WO2013154223A1 - 고농도 콜라겐 및 이의 제조방법 - Google Patents

고농도 콜라겐 및 이의 제조방법 Download PDF

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WO2013154223A1
WO2013154223A1 PCT/KR2012/003397 KR2012003397W WO2013154223A1 WO 2013154223 A1 WO2013154223 A1 WO 2013154223A1 KR 2012003397 W KR2012003397 W KR 2012003397W WO 2013154223 A1 WO2013154223 A1 WO 2013154223A1
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WO
WIPO (PCT)
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collagen
high concentration
solution
concentration
water
Prior art date
Application number
PCT/KR2012/003397
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English (en)
French (fr)
Inventor
정형우
유지철
여세근
서동삼
장정호
Original Assignee
세원셀론텍(주)
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Publication date
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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/78—Connective tissue peptides, e.g. collagen, elastin, laminin, fibronectin, vitronectin, cold insoluble globulin [CIG]

Definitions

  • the present invention relates to a high concentration of collagen and a method for producing the same to be suitable for medical materials, and more specifically to collagen can be prepared in various concentrations for use as a medical material, especially high concentration of collagen for the purpose It is designed to have excellent performance and easy to store compared to low concentration. This greatly improves the quality and reliability of the product, so that it can be planted with a good image by satisfying various needs (users) of consumers.
  • collagen is a structural protein that is distributed in various tissues of animals and is also called collagen and accounts for about 30% of the total weight.
  • Collagen is currently known in more than 20 kinds, collagen type 1 is occupied most, morphologically present in the form of a fibrous solid, three strands of polypeptides are twisted by hydrogen bonds, the length is about 300 kda.
  • Collagen is dissolved in dilute acid or dilute alkali and can be prepared in the liquid phase. The higher the concentration, the higher the viscosity.
  • Collagen is suitable for living tissues and is a biodegradable material, so it is widely used as one of medical materials such as tissue repair material, skin graft material, bone graft material, and cell culture.
  • the collagen is generally subjected to conventional filtration.
  • pressure and fluid flow are formed in a direction perpendicular to the filtration membrane to filter out substances larger than the pore size of the filtration membrane and to pass small substances.
  • the filtration method of this type permeates the filtration object at once, and the material that does not pass accumulates on the filtration membrane, and as the amount of filtration accumulates, the filtration efficiency decreases, and finally, the filtration membrane is clogged.
  • the traditional filtration method is dependent on the volume and the membrane area of the filtration object and has a low limit on the filtration concentration.
  • a high molecular protein In order to filter the collagen, a high molecular protein according to this restriction, it should be prepared in a low concentration liquid phase, especially in the case of sterile filtration to remove microorganisms, it is about 5mg / mL to permeate the filtration membrane having a small pore of 0.2 ⁇ 0.45 micrometer It should be prepared in the following concentration.
  • the prior art 1 has a patent registration No. 1105603 (January 06, 2012) (Application No. 2011-0089802) (Name: method for producing collagen solution using salt precipitation compression concentration method).
  • the present invention relates to a method for preparing a collagen solution using a salt precipitating compressive concentration method to maintain a long-term effect on tissue repair.
  • the prior art described above is a concentrated vinegar containing collagen at high concentration by adding proteinase as a brewing vinegar, acidulant, sugar, sweetener, sugar alcohol, fruit juice, purified water and processing aid to collagen peptides derived from cow, pig or fish. It relates to a method for producing a beverage.
  • the present invention has been made to solve the above problems of the prior art, tangential flow filtration device (TFF: Tangential Flow Filtration) or rotary evaporator or centrifuge or lyophilizer to use liquid collagen as a medical material
  • TDF Tangential Flow Filtration
  • the first purpose is to concentrate at a high concentration by using the above
  • the second object of the present invention according to the above-described technical configuration is to enable collagen to be produced at various concentrations for use as a medical material
  • the third purpose is
  • the high concentration of collagen has the advantage of superior performance for the purpose and easy storage compared to the low concentration
  • the fourth purpose is to greatly improve the quality and reliability of the product, thereby providing various needs of consumers. It provides a high concentration collagen and a method of manufacturing the same to be able to plant a good image.
  • the present invention concentrates to a high concentration by using a tangential flow filtration device (TFF: Tangential Flow Filtration) or rotary evaporator or centrifuge or lyophilizer to use liquid collagen as a medical material. It provides a method for producing collagen.
  • TMF Tangential Flow Filtration
  • the present invention provides a high concentration collagen, characterized in that concentrated using a tangential flow filtration device (TFF: Tangential Flow Filtration) or rotary evaporator or centrifuge or lyophilizer to use the liquid collagen as a medical material .
  • TMF Tangential Flow Filtration
  • the present invention concentrates the liquid collagen at a high concentration using a Tangential Flow Filtration (TFF) or a rotary evaporator or a centrifuge or a lyophilizer for use as a medical material.
  • TMF Tangential Flow Filtration
  • the present invention by the above technical configuration is to enable the collagen to be produced in various concentrations for use as a medical material.
  • the present invention is a collagen concentrated at a high concentration is excellent in performance for that purpose and has the advantage of easy storage compared to low concentration.
  • the present invention greatly improves the quality and reliability of the product due to the above-described effects, which is a very useful invention that can be used to plant a good image by satisfying various needs (needs) of consumers.
  • FIG. 1 is a schematic diagram illustrating a method of filtering collagen in a conventional method.
  • FIG. 2 is a schematic diagram illustrating a method of filtering collagen with a tangential flow filtration device (TFF) applied to the present invention.
  • FIG. 3 is an explanatory diagram of a method of filtering collagen with a tangential flow filtration device (TFF) applied to the present invention.
  • Figure 4 is an explanatory photo of a method of filtering collagen with a rotary evaporator applied to the present invention.
  • FIG. 5 is a simplified configuration diagram of a pH tank applied to the present invention.
  • FIG. 6 is a simplified configuration diagram of a mixer container applied to the present invention.
  • 7,8,9 is a photograph of the configuration of a device for mixing lyophilized collagen applied to the present invention.
  • 10, 11, 12, 13 is an explanatory photo of a method of mixing lyophilized collagen applied to the present invention.
  • High concentration collagen and a method for producing the same applied to the present invention is configured as shown in Figs.
  • the present invention uses a tangential flow filtration device (TFF: Tangential Flow Filtration) (FIG. 2, 3) or rotary evaporator (FIG. 4) or centrifuge (FIG. 5, 6) or freezing to use liquid collagen as a medical material.
  • Collagen is produced at a high concentration by using a dryer (FIGS. 7 to 9 and 10 to 13).
