CN111562209A - 一种快速鉴定四倍体茄子砧木的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种快速鉴定四倍体茄子砧木的方法，属于植物变异快速鉴定领域，该方法操作简单，生产成本低，能短时间内快速鉴定大量四倍体水茄植株。通过形态学初筛结合流式细胞仪倍性鉴定可快速获得四倍体。通过形态鉴定进行初筛，流式细胞仪鉴定确认倍性，整个过程周期短，操作简便，能快速鉴定植株倍性，并以种子为实验材料，所用材料简单易取；所用试剂配比简单，价格低廉，操作步骤简单明了，四倍体发生率高达15％。
Description
技术领域
本发明涉及植物变异快速鉴定领域，尤其涉及一种快速鉴定四倍体茄子砧木的方法。
背景技术
水茄(Solanum torvum)又称为“托鲁巴姆"，是栽培种茄子(Solanum melogenaL.)的近缘野生种，原产于美洲。该植物高抗青枯病、黄萎病、枯萎病、根结线虫等主要土传病虫害，是茄子和番茄生产上普遍使用的嫁接砧木。
植物多倍体育种已经广泛应用于生产与育种研究中。植物染色体加倍后，多倍体往往具有植株粗壮、抗逆性更强等优点，因此培育四倍体水茄对茄子砧木遗传改良具有重要意义。培育优良四倍体新品种，对于茄子砧木种质资源开发和利用，以及提升其市场价值具有重要意义。然而，目前的多倍体育种方法的鉴定工作量较大，鉴定速度较慢，导致选育时间较长，育种效率不高。因此，如何提高植物多倍体植株的鉴定筛选速度，缩短育种时间，从而为农业生产选育优良多倍体砧木新品种成为本领域亟待解决的课题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种快速鉴定四倍体茄子砧木的方法，解决背景技术中提到的技术问题。该方法操作简单，成本低，能短时间内快速鉴定筛选出大量四倍体水茄植株。通过形态学初筛结合流式细胞仪倍性鉴定可快速获得四倍体。
一种快速鉴定四倍体茄子砧木的方法，所述方法包括如下步骤：
步骤1：形态鉴定：培育新植株，待新芽萌发后，选出外观形态上与正常植株不同的植株即为初步筛选变异植株；
步骤2：流式细胞仪鉴定：将初步筛选变异植株分别提取单细胞悬浮液，通过流式细胞仪测定其细胞的DNA含量，以二倍体水茄叶片细胞经荧光染色后上机时出峰的荧光强度为对照，荧光强度翻一倍的植株即为四倍体。
所述步骤1中，初步筛选变异植株的标准为：植株叶色浓绿、节间距短、叶片厚而圆润和叶片变大变宽。
所述步骤1中培育新植株的具体过程为：
选取一百粒饱满的水茄种子置于锥形瓶中，配制0.3％秋水仙素溶液，将溶液倒入锥形瓶中浸没水茄种子，将锥形瓶盖紧后放入摇床轻轻震荡(转速为50rpm)48h；
浸泡完成的种子取出后用蒸馏水冲洗5遍，再用1g/L GA3浸种3h，在培养皿上垫两层滤纸，将种子点播至滤纸上，保持滤纸湿润，盖上培养皿后放入恒温箱催芽，催芽温度为28℃-30℃；
将催芽露白的种子播于装有育苗基质50孔穴盘中，出芽率为46％，待植株生长至三叶一心时进行倍性鉴定。
所述苗基质由泥炭、椰糠和珍珠岩组成，泥炭、椰糠和珍珠岩的体积比为3:2:1。
所述步骤2中提取单细胞悬浮液的具体过程为，于上午9:00-10:00选取新鲜幼嫩的叶片0.1g，在蒸馏水中洗净并用吸水纸擦干，放在预冷的玻璃培养皿中，叶片浸没在2mLOTTO I缓冲液中，用单面刀片切碎，切碎时每个样品单独使用刀片，冰上静置5min，细胞核游离出来，此时即为细胞悬浮液。
所述步骤2中DNA含量测定的过程为：
将细胞悬浮液经400目尼龙网过滤至2mL离心管内，在离心机中离心5min，离心机的温度为4℃，转速为1000g，弃去上清液，加入OTTO I缓冲液100μL，轻轻震荡重悬细胞液，室温孵育30min；
