CN105039465B - 一种酶催化二硫键交联的天然高分子水凝胶及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
一种酶催化二硫键交联的天然高分子水凝胶及其制备方法,水凝胶含有胱胺或N,N’‑二乙酰‑L‑胱胺酸交联键构成的三维网络结构,由接枝巯基的天然高分子在辣根过氧化酶为催化剂,苯酚类化合物为酶促底物的条件下,通过快速形成二硫键交联而得到。本发明原料来源安全、环保,产品具有非常优异的生物相容性;反应条件温和,操作简单;体系无需外加双氧水,所装载药物或细胞的生理活性得到完全保障。
Description
技术领域
本发明属于医用生物材料领域。
背景技术
水凝胶是一种经过适度交联而得到的具有三维网络结构的功能高分子材料,具有很高的含水量并且柔韧的自然特性,使得它具有很好的生物相容性,并类似天然的细胞外基质,能够有效降低组织刺激和细胞黏附(Park,H.;Park,K.,Pharm.Res.1996,13, 1770)。更重要的是水凝胶的多孔结构,以及高含水量使得它非常适合包埋具有生物活性的物质,如细胞、药效蛋白质和多肽类药物,不像其他的释放体系(微粒,乳剂等) 在制备的过程中可能会损坏细胞和蛋白质的活性,水凝胶的制备是在较温和的条件下进行的,有利于保存细胞和蛋白质的活性。因此,水凝胶作为一类新型的医用生物材料,在组织工程、药物输送与控制释放等领域具有广阔的应用前景。特别是可快速原位形成的刺激响应性(如pH、温度和氧化还原响应性)水凝胶极具临床应用价值。氧化还原响应的水凝胶是近年来研究的热点之一,其中最具代表性的就是包含二硫键的水凝胶。二硫键广泛存在于人体内,人体中最重要反应之一就是二硫键的形成和断裂。在还原性环境下,二硫键可以被还原成硫醇;而在氧化性环境下,两个硫醇又可以被氧化生成二硫键。传统的合成二硫键交联的水凝胶的方法是通过含二硫键的交联剂(如双丙烯酰胱胺、胱胺等)交联聚合物制备,制备过程通常需要有机溶剂、催化剂和较高的反应温度,残留的单体和催化剂可能导致制备的水凝胶生物相容性不好,凝胶形成速率慢,无法制备快速原位交联的氧化还原响应水凝胶。
酶催化交联制备水凝胶近年来得到广泛应用,酶催化反应具有反应速率快、反应条件温和、生物相容性好的优点,可快速原位形成可注射的水凝胶。并且在酶催化交联过程中,可以原位包埋细胞、蛋白质等生物活性物质,不会影响装载物的生理活性。近年来以辣根过氧化酶(HRP)为酶介导的催化体系经常用来制备水凝胶,辣根过氧化酶经双氧水(H2O2)活化后能够高效耦合苯酚和苯胺类衍生物自由基(S.Koayashi,H. Uyama and S.Kimura.,Chem.Rev.2001,101,3793)。天然高分子是一类在自然界广泛存在的大分子,如透明质酸、壳聚糖、聚谷氨酸和海藻酸等,它们由生物合成并广泛存在于生物体内,具有良好的生物相容性和生物可降解性。天然高分子大分子链上存在大量的活性基团(如羧基、羟基和胺基),可以方便地化学改性或交联,经常用于制备可生物降解的水凝胶。将透明质酸(KurisawaM,Chung JE,Yang YY,Gao SJ,Uyama H., Chem.Commun.2005;34:4312-4314)、壳聚糖(Tran NQ,Joung YK,Lih E,Park KD., Biomacromolecules.2011;12:2872–2880)、聚谷氨酸(Peng ZP.,She YQ.,Chen L.,J. Biomat.Sci.-Polym.E.,2015;26:111-127.)和海藻酸(Sakai S,Hirose K,Moriyama K, Kawakami K.Acta Biomater.2010;6:1446–1452.)大分子链上的羧基或胺基接枝上酚羟基基团后可制备键合酚羟基的天然高分子,将其配制成一定浓度的预聚物溶液,再加入一定浓度的辣根过氧化酶和双氧水可快速原位交联形成水凝胶。