  • the highly concentrated collagen applied to the present invention is preferably concentrated to a concentration of 10mg / mL to 400mg / mL.
  • the collagen is preferably concentrated to a concentration of 10mg / mL ⁇ 400mg / mL because it is difficult to use for medical purposes.
  • the present invention provides a high concentration collagen prepared by the above method.
  • the method of concentrating collagen at a high concentration using the Tangential Flow Filtration (TFF) applied to the present invention is as follows.
  • the pig skin is sectioned to obtain a collagen solution having a concentration of 2 to 3 mg / mL treated with pepsin enzyme in an acidic solution.
  • the collagen solution is subjected to a step of removing foreign substances using a filtration membrane having a pore size of 0.5 to 2.0 micrometers.
  • the collagen solution is placed in a storage tank and then transferred to a tangential flow filtration membrane through a pump, which causes the solution to flow along the tangential line so that a part of the force flowing in the solution is operated in the direction of the filtration membrane. Concentrate.
  • the pores of the filtration membrane applied in the present invention is preferably 1/6 to 1/2 of the size of the material to be concentrated.
  • the pore size of the filtration membrane used for tangential flow filtration is less than 1/6 of the size of the material to be concentrated, it is difficult to concentrate because the size and amount of the material permeated through the filtration membrane is less, and 1 / the size of the material to be concentrated. If greater than 2, there is a risk of loss of concentrate. Therefore, the pore size of the filtration membrane is preferably 1/6 ⁇ 1/2 size of the concentrated material, it is preferable to use a molecular weight blocking (MWCO) filtration membrane of 50 ⁇ 150 kda for filtration of collagen solution.
  • MWCO molecular weight blocking
  • the pore of the filtration membrane applied to the present invention has a pore of 100 kda molecular weight cutoff (MWCO) standard, so that the tangential flow filtration membrane made of polyethersulfone material of 0.02 to 0.1 m 2 per liter of collagen solution It is preferable to.
  • MWCO molecular weight cutoff
  • the tangential flow filtration of the present invention allows the solution to flow along the tangential line between the filtration membrane and the solution so that a part of the force flowing through the solution acts in the direction of the filtration membrane. At this time, the material smaller than the pores of the filtration membrane is discharged to the permeate, the material that has not been permeated is collected to be filtered again.
  • This tangential flow filtration prevents the filtration membrane from clogging due to the flow direction of the solution, and can be filtered several times to concentrate a substance larger than the pores of the filtration membrane.
  • the material of the filtration membrane is polyethersulfone suitable for collagen solution, washing solution and storage solution with dilute acid or dilute alkali.
  • the pump for transferring the collagen solution to the filtration membrane of the tangential flow filtration device uses a pump capable of transferring a high viscosity solution, easy to clean, and prevent contamination of the collagen solution.
  • a pump capable of transferring a high viscosity solution, easy to clean, and prevent contamination of the collagen solution is suitable to use a rotary lobe pump or a peristaltic pump.
  • liquid collagen of about 10 mg / mL may be prepared.
  • the concentration comparison table before and after tangential flow filtration (TFF) of the first embodiment of the present invention is as follows.
  • the present invention was confirmed that the concentration ratio increased after concentration compared to before concentration.
  • the method of concentrating collagen at a high concentration using the rotary evaporator applied to the present invention is as follows.
  • the collagen solution of 1mg / mL concentration extracted from pig skin is put in a flask, and the step of evaporating the water by rotating at 40rpm in a bath.
  • the evaporated water is transferred to the cooling structure using a vacuum to be condensed and collected, and the flask and the cooling structure and the water collection tank are interconnected, and the cooling water temperature circulated to the cooling structure is controlled to 25 ° C.
  • the water collection tank is then decompressed.
  • the temperature of the bath is warmed to 42 ° C. and operated for 7 hours to remove water in the collagen solution and concentrate to 30 mg / mL to produce high concentration collagen.
  • Rotary evaporator applied to the present invention is widely used for concentration or purification as a device for putting a solution in a flask and rotating in a bath bath to evaporate the solvent.
  • a rotary evaporator the flask containing collagen is rotated in a bath to evaporate water and the evaporated water is transferred to a separate cooling structure using a vacuum to be condensed and collected to remove the water in the collagen solution. can do.
  • the temperature of the bath is 42 ° C.
  • the rotational speed of the flask is 40 rpm
  • the temperature of the cooling water of the cooling structure is preferably 25 ° C.
  • the collagen solution of 1 mg / mL concentration can be concentrated to 30 mg / mL under such conditions. Can be.
  • the concentration comparison table before and after concentration using the rotary evaporator of the second embodiment of the present invention is as follows.
  • the present invention was confirmed that the concentration ratio increased after concentration compared to before concentration.
  • the method of concentrating collagen at a high concentration using the centrifuge applied to the present invention is as follows.
  • the collagen solution of 2 ⁇ 5mg / mL concentration extracted from pig skin is filtered stepwise using a filtration membrane having a pore of 2.0 ⁇ 0.2 micrometer to prepare a collagen solution of a sterile state.
  • the sterile collagen solution is subjected to a step of adding a sterilized pH titration tank with steam.
  • the temperature of the collagen solution in the pH titration tank is adjusted to 25-35 ° C. and left to stand for 4 hours to 1 day to allow the collagen to aggregate and separate the layers from the water.
  • the collagen and the separated water in the pH titration tank are removed separately, and the collagen layer is aseptically dispensed into a sterile centrifuge container in an aseptic operation space and sealed in a centrifuge container.
  • the centrifuge is placed in a centrifuge, and the centrifugation is performed by setting the number of revolutions to which the gravity acceleration of 4,000 to 6,000 g is applied.
  • centrifugation vessel is brought into a sterile manipulation space and aseptically operated to remove the separated water through centrifugation.
  • the step of injecting the sterile collagen solution into a steam titration tank sterilized by steam the step of titrating the pH to near neutral (pH 6.0 ⁇ 8.0) using hydrochloric acid (HCl) and sodium hydroxide solution (NaOH).
  • HCl hydrochloric acid
  • NaOH sodium hydroxide solution
  • collagen contained in dilute acid or dilute alkaline solution is agglomerated when titrated to neutral or near neutral pH (pH 6.0 to 8.0) at room temperature, wherein the collagen layer having different specific gravity from water is separated. .
  • the collagen and water are first separated, and then centrifuged at a gravity acceleration of about 4,000 to 6,000 g using a centrifuge to separate collagen and water secondly.
  • the water in the centrifuge vessel is removed and the concentrated collagen is recovered.
  • the recovered collagen can be prepared in a high concentration collagen solution of about 100 mg / mL by adding hydrochloric acid (HCl) to form a liquid again and stirring using a mixer.
