CN1539514A - 一种多功能生物修复材料的制备方法 - Google Patents
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Abstract
一种多功能生物修复材料的制备方法,涉及一种用于皮肤、神经及软骨修复的生物材料的制备。本发明以壳聚糖、胶原和透明质酸钠为基本原料,分别配成一定浓度的溶液并按一定的体积比混合,经脱泡,装入模具中冻干,制成薄膜状或管状;经氨水等浸泡后冻干或凉干;也可用蒸馏水冲洗净,再冻干;然后再复合一层壳聚糖、壳聚糖/透明质酸钠、壳聚糖/胶原或壳聚糖/胶原/透明质酸钠溶液,烘干或凉干,制得双层复合材料。该方法制备工艺简单,所制备的复合生物材料用于皮肤、神经、软骨等组织修复时,不仅具有良好的生物相容性、机械强度以及抗菌性,且使用方便,价格低廉,是一种可在体内降解速度可调的、适合大众使用的多功能生物修复材料。
Description
技术领域
本发明涉及一种用于皮肤、神经及软骨修复的生物材料的制备方法,主要利用壳聚糖/胶原/透明质酸钠为原料制备薄膜状或管状材料,属于生物医学技术领域。
背景技术
皮肤、神经系统是人体中最重要的组织和器官,一旦受到损伤,正常功能就会受到影响。虽然皮肤的再生能力很强,但是,大面积的烧伤或创伤,单靠自身皮肤或自体移植皮肤来愈合是远远不够的,需要(人造皮肤作为)在治疗过程中的一种暂时性的创面保护覆盖材料来帮助。由合成材料或胶原蛋白等制成的人造皮肤,已经在临床上使用多年,但都存在着一定的缺陷。壳聚糖是已知天然多糖中唯一的碱性多糖,其分子中含有某些有助于细胞粘附和保持细胞分化的功能信息,具有减少成纤维细胞生长,减少癍痕形成,促进内皮细胞、毛细血管、心肌细胞及神经生长等功能,已广泛应用于生物医学领域如药物载体、人工皮肤、手术缝合线、人造肾膜、隐形眼镜等。由壳聚糖或甲壳素制成的人工皮肤,被认为是一种较理想的材料。它柔软、舒适,与创面的贴合性好,既透气,又吸水,既有止血止痛的功能,又有抑菌消炎作用,随着创伤慢慢愈合,自身皮肤生长,能自行溶解而被机体吸收,对治疗高热创伤特别有效。与非降解材料相比,既免除了揭除时病人流血多引起的痛苦,也不会留下碎屑而延缓伤口的愈合,还会促进皮肤再生。从20世纪40年代开始,就已有人研究壳聚糖人造皮肤了。日本开发了甲壳素无纺织物Beschitin W(BCW)创伤敷料,厚度为0.12mm,具有止血、止痛、抗溶化及促进表皮形成等功能。用于1度和2度烧伤,有效率高达90%,对3度烧伤,疗效也达53%(蒋挺大.甲壳素.化学工业出版社,2003.538)。Katakura-Chikarina制药公司(北海道,日本)开发的壳聚糖-胶原复合材料人工皮肤,已用于治疗创伤或烧伤。我国青岛海洋大学和青岛医学院研制的人造皮肤,除了壳聚糖和胶原蛋白掺用外,还加入了中药有效成分,收到了良好的效果。Sparkes等人(Sparkes B G,Murray D G.US Patent.4572906.1986)用壳聚糖、明胶和甘油制成了一种人造皮肤,能抑制伤口的收缩,防止严重烧伤的伤口产生硬伤疤。目前用壳聚糖、明胶、肝素等制成的复合人造皮肤,对修补伤口虽取得了一定的效果,但仍存在修复速度慢,愈合效果不够理想等缺陷。同时上述人造皮肤造价昂贵,难以被常人接受。
