CN110684713A - 一种类尿布皮炎的体外重组表皮模型的构建方法 - Google Patents

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Abstract

本发明具体涉及一种类尿布皮炎的体外重组表皮模型的构建方法，该构建方法包括如下步骤，步骤（1）：表皮细胞的准备；步骤（2）：表皮细胞的液下培养；步骤（3）：表皮细胞增殖与分化调控；步骤（4）：类尿布皮炎体外重组表皮模型的构建；通过在各阶段的细胞培养液中添加特异性物质，调控角质形成细胞的增值与分化，得到屏障弱化的体外重组表皮模型，然后通过添加刺激物构建类尿布皮炎的体外重组表皮模型。采用本发明提供的方法构建的类尿布皮炎的体外重组表皮模型具有与正常病理状态下的组织切片相似的结构及相似的生化指标的变化，减少了种属差异及个体差异，大大提高了模型的真实有效性。

Description

一种类尿布皮炎的体外重组表皮模型的构建方法
技术领域
本发明属于组织工程技术领域，具体涉及一种类尿布皮炎的体外重组表皮模型的构建方法。
背景技术
婴儿期皮肤是皮肤器官从子宫羊水环境过渡到成熟状态的一个重要阶段，其生理状态与成人存在着显著的差异。研究表明，与成人皮肤相比，新生儿皮肤具有如下特点：（1）角质层、表皮很薄、细胞较小，胶原纤维细小、稀疏、细胞密度相对较大，进而导致皮肤渗透性较高且容易因摩擦受损，尤其是皮肤褶皱处，更容易因摩擦增加，而导致皮肤破溃及尿布疹等问题；（2）天然保湿因子含量较低，经皮失水较多、吸收率较高，皮肤更易干燥；（3）出生时pH值较高、易受细菌侵袭，导致局部红肿破溃；（4）体表面积/体重较高，应用化学品有较高的易损性，对过敏物质或毒性物的反应也更加强烈；（5）新生儿汗腺与皮脂腺发育不成熟，皮肤温度调节能力较弱，当皮肤环境温度增高时更容易产生热扉与瘙痒，加之新生儿会本能地抓挠，极易引起皮肤破溃；（6）免疫系统还处于不断发展过程中，皮肤抵抗力较弱易激惹、易被感染，出现皮肤过敏等症状。
相对于其他部位皮肤，新生儿臀部皮肤由于天天承受大小便的浸润、加上尿布区域环境的密闭性，使其更具有特殊性，导致其非常容易形成红屁股、尿布皮炎等症状。
刺激性尿布皮炎（Irritated Diaper Dermatitis, IDD）是发生在婴儿尿布覆盖区的接触性皮肤炎症，主要表现在尿布覆盖部位的红斑、红疹的出现。新生儿的发生率为7~35%，大多0~2岁宝宝均有经历且9~12月宝宝发生率最高。尿布区域皮损初发为轻度潮红、肿胀、逐渐可出现丘疹、水疱、糜烂渗出等。严重影响婴幼儿生活质量，且破溃后可进一步引起继发细菌感染，甚至局部形成脓疱，直接威胁到患儿生命。尽管尿布的技术已经有了很大的突破，但是尿布皮炎在婴幼儿群体中依然是一种常见的皮肤疾病。因此，对于新生儿的护理而言，皮肤特别是臀部皮肤的护理更需要引起足够的重视。
针对新生儿尿布皮炎的治疗主要集中在日常护理和预防两个方面：如勤换尿布，保持清洁及臀部区域的干燥；较少碱性皂类物质的使用并采用一定的保湿膏霜。保湿臀霜属于化妆品，2015年发布的《化妆品监督管理条例》修订草案送审稿中，明确提出“化妆品的功效宣称应当有充分的科学依据。直接进行临床实验由于实验周期及安全性等问题的限制，实现比较困难，因此在进行临床试验之前，需要设计合理的实验模型进行初步效果实验。随着婴幼儿基础护肤市场的快速发展，基础护肤产品的有效开发和安全性与功效性评估成为新的挑战。
综上所述，现有的尿布皮炎治疗及预防产品从前期开发到投放市场，缺乏一套科学的安全性及功效性评估的标准化体系及模式。部分产品会采用动物实验完成安全性评估，但其结果的准确性与婴儿皮肤的一致性也让人质疑。因此，基于婴儿尿布皮炎发病机制建立体外的尿布皮炎3D皮肤模型，并基于该模型进行产品安全性及功效性评价是必要的。
发明内容
为了解决现有技术中缺少类尿布皮炎的体外重组表皮模型，采用动物IDD模型进行药理实验准确度不足的问题，本发明一方面提供了一种类尿布皮炎的体外重组表皮模型的构建方法。本发明要解决的技术问题通过以下技术方案实现：
一种类尿布皮炎的体外重组表皮模型的构建方法，该构建方法包括如下步骤：
步骤（1）：表皮细胞的准备
取原代角质形成细胞，复苏扩增后，使用P3~P7代细胞，用胰酶消化液消化，用MCDB153培养基制成单细胞悬液，按照1.0×105～5×105个/mL的细胞密度，接种于培养瓶中，置于37℃、5% CO2条件下培养；
步骤（2）：表皮细胞的液下培养
