CN112870191A - 金属有机框架zif-8包裹普鲁士蓝负载槲皮素的纳米粒、制备方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了金属有机框架ZIF‑8包裹普鲁士蓝负载槲皮素的纳米粒、制备方法及应用，所述纳米粒包括ZIF‑8包裹的普鲁士蓝纳米粒，所述ZIF‑8包裹的普鲁士蓝纳米粒负载有槲皮素，本发明的纳米粒可避免药物的过早释放，提高了槲皮素的生物利用度；普鲁士蓝作为光热剂在近红外808nm波长下实现光热转换，改善血脑屏障的通透性，同时通过被动靶向，促进槲皮素在脑部的蓄积和释放；金属有机框架ZIF‑8包裹普鲁士蓝，提高普鲁士蓝的稳定性，防止普鲁士蓝聚集。本发明提供的金属有机框架ZIF‑8包裹普鲁士蓝负载槲皮素纳米平台的制备、生产工艺简单，产率高，对环境友好，可实现低成本大规模生产。

Description

金属有机框架ZIF-8包裹普鲁士蓝负载槲皮素的纳米粒、制备 方法及应用

技术领域

本发明涉及纳米药物技术领域，特别是涉及一种金属有机框架ZIF-8包裹普鲁士蓝负载槲皮素的纳米粒、制备方法及应用。

背景技术

神经退行性疾病是一类与年龄、遗传及环境等多因素相关的大脑及脊髓神经元缓慢、不可逆性变性丢失的神经系统疾病，临床常见的神经退行性疾病包括帕金森病(Parkinson’s disease，PD)、阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)、多发性硬化症(Multiple sclerosis，MS)、亨廷顿病(Huntington disease，HT)以及脊髓侧索硬化症(Amyotrophic lateral sclerosis，ALS)等。其神经病理涉及氧化应激、线粒体功能障碍、细胞凋亡遗传变异、衰老、病理性蛋白异常聚集及自噬异常等多种复杂机制，目前临床上缺乏有效的治疗手段。

金属-有机框架材料(MOFs)是由不同连接数的有机配体(联接桥)和金属离子结点组合而成的具有周期性网络结构多孔材料。由于该材料具有高孔隙率、低密度、比表面积大、孔道规则、孔径可调以及拓扑结构多样性等优点，近年来迅速发展，受到了广泛关注和研究。但是由于MOF材料自身结构的稳定性以及不同药物分子结构的特异性，目前已知的可被MOF材料包载的药物种类非常有限。

槲皮素(QCT)是一种常见于水果和蔬菜中的天然类黄酮，具有抗氧化、抗炎和抗凋亡等药理活性。作为一种植物化学物质，QCT还可以调节各种线粒体过程。在过去的十年中，QCT已经作为一种治疗神经退行性疾病的潜在药物应用于早期临床试验。然而，较差的生物利用度限制了QCT的使用，使用有机溶剂，如二甲基亚砜和乙醇来提高溶解度会导致肝和肾损伤。因此，需要采取替代策略来提高QCT的生物利用度及其在大脑中的积累。

血脑屏障(Blood-brain barrier，BBB)的存在一直是药物脑内给药的挑战。一些研究使用病毒载体和靶配体来促进脑内药物递送；然而，这些策略通常需要特定的病理条件和较高剂量。此外，结合后药物释放行为通常是未知的，这可能会导致潜在的副作用。因此，迫切需要开发更有效、更微创、不受病程限制的技术。

发明内容

本发明的目的是提供一种金属有机框架ZIF-8包裹普鲁士蓝负载槲皮素的纳米粒、制备方法及应用，以解决上述现有技术存在的问题。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

