CN112575070B - 一种冬枣优良突变体选种的鉴定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种冬枣优良突变体选种的鉴定方法，属于果树栽培育种技术领域。本发明鉴定方法包括以下步骤：1)试验地的选择；2)对优良单株进行初选、复选，标记变异株；3)变异株的冬枣植株与对照组的冬枣植株从生长发育、果实品质、结果特性、形态指标进行对比分析测定；4)进一步将变异株的冬枣植株与对照组的冬枣植株进行RAPD多态性分析，验证变异株的遗传物质是否发生变化；5)根据步骤3)和步骤4)的鉴定结果判断标记为变异株的冬枣植株是否为真正突变体；6)将步骤5)判断得到的正真突变体的冬枣植株进行基因转录组高通量测序，进行最终鉴定。本发明的鉴定方法简单，能够有效、快速的筛选出优良突变体。
Description
技术领域
本发明属于果树栽培育种技术领域，涉及果树突变体选种的鉴定方法，尤其是一种冬枣优良突变体选种的鉴定方法。
背景技术
冬枣是(Ziziphus jujuba cv.Dongzao)鼠李科(Rhamnaceae)枣属 (ZizyphusMill)植物。距今已有3000多年的栽培历史，在我国分布很广。且具有药用价值，适应性、抗逆性、耐瘠薄、抗盐碱等的优点。其冬枣果实营养丰富，含有维生素和钙、钾、铁等多种营养元素，最突出的特点是维生素C含量高，是普通水果的80倍以上，受人们喜爱。枣树栽培地面积可达200hm2，仅次于苹果和柑橘，产量达到900万吨，居干果首位，在我国农业产业结构中占据不可或缺的地位。但由于长期的粗放栽培管理等原因冬枣品种退化严重，品质差异很大，难以满足广人们的需求。良好的种质资源是进行育种的重要保障，也是解决目前冬枣没有专用型品种的基础。
目前关于冬枣的研究多集中在栽培技术、保鲜、贮藏生理等方面。对冬枣基础性研究少有报导，尤其关于冬枣种质资源、冬枣品种内遗传变优良突变体鉴定等的研究，因此，进行枣树种质、育种、栽培管理及鉴定等一系列研究对于我国农业新品种研究、农业农村建设具有重大意义。
通过检索发现如下与本申请相关的专利文献，具体公开内容如下：
1、一种耐盐玉米种质快速、高效、可移栽鉴定方法(CN109122254A)，包括以下步骤：1)对玉米自交系种子进行萌发；2)将萌发的种子放在多个移栽盘上储存；3)将多个移栽盘分别放入不同的容器，移栽盘的底部与容器的底部内壁在高度上设有预定间隙，在容器内加注玉米水培营养液；4)在部分容器营养液中加盐处理，其相对应的其他容器营养液中不加盐作为对照；5)在玉米子叶完全展开后，去掉玉米胚乳；6)定级鉴定筛选种质材料，筛选种质材料采用以下处理方式：一是通过筛选获得突变体材料，在盐敏感材料中出现耐盐单株时，进行移栽确保正常授粉结实，进行遗传研究；二是对稳定耐盐材料进行整体移栽育种研究、继续耐盐实验研究或育种研究各种处理。
2、强抗寒白菜型冬油菜温敏雄性不育突变体的鉴定及筛选方法(CN107593435B)，所述方法包括以下步骤：1)将强抗寒白菜型冬油菜种子秋播，正常越冬后的植株在返青后到初花期时，在日高温时段田间温度低于22℃时进行育性鉴定，所述育性鉴定的操作方式是拔掉不育株，留下可育株；2)将步骤1) 获取得到的可育株的地上部分20-30cm留茬，剪除上面花枝部分，让其继续生长再开花，使生育期延后不小于20天，日高温时段田间温度不低于28℃的情况下进行育性鉴定，筛选并标记不育株，将筛选得到的不育株移栽到高海拔冷凉生态区；所述高海拔冷凉生态区的海拔不低于2200m；所述高海拔冷凉生态区的环境温度不高于22℃；若移栽至高海拔冷凉生态区的不育株转换为可育，则移栽至高海拔冷凉生态区的不育株为育性受生态因子变化影响的生态型不育株，同时在高海拔冷凉可育生态区对筛选得到的植株进行相互授粉或人工授粉得到后代；3) 将步骤2)得到的后代进行盆栽育性鉴定：盆栽幼苗在四叶期4℃下进行30天的春化处理后，在开花前10天将其移入人工气候室；所述人工气候室的温度是28℃和22℃，在28℃和22℃下先后均处理7天，观察步骤2)所得后代的育性变化；若步骤2)所得后代在28℃时全部表现为不育且在22℃时全部表现为可育，则通过步骤2)所确定得到的育性受生态因子变化影响的生态型不育株确定为生态型不育株。
