JPH06180311A - 皮膚刺激能の評価方法 - Google Patents
皮膚刺激能の評価方法Info
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- JPH06180311A JPH06180311A JP3721192A JP3721192A JPH06180311A JP H06180311 A JPH06180311 A JP H06180311A JP 3721192 A JP3721192 A JP 3721192A JP 3721192 A JP3721192 A JP 3721192A JP H06180311 A JPH06180311 A JP H06180311A
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- measured
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-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
- G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
- G01N33/5014—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing toxicity
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Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【目的】ヒト皮膚刺激の前臨床スクリーンとして使用し
うるインビトロ皮膚培養系において一連のアッセイを提
供する。 【構成】本方法は、ヒト皮膚刺激予測に関してドレイズ
ウサギ皮膚刺激試験に代わる又は追加しうるインビトロ
代替方法で、このインビトロモデルは医用グレードのナ
イロンメッシュ上に接種されたケラチン細胞及び繊維芽
細胞の三次元ヒト皮膚同時培養物（ＨｕＫ／Ｆ）からな
る。細胞毒性及び前炎症終点を用いた一連の皮膚刺激予
測アッセイが用いられる。これらのアッセイは皮膚と接
触する組成物、特にアニオン系、カチオン系及び非イオ
ン系界面活性剤を刺激ポテンシャルの順序について評価
するために用いられる。
うるインビトロ皮膚培養系において一連のアッセイを提
供する。 【構成】本方法は、ヒト皮膚刺激予測に関してドレイズ
ウサギ皮膚刺激試験に代わる又は追加しうるインビトロ
代替方法で、このインビトロモデルは医用グレードのナ
イロンメッシュ上に接種されたケラチン細胞及び繊維芽
細胞の三次元ヒト皮膚同時培養物（ＨｕＫ／Ｆ）からな
る。細胞毒性及び前炎症終点を用いた一連の皮膚刺激予
測アッセイが用いられる。これらのアッセイは皮膚と接
触する組成物、特にアニオン系、カチオン系及び非イオ
ン系界面活性剤を刺激ポテンシャルの順序について評価
するために用いられる。
Description
【０００１】技術分野 成分及び市販製品の皮膚刺激能の評価に関する皮膚培養
物の使用は動物試験に代わる実施可能な代替法を提供す
る。刺激能は細胞生存率、細胞毒性、グルコース利用率
及び前炎症媒介物質ＰＧＥ２（プロスタグランジンＥ
２）の放出の試験を用いてヒトケラチン細胞及び繊維芽
細胞の同時培養物で測定される。
物の使用は動物試験に代わる実施可能な代替法を提供す
る。刺激能は細胞生存率、細胞毒性、グルコース利用率
及び前炎症媒介物質ＰＧＥ２（プロスタグランジンＥ
２）の放出の試験を用いてヒトケラチン細胞及び繊維芽
細胞の同時培養物で測定される。
【０００２】発明の背景 すべての市販製品は毒性障害を生じる可能性を有する。
多くの様々な製品及び成分が皮膚と直接的又は間接的に
接触する。これらの製品成分及び処方物が皮膚刺激を生
じる可能性の評価はそれらの安全性のキー要素である。
安全性評価に対する多くのアプローチが開発されたが、
ほとんどの方法は動物モデルを用いて、動物からヒトま
で推断している。皮膚刺激試験のケースにおいて、ドレ
イズ(Draize)ウサギスキンパッチ試験はヒト接触前に物
質の刺激ポテンシャルを位置付ける上で歴史的な選択モ
デルであった。動物試験を禁じる工業及び取締者におけ
る現在の社会政治的圧力は、予測代替インビトロ方法が
特に皮膚及び眼刺激試験の分野で開発されることを要求
している〔Thompson,R.C.,Reducing the Need for Anim
al Testing,FDA Consumer,1988〕。消費者の安全性を確
保し続ける上でインビトロ代替試験に対する不可欠の必
要性がある。
多くの様々な製品及び成分が皮膚と直接的又は間接的に
接触する。これらの製品成分及び処方物が皮膚刺激を生
じる可能性の評価はそれらの安全性のキー要素である。
安全性評価に対する多くのアプローチが開発されたが、
ほとんどの方法は動物モデルを用いて、動物からヒトま
で推断している。皮膚刺激試験のケースにおいて、ドレ
イズ(Draize)ウサギスキンパッチ試験はヒト接触前に物
質の刺激ポテンシャルを位置付ける上で歴史的な選択モ
デルであった。動物試験を禁じる工業及び取締者におけ
る現在の社会政治的圧力は、予測代替インビトロ方法が
特に皮膚及び眼刺激試験の分野で開発されることを要求
している〔Thompson,R.C.,Reducing the Need for Anim
al Testing,FDA Consumer,1988〕。消費者の安全性を確
保し続ける上でインビトロ代替試験に対する不可欠の必
要性がある。
【０００３】インビトロ方法は、それらが刺激ポテンシ
ャルに関して物質を評価する上で短期間で非動物的な代
替方法を提供しかつ皮膚刺激のメカニズムを良く理解さ
せうることから興味ある〔Rowan,A.N.,Perspectives on
Alternatives to CurrentAnimal Testing Techniques
in Preclinical Toxicology （前臨床毒物学に関する現
動物試験技術に対する代替法の前途),Ann.Rev.Pharmaco
l.Toxicol.,25:225-47(1985)〕。典型的には、インビト
ロモデル開発は経験的アプローチであったが、興味ある
器官の構造及び機能の理解よりもむしろ相互関係に依存
している。しかしながら、ヒト皮膚細胞の培養方法に関
する最近の進歩のおかげで、再生ヒト皮膚に対する刺激
物質の効果を調べることは現在可能である。入手しうる
ヒト皮膚に最も近いインビトロアナログである市販培養
系が開発された。これらの培養物は有糸分裂的及び代謝
的に活性な真皮繊維芽細胞、天然分泌Ｉ及びIII 型コラ
ーゲン並びにラミニン及びIV型コラーゲン含有基底膜ゾ
ーンからなる多層真皮を含んでいる。多層表皮も同時培
養物中に存在する。
ャルに関して物質を評価する上で短期間で非動物的な代
替方法を提供しかつ皮膚刺激のメカニズムを良く理解さ
せうることから興味ある〔Rowan,A.N.,Perspectives on
Alternatives to CurrentAnimal Testing Techniques
in Preclinical Toxicology （前臨床毒物学に関する現
動物試験技術に対する代替法の前途),Ann.Rev.Pharmaco
l.Toxicol.,25:225-47(1985)〕。典型的には、インビト
ロモデル開発は経験的アプローチであったが、興味ある
器官の構造及び機能の理解よりもむしろ相互関係に依存
している。しかしながら、ヒト皮膚細胞の培養方法に関
する最近の進歩のおかげで、再生ヒト皮膚に対する刺激
物質の効果を調べることは現在可能である。入手しうる
ヒト皮膚に最も近いインビトロアナログである市販培養
系が開発された。これらの培養物は有糸分裂的及び代謝
的に活性な真皮繊維芽細胞、天然分泌Ｉ及びIII 型コラ
ーゲン並びにラミニン及びIV型コラーゲン含有基底膜ゾ
ーンからなる多層真皮を含んでいる。多層表皮も同時培
養物中に存在する。
【０００４】ヒト皮膚細胞単層及び同時培養“皮膚相当
物”で細胞毒性及び刺激能終点を利用した皮膚刺激の一
連の客観的定量バイオマーカーの開発が本発明の焦点で
ある。予測終点は評価基準を確立するため化学クラス内
で既知毒性に関して物質のランク付けを確立して、関連
新規物質の毒性を予測するために用いることができる。
更に、培養系はヒト皮膚刺激の絶対レベルを予測しうる
可能性を有している。終点は市販品のヒト皮膚培養物の
有用性を評価するために用いることもできる。皮膚相当
物は紅斑及び浮腫、例えば前炎症媒介物質としてＰＧＥ
２（プロスタグランジンＥ２）の放出のメカニズムに関
連した皮膚毒性情報を提供する。これらの系からの刺激
能データは調節機関に受容されるであろう。
物”で細胞毒性及び刺激能終点を利用した皮膚刺激の一
連の客観的定量バイオマーカーの開発が本発明の焦点で
ある。予測終点は評価基準を確立するため化学クラス内
で既知毒性に関して物質のランク付けを確立して、関連
新規物質の毒性を予測するために用いることができる。
更に、培養系はヒト皮膚刺激の絶対レベルを予測しうる
可能性を有している。終点は市販品のヒト皮膚培養物の
有用性を評価するために用いることもできる。皮膚相当
物は紅斑及び浮腫、例えば前炎症媒介物質としてＰＧＥ
２（プロスタグランジンＥ２）の放出のメカニズムに関
連した皮膚毒性情報を提供する。これらの系からの刺激
能データは調節機関に受容されるであろう。
【０００５】本発明の目的は以下の通りである： １）ヒト皮膚刺激の前臨床スクリーンとして使用しうる
インビトロ皮膚培養系において一連のアッセイを提供す
ること。これらのアッセイとしては細胞生存率、細胞毒
性、グルコース利用率及び前炎症媒介物質ＰＧＥ２の放
出の測定がある。 ２）インビトロにおける刺激物質ポテンシャルをランク
付けしてヒトインビボ皮膚刺激データとの相関関係を調
べるために、アニオン系、カチオン系及び非イオン系界
面活性剤及び他の刺激物質へのヒト皮膚培養物応答性を
評価する上でこの一連のアッセイを適用すること。 ３）単層培養物におけるヒト皮膚ケラチン細胞及び繊維
芽細胞の応答性を同時培養ヒト皮膚繊維芽細胞／ケラチ
ン細胞と比較すること。 これらの及び他の目的は以下の記載から明らかになるで
あろう。
インビトロ皮膚培養系において一連のアッセイを提供す
ること。これらのアッセイとしては細胞生存率、細胞毒
性、グルコース利用率及び前炎症媒介物質ＰＧＥ２の放
出の測定がある。 ２）インビトロにおける刺激物質ポテンシャルをランク
付けしてヒトインビボ皮膚刺激データとの相関関係を調
べるために、アニオン系、カチオン系及び非イオン系界
面活性剤及び他の刺激物質へのヒト皮膚培養物応答性を
評価する上でこの一連のアッセイを適用すること。 ３）単層培養物におけるヒト皮膚ケラチン細胞及び繊維
芽細胞の応答性を同時培養ヒト皮膚繊維芽細胞／ケラチ
ン細胞と比較すること。 これらの及び他の目的は以下の記載から明らかになるで
あろう。
【０００６】発明の要旨 本発明は２つの技術：１）生細胞のリソソーム中への生
体色素ニュートラルレッドの取込み；及び２）コンピテ
ントミトコンドリアを有した細胞の呼吸電子輸送鎖によ
るテトラゾリウム塩（ＭＴＴ）からホルマザン色素への
還元、による細胞生存率の評価を含む。皮膚と接触する
界面活性剤、界面活性剤含有製品及び他の物質の刺激ポ
テンシャルを測定する細胞毒性終点としては、ダメージ
のある細胞から培地への細胞質酵素乳酸デヒドロゲナー
ゼ（ＬＤＨ）の放出及びリソソーム酵素Ｎ‐アセチルグ
ルコサミニダーゼ（ＮＡＧＳ）の放出がある。プロスタ
グランジンＥ２（ＰＧＥ２）も前炎症状態のマーカーと
して測定できる。皮膚細胞によるグルコース利用率は代
謝活性の指標として用いられる。皮膚感受性及び皮膚上
における紫外線の効果もその方法で測定できる。
体色素ニュートラルレッドの取込み；及び２）コンピテ
ントミトコンドリアを有した細胞の呼吸電子輸送鎖によ
るテトラゾリウム塩（ＭＴＴ）からホルマザン色素への
還元、による細胞生存率の評価を含む。皮膚と接触する
界面活性剤、界面活性剤含有製品及び他の物質の刺激ポ