技术方案一：

本发明提供一种金属有机框架ZIF-8包裹普鲁士蓝负载槲皮素的纳米粒，包括ZIF-8包裹的普鲁士蓝纳米粒，所述ZIF-8包裹的普鲁士蓝纳米粒负载有槲皮素。

技术方案二：

本发明提供一种所述的金属有机框架ZIF-8包裹普鲁士蓝负载槲皮素的纳米粒的制备方法，包括以下步骤：

S1、将K₃[Fe(CN)₆]和聚乙烯吡咯烷酮(PVP)混合在溶剂中，搅拌，反应；随后加入浓HCl并在加热条件下反应；离心，收集颗粒并用溶剂洗涤；真空冷冻干燥，得到普鲁士蓝纳米粒；

S2、将所述普鲁士蓝纳米粒的有机溶剂溶液与硝酸盐混合；加入二甲基咪唑(MIM)溶液，反应；将反应液离心，收集颗粒，用溶剂洗涤并在水中重新分散，得到ZIF-8包裹的普鲁士蓝纳米粒；

S3、将S2中得到的ZIF-8包裹的普鲁士蓝纳米粒分散于槲皮素的有机溶液中，反应；离心，用溶剂洗涤，所得纳米粒即为产物。

进一步地，所述S1中K₃[Fe(CN)₆]和聚乙烯吡咯烷酮的质量比为1:12～14，优选为1:13.23；优选K₃[Fe(CN)₆]和PVP与超纯水的料液比为1:13.23:40，优选PVP为PVP K30。

进一步地，所述S1中加入浓HCl后加热温度为70～90℃，时间为15～25h，优选浓HCl体积为35.0μL，优选在80℃加热20h。

进一步地，所述S2中有机溶剂包括甲醇、乙醇或丙醇中的一种，优选甲醇。

进一步地，所述S2中普鲁士蓝纳米粒的有机溶剂溶液与硝酸盐混合后超声4～6h，优选为5h，加入二甲基咪唑后的反应条件为室温下搅拌1～3h，优选2h。所述硝酸盐优选Zn(NO₃)₂·6H₂O，所述Zn(NO₃)₂·₆H₂O溶液的浓度优选为1mg/mL。

进一步地，所述S2中所述的普鲁士蓝纳米粒的有机溶剂溶液、硝酸盐溶液和二甲基咪唑溶液的体积比为2:5:5。

进一步地，所述S3中有机溶液为二甲基亚砜，所述ZIF-8包裹的普鲁士蓝纳米粒与槲皮素的质量比为2:1，所述ZIF-8包裹的普鲁士蓝纳米粒负载槲皮素的反应条件为搅拌20～24h，优选24h。所述槲皮素浓度优选为1mg/mL。

进一步地，步骤S1、S2以及S3中所述溶剂均为超纯水。

本发明还提供所述的金属有机框架ZIF-8包裹普鲁士蓝负载槲皮素的纳米粒在制备神经保护药物中的应用。

进一步地，所述的神经保护药物为抗帕金森药物、抗阿尔茨海默病药物以及抗多发性硬化症药物。

普鲁士蓝(PB)是一种良好的光吸收剂，Fe(II)和Fe(III)电荷转移能产生的光热效应，具有出色的光热转换能力。此外，美国食品药品管理局已经批准使用普鲁士蓝纳米粒来逆转辐射引起的损伤，具有良好的生物相容性。此外，普鲁士蓝还被认为是一种清除活性氧(ROS)的人工纳米酶，适合于神经退行性疾病的治疗。

有效的脑部药物递送的一个重要特征是能够避免治疗药物的过早释放。金属有机骨架(MOF)具有可调的多孔结构和超大的比表面积，非常适合负载药物，因此被广泛用于小分子药物的递送。作为MOF家族的一员，沸石咪唑啉框架8(ZIF-8)具有很高的热稳定性；其组分可以在生物实体周围自组装形成保护性晶体涂层，并且已被证明是一种用于药物递送的生物相容性材料。因此，ZIF-8的包封可以阻止普鲁士蓝纳米粒的聚集并调节药物活性成分的扩散。

