CN101965357A - 多肽、基质、水凝胶以及使用它们进行组织再生和修复的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了包含SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列的新型层粘连蛋白多肽。还公开了包含多糖(例如透明质酸)和该新型层粘连蛋白多肽或者包含透明质酸、层粘连蛋白多肽和抗氧化剂(如超氧化物歧化酶)的组成物，以及包含所述组成物的、可用于离体或体内组织形成和用于治疗以组织患病、损伤或损失为特征的病状的基质和水凝胶。

Description

多肽、基质、水凝胶以及使用它们进行组织再生和修复的方法
技术领域和背景技术
本发明在其一些实施方案中涉及包含新型层粘连蛋白多肽的组合物，更具体涉及但不唯独涉及包含该组合物的基质和水凝胶以及使用该组合物的方法。
水合凝胶(水凝胶)在生理温度和pH下是粘稠、半固体物质，其可用于组织工程、再生医学和用作生物材料。例如，水凝胶是从多糖(Coviello等人，2007)如透明质酸(例如使用透明质酸与磷酸钙、壳聚糖、明胶或藻酸盐的混杂组合)或壳聚糖(例如壳聚糖与层粘连蛋白肽；Suzuki等人，2003；Itoh等人，2005；Matzuda等人，2005；Ho等人，2005)以及从合成材料如聚(甲基丙烯酸-2-羟乙酯)制备。透明质酸基水凝胶为细胞和组织(如为神经再生)提供生长支持环境(Suzuki等人，2003；Itoh等人，2005)，同时指导营养剂和抗氧化剂的迁移和再生。
层粘连蛋白是基膜糖蛋白，其充当黏附分子介导细胞骨架结合的整联蛋白、钙黏着蛋白、细胞黏附分子(CAMs)和胞外基质(ECM)组分并与它们相互作用，并支持细胞迁移、附着、增殖、分化和存活。用层粘连蛋白修饰的透明质酸剂水凝胶被证明能促进神经突延伸(Hou等人，2005)。某些层粘连蛋白序列重复被发现对细胞表面受体具有生物活性。这些序列重复包括IKVAV(SEQ ID NO：1)和YIGSR(SEQ IDNO：2)，它们充当迁移、再生和生长的“导轨”(Tashiro等人，1989；Powell和Kleinmann，1997；Niece等人，2003；Hallmann等人，2005)。
针对氧化胁迫的主要防御机制是超氧化物歧化酶(SOD)，其催化超氧化物阴离子自由基(O2 -)歧化成过氧化氢(H2O2)和氧(O2)。包含来自牛红细胞、与透明质酸钠缀合的SOD的水凝胶被发现在小鼠中没有免疫原性，且显示出比单独的透明质酸和SOD高得多的抗炎活性(Sekurai等人，1997)。另外，还发现SOD不仅能抑制活性氧中间体(ROS)的诱导，而且能抑制由机械胁迫引起的HA解聚作用(Yamazaki等人，2003)。
另外的背景技术包括Hartman JR.，1986(Proc.Natl.Acad.Sci.83：7142-7146)。
发明概述
本发明一些实施方案的一个方面提供包含SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列的多肽。
本发明一些实施方案的一个方面提供包含多糖和本发明多肽的组成物。
本发明一些实施方案的一个方面提供包含透明质酸、层粘连蛋白多肽和抗氧化剂的组成物。
本发明一些实施方案的一个方面提供包含透明质酸、超氧化物歧化酶(SOD)和本发明多肽的组成物。
本发明一些实施方案的一个方面提供包含本发明组成物的基质。
本发明一些实施方案的一个方面提供包含本发明组成物的水凝胶。
本发明一些实施方案的一个方面提供产生水凝胶的方法，该方法包括将本发明组成物悬浮于水中以获得包含至少80％水的悬浮液，从而产生水凝胶。
本发明一些实施方案的一个方面提供诱导组织的离体形成的方法，该方法包括：(a)提供本发明的基质或水凝胶；(ii)用处于适合细胞的增殖、分化和/或迁移的培养基中的细胞接种该基质或水凝胶，从而诱导组织的形成。
本发明一些实施方案的一个方面提供诱导组织的体内形成的方法，该方法包括将本发明的基质或水凝胶植入受试者体内，从而诱导组织的形成。
本发明一些实施方案的一个方面提供治疗具有以组织患病、损伤或损失为特征的病状的受试者的方法，该方法包括将本发明的基质或水凝胶植入在受试者的患病、损伤或损失的组织处或附近，从而诱导组织的形成和治疗受试者。
根据本发明的一些实施方案，多糖是透明质酸。
根据本发明的一些实施方案，组成物还包含抗氧化剂。
根据本发明的一些实施方案，抗氧化剂是超氧化物歧化酶(SOD)。
根据本发明的一些实施方案，层粘连蛋白多肽为SEQ ID NO：3所示。
根据本发明的一些实施方案，层粘连蛋白多肽由SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列组成。
根据本发明的一些实施方案，超氧化物歧化酶包含SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列。
根据本发明的一些实施方案，组成物是经交联的。
根据本发明的一些实施方案，多糖、抗氧化剂和/或多肽是经交联的。
根据本发明的一些实施方案，透明质酸、超氧化物歧化酶(SOD)和多肽是经交联的。
根据本发明的一些实施方案，该方法还包括将组成物进行交联。
根据本发明的一些实施方案，交联是用选自EDC-N-(3-二甲基(dimenthy)-氨基丙基(aminoprophyl))-N-乙基碳二亚胺、DVS-二乙烯基砜和京尼平的交联剂来实现。
根据本发明的一些实施方案，悬浮液包含至少95％水。
根据本发明的一些实施方案，透明质酸以在水凝胶中约0.5-1.5％的浓度范围提供。
根据本发明的一些实施方案，多肽以在水凝胶中约20-100μg/ml的浓度范围提供。
根据本发明的一些实施方案，超氧化物歧化酶以在水凝胶中约5-40μg/ml的浓度范围提供。
根据本发明的一些实施方案，基质或水凝胶还包含细胞。
根据本发明的一些实施方案，组织是神经组织。
根据本发明的一些实施方案，细胞是干细胞。
根据本发明的一些实施方案，干细胞当接种在基质或水凝胶中时分化成神经元细胞。
根据本发明的一些实施方案，水凝胶为冻干形式。
除非另有定义，否则本文所用的所有技术和/或科学术语的含义与本发明所属技术领域普通技术人员通常理解的含义相同。下文描述的是示例性的方法和/或材料，不过与本文所述的这些方法和材料相似或等同的方法和材料也可用于实施或试验本发明的实施方案。如有冲突，将以本发明说明书(包括定义在内)为准。另外，材料、方法和实施例仅仅旨在说明本发明，并不表示必定限制本发明。
附图说明
本文仅以举例的方式参照以下附图描述了本发明的一些实施方案。现将具体详细地说明附图，不过要强调的是附图所示的细节仅以举例方式给出，目的是对本发明的实施方案进行说明性讨论。这样，将说明书与附图相结合，能使本领域技术人员清楚明白如何可以实施本发明的实施方案。
本专利或申请文件含有至少一张彩色制作的图画。在提出请求并支付必要费用后，专利局可提供带彩色图画的本专利或专利申请公开说明书的拷贝。
附图中：
图1是现有技术的示意图，描绘了超氧化物歧化酶(SOD)同源物的氧化还原活性位点，该位点包括包围着催化活性金属阳离子(在这里是铜Cu)的三个组氨酸残基(His 26、74和163)和一个天冬氨酸残基(Asp 159)。另选的金属阳离子有锌(Zn)、锰(Mn)和铁(Fe)。
图2A-F是各种培养条件下用博迪恩氏胶体银染色法(图2A-C)或结晶紫染色法(图2D-F)进行染色的原代细胞的显微照片。衍自大鼠胚胎(妊娠16-18天)的大脑半球的原代胎鼠脑细胞在塑料平皿上在Eagle培养基(补加2mM谷氨酰胺和5mg/ml葡萄糖的Eagle基础培养基)存在下培养3天，然后用水凝胶[1.2％透明质酸水凝胶(图2B)或透明质酸超氧化物歧化酶-层粘连蛋白肽(SEQ ID NO：3)水凝胶(图2C-F)]或用Eagle培养基覆盖细胞，再培养12天后进行染色和拍照。图2A-在Eagle培养基存在下培养的用博迪恩氏胶体银染色法进行染色的原代细胞。注意细胞为单层，不存在分化细胞的聚集体(放大倍数，x100)；图2B-用1.2％透明质酸水凝胶覆盖和用博迪恩氏胶体银染色法进行染色的原代细胞。注意细胞聚集体(放大倍数，x100)；图2C-用透明质酸-超氧化物歧化酶-层粘连蛋白肽(SEQ ID NO：3)水凝胶覆盖和用博迪恩氏胶体银染色法进行染色的原代细胞。注意分化的神经元细胞，为典型的神经元生长，细胞结合成聚集体和聚结体，具有密集的轴突出芽(放大倍数，x200)。图2D-F-用透明质酸-超氧化物歧化酶-层粘连蛋白肽(SEQ ID NO：3)水凝胶覆盖下生长和用结晶紫染色法进行染色的原代细胞。注意具有密集的轴突出芽的分化神经元细胞。图2D和E的放大倍数为x200，图2F的放大倍数为x400。
图3是描绘本发明的新型层粘连蛋白肽的序列(SEQ ID NO：3)的示意图，该序列由两个分别包含SEQ ID NO：1和2所示的氨基酸序列(以红色显示)的五肽(加框表示的序列)和以下3个另外的二聚体组成：在N末端位置的二聚体(KS)、在两个五肽之间的第二二聚体(RS)和在尾部羧基末端的第三二聚体(CV)。
本发明具体实施方案的描述
本发明在其一些实施方案中涉及包含新型层粘连蛋白多肽的组合物，更具体涉及但不唯独涉及包含该组合物的基质和水凝胶以及使用该组合物进行组织形成、再生和/或修复的方法。
