CN114903858A - 载迷迭香酸纳米微粒在制备具有肾脏靶向功能的药物方面的应用 - Google Patents

载迷迭香酸纳米微粒在制备具有肾脏靶向功能的药物方面的应用 Download PDF

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Abstract

本发明的提供一种载迷迭香酸纳米微粒在制备具有肾脏靶向功能的药物方面的应用，载迷迭香酸纳米微粒以聚酰胺－胺(PAMAM)作为载体，其中聚酰胺－胺(PAMAM)为第四代聚酰胺－胺(G4‑PAMAM)。该应用包括载迷迭香酸纳米微粒在体外保护HK‑2细胞、减轻H2O2诱导的氧化应激损伤，具有抗氧化作用；该应用包括载迷迭香酸纳米微粒在体内改善肾功能、促进受损肾脏修复的作用，具有抗氧化应激、抗炎作用。本发明实现载迷迭香酸纳米微粒在制备具有肾脏靶向功能的药物方面的应用，为纳米微粒技术在急性肾损伤中的治疗提供科学依据，为急性肾损伤的治疗提供了新思路，也为急性肾损伤抗氧化治疗的精准靶向药物研发提供新的方向，具备安全有效、靶向精准的优点。

Description

载迷迭香酸纳米微粒在制备具有肾脏靶向功能的药物方面的 应用
技术领域
本发明涉及一种载迷迭香酸纳米微粒在制备具有肾脏靶向功能的药物方面的应用。
背景技术
急性肾损伤(acute kidney injury AKI)，是一种多因素导致的严重临床综合征，特征是肾功能突然或快速下降，其中氮质血症、水和电解质紊乱、酸碱平衡紊乱及全身多系统功能损害的症状是其主要临床表现，可伴有尿量减少(400mL/24h或17mL/h)或者无尿(100mL/24h)。
引起AKI的致病因素复杂多样，脓毒血症、缺血再灌注(ischemia reperfusion，IR)损伤和肾毒性药物损伤等因素均可诱导其发生。缺血再灌注损伤(ischemiareperfusionin jury，IRI)是导致AKI发生最常见的原因。其中，氧化应激被认为是参与大多数肾脏疾病发生、进展的关键致病因素，在AKI中也起着重要作用。肾脏缺血缺氧会产生大量活性氧(reactive oxygen species，ROS)，导致生物分子和细胞膜氧化，破坏细胞器功能，导致炎症状态造成肾小管细胞凋亡、坏死。因此，抗氧化剂或ROS清除剂是未来AKI治疗的方向之一。目前已有较多源自植物天然成分的小分子抗氧化剂，因其抗氧化、抗炎特性，用于AKI的预防和治疗。但由于小分子物质给药后易被清除、无靶向肾脏传递和沉积，需要提高药物剂量或延长给药时间以达到肾脏局部有效作用浓度，限制了临床应用。如何提高抗氧化剂的生物利用度以在肾脏局部达到有效的治疗浓度，更好地治疗AKI是目前迫切需要解决的科学问题。
迷迭香酸(rosmarinic acid，RA)是一种广泛存在的天然多酚类物质，可从迷迭香属植物中提取是丹参提取物的主要有效成分。RA具有多种生物学特性，包括抗氧化、抗炎、抗菌活性、抗感染和神经保护活性。既往的研究表明RA可广泛用于治疗氧化应激相关疾病但其水溶性差、生物利用度低等特性限制了其临床应用。
纳米载药技术具备提高药物水溶性、延长药物作用时间、增强药物的体内稳定性等优点，此外可通过对载体进行修饰，利用主动靶向作用将药物递送至目标器官，因此，选择性地将药物输送到肾脏靶点，提高药物生物利用度的同时降低毒副作用；基于此，本申请提出了一种载迷迭香酸纳米微粒在制备具有肾脏靶向功能的药物方面的应用。
发明内容
本发明的主要目的是提供一种载迷迭香酸纳米微粒在制备具有肾脏靶向功能的药物方面的应用。
为了实现上述目的，本发明提供了一种载迷迭香酸纳米微粒在制备具有肾脏靶向功能的药物方面的应用。
根据本发明的另一种具体实施方式，载迷迭香酸纳米微粒以聚酰胺－胺(PAMAM)作为载体。
进一步的，聚酰胺－胺(PAMAM)为第四代聚酰胺－胺(G4-PAMAM)。
根据本发明的另一种具体实施方式，载迷迭香酸纳米微粒中迷迭香酸的载药量为20～30％。
根据本发明的另一种具体实施方式，载迷迭香酸纳米微粒的粒径大小在100nm以下。
进一步的，载迷迭香酸纳米微粒的粒径大小为60nm～90nm。
根据本发明的另一种具体实施方式，应用包括载迷迭香酸纳米微粒在体外保护HK-2细胞、减轻H2O2诱导的氧化应激损伤，具有抗氧化作用。
根据本发明的另一种具体实施方式，应用包括载迷迭香酸纳米微粒在体内改善肾功能、促进受损肾脏修复的作用，具有抗氧化应激、抗炎作用。
本发明具备以下有益效果：
本发明可实现载迷迭香酸纳米微粒在制备具有肾脏靶向功能的药物方面的应用，为纳米微粒技术在急性肾损伤中的治疗提供科学依据，为急性肾损伤的治疗提供了新思路，也为急性肾损伤抗氧化治疗的精准靶向药物研发提供新的方向，具备安全有效、靶向精准的优点。
下面结合附图对本发明作进一步的详细说明。
附图说明
图1是本发明实施例1的整体框架示意图。
图2是载迷迭香酸纳米微粒(S-G-R)合成的流程图，其中图2A显示了L-丝氨酸的去保护：合成Boc-Ser(tBu)-NHS；图2B显示了Boc-Ser(tBu)-PEG2k-COOH合成，图2C显示了丝氨酸与G4-PAMAM的连接，Boc-Ser(tBu)-PEG2k-G4-PAMAM的合成；图2D显示了RA药物的连接：Boc-Ser(tBu)-PEG2k-G4-PAMAM-RA的合成；图2E显示了药物表面氨基(NH2)被羧基(COOH)中和以减轻药物毒性：Ser-PEG2k-G4-PAMAM-RA-COOH(S-G-R)合成。
图3是载迷迭香酸纳米微粒合成的1H NMR图及紫外图，其中图3A显示了Boc-Ser(tBu)-NHS的1H NMR图；图3B显示了Boc-Ser(tBu)-PEG2K-COOH的1H NMR图；图3C显示了Ser-PEG2K-G4-PAMAM-RA-COOH(S-G-R)的1H NMR图；图3D显示了迷迭香酸纳米微粒(G-R、S-G-R)的紫外图，用于计算载药量。
图4是纳米微粒表征检测图，其中图4A显示了载药纳米微粒粒径检测，RA-NPs(G-R和S-G-R)分布在80nm左右；图4B显示了载药纳米微粒电位检测，RA-NPs(G-R和S-G-R)呈微弱的正电性；图4C显示了载药纳米微粒电镜图，两者均呈现光滑的球形小颗粒结构；图4D显示了载药纳米微粒细胞毒性结果，在RA浓度为40μM内对细胞活力无明显影响。
图5是体外氧化应激模型的构建图，其中图5A示出了H2O2对HK-2细胞活力影响；图5B示出了H2O2刺激HK-2细胞后，Kim-1蛋白表达升高；图5C示出了图5B蛋白灰度分析值(n＝3，**P<0.01，***P<0.001)；图5D示出了H2O2刺激HK-2细胞后，细胞免疫荧光证实Kim-1蛋白表达(蓝色：细胞核，绿色：Kim-1，400×)。
图6是纳米微粒体外细胞摄取能力检测图，其中图6A示出了细胞免疫荧光证实靶向组S-G-R-RB纳米微粒细胞摄取明显多于非靶向组G-R-RB纳米微粒，罗丹明B荧光强度明显增加(蓝色：细胞核，绿色：Kim-1，红色：罗丹明B，400×)；图6B示出了流式细胞学方法证实纳米微粒被细胞摄取后，红色荧光明显强于阴性对照(Control)，并且孵育靶向组纳米微粒细胞的红色荧光明显强于非靶向组，曲线右移；图6C示出了图6B流式检测两组之间细胞荧光强度值对比(n＝3，**P<0.01)。
图7是载药纳米微粒体内分布图，其中图7A示出了不同时间点纳米微粒体内主要脏器分布情况：在Sham组小鼠，荧光很快淬灭，12小时荧光明显减弱；在IRI-AKI小鼠，4h时S-G-R-RB在肾组织荧光强度最强，且随着时间增加，荧光保留时间最长；肝脏组织也可看到荧光，在Sham小鼠和AKI小鼠中，非靶向组在肝脏组织荧光强，聚集增多；而靶向组在肾脏组织荧光强、聚集多；图7B示出了不同时间点不同组别的肾脏荧光强度值分析，48h，AKI小鼠的S-G-R-RB组荧光仍较强(n＝3，*<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001)；图7C示出了不同时间点不同组其他脏器(心脏、肝脏、脾脏、肺)的荧光强度值分析(n＝3)。
