CN105255859A - 一种提高植物耐非生物胁迫能力的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种培育耐非生物胁迫能力提高的转基因植物的方法。在培养基中培养海杆菌<i>Marinobacter</i><i>？sp.</i>，提取基因组DNA，用耐逆基因特异引物进行PCR扩增，扩增产物构建入植物表达载体，此载体转化入根癌农杆菌，用根癌农杆菌侵染拟南芥，经过抗除草剂筛选、自交、分子鉴定等步骤，得到纯合转基因拟南芥。用不同浓度NaCl溶液处理转基因植株和对照非转基因植株，转基因植株的耐盐、耐旱能力与对照非转基因植株相比显著提高，具体表现在存活率、叶片大小、叶绿素含量和植株重量等方面。

Description

一种提高植物耐非生物胁迫能力的方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种利用耐逆基因提高转基因植物耐非生物胁迫的方法。

背景技术

在中国的盐碱地面积约9913万公顷，占世界总盐碱地面积的10%；这些土壤中往往含有较多的可溶性盐，造成生长在这种土壤上的植物细胞壁两侧体液渗透压不同，使得细胞内部发生程度的脱水，从而影响植物生长甚至造成死亡。在中度以上盐碱化的土壤中,只有少数具有较强耐盐碱能力的高等植物能够存活,但在同样的环境中,有大量具有较强耐盐碱能力的微生物可以正常生长。

嗜盐菌是生活在盐度较高环境中的一类细菌，它们可以生长在高盐（一般10%～30%）条件下，主要发现于盐湖、盐场等浓缩咸水中，以及腌鱼、咸菜等盐制品上。中度嗜盐菌（Moderatelyhalophilicbacteria）是一类在3%～15%NaCl浓度之间有最佳生长状态的细菌，它们对环境中的盐浓度适应范围较宽，对营养的要求很低，适应环境能力较强。

嗜盐菌的盐适应机理包括：1、由于嗜盐菌的质膜和液泡膜上的H⁺泵有K⁺/Na⁺逆向转运功能，拥有从环境中吸收浓缩K⁺和向胞外或液泡内排放Na⁺的能力，嗜盐菌采用在细胞内高度积累K⁺来抵抗细胞外的高渗环境，造成嗜盐菌本身虽然生长在盐浓度比较高的环境中，但是细胞内的Na⁺浓度并不高。2、嗜盐菌大量产生内溶质或保留从外部取得的溶质，如氨基酸等具有渗透保护作用的小分子物质，使它们能够在高盐浓度环境中保持细胞内的渗透压，从而正常生活。3、嗜盐菌的酶类对高盐浓度具有适应能力，在高盐浓度下仍保持正常、甚至比低盐浓度时更高的活性，而不象其它生物的酶那样会在高盐浓度下失活。

植物耐盐涉及多种机制和代谢途径：1.质膜和液泡膜上的多种离子转运体和离子通道蛋白，如液泡膜Na⁺/H⁺逆向转运蛋白、氢离子三磷酸腺苷酶酶和氢离子焦磷酸化酶等，在离子转运和重建离子平衡发挥着重要的作用，保持细胞膨压和维持正常的生化反应，从而使植物在高盐环境中能够重建体内离子平衡。2.氨基酸及其衍生物、糖醇类及其衍生物等有机渗透调节物质，通过维持细胞的渗透压、稳定蛋白质的高级结构以保护植物免受高盐胁迫伤害。这类物质中研究较多的是脯氨酸和甜菜碱，它们在细胞中起着无毒渗透保护剂的作用，其大量积累可保持许多代谢过程中的重要酶类的活性；植物中甜菜碱合成途径的两个关键酶是胆碱单加氧酶(cholinemonooxygenase,CMO)和甜菜碱醛脱氢酶(betainealdehydedehydrogenase,BADH)，向植物转入外源胆碱脱氢酶基因可以催化乙酰胆碱合成甜菜碱。3.具有一定耐盐能力的植物细胞中的超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、抗坏血酸—谷胱甘肽循环中的酶类，在盐胁迫下会过量表达，清除细胞内会产生氧自由基、过氧化氢(H₂O₂)和羟基自由基(OH^-)等活性氧(ROS)，减轻盐胁迫的影响。