在详细说明本发明的至少一个实施方案之前，应理解本发明在其应用上并不一定局限于以下描述中提出的或实施例所例示的细节内容。本发明还能有其他的实施方案，或者能以多种方式实施或执行。
本发明人在将本发明付诸实施时设计了能够支持细胞(如神经元细胞)的增殖、分化和/或迁移的新型层粘连蛋白多肽(SEQ ID NO：3)。该新型层粘连蛋白多肽包括两个层粘连蛋白五肽IKVAV(SEQ IDNO：1)和YIGSR(SEQ ID NO：2)以及以下三个被设计作为潜在的交联位点的二聚体：在N末端位置的二聚体(KS)、在两个五肽之间的第二二聚体(RS)和在羧基末端的第三二聚体(CV)。
因此，如下文的实施例部分所示，本发明人产生了包含新型层粘连蛋白多肽和抗氧化剂(超氧化物歧化酶)的多糖(透明质酸)-基水凝胶。该水凝胶当与干细胞混合时能够诱导神经元细胞分化(实施例2和图2C-F)。相反，没有新型层粘连蛋白多肽的透明质酸基水凝胶不能支持神经元细胞分化(实施例2，图2B)。另外，用京尼平对水凝胶组分进行交联并没有降低水凝胶支持细胞增殖和分化的能力(实施例2)。
因此，本发明的一个方面提供包含SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列的分离多肽。
术语“多肽”或“肽”在本文中可互换使用，涵括天然肽(降解产物、合成法合成的肽或重组肽)和模拟肽(通常为合成法合成的肽)以及作为肽类似物的拟肽和半拟肽，所述肽类似物可具有例如能使肽在体内时更稳定或更能够渗透到细胞中的修饰。这种修饰包括但不限于N末端修饰、C末端修饰、肽键修饰(包括但不限于CH2-NH、CH2-S、CH2-S＝O、O＝C-NH、CH2-O、CH2-CH2、S＝C-NH、CH＝CH或CF＝CH)、主链修饰和残基修饰。制备模拟肽化合物的方法是本领域公知的，在例如Quantitative Drug Design，C.A.Ramsden Gd.，Chapter 17.2，F.Choplin Pergamon Press(1992)中有详细说明，该文献通过引用并入本文，犹如在本文中全文给出。这个方面的更多细节在下文提供。
肽当中的肽键(-CO-NH-)可例如被以下的键取代：N-甲基化键(-N(CH3)-CO-)、酯键(-C(R)H-C-O-O-C(R)-N-)、酮亚甲基键(-CO-CH2-)、α-氮杂键(-NH-N(R)-CO-)，其中R为任何烷基，例如甲基、carba键(-CH2-NH-)、羟亚乙基键(-CH(OH)-CH2-)、硫代酰胺键(-CS-NH-)、烯烃双键(-CH＝CH-)、反酰胺键(-NH-CO-)、肽衍生物(-N(R)-CH2-CO-)，其中R为天然呈现在碳原子上的“正常”侧链。
这些修饰可出现在肽链上的任何键，甚至同时出现在几个(2-3个)键。
天然芳族氨基酸Trp、Tyr和Phe可用合成的非天然酸如TIC、萘基丙氨酸(Nol)、Phe的环甲基化衍生物、Phe的卤化衍生物或o-甲基-Tyr取代。
除以上之外，本发明的肽还可包括一个或多个修饰氨基酸或一个或多个非氨基酸单体(例如脂肪酸、复合碳水化合物等)。
术语“氨基酸”理解为包括20个天然氨基酸；常在体内进行翻译后修饰的氨基酸，例如羟脯氨酸、磷酸丝氨酸和磷酸苏氨酸；以及其他非常见氨基酸，包括但不限于2-氨基己二酸、羟赖氨酸、异锁链素、正缬氨酸、正亮氨酸和鸟氨酸。此外，术语“氨基酸”包括D-和L-氨基酸。
下表1和2列出了可用于本发明的天然氨基酸(表1)或修饰氨基酸(例如合成氨基酸，表2)。
表1
  氨基酸   三字母缩写   单字母符号
  丙氨酸   Ala   A
  精氨酸   Arg   R
  天冬酰胺   Asn   N
  天冬氨酸   Asp   D
  半胱氨酸   Cys   C
  谷氨酰胺   Gln   Q
  谷氨酸   Glu   E
  甘氨酸   Gly   G
  组氨酸   His   H
  氨基酸   三字母缩写   单字母符号
  异亮氨酸   Iie   I
  亮氨酸   Leu   L
  赖氨酸   Lys   K
  甲硫氨酸   Met   M
  苯丙氨酸   Phe   F
  脯氨酸   Pro   P
  丝氨酸   Ser   S
  苏氨酸   Thr   T
  色氨酸   Trp   W
  酪氨酸   Tyr   Y
  缬氨酸   Val   V
  任何上述氨基酸   Xaa   X
表2
  非常规氨基酸   代号   非常规氨基酸   代号
  α-氨基丁酸   Abu   L-N-甲基丙氨酸   Nmala
  α-氨基-α-甲基丁酸   Mgabu   L-N-甲基精氨酸   Nmarg
  氨基环丙烷-   Cpro   L-N-甲基天冬酰胺   Nmasn
  羧酸   L-N-甲基天冬氨酸   Nmasp
  氨基异丁酸   Aib   L-N-甲基半胱氨酸   Nmcys
  氨基降冰片基-   Norb   L-N-甲基谷氨酰胺   Nmgin
  羧酸   L-N-甲基谷氨酸   Nmglu
  环己基丙氨酸   Chexa   L-N-甲基组氨酸   Nmhis
  环戊基丙氨酸   Cpen   L-N-甲基异亮氨酸   Nmile
  D-丙氨酸   Dal   L-N-甲基亮氨酸   Nmleu
  D-精氨酸   Darg   L-N-甲基赖氨酸   Nmlys
  D-天冬氨酸   Dasp   L-N-甲基甲硫氨酸   Nmmet
  D-半胱氨酸   Dcys   L-N-甲基正亮氨酸   Nmnle
  D-谷氨酰胺   Dgln   L-N-甲基正缬氨酸   Nmnva
  D-谷氨酸   Dglu   L-N-甲基鸟氨酸   Nmorn
  D-组氨酸   Dhis   L-N-甲基苯丙氨酸   Nmphe
  D-异亮氨酸   Dile   L-N-甲基脯氨酸   Nmpro
  D-亮氨酸   Dleu   L-N-甲基丝氨酸   Nmser
  D-赖氨酸   Dlys   L-N-甲基苏氨酸   Nmthr
  D-甲硫氨酸   Dmet   L-N-甲基色氨酸   Nmtrp
  D-鸟氨酸   Dorn   L-N-甲基酪氨酸   Nmtyr
  D-苯丙氨酸   Dphe   L-N-甲基缬氨酸   Nmval
  D-脯氨酸   Dpro   L-N-甲基乙基甘氨酸   Nmetg
  D-丝氨酸   Dser   L-N-甲基-叔丁基甘氨酸   Nmtbug
  D-苏氨酸   Dthr   L-正亮氨酸   Nle
  D-色氨酸   Dtrp   L-正缬氨酸   Nva
  非常规氨基酸   代号   非常规氨基酸   代号
  D-酪氨酸   Dtyr   α-甲基-氨基异丁酸   Maib
  D-缬氨酸   Dval   α-甲基-γ-氨基丁酸   Mgabu
  D-α-甲基丙氨酸   Dmala   α-甲基环己基丙氨酸   Mchexa
  D-α-甲基精氨酸   Dmarg   α-甲基环戊基丙氨酸   Mcpen
  D-α-甲基天冬酰胺   Dmasn   α-甲基-α-萘基丙氨酸   Manap
  D-α-甲基天冬氨酸   Dmasp   α-甲基青霉胺   Mpen
  D-α-甲基半胱氨酸   Dmcys   N-(4-氨基丁基)甘氨酸   Nglu
  D-α-甲基谷氨酰胺   Dmgln   N-(2-氨基乙基)甘氨酸   Naeg
  D-α-甲基组氨酸   Dmhis   N-(3-氨基丙基)甘氨酸   Norn
  D-α-甲基异亮氨酸   Dmile   N-氨基-α-甲基丁酸   Nmaabu
  D-α-甲基亮氨酸   Dmleu   α-萘基丙氨酸   Anap
  D-α-甲基赖氨酸   Dmlys   N-苄基甘氨酸   Nphe
  D-α-甲基甲硫氨酸   Dmmet   N-(2-氨基甲酰基乙基)甘氨酸   Ngln
  D-α-甲基鸟氨酸   Dmorn   N-(氨基甲酰基甲基)甘氨酸   Nasn
  D-α-甲基苯丙氨酸   Dmphe   N-(2-羧基乙基)甘氨酸   Nglu
  D-α-甲基脯氨酸   Dmpro   N-(羧基甲基)甘氨酸   Nasp
  D-α-甲基丝氨酸   Dmser   N-环丁基甘氨酸   Ncbut
  D-α-甲基苏氨酸   Dmthr   N-环庚基甘氨酸   Nchep
  D-α-甲基色氨酸   Dmtrp   N-环己基甘氨酸   Nchex
  D-α-甲基酪氨酸   Dmty   N-环癸基甘氨酸   Ncdec
  D-α-甲基缬氨酸   Dmval   N-环十二烷基甘氨酸   Ncdod
  D-α-甲基丙氨酸   Dnmala   N-环辛基甘氨酸   Ncoct
  D-α-甲基精氨酸   Dnmarg   N-环丙基甘氨酸   Ncpro
  D-α-甲基天冬酰胺   Dnmasn   N-环十一烷基甘氨酸   Ncund
  D-α-甲基天冬氨酸   Dnmasp   N-(2，2-二苯基乙基)甘氨酸   Nbhm
  D-α-甲基半胱氨酸   Dnmcys   N-(3，3-二苯基丙基)甘氨酸   Nbhe
  D-N-甲基亮氨酸   Dnmleu   N-(3-吲哚基乙基)甘氨酸   Nhtrp