3、一种花生突变体的快速筛选方法及应用(CN109156352A)，对花生离体诱变获得的再生苗，采用SSR方法进行基因型上的突变性鉴定，淘汰基因型未突变的再生苗，鉴定的基因型突变的再生苗即为花生突变体；步骤为：(1)提取诱变亲本花生品种和诱变后再生苗叶片的全基因组DNA，进行SSR的PCR扩增；(2) 对比诱变亲本花生和诱变后再生苗的SSR扩增结果，选择扩增结果呈现多态性的再生苗即为花生突变体，淘汰基因型未突变的再生苗。
4、一种基于夹板水培法的玉米根系突变体筛选方法(CN111837919A)，包括以下步骤：S1、玉米种子消毒，将玉米种子置于50mL的圆底无菌离心管中，在室温下先用ddH2O洗涤2次，去除玉米种子表面杂质；然后用70％的乙醇溶液表面消毒5min，然后将乙醇溶液沥出，用ddH2O将种子洗三次；洗净后，用12％的花王消毒溶液消毒15min，再将花王消毒溶液沥出，然后用ddH2O将种子洗三次；将玉米种子放在滤纸上静置，静置至玉米种子表面变干；S2、在夹板培养装置中培养，夹板培养装置用配制好的2.5g/L克菌丹溶液进行浸润处理，然后夹板间隙中放置8个大小相同的消毒后的玉米种子，玉米种子水平距离为3cm，依次做好标记，且每个夹板培养装置中含有至少一个野生型玉米，然后以30个夹板培养装置为一组，放置在培养盆中进行培养，且在培养盆加入霍格兰培养液，霍格兰培养液将夹板培养装置浸没，置于光照培养室内培养；S3、玉米根系性状记录，玉米种子在培养盆中培养14天，在玉米种子培养14天后记录各组玉米种子发芽成的玉米幼苗的根系结构，利用EpsonPerfection V700 Photo系统对玉米幼苗的根系结构进行扫描，使用WinRhizo根系分析系统对扫描图像进行根特征分析；S4、筛选移栽，将扫描分析后经过筛选的玉米突变体移栽至无纺布培养袋中，培养袋中放置有培养基质，移栽后向玉米突变体根部施加生根溶液以促进玉米生根，室内培养7天后，移栽大田，完成玉米突变体筛选过程。
通过技术特征的对比，上述公开专利文献与本发明的技术结构不相同，不会影响本发明申请的创造性及新颖性。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种冬枣优良突变体的鉴定方法，该方法成本低、简便易行、安全环保，在较短时间内获得优良突变体，通过对冬枣园进行选种(初选和复选)，筛选出优良突变体单株，对冬枣品种进行更新复壮，并从生长、结果特性、果实品质、植株形态差异，RAPD多态性和高通量测序方面进行了鉴定。
本发明解决其技术问题是采取以下技术方案实现的：
一种冬枣优良突变体选种的鉴定方法，包括以下步骤：
1)试验地的选择，在该试验地栽种三种不同品种的冬枣植株；
2)根据果实品质指标对优良单株进行初步筛选，再对初步筛选得到的优良单株根据其对应的果实品质指标进行隶属函数值分析筛选，并标记变异株，将初步筛选未达到果实品质指标的冬枣植株作为对照组；
3)将获得标记为变异株的冬枣植株与对照组的冬枣植株从生长发育、果实品质、结果特性、形态指标进行对比分析测定；
4)将获得标记为变异株的冬枣植株与对照组的冬枣植株进行RAPD多态性分析，验证变异株的遗传物质是否发生变化；其中RAPD多态性分析采用以下步骤： a)提取变异株以及对照组的冬枣植株枣叶的全基因组DNA，b)筛选3对多态性较强的引物进行PCR扩增；c)对比变异株和对照组的冬枣植株的扩增结果，扩增结果呈现多态性的变异株即为冬枣植株突变体；d)对PCR扩增结果进行检测；
5)根据步骤3)和步骤4)的鉴定结果判断标记为变异株的冬枣植株是否为真正突变体；