取对数生长期的表皮细胞，以细胞培养液Ⅰ制成细胞密度为1.25×106~2.5×106个/mL的表皮细胞悬浮液，取适量接种到含有聚碳酸酯滤膜的细胞培养小室中，置于37℃、5%CO2条件下培养0.5～2小时；然后将细胞培养小室置于表皮模型培养皿，每只培养皿添加60～80 mL细胞培养液Ⅰ，37℃、5%CO2条件下继续培养1～3天，每天换液，实现表皮细胞的液下培养；
所述细胞培养液Ⅰ是以MCDB153为基础培养基，添加胰岛素、异丙肾上腺素、氢化可的松、表皮生长因子、腺嘌呤、转铁蛋白、L-肉碱和氯化钙配制的；
步骤（3）：表皮细胞增殖与分化调控
将上述步骤（2）中的细胞培养小室内的培养液弃掉，表皮模型培养皿内的培养液更换为细胞培养液Ⅱ，添加量为每只培养皿添加50~70 mL细胞培养液Ⅱ，使液面与细胞培养小室内细胞上表面位于同一水平线，进行气液面培养，37℃、5%CO2条件下培养，培养时间为8~10天，培养期间每天换液，可得屏障弱化的体外重组表皮模型；
所述细胞培养液II是以MCDB153为基础培养基，添加胰岛素、异丙肾上腺素、氢化可的松、表皮生长因子、腺嘌呤、转铁蛋白、L-肉碱、L-丝氨酸、棕榈酸、油酸、精氨琥珀酸、氯化钙、角质细胞生长因子和粒细胞集落刺激因子配制的；
步骤（4）：类尿布皮炎的重组表皮模型的构建
将步骤（3）所得到的屏障弱化的体外重组表皮模型转移至多孔板中，每孔内预先添加培养液Ⅱ，在每孔的表皮模型表面添加质量体积浓度为0.15%的十二烷基硫酸钠，均匀涂抹后，置于37℃，5% CO2孵箱中后孵育24小时，清洗后即得到类尿布皮炎的重组表皮模型。
进一步地，本发明所述的类尿布皮炎的体外重组表皮模型的构建方法，步骤（2）：表皮细胞的液下培养时，取对数生长期的表皮细胞，以细胞培养液Ⅰ制成细胞密度为1.25×106~2.5×106个/ mL的表皮细胞悬浮液，取适量接种到含有聚碳酸酯滤膜的细胞培养小室中，置于37℃、5%CO2条件下培养0.5～2小时；所述适量指200 µL。
进一步地，本发明所述的类尿布皮炎的体外重组表皮模型的构建方法，所述细胞培养液Ⅰ是以MCDB153为基础培养基，添加胰岛素0.5~5 μg/mL，异丙肾上腺素0.1~1 μM，氢化可的松0.02~0.2 μg/mL，表皮生长因子1~10 ng/mL，腺嘌呤10~50 μg/mL，转铁蛋白5~12μg/mL，L-肉碱0.001~0.1 mM和氯化钙0.03~0.2 mM配制的。
进一步地，本发明所述的类尿布皮炎的体外重组表皮模型的构建方法，所述细胞培养液II是以MCDB153为基础培养基，添加胰岛素0.5~5 μg/mL，异丙肾上腺素0.1~1 μM，氢化可的松0.02~0.2 μg/mL，表皮生长因子1~10 ng/mL，腺嘌呤10~50 μg/mL，转铁蛋白5~12μg/mL，L-肉碱0.001~0.1 mM，L-丝氨酸0.01~0.1 mM，棕榈酸0.01~0.05 mM，油酸 0.01~0.05 mM，精氨琥珀酸0.05~0.1 mM，氯化钙1.0~1.5 mM，角质细胞生长因子1~10 ng/mL和粒细胞集落刺激因子10~20 ng/mL配制的。
进一步地，本发明所述的类尿布皮炎的体外重组表皮模型的构建方法，步骤（1）表皮细胞的准备中，取原代角质形成细胞，复苏扩增后，用胰酶消化液消化P3~P7代细胞，用于消化P3~P7代细胞的胰酶消化液为质量体积浓度2.5%的胰酶。
进一步地，本发明所述的类尿布皮炎的体外重组表皮模型的构建方法，所述步骤（4）具体为：将步骤（3）所得到的屏障弱化的体外重组表皮模型转移至多孔板中，每孔内预先添加0.9mL细胞培养液Ⅱ，在每孔的表皮模型表面添加质量体积浓度为0.15%的十二烷基硫酸钠25μL，均匀涂抹后，置于37℃，5% CO2孵箱中后孵育24小时，然后用DPBS缓冲液将组织表面残留的液体用清洗干净，即得到类尿布皮炎的重组表皮模型。
本发明所述的“质量体积浓度”是指每100毫升溶剂中，含有多少克溶质。
本发明所述的“质量百分浓度”是指每100 g溶剂中，含有多少克溶质。
与现有技术相比，本发明的有益效果：
本发明提供了一种以人皮肤角质形成细胞为来源的类尿布皮炎的体外重组表皮模型的构建方法，避免种属差异，降低个体差异，同时缩短了造模时间，上述模型可应用于婴幼儿尿布皮炎病理研究及相关的治疗活性物有效性的检测。