图8是纳米微粒在肾脏组织分布情况图，其中图8A示出了不同时间点G-R-RB在Sham和AKI组小鼠肾脏分布情况；图8B示出了S-G-R-RB在Sham和AKI组小鼠肾脏分布情况；同体外离体荧光成像趋势一致，4h时，AKI小鼠的S-G-R-RB组肾脏荧光强度最强(蓝色：细胞核，红色：罗丹明B，肾脏形态：10×)。
图9是纳米微粒在肾小管分布情况图：AKI小鼠肾组织Kim-1表达增加，靶向组S-G-R-RB组肾组织罗丹明B的红色荧光强度强于非靶向组G-R-RB，且主要位于肾小管上皮细胞中(蓝色：细胞核，红色：罗丹明B，绿色：Kim-1；肾脏形态：10×，放大：400×)。
图10是载药纳米微粒体内生物安全性检测图，其中图10A示出了Sham组小鼠给药前后各时间点肝功能指标ALT、AST检测，随着时间变化，肝功能无明显改变；图10B示出了Sham组小鼠给药前后各时间点肾功能指标Scr、BUN检测，随着时间变化，肾功能无明显改变。
图11是载迷迭香酸纳米微粒对细胞活力及HO-1蛋白表达影响图，其中图11A示出了载迷迭香酸纳米微粒对细胞活力影响；图11B示出了H2O2诱导HO-1蛋白表达增加；图11C示出了图B灰度分析统计值；图11D示出了不同组别处理HO-1表达；图11E示出了图D的灰度分析统计值；(*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001)。
图12是细胞内ROS、NO、线粒体膜电位检测检测图，其中图12A示出了ROS水平检测(200×)；图12B示出了NO水平检测(200×)；图12C示出了线粒体膜电位检测(400×)。
图13是流式细胞学方法检测纳米微粒抗氧化应激及抗凋亡作用图，其中图13A示出了各组ROS水平检测；图13B示出了各组NO水平检测；图13C示出了各组细胞凋亡情况检测；图13D、图13E、图13F分别是ROS荧光强度、NO荧光强度、细胞凋亡情况的统计图；(*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001)。
图14是载迷迭香酸纳米微粒改善IRI-AKI小鼠肾功能图，其中图14A示出了造模给药流程图；图14B示出了实验终点各组血肌酐值，AKI小鼠明显升高，给药处理后逐渐下降，S-G-R组下降最明显；图14C示出了实验终点各组尿素氮值，AKI小鼠明显升高，给药处理后逐渐下降，S-G-R组下降最明显；图14D示出了实验终点各组尿酸值，AKI小鼠明显升高，给药处理后逐渐下降，三组之间无统计学差异；图14E示出了实验终点各组谷丙转氨酶值，AKI小鼠较Sham组有所升高，给药治疗后无明显改变；图14F示出了实验终点各组谷草转氨酶值，AKI小鼠较Sham组小鼠有升高，给药处理后逐渐下降，但三组之间无统计学差异；图14G示出了HE染色下各组肾小管坏死评分；图14H示出了实验终点各组小鼠肾组织HE染色，Sham组小鼠肾组织形态基本正常，AKI小鼠肾组织肾小管上皮细胞肿胀甚至脱落、刷状缘消失，出现管型；给药处理后，肾组织逐渐修复，S-G-R组恢复最接近正常形态；(*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001；红色箭头：刷状缘，黑色三角：管型；OSOM及ISOM：200×，Magnify：1000×)。
图15是载药纳米微粒治疗后肾脏电镜、氧化应激、炎症指标变化图，其中图15A示出了Sham小鼠肾组织超微结果基本正常，AKI小鼠肾组织电镜下肾小管上皮细胞出现空泡、甚至坏死脱落，刷状缘(红色箭头)消失、线粒体(蓝色箭头)肿胀、线粒体嵴破裂改变；治疗后形态逐渐恢复正常；图15B示出了免疫组化染色4-HNE表达(200×)及TUNEL染色观察细胞凋亡情况(蓝色：DAPI、细胞核，红色：TUNEL、凋亡细胞，200×)，AKI小鼠肾组织4-HNE表达增高、凋亡细胞数目增多，治疗后4-HNE水平逐渐下降、凋亡细胞数目逐渐减少，S-G-R治疗组效果最明显；图15C示出了肾脏组织SOD水平变化；图15D示出了肾脏组织MDA水平变化；图15E示出了肾脏组织IL-6水平变化；图15F示出了肾脏组织TNF-α水平变化；(*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001)。
具体实施方式
为了能够更清楚地理解本发明的上述目的、特征和优点，下面结合附图和具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述。需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
本实施例中实验所用设备、试剂、实验动物和细胞株等均可在现有实验条件下获得，均可以进行使用，未涉及讲明之处，均适用于现有技术。
阳离子聚合物类载体是由聚合反应得到的表面带有大量正电荷的聚合物，其电荷密度高于脂质体类载体，其末端修饰基团中含有大量的氢离子。人工合成的阳离子聚合物主要包括：聚赖氨酸(poly-(L-lysine)，PLL)、聚乙烯亚胺(polyethyleneimine，PEI)、树枝状聚合物聚酰胺－胺(PAMAM)，PAMAM是一类结构髙度可控的树枝状聚合物，内到外分为三个部分，即中心核心、重复单元和表面功能，其中，重复单元重复一次代表一个代数(generation，G)，其具有结构独特、纳米尺寸可控、化学结构稳定且表面易于修饰等特点，可作为药物、基因和疫苗的载体，用于药物持续和靶向释放。
实施例1
本实施例提供了一种载迷迭香酸纳米微粒在制备具有肾脏靶向功能的药物方面的应用，其中载迷迭香酸纳米微粒以聚酰胺－胺(poly-amidoamine，PAMAM)作为载体，具体的，聚酰胺－胺(PAMAM)为第四代聚酰胺－胺(G4-PAMAM)，是树枝状聚合物。
其中载迷迭香酸纳米微粒中迷迭香酸的载药量为20～30％，具体例如为24％；进一步的，载迷迭香酸纳米微粒的粒径大小在100nm以下，具体例如为60nm～90nm。
具体的，本实施例中的应用包括载迷迭香酸纳米微粒在体外保护HK-2细胞、减轻H2O2诱导的氧化应激损伤，具有抗氧化作用。
本实施例中的应用还包括载迷迭香酸纳米微粒在体内改善肾功能、促进受损肾脏修复的作用，具有抗氧化应激、抗炎作用。
本实施例的下述内容中主要具有三部分，如图1所示：
构建具有肾脏靶向功能的载迷迭香酸纳米微(S-G-R载药纳米微粒)，分析其表征特性：载药量、粒径和表面电位、细胞毒性、体内外的细胞摄取能力、体内靶向性及生物安全性。
体外部分：通过细胞活力、细胞凋亡、ROS水平等进行验证RA的不同组别药物(游离RA，未连接丝氨酸的非靶向组纳米微粒：G-R，丝氨酸修饰的靶向组纳米微粒：S-G-R)对氧化应激损伤模型—由过氧化氢(hydrogen peroxide，H2O2)诱导的肾小管上皮细胞损伤的改善作用。
体内部分：在体内探讨游离RA，非肾脏靶向纳米微粒(G-R)和肾脏靶向纳米微粒(S-G-R)对肾脏缺血再灌注损伤诱导的AKI(IRI-AKI)小鼠的肾功能、肾脏病理改变、氧化应激和炎症等指标的影响，证实肾脏靶向纳米微粒S-G-R对AKI的治疗作用。
AKI早期肾小管出现损伤，并且在损伤的肾小管上皮细胞高表达肾损伤分子-1(Kidney injury molecule，Kim-1)，发明人将L-丝氨酸(L-serine，Ser)通过化学键合的方式对纳米载体进行修饰，利用丝氨酸与受损肾小管上皮细胞表达的Kim-1有效结合将药物靶向递送到受损肾小管上皮细胞的机理，设计了可靶向受伤肾脏递送RA的纳米微粒(Ser-G4-PAMAM-RA，S-G-R)，并进一步通过体内、外实验评估S-G-R的功能和治疗效果。
