CN115404216A - 一种中性粒细胞胞外诱捕网的诱导物、诱导方法及其抑制剂 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种中性粒细胞胞外诱捕网的诱导物、诱导方法及其抑制剂。本发明公开了焦亡巨噬细胞微囊泡在制备体外诱导中性粒细胞产生胞外诱捕网的诱导剂中的应用，还公开了其诱导方法及相关抑制剂，包括以下步骤：分离中性粒细胞，利用上述包含焦亡巨噬细胞产生的微囊泡的诱导物与中性粒细胞共培养，以形成NETs。并采用线粒体活性氧特异性抑制剂MitoTEMPO阻断该诱导物诱导的NET的形成。本发明在人和动物NETs的体外诱导以及与NETs相关的疾病治疗方面具有良好的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种中性粒细胞胞外诱捕网的诱导物、诱导方法及其抑制剂。
背景技术
中性粒细胞是感染防治的第一条防线，在固有免疫系统中发挥重要的角色。生理情况下，中性粒细胞占人外周血白细胞50％-70％,在感染的条件下，比例进一步升高。
中性粒细胞胞外诱捕网(NETs)是中性粒细胞特有的一种死亡方式，其主要由组蛋白、DNA、弹性蛋白酶及髓过氧化物酶等组成。研究显示，NETs在不同疾病的不同阶段发挥着不同的作用。适量的NETs可以包裹相关的细菌及病毒，并通过释放的相关酶对病原体进行杀伤，达到限制病原体传播，清除感染的目的。然而，大量的NETs的产生会对机体的相关器官造成损害，比如NETs可以引起肺纤维化，可以引起肝脏、肾脏、心脏损伤，NETs也可以在机体形成血栓。此外，NETs可以促进肿瘤的转移等。在NETs产生的同时，中性粒细胞会被激活，其释放的活性氧(ROS)进一步对机体的相关器官产生损伤。
目前，关于NET的诱导物中，微生物，(12-)十四酸佛波酯(-13-)乙酸盐(PMA),活化的血小板，离子霉素，新冠患者血清等均可以诱导中性粒细胞产生NETs。此外有研究表明相关的细胞因子如肿瘤坏死因子-a，白细胞介素-8，干扰素等同样可以刺激中性细胞活化及诱导NETs的形成。
中性粒细胞NETs的诱导物部分是外来物质干预，但在疾病中本身存在的，特别是在脓毒症及急性呼吸窘迫综合征中，患者的中性粒细胞比健康人的中性粒细胞更容易引起NETs，考虑到病情的改善和治疗，就需要抑制NETs的形成，而目前关于阻断NETs形成的主要的药物是脱氧核糖核酸酶-1，其他药物较少。
综上，目前在脓毒症及急性呼吸窘迫综合征的治疗效果欠佳，仍具有较高的死亡率，因此，寻找新的治疗靶点及新的药物对提高患者的生存率具有重要的意义。
发明内容
针对目前现有技术存在的不足，为了提供与NETs相关疾病，如脓毒症、急性呼吸窘迫综合征、肺纤维化、肺栓塞、系统性红斑狼疮、慢性阻塞性肺疾病等疾病新的诊断和治疗手段，本发明的目的在于提供一种体外诱导中性粒细胞胞外诱捕网的诱导物、诱导方法及其相关的抑制剂。
本发明首先提供了焦亡巨噬细胞微囊泡在制备体外诱导中性粒细胞产生胞外诱捕网的诱导剂中的应用。
优选地，上述体外诱导中性粒细胞产生胞外诱捕网的诱导方法，包括以下步骤：
S1、分离中性粒细胞；
S2、诱导巨噬细胞焦亡，提取焦亡巨噬细胞微囊泡；
S3、利用步骤S2所得焦亡巨噬细胞微囊泡诱导步骤S1分离的中性粒细胞，形成NETs。
优选地，步骤S1中所述中性粒细胞来自哺乳动物。
优选地，步骤S1中所述中性粒细胞来源于人外周血和小鼠骨髓。
优选地，步骤S2所述巨噬细胞来自哺乳动物。
优选地，步骤S2所述巨噬细胞来源与人巨噬细胞系THP1和小鼠骨髓诱导的巨噬细胞(BMDM)。
优选地，步骤S3所述微囊泡的浓度为9×105-4×106个/mL。
优选地，步骤S3所述诱导时间为3-4h。
本发明通过在中性粒细胞加入焦亡巨噬细胞产生的微囊泡干预后，中性粒细胞NETs的产生较无干预组及正常巨噬细胞产生的微囊泡的干预组明显增多，因此，焦亡巨噬细胞微囊泡也可以作为NETs形成的标识物，用于NETs的快速检测。
本发明的第二个目的在于提供一种用于诱导中性粒细胞产生胞外诱捕网NETs的试剂盒，包括焦亡巨噬细胞微囊泡。
本发明还研究了抑制剂MitoTEMPO对NETs的阻断作用，研究发现其可以在焦亡巨噬细胞微囊泡诱导NETs形成的上游进行阻断，中性粒细胞并没有破裂崩解，可以一定程度执行相关的功能。
