CN104946683A - 一种转盐生杜氏藻chyb基因烟草的获得方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种转盐生杜氏藻CHYB基因烟草的获得方法，该转盐生杜氏藻CHYB基因烟草的获得方法首先将经次氯酸钠溶液浸泡烟草种后用无菌水清洗，再用乙醇浸泡，无菌水冲洗，接种于MS培养基上，培养获得无菌苗；然后构建植物表达载体pCAMBIA3301-chyb及转化根癌农杆菌；最后叶盘法转化烟草。本发明通过农杆菌介导的叶盘法将盐生杜氏藻chyb基因成功转入烟草，获得的转基因烟草株高、叶面积、叶绿素含量均高于对照组植株；在200mmol/L NaCl胁迫处理后，转chyb基因烟草仍可存活生长，叶片的相对电导率变化较小，脯氨酸含量增加，转基因烟草的耐盐性增强。

Description

一种转盐生杜氏藻CHYB基因烟草的获得方法

技术领域

本发明属于烟草培育领域，尤其涉及一种转盐生杜氏藻CHYB基因烟草的获得方法。

背景技术

土壤盐碱化是世界范围内的难题，也是造成农作物产量下降的主要因素之一。我国盐碱地分布广、类型多，据统计总面积超过3.6×10⁷hm²(杨劲松，2008)。植物在受到盐胁迫后，会通过诱导相关基因的表达或积累渗透调节物质来提高自身的抗盐能力，盐度过高会使植物新陈代谢及生长受到抑制甚至死亡。通过传统育种方法来提高植物耐盐性的研究困难较大、周期较长，且效果有限。目前国内外学者对耐盐碱植物耐盐基因的筛选、克隆和转化已有研究(Rania et al.,2010；Stephen and Cory,2012；Yan et al.,2014；丁林云等，2014；王敏华等，2014)，将特定的耐盐基因转入受体植物，以期获得抗盐性增加且应用价值提高的转基因植株。

盐生杜氏藻(Dunaliella Viridis)，是目前发现的最耐盐的真核生物之一，可存活于含0.05-5.5mol/L NaCl的培养液中(Oren,2005)。盐生杜氏藻对环境胁迫有极强的抗逆性，主要因为其体内有独特的渗透压调节机制和β-胡萝卜素合成途径(贺庆华，张庆莲，2008；孙辉，2005)。β-胡萝卜素羟化酶(β-carotene hydroxylase,CHYB)是类胡萝卜素生物合成途径中重要的限速酶(Kato et al.,2004)，其催化生成的终产物玉米黄素具有较强的清除氧自由基、抗氧化的能力，帮助植物将多余的能量以热能等形式释放，防止生成具有破坏性的单线态活化氧，从而抑制光氧化，起到光保护的作用(Davison et al.,2002)。目前，编码β-胡萝卜素羟化酶的基因已从多种生物中克隆分离(Yu et al.,2007；冯唐锴等，2007；郑凯静等，2007；Du et al.,2010；Cui et al.,2014)，对其在植物受到非生物胁迫下的功能研究已有报道(Davison et al.,2002；Kim et al.,2012；Ji et al.,2014；Zhao et al.,2014)。章丽等通过RACE技术首次从盐生杜氏藻中扩增出β-胡萝卜素羟化酶基因chyb(GenBank登录号:JN118489)，并且研究了在强光、钠、铁及葡萄糖胁迫处理下盐生杜氏藻中chyb基因的表达情况(章丽等，2013)。

发明内容

本发明的目的在于提供一种转盐生杜氏藻CHYB基因烟草的获得方法，旨在获得抗盐性增加且应用价值提高的转基因烟草植株。

本发明是这样实现的，一种转盐生杜氏藻CHYB基因烟草的获得方法包括：

步骤一、经次氯酸钠溶液浸泡烟草种后用无菌水清洗，再用乙醇浸泡，无菌水冲洗，接种于MS培养基上，培养获得无菌苗；

步骤二、构建植物表达载体pCAMBIA3301-chyb及转化根癌农杆菌；

步骤三、叶盘法转化烟草。

进一步，步骤二所述的构建植物表达载体pCAMBIA3301-chyb及转化根癌农杆菌的具体方法为：

步骤一、以盐生杜氏藻的cDNA为模板，用带有Bgl II和BstE II酶切位点引物CHYB-F(GAAGATCTATGCAGGCGCTACCGCTCC)、CHYB-R(GGGTNACCCTACACTCTTT GGACGCCACAGC)和ExTaq DNA聚合酶进行PCR扩增得到含酶切位点的chyb基因片段，连接入pMD19T克隆载体后，用Bgl II和BstE II双酶切后回收；