具有肾脏靶向功能的载迷迭香酸纳米微粒的构建与表征
实验方法
1)载迷迭香酸纳米微粒的制备和表征检测
1.1)Boc-Ser(tBu)-NHS的合成(如图2A所示)
(1)将Boc-Ser(tBu)-OH·DCHA(L-丝氨酸，700mg,1.5mmol，；来源：合肥Popchem公司)悬浮在乙酸乙酯中并与柠檬酸水溶液(1M)混匀，将有机层用蒸馏水洗涤3次。
(2)分离有机层并通过旋转蒸发器在减压条件下蒸发溶剂以获得Boc-Ser(tBu)-OH，然后将其溶解在5mL二氯甲烷中并将N-(3-二甲基氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl,382mg,2mmol)和N-羟基磺基琥珀酰亚胺钠盐(NHS,230mg,2mmol)添加到该溶液中，室温搅拌4小时。
(3)将(2)中得到的混合物分别用饱和NaHCO3水溶液(3×50mL)、饱和NaCL水溶液(3×50mL)和去离子水(3×50mL)洗涤，有机层用Na2SO4干燥并通过旋转蒸发器在减压条件下蒸发溶剂以获得Boc-Ser(tBu)-NHS白色粉末(产率65％)。
(4)检测Boc-Ser(tBu)-NHS的核磁共振氢谱(1HNMR)，如图3A所示。
1.2)Boc-Ser(tBu)-PEG2K-COOH的合成(图2B)
(1)将NH2-PEG2K-COOH(100mg,0.05mmol)和Boc-Ser(tBu)-NHS(36mg,0.10mmol)溶解在10mL二氯甲烷中，加入三乙胺搅拌24小时。
(2)然后将混合物浓缩，在乙醚/甲醇(9:1，v/v)中沉淀三次，得到Boc-Ser(tBu)-PEG2K-COOH(产率95％)。
(3)检测Boc-Ser(tBu)-PEG2K-COOH的1H NMR，显示在图3B中。
1.3)Ser-PEG2K-G4-PAMAM-RA-COOH(S-G-R)的合成
(1)将Boc-Ser(tBu)-PEG2K-COOH(140mg,10eqv)溶解在1.5mL DMSO中，加入EDC·HCl(20mg,15eqv)和NHS(12mg,15eqv)并在室温下搅拌30分钟。
(2)然后在上述溶液中加入G4-PAMAM(100mg，7μmol，来源：山东威海CYD聚合物技术有限公司)，加入三乙胺在冰浴条件下搅拌10分钟，后室温搅拌24小时。随后，将混合物浓缩并通过Sephadex LH-20凝胶柱纯化以获得Boc-Ser(tBu)-PEG2K-G4-PAMAM(产率90％)。
(3)将迷迭香酸(RA,31mg,90eqv)、N,N'-二异丙基碳二亚胺(DIC,23mg,180eqv)和1-羟基苯并三唑水合物(HOBt,17mg,180eqv)溶解在2mL DMF中并在0℃下搅拌30分钟。
(4)然后将Boc-Ser(tBu)-PEG2K-G4-PAMAM(25mg)溶解在1mL DMSO中，并添加到(3)的溶液中，室温下搅拌24小时，得到Boc-Ser(tBu)-PEG2K-G4-PAMAM-RA(图2D)。
(5)随后向上述(4)的混合物中加入过量的琥珀酸酐，反应24小时。然后将混合物浓缩并溶解在TFA/水(8:2,v/v)中，在室温下搅拌2小时。
(6)最后，将(5)中的混合物通过Sephadex LH-20柱浓缩纯化，得到产物Ser-PEG2K-G4-PAMAM-RA-COOH(S-G-R)(图2E)。
(7)检测(6)中产物的1H NMR，并显示在图3C中。
1.4)Ser-PEG2K-G4-PAMAM-RA-COOH-RB(S-G-R-RB)的合成
(1)将Boc-Ser(tBu)-PEG2K-G4-PAMAM-RA溶解在甲醇中，加入罗丹明B异硫氰酸酯(RBITC)并在室温下搅拌48小时。
(2)然后，向上述(1)混合物中加入过量的琥珀酸酐，反应24小时。随后将混合物浓缩并溶解在TFA/水(8:2,v/v)中，室温下搅拌2小时。
(3)后将(2)中混合物用去离子水(MWCO＝3500Da)透析72小时，冷冻干燥得到罗丹明B标记的Ser(tBu)-PEG2K-G4-PAMAM-RA-COOH-RB(S-G-R-RB)。
1.5)m-PEG2K-G4-PAMAM-RA-COOH(G-R)的合成
(1)将N,N'-羰基二咪唑(CDI，0.2g,1mmol)用5mL二氯甲烷溶解。然后，在搅拌下将溶解在5mL二氯甲烷中的m-PEG2K-OH(1g，0.5mmol)滴加到上述CDI溶液中。将反应在室温搅拌24小时，浓缩溶剂后，在乙醚/甲醇(9:1，v/v)中沉淀三次，得到m-PEG2K-CDI。
(2)将m-PEG2K-CDI(140mg,10eqv)、G4-PAMAM(100mg,7μmol)和三乙胺溶解在1.5mLDMSO中并在室温下搅拌24小时。随后，将混合物浓缩并通过Sephadex LH-20凝胶柱纯化以获得m-PEG2K-G4-PAMAM(产率93％)。
(3)将RA(31mg,90eqv)、DIC(23mg,180eqv)和HOBt(17mg,180eqv)溶解在2mL DMF中，并在0℃条件下搅拌30分钟。
(4)然后将m-PEG2K-G4-PAMAM(25mg)溶解在1mL DMSO中并加入(3)的RA溶液中，在室温下继续搅拌24小时。
(5)随后向上述混合物中加入过量的琥珀酸酐反应24小时，该混合物通过Sephadex LH-20凝胶柱浓缩和纯化得到m-PEG2K-G4-PAMAM-RA-COOH(G-R)(产率76％)。
1.6)m-PEG2K-G4-PAMAM-RA-COOH-RB的合成
(1)将m-PEG2K-G4-PAMAM-RA-COOH溶解在甲醇中，加入罗丹明B异硫氰酸酯，并在室温下搅拌48小时。
(2)然后，向上述(1)中混合物中加入过量的琥珀酸酐，反应24小时。最后，将混合物用去离子水(MWCO＝3500Da)透析72小时，然后冷冻干燥，得到罗丹明B标记的微粒m-PEG2K-G4-PAMAM-RA-COOH-RB(G-R-RB)。
1.7)RA载药量的检测
在DMSO中使用紫外-可见(UV/Vis)分光光度计在334nm处单独测量RA的浓度。标准RA的比率曲线是根据其在紫外-可见光谱中334nm处不同浓度的吸收得到的。然后通过在紫外可见光谱中检测它们在334nm处的吸收来直接计算纳米颗粒中RA的负载量，RA的载药量(Drug Loading,DL)按以下公式计算：
载药量＝(负载RA的质量/RA-NPs的质量)×100％。
1.8)载药纳米微粒的粒径和电位
检测载药纳米粒的粒径和电位的实验方法，以S-G-R为例来描述。
(1)将10mg Ser-PEG2K-G4-PAMAM-RA-COOH溶解在NaOH(pH＝12)溶液中，并在添加稀HCl后调节至pH＝7。使用3000Da分子量超滤管通过三个循环的超速离心去除盐。
(2)向胶束溶液中加入蒸馏水以将聚合物浓度调节至1.0mg/mL。
(3)检测S-G-R-NPs的流体动力学尺寸和表面电位。
(4)使用透射电子显微镜(transmission electron microscope，TEM)拍摄电镜图片。
1.9)纳米微粒细胞毒性检测
为评估G-R和S-G-R纳米微粒在体外对人肾小管上皮细胞HK-2的细胞毒性，进行CCK8实验。每组3个复孔，独立重复3次。
(1)96孔板接种HK-2细胞，0.8×104/孔，双抗生素10％FBS完全培养基中，生长24小时。
(2)去除旧培养基，分别加入对应RA浓度为0、10、20、30、40μM的RA、G-R和S-G-R及新鲜培养基共200μL，空白组仅含新鲜培养基，对照组含HK-2细胞和DMEM/F12培养基。
(3)孵育24小时(培养条件：37℃，5％CO2)。
(4)孵育24小时后去除旧培养基，每孔加入100μL(含有10μL CCK8)新鲜无血清DMEM/F12培养基，继续孵育2小时。