テンシャルを測定する細胞毒性終点としては、ダメージ
のある細胞から培地への細胞質酵素乳酸デヒドロゲナー
ゼ（ＬＤＨ）の放出及びリソソーム酵素Ｎ‐アセチルグ
ルコサミニダーゼ（ＮＡＧＳ）の放出がある。プロスタ
グランジンＥ２（ＰＧＥ２）も前炎症状態のマーカーと
して測定できる。皮膚細胞によるグルコース利用率は代
謝活性の指標として用いられる。皮膚感受性及び皮膚上
における紫外線の効果もその方法で測定できる。
【０００７】発明の具体的な説明 細胞培養物：不活性な医用グレードのナイロンメッシュ
上に接種されたヒト新生児包皮繊維芽細胞及びケラチン
細胞からなるヒト皮膚細胞同時培養物が用いられる。こ
れらはマロー‐テック(Marrow-Tech) 〔１０９３３ ノ
ース・トリー・パインズ・ロード，ラジョラ，カリフォ
ルニア ９２０３７(10933 NorthTorrey Pines Road,La
Jolla,California 92037) 〕から入手できる。フィルタ
ー上のコラーゲンマトリックスで増殖された同様の培養
物はオルガノゲネシス(Organogenesis) 〔８３ ロジャ
ース・ストリート，ケンブリッジ，マサチュセッツ０２
１４２(83 Rogers Street,Cambridge,Massachusetts 02
142)〕から入手できる。クローンティクス(Clonetics)
〔９６２０ チェサピーク・ドライブ，サンジエゴ，カ
リフォルニア９２１２３(9620 Chesapeake Drive,San D
iego，LaJolla,California 92123) 〕はヒト皮膚ケラチ
ン細胞及び真皮繊維芽細胞単層細胞培養モデルを有す
る。細胞同時培養物は空気と相互接触された場合に皮膚
と似た角質層を含むことができる。この層は分化したケ
ラチン細胞を有しており、皮膚相当物である。皮膚相当
培養物は、それらが攻撃性界面活性剤又はそれを含有し
た製品の経皮吸収モデルとして使用できることから、最
も好ましい。
上に接種されたヒト新生児包皮繊維芽細胞及びケラチン
細胞からなるヒト皮膚細胞同時培養物が用いられる。こ
れらはマロー‐テック(Marrow-Tech) 〔１０９３３ ノ
ース・トリー・パインズ・ロード，ラジョラ，カリフォ
ルニア ９２０３７(10933 NorthTorrey Pines Road,La
Jolla,California 92037) 〕から入手できる。フィルタ
ー上のコラーゲンマトリックスで増殖された同様の培養
物はオルガノゲネシス(Organogenesis) 〔８３ ロジャ
ース・ストリート，ケンブリッジ，マサチュセッツ０２
１４２(83 Rogers Street,Cambridge,Massachusetts 02
142)〕から入手できる。クローンティクス(Clonetics)
〔９６２０ チェサピーク・ドライブ，サンジエゴ，カ
リフォルニア９２１２３(9620 Chesapeake Drive,San D
iego，LaJolla,California 92123) 〕はヒト皮膚ケラチ
ン細胞及び真皮繊維芽細胞単層細胞培養モデルを有す
る。細胞同時培養物は空気と相互接触された場合に皮膚
と似た角質層を含むことができる。この層は分化したケ
ラチン細胞を有しており、皮膚相当物である。皮膚相当
培養物は、それらが攻撃性界面活性剤又はそれを含有し
た製品の経皮吸収モデルとして使用できることから、最
も好ましい。
【０００８】ここで用いられる“ＨｕＫ／Ｆ”とはこれ
らのヒト皮膚新生児包皮ケラチン細胞及び繊維芽細胞同
時培養物を意味する。ここで用いられる“ＨｕＫ”とは
ヒトケラチン細胞の細胞培養物を意味する。ここで用い
られる“ＨｕＦ”とはヒト繊維芽細胞の細胞培養物を意
味する。
らのヒト皮膚新生児包皮ケラチン細胞及び繊維芽細胞同
時培養物を意味する。ここで用いられる“ＨｕＫ”とは
ヒトケラチン細胞の細胞培養物を意味する。ここで用い
られる“ＨｕＦ”とはヒト繊維芽細胞の細胞培養物を意
味する。
【０００９】ヒト皮膚同時培養系は、それが形態学的に
ヒト皮膚に類似しているという点で、他の市販皮膚毒性
試験系以上の利点を有する。これは特に角質層を含む場
合にあてはまる。インビトロモデルに固有の１つの問題
は、細胞が増殖及び処理される水性培地において試験化
合物の溶解度、安定性及び生物物理学的効果に関する物
理的問題を細胞培養物が生じることである。角質層含有
皮膚培養物によれば細胞層の表面に試験物質を適用する
ことができる。毛細管チャンネル含有培養内皮細胞も細
胞の補給及びバイオマーカー放出のサンプリングのため
に培養物中に配合させることができる。メラニン細胞及
び肥満細胞のような炎症プロセスに関与する細胞も更に
良い応答性のため培養物中に配合してよい。
ヒト皮膚に類似しているという点で、他の市販皮膚毒性
試験系以上の利点を有する。これは特に角質層を含む場
合にあてはまる。インビトロモデルに固有の１つの問題
は、細胞が増殖及び処理される水性培地において試験化
合物の溶解度、安定性及び生物物理学的効果に関する物
理的問題を細胞培養物が生じることである。角質層含有
皮膚培養物によれば細胞層の表面に試験物質を適用する
ことができる。毛細管チャンネル含有培養内皮細胞も細
胞の補給及びバイオマーカー放出のサンプリングのため
に培養物中に配合させることができる。メラニン細胞及
び肥満細胞のような炎症プロセスに関与する細胞も更に
良い応答性のため培養物中に配合してよい。
【００１０】予備実験において、新生児（包皮）又は成
人（胸）皮膚いずれかの細胞を含有したＨｕＫ／Ｆ培養
物の応答性が比較された。新生児細胞は成人細胞の場合
よりもドデシル硫酸ナトリウムに対して一貫した応答性
を示した。ミキシング実験では、ケラチン細胞の増殖を
支持しうる成人真皮繊維芽細胞の能力に関してドナー毎
に変化があることを示唆した。この理由から、新生児Ｈ
ｕＫ／Ｆがより首尾一貫したモデルであり、したがって
好ましい。
人（胸）皮膚いずれかの細胞を含有したＨｕＫ／Ｆ培養
物の応答性が比較された。新生児細胞は成人細胞の場合
よりもドデシル硫酸ナトリウムに対して一貫した応答性
を示した。ミキシング実験では、ケラチン細胞の増殖を
支持しうる成人真皮繊維芽細胞の能力に関してドナー毎
に変化があることを示唆した。この理由から、新生児Ｈ
ｕＫ／Ｆがより首尾一貫したモデルであり、したがって
好ましい。
【００１１】皮膚刺激毒性学上における１つの大きな利
点はインビトロデータとの比較のためヒトデータの利用
可能性である。ヒト皮膚刺激データは主観的終点（即
ち、紅斑及び浮腫に関する視覚的皮膚等級付け、０〜４
グレード）に基づいている。我々の比較に用いられたデ
ータはNixon,G.A.,Bannon,E.A.,Gaynor,T.W.,Johnston,
D.H. and Griffith,J.F.,Evaluation of Modified Moth
ods for Determing SkinIrritation in Animals（動物
において皮膚刺激を測定するための修正法の評価),Regu
latory Toxicol.Pharmacol.,1990（印刷中）及びプロク
ター＆ギャンブル(Proctor & Gamble)からの未公開のデ
ータを含めた様々な出典に基づく。ヒトスコアは用量濃
度に換算された。ＨｕＫ／Ｆ培養物で測定された細胞毒
性終点とヒト皮膚応答性との相互関係は界面活性剤とし
て知られている種類の物質に対するヒト皮膚応答性に関
しての予測可能性を示す。図４及び５参照。
点はインビトロデータとの比較のためヒトデータの利用
可能性である。ヒト皮膚刺激データは主観的終点（即
ち、紅斑及び浮腫に関する視覚的皮膚等級付け、０〜４
グレード）に基づいている。我々の比較に用いられたデ
ータはNixon,G.A.,Bannon,E.A.,Gaynor,T.W.,Johnston,
D.H. and Griffith,J.F.,Evaluation of Modified Moth
ods for Determing SkinIrritation in Animals（動物
において皮膚刺激を測定するための修正法の評価),Regu
latory Toxicol.Pharmacol.,1990（印刷中）及びプロク
ター＆ギャンブル(Proctor & Gamble)からの未公開のデ
ータを含めた様々な出典に基づく。ヒトスコアは用量濃
度に換算された。ＨｕＫ／Ｆ培養物で測定された細胞毒
性終点とヒト皮膚応答性との相互関係は界面活性剤とし
て知られている種類の物質に対するヒト皮膚応答性に関
しての予測可能性を示す。図４及び５参照。
【００１２】細胞培養物は下記のように維持できる：培
養物は、非必須アミノ酸〔ギブコ(Gibco) カタログ＃３
２０‐１１４ＡＧ、１×最終濃度〕、Ｌ‐グルタミン
〔セルグロ(Cellgro) カタログ＃２５‐００５‐Ｌ１、
１×最終濃度〕、抗生物質／抗真菌剤（ギブコカタログ
＃６００‐５２４０‐ＡＧ、１×最終濃度）及びウルト
ロサー‐Ｇ(Ultroser-G)代替血清（ＩＢＦ、カタログ＃
２５９５０１、１‐１０mlボトル／５００ml培地）を含
有した修正イーグル培地が加えられたダルベッコ修正イ
ーグル培地（セルグロカタログ＃１５‐０１３‐ＬＭ）
からなる培地（２ml／ウェル）を含んだ２４ウェルプレ
ート〔コーニング(corning) カタログ＃２５８２０〕中
に無菌的に入れられる。すべての培養物は実験全体にわ
たり３７℃で５％二酸化炭素（ＣＯ２）下湿潤雰囲気中
〔フィッシャー(Fisher)ＣＯ２インキュベーターモデル
＃６１０〕で維持される。培地は処理前に２日毎で無菌
的〔ベーカー・フード(Baker Food)〕に変えられる（２
ml増殖培地／ウェル）。通常、培養物は業者から到着後
１週間以内に実験に用いられる。これらの増殖培地は当
業界で周知であり、それは細胞生存及び細胞増殖を維持
するために使用できる培地を決定する上で生物学者の技
術的範囲内に属する。培地は必須細胞栄養素を含有して
いる。一部の試験において同時培養物は不要である。ヒ
ト繊維芽細胞培養物又はヒトケラチン細胞培養物が使用
可能である。これらの培養物を使用する前に、細胞スト
ックはトリプシンで処理され、継代培養される。
養物は、非必須アミノ酸〔ギブコ(Gibco) カタログ＃３
２０‐１１４ＡＧ、１×最終濃度〕、Ｌ‐グルタミン
〔セルグロ(Cellgro) カタログ＃２５‐００５‐Ｌ１、
１×最終濃度〕、抗生物質／抗真菌剤（ギブコカタログ
＃６００‐５２４０‐ＡＧ、１×最終濃度）及びウルト
ロサー‐Ｇ(Ultroser-G)代替血清（ＩＢＦ、カタログ＃
２５９５０１、１‐１０mlボトル／５００ml培地）を含
有した修正イーグル培地が加えられたダルベッコ修正イ
ーグル培地（セルグロカタログ＃１５‐０１３‐ＬＭ）
からなる培地（２ml／ウェル）を含んだ２４ウェルプレ
ート〔コーニング(corning) カタログ＃２５８２０〕中
に無菌的に入れられる。すべての培養物は実験全体にわ
たり３７℃で５％二酸化炭素（ＣＯ２）下湿潤雰囲気中
〔フィッシャー(Fisher)ＣＯ２インキュベーターモデル
＃６１０〕で維持される。培地は処理前に２日毎で無菌
的〔ベーカー・フード(Baker Food)〕に変えられる（２
ml増殖培地／ウェル）。通常、培養物は業者から到着後
１週間以内に実験に用いられる。これらの増殖培地は当
業界で周知であり、それは細胞生存及び細胞増殖を維持
するために使用できる培地を決定する上で生物学者の技
術的範囲内に属する。培地は必須細胞栄養素を含有して
いる。一部の試験において同時培養物は不要である。ヒ
ト繊維芽細胞培養物又はヒトケラチン細胞培養物が使用
可能である。これらの培養物を使用する前に、細胞スト
ックはトリプシンで処理され、継代培養される。
【００１３】ヒト新生児繊維芽細胞は１０％牛胎児血清
（ＦＢＳ）（マロウ‐テック製）で補充されたダルベッ
コ修正イーグル培地（ＤＭＥＭ）で増殖される。この維
持培地は前記同時培養物に関して記載されたものと同様
の処方であるが、但し２％ウルトロサー‐Ｇ培地の代わ
りに１０％ＦＢＳを用いる。処理２４時間前に繊維芽細
胞はＰＢＳ洗浄細胞上に０．２５％トリプシン（ギブ