周围神经修复是90年代才发展起来的一门新兴科技。由于神经细胞具有一般不分裂、生长没有穿透力等特点,使神经修复十分困难。目前应用于临床的神经系统修复方法有直接缝合法和自体移植法。前一种方法只适合断损较小的情况,后一种是以肢体的其它功能受损为代价。针对上述两种方法的缺陷,人们提出了神经导管法,与自体移植法相比,该方法具有明显的优势[Dunnen WF,Lei B,Schakenraad JM,et al.Long-term evaluation of nerveregeneration in a biodegradable nerve guide.Microsurgery,1993;14:508;Meek MF,DenDunnen WF,Schakenread JM,et al.Peripheral nerve regeneration and functionalrecovery after reconstruction with a thin-walled biodegradable poly(DL-lactide-ε-caprolactone)nerve guide.Cells Mater,1997;7(1):53]。据文献报道,目前人工神经导管主要有生物不可降解的和生物可降解的两类。生物不可降解的包括硅酮、聚乙烯、聚氯乙烯、聚四氟乙烯、丙烯腈-氯乙烯等惰性聚合物[Carole AH,Gregory E,Rutkowski.Thedevelopment of bioartificial nerve grafts for peripheral-nerve regeneration.Tibtech,1998;16:163;Valentini RF,Sanatini AM,Dario P,et al.Polymer electret guidancechannels enhance peripheral nerve regeneration in mice.Brain Research,1989;480:300]。这些材料制成的导管在修复神经时都会产生持续炎症反应,如不及时拆除,会压迫神经甚至造成神经损伤[杨吟野,李训虎等.壳聚糖及相关材料用于神经修复的前景.生物医学工程学杂志.2001:18(3):444]。生物可降解导管包括聚羟基乙酸、聚乳酸、聚酯、胶原、乳酸-ε-己内酯共聚物等[Carole AH,Gregory E,Rutkowski.The development ofbioartificial nerve grafts for peripheral-nerve regeneration.Tibtech,1998;16:163;Li ST,Archibald SJ.Peripheral nerve repair with collagen conduits.Clin Materials,1992;9:195]。由于神经导管的结构直接影响着营养物质的供给、神经导管材料还存在降解性能、力学性能与神经修复速度相匹配,与周围组织相容性等问题,至今生物可降解材料对神经修复的研究仍处于实验阶段,估计到临床应用还有一段距离。如前所述,壳聚糖作为一种有潜力的可降解生物材料,已被用于神经修复材料的研究。但已知作为神经修复的壳聚糖,其力学强度、降解速度和修复效果等仍存在一些问题。
发明内容
本发明的目的是提供一种多功能生物修复材料的制备方法,该方法制备工艺简单,成本较低,它是以壳聚糖、胶原、透明质酸钠为主要成份,所制备的生物材料功能多,可用于皮肤、神经及软骨组织的修复,使用方便,具有良好的生物相容性、机械强度以及抗菌性。