6)将步骤5)判断得到的正真突变体的冬枣植株进行基因转录组高通量测序，进行最终鉴定。
在上述方案的基础上，所述步骤1)试验地选择土壤类型为黏壤土，pH为 7.8，含盐量为0.18％。
在上述方案的基础上，所述步骤2)的果实品质指标包括平均单果重为 16.011g—23.167g；含水量为65.02％—72.7％；可溶性糖为19.572％—30.216％；可滴定酸为0.261％—0.355％、可溶性固形物为23.78％—33.17％；糖酸比为66.859 —85.115。
在上述方案的基础上，所述步骤2)的果实品质指标的隶属函数值的范围为0.144—0.456，且果实品质指标的隶属函数值大于0.456的冬枣植株标记为变异株。
在上述方案的基础上，所述步骤1)试验地选择的试验地面积120亩，三种不同品种的冬枣植株选为大港冬枣、沾化冬枣、沾冬2号3个品种，树龄平均为10年，试验地内枣树南北向栽植，株行距1.5m×3m。
在上述方案的基础上，所述PCR扩增结果的检测方法为：A)制胶；B)左右灌胶；C)上样与电泳：将扩增产物在琼脂糖凝胶上电泳，电泳缓冲液位1×TBE，每个点样孔加5μL样品，75伏恒电压下电泳约45分钟；D)凝胶分析:待电泳完后，将凝胶移入凝胶成像系统中，扫描拍照,统计凝胶电泳条带数量与结果，计算遗传相似系数。
在上述方案的基础上，所述PCR扩增体系为：25mmol/LMgCl2 2μL，10×PCR 缓冲液2.5μL，10ng/μL引物1μL，50ng/μL DNA 2μL，2mmol/L dNTP 2 μL，5U/μL Taq DNA聚合酶0.3μL，双蒸水15.2μL。
在上述方案的基础上，所述PCR扩增反应程序为：94℃预变性2min；94℃变性30s，37℃退火40s，72℃延长60s，40个循环；72℃延长10min；4℃保温∞。
在上述方案的基础上，所述扩增结果呈现多态性是指扩增条带增多或扩增条带减少。
本发明的优点和积极效果是：
(1)本发明使用的方法能够通过对优良单株进行初选、复选，并对疑似突变体植株进行生长发育、结果特性、果实品质、植株形态差异，RAPD多态性和高通量测序进行了鉴定，选出新的优质品种，为今后提高产量和果实品质等的育种目标奠定基础。
(2)本发明使用的方法能正确地选择出具有优良性状的特性的突变体，这样既能够对冬枣品种进行更新复壮，又能保证突变体性状的优良性；本发明方法较全面且简单快速，能够从本质上分析出优良突变体；为后期改善和提高枣树产量和品质提供科学依据。
(3)本发明使用的方法方法简单、可靠性较高、效果较好，能够为今后选种鉴定提供合理的依据；利用高通量测序，通量高、效率高、成本低能够较准确的对鉴定出突变体。
附图说明
图1变异株与对照组冬枣3组引物的电泳图谱；
图2变异株冬枣的基因转录组高通量测序流程；
图3 P1_vs_B1差异表达基因KEGG注释分类统计图；
图4 P1_vs_B2差异表达基因KEGG注释分类统计图；
图5 ZD_vs_B1差异表达基因KEGG注释分类统计图；
图6 ZD_vs_B2差异表达基因KEGG注释分类统计图。
具体实施方式
在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义；下面结合具体实施例，并参照数据进一步详细的描述本发明，以下实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。
一种冬枣优良突变体选种的鉴定方法，包括以下步骤：
步骤1：试验地的确定
试验地位于天津市滨海新区战备路沈清庄，方位为东经116°43'53"，北纬 39°40'32"。土壤类型为黏壤土，pH为7.8，含盐量为0.18％。气候属于暖温带大陆性季风气候，年平均气温为12.1℃，年平均降雨量为560.7mm，年相对湿度为63％。供试园面积120亩，栽培有大港冬枣、沾化冬枣、沾冬2号3个品种，树龄平均为10年，样本园内枣树南北向栽植，株行距1.5m×3m。