步骤二、质粒pCAMBIA3301用Bgl II和BstE II双酶切后回收大片段，将其与回收后的chyb基因用T₄DNA连接酶连接，转化大肠杆菌DH5α，获得载体pCAMBIA3301-chyb，采用冻融法转化农杆菌LBA4404感受态细胞，涂布于YEB+50mg/L Km+250mg/L Rif+50mg/L Str的固体培养基平板上，28℃恒温培养箱中培养48h；

步骤三、将单菌落挑至含相同抗生素的YEB液体培养基中摇床培养，对菌液进行PCR检测。

进一步，步骤三所述的叶盘法转化烟草的具体方法为：

步骤一、取经过夜培养的农杆菌工程菌株低速离心，用MS液体培养基稀释20倍后悬浮；

步骤二、剪取烟草无菌苗叶片，去主脉后剪成0.5mm²小块，在步骤一所述的的稀释后的培养基中浸泡，用无菌滤纸吸干叶面上多余菌液，正面朝下接种在分化培养基上进行光照培养，该分化培养基为MS+1.0mg/L 6-BA+0.1mg/LNAA，暗培养3d后转至选择培养基，该选择培养基为MS+1.0mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA+250mg/L Cb+30mg/L Hygr，每15d转移1次培养基，期间切去部分坏死的愈伤组织；

步骤三、待不定芽长至2cm左右时，将其切下并转入1/2MS培养基，生根后转入MS固体培养基。

本发明通过农杆菌介导的叶盘法将盐生杜氏藻chyb基因成功转入烟草，获得的转基因烟草株高、叶面积、叶绿素含量均高于对照组植株；在200mmol/LNaCl胁迫处理后，转chyb基因烟草仍可存活生长，叶片的相对电导率变化较小，脯氨酸含量增加，转基因烟草的耐盐性增强。

附图说明

图1是本发明实施例提供的转盐生杜氏藻CHYB基因烟草的获得方法流程图；

图2是本发明实施例提供的转chyb基因烟草株高；

图3是本发明实施例提供的转chyb基因烟草叶面积；

图4是本发明实施例提供的转chyb基因烟草叶绿素含量；

图5是本发明实施例提供的两种浓度NaCl胁迫下转chyb基因植株相对电导率；

图6是本发明实施例提供的两种浓度NaCl胁迫下转chyb基因植株脯氨酸含量；

图中：NC:非转基因烟草；P3301:转空载体烟草；F1:转chyb基因烟草F1株系；F3:转chyb基因烟草F3株系。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

下面结合附图及具体实施例对本发明的应用原理作进一步描述。

实施例一

植物材料及菌株质粒

烟草百日红(Nicotiana Tabacum L.)种子由上海交通大学胡朝阳博士惠赠，无菌苗为本实验室培养。经2.5％次氯酸钠溶液浸泡烟草种子5min后用无菌水清洗1次，再用75％乙醇浸泡1min，无菌水冲洗3次，接种于MS培养基上，25℃培养35d后，获得无菌苗。

pMD-19T克隆载体、DH5α感受态细胞、cDNA合成试剂盒、PCR试剂及限制性内切酶均购自大连TAKARA公司；根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)LBA4404及pCAMBIA3301植物表达载体均由本实验室保存；植物RNA提取试剂盒购自美国Omega公司；引物合成及DNA测序由上海生工生物工程有限公司完成；其余试剂均使用进口分装或国产分析纯。

请参阅图1：

本发明是这样实现的，一种转盐生杜氏藻CHYB基因烟草的获得方法包括：

S101、经2.5％次氯酸钠溶液浸泡烟草种子5min后用无菌水清洗1次，再用75％乙醇浸泡1min，无菌水冲洗3次，接种于MS培养基上，25℃培养35d后，获得无菌苗；

S102、构建植物表达载体pCAMBIA3301-chyb及转化根癌农杆菌；

S103、叶盘法转化烟草。

进一步，步骤S102所述的构建植物表达载体pCAMBIA3301-chyb及转化根癌农杆菌的具体方法为：

步骤一、以盐生杜氏藻的cDNA为模板，用带有Bgl II和BstE II酶切位点引物CHYB-F(GAAGATCTATGCAGGCGCTACCGCTCC)、CHYB-R(GGGTNACCCTACACTCTTT GGACGCCACAGC)和ExTaq DNA聚合酶进行PCR扩增得到含酶切位点的chyb基因片段，连接入pMD19T克隆载体后，用Bgl II和BstE II双酶切后回收；

