NaCl 8g；KCl 0.4g；Na2HP04·12H20 0.06g；KH2PO4 0.06g；NaHCO3 0.35g；酚红 0.02g；加压过滤除菌，分装后-20℃保存

DMEM培养基（1L）：DMEM 粉2袋；NaHCO3 7.4g；青霉素 0.12g；链霉素0.2g；HCl、NaOH调节pH值至7.2-7.4，加压过滤除菌，4℃保存；细胞冻存液：DMEM 培养基 70%；二甲亚砜（DMSO）10%；新生牛血清 20%；分装后-20℃保存；细胞裂解液：Tris 10mmol/L；Nacl    100mmol/L；EDTA  1mmol/L；EGTA  1mmol/L；NaF 1mmol/L；Na4P2O7·10H2O      20mmol/L；钒酸钠2mmol/L； Triton X-100 1%； 甘油 10%；十二烷基硫酸钠0.1%；脱氧胆酸盐 0.5%；PMSF 100μg/μL。

3. 仪器设备及耗材

细胞培养瓶及多孔培养板（丹麦NUNC公司）；CO2培养箱（日本SANYO公司）；CA-1390-1 循环气流垂直净化工作台（上海上净净化设备有限公司）；DK-S24型电热恒温水浴锅（上海精宏试验设备有限公司）；液氮生物容器（成都金凤液氮生物容器有限公司）；RE-852旋转蒸发仪（上海青浦沪西仪器厂），JY92-Ⅱ超声波细胞粉碎仪（宁波新芝生物科技股份有限公司），mini薄膜挤压器（美国Avanti Polar Lipids Inc公司）， Avanti J-E高效冷冻离心机（美国Beckman公司），Ultracel YM100超滤管（美国Millipore公司），zeta plus 型zeta电位及粒度测量仪（美国Brokhaven公司），JEM-1230透射电镜（日本电子公司），紫外分光分度计（上海第三分析仪器厂），细胞培养瓶及培养板（丹麦Nunc公司）， CO2培养箱（Sanyo公司），Philip 1.5 Tesla磁共振扫描仪（美国GE公司），Philip 3.0 Tesla磁共振扫描仪（美国GE公司），SPF级条件下饲养裸鼠由上海斯莱克公司提供。

 

通过以下实施例进一步说明本发明，但不作为本发明的限制。

 

实施例1：双重靶向肿瘤多肽的合成步骤

采用9-芴甲氧羰基（fluorenylmethyloxycarbonyl, FMOC）固相合成法合成双靶向多肽, 采用高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC)法纯化，采用质谱鉴定。具体合成步骤如下：

1）树脂溶涨：将FMOC-AA-Wang-Resin树脂放入反应管中，加二甲基甲酰胺（N, N-dimethylformamide，DMF）(15ml/g) 30min；

脱保护：吸弃DMF，加20%哌啶DMF溶液(15ml/g) 5min，吸弃后再加20%哌啶DMF溶液(15ml/g)15min；

2）检测：抽掉哌啶溶液，取树脂十几粒，用乙醇洗三次，加入茚三酮，氰化钾，苯酚溶液各一滴，105℃－110℃加热5min，变深蓝色为阳性反应。

3）洗涤：DMF(10ml/g)两次，甲醇(10ml/g)两次，DMF(10ml/g)两次

4）缩合：保护氨基酸(FOMC-Asp-OH)三倍过量，1-氧-3-双二甲胺羧基苯骈三氮唑四氟化硼盐三倍过量，均用尽量少DMF溶解，加入反应管，立刻加入N-甲基吗啉十倍过量．反应30min.

5）洗涤：DMF(10ml/g)一次，甲醇(10ml/g)两次，DMF(10ml/g)两次；

6）重复操作步骤2）-- 6），依次连接FMOC-Tyr-OH、 FMOC-Thr-OH、FMOC-Met-OH、FMOC-Asn-OH、FMOC-Pro-OH、 FMOC-Arg-OH、FMOC-Lys-OH、 FMOC-Leu-OH、FMOC-Phe-OH；

7）最后一次洗涤：DMF(10ml/g)两次，甲醇(10ml/g)两次，DMF(10ml/g)两次， DCM(10ml/g)两次；

8）裂解：裂解液（10ml/g）（含TFA 94.5%；水2.5%；EDT 2.5%；TIS 1%）120min；

9）吹干洗涤：氮气尽量吹干裂解液，乙醚洗涤六次，常温挥干；

10）密封，-20度保存。

所得为白色粉末状物质，HPLC纯化，纯度＞95%；   

实施例2：非靶向、单靶向及双重靶向肿瘤的顺磁性钆喷酸葡胺纳米脂质体的制备

采用薄膜超声分散法制备上述钆喷酸葡胺纳米脂质体

1）          成分：蛋黄磷脂酰胆碱、胆固醇、DSPE-PEG2000、不同脂质多肽（ATWLPPR-C6、ARYCRGDCFDG-C6、ARYCRGDCFDATWLPPR-C6）（摩尔比13:5:0.9:0.03）。

2）          上述配方按比例混合后溶解于氯仿中，旋转蒸发成膜，真空干燥后加入10mg/mL钆喷酸葡胺PBS液（100mg磷脂加10Ml），充分旋转水化，至形成混悬液。

3）  所得脂质体混悬液经间歇超声或高压均质处理后，经mini-extruder依次过1μm、0.4μm、0.2μm、0.1μm聚碳酸酯膜控制粒径大小。采用高速超滤离心法浓缩脂质体溶液，置4℃冰箱保存备用。