步骤2：对优良单株进行初选、复选，从而确定疑似变异株
冬枣果实成熟时，在120亩的冬枣栽培地进行拉网式的优良单株筛选，根据果实品质指标(单果重、含水量、可溶性糖、可滴定酸、可溶性固形物、VC、糖酸比)7个指标对优良单株进行初步筛选；最后通过果实品质测定初选了52 个优良单株，并标记序号，果实品质指标结果显示：初选得到的52个优良单株的平均单果重为16.011g—23.167g；含水量为65.02％—72.7％；可溶性糖为 19.572％—30.216％；可滴定酸为0.261％—0.355％、可溶性固形物为 23.78％—33.17％；糖酸比为66.859—85.115；而到果实品质指标未达到上述参数的冬枣植株作为对照组；
对初选得到的52个冬枣优良单株复选，并进行隶属函数分析，结果显示：大多数出现的优良单株果实品质平均隶属函数值为0.144—0.456之间，而17 号、32号优良单株果实品质的隶属函数值远远高于其他优良单株，将17号、 32号优良单株分别命名标记为突变体1号，突变体2号，以栽培园内栽植的果实品质指标未达到上述参数的冬枣植株的大港冬枣、沾化冬枣、沾冬2号为对照组，进行生长发育、结果性状、果实品质、形态指标、遗传性鉴定的比较与鉴定。
步骤3：突变体与对照组植株的生长发育、果实品质、结果特性、形态指标进行测定
由上数据分析：(1)从果实品质层面讲：2个突变体冬枣的果实品质指标显著高于对照组的沾化冬枣、大港冬枣、沾冬2号。(2)从结果特性层面讲：2个突变体的结果特性指标显著低于对照组的沾化冬枣、大港冬枣和沾冬2号。
表1相关矩阵的特征值
Tab.1 Eigenvalues of the correlation matrix
表2主要主成分的特征向量
Tab.2 Eigenvectors of leading principal components
由上表1、2主成分分析结果得出：22个指标共提取出2类主成分(特征值>1)，累计贡献率达94.012％。第一主成分的贡献率为85.555％，其中影响较大的指标是果实横径(特征根为0.994)，其余指标的特征值也均在0.7以上；
第二主成分的贡献率为94.012％，其中影响较大的指标是可滴定酸(特征根为0.546)；除果实横径、单果重、花序数枣吊指标之外，其余指标特征值均在 0.1以上；
将2个主成分中每个指标所对应的系数代入具体数据后，得到主成分方程如下：
Y1＝0.994X1+0.991X2+0.985X3-0.980X4+0.966X5+0.966X6+0.962X7+0.955X8-0.952X9+0.94810+0.944X11+0.943X12++0.937X13+0.933X14-0.929X15+0.926X16-0.900 X17-0.839X18+0.833X19- 0.830X20+0.808X21-0.786X22
Y2＝0.076X1-0.025X2+0.127X3+0.042X4+0.160X5+0.160X6+0.175X7-0.175X8-0.306X9-0.296X10+0.330X11-0.288X12-0.319X13+0.335X14+0.233X15+0.179X16+0.429 X17+0.120X18-0.546X19+ 0.323X20+0.537X21-0.402X22
然后对突变体与对照组的相关指标进行隶属函数分析；
表3变异株与对照组冬枣生长性状隶属函数
Table 3 Membership functions of growth traits of the mutant strainand the control group
由上数据分析表明：生长情况高低排名为：沾化冬枣＞大港冬枣＞沾冬2号＞突变体2号＞突变体1号。突变体1号与突变体2号在生长发育上弱于沾化冬枣、大港冬枣和沾冬2号。