步骤二、质粒pCAMBIA3301用Bgl II和BstE II双酶切后回收大片段，将其与回收后的chyb基因用T₄DNA连接酶连接，转化大肠杆菌DH5α，获得载体pCAMBIA3301-chyb，采用冻融法转化农杆菌LBA4404感受态细胞，涂布于YEB+50mg/L Km+250mg/L Rif+50mg/L Str的固体培养基平板上，28℃恒温培养箱中培养48h；

步骤三、将单菌落挑至含相同抗生素的YEB液体培养基中摇床培养，对菌液进行PCR检测。

进一步，步骤S103所述的叶盘法转化烟草的具体方法为：

步骤一、取10ml经过夜培养的农杆菌工程菌株低速离心，用MS液体培养基稀释20倍后悬浮；

步骤二、剪取烟草无菌苗叶片，去主脉后剪成约0.5mm²的小块，在上述菌液中浸泡10min，用无菌滤纸吸干叶面上多余菌液，正面朝下接种在分化培养基(MS+1.0mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA)上，25℃暗培养3d后转至选择培养基(MS+1.0mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA+250mg/L Cb+30mg/L Hygr)上进行光照培养(25℃，14h/10h)，每15d转移1次培养基，期间切去部分坏死的愈伤组织；

步骤三、待不定芽长至2cm左右时，将其切下并转入1/2MS培养基，生根后转入MS固体培养基。

培养2周后，取0.1g烟草叶片，用植物DNA提取试剂盒提取烟草总基因组，以总DNA为模版进行PCR扩增，检测chyb基因在转基因烟草植株中的整合情况。提取烟草总RNA，反转录后进行RT-PCR分析chyb基因的表达情况。RT-PCR扩增中扩增chyb基因的引物是CHYB-RTF(GGGCATAACTCTGTTTGGCATC)和CHYB-RTR(GGGCAGCTCAGCAATAGGG)。选择烟草β-actin基因作为内参，引物分别是ACTIN-F(TCGCCATTCAAGCCGTTCT)和ACTIN-R(TAATCAGGAGCAGAGGCGAATC)。

1、植物表达载体pCAMBIA3301-chyb的构建与检测

分别对pMD19T-CHYB质粒和植物表达载体pCAMBIA3301质粒用Bgl II和BstE II进行双酶切，回收获得chyb基因小片段(969bp)和pCAMBIA 3301载体大片段。用T₄连接酶将大、小两个片段进行连接后转化大肠杆菌DH5α，PCR扩增获得1000bp左右的chyb目的基因片段。双酶切验证结果表明，chyb基因已被成功克隆到pCAMBIA3301质粒中。

2、根癌农杆菌的转化及转chyb基因烟草的PCR检测

通过农杆菌介导的叶盘法将含有质粒pCAMBIA3301-chyb的农杆菌工程菌株转化入烟草外植体，在经含有30mg/L草铵膦的MS筛选培养基上培养30d后获得再生烟草抗性芽16株，标记为F1-F16。分别以重组质粒pCAMBIA3301-chyb为阳性对照，未转化的植株及转入空载体的植株为阴性对照进行PCR扩增，结果表明在16株抗性苗中F6、F7、F12为阴性，其余13株均可以扩增出目的基因。选取阳性植株进行RT-PCR检测，结果表明chyb基因均在转化烟草中表达，其中F1、F4条带相对较弱，推测可能是chyb基因在F1、F4烟草中的表达量相对较低。

3、转chyb基因烟草的耐盐性鉴定

3、1转chyb基因烟草的耐盐性

不同株系转基因烟草中的chyb基因表达量不同，选取表达量相对较低的F1组烟草和表达量相对较高的F3组烟草，用不同浓度的NaCl分别处理转基因及对照组烟草，结果表明在低盐浓度时(0mmol/L、100mmol/L NaCl)对照组植株和转基因组植株都可以生长，但对照组烟草在经100mmol/L NaCl处理后开始出现萎蔫现象；经200mmol/L NaCl处理后，对照组植株长势明显受到抑制并死亡，转基因F1组植株叶片出现萎蔫发黄，转基因F3组烟草仍可以正常生长，可能与chyb基因在F1中的表达量相对较少有关；经250mmol/L NaCl处理后，转基因组植株生长受到抑制并死亡。说明转化植株的耐盐性可达200mmol/L。

3.2、转chyb基因烟草生长指标的变化

以野生型和转入空载体烟草为对照，将阳性转化植株F1、F3经组培扩繁、炼苗后，移栽到蛭石基质上培养，一个月后分别测定其株高、叶绿素含量，选取第五片叶子测定叶面积。结果如图2、3、4所示，转基因植株的长势较对照组更好，株高明显高于对照组植株，其中F1组株高较非转基因和转空载体植株分别增加了约32.85％和27.65％，F3组株高分别增加了约47.57％和41.79％；转基因组烟草的叶面积较对照组增加且均有极显著性差异(P≤0.01)；F1组植株的叶绿素总含量较非转基因及转空载体植株组分别提高了20.76％、25.00％，F3组植株则分别提高了44.10％、46.05％。