コ、トリプシンＥＤＴＡ、カタログ＃６１０‐５２００
ＡＧ）〕２mlを入れることでトリプシン処理される。約
１分間後にトリプシンは吸引され、細胞は培養皿からの
回収及び放出のために顕微鏡で観察される。放出された
細胞はトリプシンを中和するため１０％ＦＢＳ／ＤＭＥ
Ｍ含有５０ml円錐管中に洗い出され、２００ｇで１０分
間遠心される。培地は吸引され、細胞ペレットはコール
ター・マルチサイザー(CoulterMultisizer) でカウント
するため再懸濁される。細胞は１０％ＦＢＳ／ＤＭＥＭ
で更に希釈され、２４ウェルコーニング培養プレートに
入れられる（約３３，０００細胞／試験ウェル）。ヒト
新生児包皮ケラチン細胞は表皮増殖因子、インシュリ
ン、ヒドロコルチゾン、抗真菌剤で完成されたケラチン
細胞増殖培地‐ＫＧＭで増殖され、牛下垂体抽出物で補
充される（この培地はクローンティクスから入手でき
る）。培養物は実験全体にわたり３７℃で５％二酸化炭
素下湿潤雰囲気中で維持される。処理４日前にケラチン
細胞はトリプシン処理され、継代培養される。ＫＧＭ培
地が用いられ、クローンティクス試薬及び方法がそれら
の標準プロトコールどおりに用いられる。細胞は２４ウ
ェルコーニング培養プレートに約３３，０００細胞／ウ
ェルの密度で入れられる。
（ＦＢＳ）（マロウ‐テック製）で補充されたダルベッ
コ修正イーグル培地（ＤＭＥＭ）で増殖される。この維
持培地は前記同時培養物に関して記載されたものと同様
の処方であるが、但し２％ウルトロサー‐Ｇ培地の代わ
りに１０％ＦＢＳを用いる。処理２４時間前に繊維芽細
胞はＰＢＳ洗浄細胞上に０．２５％トリプシン（ギブ
コ、トリプシンＥＤＴＡ、カタログ＃６１０‐５２００
ＡＧ）〕２mlを入れることでトリプシン処理される。約
１分間後にトリプシンは吸引され、細胞は培養皿からの
回収及び放出のために顕微鏡で観察される。放出された
細胞はトリプシンを中和するため１０％ＦＢＳ／ＤＭＥ
Ｍ含有５０ml円錐管中に洗い出され、２００ｇで１０分
間遠心される。培地は吸引され、細胞ペレットはコール
ター・マルチサイザー(CoulterMultisizer) でカウント
するため再懸濁される。細胞は１０％ＦＢＳ／ＤＭＥＭ
で更に希釈され、２４ウェルコーニング培養プレートに
入れられる（約３３，０００細胞／試験ウェル）。ヒト
新生児包皮ケラチン細胞は表皮増殖因子、インシュリ
ン、ヒドロコルチゾン、抗真菌剤で完成されたケラチン
細胞増殖培地‐ＫＧＭで増殖され、牛下垂体抽出物で補
充される（この培地はクローンティクスから入手でき
る）。培養物は実験全体にわたり３７℃で５％二酸化炭
素下湿潤雰囲気中で維持される。処理４日前にケラチン
細胞はトリプシン処理され、継代培養される。ＫＧＭ培
地が用いられ、クローンティクス試薬及び方法がそれら
の標準プロトコールどおりに用いられる。細胞は２４ウ
ェルコーニング培養プレートに約３３，０００細胞／ウ
ェルの密度で入れられる。
【００１４】皮膚モデルでの評価用に選択される終点の
一部は、動物及びヒト皮膚及び皮膚培養物に関して、他
の研究者により、関連していることが示された〔Gibso
n,W.T.and Teal,M.R.,Interactions of C12 Surfactant
s with the Skin:Changes inEnzymes and Visible Hist
ological Featurea of Rat Skin Treated withSodium L
auryl Sulfate （Ｃ１２界面活性剤と皮膚との相互作
用：酵素に関する変化及びラウリル硫酸ナトリウムで処
理されたラット皮膚の視覚組織学的特徴),Fd.Chem.Toxi
c.,21:587-594,1983;Csato',M.,Rosenbach,T,Grabbe,J.
andCzarnetski,B.M.,Epidermal Scales;Are They a Was
tebasket of InflammatoryMediators or Active Partic
ipants in Epidermal Inflammation ?（表皮スケール：
それらは表皮炎症における炎症媒介物質又は活性関係物
質のくずかごか？),Int.J.Derm.,28:86-89,1989 〕。
一部は、動物及びヒト皮膚及び皮膚培養物に関して、他
の研究者により、関連していることが示された〔Gibso
n,W.T.and Teal,M.R.,Interactions of C12 Surfactant
s with the Skin:Changes inEnzymes and Visible Hist
ological Featurea of Rat Skin Treated withSodium L
auryl Sulfate （Ｃ１２界面活性剤と皮膚との相互作
用：酵素に関する変化及びラウリル硫酸ナトリウムで処
理されたラット皮膚の視覚組織学的特徴),Fd.Chem.Toxi
c.,21:587-594,1983;Csato',M.,Rosenbach,T,Grabbe,J.
andCzarnetski,B.M.,Epidermal Scales;Are They a Was
tebasket of InflammatoryMediators or Active Partic
ipants in Epidermal Inflammation ?（表皮スケール：
それらは表皮炎症における炎症媒介物質又は活性関係物
質のくずかごか？),Int.J.Derm.,28:86-89,1989 〕。
【００１５】本発明において用いられる“ＰＧＥ２”と
はプロスタグランジンＥ２を意味する。ＰＧＥ２の場
合、我々の研究では、マウス皮膚モデルにおいて、この
エイコセノイドが、独特な非侵襲性サンプリング技術を
用いてドデシル硫酸ナトリウムにより処理された完全な
マウス皮膚で検出されうることを示した。同様のサンプ
リング技術を用いたヒト皮膚臨床試験では、ヒト皮膚に
おけるＰＧＥ２レベルが界面活性剤接触で増加すること
を示した。このデータは、ＰＧＥ２がヒト臨床結果と直
接関連した優れたインビトロバイオマーカーであること
を示している。界面活性剤への応答性に関するＰＧＥ２
産生の促進は、その培養物が刺激物質誘導皮膚炎症の分
子及び細胞経路を研究する上で有用であり、したがって
皮膚刺激を評価する機械的アプローチを提供しうること
を示している。
はプロスタグランジンＥ２を意味する。ＰＧＥ２の場
合、我々の研究では、マウス皮膚モデルにおいて、この
エイコセノイドが、独特な非侵襲性サンプリング技術を
用いてドデシル硫酸ナトリウムにより処理された完全な
マウス皮膚で検出されうることを示した。同様のサンプ
リング技術を用いたヒト皮膚臨床試験では、ヒト皮膚に
おけるＰＧＥ２レベルが界面活性剤接触で増加すること
を示した。このデータは、ＰＧＥ２がヒト臨床結果と直
接関連した優れたインビトロバイオマーカーであること
を示している。界面活性剤への応答性に関するＰＧＥ２
産生の促進は、その培養物が刺激物質誘導皮膚炎症の分
子及び細胞経路を研究する上で有用であり、したがって
皮膚刺激を評価する機械的アプローチを提供しうること
を示している。
【００１６】ヒト表皮ケラチン細胞（ＨｕＫ）、真皮繊
維芽細胞（ＨｕＦ）及びＨｕＫ／Ｆ同時培養物又は“皮
膚相当物”に関する細胞毒性及び刺激能終点を利用した
皮膚刺激の一連の客観的定量バイオマーカーの開発は、
界面活性剤、即ち、多くのクリーニング及び皮膚ケア製
品中の重要な成分、で処理された皮膚培養物からの細胞
及び培地の評価に基づいている。細胞生存率に関するＭ
ＴＴアッセイ（機能性ミトコンドリアによるテトラゾリ
ウム色素の還元に基づく）は生細胞のリソソーム中への
ＮＲ色素の取込みに基づくニュートラルレッドアッセイ
（以下、“ＮＲ”と称される）よりも好ましい。その優
越性はＭＴＴの大きな最大取込み及びＭＴＴ対ＮＲに関
するナイロンメッシュへの色素の低い非特異的結合性に
基づく。プロトタイプ原型界面活性剤のドデシル硫酸ナ
トリウムに対する応答性は処理後４時間ほどの早期でみ
られ、２４〜４８時間で最大であり、７２時間以内にわ
たり維持される。“処理の有効時間”は結果をみる上で
必要な時間の量である。これは通常４〜７２時間であ
る。最大の結果は通常２４〜４８時間で明らかである。
４８時間処理されたＨｕＫ／Ｆ培養物において、試験さ
れた物質との応答により細胞生存率（ＭＴＴ取込み）、
細胞毒性（乳酸デヒドロゲナーゼ‐ＬＤＨ及びＮ‐アセ
チルグルコサミニダーゼ‐ＮＡＧＳ放出）、グルコース
利用率及びプロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）産生に
関して用量依存的変化がある。界面活性剤との応答性に
関する終点の間に、及び界面活性剤に対するインビトロ
応答性とヒト皮膚刺激応答性との間に密接な相関関係が
ある（図４及び５）。ＨｕＫ及びＨｕＦ細胞は、これら
の細胞はＨｕＫ／Ｆ培養物よりも約１０倍感受的であっ
たが、細胞生存率に関し用量依存的に減少してドデシル
硫酸ナトリウムに応答した。これらのデータは、ケラチ
ン細胞及び繊維芽細胞が各々ＨｕＫ／Ｆ同時培養物で観
察された応答性に一部関与していることを示す。
維芽細胞（ＨｕＦ）及びＨｕＫ／Ｆ同時培養物又は“皮
膚相当物”に関する細胞毒性及び刺激能終点を利用した
皮膚刺激の一連の客観的定量バイオマーカーの開発は、
界面活性剤、即ち、多くのクリーニング及び皮膚ケア製
品中の重要な成分、で処理された皮膚培養物からの細胞
及び培地の評価に基づいている。細胞生存率に関するＭ
ＴＴアッセイ（機能性ミトコンドリアによるテトラゾリ
ウム色素の還元に基づく）は生細胞のリソソーム中への
ＮＲ色素の取込みに基づくニュートラルレッドアッセイ
（以下、“ＮＲ”と称される）よりも好ましい。その優
越性はＭＴＴの大きな最大取込み及びＭＴＴ対ＮＲに関
するナイロンメッシュへの色素の低い非特異的結合性に
基づく。プロトタイプ原型界面活性剤のドデシル硫酸ナ
トリウムに対する応答性は処理後４時間ほどの早期でみ
られ、２４〜４８時間で最大であり、７２時間以内にわ
たり維持される。“処理の有効時間”は結果をみる上で
必要な時間の量である。これは通常４〜７２時間であ
る。最大の結果は通常２４〜４８時間で明らかである。
４８時間処理されたＨｕＫ／Ｆ培養物において、試験さ
れた物質との応答により細胞生存率（ＭＴＴ取込み）、
細胞毒性（乳酸デヒドロゲナーゼ‐ＬＤＨ及びＮ‐アセ
チルグルコサミニダーゼ‐ＮＡＧＳ放出）、グルコース
利用率及びプロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）産生に
関して用量依存的変化がある。界面活性剤との応答性に
関する終点の間に、及び界面活性剤に対するインビトロ
応答性とヒト皮膚刺激応答性との間に密接な相関関係が
ある（図４及び５）。ＨｕＫ及びＨｕＦ細胞は、これら
の細胞はＨｕＫ／Ｆ培養物よりも約１０倍感受的であっ
たが、細胞生存率に関し用量依存的に減少してドデシル
硫酸ナトリウムに応答した。これらのデータは、ケラチ
ン細胞及び繊維芽細胞が各々ＨｕＫ／Ｆ同時培養物で観
察された応答性に一部関与していることを示す。
【００１７】ここで記載された方法は皮膚と接触する様
々な物質を試験するために用いることができる。これら
には界面活性剤（アニオン系、カチオン系又は非イオン
系）とこれらの界面活性剤を含有した製品、例えばシャ
ンプー、洗剤、布帛柔軟剤、コンディショナー、食器洗
浄液、スキンクレンザー、クリーニング剤及びスキンケ
ア品目がある。皮膚と接触する他の物質及び製品も試験
できる。これらにはパーマネントウェーブ溶液、直毛
剤、毛染め剤、化粧品、保湿剤と、化粧品、クリーニン
グ剤、日焼け止め剤及び日焼け剤で用いられる着色剤及
び色素がある。これらの物質はすべて皮膚刺激を起こす
可能性を有する。アッセイ及び試験方法に関する以下の
記載は界面活性剤で説明される。しかしながら、方法論
の記載から明らかなように、それは皮膚と接触する他の
成分又は製品に適用してもよい。
々な物質を試験するために用いることができる。これら
には界面活性剤（アニオン系、カチオン系又は非イオン
系）とこれらの界面活性剤を含有した製品、例えばシャ