表4变异株与对照组冬枣结果特性隶属函数
Table 4 Resulting characteristics of mutant strains and control groupDongzao membership function
结果显示：不同品种冬枣树开花情况高低排名为：沾化冬枣＞大港冬枣＞沾冬2号＞突变体1号＞突变体2号。
表5变异株与对照组果实品质性状隶属函数
Table 5 Membership functions of fruit quality traits of mutant andcontrol groups
由上数据显示：不同品种冬枣树果实品质高低排名为：突变体1号＞突变体2号＞沾冬2号＞沾化冬枣＞大港冬枣。突变体1号在果实品质上明显高于大港冬枣和沾冬2号冬枣；突变体2号在果实品质上与沾冬2号相近，远高于沾化冬枣和大港冬枣。
步骤4：变异株RAPD多态性分析，验证遗传物质是否发生变化 (1)DNA的提取
选择以CIAB法提取样本DNA，5个冬枣叶片样品DNA的提取采用索莱宝DNA 提取试剂盒提取，具体步骤如下：
A称取样叶粉末约200mg，放入事先装有400μl溶液A，20μl RNaseA (10mg/ml)和5μl巯基还原剂的离心管中，颠倒混匀，室温放置10min。
B加入140μl溶液B，颠倒混匀，12000r离心10min，上清液(约400～ 500μl)移到新的离心管中，注意不要吸入沉淀。
C加入和上清液同体积的溶液C，充分颠倒混匀，再加入与溶液C相同体积的无水乙醇。将混合液加入吸附柱中(1次加不完，可分两次)，12000r离心 5min，弃废液。
D再向吸附柱中加入加入混合有无水乙醇的漂洗液600μl，12000r离心 1min，弃废液，吸附柱放回新的收集管中。重复此过程。然后12000r离心2min。
E将吸附柱室温或50℃温箱内放置5min。
F将吸附柱放入一个干净的离心管中，向膜中央悬空加入100μl经65℃水预热的洗脱液。室温放置1～5min，12000r离心2min，得到冬枣叶片基因组 DNA。若暂时不用可-20℃冰箱内保存。
(2)引物的筛选
筛选了3对多态性较强且扩增产物清晰地引物组合，见下表：
表6 RAPD引物扩增结果
Table 6 RAPD primer amplification results
| 引物名称 | 引物序列 | 条带总数 | 多态性条带数 | 态性比率/％ |
| S25 | CCCAAGGTCC | 20 | 15 | 75 |
| S130 | AGGGGTCTTG | 21 | 11 | 52.38 |
| OPE1 | GGAAGCTTGG | 15 | 10 | 66.67 |
| 总计 | — | 58 | 38 | — |
3对引物共扩增条带58条，其中多态性带38条；平均一对引物扩增条带19.3条，多态性带12.7条。多态百分比为52.38％～77.27％。3对引物组合均能揭示DNA多态性，其中引物OPE1和S130扩增出多态性条带较少，分别为10 条和11条，多态性比例也较小，分别为52.38％和66.67％，S25扩增的多态性带最多，为15条，多态性比例最高为75％。
(3)PCR扩增方法
打开试剂盒清点试剂，待试剂管中溶液溶解后，离心60s，配置PCR反应液。采用25μlPCR反应体系，如下表：
表7PCR反应液配置(25μl体系)
Table 7 PCR reaction solution configuration(25μl system)
加完各试剂后，离心机中4000r离心60s。将离心管放入Bio-RAD全自动基因扩增仪C1000 Touch中，按表2-4设置程序，进行PCR扩增。
表8 PCR扩增程序
Table 8 PCR amplification program
扩增结束后，将PCR产物置于-20℃冰箱中保存备用。
(4)琼脂糖凝胶电泳