在近红外光辐射下，普鲁士蓝纳米粒将光转化为热能，从而增强血脑屏障的通透性，实现药物的被动靶向脑部并促进药物释放，同时具有良好的生物相容性。

本发明公开了以下技术效果：

(1)本发明优化了普鲁士蓝纳米粒合成过程中铁氰化钾(K₃[Fe(CN)₆])和聚乙烯吡咯烷酮(PVP)的反应的质量比例；

(2)本发明构建的金属有机框架ZIF-8包裹普鲁士蓝负载槲皮素纳米粒，提高了普鲁士蓝纳米粒的稳定性；普鲁士蓝作为光热剂在近红外808nm波长下实现光热转换，改善血脑屏障的通透性，同时通过被动靶向，促进槲皮素在脑部的蓄积和释放；金属有机框架ZIF-8包裹普鲁士蓝，提高普鲁士蓝的稳定性，防止普鲁士蓝聚集；

(3)槲皮素为潜在的脑部疾病治疗药物，本发明构建的金属有机框架ZIF-8包裹普鲁士蓝负载槲皮素纳米粒，避免药物的过早释放，改善槲皮素的溶解度，提高了槲皮素的生物利用度，对中药与纳米生物医药领域的应用结合提供了依据与方向；

(4)本发明提供的制备方法，生产工艺较为简单、包封率高，最终产物溶剂为水，没有毒性，对环境友好，可实现低成本大规模生产；

(5)本发明所述的纳米粒具有集成的、无创的、靶向的和生物相容的特点，具有近红外响应和有效的脑部药物递送的特点，本发明涉及的光热效应治疗策略，能增强血脑屏障的通透性，实现药物的被动靶向与释放，克服了治疗脑部疾病药物递送的主要障碍，同时具有良好的生物相容性，为设计脑部药物递送载体提供了新的方法与思路；

(6)本发明提供的金属有机框架ZIF-8包裹普鲁士蓝负载槲皮素纳米粒有望在多方向多维度的纳米生物医药领域如帕金森病、阿尔茨海默症、脑部肿瘤等以脑部病变为主的疾病方向作为药物递送策略使用。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为实施例1步骤2～3制备的各自新鲜产物的透射电镜图；其中，A为实施例1步骤2所得产物，B为实施例1步骤3所得产物；

图2为实施例1步骤2～3所述产物的稳定性考察结果图；

图3为实施例1步骤1～3所述产物的的紫外-可见光-近红外吸收结果图；

图4为实施例1中步骤1和步骤3所述产物的光热性能结果图；

图5为本发明ZIF-8@PB-QCT与近红外光照联合应用后的药物释放结果图；

图6为本发明ZIF-8@PB-QCT与近红外光照联合应用后的表观渗透系数结果图；

图7为本发明ZIF-8@PB-QCT与近红外光照联合应用后细胞毒性实验结果图；

图8为本发明ZIF-8@PB-QCT与近红外光照联合应用后的体外神经保护作用实验结果图；

图9为本发明ZIF-8@PB-QCT与近红外光照联合应用后的体外耗氧率结果图；

图10为本发明ZIF-8@PB-QCT与近红外光照联合应用后的在动物体内的药代动力学结果图；其中A为血浆中的时间-药物浓度曲线图，B为脑组织中的时间-药物含量曲线图；

图11为研究本发明ZIF-8@PB-QCT与近红外光照联合应用后对动物行为学影响的实验结果图；其中，A为转棒实验结果图，B为爬杆实验结果图，C和D为旷场实验结果图；

图12为研究本发明ZIF-8@PB-QCT与近红外光照联合应用后对脑部黑质致密部TH阳性神经元数量和多巴胺代谢水平影响的实验结果图。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。

关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。

本发明实施例中涉及的材料：

铁氰化钾(K3[Fe(CN)6])购自国药化学试剂有限公司；

聚乙烯吡咯烷酮K30(PVP K30)购自国药化学试剂有限公司；

二甲基亚砜购自国药化学试剂有限公司；

二甲基咪唑(MIM)购自阿拉丁生物科技公司；

槲皮素购自阿拉丁生物科技公司；

小鼠脑星形胶质细胞样细胞(ALT)、人神经母细胞瘤(SH-SY5Y)细胞和永生化小鼠脑内皮细胞(bEnd.3)购自台湾新竹生物资源收集与研究中心。

本发明的验证例1-6均以实施例1制备的产物为例进行说明。

实施例1

步骤1：普鲁士蓝(PB)纳米粒的制备

将226.7mg K₃[Fe(CN)₆]和3g PVP混合在40ml超纯水中，剧烈搅拌以获得均匀溶液。随后加入35.0μL浓HCl，80℃加热20h。通过离心收集颗粒并用超纯水洗涤，然后真空冷冻干燥，得到普鲁士蓝纳米粒(PB)。