  • the vessel for titrating pH, the vessel used for centrifugation, and the vessel of the mixer should be capable of appropriate sterilization and should be sealed to prevent contamination.
  • the mixer should also be equipped with a stirrer capable of stirring the high viscosity collagen solution.
  • the concentration comparison table before and after concentration using the rotary evaporator of the third embodiment of the present invention is as follows.
  • the present invention was confirmed that the concentration ratio after concentration is very large compared to before concentration.
  • the method of concentrating collagen at a high concentration using the lyophilizer applied to the present invention is as follows.
  • the step is to prevent moisture from sublimating.
  • the collagen solution is dispensed into a freeze dryer, frozen at -40 ° C., and then decompressed to maintain the composition, followed by freeze-drying for 12 hours to 1 day.
  • the lyophilized collagen is then sealed with a rubber stopper at the back, which has been opened for container lyophilization.
  • the amount of collagen in the first aliquoted collagen solution applied to the present invention is 180 mg (60 mg / mL X 3 mL), and collagen obtained by the preparation method is obtained by dissolving collagen in 0.5 mL of a mixed solvent after lyophilization. The concentration of the solution is calculated at 360 mg / mL.
  • the collagen solution applied to the present invention is preferably mixed with physiological saline to form the concentration of the body fluid and salt of the human body.
  • the mixed solvent is preferably sealed with a rubber stopper after dispensing 0.5 mL of water, platelet-rich plasma (PRP) and hyaluronic acid (Hyaluronic acid) in each container.
  • PRP platelet-rich plasma
  • Hyaluronic acid hyaluronic acid
  • the collagen is concentrated at a high concentration by the method shown in FIGS. 7 to 9 and the methods shown in FIGS. 10 to 13.
  • the lyophilizer applied to the present invention is a drying method of freezing a sample in a solution state and leaving it under reduced pressure in a state of intact, thereby subliming and removing water in the sample, and widely used for drying a sample containing an unstable substance, including a biological sample, a vaccine, and the like. Used.
  • lyophilization is generally used to remove the moisture in the solution to prepare a wound wound coating in the form of a sponge.
  • a collagen solution containing physiological saline is firstly formulated into a sponge form by removing moisture through lyophilization, and then a method of secondly dissolving in a mixed solvent to liquefy.
  • the container containing the saline collagen solution using a syringe-type container having a Luer-Lok-type connection at one end Luer-Lok in the front during the lyophilization process
  • the type of connection is blocked and the back is not blocked for moisture to sublimate.
  • freeze-drying After freeze-drying, the freeze-drying was allowed to stand for 12 hours to 1 day under reduced pressure after freezing, and the rear portion of the freeze-dried container was sealed with a rubber stopper.
  • a mixed solvent to be mixed with sponge-type collagen after freeze-drying water, platelet-rich plasma (PRP), hyaluronic acid, etc. may be selectively used depending on the purpose. Add 3 mL each and seal with rubber stopper.
  • a mixture of collagen and a mixed solvent uses a connector made of polycarbonate, both of which are Luer-Lok type.
  • the concentration comparison table before and after lyophilization and mixed solvent mixing of the fourth embodiment of the present invention is as follows.
  • the present invention was confirmed that the concentration ratio after concentration is very large compared to before concentration.
  • the present invention of course, the semi-solid or solid collagen can be prepared in the liquid phase again through the centrifuge or lyophilizer.
  • the present invention may be variously modified and may take various forms in applying the above configuration.
  • the technical idea of the high-density collagen of the present invention and its manufacturing method is actually capable of repeating the same result.
  • it is possible to promote technology development and contribute to industrial development, so it is worth protecting.

Abstract

본 발명은 고농도 콜라겐 및 이의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명은 이를 위해 액상의 콜라겐을 의료용 재료로 사용하기 위해 접선유동여과장치(TFF: Tangential Flow Filtration) 또는 회전증발기 또는 원심분리기 또는 동결건조기를 이용하여 고농도로 농축함을 특징으로 구성된다. 상기와 같이 구성된 본 발명은 콜라겐을 의료용 재료로 사용하기 위해 다양한 농도로 제조할 수 있도록 한 것이고, 특히 고농도로 농축된 콜라겐은 해당목적에 대해 성능이 뛰어나고 저농도에 비해 보관이 용이한 장점이 있도록 한 것이며, 이로 인해 제품의 품질과 신뢰성을 대폭 향상시키므로 사용자인 소비자들의 다양한 욕구(니즈)를 충족시켜 좋은 이미지를 심어줄 수 있도록 한 것이다.

Description

고농도 콜라겐 및 이의 제조방법
본 발명은 의료용 재료에 적합하도록 한 고농도 콜라겐 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 콜라겐을 의료용 재료로 사용하기 위해 다양한 농도로 제조할 수 있도록 한 것이고, 특히 고농도로 농축된 콜라겐은 해당목적에 대해 성능이 뛰어나고 저농도에 비해 보관이 용이한 장점이 있도록 한 것이며, 이로 인해 제품의 품질과 신뢰성을 대폭 향상시키므로 사용자인 소비자들의 다양한 욕구(니즈)를 충족시켜 좋은 이미지를 심어줄 수 있도록 한 것이다.
주지하다시피 콜라겐(Collagen)이란 동물의 다양한 조직에 분포하고 교원질 이라고도 하며, 전체 중량의 30% 정도를 차지하고 있는 구조 단백질이다.
콜라겐은 현재 20여 가지의 종류가 알려져 있는데, 콜라겐 1형이 대부분을 차지하고 있으며, 형태적으로는 섬유상 고체로 존재하고, 3가닥의 폴리펩타이드가 수소결합으로 꼬인 구조를 가지며, 그 길이는 약 300 kda 이다.
콜라겐은 묽은 산이나 묽은 알칼리에 용해되어 액상으로 제조할 수 있고, 농도가 높아질수록 점도가 높아진다.
콜라겐은 생체 조직에 적합하고, 생분해 물질이어서 조직수복재, 피부이식재, 뼈이식재, 세포배양 등 의료용 재료 중 하나로 널리 이용된다.
한편 다양한 원료로부터 추출 및 액상으로 제조된 콜라겐을 이물질과 미생물을 제거하여 의료용 재료로 제조하기 위해서는 일반적으로 전통적인 여과를 실시한다.