(5)空白孔调零，检测450nm吸光度值(optical density，OD值)。细胞活力的计算方法：
细胞存活率(％)＝(实验组OD值/对照组OD值)×100％。
2)体外验证载迷迭香酸纳米微粒的细胞摄取能力
为证实S-G-R可以通过丝氨酸与受伤的细胞表面Kim-1特殊识别作用介导S-G-R的细胞靶向摄取，首先利用H2O2刺激HK-2细胞构建氧化应激致细胞损伤模型，并使用Westernblotting方法和细胞免疫荧光方法验证Kim-1表达情况，后续采用细胞免疫荧光方法和流式细胞学方法进行细胞摄取功能检测。
2.1)氧化应激致细胞损伤模型构建
(1)在96孔板接种HK-2细胞(0.8×104/孔)，生长24小时；
(2)去除旧培养基，分别加入含有不同浓度H2O2的新鲜培养基200μL。
(3)空白组和对照组的设置及后续采用CCK8方法检测细胞存活率方法如实验方法1.9)所述。
2.2)Western blotting试验检测Kim-1表达：
(1)6孔板中接种HK-2细胞(2×105/孔)，生长24小时；
(2)弃去旧培养基，PBS轻洗细胞，加入2mL含有500μM H2O2的无血清培养基孵育，对照组不接受H2O2刺激。
(3)细胞总蛋白提取：
在H2O2孵育细胞12小时和24小时后提取细胞总蛋白，过程如下：弃去旧培养基，用PBS轻洗一次，尽量将PBS吸干净；每孔分别加入RIPA(80μL)和PMSF(0.8μL，使得终浓度为1mM)；使用细胞刮轻轻地刮数下，使RIPA与HK2细胞充分接触，裂解15分钟及30分钟再次使用细胞刮轻刮孔板底部数下，30分钟刮完细胞后，收集细胞裂解液至EP管中，以上操作均在冰上进行；后离心30分钟，离心条件：4℃，12,000×g。离心后小心吸取上清至新的EP管中，上清内含有细胞总蛋白，注意不要吸到管底沉淀。
(4)蛋白浓度测定：
蛋白浓度测定使用商业化试剂盒(BCA-100蛋白定量试剂盒)(96孔板法)，按照步骤进行，具体可参照BCA-100蛋白定量试剂盒的操作手册。
(5)蛋白样品制备及变性：
为保证每孔上样的蛋白量(25μg)和体积相同(20μL)，在EP管(0.2mL规格)中分别加入：待测蛋白样品(总量25μg，根据浓度计算体积)，不足16μL的利用RIPA(含1％PMSF)补齐体积至16μL,然后加入(5×loading buffer)至总体积20μL。混合均匀后瞬离，放于100℃水浴锅中反应10分钟，取出后冷却至室温，瞬离，直接上样或放-80℃保存备用。
(6)制胶：根据雅酶快速胶制备方法制备上层胶和下层胶。
(7)上样：加入电泳液，小心将梳子拔出，从右往左依次加入20μL上述变性蛋白样品，在相应的泳道中加入5μL预染蛋白maker，尽可能使上样的泳道居中放置。
(8)电泳：接通电源，注意正负极对应：红色—正极，黑色—负极。90V恒压条件电泳，预染蛋白marker分离后，改用120V恒压继续电泳，待溴酚蓝至下层胶底部，停止。
(9)电转：电泳停止后将玻璃板取出，从玻璃板中轻轻取下凝胶，以免损伤凝胶；将海绵垫、滤纸、凝胶和PVDF膜(已剪去右上角做为标记，并置于甲醇中活化)按照设定好的顺序置放于电转夹上，操作过程中避免气泡存留在凝胶和PVDF膜中间，夹紧电转夹；后将电转夹放入电转槽中(电转槽置于冰盒中)，加入电转液，注意正负极相对应，低温条件下230mA恒流电转90分钟。
(10)封闭：转膜完成后，轻轻取出PVDF膜，置于配置的5％BSA封闭缓冲液中，室温慢摇封闭2小时。
(11)孵育一抗：抗体稀释液稀释一抗(Kmi-1：1:1000稀释，β-actin：1:1000稀释)，根据目的蛋白分子量的大小，按照marker位置切膜，孵育相应的一抗，4℃条件下摇床(慢速)过夜。
(12)孵育二抗：一抗封闭结束后，TBST洗膜3次，每次10分钟；置于已对应的二抗(1:1000稀释)中，室温摇床孵育(慢摇)2小时。取出条带后，TBST洗膜3次，每次10分钟。
(13)曝光：将发光液按照说明书配好，并均匀涂在PVDF模上，将条带置于曝光机中，按照机器操作曝光条带，观察条带。
(14)结果分析：曝光后的条带，通过Image J软件进行灰度分析。目的蛋白定量值通过β-actin条带的灰度值进行归一化。
2.3)细胞免疫荧光试验检测Kim-1表达
(1)共聚焦皿接种HK-2细胞(2×105/孔)，生长24小时；
(2)弃去旧培养基，PBS轻洗细胞，加入2mL含有500μM H2O2的无血清培养基孵育24小时，对照组不接受H2O2刺激；
(3)固定、破膜：24小时后，弃去旧培养基，PBS轻洗三次，每孔加入500μL 4％多聚甲醛室温固定10分钟；PBS轻洗，1％Triton破膜10分钟。
(4)封闭：PBS轻洗3次；每孔加入200μL的5％BSA封闭液，室温下慢摇封闭1小时。
(5)孵育一抗：去除封闭液，按照说明书加入稀释好的Kim-1抗体，4℃条件下孵育过夜。
(7)孵育二抗：去除一抗，PBST轻洗3次；加入Alexa
Figure BDA0003672883750000101
488荧光标记二抗，室温避光孵育1小时。
(8)染核：DAPI工作液染核10分钟。
(9)PBS轻洗2次，加入防淬灭甘油，观察、拍照。
2.4)流式细胞学检测细胞摄取能力
具体检测方法适用于现有技术。
2.5)细胞免疫荧光检测细胞摄取能力
具体检测方式适用于现有技术。
3)体内验证载迷迭香酸纳米微粒的靶向性和生物安全性
为证实S-G-R在体内的靶向作用，同时验证其生物安全性，首先构建肾缺血再灌注(ischemia reperfusion)AKI模型(IRI-AKI)，Sham组做对照；通过尾静脉注射方法注射罗丹明B标记的纳米微粒(G-R-RB和S-G-R-RB)，一定时间点安乐死小鼠，收集血液检测肝肾功能证实生物安全性，重要脏器行小动物荧光成像仪观察纳米微粒体内分布情况，肾脏行冰冻切片观察肾近端小管细胞内荧光情况，并行肾脏组织Kim-1染色证实S-G-R-RB被肾小管上皮细胞的摄取情况。
3.1)IRI-AKI模型构建
本实验随机选取48只健康的8周雄性C57BL/6小鼠(SPF级)，体重20-25g，48只小鼠随机分为4组：(1)Sham+G-R-RB组，(2)Sham+S-G-R-RB组，(3)IRI-AKI+G-R-RB组，(4)IRI-AKI+S-G-R-RB组；每组12只小鼠。IRI-AKI模型通过已报道的方法进行肾脏IRI-AKI模型建立，具体方法简述如下：
(1)小鼠称重后，使用1％戊巴比妥钠麻醉小鼠，剔除手术部位被毛，并固定于操作台上进行消毒。
(2)采取小鼠两侧背部做手术切口，暴露双侧肾脏组织，钝性分离双侧肾蒂，利用无创微型动脉夹同时夹闭双侧肾蒂，可观察到两侧肾脏的颜色逐渐由红变黑，35min后移除双侧微型动脉夹，观察到肾脏血流恢复后颜色由黑色逐渐恢复，造模成功。
(3)将肾脏回纳后，逐层缝合手术切口。手术过程中及术后注意保暖，维持小鼠体温。
(4)假手术组的小鼠采取假手术术式，小鼠麻醉后、背部手术切口、手术钝性分离双侧肾蒂，不夹闭双侧肾蒂，一定时间后逐层缝合手术切口。
3.2)重要组织器官荧光成像显示体内分布情况
(1)小鼠手术切口缝合后，通过尾静脉注射将G-R-RB和S-G-R-RB(按照RA 2mg/kg的量)分别注射到小鼠体内。
(2)在注射药物4小时、12小时、24小时和48小时后，分别麻醉小鼠后，采用眼眶采血方法留取血液标本；安乐死小鼠后，将小鼠重要脏器：心脏、肝脏、脾脏、肺、双侧肾脏剥离出来，行荧光成像检查各组织内荧光强度，采用Spectral instruments imaging软件分析数据。
3.3)观察纳米微粒在肾脏组织分布情况及靶向作用
为观察纳米微粒在肾脏组织局部的分布情况，荧光成像后发明人收集肾脏组织行冰冻切片(所有时间点小鼠肾脏组织)观察罗丹明分布情况，后将4小时肾组织切片，染色Kim-1并同时观察罗丹明荧光强度了解S-G-R-RB的靶向作用，具体步骤如下：