  D-N-甲基赖氨酸   Dnmlys   N-甲基-γ-氨基丁酸   Nmgabu
  N-甲基环己基丙氨酸   Nmchexa   D-N-甲基甲硫氨酸   Dnmmet
  D-N-甲基鸟氨酸   Dnmorn   N-甲基环戊基丙氨酸   Nmcpen
  N-甲基甘氨酸   Nala   D-N-甲基苯丙氨酸   Dnmphe
  N-甲基氨基异丁酸   Nmaib   D-N-甲基脯氨酸   Dnmpro
  N-(1-甲基丙基)甘氨酸   Nile   D-N-甲基丝氨酸   Dnmser
  N-(2-甲基丙基)甘氨酸   Nile   D-N-甲基丝氨酸   Dnmser
  N-(2-甲基丙基)甘氨酸   Nleu   D-N-甲基苏氨酸   Dnmthr
  D-N-甲基色氨酸   Dnmtrp   N-(1-甲基乙基)甘氨酸   Nva
  D-N-甲基酪氨酸   Dnmtyr   N-甲基a-萘基丙氨酸   Nmanap
  D-N-甲基缬氨酸   Dnmval   N-甲基青霉胺   Nmpen
  γ-氨基丁酸   Gabu   N-(对羟苯基)甘氨酸   Nhtyr
  L-叔丁基甘氨酸   Tbug   N-(硫代甲基)甘氨酸   Ncys
  L-乙基甘氨酸   Etg   青霉胺   Pen
  L-高苯丙氨酸   Hphe   L-α-甲基丙氨酸   Mala
  非常规氨基酸   代号   非常规氨基酸   代号
  L-α-甲基精氨酸   Marg   L-α-甲基天冬酰胺   Masn
  L-α-甲基天冬氨酸   Masp   L-α-甲基-叔丁基甘氨酸   Mtbug
  L-α-甲基半胱氨酸   Mcys   L-甲基乙基甘氨酸   Metg
  L-α-甲基谷氨酰胺   Mgln   L-α-甲基谷氨酸   Mglu
  L-α-甲基组氨酸   Mhis   L-α-甲基高苯丙氨酸   Mhphe
  L-α-甲基异亮氨酸   Mile   N-(2-甲基硫代乙基)甘氨酸   Nmet
  D-N-甲基谷氨酰胺   Dnmgln   N-(3-胍基丙基)甘氨酸   Narg
  D-N-甲基谷氨酸   Dnmglu   N-(1-羟乙基)甘氨酸   Nthr
  D-N-甲基组氨酸   Dnmhis   N-(羟乙基)甘氨酸   Nser
  D-N-甲基异亮氨酸   Dnmile   N-(咪唑基乙基)甘氨酸   Nhis
  D-N-甲基亮氨酸   Dnmleu   N-(3-吲哚基乙基)甘氨酸   Nhtrp
  D-N-甲基赖氨酸   Dnmlys   N-甲基-γ-氨基丁酸   Nmgabu
  N-甲基环己基丙氨酸   Nmchexa   D-N-甲基甲硫氨酸   Dnmmet
  D-N-甲基鸟氨酸   Dnmorn   N-甲基环戊基丙氨酸   Nmcpen
  N-甲基甘氨酸   Nala   D-N-甲基苯丙氨酸   Dnmphe
  N-甲基氨基异丁酸   Nmaib   D-N-甲基脯氨酸   Dnmpro
  N-(1-甲基丙基)甘氨酸   Nile   D-N-甲基丝氨酸   Dnmser
  N-(2-甲基丙基)甘氨酸   Nleu   D-N-甲基苏氨酸   Dnmthr
  D-N-甲基色氨酸   Dnmtrp   N-(1-甲基乙基)甘氨酸   Nval
  D-N-甲基酪氨酸   Dnmtyr   N-甲基a-萘基丙氨酸   Nmanap
  D-N-甲基缬氨酸   Dnmval   N-甲基青霉胺   Nmpen
  γ-氨基丁酸   Gabu   N-(对羟苯基)甘氨酸   Nhtyr
  L-叔丁基甘氨酸   Tbug   N-(硫代甲基)甘氨酸   Ncys
  L-乙基甘氨酸   Etg   青霉胺   Pen
  L-高苯丙氨酸   Hphe   L-α-甲基丙氨酸   Mala
  L-α-甲基精氨酸   Marg   L-α-甲基天冬酰胺   Masn
  L-α-甲基天冬氨酸   Masp   L-α-甲基-叔丁基甘氨酸   Mtbug
  L-α-甲基半胱氨酸   Mcys   L-甲基乙基甘氨酸   Metg
  L-α-甲基谷氨酰胺   Mgln   L-α-甲基谷氨酸   Mglu
  L-α-甲基组氨酸   Mhis   L-α-甲基高苯丙氨酸   Mhphe
  L-α-甲基异亮氨酸   Mile   N-(2-甲基硫代乙基)甘氨酸   Nmet
  L-α-甲基亮氨酸   Mleu   L-α-甲基赖氨酸   Mlys
  L-α-甲基甲硫氨酸   Mmet   L-α-甲基正亮氨酸   Mnle
  L-α-甲基正缬氨酸   Mnva   L-α-甲基鸟氨酸   Morn
  L-α-甲基苯丙氨酸   Mphe   L-α-甲基脯氨酸   Mpro
  L-α-甲基丝氨酸   mser   L-α-甲基苏氨酸   Mthr
  L-α-甲基缬氨酸   Mtrp   L-α-甲基酪氨酸   Mtyr
  L-α-甲基亮氨酸   Mval Nnbhm   L-N-甲基高苯丙氨酸   Nmhphe
  N-(N-(2，2-二苯基乙基)   N-(N-(3，3-二苯基丙基)
  氨基甲酰基甲基-甘氨酸   Nnbhm   氨基甲酰基甲基(1)甘氨酸   Nnbhe
  1-羧基-1-(2，2-二苯基乙基氨基)环丙烷   Nmbc
本发明的肽优选以线性形式应用，不过要领会，在环化不会严重干扰肽特性的情况中，也可应用环形的肽。
由于本发明的肽可应用于要求肽为可溶性形式的治疗或诊断中，本发明的肽优选包含一个或多个非天然的或天然的极性氨基酸，包括但不限于由于其含羟基的侧链而能够增加肽的溶解度的丝氨酸和苏氨酸。
本发明的肽可通过肽合成领域的技术人员知道的任何技术来合成。对于固相肽合成，多种技术的概述可见于J.M.Stewart和J.D.Young，Solid Phase Peptide Synthesis，W.H.Freeman Co.(美国旧金山)，1963及J.Meienhofer，Hormonal Proteins and Peptides，第2卷第46页，Academic Press(美国纽约)，1973。对于经典的溶液合成，参见G.Schroder和K.Lupke，The Peptides，第1卷，Academic Press(美国纽约)，1965。
大体上说，这些方法包括将一个或多个氨基酸或经适当保护的氨基酸依次添加到增长中的肽链。通常，用合适的保护基保护第一个氨基酸的氨基或羧基。接着可将该经保护的或衍生化的氨基酸连接到惰性固相载体或应用于溶液中，在适合形成酰胺键的条件下添加序列中的具有经适当保护的互补基团(氨基或羧基)的下一个氨基酸。然后从这个新添加的氨基酸残基除去保护基，再添加下一个氨基酸(经适当保护)，如此不断进行下去。在所有所需的氨基酸已按正确顺序连接后，将任何剩余的保护基(和任何固相载体)依次或同时除去，以得到最终的肽化合物。通过对这个通用的程序进行简单更改，就可以将一个以上的氨基酸一次添加到增长中的链，例如通过(在不会使手性中心外消旋化的条件下)将经保护的三肽与经适当保护的二肽偶联以在脱保护后形成五肽，如此不断添加。有关肽合成的更多描述在美国专利第6,472,505号中公开。
制备本发明肽化合物的优选方法涉及固相肽合成。
大规模肽合成由Andersson Biopolymers 2000；55(3)：227-50描述。
在需要大量的或者长的多肽(例如长度超过20个氨基酸)的情况中，可用例如以下文献中所述的重组技术产生本发明的多肽：Bitter等人，(1987)Methods in Enzymol.153：516-544，Studier等人(1990)Methods in Enzymol.185：60-89，Brisson等人(1984)Nature310：511-514，Takamatsu等人(1987)EMBO J.6：307-311，Coruzzi等人(1984)EMBO J.3：1671-1680，Brogli等人，(1984)Science224：838-843，Gurley等人(1986)Mol.Cell.Biol.6：559-565及Weissbach&Weissbach，1988，Methods for Plant Molecular Biology，Academic Press，NY，Section VIII，第421-463页。
可将本发明的多肽与多糖进行组合以产生水凝胶或基质。
多糖可从生物如细菌(例如假单胞杆菌(Pseudomonas sp NCIB11264，美国专利第4298725号)提取和分离，或者可通过在合适的条件下使碳水化合物亚单位(例如糖类如葡萄糖、葡糖胺、N-Ac-glcNH2、糖醛酸或其他单糖或二糖)进行化学反应而合成产生(参见例如美国专利第5,558,899号)。多糖可为线性结构或带支链结构，分子量为约10,000至约3×106道尔顿。
根据本发明的一些实施方案，多糖是生物学上惰性的，在普通条件下与其他物质的反应率低。
根据本发明的一些实施方案，多糖是生物相容性的，例如当与生物的细胞、组织或体液接触时不会引起不良反应，如免疫反应和/或排斥、细胞死亡等。生物相容性多糖也可以是生物可降解的。