发明内容

本发明的目的是提供一种培育耐非生物胁迫能力提高的转基因植物的方法。

本发明提供的技术方案如下：

在培养基中培养海杆菌Marinobactersp.，提取基因组DNA，用耐逆基因特异引物进行PCR扩增，扩增产物构建入植物表达载体，此载体转化入根癌农杆菌，用根癌农杆菌侵染拟南芥，经过抗除草剂筛选、自交、分子鉴定等步骤，得到纯合转基因拟南芥。用不同浓度NaCl溶液处理转基因植株和对照非转基因植株，发现转基因植株的耐盐、耐旱能力与对照非转基因植株相比显著提高，具体表现在存活率、叶片大小、叶绿素含量和植株重量等方面。

上述方法中，所述耐逆基因为海杆菌甜菜碱醛脱氢酶基因（betA），其核酸序列为序列表中的序列1，氨基酸序列为序列表中的序列2；

所述耐盐基因特异正反向引物序列分别为序列表中序列3和序列4；

上述方法中，所述耐逆基因以基因表达盒的形式导入目的植物；所述耐逆基因表达盒具体包括花椰菜花叶病毒35S启动子（pCaMV35S）、耐逆基因（betA）和nos终止子（Tnos），其序列为序列表中序列5，其中1-828bp为花椰菜花叶病毒35S启动子序列，其中848-2542bp为耐逆基因序列，其中2561-2815bp为nos终止子序列；

上述表达盒中的耐逆基因的序列为基因编码区序列。

上述方法中，所述耐逆基因表达盒通过重组表达载体pTF101.1-betA导入目的植物中，其序列为序列表中序列6；

上述方法中，所述目的植物是双子叶植物或单子叶植物。在本发明的实施例中采用的双子叶植物为拟南芥，具体生态型为Columbia。

本发明提供的方法，包括如下步骤：

1）耐逆基因的获得：

a、在高盐LB培养基中培养嗜盐细菌(Marinobactersp.)；

b、用细菌基因组DNA提取液提取细菌基因组DNA；

c、用耐逆基因特异引物，从细菌基因组中PCR扩增逆盐基因；

d、耐逆基因利用酶切/连接方法，重组入植物表达载体，将此重组植物表达载体用热激法转入大肠杆菌感受态中，用LB液体培养基摇菌，菌液离心后的得到的菌体用碱裂解法小量提取质粒，经过酶切、测序验证；

2）植物转基因：

a、植物重组表达载体用热激法转化入根癌农杆菌；

b、根癌农杆菌浸花法转化拟南芥；

c、转化的拟南芥结的种子经除草剂Basta筛选，对抗性植株用Trizol法分别提取基因组DNA和总RNA，分别以耐逆基因特异引物做PCR和反转录-PCR（RT-PCR）进行分子鉴定，经过以上检测步骤得到的植株为T1代转基因植株；

d.获得耐逆基因纯合转基因植株：T1代转基因植株自交得到T2代种子，种植T2代种子并用除草剂Basta筛选，抗性植株继续生长、结出T3代种子，种植T3代种子，用抗除草剂Basta筛选，并根据其除草剂抗性，挑选已纯合的T2代产生的纯合T3代进行后续耐逆表型研究；

3）转基因植物的耐逆性鉴定：

a、盐胁迫后存活率分析；

b、盐胁迫后植株大小分析；

c、盐胁迫后叶绿素含量分析；

d、干旱胁迫后植株重量分析；

上述方法中，步骤1）中，所述高盐LB液体培养基，按照如下方法制备：向800ml蒸馏水中分别加入10g胰蛋白胨，5g酵母水解物，50g氯化钠，搅拌充分溶解后，用蒸馏水水补足体积1000ml，121℃高压灭菌18分钟后备用；

