CN113599528A - 一种仿生型膜-MOFs复合载药体系及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种仿生型膜‑MOFs复合载药体系及其应用，复合载药体系为金属有机框架材料ZIF‑8负载槲皮素后包覆凋亡小体膜制得的凋亡小体膜修饰纳米粒，其粒径小于200nm，包封率为包封率为92‑95％，载药量为19‑23％。本发明仿生型膜‑MOFs复合载药体系具有良好的生物相容性，又具有关节腔原位治疗作用，为骨关节炎的治疗提供一种安全有效的新型仿生型纳米药物载体，促进骨关节炎中滑膜巨噬细胞极化为M2表型，实现对骨关节炎的免疫治疗。
Description
技术领域
本发明涉及药物载体领域，具体的是一种仿生型膜-MOFs复合载药体系及其应用。
背景技术
骨关节炎(osteoarthritis，OA)是一种严重影响患者生活质量的关节退行性疾病。该病不仅会导致关节软骨损害，还可累及整个关节，包括软骨下骨、韧带、关节囊、滑膜和关节周围肌肉，最终发生关节软骨退变、纤维化、断裂、溃疡及整个关节面的损害。典型的临床表现包括疼痛，僵硬和关节变形。
OA与人体衰老密切相关，现已成为全世界第四大致残疾病。临床数据显示，目前全球约有2.5亿人罹患OA，其中在60岁以后，大约9.6％的男性和18.0％的女性会患有OA，而且随年龄的增加发病率逐渐升高。在我国，60岁以上的老年人中，经X线平片检查有OA表现的约占50％，其中30％～50％有临床症状。
目前认为OA的发病机制是由多种因素参与的复杂病变过程，与年龄、创伤、炎症、职业、肥胖、代谢和遗传等因素有关，其病理基础都是由于软骨的磨损大于修复，最终导致关节软骨的缺损而产生疼痛。由于OA的发病机制复杂，目前尚缺乏能够有效改变OA病情的药物，主要以对症治疗为主，包括缓解或消除疼痛，矫正畸形，恢复关节功能，从而提高患者的生活质量。
发明内容
为解决上述背景技术中提到的不足，本发明的目的在于提供一种仿生型膜-MOFs复合载药体系及其应用，该复合载药体系具有良好的生物相容性，又具有关节腔原位治疗作用，为骨关节炎的治疗提供一种安全有效的新型仿生型纳米药物载体。
本发明的目的可以通过以下技术方案实现：
一种仿生型膜-MOFs复合载药体系，复合载药体系为金属有机框架材料ZIF-8(MOFs)负载槲皮素(quercetin，Que)后包覆凋亡小体膜制得的凋亡小体膜修饰纳米粒(apM@MOFs-Que)，其粒径小于200nm，包封率为93.89±0.91％，载药量为20.61±1.22％，其制备方法包括以下步骤：
S1、采用两步酶消化法从大鼠关节中提取关节软骨细胞，星形孢菌素10μM促凋亡2h，再通过膜蛋白提取试剂盒提取得到凋亡小体膜；
S2、将二甲基咪唑与六水合硝酸锌通过溶剂热法合成金属有机框架材料ZIF-8(MOFs)；
S3、将金属有机框架材料ZIF-8(MOFs)和槲皮素(quercetin，Que)采用一锅法制备MOFs纳米粒载槲皮素(MOFs-Que)，再将MOFs纳米粒载槲皮素(MOFs-Que)和凋亡小体膜通过超声加脂质体挤出方法制得凋亡小体膜修饰纳米粒(apM@MOFs-Que)。
进一步优选地，步骤S2中二甲基咪唑与六水合硝酸锌的摩尔比为9:1-3:1。
进一步优选地，步骤S3中MOFs纳米粒载槲皮素和凋亡小体膜的质量比为1:1-1:3。
一种仿生型膜-MOFs复合载药体系在在骨关节炎治疗中的应用，所述复合载药体系促进骨关节炎中滑膜巨噬细胞极化为M2表型，实现对OA的免疫治疗。
本发明的有益效果：
本发明仿生型膜-MOFs复合载药体系具有良好的生物相容性，又具有关节腔原位治疗作用，为骨关节炎的治疗提供一种安全有效的新型仿生型纳米药物载体，促进骨关节炎中滑膜巨噬细胞极化为M2表型，实现对骨关节炎的免疫治疗，为骨关节炎的治疗提供一种新思路和新方法。
附图说明
下面结合附图对本发明作进一步的说明。