(1)肾脏组织观察罗丹明分布情况(所有时间点小鼠组织)：
①荧光成像后，将小鼠肾组织放液氮中备用，并尽快包埋后行冰冻切片；
②冰冻切片取出，室温干燥，组化油笔将组织圈好，浸泡在PBS中10分钟，去除OCT；用冷丙酮4℃固定10分钟；
③染核：PBST轻洗，加入DAPI工作液体染核10分钟，PBST轻洗，加入防淬灭甘油，观察、拍照(蓝色-细胞核，红色-罗丹明B)。
(2)肾脏组织染色了解S-G-R-RB的靶向作用：
①同上述3.3(1)中步骤处理冰冻切片；
②封闭：用含5％BSA室温封闭切片1小时，过程注意避光；
③孵育一抗：加入Kim-1抗体，4℃孵育过夜，注意避光；
④孵育二抗：PBST轻洗，加入Alexa
Figure BDA0003672883750000111
488荧光二抗，室温避光孵育1小时；
⑤染核：PBST轻洗，加入DAPI工作液体染核10分钟，PBST轻洗，加入防淬灭甘油封片，荧光显微镜下观察、拍照(绿色：Kim-1，红色：罗丹明B，蓝色：细胞核)。
3.4)纳米微粒体内生物安全性检测
每只小鼠眼眶采血后，将约500μL的血液储存在1.5mL的EP管中，4℃冰箱静置过夜。第二天，取出后3000rpm，离心10分钟，离心后取上清，尽可能吸取血清，置于冰上。血清ALT、AST使用全自动生化仪(日立3100)检测，Scr、BUN按照按照南京建成公司试剂说明书进行检测，肌酐检测方法和尿素氮检测方法均适用于现有技术。
实验结果
1)载迷迭香酸纳米微粒的制备和表征检测
1.1)载迷迭香酸纳米微粒(S-G-R)合成的流程：
按照上述方法合成载迷迭香酸纳米微粒(以S-G-R合成为例)，流程图如图2所示。
1.2)载药纳米微粒合成过程中的1H NMR检测：
按照上述方法合成载迷迭香酸纳米微粒(以S-G-R合成为例)，1H NMR如图3所示。
1.3)载药纳米微粒载药量：
使用分光光度计在334nm处单独测量RA的浓度(图3D)，根据公式得出G-R和S-G-R中RA的载药量均为24％。
1.4)载药纳米微粒粒径和电位：
如图4C所示，电镜下S-G-R和G-R呈现小球形、颗粒结构，大小较均匀，表面光滑，粒径分别约为63和68nm。用Zeta电位粒径仪器检测其粒径分别约为83nm和88nm(图4A)；粒径小于100nm的粒子可以滤过受损的肾小球基底膜，到达肾小管管腔，被小管上皮细胞所摄取。
电位结果显示，G-R和S-G-R具有微弱的正电性，表面电位约为+(4±0.7)mV(图4B)，这种弱正电荷有利于纳米颗粒与细胞表面的结合及内吞，同时对细胞毒性较小。
1.5)载药纳米微粒细胞毒性检测：
体外实验发现RA在40μM浓度下对肾小管上皮细胞(HK2细胞株)活力没有影响，且能够减轻镉离子对HK-2细胞的毒性。合成的载迷迭香酸纳米微粒(G-R、S-G-R)在RA浓度为10μM、20μM、30μM、40μM下对HK-2细胞活力基本没有影响(图4D)，RA浓度40μM时S-G-R和G-R组HK-2细胞活力分别为(96.5±0.62)％和(96.81±1.27)％。2)体外验证载迷迭香酸纳米微粒的细胞摄取能力
2.1)氧化应激致细胞损伤模型构建
为进一步评估载迷迭香酸纳米微粒的细胞摄取情况，发明人首先利用H2O2构建模拟氧化应激损伤的细胞模型，体外用不同浓度H2O2刺激HK-2细胞24小时，500μM浓度刺激24小时后细胞活力为(51.95±0.53)％(图5A)，选择此浓度为后续实验浓度。然后，发明人利用Western blotting方法和细胞免疫荧光方法检测细胞Kim-1分子表达，验证细胞模型构建是否成功。如图5B和C所示，H2O2刺激HK-2细胞12小时和24小时后，Kim-1表达明显升高，在24小时时表达量升高至对照组的(294.92±3.73)％(P<0.001)。细胞免疫荧光进一步证实Kim-1分子的表达，Kim-1是一种跨膜糖蛋白，如图5D所示在H2O2刺激HK-2细胞后在细胞膜及胞内均可看到绿色荧光，而对照组无荧光，提示Kim-1表达升高。
2.2)载药纳米微粒细胞摄取能力检测
发明人进一步采用细胞免疫荧光及流式细胞学方法验证载药纳米微粒的细胞摄取能力，首先发明人利用罗丹明B对载药纳米微粒进行荧光标记，合成非靶向组(G-R-RB)和丝氨酸靶向组(S-G-R-RB)包载罗丹明B的纳米微粒，将其与H2O2刺激后的细胞一起孵育，如图6A所示：免疫荧光观察到两组Kim-1表达均升高，靶向组罗丹明B的红色荧光强于非靶向组。流式细胞学方法同样证实这一结果，如图6B、C所示，靶向组红色荧光强度较非靶向组明显增强，是非靶向组的(1.85±0.14)倍(P<0.01)。提示丝氨酸靶向组纳米微粒细胞摄取能力较非靶向组强，这与丝氨酸和Kim-1的特殊作用介导纳米细胞内吞有关。
3)体内载迷迭香酸纳米微粒的分布、靶向性及生物安全性
3.1)纳米微粒体内分布
为验证载药纳米微粒在体内的分布情况，发明人首先构建IRI-AKI小鼠模型，和罗丹明B标记的载药纳米微粒。给药处理后，不同时间点解剖小鼠主要脏器行荧光成像观察体内分布情况。结果如图7A-7B所示：给药4小时后，IRI-AKI小鼠组，尾静脉注射S-G-R-RB后肾脏荧光明显增高，高于G-R-RB组，分别为(22±1.23)counts/108和(12.47±0.15)counts/108(P<0.0001)；Sham组的肾脏也可检测到荧光，G-R-RB和S-G-R-RB组肾脏组织的荧光强度分别为(5.84±0.15)counts/108和(9.19±0.76)counts/108(P<0.05)。随着时间延长，Sham组小鼠荧光淬灭较快，24小时的荧光强度极弱，48小时几乎检测不到荧光。而在IRI-AKI小鼠组，S-G-R-RB处理后在24小时荧光强度仍较高为(10.11±1.75)counts/108；48小时，IRI-AKI小鼠S-G-R-RB的荧光强度值为(8.08±0.65)counts/108，明显强于G-R组(4.33±0.15)counts/108(P<0.001)，也明显强于Sham组小鼠中的S-G-R-RB组(1.97±0.4)counts/108(P<0.0001)。提示丝氨酸靶向组肾脏局部的荧光持续时间长，有效药物作用浓度高，在肾脏具有良好的靶向作用，可增加药物的治疗效果。如图7A和7C所示，S-G-R-RB给药后，在4小时的IRI-AKI组，心脏、脾脏荧光强度几乎检测不到，肺部荧光强度弱；因为肝脏体积较大、荧光强度值总和较高，但平均荧光强度低于肾脏；且非靶向组被肝脏摄取明显多于靶向组(如图7A所示)。
3.2)纳米微粒肾脏局部分布：
为进一步了解载药纳米微粒在肾脏局部分布情况，主要脏器行荧光成像后，收集肾脏行冰冻切片，观察罗丹明B荧光信号。如图8A-B所示，不同时间点荧光强度值趋势同图7基本相同，在AKI小鼠中，4小时时S-G-R-RB组荧光强度最强，高于G-R-RB组；48小时S-G-R-RB组红色荧光仍较强，明显高于其他组。在Sham小鼠中，两组荧光24小时后荧光强度非常微弱，48小时检测不到荧光。体内分布研究表明，S-G-R-RB在IRI-AKI肾脏中具有最佳的肾脏靶向能力和最长的保留时间。
3.3)丝氨酸介导的体内靶向性检测
为了更直观研究纳米微粒是否可被肾小管上皮摄取及S-G-R-RB组的肾小管靶向能力，发明人收集了静脉注射纳米微粒后4小时的肾脏切片，并做Kim-1染色，观察小管上皮细胞中纳米微粒摄取情况。如图9所示，AKI模型中，Kim-1早期表达即升高；S-G-R-RB及G-R-RB的红色荧光信号主要位于肾小管，与Kim-1表达区域相吻合；且靶向组的罗丹明B的红色荧光强度明显高于非靶向组，表明S-G-R-RB被肾小管上皮细胞摄取更多、具有优异的肾小管靶向能力；S-G-R-RB在肾小管中的积累表明S-G是有效的用于AKI治疗的药物载体，可将RA靶向输送至肾小管上皮细胞。
3.4)纳米微粒体内生物安全性检测