전통적인 여과 방식은 도 1 에 도시된 바와 같이 여과막과 수직방향으로 압력과 유체흐름을 형성시켜 여과막의 공극(Pore) 크기보다 큰 물질은 걸러내고 작은 물질은 통과시켜 취하는 방식이다. 이러한 방식의 여과방법은 여과대상을 한번에 투과시키며, 통과되지 않은 물질은 여과막에 쌓여 여과양이 누적될수록 여과효율이 떨어지며 최종적으로 여과막이 막히는 현상이 발생한다. 이에 따라 전통적인 여과 방식은 여과대상의 용량과 막면적에 의존적이며 여과할 수 있는 농도가 낮은 한계를 갖는다.
이러한 제한요건에 따라 고분자 단백질인 콜라겐을 여과하기 위해서는 저농도의 액상으로 제조하여야하며, 특히 미생물을 제거하기 위한 제균여과의 경우 0.2~0.45 마이크로미터의 작은 공극을 가진 여과막을 투과시키기 위하여 약 5mg/mL 이하의 농도로 제조해야 한다.
저농도로 제조된 콜라겐 용액을 고농도로 농축하는 방법에 있어서 일반적인 증발농축은 콜라겐의 열변성의 우려가 있어 적용하기 어려우며, 휘발성 용매를 사용하는 농축하는 방법 또한 잔류용매를 별도로 제거해야 하므로 의료용 재료를 제조하는 방법으로 적합하지 않다.
상기한 문제점을 해결하기 위해 종래에는 다음과 같은 선행기술문헌이 출원된바 있다. 즉, 선행기술 1은 특허등록 제1105603호(2012년 01월 06일)(출원번호 제2011-0089802호)(명칭: 염침전 압축 농축법을 이용한 콜라겐 용액 제조방법)가 있다.
상기한 종래 기술은 콜라겐을 염침전 하여 압축 농축함으로써, 수분 제거를 위한 건조시간이 단축되어 제조시간을 단축할 수 있을 뿐 아니라 고농도의 콜라겐 용액을 제조할 수 있기 때문에, 시술시 생체 내에 콜라겐이 오랫동안 머무를 수 있으므로 조직 수복에 대한 효과가 장기간 유지될 수 있도록 한 염침전 압축 농축법을 이용한 콜라겐 용액 제조방법에 관한 것이다.
또한 선행기술 2는 공개특허 제2009-0087716호(2009-08월 18일)(출원번호 제2008-0013126호)(명칭: 고농도 콜라겐 함유 농축형 식초 음료 제조방법)가 있다.
상기한 종래 기술은 소, 돼지 또는 생선에서 유래한 콜라겐 펩타이드에 양조식초와 산미료와 당류와 감미료와 당알콜류와 과즙과 정제수 및 가공조제로서 단백분해효소를 첨가하여 고농도로 콜라겐을 함유한 농축형 식초 음료의 제조방법에 관한 것이다.
그러나 상기한 종래 기술도 콜라겐을 의료용 재료로 사용하기 위해 다양한 농도로 제조할 수 없다는 커다란 문제점이 발생 되었다.
또한 상기 종래 기술은 고농도로 콜라겐을 농축할 수 없음은 물론 이로 인해 성능저하와 보관이 용이하지 못하다는 커다란 문제점이 발생 되었다.
또한 상기 선행기술 1의 경우 염침전 압축 농축 시 염분이 적절하게 제거되지 못하여 인체에 적용 시 삼투압의 변화를 일으켜 의료용 재료로써 사용될 수 없다는 문제점이 존재한다.
본 발명은 상기와 같은 종래 기술의 제반 문제점을 해소하기 위하여 안출한 것으로, 액상의 콜라겐을 의료용 재료로 사용하기 위해 접선유동여과장치(TFF: Tangential Flow Filtration) 또는 회전증발기 또는 원심분리기 또는 동결건조기를 이용하여 고농도로 농축함을 제1목적으로 한 것이고, 상기한 기술적 구성에 의한 본 발명의 제2목적은 콜라겐을 의료용 재료로 사용하기 위해 다양한 농도로 제조할 수 있도록 한 것이고, 특히 제3목적은 고농도로 농축된 콜라겐은 해당목적에 대해 성능이 뛰어나고 저농도에 비해 보관이 용이한 장점이 있도록 한 것이며, 제4목적은 이로 인해 제품의 품질과 신뢰성을 대폭 향상시키므로 사용자인 소비자들의 다양한 욕구(니즈)를 충족시켜 좋은 이미지를 심어줄 수 있도록 한 고농도 콜라겐 및 이의 제조방법을 제공한다.
이러한 목적 달성을 위하여 본 발명은 액상의 콜라겐을 의료용 재료로 사용하기 위해 접선유동여과장치(TFF: Tangential Flow Filtration) 또는 회전증발기 또는 원심분리기 또는 동결건조기를 이용하여 고농도로 농축함을 특징으로 하는 고농도 콜라겐의 제조방법을 제공한다.
또한 본 발명은 액상의 콜라겐을 의료용 재료로 사용하기 위해 접선유동여과장치(TFF: Tangential Flow Filtration) 또는 회전증발기 또는 원심분리기 또는 동결건조기를 이용하여 고농도로 농축함을 특징으로 하는 고농도 콜라겐을 제공한다.
상기에서 상세히 살펴본 바와 같이 본 발명은 액상의 콜라겐을 의료용 재료로 사용하기 위해 접선유동여과장치(TFF: Tangential Flow Filtration) 또는 회전증발기 또는 원심분리기 또는 동결건조기를 이용하여 고농도로 농축하는 것이다.
상기한 기술적 구성에 의한 본 발명은 콜라겐을 의료용 재료로 사용하기 위해 다양한 농도로 제조할 수 있도록 한 것이다.
특히 본 발명은 고농도로 농축된 콜라겐은 해당목적에 대해 성능이 뛰어나고 저농도에 비해 보관이 용이한 장점이 있도록 한 것이다.
본 발명은 상기한 효과로 인해 제품의 품질과 신뢰성을 대폭 향상시키므로 사용자인 소비자들의 다양한 욕구(니즈)를 충족시켜 좋은 이미지를 심어줄 수 있도록 한 매우 유용한 발명인 것이다.
도 1 은 종래 전통적 방법으로 콜라겐을 여과하는 방법을 설명한 모식도.
도 2 는 본 발명에 적용된 접선유동여과장치(TFF)으로 콜라겐을 여과하는 방 법을 설명한 모식도.
도 3 은 본 발명에 적용된 접선유동여과장치(TFF)으로 콜라겐을 여과하는 방식의 설명도.
도 4 는 본 발명에 적용된 회전증발기로 콜라겐을 여과하는 방법의 설명 사진.
도 5 는 본 발명에 적용된 pH탱크의 간략 구성도.
도 6 은 본 발명에 적용된 혼합기용기의 간략 구성도.
도 7,8,9는 본 발명에 적용된 동결건조된 콜라겐을 혼합하는 장치의 구성 사진.