图1是MOF、MOFs-Que、chM@MOFs-Que和apM@MOFs-Que纳米粒凋亡小体膜构成的囊泡的透射电镜图。
图2是MOF、MOFs-Que、chM@MOFs-Que、apM@MOFs-Que体外生物相容性研究结果(CCK8法)；
图3是荧光显微镜法观测巨噬细胞细胞对MOFs-Que、chM@MOFs-Que、apM@MOFs-Que的摄取情况；
图4是荧光显微镜法观测apM@MOFs-Que纳米粒的免疫调节作用
图5是荧光显微镜法观测游离Cy5、MOFs-Cy5、chM@MOFs-Cy5、apM@MOFs-Cy7在0h，6，12，24，48h的荧光强度
图6是小动物活体成像法观测游离Cy5、MOFs-Cy5、chM@MOFs-Cy5、apM@MOFs-Cy7的体内分布情况和离体组织分布情况。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
一种仿生型膜-MOFs复合载药体系，复合载药体系为金属有机框架材料ZIF-8负载槲皮素后包覆凋亡小体膜制得的凋亡小体膜修饰纳米粒，其制备方法包括以下步骤：
S1、采用两步酶消化法从大鼠关节中提取关节软骨细胞，星形孢菌素10μM促凋亡2h，再通过膜蛋白提取试剂盒提取得到凋亡小体膜；
S2、将摩尔比为3:1的二甲基咪唑与六水合硝酸锌通过溶剂热法合成金属有机框架材料ZIF-8；
S3、将金属有机框架材料ZIF-8和槲皮素采用一锅法制备MOFs纳米粒载槲皮素，再将MOFs纳米粒载槲皮素和凋亡小体膜按照质量比1:3通过超声加脂质体挤出方法制得凋亡小体膜修饰纳米粒。
实施例2
一种仿生型膜-MOFs复合载药体系，复合载药体系为金属有机框架材料ZIF-8负载槲皮素后包覆凋亡小体膜制得的凋亡小体膜修饰纳米粒，其制备方法包括以下步骤：
S1、采用两步酶消化法从大鼠关节中提取关节软骨细胞，星形孢菌素10μM促凋亡2h，再通过膜蛋白提取试剂盒提取得到凋亡小体膜；
S2、将摩尔比为6:1的二甲基咪唑与六水合硝酸锌通过溶剂热法合成金属有机框架材料ZIF-8；
S3、将金属有机框架材料ZIF-8和槲皮素采用一锅法制备MOFs纳米粒载槲皮素，再将MOFs纳米粒载槲皮素和凋亡小体膜按照质量比1:2通过超声加脂质体挤出方法制得凋亡小体膜修饰纳米粒。
实施例3
一种仿生型膜-MOFs复合载药体系，复合载药体系为金属有机框架材料ZIF-8负载槲皮素后包覆凋亡小体膜制得的凋亡小体膜修饰纳米粒，其制备方法包括以下步骤：
S1、采用两步酶消化法从大鼠关节中提取关节软骨细胞，星形孢菌素10μM促凋亡2h，再通过膜蛋白提取试剂盒提取得到凋亡小体膜；
S2、将摩尔比为9:1的二甲基咪唑与六水合硝酸锌通过溶剂热法合成金属有机框架材料ZIF-8；
S3、将金属有机框架材料ZIF-8和槲皮素采用一锅法制备MOFs纳米粒载槲皮素，再将MOFs纳米粒载槲皮素和凋亡小体膜按照质量比1:1通过超声加脂质体挤出方法制得凋亡小体膜修饰纳米粒。
性能检测
1、不同类型纳米粒粒径、PDI和Zeta电位
采用类似实施例1-3方法制备普通软骨细胞膜包裹的纳米粒，命名为chM@MOFs-Que，粒游离Que、MOFs-Que、chM@MOFs-Que、apM@MOFs-Que、的粒径、PDI和Zeta电位见下表1，各透射电镜图透射电镜图如图1：
表1不同类型纳米粒粒径、PDI和Zeta电位
2、不同纳米粒包封率及载药量的测定
MOFs-Que、chM@MOFs-Que、apM@MOFs-Que的包封率和载药量如表2所示。三种纳米粒的包封率均在90％以上，具有较高的包封率(EE)；三种纳米粒的载药量(DLC)均在20％以上。
表2不同纳米粒包封率及载药量的测定结果
3、不同纳米粒包封率及载药量的测定
游离Que、MOFs-Que、chM@MOFs-Que、apM@MOFs-Que与巨噬细胞细胞共孵育24h，考察其体外生物相容性。通过CCK8法研究细胞存活率表明，MOF材料在浓度范围0-300μg/mL内，巨噬细胞仍然保持88％以上的存活率，表明MOFs材料具有良好的体外生物相容性。见图2。