根据本发明的一些实施方案，多糖能够在水溶液中形成高度水合的凝胶。
合适的多糖的实例包括但不限于透明质酸[例如透明质酸钠(Na-HA)，Hou S等人，2005，J.Neurosci.Methods.6月21日；印刷前电子版]、藻酸盐、琼脂糖、壳聚糖、果胶、合成聚合物如甲基纤维素、聚乙醇酸和聚乳酸(例如Fukuhara S.等人Circ.J.69：850-7，2005)、透明质酸(HA)水凝胶、纤维素、糖原、淀粉、麦芽糖糊精、右旋糖酐、β-葡聚糖、海带多糖和几丁质。根据本发明的一些实施方案，本发明的多糖是透明质酸。
根据本发明的一些实施方案，组成物还包含能保护细胞或大分子(例如多糖)免受氧化胁迫(由自由基引起的氧化损害)的抗氧化剂。因此，抗氧化剂能通过防止大分子的氧化解聚而延长它们的存留期。
合适的抗氧化剂的非限制性实例包括分子类如谷胱甘肽、维生素C(抗坏血酸钠)、维生素E(生育酚和生育三烯醇)、N-Ac-L-半胱氨酸、氢醌、谷氨酸盐，或者酶类如过氧化氢酶、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶或其他过氧化物酶以及葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD)(参见Osmen I.，Naziroglu M.，Okutan R.Comparative study ofantioxidant enzymes in tissues surrounding implant in rabbits(兔子中植入物周围的组织中的抗氧化酶的比较研究).Cell.Biochem.Funct.24：275-281，2006)。
超氧化物歧化酶除了它已知的作为抗氧化剂的活性之外，当在体内使用时还可充当抗炎剂。可用于本发明组合物的超氧化物歧化酶(SOD)的非限制性实例包括SOD-1(可溶性)、SOD-2(线粒体)或SOD-3(胞外)，如人类可溶性超氧化物歧化酶1(SOD-1)GenBank登录号NP_000445(SEQ ID NO：4)；人类线粒体超氧化物歧化酶2(SOD-2)GenBank登录号NP_001019637.1(同种型B)、NP_001019636.1(同种型A)、NP_0627.2(同种型A)；人类胞外超氧化物歧化酶3(SOD-3)GenBank登录号NP_003093.2；酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)SOD-1GenBank登录号NP_012638.1；和褐家鼠(Rattus norvegicus)SOD-1GenBank登录号NP_058746。
本发明的抗氧化剂可通过重组技术产生。例如，可将编码超氧化物歧化酶1(GenBank登录号NM_000454；SEQ ID NO：5)的多核苷酸连接到适合在宿主细胞(例如细菌细胞、酵母细胞、哺乳动物细胞)中表达的核酸构建物。这种核酸构建物包含指导多核苷酸序列在细胞中以组成型或诱导型方式转录的启动子序列，且还可包含能使这个载体适合于在原核生物、真核生物或优选这两种生物(例如穿梭载体的情况)中复制和整合的序列；转录和翻译起始序列、增强子、转录和翻译终止子和可提高mRNA翻译的效率的聚腺苷酸化信号；针对分泌的信号序列；被工程改造成能增强所表达的多肽的稳定性、生产、纯化、产率或毒性的序列。
抗氧化剂可用多种标准的蛋白质纯化技术进行回收和纯化，如但不限于亲和层析、离子交换层析、过滤、电泳、疏水相互作用色谱、凝胶过滤色谱、反相色谱、伴刀豆球蛋白A色谱、色谱聚焦和差异溶解。
根据本发明的一些实施方案，抗氧化剂以“基本上纯的”形式回收。本文所用的词语“基本上纯的”指能让重组多肽作为抗氧化剂进行有效使用的纯度。
本发明人在将本发明进一步付诸实施时揭示，包含透明质酸、层粘连蛋白多肽和超氧化物歧化酶的组成物(例如为水凝胶的形式)能支持神经元细胞分化。
本文所用的术语“层粘连蛋白”指构成基膜的主要非胶原组分的胞外基质糖蛋白家族。层粘连蛋白已被指涉及很多种生物过程，包括细胞黏着、分化、迁移、信号转导、神经突长出和转移。层粘连蛋白由层粘连蛋白α、β、γ这3个不相同的链组成，各链由不同的基因编码。
本文所用的词语“层粘连蛋白多肽”指包含层粘连蛋白多肽的至少4个连续氨基酸且显示生物活性(例如支持细胞生长、增殖、分化和/或迁移)的氨基酸序列。
根据本发明的一些实施方案，层粘连蛋白多肽可包括层粘连蛋白α链的氨基酸序列，如LAMA1(例如GenBank登录号NP_005550.2)、LAMA2(例如GenBank登录号NP_000417.2和NP_001073291.1)、LAMA3(例如GenBank登录号NP_937762.1和NP_000218.2)、LAMA4(例如GenBank登录号NP_001098677.1、NP_001098676.1、NP_002281.2、NP_001098679.1和NP_001098678.1)及LAMA5(例如GenBank登录号NP_005551.3)；层粘连蛋白β链的氨基酸序列，如LAMB1(例如GenBank登录号NP_002282.1)、LAMB2(例如GenBank登录号NP_002283.3)、LAMB3(例如GenBank登录号NP_000219.2和NP_001017402.1)及LAMB4(例如GenBank登录号NP_031382.2)；和/或层粘连蛋白γ链的氨基酸序列，如LAMC1(例如GenBank登录号NP_002284.3)、LAMC2(例如GenBank登录号NP_05553.2和NP_061486.2)及LAMC3(例如GenBank登录号NP_06050.3)。
根据本发明的一些实施方案，层粘连蛋白多肽包括层粘连蛋白序列的重复氨基酸序列(例如4或5个氨基酸的重复序列)。
可包含在本发明组成物中的层粘连蛋白多肽的非限制性实例包括SEQ ID NO：1、2或3所示的肽。
应指出，由于本发明组成物中所包含的各成分可用合成技术或重组技术制备，它们可作为分析级或药物级的高纯无菌制品获得。
如上所述，本发明人从多糖(透明质酸)、抗氧化剂(超氧化物歧化酶)和SEQ ID NO：3所示的新型层粘连蛋白多肽产生了水凝胶(参见下文实施例部分的实施例1)。
因此，本发明一些实施方案的一个方面提供产生水凝胶的方法。该方法包括将本发明的组成物悬浮于水中以获得包含至少约50％水的悬浮液，从而产生水凝胶。
本文所用的术语“水凝胶”指包含本发明的组成物和水的材料，其中水占50％以上。
根据本发明的一些实施方案，水凝胶包含至少约60％水、至少约70％水、至少约80％水、至少约90％水、至少约95％水、至少约96％水、至少约97％水、至少约98％水、至少约99％水。
根据本发明的一些实施方案，透明质酸以在水凝胶中约0.3-2％、例如约0.4-1.8％、例如约0.5-1.6、例如约0.5-1.5％、例如约0.6-1.4％、例如约0.8-1.2％、例如约1.2％的浓度范围提供。
根据本发明的一些实施方案，层粘连蛋白多肽(例如SEQ ID NO：3)以在水凝胶中约10-200μg/ml、例如约20-100μg/ml、例如约50μg/ml的浓度范围提供。
根据本发明的一些实施方案，超氧化物歧化酶以在水凝胶中约8μM(约0.25微克/ml)至8mM(约250微克/ml)的浓度范围提供。例如，超氧化物歧化酶可以以约0.5μg/ml至约200μg/ml、例如约1μg/ml至约100μg/ml、例如约2μg/ml至约80μg/ml、例如约4μg/ml至约40μg/ml、例如约5μg/ml至约50μg/ml、例如约10μg/ml至约50μg/ml、例如约15μg/ml至约40μg/ml、例如约20μg/ml至约30μg/ml、例如约25μ/ml的浓度范围提供。
根据本发明的一些实施方案，该方法还包括将组成物进行交联。组成物中所包含的各成分(例如多糖、抗氧化剂和层粘连蛋白多肽)的交联(即通过共价键或离子键结合)可用本领域知道的任何交联剂或偶联剂来进行。
合适的交联剂的非限制性实例包括辛二亚氨酸二甲酯(一种亚氨酸酯交联剂)；双磺基琥珀酰亚胺辛二酸酯(BS3；一种NHS-酯交联剂)；甲醛；1-乙基-3-[3-二甲氨基丙基]碳二亚胺盐酸盐(EDC；碳二亚胺交联剂)；N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)[Mao J.S等人，Biomaterials.24，1621-1629，2003；Choi Y.S.等人，J.Biomed.Mater.Res.48，631-639，1999；Richert L.等人，Biomacromolecules，5，284-294，2004)]；二乙烯基砜(DVS)；和京尼平[Sung H.W.等人，J Biomed.Mater.Res.A，64A：427-438，2003；Chen SC.等人，J.Control Release.96，285-300，2004；Mwale F.等人，Tissue Eng.，11，130-40，2005；Chen H.等人，Biomacromolecules，7，2091-2098，2006]。
对于离体或体内交联，可将光活性氨基类似物(亮氨酸和甲硫氨酸的diazirine类似物)加到组成物，在暴露于紫外光之后，diazirine被活化而结合相互作用性的侧链(例如羧基或氨基)。