도 10,11,12,13은 본 발명에 적용된 동결건조된 콜라겐을 혼합하는 방법의 설명 사진.
본 발명에 적용된 고농도 콜라겐 및 이의 제조방법은 도 2 내지 도 13 에 도시된 바와 같이 구성되는 것이다.
하기에서 본 발명을 설명함에 있어, 관련된 공지 기능 또는 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명은 생략할 것이다.
그리고 후술되는 용어들은 본 발명에서의 기능을 고려하여 설정된 용어들로서 이는 생산자의 의도 또는 관례에 따라 달라질 수 있으므로 그 정의는 본 명세서 전반에 걸친 내용을 토대로 내려져야 할 것이다.
먼저, 본 발명은 액상의 콜라겐을 의료용 재료로 사용하기 위해 접선유동여과장치(TFF: Tangential Flow Filtration)(도 2,3) 또는 회전증발기(도 4) 또는 원심분리기(도 5,6) 또는 동결건조기(도 7∼9 및 도 10∼13)를 이용하여 고농도로 콜라겐을 제조하게 된다.
특히 본 발명에 적용된 상기 고농축의 콜라겐은 10mg/mL∼400mg/mL의 농도로 농축함이 바람직하다.
이유는 상기 콜라겐이 10mg/mL 이하로 농축되면 보관이 용이하지 못하고 의료용 재료로써이 성능과 다양한 제품에 적용하기 어렵다는 문제점이 있고, 상기 콜라겐이 400mg/mL 이상으로 농축되면 높은 점도로 인해 취급이 용이하지 않아 의료용으로 사용하기 어렵기 때문에 상기 콜라겐은 10mg/mL~400mg/mL의 농도로 농축함이 바람직하다.
그리고 본 발명은 상기한 방법으로 제조된 고농도 콜라겐을 제공한다.
이하 본 발명의 각 실시예를 보다 상세히 설명하면 다음과 같다.
(제1실시예)
본 발명에 적용된 상기 접선유동여과장치(TFF: Tangential Flow Filtration)를 이용하여 콜라겐을 고농도로 농축하는 방법은 다음과 같다.
먼저, 돼지피부를 절편화 하여 산성용액에서 펩신 효소를 처리한 농도가 2∼3mg/mL의 콜라겐 용액을 얻는 단계를 거친다.
이후 콜라겐 용액을 0.5∼2.0 마이크로미터 공극을 가진 여과막을 이용하여 이물질을 제거하는 단계를 거친다.
이어서 콜라겐 용액을 저장탱크에 넣은 후 펌프를 통해 접선유동여과막으로 이송하는되, 용액이 접선을 따라 흐르도록 하여 용액이 흐르는 일부의 힘이 여과막 방향으로 작동되도록 하여 콜라겐 용액을 10mg/mL의 농도로 농축하는 단계를 거친다.
마지막으로 접선유동여과막을 통과하지 못한 용액은 다시 저장탱크로 회수되고, 투과액은 별도의 폐수 탱크로 배출하는 단계를 거쳐 고농도 콜라겐을 제조하게 된다.
특히 본 발명에 적용된 상기 여과막의 공극은 농축하고자 하는 물질 크기의 1/6∼1/2 임이 바람직하다.
이유는 접선 유동 여과에 사용되는 여과막의 공극은 농축하고자 하는 물질의 크기의 1/6보다 작을 경우 여과막을 투과되는 물질의 크기와 양이 적어지므로 농축이 어려우며, 농축하고자 하는 물질의 크기의 1/2보다 클 경우 농축물질의 손실 위험이 있다. 따라서 여과막의 공극 크기는 농축물질의 1/6 ~ 1/2 크기가 바람직하며, 콜라겐 용액의 여과를 위해서는 50 ~ 150 kda의 분자량 차단(MWCO) 여과막을 사용함이 바람직하다.
또한 본 발명에 적용된 상기 여과막의 공극은 100kda의 분자량 차단(MWCO) 규격의 공극을 가지며, 폴리에테르설폰(polyethersulfone) 재질의 접선유동 여과막을 콜라겐 용액 1리터 당 0.02∼0.1 평방미터의 막면적이 되도록 함이 바람직하다.
상기 본 발명의 접선 유동 여과는 전통적인 여과방식과 달리 용액을 여과막과 용액의 접선을 따라 흐르도록 하여 용액이 흐르는 일부의 힘이 여과막 방향으로 작용되도록 한다. 이때 여과막의 공극보다 작은 물질은 투과액으로 배출되고, 투과되지 않은 물질은 회수되어 다시 여과를 할 수 있도록 포집된다. 이러한 접선 유동 여과는 용액의 흐름방향에 의해 여과막이 막히는 현상을 방지하며, 여러 번에 걸쳐 여과를 하여 여과막의 공극보다 큰 물질을 농축할 수 있다.
그리고 여과막의 재질은 묽은 산 또는 묽은 알칼리를 띄는 콜라겐 용액 및 세척액, 보관액에 적합한 폴리에테르설폰(Polyethersulfone)이 적합하다.
또한 접선 유동 여과 장치의 여과막에 콜라겐 용액을 이송하는 펌프는 점도가 높은 용액을 이송할 수 있고 세척이 용이하며, 콜라겐 용액의 오염을 방지할 수 있는 펌프를 사용한다. 이를 위해 로터리 로브 펌프(Rotary lobe pump) 또는 연동펌프(Peristaltic pump)를 사용하는 것이 적합하다.
상기 접선 유동 여과 장치를 사용하여 콜라겐 용액을 농축할 경우 약 10 mg/mL의 액상 콜라겐을 제조할 수 있다
상기한 본원발명 제1실시예의 접선 유동 여과(TFF) 전후 농도 비교표는 다음과 같다.
표 1
사례 농축전 농도(mg/mL) 농축후 농도(mg/mL) 농축배율
1 3 11 3.6배
2 2 7 3.5배
3 3 9 3.0배
4 2 7 3.5배
5 3 7 2.3배
상기와 같이 본원발명은 농축전에 비해 농축후 농축배율이 증가함을 확인할 수 있었다.
(실시예2)
본 발명에 적용된 상기 회전증발기를 이용하여 콜라겐을 고농도로 농축하는 방법은 다음과 같다.
먼저, 돼지피부에서 추출한 1mg/mL 농도의 콜라겐 용액을 플라스크에 넣고, 중탕조에서 40rpm으로 회전시켜 수분을 증발시키는 단계를 거친다.
이후 증발된 수분을 진공을 이용하여 냉각구조물로 이송하여 응축 및 수집되도록 하되, 플라스크와 냉각구조물 및 수분수집조를 상호 연결하고, 냉각구조물에 순환하는 냉각수 온도를 25℃로 통제하는 단계를 거친다.