步骤2：金属框架包裹普鲁士蓝纳米粒(ZIF-8@PB)的制备

将步骤1中得到的普鲁士蓝纳米粒的分散于2mL甲醇中，与5mL浓度为1mg/mL的Zn(NO₃)₂·6H₂O混合，超声5h。然后，加入5mL的1mg/mL的MIM溶液，室温搅拌2h。最后，将反应液以5000rpm离心10min，收集颗粒，用超纯水洗涤三次并在水中重新分散，得到ZIF-8包裹的普鲁士蓝纳米粒(ZIF-8@PB)。

步骤3：金属有机框架ZIF-8包裹普鲁士蓝负载槲皮素的纳米粒(ZIF-8@PB-QCT)的制备

取步骤2中得到的ZIF-8包裹的普鲁士蓝纳米粒20mg分散于10mg槲皮素的DMSO溶液(10mL)中，混合液连续搅拌24h。负载上药物的纳米粒通过离心收集，离心速率5000rpm，离心时间10min，然后用超纯水洗涤，得到金属有机框架ZIF-8包裹普鲁士蓝负载槲皮素的纳米粒(ZIF-8@PB-QCT)，包封率为93.66％。

实施例2

步骤1：普鲁士蓝(PB)纳米粒的制备

将226.7mg K₃[Fe(CN)₆]和3g PVP混合在40ml超纯水中，剧烈搅拌以获得均匀溶液。随后加入35.0μL浓HCl，80℃加热20h。通过离心收集颗粒并用超纯水洗涤，然后真空冷冻干燥，得到普鲁士蓝纳米粒(PB)。

步骤2：金属框架包裹普鲁士蓝纳米粒(ZIF-8@PB)的制备

将步骤1中得到的普鲁士蓝纳米粒的分散于2mL甲醇中，与5mL浓度为1mg/mL的Zn(NO₃)₂·6H₂O混合，超声5h。然后，加入5mL的1mg/mL的MIM溶液，室温搅拌2h。最后，将反应液以5000rpm离心10min，收集颗粒，用超纯水洗涤三次并在水中重新分散，得到ZIF-8包裹的普鲁士蓝纳米粒(ZIF-8@PB)。

步骤3：金属有机框架ZIF-8包裹普鲁士蓝负载槲皮素的纳米粒(ZIF-8@PB-QCT)的制备

取步骤2中得到的ZIF-8包裹的普鲁士蓝纳米粒30mg分散于10mg槲皮素的DMSO溶液(10mL)中，混合液连续搅拌24h。负载上药物的纳米粒通过离心收集，离心速率5000rpm，离心时间10min，然后用超纯水洗涤，得到金属有机框架ZIF-8包裹普鲁士蓝负载槲皮素的纳米粒(ZIF-8@PB-QCT)，包封率为88.74％。

实施例3

步骤1：普鲁士蓝(PB)纳米粒的制备

将226.7mg K₃[Fe(CN)₆]和3g PVP混合在40ml超纯水中，剧烈搅拌以获得均匀溶液。随后加入35.0μL浓HCl，80℃加热20h。通过离心收集颗粒并用超纯水洗涤，然后真空冷冻干燥，得到普鲁士蓝纳米粒(PB)。