本发明提供的类尿布皮炎的体外重组表皮模型的构建方法，包括表皮细胞的准备、表皮细胞的液下培养、气液面培养、增殖与分化的调控和模型构建。表皮细胞液下培养过程中通过添加细胞培养液Ⅰ，促进表皮基底细胞增殖；表皮细胞增值与分化调控中，通过添加细胞培养液Ⅱ，促进表皮细胞的增殖分化和迁移，并且调整培养时间，得到的屏障弱化的体外重组表皮模型。本发明的类尿布皮炎的体外重组表皮模型构建方法中，选择采用十二烷基硫酸钠（Sodium lauryl sulfate，SLS）作为刺激物，SLS是化妆品中采用的一种表面活性剂，SLS刺激性的机理主要是破坏角质层结构，影响角质层屏障功能的完整性，进一步渗透至活细胞层，引起刺激性炎症反应，真实状态的尿布皮炎也是一种非免疫细胞介导的刺激性炎症，二者机理近似，且SLS不易挥发，可操作性更强。本发明经过实验验证，找到最合适的SLS刺激物浓度。本发明的构建方法所得到的类尿布皮炎的体外重组表皮模型具有与正常病理状态下的组织切片相似的结构变化，例如主要特征如下：角质层增厚、排列疏松、空泡明显且分化不完全；活细胞层（颗粒层、棘层、基底层）活细胞数目减少，基底层细胞空泡明显，排列疏散。
附图说明
图1为实施例1不同浓度SLS刺激下的MTT检测组织活力实验结果图。
图2为实施例1不同浓度SLS刺激下的ELISA检测IL-1α分泌结果图。
图3为实施例1不同浓度SLS刺激下的组织形态观察图。
图4为实施例5地塞米松作用于类尿布皮炎表皮模型的组织活力结果图。
图5为实施例5地塞米松作用于类尿布皮炎模型的IL-1α分泌结果图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
以下实施例中所使用的MCDB153培养基、胰岛素、氢化可的松、表皮生长因子、腺嘌呤、转铁蛋白、L-肉碱、L-丝氨酸、棕榈酸、油酸、精氨琥珀酸、氯化钙和粒细胞集落刺激因子购自Sigma，胰酶消化液购自GIBCO，异丙肾上腺素购自上海和丰制药，角质细胞生长因子购自PeproTech，白介素-1α（IL-1α）、购自R&D Systems；DPBS（无钙镁PBS）购自博士德，地塞米松购自中检所。SLS溶液为SLS用PBS配制而成的一定质量体积浓度的溶液。本发明实施例中所采用的试验方法、检测方法和常规实验试剂配制方法，如无特别说明，均按照本领域常规操作。
原代角质形成细胞获取参考专利CN1253558C中所公开的的制备方法进行制备。具体方法如下：将人皮肤组织用含抗菌素的PBS缓冲液清洗；置蛋白酶液中消化；剥离表皮与真皮层；收集表皮皮片，置质量比为0.025%的EDTA-胰酶消化液中，37℃、5%CO2培养箱中消化10 min，消化完成后，加入0.1的胎牛血清的DMEM培养终止消化终止，后过200目网筛，800rpm离心6 min，稍加吹打，过滤后收集表皮细胞悬液，离心弃上清，加入新鲜培养液，重悬细胞，计数板计数。用表皮细胞培养液按照3E6/瓶接种一瓶，后续待用。
实施例1：类尿布皮炎重组表皮模型的构建方法
步骤一、表皮细胞的准备
取原代角质形成细胞，复苏扩增后，使用P7代细胞，用2.5%胰酶（100 mL PBS, 2.5 g胰酶）消化液消化，用MCDB153培养基制成单细胞悬液，按照2.5×105个/mL的密度，接种于培养瓶中，置于37℃、5%CO2条件下培养。
步骤二、表皮细胞的液下培养
取对数生长期细胞，用细胞培养液Ⅰ制成细胞密度为2.5×106个/ mL的表皮细胞悬浮液，取200 μL接种到含有聚碳酸酯滤膜的细胞培养小室中，置于37℃、5%CO2条件下培养2小时；后将小室置于模型培养皿内，每皿添加70 mL细胞培养液Ⅰ，37℃、5%CO2条件下继续培养2天，每天换液，实现表皮细胞的液下培养。
所使用的细胞培养液Ⅰ以MCDB153为基础培养基，添加胰岛素2.5 μg/mL，异丙肾上腺素0.5 μM，氢化可的松0.1 μg/mL，表皮生长因子5 ng/mL，腺嘌呤25 μg/mL，转铁蛋白8 μg/mL，L-肉碱0.05 mM以及氯化钙0.1 mM。
步骤三、表皮细胞增殖与分化调控
将上述步骤二中的细胞培养小室内的培养液弃掉，更换模型培养皿内的培养液为细胞培养液Ⅱ，添加量为每只培养皿70 mL，使液面与细胞培养小室内细胞上表面位于同一水平线，进行气液面培养，培养时间为8天，培养周期较短，形成的角质层较薄，模拟婴幼儿皮肤状态，培养期间每天换液，培养结束，屏障弱化的重组皮肤表皮模型构建完成。
细胞培养液Ⅱ以MCDB153为基础培养基，添加胰岛素2.5 μg/mL，异丙肾上腺素0.5μM，氢化可的松0.1 μg/mL，表皮生长因子5 ng/mL，腺嘌呤25μg/mL，转铁蛋白8 μg/mL，L-肉碱0.05 mM， L-丝氨酸0.05 mM，棕榈酸0.025 mM，油酸 0.025 mM，精氨琥珀酸0.075 mM，氯化钙1.25 mM，角质细胞生长因子5 ng/mL，粒细胞集落刺激因子15 ng/mL配置而成。