3.3、转基因烟草生理指标的测定

选取移栽后长势相近的转基因及对照组植株，分别用0mmol/L、200mmol/L的NaCl处理15天后测定植株叶片相对电导率及脯氨酸含量。由图5可以看出，在非胁迫条件下，烟草叶片的相对电导率值均较低，经200mmol/L NaCl胁迫后，转基因植株与对照组植株叶片相对电导率均上升，其中对照组非转基因植株与转化空载体植株分别增加约140.76％及152.55％，转基因组F1、F3植株分别增加约57.44％，61.79％，转基因组植株叶片相对电导率变化相对较小且与对照组差异极显著(P≤0.01)，表明在盐胁迫下转CHYB烟草的质膜透性小于对照组烟草。由图6可知，在非胁迫条件下，各组烟草植株的脯氨酸含量都很低，且无显著性差异(P＞0.05)，经NaCl处理后，转chyb基因烟草中脯氨酸含量明显增加，且与非转基因组差异极显著(P≤0.01)，F1、F3组植株的脯氨酸含量分别达到187.12ug/g及216.00ug/g，是非转基因组的2.75倍和3.18倍。

本发明通过农杆菌介导的叶盘法将盐生杜氏藻chyb基因成功转入烟草，获得的转基因烟草株高、叶面积、叶绿素含量均高于对照组植株；在200mmol/LNaCl胁迫处理后，转chyb基因烟草仍可存活生长，叶片的相对电导率变化较小，脯氨酸含量增加，转基因烟草的耐盐性增强。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (3)

1.一种转盐生杜氏藻CHYB基因烟草的获得方法，其特征在于，所述的转盐生杜氏藻CHYB基因烟草的获得方法包括：

步骤一、经次氯酸钠溶液浸泡烟草种后用无菌水清洗，再用乙醇浸泡，无菌水冲洗，接种于MS培养基上，培养获得无菌苗；

步骤二、构建植物表达载体pCAMBIA3301-chyb及转化根癌农杆菌；

步骤三、叶盘法转化烟草。

2.如权利要求1所述的转盐生杜氏藻CHYB基因烟草的获得方法，其特征在于，步骤二所述的构建植物表达载体pCAMBIA3301-chyb及转化根癌农杆菌的具体方法为：

步骤一、以盐生杜氏藻的cDNA为模板，用带有Bgl II和BstE II酶切位点引物CHYB-F(GAAGATCTATGCAGGCGCTACCGCTCC)、CHYB-R(GGGTNACCCTACACTCTTT GGACGCCACAGC)和ExTaq DNA聚合酶进行PCR扩增得到含酶切位点的chyb基因片段，连接入pMD19T克隆载体后，用Bgl II和BstE II双酶切后回收；

步骤二、质粒pCAMBIA3301用Bgl II和BstE II双酶切后回收大片段，将其与回收后的chyb基因用T₄ DNA连接酶连接，转化大肠杆菌DH5α，获得载体pCAMBIA3301-chyb，采用冻融法转化农杆菌LBA4404感受态细胞，涂布于YEB+50mg/L Km+250mg/L Rif+50mg/L Str的固体培养基平板上，28℃恒温培养箱中培养48h；

步骤三、将单菌落挑至含相同抗生素的YEB液体培养基中摇床培养，对菌液进行PCR检测。

3.如权利要求1所述的转盐生杜氏藻CHYB基因烟草的获得方法，其特征在于，步骤三所述的叶盘法转化烟草的具体方法为：

步骤一、取经过夜培养的农杆菌工程菌株低速离心，用MS液体培养基稀释20倍后悬浮；

步骤二、剪取烟草无菌苗叶片，去主脉后剪成0.5mm²小块，在步骤一所述的的稀释后的培养基中浸泡，用无菌滤纸吸干叶面上多余菌液，正面朝下接种在分化培养基上进行光照培养，该分化培养基为MS+1.0mg/L 6-BA+0.1mg/LNAA，暗培养3d后转至选择培养基，该选择培养基为MS+1.0mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA+250mg/L Cb+30mg/L Hygr，每15d转移1次培养基，期间切去部分坏死的愈伤组织；

步骤三、待不定芽长至2cm左右时，将其切下并转入1/2MS培养基，生根后转入MS固体培养基。