步骤1）中，所述细菌基因组DNA提取液成分为：Tris盐酸40mM，醋酸钠20mM，EDTA1mM，SDS1%，pH7.8；

步骤1）和步骤2）中，所述PCR及RT-PCR扩增程序为预变性95℃5分钟；30个循环：95℃30秒，56℃45秒，72℃100秒；72℃延伸10分钟；所述PCR及RT-PCR反应体系为：细菌基因组DNA或植物基因组DNA或反转录产生的cDNA2μl，dNTPs(2.5mM)1μl，正向引物(2.5μM)1μl，反向引物(2.5μM)1μl，10XPCRbuffer2μl，rTaq0.2μl，H₂O13μl。

步骤2）中，所述LB培养基成分为：胰蛋白胨1%，酵母水解物0.5%，氯化钠1%；在配制固体LB培养基时，还需加入琼脂使其终浓度为2%。

步骤2）中，所述除草剂为Basta（草丁膦），浓度为5mg/L。

步骤2）中，所述根癌农杆菌为具体为GV3101。

本发明的实验证明，采用本发明的方法，可将耐逆基因，通过根癌农杆菌方法转入植物，得到转基因植株与野生型植物相比，在高盐和干旱胁迫情况下，具有显著增强的耐逆能力。

附图说明

图1：a.betA基因编码区PCR、酶切产物；b.载体pTF101.1酶切产物

图2：菌落PCR检测结果

图3：转基因植株基因组DNA的PCR鉴定结果，wt：非转基因植株对照；1，2：不同的转基因植物株系；

图4：耐逆基因在不同株系转基因植物中的表达情况，Tubulin：管家基因内参；betA：目的耐逆基因，WT：未转基因植株；1，2，3：不同的转基因植物株系；

图5：盐处理后植株存活率分析，WT，野生型对照；betA，转基因植株；

图6：盐处理后叶片大小分析（长度单位：厘米）；

图7：盐处理后叶绿素含量分析（单位：毫克/升）；

图8：干旱处理后植株重量分析（单位：克/株）。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、耐盐转基因植物的获得

一、耐逆基因的获得：

1、在高盐LB培养基中培养耐盐细菌；

在灭菌的250ml三角瓶中，加入50ml高盐LB液体培养基（胰蛋白胨1%，氯化钠5%，酵母水解物0.5%），接种海杆菌Marinobactersp.，30℃150rpm振荡培养48小时，至OD₆₀₀达到0.6以上；

2、用细菌基因组DNA提取液提取细菌基因组DNA；

取2ml细菌培养液置于2ml离心管中，在常温5000rpm离心5分钟收集菌体；丢弃上清液，在沉淀中加入400μl基因组DNA提取液（Tris-HCl40mM，NaOAc20mM，EDTA1mM，SDS1%，pH7.8），重悬菌体后置于37℃水浴1小时；加入200μl5M氯化钠溶液（29.5g氯化钠溶于蒸馏水中，定容至100ml），涡旋混匀后13000rpm离心5分钟；取上清液，用苯酚：氯仿（1：1）抽提2次、氯仿抽提1次，最后一次抽提得到的上层水相转入新管，加入2×体积无水乙醇和1/10体积醋酸钾(3M,pH8.0)，-20℃保存1小时后，13000rpm离心15min，弃上清液，沉淀用70%乙醇洗2次，在空气中干燥10分钟后加入100μlTE，65℃水浴助溶。

3、用耐逆基因特异引物，从细菌基因组DNA中PCR扩增耐盐基因；

根据海杆菌的甜菜碱醛脱氢酶基因（betA）编码区序列，设计PCR扩增其全长编码区的引物，在上、下游引物的5'末端分别带有用于克隆的XbaI和SpeI以及它们的保护碱基。引物序列如下表1：