步骤2：金属框架包裹普鲁士蓝纳米粒(ZIF-8@PB)的制备

将步骤1中得到的普鲁士蓝纳米粒的分散于2mL甲醇中，与5mL浓度为1mg/mL的Zn(NO₃)₂·6H₂O混合，超声5h。然后，加入5mL的1mg/mL的MIM溶液，室温搅拌2h。最后，将反应液以5000rpm离心10min，收集颗粒，用超纯水洗涤三次并在水中重新分散，得到ZIF-8包裹的普鲁士蓝纳米粒(ZIF-8@PB)。

步骤3：金属有机框架ZIF-8包裹普鲁士蓝负载槲皮素的纳米粒(ZIF-8@PB-QCT)的制备

取步骤2中得到的ZIF-8包裹的普鲁士蓝纳米粒20mg分散于15mg槲皮素的DMSO溶液(10mL)中，混合液连续搅拌24h。负载上药物的纳米粒通过离心收集，离心速率5000rpm，离心时间10min，然后用超纯水洗涤，得到金属有机框架ZIF-8包裹普鲁士蓝负载槲皮素的纳米粒(ZIF-8@PB-QCT)，包封率为81.82％。

实施例4

步骤1：普鲁士蓝(PB)纳米粒的制备

将226.7mg K₃[Fe(CN)₆]和3g PVP混合在40ml超纯水中，剧烈搅拌以获得均匀溶液。随后加入35.0μL浓HCl，80℃加热20h。通过离心收集颗粒并用超纯水洗涤，然后真空冷冻干燥，得到普鲁士蓝纳米粒(PB)。

步骤2：金属框架包裹普鲁士蓝纳米粒(ZIF-8@PB)的制备

将步骤1中得到的普鲁士蓝纳米粒的分散于2mL甲醇中，与5mL浓度为1mg/mL的Zn(NO₃)₂·6H₂O混合，超声5h。然后，加入5mL的1mg/mL的MIM溶液，室温搅拌2h。最后，将反应液以5000rpm离心10min，收集颗粒，用超纯水洗涤三次并在水中重新分散，得到ZIF-8包裹的普鲁士蓝纳米粒(ZIF-8@PB)。

步骤3：金属有机框架ZIF-8包裹普鲁士蓝负载槲皮素的纳米粒(ZIF-8@PB-QCT)的制备

取步骤2中得到的ZIF-8包裹的普鲁士蓝纳米粒30mg分散于15mg槲皮素的DMSO溶液(10mL)中，混合液连续搅拌24h。负载上药物的纳米粒通过离心收集，离心速率5000rpm，离心时间10min，然后用超纯水洗涤，得到金属有机框架ZIF-8包裹普鲁士蓝负载槲皮素的纳米粒(ZIF-8@PB-QCT)，包封率为75.38％。

验证例1表征

对实施例1中步骤2、3所述各自新鲜产物的形态进行透射电镜测试，结果如图1所示。透射电镜图像显示步骤2产物的形态呈立方体，步骤3产物由于槲皮素的加载，边界模糊，导致尺寸增大，形貌略有改变。

对粒径大小和稳定性进行测试，结果如图2所示。步骤2产物粒径大小为107nm，步骤3产物粒径大小为143nm。在为期3天的短期稳定性考察中，连续监测上述产物的粒径，未有明显的变化。

对步骤1～3所述各自新鲜产物扫描紫外-可见光-近红外吸收峰，结果如图3所示。步骤3产物具有步骤1和步骤2产物及药物的吸收峰。步骤3产物在373nm处具有槲皮素特征峰，证实槲皮素的成功负载；在700-900nm之间的吸收表明步骤3产物保持了步骤1产物良好的光学特征。

对步骤1和步骤3所述各自新鲜产物的光热性能进行测试，结果如图4所示。将步骤1产物和步骤3产物暴露于808nm(0.8W/cm²；3min)，步骤1产物温度从33.1℃上升到48.6℃，步骤3产物温度从33.0℃上升到48.2℃。