4、巨噬细胞对apM@MOFs纳米粒的摄取情况
与MOFs-Que、chM@MOFs-Que纳米粒组相比，apM@MOFs-Que纳米粒组表现出更强的绿色荧光，表明凋亡小体膜的修饰能够增加巨噬细胞对纳米粒的摄取。而且随着孵育时间的增加，巨噬细胞对apM@MOFs纳米粒的摄取量也逐渐增加。见图3。
5、apM@MOFs-Que纳米粒的免疫调节作用鉴定
用M1型表面标记物iNOS(红色荧光)和M2型表面标记物CD206(绿色荧光)分别标记巨噬细胞，并将各组纳米粒与LPS刺激的巨噬细胞(成为M1型)共孵育后。通过荧光显微镜观测表明，与游离Que、MOFs-Que、chM@MOFs-Que纳米粒组相比，apM@MOFs纳米粒的绿色荧光强度明显强于游离Que、MOFs-Que、chM@MOFs-Que纳米粒组，说明apM@MOFs-Que纳米粒具有更强的促进巨噬细胞成为M2型的作用，即抗炎作用更显著。见图4。
6、不同MOFs纳米粒的关节滞留性
活体成像技术考察各组纳米载体在膝关节腔内的滞留时间和体内分布情况，采用Cy5标记的纳米载体得游离Cy7、MOFs-Cy7、chM@MOFs-Cy7、apM@MOFs-Cy7。分别给予OA大鼠(n＝3)关节腔注射。注射后，分别于0，6，12，24，48h将大鼠以同样的姿势放入IVIS活体成像仪中观察荧光强度。体内分布结果显示，游离Cy7、MOFs-Cy7的体内滞留时间较短，约为12h，chM@MOFs-Cy7、apM@MOFs-Cy7的体内滞留时间均为36h，由于apM@MOFs-Cy7的荧光强度高于chM@MOFs-Cy7，说明凋亡小体膜包裹的纳米粒的滞留时间均高于其他三组，apM@MOFs-Cy7纳米粒的关节滞留效果更好。见图5。
7、不同MOFs纳米粒的离体体内分布研究
取给药后6h的OA大鼠的膝关节、心、肝、脾、肺、肾等组织，进行离体组织荧光成像，与游离Cy5、MOFs-Cy5、chM@MOFs-Cy5组相比，apM@MOFs-Cy7组膝关节红色荧光强度更强，关节滞留效果更好。关节腔原位注射，避免了全身分布，心肝脾肺肾等脏器无荧光分布。见图6。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“示例”、“具体示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。
Claims (4)
1.一种仿生型膜-MOFs复合载药体系，其特征在于，所述复合载药体系为金属有机框架材料ZIF-8负载槲皮素后包覆凋亡小体膜制得的凋亡小体膜修饰纳米粒，其粒径小于200nm，包封率为92-95％，载药量为19-23％，其制备方法包括以下步骤：
S1、采用两步酶消化法从大鼠关节中提取关节软骨细胞，星形孢菌素10μM促凋亡2h，再通过膜蛋白提取试剂盒提取得到凋亡小体膜；
S2、将二甲基咪唑与六水合硝酸锌通过溶剂热法合成金属有机框架材料ZIF-8；
S3、将金属有机框架材料ZIF-8和槲皮素采用一锅法制备MOFs纳米粒载槲皮素，再将MOFs纳米粒载槲皮素和凋亡小体膜通过超声加脂质体挤出方法制得凋亡小体膜修饰纳米粒。
2.根据权利要求1所述的仿生型膜-MOFs复合载药体系，其特征在于，所述步骤S2中二甲基咪唑与六水合硝酸锌的摩尔比为9:1-3:1。
3.根据权利要求1所述的仿生型膜-MOFs复合载药体系，其特征在于，所述步骤S3中MOFs纳米粒载槲皮素和凋亡小体膜的质量比为1:1-1:3。
4.一种如权利要求1-3任一项所述仿生型膜-MOFs复合载药体系在在骨关节炎治疗中的应用，其特征在于，所述复合载药体系促进骨关节炎中滑膜巨噬细胞极化为M2表型，实现对OA的免疫治疗。
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