但是通过直接加入双氧水来活化辣根过氧化酶,往往由于双氧水过量,导致辣根过氧化酶形成惰性中间体,导致酶活性降低(K.J.aynton,J.K.ewtra,N.iswas and K.E.Taylor.,Biochim. Biophys.Acta.1994,1206,272),或者形成的水凝胶均一性较差,甚至会影响装载药物的活性,从而在一定程度上限制了酶催化交联水凝胶作为药物载体的应用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种酶催化二硫键快速交联的天然高分子水凝胶及其制备方法,以辣根过氧化酶为催化剂在不添加双氧水的条件下,通过添加少量苯酚类化合物,酶催化快速氧化巯基制备二硫键交联水凝胶的新方法。
本发明是通过以下技术方案实现的。
酶催化交联制备水凝胶(以辣根过氧化酶为例)往往是通过在双氧水的活化作用下,形成活性中间体,交联带有酚羟基的聚合物,制备三维交联网络结构,但外加双氧水容易导致辣根过氧化酶形成惰性中间体,或者破坏装载药物的活性。为了克服这一问题,本发明摒弃原有的HRP/H2O2交联酚羟基类化合物体系,采用以苯酚类化合物为酶促底物,通过酶催化氧化巯基形成二硫键的这一原理,制备三维交联网络水凝胶。
本发明所述的一种酶催化二硫键交联的天然高分子水凝胶是含有如下胱胺或 N,N’-二乙酰-L-胱胺酸键构成的三维交联结构:
或者
本发明所述的一种酶催化二硫键交联的天然高分子水凝胶的制备方法包括以下步骤:
(1)制备接枝巯基的天然高分子;
(2)配制接枝巯基的天然高分子预聚体溶液,向预聚体溶液中加入辣根过氧化酶溶液混合均匀,再向该混合溶液中加入苯酚类化合物溶液混合均匀,利用苯酚类化合物作为酶促底物,通过辣根过氧化酶氧化巯基得到二硫键,于20~37℃快速形成三维交联网络天然高分子水凝胶。
所述的天然高分子为透明质酸、壳聚糖、聚谷氨酸、海藻酸及其衍生物中的任意一种或几种。
所述的接枝巯基是指在天然高分子的羧基或者氨基位置通过酰胺键键合半胱胺盐酸盐,N-乙酰-L-半胱氨酸,半胱氨酸中的任一种得到,或通过酰胺键键合胱胺二盐酸盐再通过D,L-二硫苏糖醇断开二硫键制得。
所述的苯酚类化合物为酪胺,苯酚,间苯二酚,甘氨酰-L-酪氨酸中任一种,其作用是作为酶催化交联反应的促进剂。
步骤(1)制备接枝巯基的天然高分子,可以直接通过半胱胺盐酸盐的氨基与天然高分子(透明质酸、聚谷氨酸和海藻酸)的羧基发生酰化反应,或者用胱胺二盐酸盐与之发生酰化反应,然后用D,L-二硫苏糖醇(DTT)断开二硫键制得;也可用半胱氨酸、N-乙酰-L-半胱氨酸的羧基与壳聚糖的氨基发生酰化反应制得。
本发明的步骤(1)属于羧酸与胺的缩合酰化反应,反应体系呈酸性时,在1-(3- 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC.HCL)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)协同作用下,活化羧基,形成活性中间体,在弱碱性pH环境下与氨基发生缩合反应,制得带有二硫键活性基团的天然高分子,然后将反应溶液pH值调至8-8.5,加入DTT断开二硫键生成键合巯基的天然高分子,二硫键断开过程要在氮气氛围且避光进行。
本发明的步骤(2)中配制的预聚体最终浓度为1~10%(W/V),辣根过氧化酶最终浓度为5~50unit/mL,苯酚类化合物最终浓度为5~50mM,配制溶液所用溶剂为纯水、缓冲溶液、组织培养液中一种。巯基活性基团能够在空气中自氧化形成巯基自由基,然后通过巯基自由基相互碰撞交联形成稳定的二硫键,利用这个原理就可以将多个带有巯基活性基团的大分子相互交联形成三维交联体。然而,通过巯基在空气中的自氧化交联得到二硫键这一过程非常缓慢,往往需要数天的时间才能得到稳定的三维交联体。为了加快这一过程,本发明添加苯酚类化合物作为酶促底物,不需要外加 H2O2,不仅可以避免外加H2O2带来的不良影响,还可以在很短的时间内形成稳定的三维交联体,大大加快了巯基氧化交联速率。