所制备的双重靶向肿瘤的顺磁性钆喷酸葡胺纳米脂质体，经激光粒度分析仪测定，粒径大小分布在100-200nm范围内，平均粒径140nm。经磷钨酸染色后，透射电镜下见双重靶向肿瘤的顺磁性钆喷酸葡胺纳米脂质体呈圆形或椭圆形囊泡结构，可见清晰的多层脂质膜结构，分布均匀，大小均一，大约在100nm左右。（见附图1和图2）

实施例3：双重靶向肿瘤的顺磁性钆喷酸葡胺纳米脂质体与细胞结合力测定

HUVEC、A549细胞分别接种于6cm培养皿中（2×10⁵/孔）， 37℃、5%CO₂培养箱中孵育过夜。更换培养液后，分别加入300μl 五组不同的脂质体，包括游离钆喷酸葡胺注射液、非靶向钆喷酸葡胺纳米脂质体、双重靶向肿瘤的顺磁性钆喷酸葡胺纳米脂质体和两组单靶向肿瘤钆喷酸葡胺纳米脂质体，37℃培养箱孵育4h。生理盐水洗涤两次，浓硝酸硝化过夜，偶氮氯膦Ⅲ比色法测定钆浓度。

实验结果如下：

   （n=5,*表示该组与其他四组在统计学上有显著差异，P<0.05）

其中A为游离钆喷酸葡胺注射液，B为非靶向钆喷酸葡胺脂质体， C为双重靶向肿瘤的顺磁性钆喷酸葡胺纳米脂质体，D和E为两组单靶向钆喷酸葡胺脂质体。

    上述结合实验证明，双重靶向肿瘤的顺磁性钆喷酸葡胺纳米脂质体体外与肿瘤细胞及血管内皮细胞的结合力优于非靶向钆喷酸纳米脂质体和单靶向肿瘤的钆喷酸纳米脂质体。

 

实施例4：双重靶向肿瘤的顺磁性钆喷酸葡胺纳米脂质体细胞竞争抑制实验

HUVEC、A549细胞分别接种于培养皿（2×10⁵/孔）， 37℃、5%CO₂培养箱中孵育过夜。A组加入非靶向钆喷酸葡胺纳米脂质体， B组加入双重靶向肿瘤的钆喷酸葡胺纳米脂质体，C组先加入双靶向多肽0.5h，后加双重靶向肿瘤的钆喷酸葡胺纳米脂质体。 37℃培养箱孵育4h，生理盐水洗涤，浓硝酸硝化过夜。偶氮氯膦Ⅲ比色法测定钆浓度。

实验结果如下：

   （n=5,*表示该组与其他四组在统计学上有显著差异，P<0.05）

    上述竞争抑制实验证明，双重靶向肿瘤的钆喷酸葡胺纳米脂质体系通过多肽特异性结合于新生血管及肿瘤细胞表面。

 

实施例5：双重靶向肿瘤的钆喷酸葡胺纳米脂质体小动物体内显影能力的测定

A549 细胞悬液皮下接种于裸鼠右腋下，SPF级条件建立荷瘤裸鼠模型。腹腔麻醉后，固定于1.5T核磁共振仪上平扫成像。经尾静脉分别注射实施例3中五组不同的溶液（剂量0.1mmol/kg体重），于注射后30min、1h、2h、4h、6h进行增强扫描成像。勾出感兴趣区域测定信号强度，计算出信号增强率(SER)，比较成像效果（见附图2）。

实验结果如下：

	0.5h	1h	2h	4h	6h
						A	160.383±2.726	123.481±8.952	35.428±5.893	7.341±0.383	1.357±0.406
B	159.379±7.103	135.392±15.731	38.302±0.717	29.455±4.868	23.55±1.392
						C	176.753±4.505	205.578±2.435	166.608±5.466	148.5±0.96	115.202±0.334
D	160.048±8.483	146.927±3.838	106.163±2.085	105.834±1.495	71.419±4.654
						E	128.188±9.143	140.241±1.88	104.33±1.678	95.734±3.977	55.345±5.069

其中A为游离钆喷酸葡胺注射液，B为非靶向钆喷酸葡胺脂质体， C为双靶向钆喷酸葡胺脂质体，D和E为两组单靶向钆喷酸葡胺脂质体

上述实验证实，双靶向多肽接枝物与脂质体载体连接后，与游离造影剂、非靶向脂质体和单靶向脂质体相比，能明显增加脂质体的靶向转运能力，使造影剂在肿瘤靶区明显浓聚，增强肿瘤靶区与周围组织的信号对比度，提高MRI显像的准确性和敏感性。同时避免双靶向长循环脂质体被网状内皮系统吞噬，延长其在体内的循环时间，使MRI显影的时间窗明显延长。双重靶向肿瘤的钆喷酸葡胺纳米脂质体有望成为一种新型有效的磁共振造影剂, 达到早期肿瘤诊断和发现微小转移病灶得目的。

Claims (4)

1.一种双重靶向肿瘤的钆喷酸葡胺纳米脂质体，其特征在于含有ARYCRGDCFDATWLPPR多肽和钆喷酸葡胺。

2.根据权利要求1所述的双重靶向肿瘤的钆喷酸葡胺纳米脂质体，其特征在于主要由三部分组成：ARYCRGDCFDATWLPPR多肽，脂质连接物和脂质体纳米粒。

3.权利要求1或2所述的双重靶向肿瘤的钆喷酸葡胺纳米脂质体的制备方法，其特征在于首先合成双重靶向肿瘤的ARYCRGDCFDATWLPPR多肽，然后合成多肽接枝物，最后制备双重靶向肿瘤的钆喷酸葡胺纳米脂质体。

4.权利要求1或2所述的双重靶向肿瘤的钆喷酸葡胺纳米脂质体作为造影剂的应用。

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