验证例2药物体外释放实验

采用透析法研究ZIF-8@PB-QCT在体外的释放行为。将1mL实施例1制备的ZIF-8@PB-QCT的PBS溶液放入透析袋(MWCO＝3.0kDa)，比较使用或不使用近红外激光(808nm，1W/cm²，30min)处理后药物释放情况。在不同时间点(1、2、4、6、8、12、18和24h)收集透析袋外部的溶液并用紫外分光光度计测得在373nm处的吸光度，以确定释放的槲皮素(QCT)的浓度。结果如图5所示。结果发现没有经过近红外激光处理的溶液，只有13％的QCT被释放。然而，当暴露于近红外激光下时，大约77.96％的QCT从ZIF-8@PB-QCT中释放出来。

验证例3体外血脑屏障渗透性分析

将小鼠脑微血管内皮细胞bEnd.3细胞和星形胶质细胞ALT细胞分别种在Transwell的12孔板上室的正面和背面，共同培养约5天后，形成与血脑屏障结构类似的紧密连接。选择跨上皮电阻(TEER)>150Ω·cm²的样本进行进一步分析。用含有等浓度QCT的QCT和ZIF-8@PB-QCT溶液加入Transwell上室，其中ZIF-8@PB-QCT组用808nm近红外激光(0.8W/cm²)照射5min。然后，将上述产物置于37℃恒温箱中继续孵育1h。使用紫外-可见分光光度计在373nm处测量下室中QCT浓度，表观渗透系数(Papp)计算如下：

其中V表示下室HBS的体积(mL)，dC/dt表示随时间渗透的QCT量(ng/mL·s)，A表示上室的表面积(cm²)，C₀表示上室的初始浓度(ng/mL)。结果如图6所示。与QCT孵育的孔相比，ZIF-8@PB-QCT+NIR处理后的药物渗透性显著增加(P<0.05)，为QCT组的2.67倍。

验证例4体外神经保护作用实验

ZIF-8@PB-QCT+NIR在人神经母细胞瘤(SH-SY5Y)细胞水平上的安全性评价：

将SH-SY5Y细胞按5×10³个/孔的密度接种于96孔板中，培养24h后用梯度浓度(5、10、20、40、80和160μM)的ZIF-8@PB-QCT孵育并给予808nm激光(0.8W/cm²，5min)，继续培养24h。然后，加入CCK-8溶液孵育4h，使用微孔板读取器来测定450nm处的吸光度。细胞活力表示为A450nm下的给药组相对于空白对照组的百分比。结果如图7所示。在5～160μM浓度范围内，ZIF-8@PB-QCT+NIR细胞活力无明显变化，具有良好的生物相容性。

ZIF-8@PB-QCT+NIR在SH-SY5Y细胞水平上的神经保护作用：

将SH-SY5Y细胞(5×10³个/孔)接种于96孔板中，孵育24h。然后用QCT和ZIF-8@PB-QCT+NIR(5μM、10μM、20μM)预处理细胞2h，随后添加MPP⁺至2mM的最终浓度。37℃恒温培养36h后，加入CCK-8溶液，4h后使用微孔板读取器测量读取450nm处的吸光度值。细胞活力表示为A450nm下的给药组相对于空白对照组的百分比。结果如图8所示。在5～20μM的浓度范围内，与QCT组相比，ZIF-8@PB-QCT+NIR显示出更优异的体外神经保护作用(P<0.05)且细胞活力呈剂量依赖性增加。

ZIF-8@PB-QCT+NIR在SH-SY5Y细胞水平上线粒体耗氧量测定：

将SH-SY5Y细胞(1×10⁴个/孔)在96孔板上培养24h，然后用QCT和ZIF-8@PB-QCT+NIR预培养2h(两组所含的QCT浓度均为20μM)。随后加入MPP⁺(最终浓度为2mM，阳性对照)继续孵育36h。在进行线粒体应激试验之前，用FX培养基(175μL)替换细胞培养基。细胞在37℃下平衡60min后进行线粒体应激试验，加入线粒体抑制剂：羰基氰化物4-(三氟甲氧基)苯肼(FCCP，1μM)、寡霉素A(1μM)、抗霉素A(1μM)和鱼藤酮(1μM)的混合物。结果如图9所示。ZIF-8@PB-QCT+NIR治疗后显著改善了MPP+所致的线粒体功能障碍，提高了基础呼吸、ATP生成、H⁺质子泄漏和最大呼吸等能量指标的水平。与QCT组相比，具有更出色的逆转线粒体功能障碍作用(P<0.05)。