步骤四、类尿布皮炎的重组表皮模型的构建
本发明的类尿布皮炎的体外重组表皮模型构建方法中，选择采用十二烷基硫酸钠（Sodium lauryl sulfate，SLS）作为刺激物，SLS是化妆品中采用的一种表面活性剂，SLS刺激性的机理主要是破坏角质层结构，影响角质层屏障功能的完整性，进一步渗透至活细胞层，引起刺激性炎症反应，而尿布皮炎也是一种非免疫细胞介导的刺激性炎症，机理近似，且SLS不易挥发，可操作性更强。为了成功构建模型，首先进行SLS刺激浓度浓度摸索。
将构建好的屏障弱化的重组皮肤表皮模型转移至六孔板中，六孔板的每孔内预先添加0.9mL细胞培养液Ⅱ。实验分为四组，每组需要5个平行模型，即每组/六孔板，SLS终浓度分别为0%、0.1%、0.15%、0.2%（质量体积浓度）。按实验分组在模型表面分别添加不同浓度的SLS溶液25 μL，均匀涂抹后，置于37℃，5% CO2孵箱中后孵育24小时。
孵育完成后，从培养箱中取出六孔板。清洗皮肤模型表面，控制每个模型洗涤1min，从而保证每个模型培养小室的接触时间都相同。采用装有无菌DPBS的洗瓶清洗组织。保持DPBS以稳速不间断的流出，充满培养小室后倒掉，重复15次。清洗15次以后，采用DPBS浸洗组织培养小室里、外各一次轻轻抖动3D皮肤模型培养小室减少组织上残留的DPBS，并用无菌棉签轻轻吸去水分。
以上实验过程得到采用不同质量浓度的SLS刺激后的体外重组表皮模型，分别采用MTT检测、ELISA检测和形态学检测，观察每一试验组所得到的表皮模型的形态和生化指标。
（1）MTT检测组织活力：每组取3个吸去水分的表皮模型转移到提前预备好的新的24孔板中，并向24孔板每孔加入300 μL MTT溶液(1 mg/mL)。将24孔板转移到恒温培养箱中（37℃、5% CO2、95%相对湿度），孵育3 h±5 min。MTT孵育完成后，采用枪头从孔板中轻柔的吸去MTT溶液。给孔板中加入DPBS溶液，再次吸去，重复此清洗过程共3次，确保在最后一次吸去时组织变干。洗涤完毕后，将组织底面用吸水纸擦干，转移到新的24孔板中，在培养小室中加入2 mL异丙醇，充分溶解MTT产生的结晶。采用石蜡密封24孔板间隙避免异丙醇挥发影响终体积，4℃静置过夜溶解，溶解完成后，采用200 μL枪头刺穿组织，使溶解物从组织中流到培养孔中。丢弃被刺穿的组织，在培养孔中上下吹打溶液至少3次确保溶液均匀。用96孔板在波长570 nm读数测定OD值，以异丙醇作为空白对照调零孔，计算得到0%、0.1%、0.15%、0.2%各试验组的表皮模型的组织活力。计算公式如下：
Figure 318096DEST_PATH_IMAGE002
应用SPSS17.0软件进行统计分析，得到表1的实验结果。
表1：不同浓度SLS刺激下的MTT检测组织活力实验结果
　组织活力 Control SLS-0.1% SLS-0.15% SLS-0.2%
　平行实验1 104.583% 90.972% 79.306% 44.583%
　平行实验2 101.181% 86.667% 76.806% 44.167%
　平行实验3 94.236% 83.819% 48.368% 55.451%
均值 100.000% 87.153% 68.160% 48.067%
SD 5.274% 3.601% 17.186% 6.398%
p -- 0.3099 0.0098 0.0005
表1中的结果表示为Mean±SD，p<0.05被认为具有差异显著性，其中*p<0.05表示差异显著，**p<0.01表示差异极显著。将实验结果应用GraphPad Prism5.0软件进行作图，得到图1。
根据表1和图1所示的实验结果，可以看到：空白对照组组织活力为100±5.274%，而实施例1的体外重组类尿布疹表皮模型中组织活力随着SLS刺激浓度的增高而降低；当SLS刺激浓度为0.15%时，组织活力为68.16±17.186%，且与空白对照组相比，差异显著（p<0.01），与正常表皮（空白对照组）相比，实施例1构建的体外重组尿布皮炎表皮模型的组织活力显著性降低。
（2）ELISA检测IL-1α分泌情况：收集进行MTT检测的、孵育完成后的培养基，每组取三个用ELISA方法检测培养液中IL-1α的分泌量。实验结果如表2所示。
