CN101953306A

CN101953306A - 通过体细胞胚胎诱导四合木再生植株的方法

Info

Publication number: CN101953306A
Application number: CN 201010511430
Authority: CN
Inventors: 许亦农; 平文丽; 吴韩英; 李敏春
Original assignee: Institute of Botany of CAS
Current assignee: Institute of Botany of CAS
Priority date: 2010-10-19
Filing date: 2010-10-19
Publication date: 2011-01-26
Anticipated expiration: 2030-10-19
Also published as: CN101953306B

Abstract

本发明公开了一种通过体细胞胚胎诱导四合木再生植株的方法。该方法，包括如下步骤：1)将切下的四合木的茎诱导，形成愈伤组织；2)将步骤1得到的愈伤组织接入胚性愈伤组织诱导培养基中，形成胚性愈伤组织；3)将步骤2得到的胚性愈伤组织进行成熟和萌发培养，形成芽；4)将步骤3的芽接入伸长、生根培养基中，得到所述完整的再生植株。本研究旨在以四合木愈伤组织为外植体诱导出体细胞胚胎、进而形成再生植株，为建立高效稳定的体细胞胚胎发生系统奠定基础，这对于四合木的快速繁殖、基因工程、遗传转化、遗传改良等方面的研究，都有十分重要的意义。

Description

通过体细胞胚胎诱导四合木再生植株的方法

技术领域

本发明涉及通过体细胞胚胎诱导四合木再生植株的方法，属于生物技术领域。

背景技术

四合木(Tetraena mongolica Maxim)，落叶小灌木，强旱生植物，是1.4亿年前古地中海孑遗种，属蒺藜科，四合木属，单一种。主要分布于我国内蒙古自治区西部巴彦高勒至宁夏回族自治区贺兰山东麓的石嘴山之间，多生于石质低山，沙砾质高平原及山前洪积扇等地，目前仅存有1万公顷左右。四合木以有性生殖为主，但仅有11％的植株能正常开花，结实率低、胚胎败育率高。而且由于其种子对萌发条件要求苛刻，仅1％的种子能顺利成熟、实现繁殖。四合木的生殖特征决定了它繁殖更新速度非常缓慢。此外，近年来，由于过度放牧和工厂建设中滥垦滥伐，严重破坏了四合木的生存环境，使这一物种种群的面积和现存数量越来越少、日渐濒危。

有专家认为，四合木具有极高的保护和科学研究的价值：它的叶和嫩枝中能富集Fe、Mn、Cu、Zn等多种微量元素；含有生物碱、黄酮类、有机酸类、酚性化合物，可作药用；其茎中能积累大量油脂，可用作生物能源的原料；研究其茎中大量积累三脂酰甘油的生理生化基础和分子机理对利用营养器官储存油脂的生物工程具有重要的科学意义。

综上所述，研究四合木的快速繁殖技术，扩大其种群、挽救这一濒危植物，已迫在眉睫。贾玉华等已对扦插繁殖做了研究，5-10cm的枝条，用ABT处理后，插穗成活率较高。何丽君等曾对四合木愈伤组织培养、诱导体细胞胚胎等进行过一些研究，初步建立了组织培养体系，分析了组织培养过程中的一些基本规律。但目前尚未见报道适用于四合木大规模快速扩繁、通过体细胞胚胎途径诱导再生出完整植株的技术体系。

体细胞胚胎的概念源于20世纪初德国植物学家Haberlandt提出的“细胞全能性”的概念。他预言每个细胞都有在合适的条件下都能形成完整植株的潜力。后来，为了证实这一论断，许多科学家做了大量实验。经过50余年的不断探索，至1958年，Steward等将离体培养的胡萝卜脱分化细胞通过体细胞胚胎途径形成完整的再生植株。此后，组织培养技术迅速发展，通过体细胞胚胎发生途径形成再生植株在金花茶、枸杞、木瓜、丁香、刺五加、沙棘等多种灌木中均多有报道，而四合木中则尚未有成熟的体细胞胚胎发生、再生植株的体系。

发明内容

本发明的目的在于提供一种四合木的胚性愈伤组织诱导培养基。

本发明提供的胚性愈伤组织诱导培养基是在1/2MS培养基的基础上添加2-(N-吗啡啉)乙磺酸(MES)、水解酪蛋白、肌醇、活性炭、CuSO₄、AgNO₃、6-BA、盐酸硫胺素、盐酸吡哆醇、烟酸、肌醇、碳源和凝胶剂，得到的固体培养基；

所述添加的物质在所述胚性愈伤组织诱导培养基中的终浓度是：MES 0.4-1.0g/L、水解酪蛋白450-550mg/L、肌醇80-120mg/L、活性炭0.3-0.7g/L、CuSO₄ 20-30mg/L、AgNO₃ 3-8mg/L、6-BA 0.5-1.5mg/L、盐酸硫胺素0.5-12mg/L、盐酸吡哆醇0.5-1.5mg/L、烟酸0.5-1.5mg/L、肌醇90-110mg/L；