ンプー、洗剤、布帛柔軟剤、コンディショナー、食器洗
浄液、スキンクレンザー、クリーニング剤及びスキンケ
ア品目がある。皮膚と接触する他の物質及び製品も試験
できる。これらにはパーマネントウェーブ溶液、直毛
剤、毛染め剤、化粧品、保湿剤と、化粧品、クリーニン
グ剤、日焼け止め剤及び日焼け剤で用いられる着色剤及
び色素がある。これらの物質はすべて皮膚刺激を起こす
可能性を有する。アッセイ及び試験方法に関する以下の
記載は界面活性剤で説明される。しかしながら、方法論
の記載から明らかなように、それは皮膚と接触する他の
成分又は製品に適用してもよい。
【００１８】試験物質調製 ０．０１％ドデシル硫酸ナトリウム〔ドデシル硫酸ナト
リウム、シグマ(Sigma) ＃Ｌ‐４５０９〕の陽性コント
ロールは各試験プレートの陽性内部コントロールとして
含有される。ドデシル硫酸ナトリウム１００mgを無菌脱
イオン蒸留水〔ラボ‐５‐テクニック(Lab-5-Technic)
〕１０mlに攪拌しながら溶解し、０．２ミクロンフィ
ルター〔ナルゲン(Nalgene) 、１５０ml〕を用いて無菌
濾過する。１％ストックを適量の培地で（１：１００）
希釈して、０．０１％ドデシル硫酸ナトリウム処理溶液
を得る。各試験物質の無菌ストック溶液を培地で調製す
る。サンプルを必要に応じ高速で攪拌又は音波処理して
試験物質を溶解し、しかる後細胞処理前３７℃に前加温
する。試験溶液希釈液を適切な希釈倍率でマロウ‐テッ
ク中にて、又は無菌ストック溶液からの類似細胞培地中
にて調製する。最高濃度の試験溶液のｐＨ〔オリオン・
モデル(Orion Model) ＥＡ９２０ｐＨ電極〕及び浸透圧
〔ウェスコー(Wescor)５５００蒸気圧浸透圧計で測定さ
れる〕を記録する。
リウム、シグマ(Sigma) ＃Ｌ‐４５０９〕の陽性コント
ロールは各試験プレートの陽性内部コントロールとして
含有される。ドデシル硫酸ナトリウム１００mgを無菌脱
イオン蒸留水〔ラボ‐５‐テクニック(Lab-5-Technic)
〕１０mlに攪拌しながら溶解し、０．２ミクロンフィ
ルター〔ナルゲン(Nalgene) 、１５０ml〕を用いて無菌
濾過する。１％ストックを適量の培地で（１：１００）
希釈して、０．０１％ドデシル硫酸ナトリウム処理溶液
を得る。各試験物質の無菌ストック溶液を培地で調製す
る。サンプルを必要に応じ高速で攪拌又は音波処理して
試験物質を溶解し、しかる後細胞処理前３７℃に前加温
する。試験溶液希釈液を適切な希釈倍率でマロウ‐テッ
ク中にて、又は無菌ストック溶液からの類似細胞培地中
にて調製する。最高濃度の試験溶液のｐＨ〔オリオン・
モデル(Orion Model) ＥＡ９２０ｐＨ電極〕及び浸透圧
〔ウェスコー(Wescor)５５００蒸気圧浸透圧計で測定さ
れる〕を記録する。
【００１９】処理 各ＨｕＫ／Ｆ実験のため、２４ウェルプレートにおいて
１試験物質を４濃度（各濃度につき４ウェル）で評価す
る。加えて、４ウェルは培地コントロールとして、４ウ
ェルはドデシル硫酸ナトリウム陽性コントロールとして
使う。評価される各物質に関して、用量範囲調査研究
は、細胞生存率のＭＴＴアッセイで最少及び最大細胞毒
性を示す濃度について調べるため０．００１、０．０
１、０．１及び１．０％(w/v) 濃度で行われる。用量範
囲調査研究に基づき、試験物質濃度の範囲は、細胞生存
率のＭＴＴアッセイで最少及び最大細胞毒性を示す濃度
について調べるために選択される。用量範囲調査研究に
基づき、濃度は最大細胞毒性レベル及び最少レベルでか
つこれらの濃度間において２1/3 ｌｏｇ間隔で選択され
る（例えば、最大毒性が１％であり、細胞毒性又は細胞
死が０．１％でみられなかった場合には、その後で評価
される濃度は０．１、０．３、０．６及び１％にな
る）。処理日に、増殖培地を無菌的に吸引し、細胞メッ
シュを２ml試験培地／ウェルで処理する。培地単独は無
処理コントロールとして働き、０．０１％ドデシル硫酸
ナトリウムは陽性コントロールとして働いた（ｎ＝４ウ
ェル／群）。すべての試験プレートを３７℃で５％二酸
化炭素下４〜７２時間インキュベートする。観察（例え
ば、培地の色に関する変化）は処理期間中にわたり行
う。
１試験物質を４濃度（各濃度につき４ウェル）で評価す
る。加えて、４ウェルは培地コントロールとして、４ウ
ェルはドデシル硫酸ナトリウム陽性コントロールとして
使う。評価される各物質に関して、用量範囲調査研究
は、細胞生存率のＭＴＴアッセイで最少及び最大細胞毒
性を示す濃度について調べるため０．００１、０．０
１、０．１及び１．０％(w/v) 濃度で行われる。用量範
囲調査研究に基づき、試験物質濃度の範囲は、細胞生存
率のＭＴＴアッセイで最少及び最大細胞毒性を示す濃度
について調べるために選択される。用量範囲調査研究に
基づき、濃度は最大細胞毒性レベル及び最少レベルでか
つこれらの濃度間において２1/3 ｌｏｇ間隔で選択され
る（例えば、最大毒性が１％であり、細胞毒性又は細胞
死が０．１％でみられなかった場合には、その後で評価
される濃度は０．１、０．３、０．６及び１％にな
る）。処理日に、増殖培地を無菌的に吸引し、細胞メッ
シュを２ml試験培地／ウェルで処理する。培地単独は無
処理コントロールとして働き、０．０１％ドデシル硫酸
ナトリウムは陽性コントロールとして働いた（ｎ＝４ウ
ェル／群）。すべての試験プレートを３７℃で５％二酸
化炭素下４〜７２時間インキュベートする。観察（例え
ば、培地の色に関する変化）は処理期間中にわたり行
う。
【００２０】サンプル回収及び分析 処理期間（通常４８時間）後に培地サンプルを集め（２
ml／ウェル）、個別的に標識された冷凍管（コーニング
カタログ＃２５７０２から入手できる）内に１mlずつ２
つに分ける。１mlサンプルは日立７０５自動分析機で自
動化されたベーリンガー・マンハイム・バイオケミカル
ズ(Boehringer-Mannheim biochemicals)を用いて乳酸デ
ヒドロゲナーゼ、Ｎ‐アセチルグルコサミニダーゼ及び
グルコースに関して分析する。第二の１mlサンプルは窒
素でパージし、直ちにドライアイス上におき、−７０℃
で凍結貯蔵する。次いでこれらのサンプルをラジオイム
ノアッセイ〔アドバンスド・マグネチックス(Advanced
Magnetics)キット＃６００１〕によりプロスタグランジ
ンＥ２に関して分析する。
ml／ウェル）、個別的に標識された冷凍管（コーニング
カタログ＃２５７０２から入手できる）内に１mlずつ２
つに分ける。１mlサンプルは日立７０５自動分析機で自
動化されたベーリンガー・マンハイム・バイオケミカル
ズ(Boehringer-Mannheim biochemicals)を用いて乳酸デ
ヒドロゲナーゼ、Ｎ‐アセチルグルコサミニダーゼ及び
グルコースに関して分析する。第二の１mlサンプルは窒
素でパージし、直ちにドライアイス上におき、−７０℃
で凍結貯蔵する。次いでこれらのサンプルをラジオイム
ノアッセイ〔アドバンスド・マグネチックス(Advanced
Magnetics)キット＃６００１〕によりプロスタグランジ
ンＥ２に関して分析する。
【００２１】細胞生存率アッセイ ＨｕＫ／Ｆ同時培養物での予備実験において、細胞生存
率を測定する２つの生体色素アッセイが使用できる。ニ
ュートラルレッドアッセイでは生細胞のリソソーム中へ
のニュートラルレッドの取込みについて測定する。ＭＴ
Ｔアッセイでは生細胞のミトコンドリアにおける電子輸
送によるテトラゾリウム色素の還元、しかる後ホルマザ
ン生成物の細胞内捕捉について測定する。 １．ＭＴＴアッセイはMossmann,T.,Rapid Colorimetric
Assay for CellularGrowth and Survival:Application
to proliferation and cytotoxicity assays（細胞増
殖及び生存に関する急速比色定量アッセイ：増殖及び細
胞毒性アッセイへの適用),Journal of Immunological M
ethods,65:55-63(1983) で記載された方法から適合化さ
れた。それは細胞生存率の測定であり、それは培地回収
直後にすべての処理メッシュ上で行われる。ＭＴＴアッ
セイでは機能性ミトコンドリアの電子輸送鎖で紫色ホル
マザン色素に還元される黄色テトラゾリウム色素の還元
しかる後捕捉について定量する。簡単にいえば、ＭＴＴ
（３‐〔４，５‐ジメチルチアゾール‐２‐イル〕‐
２，５‐ジフェニルテトラゾリウムブロミド；シグマカ
タログ＃Ｍ‐２１２８）粉末を細胞培地で希釈し（０．
５mg/ml)、使用前に３７℃まで前加温する。この色素溶
液１mlを各メッシュ上で等分し、しかる後メッシュを３
７℃で５％ＣＯ２下３時間インキュベートする。インキ
ュベート後、ＭＴＴを吸引し、純粋イソプロパノール２
mlを用いて室温で２時間かけ還元された色素を抽出す
る。メッシュを培養ウェルから除去し、抽出溶媒を吸光
度読取りのため等分化前に攪拌して混ぜる。各抽出物の
吸光度はバイオテック(Biotek)ＥＬ‐３１２（９６ウェ
ル）スペクトル測定器において５４０nmで読取る。
率を測定する２つの生体色素アッセイが使用できる。ニ
ュートラルレッドアッセイでは生細胞のリソソーム中へ
のニュートラルレッドの取込みについて測定する。ＭＴ
Ｔアッセイでは生細胞のミトコンドリアにおける電子輸
送によるテトラゾリウム色素の還元、しかる後ホルマザ
ン生成物の細胞内捕捉について測定する。 １．ＭＴＴアッセイはMossmann,T.,Rapid Colorimetric
Assay for CellularGrowth and Survival:Application
to proliferation and cytotoxicity assays（細胞増
殖及び生存に関する急速比色定量アッセイ：増殖及び細
胞毒性アッセイへの適用),Journal of Immunological M
ethods,65:55-63(1983) で記載された方法から適合化さ
れた。それは細胞生存率の測定であり、それは培地回収
直後にすべての処理メッシュ上で行われる。ＭＴＴアッ
セイでは機能性ミトコンドリアの電子輸送鎖で紫色ホル
マザン色素に還元される黄色テトラゾリウム色素の還元
しかる後捕捉について定量する。簡単にいえば、ＭＴＴ
（３‐〔４，５‐ジメチルチアゾール‐２‐イル〕‐
２，５‐ジフェニルテトラゾリウムブロミド；シグマカ
タログ＃Ｍ‐２１２８）粉末を細胞培地で希釈し（０．
５mg/ml)、使用前に３７℃まで前加温する。この色素溶
液１mlを各メッシュ上で等分し、しかる後メッシュを３
７℃で５％ＣＯ２下３時間インキュベートする。インキ
ュベート後、ＭＴＴを吸引し、純粋イソプロパノール２
mlを用いて室温で２時間かけ還元された色素を抽出す
る。メッシュを培養ウェルから除去し、抽出溶媒を吸光
度読取りのため等分化前に攪拌して混ぜる。各抽出物の
吸光度はバイオテック(Biotek)ＥＬ‐３１２（９６ウェ
ル）スペクトル測定器において５４０nmで読取る。
【００２２】２．ニュートラルレッドバイオアッセイは
Borenfreund,E.and Puerner,J.,A Simple Quantitative
Procedure Using Monolayer Cultures forCytotoxicit
y Assays(HTD/NR-90)（細胞毒性アッセイのために単層
培養物を用いる簡単な定量操作),J.Tissue Cult.Meth.,
9(1):7-9(1984)で記載されている。それは無血清条件下
で増殖された正常ヒト表皮ケラチン細胞（ＮＨＥＫ又は
ＨｕＫ）に対する試験物質の毒性を定量測定するように
考えられている。ニュートラルレッドは細胞の形質膜を
通過して生細胞のリソソーム中に取り込まれる水溶性色
素である。ニュートラルレッド（３‐アミノ‐７‐ジメ
チルアミノ‐２‐メチルフェナジン塩酸、シグマカタロ
グ＃Ｎ２８８９）は同時培養物のとき細胞培地で又はケ
ラチン単層細胞の場合にはＫＧＭ培地で調製される（５
０μg/ml）。細胞は標準ニュートラルレッドアッセイ法
を用いて評価される。同時培養物の場合このアッセイは
Borenfreund博士により記載されたように行われるが、