这一催化机理如附图2所示(Kousuke M.,Kosuke M.,Rie W.,Masahiro G.,.Noriho K.,Chem.Commun.2014,50,5895-5898)。
巯基被空气中的氧气氧化形成巯基自由基,在这一过程中会伴随有微量的H2O2产生。HRP中的催化中心为铁离子,在一分子H2O2作用下,苯酚类化合物很容易被氧化成苯酚自由基,生成的苯酚自由基夺取巯基上的氢,形成大量的巯基自由基,进而交联形成二硫键,最后构建出水凝胶三维交联网络。
本发明具有以下优点和有益效果。
(1)本发明提出的酶催化二硫键交联的天然高分子水凝胶的制备方法反应条件温和、操作简单,只需要有多个带有巯基活性基团的大分子,HRP和微量的苯酚类化合物就能在生理环境下快速形成水凝胶,并且具有氧化还原响应性的特点。凝胶化速率、凝胶弹性模量、溶胀性能和还原响应的降解速率可以通过改变巯基改性的天然高分子、 HRP和苯酚类化合物的浓度方便地调控。
(2)本发明提出的酶催化二硫键交联的水凝胶,交联速度快,最快可在20min 内完成,在交联反应完成之前是流动性很好的溶液,是一种原位成型的可注射水凝胶。
(3)本发明所用的原材料本身就以一定比例存在于动物组织,制备的水凝胶具有非常优异的生物相容性和生物降解性。
(4)本发明在不添加双氧水的条件下,通过添加少量苯酚类化合物酶促交联巯基化天然高分子制备具有氧化还原响应性水凝胶的新方法既克服了化学交联剂带来的毒性,又解决了外加双氧水容易导致辣根过氧化酶形成惰性中间体,或者破坏装载药物生理活性的缺点。
(5)本发明制备的水凝胶由于具有氧化还原响应性特点,可以用来进行细胞和生物活性药物的封装及释放,在生物医用应用方面具有广泛前景。
附图说明
图1是催化机理简图。
图2是巯基接枝的透明质酸大分子的结构简图。
图3是实施例1制备的巯基接枝的透明质酸大分子1H NMR图谱。
图4是巯基接枝的 壳聚糖大分子的结构简图。
图5是实施例2制备的巯基接枝的壳聚糖大分子1H NMR图谱。
图6是巯基接枝的聚谷氨酸大分子的结构简图。
图7是实施例3制备的巯基接枝的聚谷氨酸大分子1H NMR图谱。
图8是实施例13 制备的水凝胶SEM图。
图9是实施例14 制备的水凝胶可还原性降解图。
具体实施方式
下面结合各实施例和附图对本发明进一步地解释。
实施例1。
接枝巯基的透明质酸大分子(HA-SH)的制备。
称取透明质酸钠(2g,5mmol)溶于100mL的二次蒸馏水中,用磁力搅拌器在室温下搅拌至完全溶解。称取N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)(2.3g,20mmol),1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC.HCL)(3.832g,20mmol)加入上述已溶解完全的透明质酸钠溶液,将溶液pH值调至5.4左右,在室温下活化1h。称取胱胺二盐酸盐(3.372g, 15mmol)加入上述已活化溶液中,室温搅拌反应48h。反应液移入透析袋(MWCO3500) 中用二次蒸馏水透析24h。称取D,L-二硫苏糖醇(DTT)(4.6275g,30mmol)加入上述已透析24h的反应液中,将pH值调至8.5,避光且在氮气氛围下反应24h,将反应液pH 值调至5,移入透析袋用二次蒸馏水透析3天,透析液pH值用盐酸调至5。透析完毕后将反应液用液氮快速冷冻,冷冻干燥得到白色絮状产物,结构如图2所示。1H NMR 谱图如图3所示。通过Ellman试剂测得自由巯基含量为6.5%。接枝巯基的海藻酸大分子可采用相同的合成步骤制备。
实施例2。
接枝巯基的壳聚糖大分子(CS-SH)的制备