根据本发明的一些实施方案，交联是用无毒的和/或生物相容性的物质进行。实例包括但不限于3-二甲基-氨基丙基)-N-乙基碳二亚胺(EDC-N；Sigma-Aldrich-Fluka，美国密苏里州St Louis，63178，目录号03459)、二乙烯基砜(DVS；Sigma，目录号V-370-0)和京尼平(Sigma目录号G-4796)。
根据本发明的一些实施方案，将水凝胶通过本领域公知的方法进行冻干，从而获得干的基质。应指出的是，无水基质可长时间保存而不被酶促降解或污染(例如微生物污染)。
本文所用的词语“基质”指包含本发明组合物的二维或三维支持构架。
基质可以以干的形式或湿的形式保持，或者可按照预定用途进行冷冻。
应指出的是，干的基质可在水溶液(例如水)中再水化，直到形成水凝胶。
根据本发明的一些实施方案，水凝胶或基质还包含细胞(参见下文实施例2)，如干细胞或分化细胞。
本文所用的词语“干细胞”指在被诱导分化成具有特定的专门功能的其他细胞类型(例如完全分化细胞)之前能够在培养中长时间保持在未分化状态的细胞(例如万能或多能干细胞)。
本发明可使用的干细胞的非限制性实例包括胚胎干细胞、诱导万能干细胞(iPS)、造血干细胞(例如骨髓干细胞、脐带血细胞、外周血干细胞)、成人干细胞和间充质干细胞。
本发明可使用的分化细胞的非限制性实例包括神经细胞、视网膜细胞、表皮细胞、肝细胞、胰细胞、骨细胞、软骨细胞、弹性细胞、纤维状细胞、肌细胞、心肌细胞、内皮细胞、平滑肌细胞和造血细胞(例如淋巴细胞)。
根据本发明的一些实施方案，干细胞是神经元祖细胞(如获自胚胎或胎儿神经元组织或大脑的那些神经元祖细胞)。
如上所述和实施例2中所述(例如图2C-F)，水凝胶当用衍自胎儿大脑的干细胞接种时，能够使细胞分化成神经元细胞。
因此，本发明一些实施方案的一个方面提供诱导组织的离体形成的方法。该方法是如下实现的：(a)提供本发明的基质或水凝胶，和(ii)用在适合于细胞的增殖、分化和/或迁移的培养基中的细胞对基质或水凝胶进行接种，从而诱导组织的形成。
词语“组织”指执行相似功能的一组细胞。实例包括但不限于大脑组织、神经元组织、视网膜、皮肤组织、肝组织、胰组织、骨、软骨、结缔组织、血组织、肌肉组织、心脏组织、血管组织、肾组织、肺组织、性腺组织、造血组织。根据本发明的一些实施方案，词语“组织”还涵括“器官”，即动物中为某种特定功能而特化的完全分化的结构和功能单位。器官的非限制性实例包括头、大脑、眼、骨(例如腿骨和手骨)、心脏、肝脏、肾脏、肺、胰脏、卵巢、睾丸和胃。
根据本发明的一些实施方案，组织是神经组织。
术语“接种”指将细胞铺板、放置和/或滴落在本发明基质或水凝胶内部、下方或上方。
接种细胞的浓度取决于所用的细胞类型和基质或水凝胶各组分的浓度。
根据本发明这个方面所用的培养基可以是任何适于诱导本发明细胞(例如干细胞)增殖、分化和/或迁移成更特化的(即分化的)细胞的组织培养基。根据本发明的一些实施方案，培养基补加有矿物质、氨基酸和/或营养物(例如如下文实施例2中所述，Eagle培养基补加有谷氨酰胺和葡萄糖)，或者还补加有血清和/或生长因子。
在接种后，用显微镜(例如倒置显微镜、轴平面光学显微镜或电子显微镜)例行检查基质或水凝胶，以评估细胞的生长、扩散和组织形成情况(参见例如图2A-F)。
根据本发明的一些实施方案，可将离体形成的组织再移植到受试者。在这种情况中，接种在基质或水凝胶当中的细胞可衍自被治疗个体(自体同源)，或者衍自异基因来源，如预期不会引起免疫原性反应的胚胎干细胞。
本文所用的术语“受试者”包括男女老幼。根据本发明的一些实施方案，该术语涵括遭受如下所述的病状的个体。
本发明的一个方面提供诱导体内组织形成和/或治疗具有以组织患病、损伤或损失为特征的病状的受试者的方法。该方法是这样实现的：将本发明的基质或水凝胶植入在受试者的患病、损伤或损失的组织处或附近，从而诱导组织的形成和/或治疗受试者。
本文所用的词语“以组织患病、损伤或损失为特征的病状”指任何显示组织损伤(即不发挥功能的组织、癌组织或前癌组织、被破坏的组织、断裂组织、纤维化组织或局部缺血组织)或组织损失(例如在创伤、传染病、遗传疾病等之后)而要求进行组织再生的病恙、疾病或病况。要求进行组织再生的病恙或病况的实例包括但不限于如丙型肝炎患者中的肝硬化(肝脏)、I型糖尿病(胰脏)、囊性纤维变性(肺、肝脏、胰脏)、骨癌(骨)、烧伤和伤口修复(皮肤)、年龄相关性黄斑变性(视网膜)、心肌梗塞、心肌修复、CNS损伤(髓鞘质)、关节软骨缺陷(软骨细胞)、膀胱变性、肠变性等。
词语“治疗”指抑制或停止疾病、病恙或病况的发展和/或造成疾病、病恙或病况的减少、减弱或消退。本领域技术人员会知道，有多种方法和测定可用来评估疾病、病恙或病况的发展，同样也有多种方法和测定可用来评估疾病、病恙或病况的减少、减弱或消退。
本领域技术人员能够确定何时和如何植入基质或水凝胶，从而在受试者中诱导组织形成。参见例如Artzi Z等人，2005，J.Clin.Periodontol.32：193-9；Butler CE和Prieto VG，2004，Plast.Reconstr.Surg.114：464-73。
如果需要，可将本发明的组合物、基质和/或水凝胶在包装或分配器装置中提供，如FDA批准的试剂盒，或者制品(带包装材料)，这些装置可装有一个或多个含活性成分的单位剂量形式。包装可例如包含金属或塑料薄片，如水泡眼包装。包装或分配器装置可附有说明书，说明如何进行给药、植入，和/或离体或体内形成、再生和/或修复组织，和/或治疗受试者。包装或分配器还可附有监管药物的生产、使用或销售的政府机关所规定形式的告示，该告示反映该机关对组合物形式或者人用或兽医用给药的批准。这种告示例如可为美国食品与药物管理局对处方药所批准的标签，或者可为经批准的产品插页。在相容的药物载体中配制的本发明组合物、基质或水凝胶也可制备、放置在适当的容器中，并标明用于治疗上文所详述的指定病症。
本文所用的术语“约”指±10％。
术语“包含”、“包括”、“具有”指“包括但不限于”。
术语“由......组成”指“包括且限于”。
术语“基本上由......组成”指组合物、方法或结构可包括另外的成分、步骤和/或部分，但要求这些另外的成分、步骤和/或部分不实质上改变请求权利保护的组合物、方法或结构的基本和新型特征。
本文所用的名词形式上为单数，但也具有复数指代含义，除非上下文清楚表明并非如此。例如，术语“化合物”或“至少一种化合物”可包括多种化合物，包括它们的混合物在内。
在本申请中，本发明的多个实施方案可以以范围形式给出。应理解，以范围形式进行描述仅仅是为了方便简明起见，不应解释为对本发明的范围的硬性限制。因此，对某个范围的描述应被认为是具体公开了该范围当中的所有可能的亚范围以及单个数值。例如，对诸如1-6的范围的描述应被认为是具体公开了诸如1-3、1-4、1-5、2-4、2-6、3-6等的亚范围，以及该范围当中的单个数值，例如1、2、3、4、5和6。不管范围的宽度如何，这都适用。
本文中当指定数值范围时，意指包括该指定范围内的任何述及的数值(分数或整数)。词语“在第一指定数值和第二指定数值之间”与“从第一指定数值到第二指定数值”在本文中可互换使用，意指包括第一和第二指定数值以及它们之间的所有分数和整数。
本文所用的术语“方法”指完成给定任务的方式、手段、技术和程序，包括但不限于为化学、药学、生物学、生化和医学领域的从业人员所知道的那些方式、手段、技术和程序，或者这些从业人员容易从已知的方式、手段、技术和程序开发得到的那些方式、手段、技术和程序。
应认识到，本发明的某些特征为清楚起见在各个单独实施方案的情形中进行描述的，也可在单个实施方案中组合在一起来提供。反过来，本发明的多个特征为简明起见在单个实施方案的情形中进行描述的，也可以单独提供，或者以任何合适的次级组合提供，或者在适当情况下在本发明的任何其他所描述的实施方案中提供。某些在各个实施方案的情形中描述到的特征不应被认为是这些实施方案的必要特征，除非该实施方案没有这些要素的话就不能起作用。
在上文描述的和在下文权利要求书中请求权利保护的本发明各个实施方案和方面，在以下实施例部分得到实验支持。
实施例
现将论及以下实施例，这些实施例与以上描述一起以非限制性方式说明本发明的一些实施方案。