但しＭＴＴアッセイに関して前記されたような修正、例
えばメッシュの除去が行われる。
Borenfreund,E.and Puerner,J.,A Simple Quantitative
Procedure Using Monolayer Cultures forCytotoxicit
y Assays(HTD/NR-90)（細胞毒性アッセイのために単層
培養物を用いる簡単な定量操作),J.Tissue Cult.Meth.,
9(1):7-9(1984)で記載されている。それは無血清条件下
で増殖された正常ヒト表皮ケラチン細胞（ＮＨＥＫ又は
ＨｕＫ）に対する試験物質の毒性を定量測定するように
考えられている。ニュートラルレッドは細胞の形質膜を
通過して生細胞のリソソーム中に取り込まれる水溶性色
素である。ニュートラルレッド（３‐アミノ‐７‐ジメ
チルアミノ‐２‐メチルフェナジン塩酸、シグマカタロ
グ＃Ｎ２８８９）は同時培養物のとき細胞培地で又はケ
ラチン単層細胞の場合にはＫＧＭ培地で調製される（５
０μg/ml）。細胞は標準ニュートラルレッドアッセイ法
を用いて評価される。同時培養物の場合このアッセイは
Borenfreund博士により記載されたように行われるが、
但しＭＴＴアッセイに関して前記されたような修正、例
えばメッシュの除去が行われる。
【００２３】ニュートラルレッド取込み（ＮＲ）をコン
トロール培養物におけるＭＴＴと比較し、培養物を０．
０１％ドデシル硫酸ナトリウム又は濃度１％の塩化ベン
ザルコニウム、塩化ベンゼトニウム及びツイーン２０で
処理する。これらの濃度は最大細胞毒性となるように選
択した。用いられた条件下における（双方のアッセイに
関して直線的）吸光度読取りに基づく色素取込みの比較
では、ＭＴＴ取込みがコントロール培養物におけるＮＲ
よりも５〜６倍多いことを示した。界面活性剤処理培養
物において、ＮＲ取込みはＭＴＴよりも２．２倍多く、
ＮＲ又はＭＴＴ取込みのこのレベルはメッシュ単独（細
胞なし）に対する色素のバックグラウンド結合に相当し
た。ＭＴＴアッセイはそのアッセイの大きな動的範囲の
ために（色素のより高い最大取込み及びナイロンメッシ
ュ基質に対するより低い非特異的結合のために）ＮＲア
ッセイよりも好ましい。
トロール培養物におけるＭＴＴと比較し、培養物を０．
０１％ドデシル硫酸ナトリウム又は濃度１％の塩化ベン
ザルコニウム、塩化ベンゼトニウム及びツイーン２０で
処理する。これらの濃度は最大細胞毒性となるように選
択した。用いられた条件下における（双方のアッセイに
関して直線的）吸光度読取りに基づく色素取込みの比較
では、ＭＴＴ取込みがコントロール培養物におけるＮＲ
よりも５〜６倍多いことを示した。界面活性剤処理培養
物において、ＮＲ取込みはＭＴＴよりも２．２倍多く、
ＮＲ又はＭＴＴ取込みのこのレベルはメッシュ単独（細
胞なし）に対する色素のバックグラウンド結合に相当し
た。ＭＴＴアッセイはそのアッセイの大きな動的範囲の
ために（色素のより高い最大取込み及びナイロンメッシ
ュ基質に対するより低い非特異的結合のために）ＮＲア
ッセイよりも好ましい。
【００２４】培養物の処理に関して最適の時間を決定す
るため、ドデシル硫酸ナトリウムに対するＨｕＫ／Ｆ培
養物の応答性を試験する時間推移実験を行った。有意の
応答は処理後４時間でみられた。ＭＴＴ取込み、グルコ
ース利用率及びＰＧＥ２合成に関してドデシル硫酸ナト
リウムに対するＨｕＫ／Ｆ応答は２４時間でほぼ最大で
あり、４８時間では維持されているか又は更に大きくな
った。４８時間が好ましい処理期間であるが、その理由
は一般に最大応答がこの時間で生じたためである。Ｈｕ
Ｋ／Ｆ培養物において、試験された界面活性剤との応答
で細胞生存率（ＭＴＴ取込み）、細胞毒性、グルコース
利用率及びＰＧＥ２産生に関して用量依存的変化があっ
た。ＰＧＥ２の場合、更に高濃度の一部界面活性剤はこ
の分析を妨げうることがわかった。処理細胞の培地で評
価される他の生化学終点としては全タンパク質、アルカ
リホスファターゼ、酸ホスファターゼ、カルシウム、カ
リウム及びナトリウム濃度の測定があるが、但しこれら
の終点は化学的接触に応答して変化しなかった。
るため、ドデシル硫酸ナトリウムに対するＨｕＫ／Ｆ培
養物の応答性を試験する時間推移実験を行った。有意の
応答は処理後４時間でみられた。ＭＴＴ取込み、グルコ
ース利用率及びＰＧＥ２合成に関してドデシル硫酸ナト
リウムに対するＨｕＫ／Ｆ応答は２４時間でほぼ最大で
あり、４８時間では維持されているか又は更に大きくな
った。４８時間が好ましい処理期間であるが、その理由
は一般に最大応答がこの時間で生じたためである。Ｈｕ
Ｋ／Ｆ培養物において、試験された界面活性剤との応答
で細胞生存率（ＭＴＴ取込み）、細胞毒性、グルコース
利用率及びＰＧＥ２産生に関して用量依存的変化があっ
た。ＰＧＥ２の場合、更に高濃度の一部界面活性剤はこ
の分析を妨げうることがわかった。処理細胞の培地で評
価される他の生化学終点としては全タンパク質、アルカ
リホスファターゼ、酸ホスファターゼ、カルシウム、カ
リウム及びナトリウム濃度の測定があるが、但しこれら
の終点は化学的接触に応答して変化しなかった。
【００２５】ＭＴＴ及びＬＤＨ終点の場合には、界面活
性剤に対するヒト皮膚刺激応答とよく一致した（図４及
び５）。ヒトケラチン細胞単層培養物（クローンティク
スから入手できる）はケラチン細胞の細胞骨格を優先的
に染色するフルオレセイン標識抗サイトケラチン抗体を
用いて特徴付けた。この染色から細胞が性質上上皮であ
ることを確認する。ＨｕＫ及びＨｕＦ細胞はＮＲアッセ
イで証明されるように細胞生存率に関して用量依存的に
減少してドデシル硫酸ナトリウムに応答したが、ＨｕＫ
／Ｆ培養物よりも約１０倍感受的である。ＨｕＫ細胞に
おけるＰＧＥ２放出はコントロールよりも約２．５倍有
意に増加した。これらの細胞はＰＧＥ２放出に関してＨ
ｕＫ／Ｆ培養物よりも約１０倍感受的であった。表１〜
３は様々な界面活性剤に関するこれらの方法の使用につ
いて証明している。
性剤に対するヒト皮膚刺激応答とよく一致した（図４及
び５）。ヒトケラチン細胞単層培養物（クローンティク
スから入手できる）はケラチン細胞の細胞骨格を優先的
に染色するフルオレセイン標識抗サイトケラチン抗体を
用いて特徴付けた。この染色から細胞が性質上上皮であ
ることを確認する。ＨｕＫ及びＨｕＦ細胞はＮＲアッセ
イで証明されるように細胞生存率に関して用量依存的に
減少してドデシル硫酸ナトリウムに応答したが、ＨｕＫ
／Ｆ培養物よりも約１０倍感受的である。ＨｕＫ細胞に
おけるＰＧＥ２放出はコントロールよりも約２．５倍有
意に増加した。これらの細胞はＰＧＥ２放出に関してＨ
ｕＫ／Ｆ培養物よりも約１０倍感受的であった。表１〜
３は様々な界面活性剤に関するこれらの方法の使用につ
いて証明している。
【００２６】 表１ 試験物質に関するＭＴＴ‐５０計算 界面活性剤 ＭＴＴ‐５０終点 （濃度w/v) 塩化ベンザルコニウム 0.0007％ 塩化ベンゼトニウム 0.0014％ ドデシル硫酸ナトリウム 0.0057％ C12.3 LAS* H 0.0070％ C11.8 LAS 0.0073％ C12 DDAO 0.018 ％ NH4CNAE6.5S 0.019 ％ NH4CNAE12S 0.025 ％ ツイーン20 0.18％ ツイーン80 0.43％
【００２７】 表２ 乳酸デヒドロゲナーゼ放出(U/L) 処理（％濃度w/v) 界面活性剤 コントロール 0.01 0.03 0.06 0.1 NH4CNAE6.5S Avg 35.5 43.5 1637.0+ 1586.0+ 1644.0+ NH4CNAE12S Avg 43.3 41.8 1005.5+ 1414.0+ 1487.5+ C12 DDAO Avg 50.3 116.0+ 1270.0+ 1261.5+ 1196.0+ コントロール 0.1 0.3 0.6 1.0 ツイーン20 Avg 13.8 264.3+ 1404.3+ 1503.5+ 1495.5+* ツイーン80 Avg 46.3 130.0 335.0+ 1022.5+* 1105.8+ コントロール 0.001 0.003 0.006 0.01 SDS Avg 92.5 47.5+ 62.8 796.0+ 1496.0+ 塩化ベンゼトニウム Avg 22.0 433.5+ 1408.0+* 1344.0+* 1471.5+ コントロール 0.0005 0.001 0.005 0.01 塩化ベンザルコニウム Avg 34.0 138.5+ 1032.0+* 1334.5+* 1236.0+* コントロール 0.001 0.003 0.006 0.01 C11.8 LAS Avg 48.5 54.5 62.0 371.3+ 1459.5+ C12.3 LAS* H Avg 32.3 29.3 38.0 389.3+ 1584.0+* ４つではなく、３つのサンプルを用いた。 +コントロールから統計学的な有意差を示す（ｐ＜０．
００５）。
００５）。
【００２８】 表３ Ｎ‐アセチルグルコサミニダーゼ放出(U/L) 処理（％濃度w/v) 界面活性剤 コントロール 0.01 0.03 0.06 0.1 NH4CNAE6.5S Avg 14.38 14.28 28.30+ 31.50+ 24.73+ NH4CNAE12S Avg 14.40 14.13 29.15+ 31.15+ 29.8+ C12 DDAO Avg 17.03 21.15 23.53+ 23.33+ 26.90+ コントロール 0.1 0.3 0.6 1.0 ツイーン20 Avg 15.45 20.45+ 41.88+ 42.85+ 40.85+* ツイーン80 Avg 14.03 22.08+ 34.88+ 43.18+* 43.33+ コントロール 0.001 0.003 0.006 0.01 SDS Avg 13.93 14.05 14.00 17.28+ 16.58+ 塩化ベンゼトニウム Avg 14.65 21.20+ 37.63+* 37.10+* 21.73+* コントロール 0.0005 0.001 0.005 0.01 塩化ベンザルコニウム Avg 13.98 14.95+ 18.08+* 19.93+* 11.98+* コントロール 0.001 0.003 0.006 0.01 C11.8 LAS Avg 13.03 11.8 12.58 13.75 17.18+ C12.3 LAS* H Avg 14.65 13.95 14.80 16.85 21.43+ 表４〜７は様々な市販界面活性剤含有組成物に関するこ
れらの測定の使用について証明している。すべての分析
は４サンプルで行ったが、値は４サンプルの平均値を表
す。ドデシル硫酸ナトリウムも陽性サンプルとして含め
た。
れらの測定の使用について証明している。すべての分析
は４サンプルで行ったが、値は４サンプルの平均値を表
す。ドデシル硫酸ナトリウムも陽性サンプルとして含め
た。
【００２９】 表４ ＭＴＴ生存率アッセイ吸光度（５４０nm） 処理（％濃度w/v) 処方 コントロール 0.001 0.01 0.1 1.0 液体洗剤Ａ 1.3498 1.2350 1.2535 0.0683+ 0.0615+ コントロール 0.01 0.03 0.06 0.1 液体洗剤Ａ 1.4605 1.3925 1.1613 0.0615+ 0.0613+ コントロール 0.001 0.003 0.006 0.01 0.03 ドデシル硫酸Ｎａ 1.2450 1.4313 1.5723+ 1.5820+ 0.0768+ 0.0653+ コントロール 0.001 0.01 0.1 1.0 液体洗剤Ｂ 0.9997 1.1538 1.3233 0.0875 0.0650+ 固形石鹸Ａ 1.6960 1.6700 1.3368 0.8510+ 0.1005+ 固形石鹸Ｂ 1.5055 1.1750 1.4715 0.0920+ 0.0698+ シャンプーＡ 1.1190 0.8563 1.0930 0.0778+ 0.0773+ シャンプーＢ 0.9843 0.7638 0.6215 0.0593+ 0.0638+ 液体洗剤Ｃ 1.0603 1.0865 1.2018 0.0787+ 0.0725+ コントロール 0.01 0.03 0.06 0.1 液体洗剤Ｃ 1.1720 1.1795 1.8773 0.0760+ 0.0728+ コントロール 0.001 0.01 0.1 1.0 シャンプーＡ 1.0158 1.3185 1.5805 0.0658+ 0.0658+ コントロール 0.03 0.06 0.1 0.6 1.0 シャンプーＡ 1.4770 1.6673 0.0945+ 0.0608+ 0.0600+ 0.0585+ コントロール 0.001 0.01 0.1 1.0 顆粒洗剤Ａ 1.1160 1.1102 1.0543 0.2430+ 0.0658+ コントロール 0.01 0.03 0.06 0.1 顆粒洗剤Ａ 1.1633 0.9563 1.1100 0.0758+ 0.0740+