称取壳聚糖(0.5g)溶于50mL的二次蒸馏水中,加入2mL 1mol/L的盐酸,用磁力搅拌器在室温下搅拌至完全溶解,用1mol/L NaOH回调至pH 6。称取N-乙酰半胱-L- 氨酸(NAC)(2.3563g,14.4mmol),N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)(2.0g,17.3mmol),1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC.HCL)(3.5g,18.3mmol)溶于6mL N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中。将上述DMF混合溶液滴加至已溶解完全的壳聚糖溶液中,将溶液pH 值保持在6.0左右,室温搅拌反应24h。反应液移入透析袋(MWCO3500)中用二次蒸馏水透析24h。称取D,L-二硫苏糖醇(DTT)(2.31g,15mmol)加入上述已透析24h的反应液中,避光且在氮气氛围下反应24h,将反应液移入透析袋用5mM盐酸透析1天, 1wt%的NaCl溶液透析1天,1mM的盐酸透析1天。透析完毕后将反应液用液氮快速冷冻,冷冻干燥得到白色絮状产物,结构如图4所示。1HNMR谱图如图5所示。通过Ellman试剂测得自由巯基含量为3.5%。
实施例3。
接枝巯基的聚谷氨酸大分子(PGA-SH)的制备
称取聚谷氨酸钠(0.3g)溶于30mL的二次蒸馏水中,用磁力搅拌器在室温下搅拌至完全溶解。称取N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)(0.2624g,2.28mmol),1-(3-二甲氨基丙基)-3- 乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC.HCL)(1.14g,5.94mmol)加入上述已溶解完全的聚谷氨酸钠溶液,将溶液pH值调至6.0左右,在室温下活化1h。称取半胱胺盐酸盐(0.675g, 5.94mmol)加入上述已活化溶液中,室温搅拌反应24h。将反应液移入透析袋用1mM 盐酸透析1天,1wt%的NaCl溶液透析1天,1mM的盐酸透析1天。透析完毕后将反应液用液氮快速冷冻,冷冻干燥得到白色絮状产物,结构如图6所示。1H NMR谱图如图7所示。通过Ellman试剂测得自由巯基含量为2.9%。
实施例4。
HA-SH自氧化交联水凝胶的制备。
称取实施例1中合成的大分子预聚体(HA-SH)10mg,用pH=7.4的PBS缓冲液配制成10mg/mL的预聚体溶液,观察到经过48h后生成水凝胶。
实施例5。
辣根过氧化酶/酪胺催化交联水凝胶的制备。
称取实施例1中合成的大分子预聚体(HA-SH)10mg,用0.5mL pH=7.4的PBS缓冲液充分搅拌溶解,配制为一号溶液。称取1.44mg酪胺盐酸盐溶于4mL PBS缓冲液,配制为二号溶液。称取1mg HRP(300unit/mg)溶于1.177mL PBS缓冲液,配制为三号溶液。分别取500uL二号溶液,20uL三号溶液加入一号溶液中,经过62min后生成无色透明水凝胶。体系预聚体浓度为1%(w/v),HRP浓度为5unit/mL,酪胺盐酸盐浓度为1mM。
实施例6。
称取实施例2中合成的大分子预聚体(CS-SH)20mg,用0.6mL pH=7.4的PBS缓冲液充分搅拌分散,加入0.04mL的1M的盐酸搅拌完全溶解后,再加入0.04mL的 1M NaOH回调pH值,配制为一号溶液。称取0.345mg酪胺盐酸盐溶于4mL PBS缓冲液,配制为二号溶液。称取1mg HRP(300unit/mg)溶于1.0mL PBS缓冲液,配制为三号溶液。分别取40uL二号溶液,40uL三号溶液加入一号溶液中,再加入240uLPBS 溶液混合均匀,经过29min后生成淡黄色透明水凝胶。体系预聚体浓度为2%(w/v), HRP浓度为12.5unit/mL,酪胺盐酸盐浓度为25mM。
实施例7。