表1扩增甜菜碱醛脱氢酶基因编码区的引物序列

名称	序列
		betA-F	TGCTCTAGAATGACAGAAAACCGATACGACTACATC
betA-R	CGGACTAGTCTATGCCAGCGCGCGC

PCR扩增程序为：95℃5分钟；30个循环：95℃30秒，56℃45秒，72℃100秒；72℃延伸10分钟；

PCR反应体系为（表2）：

表2耐逆基因PCR扩增体系

成分	体积
		细菌基因组DNA	2μl
dNTPs(2.5mM)	1μl
		正向引物betA-F (2.5μM)	1μl
反向引物betA-R (2.5μM)	1μl
		10X PCR buffer	2μl
rTaq	0.2μl
		H2O	13μl

4、耐逆基因利用酶切/连接方法，重组入植物表达载体，连接产物用热激法转化大肠杆菌感受态DH5α细胞，PCR检测正确单克隆并摇菌、碱裂解法小提质粒；

PCR产物用XbaI和SpeI双酶切，植物表达载体pTF101.1用同样的酶双切，酶切时间均为2小时，反应体系如下表3：

表3耐逆基因构建表达载体酶切体系

成分	体积
		PCR产物/植物表达载体	20μl（约1μg）
XbaI	0.5μl
		SpeI	0.5μl
10× Cutsmart buffer	2.5μl
		100× BSA	0.25μl
超纯水	1.25μl

酶切产物用1%琼脂糖凝胶5V/cm电泳1小时，在紫外凝胶仪上分别切取对应PCR产物（图1.a）和载体大片段（图1.b）的条带，用凝胶回收试剂盒回收DNA，分别溶于30μl超纯水中，按照以下方式（表4）连接过夜：

表4植物表达载体构建连接体系

成分	体积
		PCR酶切纯化产物	2 μl
pTF101.1 酶切纯化产物	0.5 μl
		T4 DNA连接酶	o.5μl
T4 DNA连接酶buffer	2 μl
		ATP (10mM)	0.2μl
超纯水	15μl

取1μl连接产物，用42℃热激法转化100μl大肠杆菌感受态DH5α细胞，转化产物涂在含有100μg/ml氨苄青霉素的LB固体培养基平板上，37℃倒置培养16小时后，挑取单菌落为模板，用以上步骤3中的方法进行PCR，可检测到1.6kb产物的为正确重组克隆（图2），得到重组植物表达载体命名为pTF101-NaH。将正确的克隆在液体LB培养基中37℃摇菌16小时、用碱裂解法小量提取质粒备用。

二、植物转基因：

1、植物重组表达载体热激法转化入根癌农杆菌；

（1）从-80℃冰箱取出根癌农杆菌感受态细胞，37℃水浴迅速融化后置于冰上；

（2）用移液器取1μg构建成功的植物过表达载体质粒溶液，加入100μl根癌农杆菌感受态细胞中，用枪头轻轻搅动混匀，继续冰浴30min；

（3）把加入植物过表达载体的根癌农杆菌感受态放入-70℃超低温冰箱中5分钟，然后放入42℃水浴锅中热激45秒，取出冰浴2分钟；

（4）将500μlLB液体培养基加到感受态细胞中，28℃振荡培养3小时；

（5）把振荡培养后的菌液涂到含有壮观霉素（50mg/L）的固体LB培养基上，28℃过夜倒置培养2天；

（6）菌落PCR验证正确后，挑取单菌落，接种到10ml含有壮观霉素（50mg/L）和庆大霉素（50mg/L）的LB液体培养基中，28℃150rpm振荡培养30小时。

2、根癌农杆菌浸花法转化拟南芥；

（1）转化前一天将需要做转化的野生型拟南芥植株浇透水；

（2）将用于转化的拟南芥植株上的果实全部剪掉，再用宽胶带把花盆的土封好；

（3）将已活化的菌液取2ml转至含有壮观霉素（50mg/L）和庆大霉素（50mg/L）的200mlLB液体培养基中，28℃，200rpm培养约14小时，当菌液达到OD600为1.2~1.6之内时，4℃4000g离心10min收集菌体于50ml灭菌收集管中；