(A)制胶：称取0.25g琼脂糖放入锥形瓶中，加入25ml 1×TAE缓冲液，微波炉中，中高火加热摇溶，直至无颗粒物为止。然后加入3μl Gel Red染液于锥形瓶中，室温冷却至60℃。
(B)左右灌胶：将U型板放入胶槽中，插好梳子，将冷却好的琼脂糖溶液缓慢倒入胶槽中，室温冷却30min至凝固。
(C)上样与电泳：待胶凝固之后，将梳子拔出，将胶和U型板一起放入电泳槽中，倒入1×TAE缓冲液，至没过胶面1.5mm。将10μl PCR产物和2μl 6×Loading Buffer混合并吸取5μl混合液点样。之后连接电泳仪设置75V， 45min进行电泳。
(5)凝胶分析
待电泳完后，将凝胶移入凝胶成像系统中，扫描拍照，统计凝胶电泳条带数量与结果，计算遗传相似系数。(见图1)
其中突变体1号为B1；突变体2号为B2；大港冬枣为P1；沾化冬枣为P2；沾冬2号ZD。从图中可得知，突变体1号、突变体2号与其它所有冬枣样品谱带都不相同。结合对突变体1号、突变体2号与对照组冬枣的生长发育、生长性状、果实指标观测结果得出，突变体1号、突变体2号分别与大港冬枣、沾冬2 号相比，遗传物质发生了变化。
表9突变体与对照组冬枣RAPD多态性分析
Table 9 RAPD polymorphism analysis of mutant strains and controlgroup
结果显示：多态性比率最高的为变异2号，其次，变异1号为69.23％；沾化冬枣的态性比率最低为50％。
表10突变体与对照组冬枣间遗传相似系数分析
Table 10 Analysis of genetic similarity coefficient between themutant strain and the control group Dongzao
结果显示：变异株冬枣与对照组冬枣的比较中，突变体1号冬枣与大港冬枣、沾化冬枣、沾冬2号的遗传相似系数分别为0.6111、0.5516、0.6349，突变体2号冬枣与大港冬枣、沾化冬枣、沾冬2号的遗传相似系数分别为0.4907、 0.4444、0.4646。推测突变体1号可能为沾冬2号的变异体，2个变异株可能为天津大港地区发现的冬枣新品种。
步骤5：根据各个水平的鉴定结果判断疑似变异株是否为真正的变异株(变异株冬枣的基因转录组高通量测序)
(A)材料的选择与处理
选择突变体1号、突变体2号、大港冬枣、沾冬2号、沾化冬枣叶片各1.0g用液氮冷冻，置于5ml离心管中用锡箔纸包住，然后放于盛有干冰的泡沫箱中，送去百迈客生物科技有限公司进行转录组测序。(测序流程见图2)
结果表明(见图3-6)：
(1)本试验基于所选参考基因组序列，共发掘2,102个新基因，可注释新基因1782个
(2)对差异表达基因进行数据库的功能注释后。结果显示：突变体1号与大港冬枣共得到1220个可注释的差异表达基因；突变体1号与沾冬2号共得到 2672个可注释的差异表达基因；突变体2号与大港冬枣共得到1341个可注释的差异表达基因；突变体2号与沾冬2号共得到2941个可注释的差异表达基因；
(3)运用COG库注释差异基因后发现突变体1号、突变体2号、沾冬2号冬枣、大港冬枣4个样品两两比较的差异基因占比较多的生物学过程基本相同，均为：蛋白质通用功能预测、碳水化合物的运输和新陈代谢、氨基酸转运和代谢、蛋白转运和分解代谢、能源生产和转换等。
(4)综合差异表达基因KEGG通路富集散点图可知，突变体1号与大港冬枣富集显著性可靠、差异基因数量多的通路为α-亚麻酸代谢、苯丙素的生物合成、糖酵解和糖异生、谷胱甘肽代谢；突变体2号与大港冬枣富集显著性可靠、差异基因数量多的通路为氨基糖和核苷酸糖代谢、氨基酸的生物合成、植物激素信号转导、苯丙素的生物合成、氨基酸的生物合成；突变体1号与沾冬2号富集显著性可靠、差异基因数量多的通路为类黄酮生物合成、酪氨酸代谢、植物激素信号转导、氰胺酸代谢、光合作用、苯丙氨酸代谢、苯丙酸生物合成、植物昼夜节律、甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢；突变体2号与沾冬2号富集显著性可靠、差异基因数量多的通路为植物激素信号转导类黄酮生物合成、酪氨酸代谢、光合作用、苯丙酸生物合成、氰胺酸代谢。