表2：不同浓度SLS刺激下的ELISA检测IL-1α分泌情况
IL-1α(pg/mL) Control SLS-0.1% SLS-0.15% SLS-0.2%
　平行实验1 4.03317 58.86249 148.1359 296.4562
　平行实验2 4.38464 57.80808 147.0815 293.6445
　平行实验3 4.38464 59.21396 149.1903 299.268
均值 4.27 58.63 148.14 296.46
SD 0.20 0.73 1.05 2.81
p -- < 0.0001 < 0.0001 < 0.0001
表2中的结果表示为Mean±SD，p<0.05被认为具有差异显著性， **p<0.01表示差异极显著。将实验结果应用GraphPad Prism5.0软件进行作图，得到图2。
根据表2和图2所示的实验结果，可以看到：空白对照组中表皮的IL-1α组含量为4.83±2.64 pg/mL。而实施例1的体外重组类尿布疹表皮模型中IL-1α的分泌量随着SLS刺激浓度的增高而增加；当SLS刺激浓度为0.15%时，IL-1α的分泌量为148.14±1.05 pg/mL，且与空白对照组相比差异显著（p<0.01）。与正常表皮（空白对照组）相比，实施例1构建的体外重组类尿布皮炎表皮模型IL-1α的分泌量增加。
（3）形态学染色H&E检测：
实验方法：每组取2个吸去水分的表皮模型，用刀片把体外重组表皮模型从细胞培养小室中环切下来，并转移到1.5 mL EP管中，加入10%多聚甲醛固定，迅速杀死细胞以保持组织及细胞的原有结构，乙醇溶液由低浓度到高浓度进行系列脱水，二甲苯透明处理，常规石蜡包埋，切片，制成切片后进行H&E染色，然后显微镜下拍照观察。实施例1的表皮模型所制得的切片观察到的组织学切片HE染色结果及组织形态学变化如图3所示。
图3中可以明显观察到：正常表皮模型（空白对照，Control）含典型四层表皮复层化结构，包括角质层、颗粒层、棘层与基底层。当SLS作用浓度为0.1%时，模型的结构基本未变。当SLS作用浓度增加至0.15%时，该模型活细胞层略有空泡出现，颗粒层细胞边界模糊，角质层较正常表皮模型厚且松散。当SLS作用浓度增加至0.2%时，该模型角质层出现空泡，模型处于分化不完全阶段，模型各层之间空泡增多且对棘层有较大的影响，活细胞层活细胞数目明显减少，表明该浓度下表皮已经造成了严重的损伤，表皮损伤状态比尿布皮炎严重。
综合上述MTT检测组织活力、ELISA检测IL-1α分泌情况和形态学染色H&E检测结果，选择皮肤组织在SLS刺激后组织活力显著性降低（p<0.05），IL-1α分泌量显著性降低（p<0.05）且组织形态学有一定损伤（但不能损伤过度，导致表皮无法修复）的SLS浓度，作为尿布皮炎模型造模的最佳刺激浓度，确定将SLS的刺激浓度确定为0.15%可以很好模拟婴幼儿尿布皮炎表皮状态。
实施例2：类尿布皮炎的体外重组表皮模型的构建
步骤一、表皮细胞的准备
取原代角质形成细胞，复苏扩增后，使用P7代细胞，用2.5%胰酶消化液消化，用MCDB153培养基制成单细胞悬液，按照5×105个/mL的密度，接种于培养瓶中，置于37℃、5%CO2条件下培养。
步骤二、表皮细胞的液下培养
取对数生长期细胞，用细胞培养液Ⅰ制成细胞密度为1.25×106个/mL的表皮细胞悬浮液，取200μL接种到含有聚碳酸酯滤膜的细胞培养小室中，置于37℃、5%CO2条件下培养0.5小时；后将小室置于模型培养皿内，每皿添加80 mL细胞培养液Ⅰ，37℃、5%CO2条件下继续培养1天，每天换液，实现表皮细胞的液下培养。
所述培养液Ⅰ，以MCDB153为基础培养基，添加胰岛素0.5 μg/mL，异丙肾上腺素0.1μM，氢化可的松0.02 μg/mL，表皮生长因子1 ng/mL，腺嘌呤10 μg/mL，转铁蛋白5 μg/mL，L-肉碱0.001 mM以及氯化钙0.03 mM。
步骤三、表皮细胞增殖与分化调控
将上述步骤二中的细胞培养小室内的培养液弃掉，更换模型培养皿内的培养液为细胞培养液Ⅱ，添加量为每只培养皿50 mL，使液面与细胞培养小室内细胞上表面位于同一水平线，进行气液面培养，培养时间为8天，培养周期较短，形成的角质层较薄，模拟婴幼儿皮肤状态，培养期间每天换液，培养结束，屏障弱化的重组皮肤表皮模型构建完成。