为验证纳米微粒在体内的生物安全性，行重要器官的离体荧光成像前，采集Sham组小鼠血液检测肝、肾功能，未接受药物注射的Sham小鼠作为对照。结果如图10所示：G-R-RB和S-G-R-RB给药后，随着时间变化，Sham组小鼠Scr、BUN水平正常，较对照无明显升高；Sham组小鼠ALT、AST结果无明显改变；结果提示纳米微粒体内生物安全性好，无明显急性肝肾毒性。
综上所述，通过多种方法对具有肾脏靶向功能的载RA纳米微粒(S-G-R)进行表征，呈光滑的小颗粒状，分布均匀；其粒径小、表面带微正电，对细胞无明显毒性、体内对小鼠肝肾功能无明显影响，生物安全性好；体外检测示靶向组细胞摄取能力强于非靶向组，体内结果提示靶向组能够被肾小管上皮细胞内吞，具有良好的肾小管上皮细胞的靶向性，并可在肾脏中积累、停留较长时间，提示其有可能达到较好的治疗效果。载迷迭香酸纳米微粒对H2O2诱导HK-2细胞氧化应激损伤的保护作用
实验方法
1)细胞活力检测
为评估RA、G-R和S-G-R在体外改善H2O2对HK-2细胞的损伤，进行CCK8实验。每组3个复孔，独立重复3次。
(1)HK-2细胞接种在96孔板，0.8×104/孔，双抗生素10％FBS完全培养基，生长24小时。
(2)去除旧培养基，加入含有40μM RA的RA、G-R和S-G-R的新鲜培养基200μL刺激1小时后，再加入H2O2(终浓度为500μM)继续孵育24小时。对照组只含有培养基，H2O2组不使用药物预刺激。
(3)余步骤同1.9)纳米微粒细胞毒性检测。
2)Western blotting实验
为评估H2O2对HK-2细胞的损伤，检测HO-1蛋白表达情况，独立重复3次：
(1)HK-2细胞接种在6孔板，2×105/孔，双抗生素10％FBS完全培养基中贴壁生长24小时。(2)去除旧培养基，加入含有500μM H2O2分别孵育12小时、24小时。对照组只含有培养基。(3)实验终点提取细胞总蛋白，按照步骤3.22检测HO-1蛋白表达。
为评估RA、G-R和S-G-R在体外改善H2O2对HK-2细胞的氧化应激损伤，进行Westernblotting实验，独立重复3次：
(1)HK-2细胞接种在6孔板，2×105/孔，双抗生素10％FBS完全培养基中，生长24小时。(2)去除旧培养基，加入含有40μM RA的RA、G-R和S-G-R的新鲜培养基2mL刺激1小时后，再加入H2O2(终浓度为500μM)继续孵育24小时。对照组只含有培养基，H2O2组不使用药物预刺激。(3)实验终点提取细胞总蛋白，按照步骤3.22检测HO-1蛋白表达。
3)细胞内活性氧水平检测(荧光显微镜法、流式细胞学方法)
为评估RA、G-R和S-G-R降低H2O2引起的ROS水平，使用ROS检测试剂盒(DCFH-DA探针)检测细胞内ROS。
荧光显微镜方法检测细胞ROS水平的检测方法适用于现有技术。
流式细胞学方法检测细胞ROS水平的检测方法适用于现有技术。
4)细胞内一氧化氮水平检测(荧光显微镜法、流式细胞学方法)
为评估RA、G-R和S-G-R降低H2O2引起的NO(RNS)水平，使用NO检测试剂盒(DAF-FMDA探针)检测细胞内NO。
荧光显微镜方法检测细胞NO水平的检测方法适用于现有技术。
流式细胞学方法检测细胞NO水平的检测方法适用于现有技术。
5)线粒体膜电位检测(荧光显微镜法)
为评估RA、G-R和S-G-R改善H2O2引起的线粒体损伤，可通过JC-1方法检测线粒体膜电位改变。
6)细胞凋亡检测(流式细胞学法)
为评估RA、G-R和S-G-R改善H2O2引起的细胞凋亡，可通过流式细胞学方法，使用FITC-Annexin V/PI试剂盒检测各组细胞凋亡的改变。
实验结果
1)载迷迭香酸纳米微粒体外抗氧化应激和抗凋亡作用
1.1)载迷迭香酸纳米微粒改善H2O2对HK-2细胞的细胞活力影响
为评估RA、G-R和S-G-R在体外改善H2O2对HK-2细胞的损伤，进行CCK8实验。结果如图11A所示，H2O2刺激HK-2细胞24小时后，细胞活力为(59.49±0.56)％；经过RA、G-R和S-G-R预处理后，再给予H2O2刺激，细胞活力较单纯H2O2组明显升高，分别增加至(66.79±1.74)％(P<0.05)、(74.34±1.69)％(P<0.001)、(84.30±1.87)％(P<0.0001)；并且S-G-R组对比RA组和G-R组具有更好的保护作用，差异具有统计学意义(S-G-R vs RA，P<0.001；S-G-R vsG-R，P<0.01)。
1.2)载迷迭香酸纳米微粒对HK-2细胞HO-1蛋白的影响
众所周知，血红素加氧酶-1(HO-1)蛋白具有调节氧化应激、自噬和炎症，并通过直接和间接机制调节细胞周期进程的作用，HO-1可通过分解血红素(一种强效的促氧化剂分子)、产生保护性产物(即一氧化碳、胆绿素等)发挥保护作用。HO-1是一种抗氧化酶，可在高ROS水平下应激性显着上调；如图11B所示，当H2O2刺激后，氧化应激诱导HO-1表达升高，以抵御H2O2的损伤；H2O2刺激12小时后表达量增加至(235.94±28.74)％，相对表达量和对照组相比具有统计学意义(P<0.05)；且24小时后相对表达量增加更明显，至(288.16±33.61)％(P<0.01)。如图11D、E所示，H2O2处理24小时后，与对照组相比，HO-1表达量增加至(429.50±15.93)％(P<0.0001)；当经过RA、G-R和S-G-R处理后，药物的抗氧化能力使得H2O2的氧化应激损伤减弱，对HO-1的诱导表达能力下降；与H2O2组相比，RA处理组相对表达量减至(280.8±15.56)％(P<0.0001)，G-R组相对表达量减至(176.06±12.34)％(P<0.0001)，S-G-R组相对表达量减至(116.41±8.76)％(P<0.0001)。且S-G-R组HO-1下降较G-R组(P<0.05)和RA组(P<0.001)更明显；这些结果证明S-G-R组抗氧化能力最强。
1.3)载迷迭香酸纳米微粒清除ROS、NO及稳定线粒体膜电位的作用
迷迭香酸具有良好的抗氧化能力，可清除活性氧发挥细胞保护作用；为验证RA、G-R、S-G-R对ROS、NO的清除作用，发明人采用细胞免疫荧光，利用ROS(DCFH-DA)、NO(DAF-FMDA)、线粒体膜电位(JC-1)试剂盒进行检测。结果如图12A所示，正常生长状态下HK-2细胞内ROS水平较低，ROS荧光较弱；H2O2刺激后，细胞内ROS水平明显增加，氧化无荧光的DCFH为有荧光的DCF，所以激光共聚焦显微镜下看到细胞内绿色荧光强度显著增加。经过RA、G-R和S-G-R处理后，荧光强度逐渐下降，S-G-R组荧光强度最弱，这一结果表明S-G-R组比其他两组药物具有更好的减少ROS产生、清除ROS的能力。
同ROS一样，活性氮水平(RNS)在AKI肾损伤中也起重要作用；主要的RNS包括一氧化氮(NO)、三氧化二氮(N2O3)、过氧亚硝酸根离子(OONO-)、二氧化氮(NO2)和其他氮氧化物。结果如图12A所示，对照组HK-2细胞内NO水平较低，荧光较弱；H2O2刺激后，细胞内绿色荧光强度显著增加，这说明细胞内细胞内NO水平明显增加，与DAF-FM反应后产生强烈荧光。经过RA、G-R和S-G-R处理后，荧光强度逐渐下降，S-G-R组荧光强度较RA组和G-R组更弱，这一结果表明S-G-R组比其他两组药物具有更好的减少NO产生、清除NO的能力，能更好发挥细胞保护作用。
之后利用JC-1试剂研究线粒体膜电位(MMP)的变化。如图12C所示，正常情况下，细胞MMP较高，JC-1聚集在线粒体的基质，形成聚合物(J-aggregates)，显示红色荧光。细胞与H2O2孵育24小时后，绿色荧光强度增加，表明JC-1呈现为单体(monomer)形式，则红/绿荧光强度比值明显降低，表明H2O2诱导的氧化应激大大降低了HK-2细胞的MMP，经过RA、G-R和S-G-R处理后，HK-2细胞绿光逐渐减弱、红/绿荧光强度比值逐渐增强，恢复接近正常细胞水平。与RA组和G-R组相比，S-G-R的处理可以引起更明显的红/绿荧光强度比值增强，揭示了S-G-R可以通过缓解线粒体中的氧化应激来稳定MMP，起到保护作用。
