TWI415627B - 一種利用一鍋法合成可應用於癌症診斷造影與標靶治療的多功能微脂體之方法 - Google Patents

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一種利用一鍋法合成可應用於癌症診斷造影與標靶治療的多功能微脂體之方法
一種利用一鍋法合成可應用於癌症診斷造影與標靶治療的多功能微脂體之方法。利用一鍋法製程方法，將放射核種溶液、化療藥物、與標的分子在適當的溫度下一同與微脂體進行反應，可得到可應用於癌症診斷造影與標靶治療的多功能奈米微脂體藥物。
微脂體(liposome)於1970年被認為可攜帶藥物作為載體，特別是運用在抗癌藥物。微脂體是將抗癌藥物包裹在載體內，傳輸到有癌細胞的部位，才釋放出抗癌藥物，直接作用於腫瘤區，且不容易進入正常組織中，減少對正常細胞的傷害。微脂體之主要優點可簡述如下。
1.藥物包裹在微脂體內會改變藥物動力學，延長藥物在血液中的半衰期。微脂體的大小約100奈米，能穿過腫瘤新生血管壁的漏洞，使包裹抗癌藥物的微脂體能大量累積在腫瘤，增進治療效果。此種微脂體屬於被動式標靶(passive targeting)。
2.毒性高的藥物包裹在微脂體內，可以減少不良的副作用。
3.微脂體的脂質組成、顆粒大小、結構、製備方法與包裹藥物的選擇性很大，能夠符合各種不同情況，進行各種應用。
4.微脂體是由磷脂質組成，其與細胞膜成分相同，在生物體內能被分解，所以不具毒性，且不像蛋白質會引起免疫反應，故能夠多次使用。
為了增加微脂體對目標組織的專一作用，可在微脂體表面加入細胞-特定配位體，以促進微脂體與目標細胞的作用，提高癌細胞吞噬微脂體的能力，達到定點釋放藥物，降低抗癌藥物對一般組織的非特異毒性，並增進抗癌功效。一般而言，使用單株抗體或配位體共價鍵結到微脂體上，經細胞表面的受體或抗原辨認，再進入特定細胞。此種靶向性微脂體相較於無靶向性微脂體的療效更佳。再者，在包埋化療藥物微脂體，若能同時包埋放射性核種，如錸-188或錸-186，由於其可放射出β-射線(2.1MeV)，可做為放射性標靶治療腫瘤藥物，由於錸-188或錸-186同時也放出155KeV或139KeV γ-射線，故也具備加馬造影診斷功能。此放射與化療組合式靶向性微脂體藥物有效且快速的傳遞至腫瘤細胞，增強放化療敏感性，增加放化療對腫瘤毒殺效應。
Bao發表以186 Re,99m Tc標幟BMEDA，以及包埋在微脂體內探討放射診斷造影劑或放射治療在正常老鼠之基礎研究(Bao et al.J.Pharm.Sci(2003)92,1893-1904 and J.Nucl.Med(2003),44,1992-1999)。該項技術僅具單功能放射診斷或放射治療，缺少放射及化學治療多功能與多功效技術。
此外，已有一些包埋化學治療藥物的微脂體或標靶微脂體的研究已經發表(Allen et al.Cell.Mol.Biol. Lett(2002)7,889-894)。然而同時包埋化學治療藥物及放射藥物的標靶微脂體藥物，且為一鍋法製程技術，目前並沒有文獻的發表。
有鑑於此，為解決上述問題，本發明提供一種以簡單、方便的一鍋式製程方法，製作結合放射藥物與化學治療藥物組合而成多功能與多功效靶向性免疫微脂體，可作為腫瘤造影診斷與治療之應用。
本發明是以一鍋式製備多功能微脂體藥物。在製備過程中，將放射核種溶液、化療藥物、與標的分子在適當的溫度下，一同與微脂體進行反應，其產品可應用於癌症診斷造影、傳輸與標靶治療的多功能微脂體藥物。
於一較佳實施樣態中，該一鍋式製備方法所使用之放射性核種溶液係為188Re-BMEDA、186Re-BMEDA、99mTc-BMEDA及與其衍生之放射性核種溶液所組成之群組。
於一較佳實施樣態中，該一鍋式製備方法使用化療藥物係為vinca衍生藥物vinorelbine、vincristine、vinblastine、vinflunine及anthracyline類(小紅莓類)的藥物所組成之群組。於一具體實施樣態中，該化療藥物anthracyline類係為doxorubicin、daunorubicin、mitomycin C及epirubicin所組成之群組。
於一較佳實施樣態中，該一鍋式製備方法所使用標的分子是由胜肽所組成之微胞溶液。於另一較佳實施樣態 中，該標的分子微胞溶液係為DSPE-PEG-BBN、DSPE-PEG-Oct、DSPE-PEG-Oct衍生物、單株抗體微胞及單株抗體微胞衍生物所組成之群組。
於一較佳實施樣態中，該一鍋式製備方法之適當溫度在4℃~110℃之間。
於一較佳實施樣態中，該一鍋式製備方法使用之微脂體其組成為磷脂質與其衍生物、聚乙二醇(PEG)、聚乙二醇衍生物、膽固醇及膽固醇衍生物所組成之群組。