称取实施例3中合成的大分子预聚体(PGA-SH)20mg,用0.5mL pH=7.4的PBS 缓冲液充分溶解,配制为一号溶液。称取0.345mg酪胺盐酸盐溶于4mL PBS缓冲液,配制为二号溶液。称取14.2mg酪胺盐酸盐溶于2mL PBS缓冲液,配制为二号溶液。称取1.7mg HRP(300unit/mg)溶于1mL PBS缓冲液,配制为三号溶液。分别取500uL 二号溶液,20uL三号溶液加入一号溶液中,经过33min后生成无色透明水凝胶。体系预聚体浓度为2%(w/v),HRP浓度为10unit/mL,酪胺盐酸盐浓度为20mM。
实施例8。
辣根过氧化酶/酪胺催化交联水凝胶的制备。
称取实施例1中合成的大分子预聚体(HA-SH)10mg,用0.5mL pH=7.4的PBS缓冲液充分搅拌溶解,配制为一号溶液。称取14.2mg酪胺盐酸盐溶于2mL PBS缓冲液,配制为二号溶液。称取1mg HRP(300unit/mg)溶于1.177mL PBS缓冲液,配制为三号溶液。分别取500uL二号溶液,20uL三号溶液加入一号溶液中,经过25min后生成无色透明水凝胶。体系预聚体浓度为1%(w/v),HRP浓度为5unit/mL,酪胺盐酸盐浓度为20mM。
实施例9。
辣根过氧化酶/酪胺催化交联水凝胶的制备。
称取实施例1中合成的大分子预聚体(HA-SH)10mg,用0.5mL pH=7.4的PS缓冲液充分搅拌溶解,配制为一号溶液。称取35.5mg酪胺盐酸盐溶于2mL PBS缓冲液,配制为二号溶液。称取1mg HRP(300unit/mg)溶于1.177mL PBS缓冲液,配制为三号溶液。分别取500uL二号溶液,20uL三号溶液加入一号溶液中,经过23min后生成无色透明水凝胶。体系预聚体浓度为1%(w/v),HRP浓度为5unit/mL,酪胺盐酸盐浓度为50mM。
实施例10。
辣根过氧化酶/酪胺催化交联水凝胶的制备。
称取实施例1中合成的大分子预聚体(HA-SH)10mg,用0.5mL pH=7.4的PBS缓冲液充分搅拌溶解,配制为一号溶液。称取35.5mg酪胺盐酸盐溶于2mL PBS缓冲液,配制为二号溶液。称取1.7mg HRP(300unit/mg)溶于1mL PBS缓冲液,配制为三号溶液。分别取500uL二号溶液,20uL三号溶液加入一号溶液中,经过24min后生成无色透明水凝胶。体系预聚体浓度为1%(w/v),HRP浓度为10unit/mL,酪胺盐酸盐浓度为50mM。
实施例11。
辣根过氧化酶/酪胺催化交联水凝胶的制备。
称取实施例1中合成的大分子预聚体(HA-SH)10mg,用0.5mL pH=7.4的PBS缓冲液充分搅拌溶解,配制为一号溶液。称取35.5mg酪胺盐酸盐溶于2mL PBS缓冲液,配制为二号溶液。称取4.25mg HRP(300unit/mg)溶于0.5mL PBS缓冲液,配制为三号溶液。分别取500uL二号溶液,20uL三号溶液加入一号溶液中,经过25min后生成无色透明水凝胶。体系预聚体浓度为1%(w/v),HRP浓度为50unit/mL,酪胺盐酸盐浓度为50mM。
实施例12。
水凝胶溶胀性能研究。
将体系预聚体浓度分别为1%、3%、5%,HRP浓度为5unit/mL,酪胺盐酸盐浓度为20mM制备的水凝胶经冷冻干燥后,准确称重置于pH=7.4的PBS缓冲液中,充分溶胀3天,用滤纸去除表面的水后,称重,通过溶胀公式WR=(Ws-Wd)/Wd可以算出溶胀率分别为40.81、28.41、25.40。WR指水凝胶的吸水溶胀率,Ws指充分吸水溶胀的水凝胶质量,Wd指冻干的水凝胶质量。
实施例13。
水凝胶微结构形貌分析。
将体系预聚体浓度为5%,HRP浓度为5unit/mL,酪胺盐酸盐浓度为20mM制备的水凝胶经液氮淬冷后冷冻干燥,采用扫描电镜进行形貌分析,如图8所示。
实施例14。
水凝胶可还原降解性能研究。
将体系预聚体浓度为3%,HRP浓度为5unit/mL,酪胺盐酸盐浓度为20mM制备的水凝胶切成三块大小、形状相同的样品,置于pH=7.4的PS缓冲液中,充分溶胀3 天,用滤纸去除表面的水后,称重。配制浓度为5mM、10mM的DL-半胱氨酸(Cys) 的PBS缓冲溶液。将三块水凝胶样品分别置于浓度为0mM、5mM、10mM的DL- 半胱氨酸的PBS缓冲溶液进行降解,降解性能如图9所示。