1.4)流式细胞学检测载迷迭香酸纳米微粒抗氧化应激和抗凋亡作用
为更进一步证实RA、G-R、S-G-R的抗氧化作用和抗凋亡作用，发明人采用细流式细胞学方法，利用ROS(DCFH-DA)荧光探针、NO(DAF-FM DA)荧光探针、细胞凋亡试剂盒进行检测。结果如图13A所示检测胞内ROS水平，H2O2刺激HK-2后，流式细胞学可见峰右移、荧光强度明显增强；经过RA、G-R和S-G-R处理后，荧光强度逐渐下降，峰较H2O2组左移。进一步对荧光值进行定量分析(图13D所示)，结果示H2O2组荧光强度是对照组(Control)的(2.69±0.13)倍；RA、G-R和S-G-R组荧光强度分别是对照组的(1.99±0.05)倍、(1.61±0.05)倍和(1.13±0.02)倍；比单纯H2O2组荧光强度明显减弱，差异均具有统计学意义(单纯H2O2组vs H2O2/S-G-R组、P<0.0001，单纯H2O2组vs H2O2/G-R组、P<0.0001,单纯H2O2组vs RA组、P<0.001)；且S-G-R组荧光强度最弱(G-R组vs S-G-R组、P<0.01,RA组vs S-G-R组、P<0.0001)，这一结果表明S-G-R组清除ROS能力比其他两组药物具强。
如图13B、13E所示，HK-2细胞孵育H2O2后，NO水平明显升高，流式细胞学可见峰右移、荧光强度显著增强；但经过RA、G-R和S-G-R处理后，NO水平逐渐降低、荧光强度逐渐下降，峰左移。进一步发明人对荧光值进行定量分析(图13E所示)，H2O2组荧光强度值是对照组的(2.48±0.01)倍；RA、G-R和S-G-R组处理后，荧光强度分别下降至对照组的(1.47±0.02)倍、(1.22±0.03)倍和(1.11±0.02)倍；差异均具有统计学意义(单纯H2O2组vs H2O2/S-G-R组、P<0.0001,单纯H2O2组vs H2O2/G-R组、P<0.0001,单纯H2O2组vs RA组、P<0.0001)；S-G-R组荧光强度最弱、NO水平最低，清除NO效果最好(G-R组vs S-G-R组、P<0.05,RA组vs S-G-R组、P<0.0001)。
载RA纳米微粒药物的抗凋亡作用如图C、F所示，H2O2作用HK-2细胞24小时后，与对照组凋亡细胞比例(5.53±1.06)％相比，凋亡(早期凋亡+晚期凋亡)细胞比例明显增多至(37.37±1.24)％(P<0.0001)。经过RA处理后，凋亡细胞比例降至(30.71±1.51)％，与单纯H2O2组相比差异具有统计学意义(P<0.05)。G-R和S-G-R处理后，细胞凋亡比例分别减少至(20.92±1.01)％和(14.47±1.06)％，与单纯H2O2组相比差异均具有统计学意义(单纯H2O2组vs H2O2/S-G-R组、P<0.0001,单纯H2O2组vs H2O2/G-R组、P<0.0001)。进一步对比S-G-R与游离RA及G-R的抗凋亡作用发现，S-G-R组的抗凋亡作用最强(RA组vs S-G-R组、P<0.0001,G-R组vs S-G-R组、P<0.05)。
综上所述，通过体外多项功能实验检测，RA能够清除ROS、NO，稳定线粒体膜电位，具有抗氧化应激、抗细胞凋亡作用，可以发挥细胞保护作用；合成的载迷迭香酸纳米微粒(S-G-R)比游离单药(RA)及非靶向药物(G-R)的抗氧化应激作用、抗细胞凋亡作用更强，是具有前景的纳米前药，可用于保护HK-2细胞，减轻H2O2诱导的氧化应激损伤。
载迷迭香酸纳米微粒对IRI-AKI小鼠的肾功能和肾脏损伤的改善作用
实验方法
1)IRI-AKI小鼠模型构建及给药
为评估RA、G-R和S-G-R治疗改善IRI-AKI小鼠肾功能的作用，随机选取30只健康雄性8周C57BL/6小鼠(SPF级)，体重20-25g，30只小鼠随机分为5组：(1)Sham+生理盐水组，(2)IRI-AKI+生理盐水组，(3)IRI-AKI+RA组，(4)IRI-AKI+G-R组，(5)IRI-AKI+S-G-R组，每组6只小鼠。IRI-AKI模型参考前述实验方法。
2)小鼠肾功能及肝功能检测：
每只小鼠眼眶采血后，按照南京建成公司肌酐、尿素氮说明书进行检测，具体方法与前述相同，尿酸、谷丙转氨酶、谷草转氨酶检测使用全自动生化仪(日立3100)检测。
3)小鼠肾脏HE染色：
(1)肾脏组织收集后包埋切片，切好的石蜡切片置于60℃烤箱中烤片，3小时。(2)将烤好的石蜡切片放置至室温，进行脱蜡、复水。石蜡切片依次放入二甲苯中，每次10分钟，共3次，进行脱蜡。(3)再依次置入梯度浓度酒精复水：依次无水乙醇、95％酒精、85％酒精、75％酒精、纯水浸泡各5分钟。(4)苏木素染色3秒，流动自来水冲洗掉10分钟，随即至显微镜下观察染色情况。若染色过深，1％盐酸酒精分化5秒，自来水冲洗10分钟。(5)1％的伊红染液染色3分钟，冲洗10分钟(流动自来水下)。(6)再依次放入75％酒精、85％酒精、95％酒精、无水乙醇浸泡，各3分钟，二甲苯10分钟×3次。(7)石蜡切片通风橱中3h风干，中性树脂进行封片。显微镜下观察及拍摄成像。
4)小鼠肾脏免疫组织化学染色：
(1)脱蜡、复水步骤同上述HE染色步骤。(2)抗原修复：石蜡切片置于100℃的PH＝7.0柠檬酸钠溶液中，微波炉高火15分钟，中高火10分钟，放置室温，PBS溶液冲洗10分钟×3次。(3)灭活过氧化物酶及封闭：将石蜡切片背部用纸巾擦干，阻水笔画圈。每张切片滴加约100uL的灭活过氧化物酶封闭液，室温孵育，PBS溶液冲洗10分钟×3次。(4)一抗孵育：分别滴加50uL兔抗4-HNE抗体，4℃孵育过夜。(5)二抗孵育：石蜡切片放置至室温，回收一抗。PBS溶液冲洗10分钟×3次。分别滴加50uL兔二抗，室温孵育1小时。PBS溶液冲洗10分钟×3次。(6)DAB显色：滴加约50uL的DAB显色液(按照说明书配制)，显微镜下观察染色情况，严格控制染色时间。(7)终止DAB显色：自来水冲洗10分钟。(8)苏木素染色、水化及封片步骤同上HE染色，显微镜下观察及拍摄成像。
5)肾小管损伤半定量评分
在HE染色切片中，肾小管损伤评分以0到5分进行半定量评分，根据肾小管坏死和/或细胞凋亡、刷状缘缺失、透明管型、脱落细胞和肾小管扩张影响占外髓质区域的百分比来计算：0＝正常组织学，1＝<10％，2＝10％–25％，3＝26％–50％，4＝51％–75％，5＝>75％。
6)肾脏组织电镜超微结构
(1)取材固定：解剖肾脏后，取肾脏皮质切割成1mm3的小组织块，转移至装有新电镜固定液的EP管内固定，4℃固定保存及运输。(2)用PBS漂洗3次，每次15分钟。(3)后固定：PBS配制的1％锇酸避光室温固定2小时。PBS漂洗3次，每次15分钟。(4)室温脱水：组织依次入30％-50％-70％-80％-95％-100％-100％酒精，行脱水每次20分钟，100％丙酮两次，每次15分钟。(5)渗透包埋：丙酮:包埋剂(812)＝1:1，37℃温度小时；丙酮:包埋剂(812)＝1:2，37℃渗透过夜，纯包埋剂(812)37℃温育6小时。将纯包埋剂(812)倒入包埋板，插入样品到包埋板中37℃烤箱过夜。(6)聚合：包埋板置于60℃烤箱，聚合48小时。(7)超薄切片：利用超薄切片机将树脂块行60-80nm超薄切片，使用150目方华膜铜网捞片。(8)染色：铜网于2％醋酸铀饱和酒精溶液避光染色8分钟；70％酒精、超纯水依次清洗3次。2.6％枸橼酸铅溶液避二氧化碳染色8分钟；超纯水清洗3次，滤纸稍吸干。铜网切片放入铜网盒内室温干燥过夜。(9)透射电子显微镜下观察，采集图像分析。
7)肾脏组织TUNEL染色
(1)切片处理：