细胞培养液Ⅱ以MCDB153为基础培养基，添加胰岛素5 μg/mL，异丙肾上腺素1μM，氢化可的松0.2 μg/mL，表皮生长因子10 ng/mL，腺嘌呤50 μg/mL，转铁蛋白12 μg/mL，L-肉碱0.1 mM， L-丝氨酸0.1 mM，棕榈酸0.05 mM，油酸 0.05 mM，精氨琥珀酸0.1 mM，氯化钙1.5 mM，角质细胞生长因子10 ng/mL，粒细胞集落刺激因子20 ng/mL配置而成。
步骤四、类尿布皮炎的重组表皮模型的构建
将构建好的屏障弱化的重组皮肤表皮模型转移至六孔板中，六孔板的每孔内预先添加0.9 mL细胞培养液Ⅱ。在模型表面添加质量体积浓度为0.15%的SLS溶液25 μL，均匀涂抹后，置于37℃，5% CO2孵箱中后孵育24小时。孵育完成后，从培养箱中取出六孔板，清洗皮肤模型表面，采用装有无菌DPBS的洗瓶清洗组织，保持DPBS以稳速不间断的流出，充满培养小室后倒掉，重复15次。清洗15次以后，采用DPBS浸洗组织培养小室里、外各一次轻轻抖动3D皮肤模型培养小室减少组织上残留的DPBS，并用无菌棉签轻轻吸去水分。
实施例3：类尿布皮炎的体外重组表皮模型的构建
步骤一、表皮细胞的准备
取原代角质形成细胞，复苏扩增后，使用P7代细胞，用2.5%胰酶消化液消化，用MCDB153培养基制成单细胞悬液，按照1×105个/mL的密度，接种于培养瓶中，置于37℃、5%CO2条件下培养。
步骤二、表皮细胞的液下培养
取对数生长期细胞，用细胞培养液Ⅰ制成细胞密度为2×106个/ mL的表皮细胞悬浮液，取200μL接种到含有聚碳酸酯滤膜的细胞培养小室中，置于37℃、5%CO2条件下培养2小时；后将小室置于模型培养皿内，每皿添加60mL细胞培养液Ⅰ，37℃、5%CO2条件下继续培养3天，每天换液，实现表皮细胞的液下培养。
所使用的细胞培养液Ⅰ，以MCDB153为基础培养基，添加胰岛素5 μg/mL，异丙肾上腺素1 μM，氢化可的松0.2 μg/mL，表皮生长因子10 ng/mL，腺嘌呤50 μg/mL，转铁蛋白12 μg/mL，L-肉碱0.1 mM以及氯化钙0.2 mM。
步骤三、表皮细胞增殖与分化调控
将上述步骤二中的细胞培养小室内的培养液弃掉，更换模型培养皿内的培养液为细胞培养液Ⅱ，添加量为每只培养皿60mL，使液面与细胞培养小室内细胞上表面位于同一水平线，进行气液面培养，培养时间为10天，培养周期较短，形成的角质层较薄，模拟婴幼儿皮肤状态，培养期间每天换液，培养结束，屏障弱化的重组皮肤表皮模型构建完成。
细胞培养液Ⅱ以MCDB153为基础培养基，添加胰岛素0.5 μg/mL，异丙肾上腺素0.1μM，氢化可的松0.02 μg/mL，表皮生长因子1 ng/mL，腺嘌呤10 μg/mL，转铁蛋白5 μg/mL，L-肉碱0.001 mM，L-丝氨酸0.01 mM，棕榈酸0.01 mM，油酸 0.01 mM，精氨琥珀酸0.05 mM，氯化钙1.0 mM，角质细胞生长因子1 ng/mL，粒细胞集落刺激因子10 ng/mL配置而成。
步骤四、类尿布皮炎的重组表皮模型的构建
将构建好的屏障弱化的重组皮肤表皮模型转移至六孔板中，六孔板的每孔内预先添加0.9 mL细胞培养液Ⅱ。在模型表面添加质量体积浓度为0.15%的SLS溶液25 μL，均匀涂抹后，置于37℃，5% CO2孵箱中后孵育24小时。孵育完成后，从培养箱中取出六孔板，清洗皮肤模型表面，采用装有无菌DPBS的洗瓶清洗组织，保持DPBS以稳速不间断的流出，充满培养小室后倒掉，重复15次。清洗15次以后，采用DPBS浸洗组织培养小室里、外各一次轻轻抖动3D皮肤模型培养小室减少组织上残留的DPBS，并用无菌棉签轻轻吸去水分。
实施例4：类尿布皮炎体外重组表皮模型的构建
步骤一、表皮细胞的准备
取原代角质形成细胞，复苏扩增后，使用P7代细胞，用2.5%胰酶消化液消化，用MCDB1537培养基制成单细胞悬液，按照2×105个/mL的密度，接种于培养瓶中，置于37℃、5%CO2条件下培养。
步骤二、表皮细胞的液下培养
取对数生长期细胞，用细胞培养液Ⅰ制成细胞密度为1.5×106个/ mL的表皮细胞悬浮液，取200 μL接种到含有聚碳酸酯滤膜的细胞培养小室中，置于37℃、5%CO2条件下培养2小时；后将小室置于模型培养皿内，每皿添加70 mL细胞培养液Ⅰ，37℃、5%CO2条件下继续培养2天，每天换液，实现表皮细胞的液下培养。
所述培养液Ⅰ，以MCDB153为基础培养基，添加胰岛素2 μg/mL，异丙肾上腺素0.7 μM，氢化可的松0.15 μg/mL，表皮生长因子8 ng/mL，腺嘌呤20 μg/mL，转铁蛋白10 μg/mL，L-肉碱0.06 mM以及氯化钙0.09 mM。