그리고 수분수집조를 감압하는 단계를 거친다.
마지막으로 중탕조의 온도를 42℃로 가온하고, 7시간 동안 가동시켜 콜라겐 용액 내의 수분을 제거하여 30mg/mL 농도로 농축하는 단계를 거쳐 고농도 콜라겐을 제조하게 된다.
본 발명에 적용된 회전증발기는 용액을 플라스크에 넣어 중탕조에 회전하시켜 용매를 증발시키는 장치로써 농축 또는 정제를 위해 널리 사용된다. 이러한 회전증발기를 이용하여 콜라겐을 넣은 플라스크를 중탕조에 회전시켜 수분을 증발시키고 증발된 수분을 진공을 이용하여 별도의 냉각구조물로 이송하여 응축, 수집되도록 하여 콜라겐 용액 내 수분을 제거함으로써 콜라겐 용액을 농축 할 수 있다.
상기 방법을 이용할 때 중탕조의 온도는 42 ℃, 플라스크의 회전속도는 40 rpm, 냉각구조물의 냉각수 온도는 25 ℃가 바람직하며, 해당 조건에서 1 mg/mL 농도의 콜라겐 용액을 30mg/mL로 농축할 수 있다.
상기한 본원발명 제2실시예의 회전증발기를 이용한 농축 전후 농도 비교표는 다음과 같다.
표 2
사례 중탕조 온도 냉각수 온도 농축시간 농도(mg/mL) 농축배율
농축전 농축후
1 35 ℃ 30 ℃ 8시간 1 2.7 2.7배
2 43 ℃ 25 ℃ 2.5시간 1 2.3 2.3배
3 41 ℃ 30 ℃ 3.5시간 1 12 12배
4 41 ℃ 31 ℃ 7시간 1 18 18배
42 ℃ 25 ℃ 7시간 1 29 29배
상기와 같이 본원발명은 농축전에 비해 농축후 농축배율이 증가함을 확인할 수 있었다.
(실시예3)
본 발명에 적용된 상기 원심분리기를 이용하여 콜라겐을 고농도로 농축하는 방법은 다음과 같다.
먼저, 돼지피부에서 추출한 2∼5mg/mL 농도의 콜라겐 용액을 2.0∼0.2마이크로미터의 공극을가진 여과막을 이용하여 단계적으로 여과하여 무균상태의 콜라겐 용액을 제조하는 단계를 거친다.
이후 상기 무균상태의 콜라겐 용액을 스팀으로 멸균된 pH 적정 탱크에 투입하는 단계를 거친다.
이어서 pH 적정탱크 내 콜라겐용액의 온도가 25∼35 ℃가 되도록 조절하고 4시간∼1일간 정치하여 콜라겐이 응집하여 물과 층 분리가 되도록 하는 단계를 거친다.
이후 pH 적정탱크 내 콜라겐과 분리된 물은 별도로 제거하고 콜라겐 층은 무균조작 공간에서 멸균된 원심분리 용기에 무균적으로 분주하고 원심분리용기를 밀봉하는 단계를 거친다.
이어서 원심분리용기를 원심분리기에 넣고 4,000∼6,000 g의 중력가속도가 가해지는 회전수를 설정하여 원심분리를 진행하는 단계를 거친다.
이후 원심분리가 완료된 원심분리용기를 무균조작 공간으로 반입하여 무균적으로 조작하여 원심분리를 통해 분리된 물을 제거하는 단계를 거친다.
또한 혼합기용기를 멸균하여 무균조작 공간에서 원심분리된 콜라겐과 산성용액을 투입하는 단계를 거친다.
마지막으로 홉합기용기를 밀봉한 후 교반장치를 이용하여 균질하게 교반하여 100mg/mL 농도로 농축하는 단계를 거쳐 고농도 콜라겐을 제조하게 된다.
특히 상기 무균상태의 콜라겐 용액을 스팀으로 멸균된 pH 적정 탱크에 투입하는 단계 이후 염산(HCl)과 수산화 나트륨용액(NaOH)을 이용하여 pH를 중성(pH 6.0∼8.0)에 가깝도록 적정하는 단계를 거쳐 고농도 콜라겐을 제조할 수 있음은 물론이다.
본 발명은 묽은 산 또는 묽은 알칼리 용액에 포함된 콜라겐은 상온에서 중성 또는 중성에 가까운 pH(pH 6.0 ~ 8.0)로 적정하게 되면 응집되며, 이때 물과 비중이 다른 콜라겐층이 분리되는 성질을 가지고 있다. 이를 이용하여 콜라겐과 수분을 1차적으로 분리한 후 원심분리기를 이용하여 약 4,000 ~ 6,000 g의 중력 가속도로 원심분리를 하게 되면 2차적으로 콜라겐과 물이 분리된다. 이때 원심분리기 용기내 물은 제거하고 농축된 콜라겐을 회수한다. 회수된 콜라겐은 다시 액상으로 제형화 하기 위하여 염산(HCl)을 넣고 혼합기를 이용하여 교반하면 약 100 mg/mL의 고농도 콜라겐 용액을 제조할 수 있다.
상기 제조방법에 있어서 pH를 적정하는 용기, 원심분리에 사용되는 용기 및 혼합기의 용기는 적절한 멸균이 가능해야 하며, 오염을 방지하기 위해 밀봉이 가능한 구조여야 한다. 또한 혼합기는 고점도의 콜라겐 용액을 교반할 수 있는 교반장치를 갖추어야 한다.
상기한 본원발명 제3실시예의 회전증발기를 이용한 농축 전후 농도 비교표는 다음과 같다.
표 3
사례 농축전 농도(mg/mL) 농축후 농도(mg/mL) 농축배율
34 3 120 40.0배
35 2 95 47.5배
36 3 100 33.3배
41 4 96 24.0배
48 3 103 34.3배
상기와 같이 본원발명은 농축전에 비해 농축후 농축배율이 매우 크게 증가함을 확인할 수 있었다.
(실시예4)
본 발명에 적용된 상기 동결건조기를 이용하여 콜라겐을 고농도로 농축하는 방법은 다음과 같다.
먼저, 한쪽 끝이 루어락(Luer-Lok) 타입의 연결부를 갖는 주사기 형태의 용기에 콜라겐 용액을 3mL씩 분주하되, 이때 용기의 앞쪽 루어락(Luer-Lok) 타입의 연결부는 마개로 막는 동시에 뒤쪽은 수분이 승화할 수 있도록 막지 않도록 하는 단계를 거친다.