(2)TdT酶连反应
(3)DNA染色
(4)图片获取及结果分析：立刻在荧光显微镜下拍摄图像。
8)肾脏组织匀浆制备：
9)肾脏组织氧化应激指标检测：
丙二醛(MDA)检测和总超氧歧化酶(T-SOD)检测的具体方法适用于现有技术。
10)肾脏组织炎症指标检测：
肾脏组织IL-6检测和肾脏组织TNF-α检测的具体你方法适用于现有技术。
实验结果
1)载迷迭香酸纳米微粒在体内改善肾功能
为研究载迷迭香酸纳米微粒在IRI-AKI小鼠体内作用，首先构建IRI-AKI模型，再灌注后及再灌注24小时后通过尾静脉给予不同组别药物(如图14A所示给药流程)。再灌注48小时后，安乐死小鼠，收集肾脏和外周血行相关检查。结果如图14B-14C所示，IRI-AKI模型Scr值增加至(109.36±4.59)μmol/L，较Sham组(25.28±1.90)μmol/L明显升高，差异具有统计学意义(P<0.0001)；IRI-AKI组BUN值为(33.34±1.93)mmol/L，Sham组BUN值为(9.26±0.25)mmol/L，AKI组较Sham组明显增高。并且发明人通过HE染色观察肾脏病理改变进一步发现(图14H)，Sham组小鼠肾组织呈现基本正常的组织型态，而IRI-AKI小鼠肾组织发生了多灶状、片状损伤：肾小管上皮细胞肿胀，刷状缘消失，部分管腔上皮细胞脱落，出现透明管型；肾小管坏死评分达(4.07±0.1)(图14G)。以上结果提示IRI-AKI模型造模成功。而经过RA、G-R和S-G-R治疗后，Scr水平和BUN水平较IRI-AKI组均有不同程度的回落，差异具有统计学意义(图14B-C)；且与接受RA治疗组及G-R治疗组相比，S-G-R治疗组的Scr及BUN值下降最明显，分别至(35.73±1.77)μmol/L、(13.73±0.61)mmol/L。肾脏组织病理改变(HE染色结果)也证实了S-G-R治疗组的治疗效果较RA治疗组及G-R治疗组更好。结果如图14H所示，S-G-R治疗后，肾脏组织损伤较AKI组明显恢复，更接近正常组织形态；肾小管坏死评分也同样证实S-G-R治疗组具有更好的治疗效果，其评分降至(1.92±0.06)，较AKI组(4.07±0.1)、RA组(3.42±0.09)、G-R组(2.63±0.08)均下降，差异均具有统计学意义(图14G所示)。同时发明人也检测了小鼠UA、ALT、AST水平，结果如图14D所示，AKI组小鼠尿酸值(325.6±3.44)μmol/L，较Sham组尿酸值(244.47±17.36)μmol/L有所增加，差异具有统计学意义(P<0.001)；经过治疗后，均有不同程度下降，但RA治疗组组与AKI组对比差异无统计学意义，G-R治疗组和S-G-R治疗组与AKI组对比差异有统计学意义(图14D所示)。AKI组小鼠ALT及AST较Sham组有所增高(ALT：sham vs AKI、P<0.01，AST：sham vs AKI、P<0.001)；经过RA、G-R和S-G-R治疗后，ALT水平较AKI组均无明显变化，AST水平比AKI组有所下降且具有统计学差异，但RA治疗组、G-R治疗组和S-G-R治疗组这三组之间差异无统计学意义(图14E-F)。
2)载迷迭香酸纳米微粒治疗后肾脏组织电镜改变
行肾脏组织电镜检查，观察肾脏超微结构变化，结果如图15A所示，Sham组肾小管上皮细胞形态基本正常，刷状缘存在，线粒体无明显改变；AKI组小鼠出现小管上皮细胞空泡形成、甚至坏死，刷状缘脱落；线粒体广泛损伤，线粒体嵴消失、线粒体肿胀甚至破裂；而经过RA、G-R和S-G-R治疗后，减少了AKI小鼠近端肾小管上皮细胞中受损线粒体的数量，相比RA和G-R组，来自S-G-R组处理的AKI小鼠的肾脏样本受损线粒体数量更少，且观察到许多保留完整线粒体嵴结构的细长线粒体。并且电镜下也可以观察到经过治疗后刷状缘逐渐恢复正常形态，在S-G-R组可见大量较长的微绒毛整齐排列构成的刷状缘，较RA和G-R组更接近正常形态。
3)载迷迭香酸纳米微粒治疗后改善AKI小鼠的氧化应激、炎症和细胞凋亡
除了ROS、RNS等氧化应激指标，4-羟基壬烯醛(4-HNE)，一种氧化应激和脂质过氧化的最终产物，也可作为氧化应激的非侵入性生物标志物。为了评估不同组RA在IRI-AKI肾脏中的抗氧化应激作用，发明人对4-HNE进行了免疫组织化学染色，结果如图15B所示，IRI-AKI小鼠肾组织特别是肾小管上皮细胞4-HNE表达增高，提示其氧化应激、脂质过氧化水平增加；经过RA、G-R和S-G-R治疗后，4-HNE表达逐渐下降，S-G-R治疗组表达最低，提示S-G-R组的抗氧化能力强于RA和G-R组。进一步发明人取小鼠肾脏研磨成组织匀浆，检测SOD和MDA水平，结果如图15C所示，AKI小鼠中SOD酶消耗过多，其水平明显下降；而经过治疗后，水平逐渐恢复，S-G-R组中SOD水平较RA和G-R组升高，更接近正常组织水平。而AKI小鼠肾组织MDA表达水平升高，显著高于Sham组，RA、G-R和S-G-R治疗降低了AKI模型小鼠肾组织的MDA水平，而S-G-R组MDA水平最低(图15D)，提示这一组脂质过氧化水平最低。发明人进一步测量了肾脏组织中细胞因子IL-6和TNF-α水平，结果如图15E、F所示,AKI组IL-6和TNF-α水平显著升高。相比之下，RA、G-R和S-G-R治疗后IL-6和TNF-α表达水平逐渐降低，在这三组中，S-G-R组小鼠的肾脏组织细胞因子水平最低，表明S-G-R治疗起到的抗炎能力最强。通过TUNEL染色，发明人可以看到，AKI小鼠肾组织凋亡细胞数目明显增多，而经过RA、G-R和S-G-R处理后，凋亡细胞数目逐渐减少，S-G-R组接近正常组织，提示其促进肾脏组织修复作用最强。
综上所述，在小鼠体内验证载药纳米微粒改善肾功能、抗氧化应激、抗炎作用；结果提示S-G-R组的肾功能指标：Scr、BUN，氧化应激水平指标：SOD、MDA、4-HNE，炎症因子指标：IL-6、TNF-α，及凋亡细胞数目，比RA组和G-R组治疗效果明显，说明其应用于AKI治疗的良好前景，载药纳米技术使RA应用于AKI治疗成为可能。
虽然本发明以较佳实施例揭露如上，但并非用以限定本发明实施的范围。任何本领域的普通技术人员，在不脱离本发明的发明范围内，当可作些许的改进，即凡是依照本发明所做的同等改进，应为本发明的范围所涵盖。

Claims (8)

1.载迷迭香酸纳米微粒在制备具有肾脏靶向功能的药物方面的应用。
2.如权利要求1所述的载迷迭香酸纳米微粒在制备具有肾脏靶向功能的药物方面的应用，其特征在于，所述载迷迭香酸纳米微粒以聚酰胺－胺(PAMAM)作为载体。
3.如权利要求2所述的载迷迭香酸纳米微粒在制备具有肾脏靶向功能的药物方面的应用，其特征在于，所述聚酰胺－胺(PAMAM)为第四代聚酰胺－胺(G4-PAMAM)。
4.如权利要求1所述的载迷迭香酸纳米微粒在制备具有肾脏靶向功能的药物方面的应用，其特征在于，所述载迷迭香酸纳米微粒中迷迭香酸的载药量为20～30％。
5.如权利要求1所述的载迷迭香酸纳米微粒在制备具有肾脏靶向功能的药物方面的应用，其特征在于，所述载迷迭香酸纳米微粒的粒径大小在100nm以下。
6.如权利要求5所述的载迷迭香酸纳米微粒在制备具有肾脏靶向功能的药物方面的应用，其特征在于，所述载迷迭香酸纳米微粒的粒径大小为60nm～90nm。
7.如权利要求1所述的载迷迭香酸纳米微粒在制备具有肾脏靶向功能的药物方面的应用，其特征在于，所述应用包括载迷迭香酸纳米微粒在体外保护HK-2细胞、减轻H2O2诱导的氧化应激损伤，具有抗氧化作用。
8.如权利要求1所述的载迷迭香酸纳米微粒在制备具有肾脏靶向功能的药物方面的应用，其特征在于，所述应用包括载迷迭香酸纳米微粒在体内改善肾功能、促进受损肾脏修复的作用，具有抗氧化应激、抗炎作用。
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