加入1mL OTTO II缓冲液和50μL PI染液，锡纸避光染色30min，开启并预热流式细胞仪，清洗后迅速上机进行测定，染色的样品经488nm波长光激发，测试10000个核；
以二倍体水茄(染色体2n＝2x＝24)叶片细胞荧光染色后DNA含量分布曲线图为对照，调整仪器阈值使峰值荧光道数在65道，检测变异植株叶片细胞的DNA相对含量，检测细胞其峰值位置位于130道，如DNA相对含量翻倍，即为四倍体植株，如出现双峰，即为嵌合体。
所述OTTO I缓冲液为0.1mol/L柠檬酸和0.5％(V/V)吐温20，常温保存，OTTO II缓冲液为0.4mol/L磷酸氢二钠，4℃保存。
本发明采用了上述技术方案，本发明具有以下技术效果：
本发明通过形态鉴定进行初筛，流式细胞仪鉴定确认倍性，整个过程周期短，操作简便，能快速鉴定植株倍性，并以种子为实验材料，所用材料简单易取；所用试剂配比简单，价格低廉，操作步骤简单明了，四倍体发生率高达15％，该方法操作简单，生产成本低，四倍体发生率高，是短时间内获得大量四倍体水茄的有效途径，通过形态学初筛结合流式细胞仪倍性鉴定可快速获得四倍体。
附图说明
图1为流式细胞仪测定二倍体DNA荧光出峰图；
图2为流式细胞仪测定嵌合体DNA荧光出峰图；
图3为流式细胞仪测定四倍体DNA荧光出峰图；
图4为二倍体(左)和四倍体(右)苗期形态比较图；
图5为二倍体(左)和四倍体(右)现蕾期形态比较图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下举出优选实施例，对本发明进一步详细说明。然而，需要说明的是，说明书中列出的许多细节仅仅是为了使读者对本发明的一个或多个方面有一个透彻的理解，即便没有这些特定的细节也可以实现本发明的这些方面。
一种快速鉴定四倍体茄子砧木的方法，所述方法包括如下步骤：
步骤一：选取一百粒饱满的水茄种子置于锥形瓶中，配制0.3％秋水仙素溶液，将溶液倒入锥形瓶中浸没水茄种子，将锥形瓶盖紧后放入摇床轻轻震荡(转速为50rpm)48h。
步骤二：浸泡完成的种子取出后用蒸馏水冲洗5遍，再用1g/L GA3浸种3h，在培养皿上垫两层滤纸，将种子点播至滤纸上，保持滤纸湿润，盖上培养皿后放入恒温箱催芽，催芽温度为28℃-30℃。
步骤三：将催芽露白的种子播于装有育苗基质(泥炭：椰糠：珍珠岩＝3:2:1)50孔穴盘中，出芽率为46％，待植株生长至三叶一心时进行倍性鉴定。
步骤四：通过形态观察，以植株节间距短，叶片厚而圆润，叶色较深为变异指标，将选取出的疑似四倍体植株进行流式细胞仪鉴定，检测其细胞DNA的相对含量。具体对比如图4-5所示。
步骤五：配制OTTO缓冲液，OTTO I缓冲液配置：0.1mol/L柠檬酸，0.5％(V/V)吐温20，常温保存；OTTO II缓冲液配置：0.4mol/L磷酸氢二钠，4℃保存。
步骤六：于上午9:00-10:00选取新鲜幼嫩的叶片0.1g，较易获得单细胞悬液。在蒸馏水中洗净并用吸水纸擦干，放在预冷的玻璃培养皿中，叶片浸没在2mL OTTO I缓冲液中，用单面刀片迅速切碎，每个样品单独使用刀片，以防相互影响，冰上静置5min，使细胞核游离出来，此时即为细胞悬浮液。
步骤七：将细胞悬浮液经400目尼龙网过滤至2mL离心管内，在离心机中(温度4℃、转速为1000g)离心5min，弃去上清液，加入OTTO I缓冲液100μL，轻轻震荡重悬细胞液，室温孵育30min。
步骤八：加入1mL OTTO II缓冲液和50μL PI染液，锡纸避光染色30min。开启并预热流式细胞仪，清洗后迅速上机进行测定。染色的样品经488nm波长光激发，测试10000个核。