이후 콜라겐 용액이 분주된 용기를 동결건조기에 넣고 -40 ℃로 동결하고 감압상태를 조성 후 유지토록 하여 12시간 ~ 1일간 동결건조를 진행하는 단계를 거친다.
이어서 동결건조가 완료된 콜라겐은 용기 동결건조를 위해 개방해 놓았던 뒤쪽을 고무마개로 밀봉하는 단계를 거친다.
이후 콜라겐과 혼합용매가 들어있는 각 용기의 루어락(Luer-Lok) 연결부위와 연결기구(Connector)의 루어락(Luer-Lok) 연결부위를 연결한 후 각 용기의 고무마개를 번갈아 가며 여러 번 전진시켜 혼합용액과 콜라겐을 혼합하여 콜라겐 용액을 400mg/mL의 농도로 농축하는 단계를 거쳐 고농도 콜라겐을 제조하게 된다.
본 발명에 적용된 최초 분주한 콜라겐용액 속의 콜라겐의 양은 180 mg(60 mg/mL X 3 mL)이며, 동결건조 후 혼합용매 0.5 mL에 콜라겐이 용해되어 포함되어 있으므로, 상기 제조방법을 통해 수득한 콜라겐 용액의 농도는 360 mg/mL로 계산된다.
한편, 본 발명에 적용된 상기 콜라겐 용액은 인체의 체액과 염분의 농도가 등장을 이루는 생리식염수와 혼합함이 바람직하다.
그리고 상기 혼합용매는 물, 혈소판 풍부 혈장(PRP), 히알루론산(Hyaluronic acid)을 각 용기에 0.5mL씩 분주한 후 고무마개로 밀봉함이 바람직하다.
상기한 본원발명은 도 7∼9의 구성도 및 도 10∼13에 도시된 방법으로 콜라겐을 고농도로 농축하게 된다.
본 발명에 적용된 동결건조기는 용액상태 등에 있는 시료를 동결하여 그대로의 상태로 감압하에 방치함으로써 시료 중의 수분을 승화시켜 제거하는 건조 방법으로 생체 시료, 백신 등를 비롯하여 불안정한 물질을 함유하는 시료의 건조에 널리 쓰인다. 콜라겐의 경우 일반적으로 용액내 수분을 제거하여 스폰지 형태의 창상피복제를 제조하기 위하여 동결건조를 이용한다.
본 발명에서는 1차적으로 생리식염수가 포함된 콜라겐 용액을 동결건조를 통해 수분을 제거하여 스폰지 형태로 제형화 한 후 2차적으로 혼합 용매에 녹여 액상화 시키는 방법을 제시한다.
또한 생리식염수가 포함된 콜라겐 용액을 담는 용기는 한쪽 끝이 루어락(Luer-Lok) 타입의 연결부를 갖는 주사기 형태의 용기를 사용하며, 동결건조를 진행하는 동안 앞쪽의 루어락(Luer-Lok) 타입의 연결부위는 막아 놓고 뒤쪽은 수분이 승화할 수 있도록 막지 않는다.
그리고 동결건조는 -40℃ 동결 후 감압상태에서 12시간 ~ 1일간 정치하고, 동결건조가 완료된 용기의 뒷부분은 고무마개로 밀봉한다.
또한 동결건조 후 스폰지 형태의 콜라겐과 혼합할 혼합용매로는 용도에 따라 물, 혈소판 풍부 혈장(PRP), 히알루론산(Hyaluronic acid) 등을 선택적으로 사용할 수 있으며, 콜라겐을 담은 용기와 동일한 용기에 0.5 ~ 3 mL씩 넣은 뒤 고무마개로 밀봉한다.
그리고 콜라겐과 혼합용매의 혼합에는 양쪽이 루어락(Luer-Lok) 타입으로 되어 있는 폴리카보네이트(Polycarbonate) 재질의 연결기구(Connector)를 사용한다.
또한 콜라겐과 혼합용매가 들어있는 각 용기의 루어락(Luer-Lok) 연결부위와 연결기구(Connector)의 루어락(Luer-Lok) 연결부위를 연결한 후 각 용기의 고무마개를 번갈아 가며 여러 번 전진 시켜 혼합용액과 콜라겐을 혼합하면 약 400 mg/mL의 고농도 콜라겐 용액을 취할 수 있다.
상기한 본원발명 제4실시예의 동결건조 및 혼합용매 혼합 전후 농도 비교표는 다음과 같다.
[규칙 제91조에 의한 정정 24.05.2012]
표 4　
Figure WO-DOC-FIGURE-105
상기와 같이 본원발명은 농축전에 비해 농축후 농축배율이 매우 크게 증가함을 확인할 수 있었다.
한편, 본 발명은 상기 원심분리기 또는 동결건조기를 통해 반고체 또는 고체상태의 콜라겐을 다시 액상으로 제조할 수 있음은 물론이다.
한편 본 발명은 상기의 구성부를 적용함에 있어 다양하게 변형될 수 있고 여러 가지 형태를 취할 수 있다.
그리고 본 발명은 상기의 상세한 설명에서 언급되는 특별한 형태로 한정되는 것이 아닌 것으로 이해되어야 하며, 오히려 첨부된 청구범위에 의해 정의되는 본 발명의 정신과 범위 내에 있는 모든 변형물과 균등물 및 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
본 발명 고농도 콜라겐 및 이의 제조방법의 기술적 사상은 실제로 동일결과를 반복 실시 가능한 것으로, 특히 이와 같은 본원발명을 실시함으로써 기술발전을 촉진하여 산업발전에 이바지할 수 있어 보호할 가치가 충분히 있다.

Claims (13)

  1. 액상의 콜라겐을 의료용 재료로 사용하기 위해 접선유동여과장치(TFF: Tangential Flow Filtration) 또는 회전증발기 또는 원심분리기 또는 동결건조기를 이용하여 고농도로 농축함을 특징으로 하는 고농도 콜라겐의 제조방법.
  2. 청구항 1 에 있어서,
    상기 고농축의 콜라겐은 10mg/mL∼400mg/mL의 농도로 농축함을 특징으로 하는 고농도 콜라겐의 제조방법.
  3. 청구항 1 에 있어서,
    상기 접선유동여과장치(TFF: Tangential Flow Filtration)를 이용하여 콜라겐을 고농도로 농축하는 방법은,
    돼지피부를 절편화 하여 산성용액에서 펩신 효소를 처리한 농도가 2∼3mg/mL의 콜라겐 용액을 얻는 단계;
    콜라겐 용액을 0.5∼2.0 마이크로미터 공극을 가진 여과막을 이용하여 이물질을 제거하는 단계;
    콜라겐 용액을 저장탱크에 넣은 후 펌프를 통해 접선유동여과막으로 이송하는되, 용액이 접선을 따라 흐르도록 하여 용액이 흐르는 일부의 힘이 여과막 방향으로 작동되도록 하여 콜라겐 용액을 10mg/mL의 농도로 농축하는 단계; 및
    접선유동여과막을 통과하지 못한 용액은 다시 저장탱크로 회수되고, 투과액은 별도의 폐수 탱크로 배출하는 단계;가 포함됨을 특징으로 하는 고농도 콜라겐의 제조방법.