本發明具有以下優點：(1)使用方便(2)操作簡單(3)具有放射診斷、傳輸與治療多功能(4)具放射及化學治療加成效果特性(5)具有標靶治療的特性。
縮寫列表如表一所示。
實施例一：標的分子胜肽藥物配方製備及品管分析
分別秤取Bombesin與DSPE-PEG2000 -NHS(1：1.1莫 耳比)，將其分別加入1mL的Dimethylformamide(DMF)中使其完全溶解後，將bombesin/DMF溶液移入50毫升雙頸瓶中，加入20倍莫耳的Triethylamine(TEA)，並在N2 下以磁石攪拌1小時，之後再加入含有DSPE-PEG2000 -NHS的DMF溶液，於室溫與N2 下以磁石攪拌反應24小時。待其反應完成後，利用真空系統將DMF完全去除，可得到淡黃色產物。
將去除DMF後之產物加入過量的CHCl3 並靜置使其產生沉澱，接著以42號濾紙過濾，殘留在濾紙上之固體即為產物DSPE-PEG2000 -BBN，將此固體溶於水(H2 O)，並利用產物在水中形成微胞(micelle)的特點，採用葡聚糖凝膠色譜法分離。將含產物之溶液過Sephadex G-25凝膠管柱，用純水洗脫，每管1mL收集。利用BCA蛋白質定量分析法確定產物位置，收集純產物的部分，以微控冷凍乾燥機除去溶劑，之後以以高效能液相層析儀分析，產物滯留時間4.5分鐘，以MADLI/TOF/TOF分析其平均分子量為[M+H]+ =3751Da。
實施例二：一鍋式製備錸-188-DXR-Liposome-BBN
秤取5mg BMEDA置於玻璃瓶中，加入0.5mL的0.17mol/L Gluconate-acetate溶液後再加入以12N HCl新鮮配製的SnCl2 溶液120μL(10μg/mL)，隨後灌入氮氣約2分鐘，以避免SnCl2 氧化，再加入1mL高比活度的188 Re溶液，以塑膠軟塞及鋁蓋將瓶蓋密封後隨即置於攝氏80度(80℃)恆溫水浴槽內以每分鐘200轉(200rpm)震盪搖晃作 用反應一小時，隨後取出並置於室溫自然冷卻。隨後緩慢加入5N NaOH(120~150μL)將pH調整至中性(pH 6~7)，並以radio-ITLC/SG(移動相為normal saline)分析標幟效率(labeling efficiency)，標幟效率達90%~100%。(Rf：1,free188 Re；Rf：0,188 Re-BMEDA)。
取10μL DSPE-PEG2000 -BBN(40mg/mL ddH2 O)，188.5μl DXR(10mg/mL)，隨即加入1mL微脂體(其成分包含磷脂質、膽固醇、PEG等，依照一定比例組成)及0.5mL188 Re-BMEDA，混合均勻後放入攝氏60度(60℃)水浴槽中反應30分鐘，待反應完成後，再以Sepharose CL-6B column(volume：20mL)進行純化。首先，以40mL的生理食鹽水(normal Saline)平衡Sepharose CL-6B column，接著使用生理食鹽水當沖提液。待沖堤液留乾後，將樣品加入column中，加入後便開始進行收集，每0.5mL收集為一管，待樣品留乾後，隨即以生理食鹽水(Normal Saline)進行沖堤，共收取30管(fraction)，計算各管的活度及殘留在column的活度。收集含有188 Re-DXR-liposome-BBN的fraction(約第14-18 fraction)，並計算188 Re-DXR-liposome-BBN產率，其計算方式為：產率(%)=100×(F14+F15+F16+F17+F18)/(F1 to F30)+column residue。188 Re-DXR-liposome-BBN合成平均產率約75-85%。
188 Re-DXR-Liposome-BBN之DXR之品管分析：
將樣品或標準品與酸化isopropanol依1：5的比例均勻 混合後，利用Spectrofluorometer(JASCO,FP6200)於激發光475nm和發射光580nm下可測得doxorubicin濃度。再利用phosphate assay進行微脂體濃度分析，結果由doxorubicin與磷脂質濃度測定結果可得DXR與磷脂質的比率三批次平均為120~160μg/μmole。而在DXR為2mg/mL的條件下磷脂質的濃度三批次平均為12~16.5μmole/mL。透過Malvern Nano ZS90粒徑分析儀，可測得微脂體三批次平均粒徑為95±25nm之常態分佈，結果如表二所示。
188 Re-DXR-Liposome-BBN之DXR之包覆效率分析：