【００３０】 表５ 乳酸デヒドロゲナーゼ放出(U/L) 処理（％濃度w/v) 処方 コントロール 0.001 0.01 0.1 1.0 液体洗剤Ａ 18.3 20.5 15.3 513.8+ 0.00+ コントロール 0.01 0.03 0.06 0.1 液体洗剤Ａ 34.8 51.0 77.0 934.5+ 962.3+ コントロール 0.001 0.003 0.006 0.01 0.03 ドデシル硫酸Ｎａ 24.5 24.0 29.8 101.0+ 754.0+ 1.3+ コントロール 0.001 0.01 0.1 1.0 液体洗剤Ｂ 18.0 17.0 16.0 17.3 32.3 固形石鹸Ａ 26.0 22.8 25.0 261.3+ 28.5 固形石鹸Ｂ 20.3 19.3 21.5 405.0+ 5.8+ シャンプーＡ 23.0 22.0 23.5 358.8+ 0.0+ シャンプーＢ 19.3 23.0 162.0+ 277.8+ 0.0+ 液体洗剤Ｃ 61.5 54.5 58.3 522.0+ 0.0+ コントロール 0.01 0.03 0.06 0.1 液体洗剤Ｃ 41.3 41.8 400.0+ 816.8+ 200.3+ コントロール 0.001 0.01 0.1 1.0 シャンプーＣ 17.3 14.3 13.5 296.8+ 0.0+ コントロール 0.03 0.06 0.1 0.6 1.0 シャンプーＣ 27.5 64.3+ 732.3+ 483.5+ 0.3+ 0.0+ コントロール 0.001 0.01 0.1 1.0 顆粒洗剤 12.0 13.0 15.8 503.0+ 0.0+ コントロール 0.01 0.03 0.06 0.1 顆粒洗剤 36.5 36.3 225.3+ 895.3+ 586.0+
【００３１】 表６ Ｎ‐アセチルグルコサミニダーゼ放出(U/L) 処理（％濃度w/v) 処方 コントロール 0.001 0.01 0.1 1.0 液体洗剤Ａ 11.35 11.30 11.45 14.13+ 8.70+ コントロール 0.01 0.03 0.06 0.1 液体洗剤Ａ 11.80 11.38 11.33 16.15+ 15.30+ コントロール 0.001 0.003 0.006 0.01 0.03 ドデシル硫酸Ｎａ 11.25 10.88 11.45 12.95+ 16.65+ 9.35+ コントロール 0.001 0.01 0.1 1.0 液体洗剤Ｂ 11.98 12.13 11.95 11.98 10.25+ 固形石鹸Ａ 11.18 12.18 11.93 13.65+ 4.18+ 固形石鹸Ｂ 11.40 11.40 11.53 11.25 3.17+ シャンプーＡ 11.13 11.07 10.95 11.15 8.50+ シャンプーＢ 11.08 11.23 11.93+ 11.23 8.57+ 液体洗剤Ｃ 11.75 12.10 11.68 12.40 8.40+ コントロール 0.01 0.03 0.06 0.1 液体洗剤Ｃ 11.53 11.45 14.00+ 15.43+ 10.83+ コントロール 0.001 0.01 0.1 1.0 シャンプーＡ 11.80 11.80 11.48 13.33+ 8.80+ コントロール 0.03 0.06 0.1 0.6 1.0 シャンプーＡ 11.93 13.10+ 16.03+ 13.32+ 8.85+ 8.43+ コントロール 0.001 0.01 0.1 1.0 顆粒洗剤Ａ 11.55 11.53 11.35 16.80+ 8.95+ コントロール 0.01 0.03 0.06 0.1 顆粒洗剤Ａ 11.90 11.13 12.18 14.68+ 13.38+
【００３２】 表７ マロウ‐テック全厚皮膚培養物グルコース利用率 に関する洗剤処方物の評価(MG/DL) 処理（％濃度w/v) 処方 コントロール 0.001 0.01 0.1 1.0 液体洗剤Ａ 270.8 268.0 239.8 450.8+ 457.3+ コントロール 0.01 0.03 0.06 0.1 液体洗剤Ａ 211.5 175.5+ 217.8 389.5+ 405.0+ コントロール 0.001 0.003 0.006 0.01 0.03 ドデシル硫酸Ｎａ 242.8 241.5 226.8 259.3 397.3+ 415.5+ コントロール 0.001 0.01 0.1 1.0 液体洗剤Ｂ 268.5 259.5 227.0 258.5 417.3+ 固形石鹸Ａ 270.8 263.5 266.3 298.0 391.5+ 固形石鹸Ｂ 237.8 264.3+ 246.3 397.0+ 339.8+ シャンプーＡ 253.5 279.0 236.5 416.3+ 422.5+ シャンプーＢ 280.0 293.5 325.0+ 425.8+ 427.3+ 液体洗剤Ｃ 248.8 248.8 247.3 409.8+ 411.8+ コントロール 0.01 0.03 0.06 0.1 液体洗剤Ｃ 243.5 236.3+ 279.0 402.3+ 418.8+ コントロール 0.001 0.01 0.1 1.0 シャンプーＣ 260.8 257.5 248.3 423.0+ 430.3+ コントロール 0.03 0.06 0.1 0.6 1.0 シャンプーＣ 237.0 258.8 374.3+ 411.8+ 425.5+ 425.3+ コントロール 0.001 0.01 0.1 1.0 顆粒洗剤Ａ 262.8 263.3 273.8 341.0+ 436.5+
【００３３】分析方法メッシュ上における２４ウェル全厚皮膚培養物に関する
ＭＴＴアッセイプロトコール １．メッシュに対するＭＴＴのバックグラウンド非特異
的結合（ＮＳＢ）を調べかつ絶対ブランクとして作用さ
せるため、１つの未処理プレカットメッシュ（無細胞）
を１以上のウェルに入れる。残りのウェルには１メッシ
ュ／ウェルで繊維芽細胞／ケラチン細胞同時培養物を入
れる。試験キットと共に供給されるアッセイ培地２mlを
加える（マロウ‐テックが培地を供給する）。 ２．各ウェルから培地を除去し、アッセイ培地で希釈さ
れた試験物質を２ml／ウェルで加える。アッセイ培地と
共に未処理コントロールメッシュ及び無細胞のメッシュ
を再供給する。 ３．５％二酸化炭素雰囲気下３７℃で４８時間インキュ
ベートする。 ４．アッセイ培地中で０．５mg/ml ＭＴＴ（シグマ・ケ
ミカル社カタログ＃Ｍ‐２１２８）の溶液を調製する。
ＭＴＴ／培地を３０００rpm で５分間遠心して未溶解結
晶をペレット化し、しかる後３７℃水浴でＭＴＴを前加
温する。 ５．使われた培地を除去する。乳酸デヒドロゲナーゼ、
Ｎ‐アセチルグルコサミニダーゼ及びグルコースについ
て分析するため１mlアリコートを用いる；１mlは後でＰ
ＧＥ２分析のために−７０℃で窒素下で保存することが
できる。 ６．ＭＴＴ／培地溶液を１ml／ウェルで加える。絶対ブ
ランクウェルにはＭＴＴなしで培地を加える。５％二酸
化炭素下３７℃で３時間にわたり培養物をインキュベー
トする。 ７．ＭＴＴ／培地を除去し、カルシウム及びマグネシウ
ム含有のダルベッコリン酸緩衝液（ＰＢＳ）１mlで各メ
ッシュを２回にわたり各々約２〜５分間かけて洗浄す
る。 ８．第二ＰＢＳ洗液を除去し、２mlイソプロパノール／
ウェルを室温で２時間かけて加える。これは細胞のミト
コンドリアから上澄中にホルマザンを抽出する（注意：
細胞培養物に取り込まれた後に溶媒抽出で放出されたＭ
ＴＴの量は培養物内における生細胞の数と比例してい
る）。試験ウェルからメッシュを除去し、振盪渦巻ミキ
サーで攪拌する。 ９．各ウェルから青色が薄まった溶媒を２００μＬずつ
９６ウェル微量滴定プレートに移し、絶対ブランクにと
って空白な５４０nmで吸光度を読取る（ウェルはＭＴＴ
と接触しない）。ＮＳＢメッシュ含有ウェルの吸光度は
下記計算を行う前に試験ウェル吸光度から差し引かれる
べきである。
ＭＴＴアッセイプロトコール １．メッシュに対するＭＴＴのバックグラウンド非特異
的結合（ＮＳＢ）を調べかつ絶対ブランクとして作用さ
せるため、１つの未処理プレカットメッシュ（無細胞）
を１以上のウェルに入れる。残りのウェルには１メッシ
ュ／ウェルで繊維芽細胞／ケラチン細胞同時培養物を入
れる。試験キットと共に供給されるアッセイ培地２mlを
加える（マロウ‐テックが培地を供給する）。 ２．各ウェルから培地を除去し、アッセイ培地で希釈さ
れた試験物質を２ml／ウェルで加える。アッセイ培地と
共に未処理コントロールメッシュ及び無細胞のメッシュ
を再供給する。 ３．５％二酸化炭素雰囲気下３７℃で４８時間インキュ
ベートする。 ４．アッセイ培地中で０．５mg/ml ＭＴＴ（シグマ・ケ
ミカル社カタログ＃Ｍ‐２１２８）の溶液を調製する。
ＭＴＴ／培地を３０００rpm で５分間遠心して未溶解結
晶をペレット化し、しかる後３７℃水浴でＭＴＴを前加
温する。 ５．使われた培地を除去する。乳酸デヒドロゲナーゼ、
Ｎ‐アセチルグルコサミニダーゼ及びグルコースについ
て分析するため１mlアリコートを用いる；１mlは後でＰ
ＧＥ２分析のために−７０℃で窒素下で保存することが
できる。 ６．ＭＴＴ／培地溶液を１ml／ウェルで加える。絶対ブ
ランクウェルにはＭＴＴなしで培地を加える。５％二酸
化炭素下３７℃で３時間にわたり培養物をインキュベー
トする。 ７．ＭＴＴ／培地を除去し、カルシウム及びマグネシウ
ム含有のダルベッコリン酸緩衝液（ＰＢＳ）１mlで各メ
ッシュを２回にわたり各々約２〜５分間かけて洗浄す
る。 ８．第二ＰＢＳ洗液を除去し、２mlイソプロパノール／
ウェルを室温で２時間かけて加える。これは細胞のミト
コンドリアから上澄中にホルマザンを抽出する（注意：
細胞培養物に取り込まれた後に溶媒抽出で放出されたＭ
ＴＴの量は培養物内における生細胞の数と比例してい
る）。試験ウェルからメッシュを除去し、振盪渦巻ミキ
サーで攪拌する。 ９．各ウェルから青色が薄まった溶媒を２００μＬずつ
９６ウェル微量滴定プレートに移し、絶対ブランクにと
って空白な５４０nmで吸光度を読取る（ウェルはＭＴＴ
と接触しない）。ＮＳＢメッシュ含有ウェルの吸光度は
下記計算を行う前に試験ウェル吸光度から差し引かれる
べきである。
【００３４】ＭＴＴ‐５０及びＮＲ‐５０計算 試験物
質の毒性を報告するために用いられたＭＴＴ及びＮＲ細
胞毒性アッセイの終点は、未処理コントロール値と比較
した場合にＭＴＴ又はＮＲ色素取込みのいずれかに関し
て５０％減少（即ち、ＭＴＴ‐５０又はＮＲ‐５０）を
起こす試験物質の濃度である。計算は下記のように行っ
た： １）未処理コントロールウェルの平均ＯＤ５４０（５４
０nmの光学密度）を計算する。注意：アッセイが培養物
メッシュで行われた場合には、非特異的結合（ＮＳＢ）
コントロールを評価して、この値を各コントロール及び
処理吸光度から差し引く。 ２）各濃度の試験物質に関して４ウェルの平均ＯＤ５４
０を計算する。 ３）各平均ＯＤ５４０に関して未処理コントロールの％
を計算する： 片対数グラフにおいて、未処理コントロールの％をｙ軸
上にプロットし、試験物質の濃度をｘ軸上にプロットし
て、各試験物質に関する用量応答曲線を確立する。統計
学的プログラムに組み込まれる同様の三角法を用いた計
算を各試験物質用量応答曲線に関して行い、ＮＲ‐５０
又はＭＴＴ‐５０処理濃度を調べた。ＮＲ‐５０又はＭ
ＴＴ‐５０は細胞生存率が未処理コントロール値の５０