一般来讲，本文所用的术语和本发明中用到的实验室程序包括分子技术、生化技术、微生物学技术和重组DNA技术。这些技术在文献中有详尽说明。参见例如″Molecular Cloning：A laboratory Manual″Sambrook等人，(1989)；″Current Protocols in Molecular Biology″第I-III卷，Ausubel，R.M.编辑(1994)；Ausubel等人，″Current Protocols inMolecular Biology″，John Wiley和Sons，Baltimore，Maryland(1989)；Perbal，″A Practical Guide至Molecular Cloning″，John Wiley &Sons，New York(1988)；Watson等人，″Recombinant DNA″，ScientificAmerican Books，New York；Birren等人(编辑)″Genome Analysis：ALaboratory Manual Series″，第1-4卷，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，New York(1998)；在美国专利第4,666,828号；第4,683,202号；第4,801,531号；第5,192,659号和第5,272,057号中提出的方法；″CellBiology：A Laboratory Handbook″，第I-III卷，Cellis，J.E.编辑(1994)；″Current Protocols in Immunology″，第I-III卷，Coligan J.E.编辑(1994)；Stites等人(编辑)，″Basic and Clinical Immunology″(第8版)，Appleton&Lange，Norwalk，CT(1994)；Mishell和Shiigi(编辑)，″Selected Methods in Cellular Immunology″，W.H.Freeman和Co.，NewYork(1980)；可采用的免疫测定法在专利和科学文献中有广泛描述，参见例如以下各号美国专利3,791,932、3,839,153、3,850,752、3,850,578、3,853,987、3,867,517、3,879,262、3,901,654、3,935,074、3,984,533、3,996,345、4,034,074、4,098,876、4,879,219、5,011,771和5,281,521；″Oligonucleotide Synthesis″Gait，M.J.编辑(1984)；“Nucleic Acid Hybridization″Hames，B.D.和Higgins S.J.编辑(1985)；″Transcription and Translation″Hames，B.D.和Higgins S.J.编辑(1984)；″Animal Cell Culture″Freshney，R.I.编辑(1986)；″ImmobilizedCells and Enzymes″IRL Press，(1986)；″A Practical Guide to MolecularCloning″Perbal，B.，(1984)以及″Methods in Enzymology″，第1-317卷，Academic Press；″PCR Protocols：A Guide to Methods AndApplications″，Academic Press，San Diego，CA(1990)；Marshak等人，″Strategies for Protein Purification and Characterization-A LaboratoryCourse Manual″CSHL Press(1996)；所有这些文献和专利都通过引用并入本文，犹如在本文中全文提出。其他的一般参考文献在本文件通篇有提供。这些文献中的程序方法据信是本领域公知的，并为读者方便起见而提供。这些文献中所包含的所有信息都通过引用并入本文。
实施例1
透明质酸-超氧化物歧化酶和层粘连蛋白肽水凝胶的产生
透明质酸-透明质酸钠是天然的高分子量(3×106道尔顿)线性多糖，存在于结缔组织的胞外基质、皮肤、软骨、滑液、眼睛的玻璃状液和许多其他部位。透明质酸钠(Na-HA)是药理学上惰性聚合物，在水溶液中形成具有粘弹性特征的高度水化凝胶形式。这种制品被：(1)用作眼科手术助剂，保持手术过程中眼睛组织细胞器完整，所述手术例如人工晶体插入、晶状体囊内和囊外摘出、白内障和青光眼手术、角膜移植手术、视网膜脱离和玻璃体置换手术；(2)用于关节置换手术。Na-HA注射液可充当粘弹补充物以改善炎性状态和炎性介质，充当抗炎剂和抗炎介质，通过其自身(HA)切割和解聚起到中和自由基和氧化剂的作用；和(iii)有新的方法采用HA作为友好生物材料，结合在组织工程构建物中，作为细胞和组织的支持结构、定向、迁移和再生的支架凝胶，在肿瘤切除时用作空缺填充物。反过来，HA容易被透明质酸酶切割消除，从而为细胞迁移腾出通路。
超氧化物歧化酶-存在于细胞的胞质中的人细胞溶胶Cu-Zn-SOD是分子量为32,500道尔顿的同型二聚体。两个相同的亚单位主要通过疏水相互作用和静电相互作用连接在一起。铜和锌的配体是组氨酸侧链(图1)。
新型层粘连蛋白合成肽KSIKVAVRSYIGSRCV(SEQ ID NO：3)的产生-层粘连蛋白肽(SEQ ID NO：3)含有两个五肽：IKVAV序列(SEQ ID NO：1)和YIGSR序列(SEQ ID NO：2)，这两个五肽模拟神经元上的完整层粘连蛋白分子的活性；以及3个另外的二聚体：在N末端位置的二聚体(KS)、在两个五肽之间的第二二聚体(RS)和在尾部羧基末端的第三二聚体(CV)(参见图3)。二聚体是作为间隔物和作为潜在的交联位点设置，因此它们不应打断两个五肽的序列(SEQ ID NO：1和2)。
交联剂-交联剂在构成水凝胶的三个元件(Na-HA(透明质酸钠)；LN肽(层粘连蛋白肽)；Cu-Zn-SOD)之间形成共价键。为了在交联过程中形成共价键而又不丧失被键合的元件的生物活性，有几种交联剂可以使用，如EDC-N-(3-二甲氨基丙基)-N-乙基碳二亚胺、DVS-二乙烯基砜和京尼平。交联的原理主要在于：使游离伯氨基与羧基结合，或者在接近的羟基之间氧化，形成活性醛，互相相互作用，或者与另外的缀合物的胺相互作用，通过硫醇残基形成。
材料和实验方法
透明质酸钠-透明质酸钠(HA)由Bio-Technology General(BTG)Corporation Ltd.(以色列Kiryat Weizmann，Rehovot 76326和Be’erTuvia，Industrial Zone，P.O.Box 571，Kiryat Malachi，83104)从因其荚膜分泌量高而被选出的链球菌属菌株生产。它是从分泌的荚膜经多步骤纯化产生不含蛋白质、氮或热原物质的无菌制品而作为高度纯品获得。
Cu，Zn超氧化物歧化酶(Cu-Zn-SOD)-SOD[EC 1.15.1.1，可溶性人类超氧化物歧化酶1；GenBank登录号NP_000445(SEQ ID NO：4多肽)和GenBank登录号NM_000454(SEQ ID NO：5多核苷酸)]是由BTG Ltd(Savient et.Ferring)基本上按Hartman JR.等人，1986(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，Vol：83，第7142-7146页)的描述在细菌(大肠杆菌)中重组产生。
新型层粘连蛋白肽的合成(SEQ ID NO：3)-由美国加州Hayward(94545)的Elim Biopharmacenticals，Inc进行。
水凝胶的产生-为制备10ml水凝胶，用磁力搅拌器将120mg的透明质酸钠(HA)在水中溶解24小时，然后加入50μl的SOD(5mg/ml)和500μg的层粘连蛋白肽(SEQ ID NO：3，为干粉形式)并混合成水凝胶。
构成水凝胶的元件的分析测定：
透明质酸钠-透明质酸的总含量是基于糖醛酸(葡糖醛酸)的含量，采用carbazol试剂按Dische(Dische Z.A new specific color reactionof hexuronic Acids.J.Biol.Chem，167，189-197，1947)的常规试验法进行测定。透明质酸的分子量是通过用Brookfield牌Cone/Plate DVII+Per(Brookfield Engineering Laboratories Inc.美国马萨诸塞州Middleboro，02346-1031)数字粘度计测量粘度来估计。透明质酸的分子量也可通过Dische测定中获得的数值与Park-Johnson(Park J.T.Johnson M.J.A submicrodetermination of glucose J.Biol.Chem.181，149-151，1949))的还原糖测定所获得的数据之间的差异进行计算。
超氧化物歧化酶活性的测定-SOD活性是在560nm处测定为黄嘌呤氧化酶对黄嘌呤氧化过程中产生超氧化物阴离子时硝基四氮唑蓝的还原的抑制速率。反应混合物含有溶于50mM磷酸钾钠缓冲液(pH 7.8，25℃)的50mM碳酸钠、0.1mM EDTA、0.1mM黄嘌呤、0.025mM硝基四氮唑蓝。对于1单位的活性，取在标准条件下使硝基四氮唑蓝还原被抑制50％的蛋白质的量。膜结合的含锰(Mn)SOD可测定为总SOD活性与用2％SDS Cu/Zn-SOD处理样品后测定的Cu/Zn-酶活性之差，在组织的细胞溶胶部分和在从细胞获得的裂解液测量。
LN的活性肽测定-用免疫组织化学染色方法，通过特异性的抗IKVAV(SEQ ID NO：1)和YIGSR(SEQ ID NO：2)抗体或者抗层粘连蛋白抗体(Sigma目录号L 9393，Sigma-Aldrich，以色列)检测LN的五肽。
实验结果
本发明人从以下三个元件产生了水凝胶：透明质酸钠、新型层粘连蛋白肽(SEQ ID NO：3)和抗氧化剂(例如SOD)。
这种水凝胶显示独特的物理特征：(i)与涂覆塑料表面的膜例如纤连蛋白、聚赖氨酸共存；(ii)在等渗盐溶液(培养基)中的导电率为11.0mOhm/cm(相比之下，单独的透明质酸的导电率为1.37mOhm/cm)；(iii)具有粘稠性，例如1％HA在100rpm和25℃下为82厘泊；(iv)具有透明性；和(v)所添加成分的含量释放慢。