所述1/2MS培养基的溶剂是水，溶质如表2所示。

表2、1/2MS培养基的溶质

1/2MS 大量元素	培养基中浓度(g·L^-1)
		NH₄NO₃	0.825
KNO₃	0.95
		KH₂PO₄	0.085
MgSO₄.7H₂O	0.185
		CaCl₂.2H₂O	0.22
MS 铁盐	(mg·L^-1)
		FeSO₄.7H₂O	37.3
Na₂EDTA	27.8
		MS 微量元素	培养基中浓度(mg·L^-1)
MnSO₄.H₂O	22.3
		ZnSO₄.7H₂O	8.6
H₃BO₃	6.2
		KI	0.83
Na₂MoO₄.2H₂O	0.25
		CuSO₄.5H₂O	0.025
CoCl₂.6H₂O	0.025

上述添加的物质在所述胚性愈伤组织诱导培养基中的终浓度优选是：MES 0.6g/L、水解酪蛋白500mg/L、肌醇100mg/L、活性炭0.5g/L、CuSO₄ 25.025mg/L、AgNO₃ 5mg/L、盐酸硫胺素10mg/L、盐酸吡哆醇1mg/L、烟酸1mg/L、肌醇100mg/L、6-BA 1.0mg/L。

上述凝胶剂是琼脂、卡拉胶或植物凝胶(Gelrite Gellan Gum，GGG)，优选是植物凝胶；所述植物凝胶的终浓度是2-5g/L，优选为3.0g/L；上述碳源是葡萄糖、麦芽糖或蔗糖，优选为蔗糖；所述蔗糖的终浓度是25-40g/L，优选为30g/L。

本发明的另一目的在于提供一种生产四合木再生植株的方法。

本发明提供的生产四合木再生植株的方法，包括如下步骤：

1)将切下的四合木的茎诱导，形成愈伤组织；

2)将步骤1)得到的愈伤组织接入上述的胚性愈伤组织诱导培养基中，形成胚性愈伤组织；

3)将步骤2)得到的胚性愈伤组织进行成熟和萌发培养，形成芽，得到所述再生植株。

步骤1)中，所述诱导是将所述切下的四合木的茎接入愈伤培养基中进行培养的；所述愈伤培养基是在MS培养基的基础上添加2，4-D、6-BA、碳源和凝胶剂得到的固体培养基；所述2，4-D和6-BA在所述愈伤培养基中的终浓度是如下a)或b)：

a)2，4-D 0.15-1.35mg/L和6-BA 0.05-1.5mg/L；

b)2，4-D 0.25mg/L和6-BA 0.1mg/L；

所述MS培养基的溶剂是水，溶质如表1所示。

表1.MS培养基的溶质

MS 大量元素	培养基中浓度(g·L^-1)
		NH₄NO₃	1.65
KNO₃	1.90
		KH₂PO₄	0.17
MgSO₄.7H₂O	0.37
		CaCl₂.2H₂O	0.44
MS 铁盐	(mg·L^-1)
		FeSO₄.7H₂O	37.3
Na₂EDTA	27.8
		MS 微量元素	培养基中浓度(mg·L^-1)
MnSO₄.H₂O	22.3

ZnSO₄.7H₂O	8.6
		H₃BO₃	6.2
KI	0.83
		Na₂MoO₄.2H₂O	0.25
CuSO₄.5H₂O	0.025
		CoCl₂.6H₂O	0.025
MS 维生素	培养基中浓度(mg·L^-1)
		甘氨酸	2.0
盐酸硫胺素	0.1
		盐酸吡哆醇	0.5
烟酸	0.5
		肌醇	100

上述方法还包括步骤1)和步骤2)之间的继代培养，所述继代培养是将所述步骤1)得到的愈伤组织接入继代培养基中进行继代培养；所述继代培养基与所述愈伤培养基相同。

步骤3)中，所述成熟和萌发培养包括如下步骤：将所述步骤2)得到的胚性愈伤组织接入成熟和萌发培养基中培养得到芽；所述成熟和萌发培养基是在上述的胚性愈伤组织诱导培养基的基础上去掉活性炭成分、6-BA减半并且添加NAA得到的培养基；所述成熟和萌发培养基中的NAA终浓度是0.1-0.5mg/L，优选是0.5mg/L。

上述方法还包括步骤3)之后的芽伸长；所述芽伸长包括如下步骤：将步骤3)得到的芽插入伸长培养基中进行培养，得到小苗；所述伸长培养基在上述的胚性愈伤组织诱导培养基的基础上添加GA₃得到的培养基；所述伸长培养基中的GA₃终浓度是0.1-0.2mg/L，优选是0.1mg/L。