本发明的技术方案如下:一种多功能生物修复材料的制备方法,其特征在于该方法包括如下步骤:
(1)将壳聚糖溶于弱酸中,配成浓度为0.5~3%壳聚糖溶液;将胶原溶于酸中,制成0.1~2%的胶原溶液,将两种溶液混合;将透明质酸钠加入去离子水,配成0.1~10%的透明质酸钠溶液,将盐酸逐滴加入透明质酸钠溶液,调节其pH值达到1~4;将透明质酸钠溶液加入胶原/壳聚糖溶液中,混匀混合,制得壳聚糖与胶原、透明质酸钠混合溶液;其中透明质酸钠与胶原、壳聚糖溶液的体积比为:1∶1~50∶1~200;
(2)将所配混合溶液装入模具中冻干,制成多孔薄膜或管子,其中膜厚为0.5~5毫米,管子内径为2~6毫米;
(3)将制成薄膜状或管状样品用氨水、氨水/乙醇、氨水/丙酮、氨水/甲醇或用1-乙基-(二甲基氨丙基)-碳二亚胺盐酸盐/羧基琥珀酰亚胺/2-吗啉乙基磺酸混合溶液浸泡后直接冻干或凉干,或用蒸馏水冲洗后,再冻干或凉干;
(4)在步骤(3)所制得的薄膜或管内复合一层壳聚糖、壳聚糖/透明质酸钠、壳聚糖/胶原或壳聚糖/胶原/透明质酸钠溶液,烘干或凉干,制得双层复合材料;
(5)将步骤(4)制备的双层薄膜或管状复合材料再用氨水、氨水/乙醇、氨水/丙酮、氨水/甲醇或用1-乙基-(二甲基氨丙基)-碳二亚胺盐酸盐/羧基琥珀酰亚胺/2-吗啉乙基磺酸混合溶液浸泡,蒸馏水冲洗,再冻干,消毒、备用。
上述步骤(1)中制备的壳聚糖/胶原/透明质酸钠混合液中按体积比0.1~10%加入浓度为1~2%的羧甲基纤维素钠、聚乙二醇、聚乙烯醇或硫酸软骨素。
在上述方案的基础上,本发明的技术特征还在于:在上述步骤(1)的溶液中或步骤(5)冻干前的样品中加入干重比为0.1~1%的生长因子、层粘连蛋白、纤维粘连蛋白、生物蛋白胶、肝素钠或多聚赖氨酸。
在制备好的薄膜层中还可加入薄膜重量的1~100%的细胞悬浮液,所述的细胞为表皮细胞、神经细胞或软骨细胞;在管内可加入与管壁平行排列的至少一根诱导纤维,该诱导纤维采用胶原纤维、甲壳素/壳聚糖纤维、壳聚糖/胶原或壳聚糖/胶原/透明质酸钠复合纤维。
本发明所用胶原为I型胶原、II型胶原或IV型胶原,其中作为软骨修复时可使用II型胶原;作为神经修复时可使用IV型胶原,作为皮肤修复时可使用I型胶原。
本发明与现有技术相比,具有以下优点和突出性效果:本发明采用壳聚糖/胶原/透明质酸钠为基本原料,制备工艺简单,成本低;所制备的多功能生物修复材料用于皮肤、神经、软骨修复等组织修复时,不仅具有良好的生物相容性、机械强度以及抗菌性,且使用方便,价格低廉。是一种促进组织修复的、在体内降解速度可调的、适合大众多功能材料,在生物医学领域具有广泛的应用价值。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。
实施例1:
(1)将脱乙酰度为50%、分子量为400000道尔顿的壳聚糖、I型胶原、透明质酸钠分别溶解在1%的醋酸溶液或蒸馏水中,制成浓度为2%的壳聚糖醋酸溶液、1%的I型胶原醋酸溶液和1%的透明质酸钠水溶液;用1M的HCI将透明质酸钠水溶液的pH调至3左右,然后按1∶50∶200(v/v)将透明质酸钠溶液与胶原、壳聚糖溶液混合均匀。