Claims (2)
1.一种酶催化二硫键交联的天然高分子水凝胶的制备方法,
所述酶催化二硫键交联的天然高分子水凝胶含有如下胱胺或N,N’-二乙酰-L-胱胺酸键构成的三维交联结构:
或者
其特征是按如下步骤:
(1)制备接枝巯基的天然高分子,所述的天然高分子为透明质酸、壳聚糖、聚谷氨酸或海藻酸:
接枝巯基的透明质酸大分子的制备:称取2g,5mmol透明质酸钠溶于100mL的二次蒸馏水中,用磁力搅拌器在室温下搅拌至完全溶解;称取2.3g,20mmolN-羟基琥珀酰亚胺,3.832g,20mmol 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐加入上述已溶解完全的透明质酸钠溶液,将溶液pH值调至5.4,在室温下活化1h;称取3.372g,15mmol胱胺二盐酸盐加入上述已活化溶液中,室温搅拌反应48h;反应液移入透析袋中用二次蒸馏水透析24h;称取4.6275g,30mmol D,L-二硫苏糖醇加入上述已透析24h的反应液中,将pH值调至8.5,避光且在氮气氛围下反应24h,将反应液pH值调至5,移入透析袋用二次蒸馏水透析3天,透析液pH值用盐酸调至5;透析完毕后将反应液用液氮快速冷冻,冷冻干燥得到白色絮状产物,即为接枝巯基的透明质酸大分子;接枝巯基的海藻酸大分子可采用相同的合成步骤制备;
接枝巯基的壳聚糖大分子的制备:称取0.5g壳聚糖溶于50mL的二次蒸馏水中,加入2mL1mol/L的盐酸,用磁力搅拌器在室温下搅拌至完全溶解,用1mol/LNaOH回调至pH6;称取2.3563g,14.4mmol N-乙酰半胱-L-氨酸,2.0g,17.3mmol N-羟基琥珀酰亚胺,3.5g,18.3mmol1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐溶于6mL N,N-二甲基甲酰胺中;将上述DMF混合溶液滴加至已溶解完全的壳聚糖溶液中,将溶液pH值保持在6.0,室温搅拌反应24h;反应液移入透析袋中用二次蒸馏水透析24h;称取2.31g,15mmol D,L-二硫苏糖醇加入上述已透析24h的反应液中,避光且在氮气氛围下反应24h,将反应液移入透析袋用5mM盐酸透析1天,1wt%的NaCl溶液透析1天,1mM的盐酸透析1天;透析完毕后将反应液用液氮快速冷冻,冷冻干燥得到白色絮状产物,即为接枝巯基的壳聚糖大分子;
接枝巯基的聚谷氨酸大分子的制备:称取0.3g聚谷氨酸钠溶于30mL的二次蒸馏水中,用磁力搅拌器在室温下搅拌至完全溶解;称取0.2624g,2.28mmol N-羟基琥珀酰亚胺,1.14g,5.94mmol 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐加入上述已溶解完全的聚谷氨酸钠溶液,将溶液pH值调至6.0,在室温下活化1h;称取0.675g,5.94mmol半胱胺盐酸盐加入上述已活化溶液中,室温搅拌反应24h;将反应液移入透析袋用1mM盐酸透析1天,1wt%的NaCl溶液透析1天,1mM的盐酸透析1天;透析完毕后将反应液用液氮快速冷冻,冷冻干燥得到白色絮状产物,即为接枝巯基的聚谷氨酸大分子;
(2)配制接枝巯基的天然高分子预聚体溶液,其最终浓度为1~10%(W/V),向预聚体溶液中加入辣根过氧化酶溶液混合均匀,辣根过氧化酶最终浓度为5~50unit/mL,再向该混合溶液中加入苯酚类化合物溶液混合均匀,苯酚类化合物最终浓度为5~50mM,于20~37℃交联,配制溶液所用溶剂为纯水、缓冲溶液、组织培养液中一种。
2.根据权利要求1所述的酶催化二硫键交联的天然高分子水凝胶的制备方法,其特征在于所述的苯酚类化合物为酪胺、苯酚、间苯二酚或甘氨酰-L-酪氨酸中任意一种。
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