（4）用10%蔗糖（含0.02%silwet）重悬菌液至OD600约为0.8-1.0；

（5）整株拟南芥地上部分倒扣到重悬菌液中，保证所有的花序都侵入到菌液中，侵染3分钟；

（6）将转化后的拟南芥平放于盒子内，上盖封口膜封好，避光培养24小时～48小时，将植株立起正常培养，3天浇水1次。

3、T1代转基因拟南芥的除草剂筛选及分子鉴定；

（1）待侵染后的拟南芥继续生长4-6周后，荚果成熟收集种子；

（2）种子用75%乙醇消毒，再用无菌水冲洗5-6次，平铺到含有0.005‰Basta+200mg/L头孢霉素的1/2MS培养基上，4℃春化2-3天，再转移到温室，12h光照，12h黑暗培养。

（3）3天后，转基因成功的种子可以在含有0.005‰Basta的培养基上生长，非转基因种子在培养基上不萌发或者萌发之后叶片变黄。

（4）拟南芥基因组DNA和RNA提取：从Basta培养基上筛选出的抗除草剂阳性苗和对照的非转基因拟南芥，移栽到土中继续生长至21天，按以下方法取叶片提取基因组DNA和RNA：

a.将研钵和研杵用液氮充分预冷，放入约50mg叶片，在液氮中磨碎；

b.在1.5ml离心管中加入1mlTrizol，将磨碎的叶片粉末加入离心管中，然后盖上管盖并颠倒离心管使其融化，室温放置5分钟；

c.12000rpm离心5分钟，取上清液转入新离心管中；

此后步骤严格按照用Trizol试剂（Invitrogen公司）说明书步骤操作，同时提取DNA和RNA。

（5）RNA反转录：

a.取9μlRNA样品，加入1μlDNaseI，37℃放置10分钟，加入1μl反转录引物（OligodT18，序列见序列表中序列7），70℃10分钟，然后置于冰上，以除去DNA污染；

b.在上管中加入5X反转录缓冲液5μl，dNTP（2.5mM）5μl，RNA酶抑制剂1μl，M-MLV反转录酶1μl，DEPC水2μl，混匀后37℃反转录30分钟，70℃酶失活10分钟，得到cDNA；

（6）转基因和表达水平鉴定：分别用以上的基因组DNA和cDNA为模板，耐逆基因特异引物(betA-F和betA-R)进行PCR扩增；

PCR扩增程序为：95℃5分钟；30个循环：95℃30秒，56℃45秒，72℃100秒；72℃延伸10分钟；PCR反应体系为：细菌基因组DNA2μl，dNTPs(2.5mM)1μl,正向引物NaH-F(2.5μM)1μl，反向引物NaH-R(2.5μM)1μl，10XPCRbuffer2μl，rTaq0.2μl，H₂O13μl。

扩增结果如图3和图4：图3中有1.6kb扩增条带的为转基因植株；图4示外源基因在不同拟南芥株系中的表达水平不同。

4.T3代纯合转基因植株的获得：T1代拟南芥经过上一步的Basta除草剂筛选、基因组DNA——外源基因特异引物PCR鉴定、外源基因表达水平测定，确认为转基因植株的，继续种植，开花时自交，一个月后收获T2代种子；种植T2代种子，对长出的T2代植株喷洒抗除草剂Basta筛选除去分离出的非转基因植株，继续种植、自交，得到T3代种子；种植T3代种子，对长出的T3代植株喷洒抗除草剂Basta，根据其除草剂抗性，只选择来自同一株T2种子产生的所有T3代植株均抗Basta的植株，作为纯合转基因植株进行后续耐逆表型研究。

三、转基因植物的耐盐性鉴定：

T3代纯合转基因种子萌发14天后，开始对T3代转基因植株和同生长时期的对照非转基因植株浇灌NaCl溶液：前两次浓度分别为50mM和100mM，每3天浇灌一次；然后150mM和200mM各处理9天，每3天浇灌一次。

1、存活率分析：每次浇灌NaCl溶液时记录植株的生长情况和存活率，盐浓度达到100mM时，对照组和转基因组的生长状态出现明显差异；150mM盐浓度处理结束时，对照组植株大量死亡（存活率34%），转基因组植株死亡较少（存活率61%）；200mM盐浓度处理结束时，对照组植株全部死亡（存活率0%），转基因组植物仍有较多植株存活（存活率49%）（图5）。