以上结果表明，ZIF-8@PB-QCT+NIR在具备良好生物相容性的情况下，比游离QCT具有更明显的神经保护作用，且能改善体外PD模型的线粒体障碍。

验证例5药代动力学实验

SD大鼠分为QCT组和ZIF-8@PB-QCT+NIR组。大鼠经尾静脉给予相当于4mg/kg QCT剂量的相应化合物。照射组大鼠接受808nm激光(0.8W/cm²，41～43℃，10min)。随后，在给药后0.083、0.25、0.5、1、2、3、4、6和8h采集血浆样本。在另外一个独立的实验中，给药后0.25、0.5、1、2、3、4、6、8、10和12h收集全脑样本。采用LC-MS/MS法测定QCT在血浆和脑中的浓度，用DAS2.0软件评价QCT的药动学参数。结果如图10所示。与游离QCT组相比，ZIF-8@PB-QCT+NIR组血浆中的QCT峰值水平(C_max)显著提高，同时增加了AUC下面积(AUC_0-t)，延长了消除半衰期(T_1/2)和平均停留时间(MRT_0-t)。给药后4h左右，ZIF-8@PB-QCT+NIR组脑内QCT浓度达到最高。与QCT组相比，C_max增加了约2.0倍，T_1/2增加到QCT的1.4倍，AUC_0-t增加到QCT的4.3倍。这些结果表明ZIF-8@PB-QCT+NIR在体内介导QCT的持续释放，增加QCT作用的时间，从而提高其生物利用度。

验证例6药效试验

将雄性C57BL/6小鼠随机分组：(1)对照组，(2)MPTP组，(3)左旋多巴组和(4)ZIF-8@PB-QCT+NIR。PD小鼠模型是通过每2小时腹腔注射MPTP(18mg/kg)溶液四次构建的，而对照小鼠注射等量的0.9％生理盐水。在接下来的7天内，每天给小鼠如下处理：第1-2组：0.9％生理盐水；第3组：左旋多巴(25mg/kg)；第4组：以QCT计，剂量为5mg/kg的ZIF-8@PB-QCT，用808nm激光(0.8W/cm²)照射10分钟，头部温度控制在41～43℃。

最后一次注射MPTP/生理盐水后7天，进行行为测试。

转棒试验：将小鼠放在杆上的一个单独的隔间中，在20rpm下测试2分钟。记录小鼠第一次掉落时间和掉落次数。为了保证准确度，对每只小鼠重复进行三次实验。结果如图11A所示。

爬杆试验：将小鼠置于表面粗糙的垂直立杆顶部(直径为1厘米，高度为50厘米)，记录小鼠回头时间(T-turn)和到达底部的时间(T-total)。对每只小鼠重复进行三次实验以获得数据。结果如图11B所示。

旷场实验：将小鼠置于活动空箱(60厘米×60厘米×40厘米)中，在测试之前，将小鼠放置在空箱的中心，在10分钟内进行自由探索提前适应。然后在20分钟的测试中记录移动的总距离和平均移动速度。结果如图11C和图11D所示。

于实验第8天处死小鼠收集组织进行进一步分析。

免疫荧光量化黑质致密部中的TH⁺神经元：收集从AP-2.80mm到AP-3.97mm的厚度为30μm的连续冠状切片。分别用兔抗小鼠TH(Abcam，1:1000)和Alexa-fluor594结合抗兔IgG(Cell-Signaling Technology，1:1000)作为一抗和二抗。在荧光显微镜下观察到红色荧光。随后用ImageJ软件计数TH⁺细胞数。结果如图12A和图12B所示。