先以250μl生理食鹽水平衡Microspin column三次(3000rpm,1分鐘)後，取25μl樣品小心加入column中心並避免sample流到管壁。再以3000rpm離心2分鐘並以一乾淨微量離心管收取通過column的樣品。再加入25μl 生理食鹽水沖提並以相同微量離心管收集通過column的樣品。將樣品或標準品與酸化isopropanol依1：5的比例均勻混合後，利用Spectrofluorometer(JASCO,FP6200)於激發光475nm和發射光580nm下測定以spin column純化前後樣品之DXR濃度，並計算包覆效率。
其計算方式為：包覆效率(%)=100 x{(純化後樣品總體積x純化後樣品之DXR濃度)/25 x(純化前樣品之DXR濃度)}。三批次包覆效率平均為大於85%。
實施例三：Liposome-BBN生物活性試驗
欲檢測物為以新製程合成的Bombesin、DSPE-PEG2000 -BBN及Liposome-BBN(cold)濃度從10-3 nM到103 nM間分為11個點，第12個assay則不加入Bombesin而改為1μM的Bombesin® -Fluka，做為非特異性結合。使用從HEK-293細胞表現的human bombesin 2 receptor來進行抑制實驗。先在polystyrene材質的96-well plate中反應，實驗至少進行三重覆，在每一個assay中總反應體積為250μl，依序加入結合緩衝液(binding buffer 20mM Hepes、3mM MgCl2 ，pH 7.4、0.3% BSA及1mM EDTA)及相同濃度(0.01nM)125 I-tyr4 -bombesin共230μl，最後加入0.08μg/μl的細胞膜蛋白20μl。在室溫下反應1-2小時後，各assay轉至Millipore出品的MAFB NOB型的96-well plate中分離游離型和結合型的radioligand，但MAFB NOB型的96-well plate在使用前需經0.5% polyethylenimine過濾，接著以真空抽氣的方式使反 應溶液通過一材質為0.1μm glass fibre的filter過濾，以50mM Tris-HCl,pH 7.4,4℃清洗filter 9次，使結合型的radioligand留在濾紙上，而游離型radioligand被過濾收集成廢液。將過濾後的filter以punch tips(Millipore#MADP19650)打下後，裝入12x75mm polystyrene材質的試管，直接至γ -counter測其放射性活度。將數據輸入EXCEL軟體(Microsoft,U.S.A.)中分析，利用已知之Kd(for【125 I-Tyr4 -bombesin】binding：0.037nM)和Bmax值(9.3pmol/mg protein)，求出IC50 值，進而帶入公式得出Ki值。此外，為進一步確認本組合成的Bombesin、DSPE-PEG2000 -BBN及Liposome-BBN的生物活性，完全相同的實驗是以Bombesin® -Fluka(購買自Fluka公司)做為實驗的對照組，Bombesin® -Fluka是天然的蛙皮素，故是極佳的對照組。
結果如圖1所示，可以看出Bombesin之IC50 為0.186nM而Ki值為0.146nM；DSPE-PEG2000 -BBN之IC50 為0.627nM而Ki值為0.494nM；Liposome-BBN之IC50 為4.480nM而Ki值為3.527nM。
實施例四：錸-188-DXR-Liposome-BBN之細胞毒殺分析
錸-188-DXR-Liposome-BBN對於人類前列腺癌細胞株PC-3的細胞毒殺實驗結果是用Trypan Blue染色細胞，並以細胞計數器計算細胞數加以分析而得，詳述如下： PC-3為貼附型細胞，於細胞毒殺實驗前一天，種植於25T平底細胞培養瓶中，實驗當天進行188 Re-BMEDA的標幟(標幟效率100%)及188 Re-BMEDA loading(loading效率為70-80%)實驗。藥物分組及濃度(以PC-3培養液稀釋)為：正常組(正常細胞培養液)、控制組(生理食鹽水)、188 Re-BMEDA(30.5μCi/ml)、188 Re-Liposome-BBN(簡寫為188 Re-LB 30.5μCi/ml)、DXR-Liposome-BBN(簡寫為LDB 32μg/ml)及188 Re-DXR-Liposome-BBN(簡寫為188 Re-LDB 32μg/30.5μCi/ml)。細胞毒殺實驗進行時(細胞約為5分滿)，更換含有上述五組藥物的培養液2ml，並於37℃細胞培養箱中反應1小時。之後小心的以PBS清洗六次後，加入新鮮培養液，復於37℃細胞培養箱中，持續培養。二天後，將各組25T平底細胞培養瓶的細胞進行Trypan Blue染色細胞，並以CountessTM cell counter(Invitrogen,Carlsbad,California,USA)計數器計算活細胞數，並以下列公式計算細胞存活率： 實驗結果如圖2所示，靶向性組合治療藥物188 Re-LDB對PC-3細胞有最佳的毒殺效果，細胞存活率只有28.6±3.7%。