(2)将所配溶液装入容器中冻干,形成厚度为3毫米的海绵层薄膜或内径2毫米,外径5毫米的多孔管状材料;(注:管状材料是将壳聚糖/胶原/透明质酸钠溶液注射到由同心管状聚四氟乙烯制成的环形容器中,然后迅速凉冻,干燥而得。)
(3)用25%氨水浸泡样品10分钟后,再冻干。
(4)在步骤(3)所制得的薄膜或管内涂覆一层壳聚糖溶液、立即烘干,制得双层复合材料;所得双层复合材料可直接用于皮肤、周围神经及软骨的修复。用于周围神经修复时可将管子套在缺损神经两端,不用缝合。
实施例2:
(1)将透明质酸钠、II型胶原、脱乙酰度为70%、分子量为200000道尔顿的壳聚糖分别溶解在蒸馏水或1%的醋酸溶液中,制成浓度为10%的透明质酸钠水溶液、2%的I型胶原、1%的壳聚糖醋酸溶液;用1M的HCI将透明质酸钠水溶液的pH调至2左右,然后按1∶20∶50(v/v)将透明质酸钠溶液与胶原、壳聚糖溶液混合均匀。
(2)将所配溶液装入容器中冻干,形成厚度为4毫米的海绵或内径3毫米、外径5毫米、长为15毫米的多孔管状材料;
(3)用40%氨水浸泡样品10分钟;然后用蒸馏水冲洗净,再冻干。
(4)将2%壳聚糖溶液溶液(烘至将干不干时,在聚四氟乙烯板上涂上薄薄一层。将由步骤(3)所制得的海绵状薄膜放在聚四氟乙烯板的壳聚糖薄层上,立即烘干,制得双层复合材料;若在直径略小的聚四氟乙烯棒上涂一层或蘸一下上述将干溶液(或在多孔管状材料内侧涂一层上述将干溶液),将步骤(3)制得的管状材料套在上面,70℃下立即烘干,制得双层管状复合材料;
(5)将步骤(4)制备的双层平面或管状复合材料再用氨水/丙酮(9∶1)溶液浸泡,蒸馏水冲洗,加入1%的肝素钠,再冻干,γ射线消毒、备用。
实施例3:
(1)将透明质酸钠、IV型胶原、脱乙酰度为90%、分子量为10000道尔顿的壳聚糖分别溶解在蒸馏水或2%的醋酸溶液中,制成浓度为3%壳聚糖溶液,0.1%的透明质酸钠水溶液、2%的I型胶原、2%的壳聚糖醋酸溶液;用1M的HCI将透明质酸钠水溶液的pH调至1左右,然后按1∶1∶1(v/v)比例将透明质酸钠溶液与胶原、壳聚糖溶液混合均匀。
(2)将所配溶液装入容器中冻干,形成厚度为0.5毫米的海绵或内径2毫米,外径3毫米的多孔管状材料;
(3)用25%氨水浸泡样品20分钟;然后用蒸馏水冲洗净,再冻干。
(4)将步骤(1)所制溶液烘至将干不干时,加入微量粒径在1微米的氯化钠混匀,在聚四氟乙烯板上涂上薄薄一层。将由步骤(3)所制得的海绵放在聚四氟乙烯板的壳聚糖薄层上,立即烘干,制得双层复合材料;在直径略小的聚四氟乙烯棒上涂一层上述将干溶液(或在多孔管状材料内侧涂一层上述将干溶液),将步骤(3)制得的管状材料套在上面,立即烘干,制得双层管状复合材料;
(5)将步骤(4)制备的双层平面或管状复合材料再用氨水/丙酮(9∶1)溶液浸泡,蒸馏水冲洗,加入0.1%(W/W)纤维粘连蛋白,再冻干,γ射线消毒、备用。
作为人工皮肤,在使用前可在海绵层中加入50微升的成纤维细胞悬浮液;作为神经修复导管,使用前还可在导管中装入80微升的许旺氏细胞与IV型胶原混合液,3根甲壳素纤维(与导管长轴平行排列),以防液体流失,可用明胶凝胶封住端口;作为软骨修复材料,可在海绵层中加入80微升的软骨细胞,将周围少量软骨组织粉碎破坏软骨细胞外基质后再填进去,以促进软骨细胞迁移。
实施例4