步骤三、表皮细胞增殖与分化调控
将上述步骤二中的细胞培养小室内的培养液弃掉，更换模型培养皿内的培养液为细胞培养液Ⅱ，添加量为每只培养皿70 mL，使液面与细胞培养小室内细胞上表面位于同一水平线，进行气液面培养，培养时间为8天，培养周期较短，形成的角质层较薄，模拟婴幼儿皮肤状态，培养期间每天换液，培养结束，屏障弱化的重组皮肤表皮模型构建完成。
细胞培养液Ⅱ以MCDB153为基础培养基，添加胰岛素2 μg/mL，异丙肾上腺素0.4 μM，氢化可的松0.12 μg/mL，表皮生长因子4 ng/mL，腺嘌呤35 μg/mL，转铁蛋白8 μg/mL，L-肉碱0.05 mM， L-丝氨酸0.03 mM，棕榈酸0.045 mM，油酸 0.035 mM，精氨琥珀酸0.075 mM，氯化钙1.25mM，角质细胞生长因子5 ng/mL，粒细胞集落刺激因子15 ng/mL配置而成。
步骤四、类尿布皮炎的重组表皮模型的构建
将构建好的屏障弱化的重组皮肤表皮模型转移至六孔板中，六孔板的每孔内预先添加0.9mL细胞培养液Ⅱ。在模型表面添加浓度为0.15%的SLS溶液25 μL，均匀涂抹后，置于37℃，5% CO2孵箱中后孵育24小时。孵育完成后，从培养箱中取出六孔板，清洗皮肤模型表面，采用装有无菌DPBS的洗瓶清洗组织，保持DPBS以稳速不间断的流出，充满培养小室后倒掉，重复15次。清洗15次以后，采用DPBS浸洗组织培养小室里、外各一次轻轻抖动3D皮肤模型培养小室减少组织上残留的DPBS，并用无菌棉签轻轻吸去水分。
以上实施例2~4制备得到类尿布皮炎体外重组表皮模型，分别采用MTT检测、ELISA检测IL-1α分泌情况和形态学染色H&E检测，观察每一试验组所得到的表皮模型的形态和生化指标。结果与实施例1类似。
将本发明实施例所制备得到的类尿布皮炎体外重组表皮模型应用于药理实验中，验证该模型的实用性。
实施例5：类尿布皮炎体外重组表皮模型用于治疗尿布皮炎类的产品有效性评价
以具有抗炎症作用的弱效激素地塞米松为阳性对照进行试验，验证本发明所构建的类尿布皮炎表皮模型的应用效果。实验分为3组，空白对照组（control）、SLS刺激组（类尿布皮炎表皮模型组）和阳性对照组（地塞米松），每组设置5个平行模型。取按照实施例1~4中步骤一~步骤三所制备得到的屏障弱化的体外重组表皮模型作为空白组，按照实施例1~4中步骤一~步骤四所制备得到的类尿布皮炎重组表皮模型作为刺激组（SLS组）；将构建好的类尿布皮炎重组表皮模型转移至预先添加0.9 mL培养液Ⅱ/孔的六孔板中，将待检测的样品地塞米松与SLS溶液混合，使得SLS的终浓度为0.15%，地塞米松的终浓度为0.5%作为阳性对照组，按实验分组在表皮模型表面分别添加各组配制好的溶液各25 μL，均匀涂抹后，置于37℃，5% CO2孵箱中后孵育24小时。分别按照实施例1中所述的方式，采用ELISA检测和MTT检测，数据处理方式同实施例1。MTT检测结果如表3和图4所示。ELISA检测IL-1α分泌量实验结果如图5和表4所示。
样品功效评判标准为：
（1）ELISA检测IL-1α分泌情况：
与SLS刺激组相比，受试物实验组培养基中炎症因子IL-1α释放水平有显著性降低（p<0.05）。
（2）MTT检测组织活力（Tissue viability）：与SLS刺激组相比，受试物实验组的模型组织活力有显著性增高（p<0.05）。
表3：实施例5中MTT检测组织活力实验结果
Figure 297554DEST_PATH_IMAGE004
由表3和图4可知，SLS刺激组与空白对照组（Control）相比，SLS刺激组（类尿布皮炎表皮模型组）的组织活力水平显著性下降（p<0.01），表明造模成功；与类尿布皮炎组相比，地塞米松组使用地塞米松可显著改善SLS刺激引起的组织活力下降的现象（p<0.01），可明确显示阳性对照地塞米松对于尿布皮炎的治疗效果。
表4：实施例5中ELISA检测IL-1α分泌量实验结果
Figure 139608DEST_PATH_IMAGE006
由表4和图5可知，与空白对照组（Control）相比，SLS刺激组的炎症因子IL-1α分泌水平显著升高（p<0.01），表明造模成功；与SLS刺激组的（类尿布皮炎表皮模型组）相比，地塞米松组使用地塞米松可显著抑制SLS刺激引起的IL-1α分泌水平升高的现象（p<0.05），明确显示阳性对照地塞米松对于尿布皮炎的治疗效果。