％まで減少した場合の試験物質濃度（ｘ軸）を表す。Ｍ
ＴＴ及びＮＲアッセイでは生存細胞数を測定する。細胞
はほとんど又は全くの無効果から全細胞の死滅までの範
囲の応答性を調べるためいくつかの用量の攻撃物質、即
ち界面活性剤で処理される。化学クラスの試験物質に関
するＭＴＴ‐５０はそれらの相対的毒性をランク付ける
ために用いられる。
質の毒性を報告するために用いられたＭＴＴ及びＮＲ細
胞毒性アッセイの終点は、未処理コントロール値と比較
した場合にＭＴＴ又はＮＲ色素取込みのいずれかに関し
て５０％減少（即ち、ＭＴＴ‐５０又はＮＲ‐５０）を
起こす試験物質の濃度である。計算は下記のように行っ
た： １）未処理コントロールウェルの平均ＯＤ５４０（５４
０nmの光学密度）を計算する。注意：アッセイが培養物
メッシュで行われた場合には、非特異的結合（ＮＳＢ）
コントロールを評価して、この値を各コントロール及び
処理吸光度から差し引く。 ２）各濃度の試験物質に関して４ウェルの平均ＯＤ５４
０を計算する。 ３）各平均ＯＤ５４０に関して未処理コントロールの％
を計算する： 片対数グラフにおいて、未処理コントロールの％をｙ軸
上にプロットし、試験物質の濃度をｘ軸上にプロットし
て、各試験物質に関する用量応答曲線を確立する。統計
学的プログラムに組み込まれる同様の三角法を用いた計
算を各試験物質用量応答曲線に関して行い、ＮＲ‐５０
又はＭＴＴ‐５０処理濃度を調べた。ＮＲ‐５０又はＭ
ＴＴ‐５０は細胞生存率が未処理コントロール値の５０
％まで減少した場合の試験物質濃度（ｘ軸）を表す。Ｍ
ＴＴ及びＮＲアッセイでは生存細胞数を測定する。細胞
はほとんど又は全くの無効果から全細胞の死滅までの範
囲の応答性を調べるためいくつかの用量の攻撃物質、即
ち界面活性剤で処理される。化学クラスの試験物質に関
するＭＴＴ‐５０はそれらの相対的毒性をランク付ける
ために用いられる。
【００３５】統計 統計は分散技術の分析を用いて実施された。分散の均一
性のバートレット試験が有意でなかったときには、処理
群は最小有意差（ＬＳＤ）基準を用いてコントロール群
と又は互いに比較された。バートレット試験が有意であ
ったときには、比較はウィルコクソンのランク合計試験
及び非均等分散を斟酌するｔ検定技術を用いて実施され
た。すべての統計試験は５％の２サイドリスクレベルで
実施された。
性のバートレット試験が有意でなかったときには、処理
群は最小有意差（ＬＳＤ）基準を用いてコントロール群
と又は互いに比較された。バートレット試験が有意であ
ったときには、比較はウィルコクソンのランク合計試験
及び非均等分散を斟酌するｔ検定技術を用いて実施され
た。すべての統計試験は５％の２サイドリスクレベルで
実施された。
【００３６】他の用途 細胞生存率と細胞同時培養物からの乳酸デヒドロゲナー
ゼ、Ｎ‐アセチルグルコサミニダーゼ及びグルコースの
放出に関する利用は皮膚に対する他の刺激剤又は物質の
効果を測定するためにも使用できる。例えば、この系は
ＵＶ（紫外線）照射の効果、非化学的刺激としてＵＶ光
の効果を測定するため又は光毒性スクリーニングのため
に使用できる。系は刺激に対するヒト皮膚に応答した皮
膚感作、年齢感作又は体部位差を研究するためにも使用
できる。経皮吸収研究及び細胞増殖研究もこの方法を用
いて研究できる。細胞増殖研究は皮膚発癌原性を予測し
うる短時間アッセイである。
ゼ、Ｎ‐アセチルグルコサミニダーゼ及びグルコースの
放出に関する利用は皮膚に対する他の刺激剤又は物質の
効果を測定するためにも使用できる。例えば、この系は
ＵＶ（紫外線）照射の効果、非化学的刺激としてＵＶ光
の効果を測定するため又は光毒性スクリーニングのため
に使用できる。系は刺激に対するヒト皮膚に応答した皮
膚感作、年齢感作又は体部位差を研究するためにも使用
できる。経皮吸収研究及び細胞増殖研究もこの方法を用
いて研究できる。細胞増殖研究は皮膚発癌原性を予測し
うる短時間アッセイである。
【図１】本発明に係る生物の形態を示す顕微鏡写真であ
る。ヒト新生児包皮繊維芽細胞及びケラチン細胞からな
るヒト皮膚細胞同時培養物はナイロンメッシュ上で増殖
された繊維芽細胞の基層を含んでいる。培養物の表面の
図（倍率２５０×）（図１）では編成ナイロンメッシュ
フィラメント間のスペースで増殖する多数の細胞につい
て示している。図１の場合のようなメッシュ表面の位相
差顕微鏡検査は培養物の細胞性を確認するため日常的に
用いられた。
る。ヒト新生児包皮繊維芽細胞及びケラチン細胞からな
るヒト皮膚細胞同時培養物はナイロンメッシュ上で増殖
された繊維芽細胞の基層を含んでいる。培養物の表面の
図（倍率２５０×）（図１）では編成ナイロンメッシュ
フィラメント間のスペースで増殖する多数の細胞につい
て示している。図１の場合のようなメッシュ表面の位相
差顕微鏡検査は培養物の細胞性を確認するため日常的に
用いられた。
【図２】市販（マロウ‐テック）培養物の断面概略図で
ある。この図では、ナイロンフィラメント（２）への繊
維芽細胞（１）付着、コラーゲン（３）及び細胞から分
泌される細胞外マトリックス成分（４）の存在並びに繊
維芽細胞／ナイロン基層上の層で増殖する表皮ケラチン
細胞（５）について示している。脂肪細胞（６）及びメ
ラニン細胞（７）もこの図に含まれているが、それらは
用いられる培養物の成分ではなかった。
ある。この図では、ナイロンフィラメント（２）への繊
維芽細胞（１）付着、コラーゲン（３）及び細胞から分
泌される細胞外マトリックス成分（４）の存在並びに繊
維芽細胞／ナイロン基層上の層で増殖する表皮ケラチン
細胞（５）について示している。脂肪細胞（６）及びメ
ラニン細胞（７）もこの図に含まれているが、それらは
用いられる培養物の成分ではなかった。
【図３】本発明に係る生物の形態を示す顕微鏡写真であ
る。例中で用いられるタイプの市販（マロウ‐テック）
培養物の組織断面（倍率４００×）（図３）では約５細
胞層のヒト新生児包皮繊維芽細胞、１層の基底ケラチン
細胞及び最上にある２〜３層の平坦層状ケラチン細胞に
ついて示す。
る。例中で用いられるタイプの市販（マロウ‐テック）
培養物の組織断面（倍率４００×）（図３）では約５細
胞層のヒト新生児包皮繊維芽細胞、１層の基底ケラチン
細胞及び最上にある２〜３層の平坦層状ケラチン細胞に
ついて示す。
【図４】ヒト研究の結果と本方法で試験された同一物質
の結果との比較について示すグラフである。
の結果との比較について示すグラフである。
【図５】ヒト研究の結果と本方法で試験された同一物質
の結果との比較について示すグラフである。図４及び５
において、試験された界面活性剤は以下のものであっ
た： １．ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート（ツ
イーン２０）、シグマ・ケミカル社、カタログ＃Ｐ‐１
３７９ ３．ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（ツ
イーン８０）、シグマ・ケミカル社、カタログ＃Ｐ‐１
７５４ ５．ドデシルジメチルアミンオキシド（Ｃ１２ＤＤＡ
Ｏ）、プロクター＆ギャンブル、３１．０％活性 ７．アンモニウムココナツアルキルエトキシレート６．
５サルフェート（ＮＨ４ＣｎＡＥ６．５Ｓ）、プロクタ
ー＆ギャンブル、６７．５％活性 ９．アンモニウムココナツアルキルエトキシレート１２
サルフェート（ＮＨ４ＣｎＡＥ１２Ｓ）、プロクター＆
ギャンブル、６３．９１％活性 １１．ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、シグマ・ケ
ミカル社、カタログ＃Ｌ‐４５０９ １３．Ｃ１２．３アルカンベンゼンスルホネート（Ｃ１
２．３ＬＡＳ）、プロクター＆ギャンブル、９６．４６
％活性 １５．Ｃ１１．８アルカンベンゼンスルホネート（Ｃ１
１．８ＬＡＳ＊Ｈ）、プロクター＆ギャンブル、９７．
０３％活性 １７．塩化ベンザルコニウム、シグマ・ケミカル社、カ
タログ＃Ｂ‐１３８３ １９．塩化ベンゼトニウム、シグマ・ケミカル社、カタ
ログ＃Ｂ‐８８７９
の結果との比較について示すグラフである。図４及び５
において、試験された界面活性剤は以下のものであっ
た： １．ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート（ツ
イーン２０）、シグマ・ケミカル社、カタログ＃Ｐ‐１
３７９ ３．ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（ツ
イーン８０）、シグマ・ケミカル社、カタログ＃Ｐ‐１
７５４ ５．ドデシルジメチルアミンオキシド（Ｃ１２ＤＤＡ
Ｏ）、プロクター＆ギャンブル、３１．０％活性 ７．アンモニウムココナツアルキルエトキシレート６．
５サルフェート（ＮＨ４ＣｎＡＥ６．５Ｓ）、プロクタ
ー＆ギャンブル、６７．５％活性 ９．アンモニウムココナツアルキルエトキシレート１２
サルフェート（ＮＨ４ＣｎＡＥ１２Ｓ）、プロクター＆
ギャンブル、６３．９１％活性 １１．ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、シグマ・ケ
ミカル社、カタログ＃Ｌ‐４５０９ １３．Ｃ１２．３アルカンベンゼンスルホネート（Ｃ１
２．３ＬＡＳ）、プロクター＆ギャンブル、９６．４６
％活性 １５．Ｃ１１．８アルカンベンゼンスルホネート（Ｃ１
１．８ＬＡＳ＊Ｈ）、プロクター＆ギャンブル、９７．
０３％活性 １７．塩化ベンザルコニウム、シグマ・ケミカル社、カ
タログ＃Ｂ‐１３８３ １９．塩化ベンゼトニウム、シグマ・ケミカル社、カタ
ログ＃Ｂ‐８８７９
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ローズマリー、オズボーン アメリカ合衆国オハイオ州、オックスフォ ード、インディアン、クリーク、ロード、 2575
Claims (46)
- 【請求項１】（１）ヒト皮膚ケラチン細胞及び繊維芽細
胞同時培養物を有効量の時間にわたり試験物質で攻撃す
る；及び（２）テトラゾリウム塩（ＭＴＴ）からホルマ
ザン色素への還元により細胞生存率を測定する；ことか
らなる、組成物の刺激ポテンシャルの測定方法。 - 【請求項２】細胞培地中への乳酸デヒドロゲナーゼの放
出も測定される、請求項１に記載の方法。 - 【請求項３】細胞培地中へのＮ‐アセチルグルコサミニ
ダーゼの放出も測定される、請求項１に記載の方法。 - 【請求項４】細胞培地中へのＮ‐アセチルグルコサミニ
ダーゼの放出も更に測定する、請求項２に記載の方法。 - 【請求項５】試験物質がアニオン系、非イオン系及びカ
チオン系界面活性剤の群から選択される界面活性剤であ
り、攻撃時間が４〜７２時間である、請求項１に記載の
方法。 - 【請求項６】試験物質がアニオン系、非イオン系及びカ
チオン系界面活性剤の群から選択される界面活性剤であ
り、攻撃時間が４〜７２時間である、請求項２に記載の
方法。 - 【請求項７】試験物質がアニオン系、非イオン系及びカ
チオン系界面活性剤の群から選択される界面活性剤であ
り、攻撃時間が４〜７２時間である、請求項３に記載の
方法。 - 【請求項８】グルコース利用率が測定される、請求項２
に記載の方法。 - 【請求項９】グルコース利用率が測定される、請求項４
に記載の方法。 - 【請求項１０】グルコース利用率が測定される、請求項
６に記載の方法。 - 【請求項１１】（１）ヒト皮膚ケラチン細胞及び繊維芽
細胞同時培養物を有効量の時間にわたり試験物質で攻撃
する；及び（２）ニュートラルレッド色素を細胞中に取
り込ませることで細胞生存率を測定する；ことからな
る、組成物の刺激ポテンシャルの測定方法。 - 【請求項１２】細胞培地中への乳酸デヒドロゲナーゼの
放出が測定される、請求項１１に記載の方法。 - 【請求項１３】細胞培地中へのＮ‐アセチルグルコサミ
ニダーゼの放出もを更に測定する、請求項１１に記載の
方法。 - 【請求項１４】細胞培養物のグルコース利用率も更に測
定する、請求項１２に記載の方法。 - 【請求項１５】細胞培地中へのＮ‐アセチルグルコサミ
ニダーゼの放出もを更に測定する、請求項１２に記載の
方法。 - 【請求項１６】細胞培養物のグルコース利用率も更に測