(1)将脱乙酰度为80%、分子量为150000道尔顿的壳聚糖溶解在1%的盐酸中,制成浓度为1.5%壳聚糖溶液。将透明质酸钠与聚乙二醇分别溶于去离子水,配置成1%的透明质酸钠溶液与15%的聚乙二醇溶液。将上述透明质酸钠溶液与聚乙二醇溶液按1∶1(v/v)比例混合,然后逐滴加入1M HCl使其pH降至3左右;将上述透明质酸钠/聚乙二醇溶液按1∶50(v/v)加入壳聚糖溶液,充分搅拌、混匀。
(2)将所配溶液装入容器中冻干,形成厚度为5毫米的海绵或内径6毫米,外径7毫米的多孔管状材料;(3)用氨水/丙酮(9∶1)浸泡样品20分钟;然后用蒸馏水冲洗净,再冻干。
(4)将壳聚糖/透明质酸钠溶液烘至将干不干时,加入微量粒径为1微米的氯化钠混匀,在聚四氟乙烯板上涂上薄薄一层。将由步骤(3)所制得的海绵放在聚硅酮板的壳聚糖薄层上,立即烘干,制得双层复合材料;若在直径略小的聚硅酮棒上涂一层上述将干溶液(或在多孔管状材料内侧涂一层上述将干溶液),将步骤(3)制得的管状材料套在上面,立即烘干,制得双层管状复合材料;
(5)将步骤(4)制备的双层平面或管状复合材料再用氨水/丙酮(9∶1)溶液浸泡,蒸馏水冲洗,加入1%(W/W)的表皮生长因子,再冻干,Co60消毒、备用。
作为人工皮肤,在使用前可在海绵层中加入100微升表皮细胞悬浮液,使用时可用少量1%的壳聚糖的氯化钙醋酸溶液(用碳酸氢钠溶液调节溶液的pH值到5左右)涂抹壳聚糖/透明质酸钠海绵层附着面,以增强海绵的粘附性;作为神经修复导管,使用前还可在导管中装入80微升的许旺氏细胞与层粘连蛋白的混合物,3根壳聚糖纤维(与导管长轴平行排列);作为软骨修复材料,可在海绵层中加入80微升的软骨细胞,将周围少量软骨组织粉碎破坏软骨细胞外基质后再填进去,以促进软骨细胞迁移。
实施例5
将脱乙酰度为85%,分子量为100000的壳聚糖溶解在0.5M的盐酸溶液中;将透明质酸钠与聚乙烯醇分别溶于去离子水,配置成1%的透明质酸钠溶液与20%的聚乙烯醇溶液。将上述透明质酸钠溶液与聚乙烯醇溶液按1∶1(v/v)比例混合,然后逐滴加入1M HCl使其pH降至3左右;将上述透明质酸钠/聚乙二醇溶液按1∶50(v/v)加入壳聚糖溶液,充分搅拌、混匀。
(2)将所配溶液装入容器中冻干,形成厚度为2毫米的海绵或内径2毫米,外径3毫米、长为50毫米的多孔管状材料;
(3)用氨水/乙醇(9∶1)浸泡样品20分钟;然后用蒸馏水冲洗净,再冻干。
(4)将壳聚糖/透明质酸钠溶液烘至将干不干时,加入微量粒径为3微米的氯化钠混匀,在聚四氟乙烯板上涂上薄薄一层。将由步骤(3)所制得的海绵放在聚四氟乙烯板的壳聚糖薄层上,立即烘干,制得双层复合材料;若用直径略小的玻璃棒蘸一下上述将干溶液(或在多孔管状材料内侧涂一层上述将干溶液),将步骤(3)制得的管状材料套在上面,立即烘干,制得双层管状复合材料;
(5)将步骤(4)制备的双层平面或管状复合材料再用氨水/乙醇(9∶1)溶液浸泡,蒸馏水冲洗,加入1%的生物蛋白胶,再冻干,Co60消毒、备用。
作为人工皮肤,在使用前可在海绵层中加入80微升(W/W)的成纤维细胞生长因子悬浮液,100微升表皮细胞悬浮液。使用时样品海绵层可用生物蛋白胶涂抹海绵层或创伤面,以增强海绵的粘附性和防粘连效果;作为神经修复导管,使用前还可在导管中装入80微升的成神经细胞生长因子悬浮液,80微升的许旺氏细胞与纤维粘连蛋白的混合物,3根壳聚糖纤维(与导管长轴平行排列);作为软骨修复材料,可在海绵层中加入80微升的软骨细胞,将周围少量软骨组织粉碎破坏软骨细胞外基质后再填进去,以促进软骨细胞迁移。