纹状体DA水平的测定：产物在冰上0.4mol/L HClO₄(10μL/mg组织)中超声处理，然后在4℃下以10000rpm/min离心10min以沉淀蛋白质。所得上清液使用带有5014B电化学检测器的ESA色谱仪测定DA及其代谢物高香草酸(HVA)和3，4-二羟基苯乙酸(DOPAC)的浓度。结果如图12C所示。

行为学结果显示，ZIF-8@PB-QCT+NIR与左旋多巴都明显改善了帕金森小鼠的行为学缺陷，且ZIF-8@PB-QCT+NIR与左旋多巴治疗效果相当。脑部切片的免疫荧光结果显示，ZIF-8@PB-QCT+NIR治疗后显著减少了MPTP所致的脑部黑质致密部TH阳性神经元的丢失。此外，ZIF-8@PB-QCT+NIR治疗后恢复了小鼠体内的多巴胺代谢水平。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (10)

1.一种金属有机框架ZIF-8包裹普鲁士蓝负载槲皮素的纳米粒，其特征在于，包括ZIF-8包裹的普鲁士蓝纳米粒，所述ZIF-8包裹的普鲁士蓝纳米粒负载有槲皮素。

2.一种如权利要求1所述的金属有机框架ZIF-8包裹普鲁士蓝负载槲皮素的纳米粒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、将K₃[Fe(CN)₆]和聚乙烯吡咯烷酮混合在溶剂中，搅拌，反应；随后加入浓HCl并在加热条件下反应；离心，收集颗粒并用溶剂洗涤；真空冷冻干燥，得到普鲁士蓝纳米粒；

S2、将所述普鲁士蓝纳米粒的有机溶剂溶液与硝酸盐混合；加入二甲基咪唑溶液，反应；将反应液离心，收集颗粒，用溶剂洗涤并在水中重新分散，得到ZIF-8包裹的普鲁士蓝纳米粒；

S3、将S2中得到的ZIF-8包裹的普鲁士蓝纳米粒分散于槲皮素的有机溶液中，反应；离心，用溶剂洗涤，所得纳米粒即为产物。

3.根据权利要求2所述的金属有机框架ZIF-8包裹普鲁士蓝负载槲皮素的纳米粒的制备方法，其特征在于，所述S1中K₃[Fe(CN)₆]和聚乙烯吡咯烷酮的质量比为1:12～14。

4.根据权利要求2所述的金属有机框架ZIF-8包裹普鲁士蓝负载槲皮素的纳米粒的制备方法，其特征在于，所述S1中加入浓HCl后加热温度为70～90℃，时间为15～25h。

5.根据权利要求2所述的金属有机框架ZIF-8包裹普鲁士蓝负载槲皮素的纳米粒的制备方法，其特征在于，所述S2中有机溶剂包括甲醇、乙醇或丙醇中的一种。

6.根据权利要求2所述的金属有机框架ZIF-8包裹普鲁士蓝负载槲皮素的纳米粒的制备方法，其特征在于，所述S2中普鲁士蓝纳米粒的有机溶剂溶液与硝酸盐混合后超声4～6h，加入二甲基咪唑后的反应条件为室温下搅拌1～3h。

7.根据权利要求2所述的金属有机框架ZIF-8包裹普鲁士蓝负载槲皮素的纳米粒的制备方法，其特征在于，所述S2中所述的普鲁士蓝纳米粒的有机溶剂溶液、硝酸盐溶液和二甲基咪唑溶液的体积比为2:5:5。

8.根据权利要求2所述的金属有机框架ZIF-8包裹普鲁士蓝负载槲皮素的纳米粒的制备方法，其特征在于，所述S3中有机溶液为二甲基亚砜，所述ZIF-8包裹的普鲁士蓝纳米粒与槲皮素的质量比为2:1，所述ZIF-8包裹的普鲁士蓝纳米粒负载槲皮素的反应条件为搅拌20～24h。

9.权利要求1所述的金属有机框架ZIF-8包裹普鲁士蓝负载槲皮素的纳米粒在制备神经保护药物中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述的神经保护药物包括抗帕金森药物、抗阿尔茨海默病药物以及抗多发性硬化症药物。

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