尽管为说明目的公开了本发明的实施例和附图，但是本领域的技术人员可以理解：在不脱离本发明及所附权利要求的精神和范围内，各种替换、变化和修改都是可能的，因此，本发明的范围不局限于实施例和附图所公开的内容。
Claims (7)
1.一种冬枣优良突变体选种的鉴定方法，其特征在于：包括以下步骤：
1)试验地的选择，在该试验地栽种三种不同品种的冬枣植株；
2)根据果实品质指标范围初步筛选出优良单株，其中，果实品质指标包括平均单果重、含水量、可溶性糖、可滴定酸、可溶性固形物以及糖酸比，其指标范围为平均单果重为16.011g—23.167g；含水量为65.02％—72.7％；可溶性糖为19.572％—30.216％；可滴定酸为0.261％—0.355％、可溶性固形物为23.78％—33.17％；糖酸比为66.859—85.115，；再对优良单株根据其对应的果实品质指标进行隶属函数值计算，并对得到的隶属函数值进行标记，将隶属函数值大于0.456的冬枣植株标记为变异株，隶属函数值范围在0.144—0.456的冬枣植株标记为对照组；
3)将获得标记为变异株的冬枣植株与标记为对照组的冬枣植株从生长发育、果实品质、结果特性、形态指标进行对比；
4)将获得标记为变异株的冬枣植株与标记为对照组的冬枣植株进行RAPD多态性分析，验证变异株的遗传物质是否发生变化；其中RAPD多态性分析采用以下步骤：a)提取变异株以及对照组的冬枣植株枣叶的全基因组DNA，b)筛选3对多态性带最多的引物进行PCR扩增；c)对比变异株和对照组的冬枣植株的扩增结果，扩增结果呈现多态性条带数最多的变异株即为冬枣植株突变体；d)对PCR扩增结果进行检测；
5)根据步骤3)和步骤4)的鉴定结果判断标记为变异株的冬枣植株是否为真正突变体；
6)将步骤5)判断得到的正真突变体的冬枣植株进行基因转录组高通量测序，进行最终鉴定。
2.根据权利要求1所述的冬枣优良突变体选种的鉴定方法，其特征在于：所述步骤1)试验地选择土壤类型为黏壤土，pH为7.8，含盐量为0.18％。
3.根据权利要求1所述的冬枣优良突变体选种的鉴定方法，其特征在于：所述步骤1)试验地选择的试验地面积120亩，三种不同品种的冬枣植株选为大港冬枣、沾化冬枣、沾冬2号3个品种，树龄平均为10年，试验地内枣树南北向栽植，株行距1.5m×3m。
4.根据权利要求1所述的冬枣优良突变体选种的鉴定方法，其特征在于：所述PCR扩增结果的检测方法为：A)制胶；B)左右灌胶；C)上样与电泳：将扩增产物在琼脂糖凝胶上电泳，电泳缓冲液位1×TBE，每个点样孔加5μL样品，75伏恒电压下电泳约45分钟；D)凝胶分析:待电泳完后，将凝胶移入凝胶成像系统中，扫描拍照,统计凝胶电泳条带数量与结果，计算遗传相似系数。
5.根据权利要求1所述的冬枣优良突变体选种的鉴定方法，其特征在于：所述PCR扩增体系为：25mmol/LMgCl22μL，10×PCR缓冲液2.5μL，10ng/μL引物1μL，50ng/μL DNA 2μL，2mmol/L dNTP 2μL，5U/μL Taq DNA聚合酶0.3μL，双蒸水15.2μL。
6.根据权利要求1所述的冬枣优良突变体选种的鉴定方法，其特征在于：所述PCR扩增反应程序为：94℃预变性2min；94℃变性30s，37℃退火40s，72℃延长60s，40个循环；72℃延长10min；4℃保温∞。
7.根据权利要求1所述的冬枣优良突变体选种的鉴定方法，其特征在于：所述扩增结果呈现多态性是指扩增条带增多或扩增条带减少。
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