生物蛋白胶的配制:将1g猪(血)纤维蛋白原37℃下溶于约10mL的蒸馏水中制成溶液A。将5000单位的人的凝血酶溶于由1mL 0.5M氯化钙(CaCI2),4mL抑肽酶(5000KIE)及7mL蒸馏水配制成的B溶液中。使用前将相同体积的A液和B液混合均匀,取一定量剂涂抹于出血处或伤口周围,然后贴上海绵。
实施例6
将脱乙酰度为90%,分子量为10000的壳聚糖溶解在0.5M的盐酸溶液中;将I型胶原、透明质酸钠、硫酸软骨素分别溶于酸或去离子水,配置成2%的透明质酸钠溶液、1%的I型胶原与1%的硫酸软骨素溶液。将上述壳聚糖、I型胶原、透明质酸钠、硫酸软骨素50∶20∶10∶1(v/v)比例混合均匀,
(2)将所配溶液装入容器中冻干,形成厚度为3毫米的海绵或内径3毫米,外径4毫米的多孔管状材料;
(3)用EDC/NHS/MES体系(将1.731g EDC,0.415g NHS溶于215mL 0.05M MES缓冲液中即可)浸泡样品4小时,蒸馏水冲净,冻干;
(4)将壳聚糖/胶原/透明质酸钠溶液烘至将干不干时,加入微量粒径为0.5微米的蔗糖混匀,在聚四氟乙烯板上涂上薄薄一层。将由步骤(3)所制得的海绵放在聚四氟乙烯板的壳聚糖薄层上,立即烘干,制得双层复合材料;若在直径略小的聚硅酮棒上涂一层上述将干溶液(或在多孔管状材料内侧涂一层上述将干溶液),将步骤(3)制得的管状材料套在上面,立即烘干,制得双层管状复合材料;
(5)将步骤(4)制备的双层平面或管状复合材料再用EDC/NHS/MES体系浸泡2小时,蒸馏水冲洗后,加入0.1%的层粘连蛋白,再冻干,消毒、备用。
作为人工皮肤,在使用前可在海绵层中加入80微升(W/W)的成纤维细胞生长因子悬浮液,100微升表皮细胞悬浮液;作为神经修复导管,使用前还可在导管中装入80微升的成神经细胞生长因子悬浮液,80微升的许旺氏细胞与纤维粘连蛋白的混合物,3根壳聚糖纤维(与导管长轴平行排列);作为软骨修复材料,可在海绵层中加入80微升的软骨细胞,将周围少量软骨组织粉碎破坏软骨细胞外基质后再填进去,以促进软骨细胞迁移。
作为人工皮肤,使用中在海绵层上涂抹壳聚糖/PLGA/EDC(10∶90∶1),以增强海绵的粘附性。
壳聚糖/PLGA/EDC胶粘剂的配制:将等量的壳聚糖醋酸溶液和PLGA的1,4-二氧六环溶液混合,37℃下预热后加入一定量的EDC的水溶液中即可。使用时将上述液体涂抹在海绵层,接触组织的一面。
实施例7
(1)将透明质酸钠、I型胶原、脱乙酰度为50%、分子量为400000道尔顿的壳聚糖分别溶解在蒸馏水或1%的醋酸溶液中,制成浓度为1%的透明质酸钠水溶液、1%的I型胶原、0.5%的壳聚糖醋酸溶液;用1M的HCI将透明质酸钠水溶液的pH调至3左右,然后按1∶50∶100(v/v)将透明质酸钠溶液与胶原、壳聚糖溶液混合均匀。
(2)将所配溶液凉或烘至将干不干时,在聚硅酮板或棒外围涂上薄薄一层,凉干或烘干。
(3)用25%氨水浸泡样品10分钟;然后用蒸馏水冲洗净,凉干或烘干。
(4)将上述薄膜铺在聚硅酮板上,其上倒上一层由(1)配制的溶液;在粘附有一层壳聚糖/透明质酸钠/I型胶原的聚硅酮棒放在环形容器中,注入上述溶液,立即放在-80℃的冰块上冷冻,再冻干。用25%氨水浸泡样品10分钟;然后用蒸馏水冲洗净,加入1%的多聚赖氨酸,冻干。所得双层支架材料可直接用于皮肤、周围神经及软骨的修复。