步骤九：以二倍体水茄(染色体2n＝2x＝24)叶片细胞的DNA含量分布曲线图为对照，调整仪器阈值使峰值荧光道数在65道，检测变异植株叶片细胞的DNA相对含量，检测细胞其峰值位置位于130道，如DNA相对含量翻倍，即为四倍体植株，如出现双峰，即为嵌合体。经检测后发现四倍体15株，四倍体发生率达15％，发现嵌合体12株，嵌合体发生率12％，具体测试结果如图1-3所示。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (7)
1.一种快速鉴定四倍体茄子砧木的方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤：
步骤1：形态初步鉴定：培育新植株，待新芽萌发后，选出外观形态上与正常二倍体植株不同的植株即为初步筛选变异植株；
步骤2：流式细胞仪鉴定：将初步筛选变异植株分别提取单细胞悬浮液，通过流式细胞仪测定其细胞的DNA含量，以确定倍性的二倍体水茄叶片细胞荧光染色后上机时出峰的荧光强度为对照，荧光强度翻一倍的植株即为四倍体。
2.根据权利要求1所述的一种快速鉴定四倍体茄子砧木的方法，其特征在于：所述步骤1中，初步筛选变异植株的标准为：植株叶色浓绿、节间距短、叶片厚而圆润和叶片变大变宽。
3.根据权利要求1所述的一种快速鉴定四倍体茄子砧木的方法，其特征在于：所述步骤1中培育新植株的具体过程为：
选取一百粒饱满的水茄种子置于锥形瓶中，配制0.3％秋水仙素溶液，将溶液倒入锥形瓶中浸没过水茄种子，将锥形瓶盖紧后放入摇床轻轻震荡(转速为50rpm)48h；
浸泡完成的种子取出后用蒸馏水冲洗5遍，再用1g/L GA3浸种3h，在培养皿上垫两层滤纸，将种子点播至滤纸上，保持滤纸湿润，盖上培养皿后放入恒温箱催芽，催芽温度为28℃-30℃；
将催芽露白的种子播于装有育苗基质50孔穴盘中，出芽率为46％，待植株生长至三叶一心时进行倍性鉴定。
4.根据权利要求3所述的一种快速鉴定四倍体茄子砧木的方法，其特征在于：所述苗基质由泥炭、椰糠和珍珠岩组成，泥炭、椰糠和珍珠岩的体积比为3:2:1。
5.根据权利要求1所述的一种快速鉴定四倍体茄子砧木的方法，其特征在于：所述步骤2中提取单细胞悬浮液的具体过程为，于上午9:00-10:00选取新鲜幼嫩的叶片0.1g，在蒸馏水中洗净并用吸水纸擦干，放在预冷的玻璃培养皿中，叶片浸没在2mL OTTO I缓冲液中，用单面刀片切碎，切碎时每个样品单独使用刀片，冰上静置5min，细胞核游离出来，此时即为细胞悬浮液。
6.根据权利要求5所述的一种快速鉴定四倍体茄子砧木的方法，其特征在于：所述步骤2中DNA含量测定的过程为：
将细胞悬浮液经400目尼龙网过滤至2mL离心管内，在离心机中离心5min，离心机的温度为4℃，转速为1000g，弃去上清液，加入OTTO I缓冲液100μL，轻轻震荡重悬细胞液，室温孵育30min；
加入1mL OTTO II缓冲液和50μL PI染液，锡纸避光染色30min，开启并预热流式细胞仪，清洗后迅速上机进行测定，染色的样品经488nm波长光激发，测试10000个核；
以二倍体水茄(染色体2n＝2x＝24)叶片细胞荧光染色后DNA含量分布曲线图为对照，调整仪器阈值使峰值荧光道数在65道，检测变异植株叶片细胞的DNA相对含量，检测其细胞荧光峰值位置位于130道，如DNA相对含量翻倍，即为四倍体植株，如出现双峰，即为嵌合体。
7.根据权利要求5所述的一种快速鉴定四倍体茄子砧木的方法，其特征在于：所述OTTOI缓冲液为0.1mol/L柠檬酸和0.5％(V/V)吐温20，常温保存，OTTO II缓冲液为0.4mol/L磷酸氢二钠，4℃保存。
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