该水凝胶中的透明质酸-透明质酸盐组分(NaHA)是(i)线性、伸展、高分子量、高度水化的透明质酸(HA)钠盐。浓度范围在0.5％至1.5％之间；(ii)仅用每个二聚体的羧基形成聚阴离子聚合物。其他潜在的低活性基团、羟基和N-乙酰化胺；(iii)产生粘度取决于HA浓度的水凝胶构建物；(iv)友好的环境，保持气态氛围，保护营养添加剂，在室温下，培养箱外；和(v)表征胎儿生命的健康环境，支持快速完美无疤痕的创伤愈合。
可作为水凝胶溶液长时间保持独特的水凝胶特征，数星期到1-2个月时间里各成分释放慢或者无释放，可在使用前较长时间加入；生物相容性(不引起炎症介质)；在修复组织的再生-愈合期间生物可降解。
这个水凝胶可用来支持各种细胞如神经元细胞的生长、增殖和分化。该水凝胶可影响富神经元培养物中以及体内移植的富复合神经元植入物中的出芽轴突增殖密度，比不包含这种水凝胶的培养物和植入物显著多得多。因此，预期当施加于损失量大的受伤周围神经上时，再生、愈合和功能化的步伐加快。
本发明人开发的独特水凝胶能刺激胞外环境，在植入时能支持体外和体内细胞，且可用作空穴填充物，例如在摘除肿瘤后产生的空腔。
从HA、SOD和LN肽(Na-HA 1.2％；LN肽50μg/ml、SOD 25μg/ml)这三个元件共价交联配制水凝胶具有许多明确的优点：由于SOD保护HA大分子免于解聚作用的氧化损害，HA大分子能长时间保持分子完整。SOD分子和高分子量HA链两者都充当抗炎剂，改善炎性介导物状态。SOD能减少在培养物中和在体内植入的移植构建物中产生的氧化胁迫条件。本文设计的层粘连蛋白合成肽(SEQ IDNO：3)呈现层粘连蛋白的生物活性的大多数积极优点，而没有完整层粘连蛋白大分子所引起的免疫原性反应的缺点。此外，层粘连蛋白的主要来源(LN-1)是从荷Engelbreth-Holm-Swarm腹水瘤的小鼠分离，对于临床应用是个缺点。而交联的构建物保留了其各组分的全部生物活性，具有极大的优点，所有的功能团紧紧靠在一起。通过SOD的抗氧化活性克服植入物当中和周围的恶劣残酷条件的危难时期，且LN肽的保卫特性确保要由开始从周围环境到达的可扩散营养物再滋养的植入物的存活。
实施例2
神经元祖细胞在透明质酸-超氧化物歧化酶-层粘连蛋白肽水凝胶当中离体分化成神经元
材料和实验方法
细胞-按先前的描述(Reshef等人，1996；Reshef，A.，Sperling，O.，Zoref-Shan E.Preconditioning of primary rat neuronal cultures againstischemic injury：characterization of the time window of protection(针对局部缺血损伤的原代大鼠神经元培养物的预调理：保护的时间窗的表征).Brain Res.741，252-257，1996)，制备衍自妊娠16-18天的大鼠大脑半球的解离、未分化干细胞。将细胞在含Eagle培养基[含Earle盐的Eagle基础培养基(Sigma，美国密苏里州St.Louis)，补加2mM谷氨酰胺和5mg/ml葡萄糖(Biological Industries，Kibbuts Beit Haemek，以色列)]的塑料平皿上在加湿环境中于95％空气和5％CO2中37℃下保持。为试验各种培养条件，将细胞在塑料平皿上在Eagle培养基存在下培养3天不更换培养基，然后更换培养基，再将细胞在塑料平皿上在培养基(对照，培养条件“i”)存在下或者在各种水凝胶(培养条件“ii”、“iii”和“iv”)覆盖下再培养12天。各培养条件如下：
培养条件
(i)对照培养物包括在Eagle培养基存在下培养和在塑料平皿上保持的细胞；
(ii)透明质酸水凝胶培养物-在接种后第三天向附着细胞添加1.2％透明质酸；
(iii)透明质酸-层粘连蛋白肽-抗氧化剂水凝胶培养物-在培养的第三天将细胞在混合的透明质酸(1.2％)、由16个氨基酸(SEQ IDNO：3；KSIKVAVRSYIGSRCV)组成的层粘连蛋白合成肽(50μg/ml)和抗氧化剂(Cu-Zn超氧化物歧化酶(Cu-Zn-SOD，25μg/ml)的存在下进行培养。
(iv)交联的透明质酸-层粘连蛋白肽-抗氧化剂水凝胶培养物-在培养的第三天将细胞在交联的透明质酸(1.2％)、由16个氨基酸(SEQ ID NO：3；KSIKVAVRSYIGSRCV)组成的层粘连蛋白合成肽(50μg/ml)和抗氧化剂(Cu-Zn超氧化物歧化酶(Cu-Zn-SOD，25μg/ml)的存在下进行培养。在大部分实验中所用的交联剂是京尼平，不过其他的交联剂如碳二亚胺、二乙烯基砜或者仅仅是糖类(单糖)也已被成功用作交联剂。
神经元的Nissl染色方法-结晶紫0.1％(0.1克于100ml蒸馏水中，加10滴冰乙酸，临用前过滤)。该染色法检测固定在福尔马林中和包埋在石蜡中的培养物或组织切片中的神经元的细胞质中的Nisll体。Nissl体被染成紫-蓝色至粉红-紫罗兰色。另外的神经元特异性染色方法：Pearse(1972；Pearse，A.Histochemistry，Theoretical andApplied.第1和2卷，第3版，Little，Brown&Co，Boston，MA，1972)中描述的博迪恩氏胶体银染色法；免疫组织化学方法：进一步使用抗MAP-2、抗GAP-43或抗神经特异性烯醇酶来评估分化中的神经元。
实验结果
如图2A所示，保持在塑料平皿上的对照培养物显示生长出了不铺满的单层培养物。与之对比，在1.2％透明质酸水凝胶存在下生长的培养物中，细胞趋向于形成细胞聚集体(聚结体)(图2B)。第三种类型的培养物包括在含有透明质酸(1.2％)、合成的层粘连蛋白肽(SEQID NO：3；50μg/ml)和Cu-Zn超氧化物歧化酶(Cu-Zn-SOD，25μg/ml)抗氧化剂的水凝胶存在下生长的细胞。如图2C-F所示，用含有透明质酸、层粘连蛋白肽(SEQ ID NO：3)和Cu-Zn超氧化物歧化酶的水凝胶生长的细胞形成了细胞聚集体，伴有大量的树突出芽，刺激成熟的功能神经元。
应指出的是，在包含混合的组分(培养物iii)或交联的组分(培养物iv)的水凝胶中培养的原代细胞相互间没有显著差异(数据未显示)。因此，为防止小分子量组分(例如层粘连蛋白肽和/或SOD)可能从水凝胶脱离，可在不丧失水凝胶的内在特性和支持细胞增殖、分化和迁移的特性的情况下将水凝胶加以交联。
包含透明质酸、SOD和充当导向生长因子的层粘连蛋白合成肽(SEQ ID NO：3)的水凝胶能推动在其中培养的细胞进行分化(例如神经发生)，而超氧化物歧化酶充当神经保护剂。
对细胞聚集体进行进一步的处理，例如通过在用胰蛋白酶消化后对细胞进行传代培养，预期可释放和扩散迁移中的神经元。在含有透明质酸、层粘连蛋白肽(SEQ ID NO：3)和Cu-Zn超氧化物歧化酶的水凝胶存在下生长的这种培养物，可用作3D构建物供进一步移植、再生到体内受伤、变性或损失的神经元元件中，容易用密集的纤维调整供植入到损伤的周围神经组织。
作为与以色列技术学院(Technion)的Eyal Zusmann教授的合作研究，使用了直径2mm的聚己酸内酯(PCL)管作为大片区域损失的接桥，将拉断的周围神经的两个断头连接起来。管中充入含有透明质酸(1.2％)、合成的层粘连蛋白肽(SEQ ID NO：3；50μg/ml)和Cu-Zn超氧化物歧化酶(Cu-Zn-SOD，25μg/ml)的水凝胶，对照管为空管。在两只受伤大鼠中的一只观察到较高密度的神经元出芽，证明2cm区域损失得到完全和完美的桥接。这些研究证明了本发明一些实施方案的水凝胶可用于神经元组织再生和修复。
上文已结合本发明的具体实施方案对本发明进行了描述，但显然的是许多替代方案、修改方案和变化方案对于本领域技术人员将是显而易见的。因此，本发明也意在涵括落入所附权利要求书的精神和宽泛范围内的所有这些替代方案、修改方案和变化方案。
本说明书中提到的所有出版物、专利和专利申请都通过引用全文并入本说明书中，犹如每个单独的出版物、专利或专利申请都具体和单独地被指出通过引用并入本文。另外，在本申请中引用或确认任何参考文献的做法，不应被解释为承认所述参考文献可利用作为本发明的现有技术。本文所用的章节标题不应解释为必定限制本发明。
参考文献
(另外的参考文献在正文中引用)
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<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
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<223>层粘连蛋白模拟合成肽
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Ile Lys Val Ala Val
1               5
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<211>5
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<220>