实施例8
(1)将透明质酸钠溶解在蒸馏水,制成浓度为1%的透明质酸钠水溶液,I型胶原和脱乙酰度为80%、分子量为150000道尔顿的壳聚糖分别溶解在1%的醋酸溶液中,配制成0.1%的I型胶原、3%的壳聚糖醋酸溶液;用1M的HCI将透明质酸钠水溶液的pH调至2左右,然后按1∶30∶90(v/v)将透明质酸钠溶液与胶原、壳聚糖溶液混合均匀。
(2)将所配溶液装入容器中冻干,形成厚度为3毫米的海绵或内径6毫米、外径9毫米、长为35毫米的多孔管状材料;
(3)用EDC/NHS/MES体系(将1.731g EDC,0.415g NHS溶于215mL 0.05M MES缓冲液中即可)浸泡样品4小时;然后用蒸馏水冲洗净,再冻干。
(4)将2%壳聚糖溶液或将步骤(1)所制溶液中加入1%粒径为5微米的氯化钠,烘至将干不干时,在聚四氟乙烯板上涂上薄薄一层。将由步骤(3)所制得的海绵放在聚四氟乙烯板的壳聚糖薄层上,立即烘干,制得双层复合材料;若在直径略小的聚硅酮棒上涂一层或蘸一下上述将干溶液(或在多孔管状材料内侧涂一层或蘸一下上述将干溶液),将步骤(3)制得的管状材料套在上面,立即烘干,制得双层管状复合材料;
(5)将步骤(4)制备的双层平面或管状复合材料再用氨水/丙酮(9∶1)溶液浸泡,蒸馏水冲洗,加入0.5%的肝素钠,再冻干,γ射线消毒、备用。
实施例9
将脱乙酰度为80%、分子量为200000道尔顿的壳聚糖与胶原分别溶解在1%的盐酸中,制成浓度为1.5%、0.5%的壳聚糖、胶原溶液。将透明质酸钠与羧甲基纤维素钠分别溶于去离子水,配成1%的透明质酸溶液与2%的羧甲基纤维素钠溶液。将上述透明质酸钠溶液与羧甲基纤维素钠醇溶液按1∶1(v/v)比例混合,然后逐滴加入1M HCl使其pH降至3左右;将上述透明质酸钠/羧甲基纤维素钠溶液按1∶50(v/v)加入壳聚糖/胶原(1∶1)溶液,充分搅拌、混匀。
(2)将所配溶液装入容器中冻干,形成厚度为2毫米的海绵或内径4毫米,外径6毫米的多孔管状材料;
(3)用氨水/甲醇(9∶1)浸泡样品20分钟;然后用蒸馏水冲洗净,再冻干。
(4)将壳聚糖/透明质酸钠溶液烘至将干不干时,加入微量粒径为1微米的氯化钠混匀,在聚四氟乙烯板上涂上薄薄一层。将由步骤(3)所制得的海绵放在聚四氟乙烯板的壳聚糖薄层上,立即烘干,制得双层复合材料;若在直径略小的聚四氟乙烯棒上涂一层或蘸一下上述将干溶液(或在多孔管状材料内侧涂一层或蘸一下上述将干溶液),将步骤(3)制得的管状材料套在上面,立即烘干,制得双层管状复合材料;
(5)将步骤(4)制备的双层平面或管状复合材料再用氨水/甲醇(9∶1)溶液浸泡,蒸馏水冲洗,加入0.6%(W/W)的纤维粘连蛋白,凉干,Co60消毒、备用。
作为人工皮肤,在使用前可在海绵层中加入100微升表皮细胞悬浮液,使用时可用少量壳聚糖/PLGA/EDC/丙酮溶液涂抹壳聚糖/透明质酸钠/胶原/羧甲基纤维素钠海绵附着面,以增强海绵的粘附性;作为神经修复导管,使用前还可在导管中装入80微升的许旺氏细胞与层粘连蛋白的混合物,3根壳聚糖纤维(与导管长轴平行排列);作为软骨修复材料,可在海绵层中加入80微升的软骨细胞,将周围少量软骨组织粉碎破坏软骨细胞外基质后再填进去,以促进软骨细胞迁移。
实施例10:
(1)将脱乙酰度为80%、分子量为180000道尔顿的壳聚糖、I型胶原、透明质酸钠分别溶解在1%的醋酸溶液或蒸馏水中,制成浓度为1%的壳聚糖醋酸溶液、1%的I型胶原和1%的透明质酸钠水溶液;用1M的HCI将透明质酸钠水溶液的pH调至3左右,然后按1∶10∶100(v/v)将透明质酸钠溶液与胶原、壳聚糖溶液混合均匀。
(2)将所配溶液装入容器中冻干,形成厚度为1毫米的海绵层薄膜或内径3毫米,外径4毫米的多孔管状材料;(注:管状材料是将壳聚糖/胶原/透明质酸钠溶液注射到由同心管状聚四氟乙烯制成的环形容器中,然后迅速凉冻,干燥而得。)
(3)用25%氨水浸泡样品10分钟;然后用蒸馏水冲洗净,加入1%的多聚赖氨酸,再冻干,Co60消毒、备用。
(4)在步骤(3)所制得的薄膜或管内涂覆一层壳聚糖、壳聚糖溶液烘干,制得双层复合材料;所得海绵可直接用于皮肤、周围神经及软骨的修复。用于周围神经修复时可将管子套在缺损神经两端,不用缝合。
Claims (5)
1.一种多功能生物修复材料的制备方法,其特征在于该方法包括如下步骤:
(1)将壳聚糖溶于弱酸中,配成浓度为0.5~3%壳聚糖溶液;将胶原溶于酸中,制成0.1~2%的胶原溶液,将两种溶液混合;将透明质酸钠加入去离子水,配成0.1~10%的透明质酸钠溶液,将盐酸逐滴加入透明质酸钠溶液,调节其pH值达到1~4;将透明质酸钠溶液加入胶原与壳聚糖混合溶液中,混合均匀,制得壳聚糖/胶原/透明质酸钠溶液;其中透明质酸钠与胶原、壳聚糖溶液的体积比为:1∶1~50∶1~200;
(2)将所配混合溶液装入模具中冻干,制成多孔薄膜或管状材料,其中膜厚为0.5~5毫米,管内径为2~6毫米;
(3)将制成薄膜状或管状样品用氨水、氨水/乙醇、氨水/丙酮、氨水/甲醇或用1-乙基-(二甲基氨丙基)-碳二亚胺盐酸盐/羧基琥珀酰亚胺/2-吗啉乙基磺酸混合溶液浸泡后冻干,或用蒸馏水冲洗净后,再冻干;
(4)在步骤(3)所制得的薄膜上或管内复合一层壳聚糖、壳聚糖/透明质酸钠、壳聚糖/胶原或壳聚糖/胶原/透明质酸钠溶液,烘干或凉干,制得双层复合材料;
(5)将步骤(4)制备的双层薄膜或管状复合材料再用氨水、氨水/乙醇、氨水/丙酮、氨水/甲醇或用1-乙基-(二甲基氨丙基)-碳二亚胺盐酸盐/羧基琥珀酰亚胺/2-吗啉乙基磺酸混合溶液浸泡,蒸馏水冲洗,再冻干,消毒、备用。
2.按照权利要求1所述的方法,其特征在于:所述的步骤(1)中制备的壳聚糖/胶原/透明质酸钠混合液中按体积比0.1~10%加入浓度为1~2%的羧甲基纤维素钠、聚乙二醇、聚乙烯醇、聚乳酸、硫酸软骨素溶液。
3.按照权利要求1或2所述的方法,其特征在于:在上述步骤(1)的溶液中或步骤(5)冻干前的样品中加入干重比为0.1~1%的生长因子、层粘连蛋白、纤维粘连蛋白、生物蛋白胶、肝素钠或多聚赖氨酸。
4.按照权利要求3所述的方法,其特征在于:在薄膜层中加入薄膜重量的1~100%的细胞悬浮液,所述的细胞为表皮细胞、神经细胞或软骨细胞;在管内加入与管壁平行排列的至少一根诱导纤维,该诱导纤维采用胶原纤维、甲壳素/壳聚糖纤维、壳聚糖/胶原或壳聚糖/胶原/透明质酸钠复合纤维。
5.按照权利要求1所述的方法,其特征在于:步骤(1)和步骤(4)中所述的胶原为I型胶原,II型胶原或IV型胶原,其中作为软骨修复时可使用II型胶原;作为神经修复时可使用IV型胶原,作为皮肤修复时可使用I型胶原。
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