2、叶片大小分析：测量非转基因和转基因拟南芥在0mM、150mM和200mMNaCl溶液处理后，存活的植株最外侧莲座叶从叶柄基部到叶片尖端的长度，比较转基因植株和野生型植株的叶柄长度，结果显示转基因植株的叶片显著大于野生型对照（图6）。

3、叶绿素含量分析：取50mg植物组织叶片，置于1.5ml离心管中，加入1ml叶绿素提取液（丙酮：无水乙醇：水=47.5：47.5：5），用组织研磨棒充分研碎样品，室温暗处放置30分钟提取叶绿素。

叶绿素含量测定：分别以提取溶剂作空白，测定叶绿素提取液吸光度A₆₄₅、A₆₆₃，利用Arnon公式计算叶绿素含量：

叶绿素a浓度(mg/L):Ca=12.7A₆₆₃-2.69A₆₄₅;

叶绿素b浓度(mg/L):Cb=22.9A₆₄₅-4.68A₆₆₃;

叶绿素总浓度(mg/L):Ca+b=Ca+Cb。

结果显示在NaCl溶液处理后，转基因植株的叶绿素含量显著高于非转基因植株对照（图7）。

4、干旱胁迫后植株重量分析：将萌发后在土壤中正常生长14天的转基因植株和非转基因植株各30株，在当天浇透水后，分别取10株称重；对剩余的植株连续10天停止浇水，然后转基因植株和非转基因植株各取10株称重；对剩余的植株浇透水一次，然后再次连续10天停止浇水，对剩余的植株分别称重。结果发现在两次干旱处理后，转基因植株的重量均显著大于对照的非转基因植株（图8）。

SEQUENCELISTING

<110>东北师范大学

刘,东波

庞,劲松

麻,爽

井,悦

刘,宝

贺,红利

马,欣彤

<120>一种提高植物耐逆能力的方法

<130>0

<160>7

<170>PatentInversion3.3

<210>1

<211>1695

<212>DNA

<213>Marinobactersp.

<220>

<221>betA基因

<222>(1)..(1695)

<400>1

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<211>564

<212>PRT

<213>Marinobactersp.

<220>

<221>betA蛋白

<222>(1)..(564)

<400>2

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GlyLysArgGluValLeuGluGlnAlaGlyIleGluValLysHisGlu

275280285

LeuProGlyValGlyGluAsnLeuGlnAspHisLeuGluPheTyrPhe

290295300

GlnTyrArgCysLysGlnProValSerLeuAsnGlyLysLeuAspTrp

305310315320

TrpAsnLysLeuLysIleGlyValArgTrpIleLeuArgLysAspGly

325330335

LeuGlyAlaThrAsnHisPheGluSerCysGlyPheIleArgSerLys

340345350

AlaGlyValGluTrpProAspLeuGlnTyrHisPheLeuProAlaAla

355360365

MetArgTyrAspGlyLysGluAlaPheAspGlyAspGlyPheGlnLeu

370375380

HisIleGlyHisAsnLysProLysSerArgGlyTyrValHisValGln

385390395400

SerAlaAspProLysGlnAlaProThrIleArgPheAsnTyrLeuGlu

405410415

HisGluAlaAspArgGluGlyPheArgAspCysValArgLeuThrArg

420425430

GluIleIleAsnGlnProAlaMetAspGluTyrArgGlyAlaGluIle

435440445

GlnProGlyValGluValGlnThrAspGluGluIleAspAlaPheVal

450455460

ArgGlnAlaValGluSerAlaTyrHisProSerCysSerCysLysMet

465470475480

GlyThrAspGluLeuAlaValValAspProHisThrArgValHisGly

485490495

IleArgAsnLeuArgValValAspSerSerIlePheProThrIlePro

500505510

AsnGlyAsnLeuAsnSerProThrIleMetValAlaGluArgAlaAla

515520525

AspLeuIleArgGlyLysGluProLeuGlnProSerAspAlaProVal

530535540

ValMetAspAspGlnTrpGlnValArgGlnArgProGlyGlnAlaLys

545550555560

ArgAlaLeuAla

<210>3

<211>36

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>betA正向引物

<222>(1)..(36)