  4. 청구항 3 에 있어서,
    상기 여과막의 공극은 농축하고자 하는 물질 크기의 1/6∼1/2 임을 특징으로 하는 고농도 콜라겐의 제조방법.
  5. 청구항 3 에 있어서,
    상기 여과막의 면적은 100kda의 분자량 차단(MWCO) 규격의 공극을 가지며, 폴리에테르설폰(polyethersulfone) 재질의 접선유동 여과막을 콜라겐 용액 1리터 당 0.02∼0.1 평방미터의 막면적이 되도록 함을 특징으로 하는 고농도 콜라겐의 제조방법.
  6. 청구항 1 에 있어서,
    상기 회전증발기를 이용하여 콜라겐을 고농도로 농축하는 방법은,
    돼지피부에서 추출한 1mg/mL 농도의 콜라겐 용액을 플라스크에 넣고, 중탕조에서 40rpm으로 회전시켜 수분을 증발시키는 단계;
    증발된 수분을 진공을 이용하여 냉각구조물로 이송하여 응축 및 수집되도록 하되, 플라스크와 냉각구조물 및 수분수집조를 상호 연결하고, 냉각구조물에 순환하는 냉각수 온도를 25℃로 통제하는 단계;
    수분수집조를 감압하는 단계; 및
    중탕조의 온도를 42℃로 가온하고, 7시간 동안 가동시켜 콜라겐 용액 내의 수분을 제거하여 30mg/mL 농도로 농축하는 단계;가 포함됨을 특징으로 하는 고농도 콜라겐의 제조방법.
  7. 청구항 1 에 있어서,
    상기 원심분리기를 이용하여 콜라겐을 고농도로 농축하는 방법은,
    돼지피부에서 추출한 2∼5mg/mL 농도의 콜라겐 용액을 2.0∼0.2마이크로미터의 공극을가진 여과막을 이용하여 단계적으로 여과하여 무균상태의 콜라겐 용액을 제조하는 단계;
    상기 무균상태의 콜라겐 용액을 스팀으로 멸균된 pH 적정 탱크에 투입하는 단계;
    pH 적정탱크 내 콜라겐용액의 온도가 25∼35 ℃가 되도록 조절하고 4시간∼1일간 정치하여 콜라겐이 응집하여 물과 층 분리가 되도록 하는 단계;
    pH 적정탱크 내 콜라겐과 분리된 물은 별도로 제거하고 콜라겐 층은 무균조작 공간에서 멸균된 원심분리 용기에 무균적으로 분주하고 원심분리용기를 밀봉하는 단계;
    원심분리용기를 원심분리기에 넣고 4,000∼6,000 g의 중력가속도가 가해지는 회전수를 설정하여 원심분리를 진행하는 단계;
    원심분리가 완료된 원심분리용기를 무균조작 공간으로 반입하여 무균적으로 조작하여 원심분리를 통해 분리된 물을 제거하는 단계;
    혼합기용기를 멸균하여 무균조작 공간에서 원심분리된 콜라겐과 산성용액을 투입하는 단계; 및
    홉합기용기를 밀봉한 후 교반장치를 이용하여 균질하게 교반하여 100mg/mL 농도로 농축하는 단계;가 포함됨을 특징으로 하는 고농도 콜라겐의 제조방법.
  8. 청구항 7 에 있어서,
    상기 무균상태의 콜라겐 용액을 스팀으로 멸균된 pH 적정 탱크에 투입하는 단계 이후 염산(HCl)과 수산화 나트륨용액(NaOH)을 이용하여 pH를 중성(pH 6.0∼8.0)에 가깝도록 적정하는 단계가 더 포함됨을 특징으로 하는 고농도 콜라겐의 제조방법.
  9. 청구항 1 에 있어서,
    상기 동결건조기를 이용하여 콜라겐을 고농도로 농축하는 방법은,
    한쪽 끝이 루어락(Luer-Lok) 타입의 연결부를 갖는 주사기 형태의 용기에 콜라겐 용액을 3mL씩 분주하되, 이때 용기의 앞쪽 루어락(Luer-Lok) 타입의 연결부는 마개로 막는 동시에 뒤쪽은 수분이 승화할 수 있도록 막지 않도록 하는 단계;
    콜라겐 용액이 분주된 용기를 동결건조기에 넣고 -40 ℃로 동결하고 감압상태를 조성 후 유지토록 하여 12시간 ~ 1일간 동결건조를 진행하는 단계;
    동결건조가 완료된 콜라겐은 용기 동결건조를 위해 개방해 놓았던 뒤쪽을 고무마개로 밀봉하는 단계; 및
    콜라겐과 혼합용매가 들어있는 각 용기의 루어락(Luer-Lok) 연결부위와 연결기구(Connector)의 루어락(Luer-Lok) 연결부위를 연결한 후 각 용기의 고무마개를 번갈아 가며 여러 번 전진시켜 혼합용액과 콜라겐을 혼합하여 콜라겐 용액을 400mg/mL의 농도로 농축하는 단계;가 포함됨을 특징으로 하는 고농도 콜라겐의 제조방법.
  10. 청구항 9 에 있어서,
    상기 콜라겐 용액은 인체의 체액과 염분의 농도가 등장을 이루는 생리식염수와 혼합함을 특징으로 하는 고농도 콜라겐의 제조방법.
  11. 청구항 9 에 있어서,
    상기 혼합용매는,
    물, 혈소판 풍부 혈장(PRP), 히알루론산(Hyaluronic acid)을 각 용기에 0.5mL씩 분주한 후 고무마개로 밀봉함을 특징으로 하는 고농도 콜라겐의 제조방법.
  12. 청구항 1 에 있어서,
    상기 원심분리기 또는 동결건조기를 통해 반고체 또는 고체상태의 콜라겐을 다시 액상으로 제조함을 특징으로 하는 고농도 콜라겐의 제조방법.
  13. 청구항 1 내지 11 항의 어느 하나의 방법으로 제조된 고농도 콜라겐.
PCT/KR2012/003397 2012-04-10 2012-05-01 고농도 콜라겐 및 이의 제조방법 WO2013154223A1 (ko)

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