實施例五：錸-188-Liposome-BBN micro-SPECT造影及影像定量分析
以1.5~2% isoflurane(in 100% oxygen)麻醉老鼠後，將188 Re-Liposome-BBN以尾靜脈注射(IV injection)方式打 入老鼠體內，分別於注射後1小時、24小時、48小時、72小時，以1.5~2% isoflurane(in 100% oxygen)麻醉老鼠，且造影期間仍持續以3% isoflurane(in 100% oxygen)麻醉老鼠；將老鼠四肢拉直固定於動物檯上，以利用低能量，高解析度的準值儀(collimator)進行micro-SPECT造影，能量視窗(energy window)設定為155±10% keV，影像大小設定為64 x 64 x 64，ROR：1.0cm，FOV：1.37cm。影像分析部份，圈取影像中腫瘤組織ROI(region of interest)的區域，依據已知活度的參考射源(Reference)，計算出每一克的腫瘤組織具有多少放射活度(μ Ci/g)，帶入下列公式計算腫瘤組織標準吸收值(SUV)：(measured activity concentration(μCi/g)/[Injected Dose(μCi)/body weight(g)]
由造影結果，如圖3所示，可看到188 Re-liposome-BBN注射1小時後，右後腿腫瘤位置即有明顯的吸收，直至24小時仍有明顯的影像。在注射後1、4小時腫瘤組織的吸收量(Standardised tumor uptake value；SUV)分別為1.54及1.25。
圖1 Liposome-BBN生物活性試驗結果；圖2錸-188-DXR-Liposome-BBN對於人類前列腺癌細胞株PC-3的細胞毒殺實驗結果；以及圖3 錸-188-Liposome-BBN micro-SPECT造影及影像定量分析

Claims (6)

  1. 一種利用一鍋法合成可應用於癌症診斷造影與標靶治療的多功能微脂體之方法，其係為使用一鍋式製備方法，將放射核種溶液、化療藥物、與標的分子在適當的溫度下與微脂體進行反應，其中該標的分子是由DSPE-PEG-BBN所組成之微胞溶液。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該一鍋式製備方法所使用之放射性核種溶液係為188 Re-BMEDA、186 Re-BMEDA、99m Tc-BMEDA及與其衍生之放射性核種溶液所組成之群組。
  3. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該一鍋式製備方法使用化療藥物係為vinca衍生藥物vinorelbine、vincristine、vinblastine、vinflunine及anthracyline類(小紅莓類)的藥物所組成之群組。
  4. 如申請專利範圍第3項所述之方法，其中該化療藥物anthracyline類係為doxorubicin、daunorubicin、mitomycin C及epirubicin所組成之群組。
  5. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該一鍋式製備方法之適當溫度在4℃~110℃之間。
  6. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該一鍋式製備方法使用之微脂體其組成為磷脂質與其衍生物、聚乙二醇(PEG)、聚乙二醇衍生物、膽固醇及膽固醇衍生物所組成之群組。
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Sofou S and Sgouros G, "Antibody-targeted liposomes in cancer therapy and imaging" Expert Opinion on Drug Delivery, Feb 2008;5(2):189-204 *
林翊翔碩士論文，RGD 胜肽耦合與188Re 及Doxorubicin 包埋之微脂體在植有 U-87 MG 腫瘤小鼠之生物分佈與藥動研究，國立清華大學，2007 年 *

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