<400>3

tgctctagaatgacagaaaaccgatacgactacatc36

<210>4

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>betA反向引物

<222>(1)..(25)

<400>4

cggactagtctatgccagcgcgcgc25

<210>5

<211>2815

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>表达盒-35S启动子

<222>(1)..(828)

<220>

<221>表达盒-耐逆基因

<222>(848)..(2542)

<220>

<221>表达盒-终止子

<222>(2561)..(2815)

<400>5

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acaaaatatagcgcgcaaactaggataaattatcgcgcgcggtgtcatctatgtt2815

<210>6

<211>11987

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>pTF101.1-betA全序列

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<400>6

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<212>DNA

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<222>(1)..(19)

<400>7

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Claims (1)

1.一种提高植物耐非生物胁迫能力的方法，其特征是包括如下步骤：

1）耐逆基因的获得：

a、在高盐LB培养基中培养嗜盐细菌(Marinobactersp.)；

b、用细菌基因组DNA提取液提取细菌基因组DNA；

c、用耐逆基因特异引物，从细菌基因组中PCR扩增逆盐基因；

d、耐逆基因利用酶切/连接方法，重组入植物表达载体，将此重组植物表达载体用热激法转入大肠杆菌感受态中，用LB液体培养基摇菌，菌液离心后的得到的菌体用碱裂解法小量提取质粒，经过酶切、测序验证；

2）植物转基因：

a、植物重组表达载体用热激法转化入根癌农杆菌；

b、根癌农杆菌浸花法转化拟南芥；

c、转化的拟南芥结的种子经除草剂Basta筛选，对抗性植株用Trizol法分别提取基因组DNA和总RNA，分别以耐逆基因特异引物做PCR和反转录-PCR,RT-PCR进行分子鉴定，经过以上检测步骤得到的植株为T1代转基因植株；

d、获得耐逆基因纯合转基因植株：T1代转基因植株自交得到T2代种子，种植T2代种子并用除草剂Basta筛选，抗性植株继续生长、结出T3代种子，种植T3代种子，用抗除草剂Basta筛选，并根据其除草剂抗性，挑选已纯合的T2代产生的纯合T3代进行后续耐逆表型研究；

3）转基因植物的耐逆性鉴定：

a、盐胁迫后存活率分析；

b、盐胁迫后植株大小分析；

c、盐胁迫后叶绿素含量分析；

d、干旱胁迫后植株重量分析；

上述方法中，步骤1）中，所述高盐LB液体培养基，按照如下方法制备：向800ml蒸馏水中分别加入10g胰蛋白胨，5g酵母水解物，50g氯化钠，搅拌充分溶解后，用蒸馏水水补足体积1000ml，121℃高压灭菌18分钟后备用；

步骤1）中，所述细菌基因组DNA提取液成分为：Tris盐酸40mM，醋酸钠20mM，EDTA1mM，SDS1%，pH7.8；

步骤1）和步骤2）中，所述PCR及RT-PCR扩增程序为预变性95℃5分钟；30个循环：95℃30秒，56℃45秒，72℃100秒；72℃延伸10分钟；所述PCR及RT-PCR反应体系为：细菌基因组DNA或植物基因组DNA或反转录产生的cDNA2μl，2.5mMdNTPs1μl，2.5μM正向引物1μl，2.5μM反向引物1μl，10XPCRbuffer2μl，rTaq0.2μl，H₂O13μl；

步骤2）中，所述LB培养基成分为：胰蛋白胨1%，酵母水解物0.5%，氯化钠1%；在配制固体LB培养基时，还加入琼脂使其终浓度为2%；

步骤2）中，所述除草剂为草丁膦Basta，浓度为5mg/L；

步骤2）中，所述根癌农杆菌为具体为GV3101。