根据检测结果可以看出，相比与SLS刺激组，地塞米松组具有促进组织活力提升、降低炎症因子IL-1α释放的效果，表明本发明所构建的类尿布皮炎重组表皮模型可以用于治疗尿布皮炎的产品的效果检测实验，对于临床实验前的产品效果筛选具有重要应用价值。
以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。

Claims (5)

1.一种类尿布皮炎的体外重组表皮模型的构建方法，其特征在于，该构建方法包括如下步骤：
步骤（1）：表皮细胞的准备
取原代角质形成细胞，复苏扩增后，使用P3~P7代细胞，用胰酶消化液消化，用MCDB153培养基制成单细胞悬液，按照1.0×105～5×105个/mL的细胞密度，接种于培养瓶中，置于37℃、5% CO2条件下培养；
步骤（2）：表皮细胞的液下培养
取对数生长期的表皮细胞，以细胞培养液Ⅰ制成细胞密度为1.25×106~2.5×106个/ mL的表皮细胞悬浮液，取适量接种到含有聚碳酸酯滤膜的细胞培养小室中，置于37℃、5%CO2条件下培养0.5～2小时；然后将细胞培养小室置于表皮模型培养皿，每只培养皿添加60～80 mL细胞培养液Ⅰ，37℃、5%CO2条件下继续培养1～3天，每天换液，实现表皮细胞的液下培养；
所述细胞培养液Ⅰ是以MCDB153为基础培养基，添加胰岛素、异丙肾上腺素、氢化可的松、表皮生长因子、腺嘌呤、转铁蛋白、L-肉碱和氯化钙配制的；
步骤（3）：表皮细胞增殖与分化调控
将上述步骤（2）中的细胞培养小室内的培养液弃掉，表皮模型培养皿内的培养液更换为细胞培养液Ⅱ，添加量为每只培养皿添加50~70 mL细胞培养液Ⅱ，使液面与细胞培养小室内细胞上表面位于同一水平线，进行气液面培养，37℃、5%CO2条件下培养，培养时间为8~10天，培养期间每天换液，可得屏障弱化的体外重组表皮模型；
所述细胞培养液II是以MCDB153为基础培养基，添加胰岛素、异丙肾上腺素、氢化可的松、表皮生长因子、腺嘌呤、转铁蛋白、L-肉碱、L-丝氨酸、棕榈酸、油酸、精氨琥珀酸、氯化钙、角质细胞生长因子和粒细胞集落刺激因子配制的；
步骤（4）：类尿布皮炎重组表皮模型的构建
将步骤（3）所得到的屏障弱化的体外重组表皮模型转移至多孔板中，每孔内预先添加适量培养液Ⅱ，在每孔的表皮模型表面添加质量体积浓度为0.15%的十二烷基硫酸钠，均匀涂抹后，置于37℃，5% CO2孵箱中后孵育24小时，清洗后即得到类尿布皮炎的重组表皮模型。
2.根据权利要求1所述的类尿布皮炎的体外重组表皮模型的构建方法，其特征在于：所述细胞培养液Ⅰ是以MCDB153为基础培养基，添加胰岛素0.5~5 μg/mL，异丙肾上腺素0.1~1μM，氢化可的松0.02~0.2 μg/mL，表皮生长因子1~10 ng/mL，腺嘌呤10~50 μg/mL，转铁蛋白5~12 μg/mL，L-肉碱0.001~0.1 mM和氯化钙0.03~0.2 mM配制的。
3.根据权利要求2所述的类尿布皮炎的体外重组表皮模型的构建方法，其特征在于：所述细胞培养液II是以MCDB153为基础培养基，添加胰岛素0.5~5 μg/mL，异丙肾上腺素0.1~1μM，氢化可的松0.02~0.2 μg/mL，表皮生长因子1~10 ng/mL，腺嘌呤10~50 μg/mL，转铁蛋白5~12 μg/mL，L-肉碱0.001~0.1 mM，L-丝氨酸0.01~0.1 mM，棕榈酸0.01~0.05 mM，油酸0.01~0.05 mM，精氨琥珀酸0.05~0.1 mM，氯化钙1.0~1.5 mM，角质细胞生长因子1~10 ng/mL和粒细胞集落刺激因子10~20 ng/mL配制的。
4.根据权利要求1所述的类尿布皮炎的体外重组表皮模型的构建方法，其特征在于：步骤（1）表皮细胞的准备中，取原代角质形成细胞，复苏扩增后，用胰酶消化液消化P3~P7代细胞，用于消化P3~P7代细胞的胰酶消化液为质量体积浓度2.5%的胰酶。
5.根据权利要求3所述的类尿布皮炎的体外重组表皮模型的构建方法，其特征在于：所述步骤（4）具体为将步骤（3）所得到的屏障弱化的体外重组表皮模型转移至多孔板中，每孔内预先添加0.9mL细胞培养液Ⅱ，在每孔的表皮模型表面添加质量体积浓度为0.15%的十二烷基硫酸钠25μL，均匀涂抹后，置于37℃，5% CO2孵箱中后孵育24小时，然后用DPBS缓冲液将组织表面残留的液体用清洗干净，即得到类尿布皮炎的重组表皮模型。
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