<223>层粘连蛋白模拟合成肽
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1               5
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<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>层粘连蛋白模拟合成肽
<400>3
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<210>4
<211>154
<212>PRT
<213>人类
<400>4
Met Ala Thr Lys Ala Val Cys Val Leu Lys Gly Asp Gly Pro Val Gln
1               5                   10                  15
Gly Ile Ile Asn Phe Glu Gln Lys Glu Ser Asn Gly Pro Val Lys Val
            20                  25                  30
Trp Gly Ser Ile Lys Gly Leu Thr Glu Gly Leu His Gly Phe His Val
        35                  40                  45
His Glu Phe Gly Asp Asn Thr Ala Gly Cys Thr Ser Ala Gly Pro His
    50                  55                  60
Phe Asn Pro Leu Ser Arg Lys His Gly Gly Pro Lys Asp Glu Glu Arg
65                  70                  75                  80
His Val Gly Asp Leu Gly Asn Val Thr Ala Asp Lys Asp Gly Val Ala
                85                  90                  95
Asp Val Ser Ile Glu Asp Ser Val Ile Ser Leu Ser Gly Asp His Cys
            100                 105                 110
Ile Ile Gly Arg Thr Leu Val Val His Glu Lys Ala Asp Asp Leu Gly
        115                 120                 125
Lys Gly Gly Asn Glu Glu Ser Thr Lys Thr Gly Asn Ala Gly Ser Arg
    130                 135                 140
Leu Ala Cys Gly Val Ile Gly Ile Ala Gln
145                 150
<210>5
<211>981
<212>DNA
<213>人类
<400>5
gtttggggcc agagtgggcg aggcgcggag gtctggccta taaagtagtc gcggagacgg    60
ggtgctggtt tgcgtcgtag tctcctgcag cgtctggggt ttccgttgca gtcctcggaa    120
ccaggacctc ggcgtggcct agcgagttat ggcgacgaag gccgtgtgcg tgctgaaggg    180
cgacggccca gtgcagggca tcatcaattt cgagcagaag gaaagtaatg gaccagtgaa    240
ggtgtgggga agcattaaag gactgactga aggcctgcat ggattccatg ttcatgagtt    300
tggagataat acagcaggct gtaccagtgc aggtcctcac tttaatcctc tatccagaaa    360
acacggtggg ccaaaggatg aagagaggca tgttggagac ttgggcaatg tgactgctga    420
caaagatggt gtggccgatg tgtctattga agattctgtg atctcactct caggagacca    480
ttgcatcatt ggccgcacac tggtggtcca tgaaaaagca gatgacttgg gcaaaggtgg    540
aaatgaagaa agtacaaaga caggaaacgc tggaagtcgt ttggcttgtg gtgtaattgg    600
gatcgcccaa taaacattcc cttggatgta gtctgaggcc ccttaactca tctgttatcc    660
tgctagctgt agaaatgtat cctgataaac attaaacact gtaatcttaa aagtgtaatt    720
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ctgtgaataa aaaccctgta tggcacttat tatgaggcta ttaaaagaat ccaaattcaa    960
actaaaaaaa aaaaaaaaaa a                                              981

Claims (28)

1.一种多肽，其包含SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列。
2.一种组成物，其包含多糖和权利要求1的多肽。
3.权利要求2的组成物，其中所述多糖是透明质酸。
4.权利要求2的组成物，其还包含抗氧化剂。
5.一种组成物，其包含透明质酸、层粘连蛋白多肽和抗氧化剂。
6.权利要求4或5的组成物，其中所述抗氧化剂是超氧化物歧化酶(SOD)。
7.权利要求5的组成物，其中所述层粘连蛋白多肽为SEQ IDNO：3所示。
8.一种组成物，其包含透明质酸、超氧化物歧化酶(SOD)和权利要求1的多肽。
9.权利要求6或8的组成物，其中所述超氧化物歧化酶包含SEQID NO：4所示的氨基酸序列。
10.权利要求2-7和9中任一项的组成物，其中所述多糖、所述抗氧化剂和/或所述多肽是交联的。
11.权利要求8的组成物，其中所述透明质酸、所述超氧化物歧化酶(SOD)和所述多肽是交联的。
12.一种基质，其包含权利要求2-11中任一项的组成物。
13.一种水凝胶，其包含权利要求2-11中任一项的组成物。
14.一种产生水凝胶的方法，所述方法包括将权利要求2-9中任一项的组成物悬浮于水中以获得包含至少80％水的悬浮液，从而产生水凝胶。
15.权利要求14的方法，其还包括使所述组成物交联。
16.权利要求15的方法，其中所述交联是用选自EDC-N-(3-二甲氨基丙基)-N-乙基碳二亚胺、DVS-二乙烯基砜和京尼平的交联剂来实现。
17.权利要求14的方法，其中所述悬浮液包含至少95％水。
18.权利要求13的水凝胶或权利要求14的方法，其中所述透明质酸以在所述水凝胶中约0.5-1.5％的浓度范围提供。
19.权利要求13的水凝胶或权利要求14的方法，其中所述多肽以在所述水凝胶中约20-100μg/ml的浓度范围提供。
20.权利要求13的水凝胶或权利要求14的方法，其中所述超氧化物歧化酶以在所述水凝胶中约5-40μg/ml的浓度范围提供。
21.权利要求12的基质或权利要求13的水凝胶，其还包含细胞。
22.一种诱导组织的离体形成的方法，其包括：
(a)提供权利要求12的基质或者权利要求13、18、19和20中任一项的水凝胶，和；
(ii)用在适于所述细胞的增殖、分化和/或迁移的培养基中的细胞接种所述基质或所述水凝胶，
从而诱导组织的形成。
23.一种诱导组织的体内形成的方法，所述方法包括将权利要求12的基质或者权利要求13、18、19和20中任一项的水凝胶植入受试者体内，从而诱导组织的形成。
24.一种治疗具有以组织患病、损伤或损失为特征的病状的受试者的方法，所述方法包括将权利要求12的基质或者权利要求13、18、19和20中任一项的水凝胶植入在受试者的患病、损伤或损失的组织处或附近，从而诱导组织的形成和治疗受试者。
25.权利要求22、23或24的方法，其中所述组织是神经组织。
26.权利要求21的基质或水凝胶，或者权利要求22的方法，其中所述细胞是干细胞。
27.权利要求26的基质、水凝胶或方法，其中所述干细胞当接种在所述基质或所述水凝胶中时分化成神经元细胞。
28.权利要求13、18、19和20中任一项的水凝胶，其为冻干形式。
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