定する、請求項１５に記載の方法。 - 【請求項１７】試験物質がアニオン系、非イオン系及び
カチオン系界面活性剤の群から選択される界面活性剤で
あり、攻撃時間が４〜７２時間である、請求項１１に記
載の方法。 - 【請求項１８】試験物質がアニオン系、非イオン系及び
カチオン系界面活性剤の群から選択される界面活性剤で
あり、攻撃時間が４〜７２時間である、請求項１２に記
載の方法。 - 【請求項１９】試験物質がアニオン系、非イオン系及び
カチオン系界面活性剤の群から選択される界面活性剤で
あり、攻撃時間が４〜７２時間である、請求項１３に記
載の方法。 - 【請求項２０】細胞同時培養物が分化したケラチン細胞
からなる角質層も有する、請求項１に記載の方法。 - 【請求項２１】細胞同時培養物が分化したケラチン細胞
からなる角質層も有する、請求項２に記載の方法。 - 【請求項２２】細胞同時培養物が分化したケラチン細胞
からなる角質層も有する、請求項３に記載の方法。 - 【請求項２３】細胞同時培養物が分化したケラチン細胞
からなる角質層も有する、請求項１１に記載の方法。 - 【請求項２４】細胞同時培養物が分化したケラチン細胞
からなる角質層も有する、請求項１２に記載の方法。 - 【請求項２５】細胞同時培養物が分化したケラチン細胞
からなる角質層も有する、請求項１４に記載の方法。 - 【請求項２６】（１）ヒト皮膚ケラチン細胞又は繊維芽
細胞培養物を有効量の時間にわたり試験物質で攻撃す
る；及び（２）ニュートラルレッド色素を細胞中に取り
込ませることで細胞生存率を測定する；ことからなる、
組成物の刺激ポテンシャルの測定方法。 - 【請求項２７】（１）ヒト皮膚ケラチン細胞又は繊維芽
細胞培養物を有効量の時間にわたり試験物質で攻撃す
る；及び（２）テトラゾリウム塩（ＭＴＴ）からホルマ
ザン色素への還元により細胞生存率を測定する；ことか
らなる、組成物の刺激ポテンシャルの測定方法。 - 【請求項２８】プロスタグランジンＥ２の放出も更に測
定する、請求項２６に記載の方法。 - 【請求項２９】プロスタグランジンＥ２の放出も更に測
定する、請求項２７に記載の方法。 - 【請求項３０】プロスタグランジンＥ２の放出も更に測
定する、請求項８に記載の方法。 - 【請求項３１】プロスタグランジンＥ２の放出も更に測
定する、請求項１に記載の方法。 - 【請求項３２】プロスタグランジンＥ２の放出も更に測
定する、請求項２に記載の方法。 - 【請求項３３】プロスタグランジンＥ２の放出も更に測
定する、請求項３に記載の方法。 - 【請求項３４】プロスタグランジンＥ２の放出も更に測
定する、請求項９に記載の方法。 - 【請求項３５】プロスタグランジンＥ２の放出も更に測
定する、請求項１１に記載の方法。 - 【請求項３６】プロスタグランジンＥ２の放出も更に測
定する、請求項１２に記載の方法。 - 【請求項３７】プロスタグランジンＥ２の放出も更に測
定する、請求項１５に記載の方法。 - 【請求項３８】プロスタグランジンＥ２の放出も更に測
定する、請求項１４に記載の方法。 - 【請求項３９】プロスタグランジンＥ２の放出も更に測
定する、請求項２１に記載の方法。 - 【請求項４０】刺激ポテンシャルが皮膚感作の測定であ
る、請求項３９に記載の方法。 - 【請求項４１】（１）ヒト新生児ケラチン細胞及び繊維
芽細胞同時培養物を有効量の時間にわたり紫外線で攻撃
する；及び（２）テトラゾリウム塩からホルマザン色素
への還元により細胞生存率を測定する；及び（３）細胞
培地中への乳酸デヒドロゲナーゼの放出を測定する；こ
とからなる、ヒト皮膚における紫外線の効果の測定方
法。 - 【請求項４２】（１）ヒト新生児ケラチン細胞及び繊維
芽細胞同時培養物を有効量の時間にわたり紫外線で攻撃
する；及び（２）テトラゾリウム塩からホルマザン色素
への還元により細胞生存率を測定する；及び（３）細胞
培地中へのＮ‐アセチルグルコサミニダーゼの放出を測
定する；ことからなる、皮膚における紫外線の効果の測
定方法。 - 【請求項４３】（１）ヒトケラチン単層細胞培養物又は
ヒト繊維芽単層細胞培養物を４〜４８時間にわたり界面
活性剤で処理する；及び（２）ニュートラルレッド色素
アッセイで細胞生存率を測定する；ことからなる、皮膚
刺激に関する界面活性剤のスクリーニング方法。 - 【請求項４４】ＰＧＥ２放出も皮膚刺激の測定としてヒ
トケラチン細胞モデルで測定される、請求項４３に記載
の方法。 - 【請求項４５】細胞同時培養物が分化したケラチン細胞
からなる角質層を有する、請求項４１に記載の方法。 - 【請求項４６】細胞同時培養物が分化したケラチン細胞
からなる角質層を有する、請求項４２に記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US64737991A | 1991-01-28 | 1991-01-28 | |
| US647379 | 1991-01-28 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06180311A true JPH06180311A (ja) | 1994-06-28 |
Family
ID=24596762
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3721192A Withdrawn JPH06180311A (ja) | 1991-01-28 | 1992-01-28 | 皮膚刺激能の評価方法 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0497399A1 (ja) |
| JP (1) | JPH06180311A (ja) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2005080977A1 (ja) * | 2004-02-24 | 2005-09-01 | Rohto Pharmaceutical Co., Ltd. | 皮膚刺激性評価方法 |
| JP2007127444A (ja) * | 2005-11-01 | 2007-05-24 | Toyobo Co Ltd | 保湿性評価方法 |
| JP2018183105A (ja) * | 2017-04-27 | 2018-11-22 | 日光ケミカルズ株式会社 | 皮膚刺激評価方法 |
| JP2021528632A (ja) * | 2018-06-28 | 2021-10-21 | ユニリーバー・ナームローゼ・ベンノートシヤープ | 方法 |
Families Citing this family (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1993017336A1 (en) * | 1992-02-19 | 1993-09-02 | The Procter & Gamble Company | In vitro model for eye and skin irritation testing |
| FR2738914A1 (fr) * | 1995-09-20 | 1997-03-21 | Biopredic | Procede et kit pour la mesure de la phototoxicite d'un produit in vitro |
| DE19606207A1 (de) * | 1996-02-21 | 1997-08-28 | Univ Duesseldorf H Heine | Verfahren zur Bestimmung der Phototoxizität und/oder Photosensibilität von Stoffen oder Stoffgemischen sowie dessen Verwendung |
| FR2759381B1 (fr) * | 1997-02-11 | 1999-04-16 | Oreal | Procede d'evaluation du potentiel sensibilisant et/ou irritant et/ou allergene d'un produit |
| CA2207882A1 (en) * | 1997-06-17 | 1998-12-17 | Joel Claveau | Assessment of human skin damage following exposure to harmful agents |
| EP1273913A1 (de) * | 2001-07-02 | 2003-01-08 | Cognis France S.A. | Verfahren zur Bestimmung der Interaktionen zwischen Keratinocyten und Neuronen |
| US20030068663A1 (en) * | 2001-09-06 | 2003-04-10 | Kelly Huang | Method and kit for measuring skin inflammation or irritation |
| WO2006090259A2 (en) * | 2005-02-24 | 2006-08-31 | Pfizer Japan Inc. | A method for screening photosensitive compound |
| CN110628866A (zh) * | 2019-08-27 | 2019-12-31 | 广州市华代生物科技有限公司 | 一种基于双细胞水平的皮肤光刺激性评价方法 |
| CN112961899B (zh) * | 2021-02-23 | 2023-06-09 | 云南贝泰妮生物科技集团股份有限公司 | 一种化妆品原料体外巨噬细胞联合3d皮肤模型抗炎功效筛选方法 |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4016036A (en) * | 1975-11-14 | 1977-04-05 | Massachusetts Institute Of Technology | Process for serially culturing keratinocytes |
| DE3737652A1 (de) * | 1987-11-06 | 1989-07-20 | Battelle Institut E V | Verfahren zur pruefung auf hautreizende eigenschaften |
-
1992
- 1992-01-15 EP EP92200099A patent/EP0497399A1/en not_active Withdrawn
- 1992-01-28 JP JP3721192A patent/JPH06180311A/ja not_active Withdrawn
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2005080977A1 (ja) * | 2004-02-24 | 2005-09-01 | Rohto Pharmaceutical Co., Ltd. | 皮膚刺激性評価方法 |
| JP2007127444A (ja) * | 2005-11-01 | 2007-05-24 | Toyobo Co Ltd | 保湿性評価方法 |
| JP2018183105A (ja) * | 2017-04-27 | 2018-11-22 | 日光ケミカルズ株式会社 | 皮膚刺激評価方法 |
| JP2021528632A (ja) * | 2018-06-28 | 2021-10-21 | ユニリーバー・ナームローゼ・ベンノートシヤープ | 方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0497399A1 (en) | 1992-08-05 |
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|---|---|---|---|
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