因此，本发明提供了线粒体活性氧特异性抑制剂MitoTEMPO在制备用于阻断中性粒细胞胞外诱捕网形成的药物中的应用。
优选地，所述胞外诱捕网是由焦亡巨噬细胞微囊泡诱导形成。
优选地，上述药物可用于治疗与NETs相关的疾病，所述疾病包括脓毒症、急性呼吸窘迫综合征、肺纤维化、肺栓塞、系统性红斑狼疮、慢性阻塞性肺疾病。
本发明还提供了一种用于阻断中性粒细胞胞外诱捕网形成的试剂盒，包括线粒体活性氧特异性抑制剂MitoTEMPO。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明提供了焦亡巨噬细胞微囊泡具有诱导中性粒细胞胞外诱捕网形成的作用，诱导方法以及相关的抑制剂，适用于体外诱导及阻断NETs的形成，具有简单、方便、重复性好的优点。
附图说明
图1为本发明实施例1中分离焦亡的巨噬细胞产生的外囊泡的电镜图。
图2为本发明中实施例1所制得的人NETs的免疫荧光图。
图3为本发明中实施例2所制得的小鼠NETs的免疫荧光图。
图4为本发明中实施例3进行抑制剂干预后的免疫荧光图(人样本)。
图5为本发明中实施例3进行抑制剂干预后的免疫荧光图(小鼠样本)。
图6为本发明中实施例4进行传统NETs抑制剂(DNas I)干预后的免疫荧光图(人样本)。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
实施例1
1、人中性粒细胞的分离
(1)取健康人外周血5mL，与PBS按照1:1的比例稀释；
(2)在离心管中加入3-5mL人中性粒细胞分离液，然后缓慢将稀释的抗凝血沿管壁滴入到分离液上层；
(3)室温条件下950g水平离心20min；离心后呈现不同的分层，用毛细血管吸取中性粒细胞层至新的离心管中；
(4)加入5-10mL PBS洗涤细胞，重复1-2次；
(5)采用PBS重悬细胞，并用台盼蓝染色，细胞计数板计数细胞数量。
2、人巨噬细胞焦亡的诱导
(1)人巨噬细胞系THP11x106，加入100nM的PMA进行过夜干预；
(2)去除上清，加入LPS(100μg/mL)在37℃孵育2小时；
(3)去掉上清，加入尼日利亚菌素10μM干预90min。
3、提取焦亡巨噬细胞产生的微囊泡
(1)收集诱导巨噬细胞焦亡的上清，2600g 4℃离心5min，去除细胞碎片及沉淀；
(2)收集(1)中离心后的上清，20000g 4℃离心20min，去除上清，收集的细胞沉淀为焦亡产生的外囊泡。
4、焦亡囊泡诱导NETs的形成
(1)将分离的人的中性粒细胞1x105种植于放置有细胞爬片的24孔板中；
(2)加入人焦亡巨噬细胞产生的外囊泡(4x106/mL)；
(3)放置在37℃培养箱中孵育3-4h。
实施例2
1、小鼠中性粒细胞的分离
(1)获取小鼠骨髓细胞，并用PBS重悬5mL；
(2)在离心管中加入3-5mL小鼠骨髓中性粒细胞分离液，然后缓慢将稀释重悬的骨髓细胞沿管壁滴入到分离液上层；
(3)室温条件下950g水平离心20min，离心后呈现不同的分层，用毛细血管吸取中性粒细胞层至新的离心管中；
(4)加入5-10mL PBS洗涤细胞，重复1-2次；
(5)采用PBS重悬细胞，并用台盼蓝染色，细胞计数板计数细胞数量。
2、小鼠巨噬细胞焦亡的诱导
(4)小鼠骨髓来源的BMDM，1x106，加入500ng/mL LPS刺激4.5h；
(5)去掉上清，加入尼日利亚菌素10μM干预2h。
3、提取焦亡巨噬细胞产生的微囊泡
(1)收集诱导巨噬细胞焦亡的上清，2600g 4℃离心5min，去除细胞碎片及沉淀；
(2)收集(1)中离心后的上清，20000g 4℃离心20min，去除上清，收集的细胞沉淀为焦亡产生的外囊泡。
4、焦亡囊泡诱导NETs的形成
(4)将分离的小鼠的中性粒细胞1x105种植于放置有细胞爬片的24孔板中；
(5)加入小鼠焦亡巨噬细胞产生的外囊泡(4x106/mL)；
(6)放置在37℃培养箱中孵育3-4h。
实施例3相关抑制剂的干预
(1)将上述实施例中分离的人或者小鼠中性粒细胞1x105种植于96孔板中；
(2)加入线粒体活性氧产生的特异性抑制剂MitoTEMPO(10μM)孵育1h；
(3)去掉上清后加入焦亡的囊泡(4x106/mL)，继续孵育3-4小时。
实施例4传统抑制剂的干预
(1)将上述实施例中分离的人或者小鼠中性粒细胞1x105种植于96孔板中；
(2)加入DNas I(传统的溶解NETs的试剂)(10U/mL)加孵育1h；
(3)去掉上清后加入焦亡的囊泡(4x106/mL)，继续孵育3-4小时。
结果分析
1、对本发明实施例1中提取焦亡巨噬细胞产生的微囊泡采用电镜检测，结果如附图1所示。
由图1可见：焦亡产生的微囊泡为大小不一的囊状结构，粒径在100nm-1000nm,其中箭头提示囊泡中包含形态类似线粒体的物质。
2、对本发明实施例1和实施例2中焦亡囊泡诱导形成的NETs检测：加入sytoxgreen探针，以正常巨噬细胞产生的微囊泡作为对照组，采用免疫荧光观察相关实验结果，结果如附图2-3所示。
由图2和3可知，加入正常巨噬细胞产生的微囊泡干预后，中性粒细胞NETs的产生与无干预组相比，并没有明显的差别。然而，加入焦亡巨噬细胞产生的微囊泡干预后，中性粒细胞NETs的产生较无干预组及正常巨噬细胞产生的微囊泡的干预组明显增多，主要表现在sytox green荧光增多。
3、对本发明实施例3经过加入线粒体活性氧产生的特异性抑制剂MitoTEMPO干扰后，加入sytox green后，用免疫荧光观察相关结果，结果如附图4-5所示。
由图4和5可见，经过焦亡巨噬细胞产生的微囊泡干预后，中性粒细胞的NETs的产生较无干预组及正常巨噬细胞产生的微囊泡的干预组明显增多，主要表现在sytox green荧光增多。而提前1小时使用MitoTEMPO干预后，再予焦亡巨噬细胞产生的微囊泡进行干预，则产生的NETs明显减少，主要表现在sytox green荧光减少。
而实施例4中用DNas I(传统的溶解NETs的试剂)作为抑制剂时(见图6)，效果为虽然可以减少NETs的形成，但是中性粒细胞已经破裂崩解，中性粒细胞已无法执行其他的功能，如吞噬及迁移功能，并且大量释放胞内的物质引起炎症反应。提示DNas I只对已经形成的NETs产生溶解作用，并不能对NETs的形成进行有效的阻断，而本发明中使用抑制剂MitoTEMPO，可以在NETs形成的上游进行阻断，中性粒细胞并没有破裂崩解，可以一定程度执行相关的功能。
显然，以上所述的具体实施方案，只是对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步的详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、同等替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.焦亡巨噬细胞微囊泡在制备体外诱导中性粒细胞产生胞外诱捕网的诱导剂中的应用。
2.根据权利要求1所述应用，其特征在于，诱导方法包括以下步骤：
S1、分离中性粒细胞；
S2、诱导巨噬细胞焦亡，提取焦亡巨噬细胞微囊泡；
S3、利用步骤S2所得焦亡巨噬细胞微囊泡诱导步骤S1分离的中性粒细胞，形成NETs。
3.根据权利要求2所述应用，其特征在于，步骤S1所述中性粒细胞和步骤S2所述巨噬细胞均来自哺乳动物。
4.根据权利要求2所述应用，其特征在于，步骤S1所述中性粒细胞来自人外周血或小鼠骨髓。
5.根据权利要求2所述应用，其特征在于，步骤S2所述巨噬细胞来源与人巨噬细胞系THP1或小鼠骨髓诱导的巨噬细胞。
6.根据权利要求2所述应用，其特征在于，步骤S3所述焦亡巨噬细胞微囊泡的浓度为9×105-4×106个/mL。
7.根据权利要求2所述应用，其特征在于，步骤S3所述诱导的时间为3-4h。
8.一种用于诱导中性粒细胞产生胞外诱捕网NETs的试剂盒，其特征在于，包括焦亡巨噬细胞微囊泡。
9.线粒体活性氧特异性抑制剂MitoTEMPO在制备用于阻断中性粒细胞胞外诱捕网形成的药物中的应用，其特征在于，所述胞外诱捕网由焦亡巨噬细胞微囊泡诱导形成。
10.根据权利要求9所述应用，其特征在于，所述药物用于治疗与NETs相关的疾病，所述疾病包括脓毒症、急性呼吸窘迫综合征、肺纤维化、肺栓塞、系统性红斑狼疮、慢性阻塞性肺疾病。
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