上述方法还包括芽伸长之后的生根培养，所述生根培养包括如下步骤：将所述小苗插入生根培养基中进行生根培养，得到带根的植株；所述生根培养基是1/2MS培养基的基础上添加MES、水解酪蛋白、肌醇、活性炭、CuSO₄、AgNO₃、6-BA、盐酸硫胺素、盐酸吡哆醇、烟酸、肌醇、碳源和凝胶剂，得到的固体培养基；

所述添加的物质在生根培养基中的终浓度是：MES 0.4-1.0g/L、肌醇80-120mg/L、IBA 0.2-0.5mg/L、盐酸硫胺素10mg/L、盐酸吡哆醇1mg/L、烟酸1mg/L、肌醇100mg/L；所述1/2MS培养基的溶剂是水，溶质如表2所示。

上述愈伤培养基、所述继代培养基和所述生根培养基中的凝胶剂均是琼脂、卡拉胶或植物凝胶，均优选是琼脂；所述琼脂的终浓度均是5-10g/L，均优选为8.0g/L；

上述愈伤培养基、所述继代培养基和所述生根培养基中的碳源均是葡萄糖、麦芽糖或蔗糖，均优选为蔗糖；所述蔗糖的终浓度均是25-40g/L，均优选为30g/L。

实验证明：用本发明的愈伤培养基，第20天时具体的诱导率如表3所示，愈伤组织的诱导率一般在90％以上。用本发明的胚性愈伤组织诱导培养基约30天后，结果如表4所示，胚性愈伤组织形成的频率在80％以上。在成熟和萌发培养基中第45天时体细胞胚胎的萌发率在15-20％。在生根培养基中30天后小苗生根率在20-30％。

本研究旨在以四合木愈伤组织为外植体诱导出体细胞胚胎、进而形成再生植株，为建立高效稳定的体细胞胚胎发生系统奠定基础，这对于四合木的快速繁殖、基因工程、遗传转化、遗传改良等方面的研究，都有十分重要的意义。

附图说明

图1为从愈伤组织诱导得到的体细胞胚胎。

图2为体细胞胚胎萌发得到的丛生芽。

图3为得到的小苗。

图4为得到的植株。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。

下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。

实施例1、

一、愈伤诱导和继代

1、四合木种子(记载该材料的文献：Wang，G.，Q.Q.Lin，et al.(2007).″Tetraena mongolica Maxim can accumulate large amounts of triacylglycerol in phloem cells and xylem parenchyma of stems.″Phytochemistry 68(15)：2112-2117.；公众可从中科院植物所获得)的挑选：考虑到四合木种子败育率较高，选取有胚且较饱满的种子，在无菌操作台里，以添加1％吐温的无菌水浸泡10min后，用70％乙醇消毒1min，10％次氯酸钠浸泡6-7min，用无菌水冲洗4-5次。用无菌滤纸吸干种子表面的水分，将其接种到不含激素的1/2MS培养基上，第3天起，就有种子萌发，20-30d左右，形成无菌苗，取幼嫩茎做以下实验。

2、四合木愈伤组织的诱导和继代：愈伤组织诱导阶段使用的愈伤培养基是MS培养基，附加的蔗糖为30g/L，pH调至5.8-6.0后，加入8g/L的琼脂。121℃高温高压灭菌20分钟后，培养基冷却至60℃左右加入维生素、激素。激素浓度采用0.25mg/L的2，4-D和0.1mg/L的6-BA。

也即：愈伤培养基是在MS培养基的基础上添加2，4-D、6-BA、蔗糖和琼脂得到的固体培养基；所述2，4-D和6-BA在愈伤培养基中的终浓度分别是0.25mg/L和0.1mg/L，琼脂和蔗糖在愈伤培养基中终浓度分别为8g/L和30g/L。

前期实验表明，无菌苗的根茎叶均能诱导出愈伤组织，但由无菌苗的幼嫩茎诱导而来愈伤组织全能性更好，本实验选用由幼嫩茎脱分化得到的愈伤诱导体细胞胚胎、再生植株。

愈伤组织诱导阶段的培养温度为25±1℃，光照强度为30μmol m^-2s^-1，光周期为16小时光照、8小时黑暗。每3周继代培养一次，继代培养基与诱导愈伤培养基相同。

将步骤1得到的幼嫩茎接入培养基后10d左右就能在切口出长出愈伤组织。初代愈伤组织颜色淡，组织紧密、质地坚硬，超过4周后，会有褐化现象。第20天时具体的诱导率如表3所示，愈伤组织的诱导率一般在90％以上。

表3.愈伤组织的诱导率

在3周时进行继代，能避免褐化，并能长出颜色晶莹、质地疏松、增殖速度很快的愈伤组织。2，4-D在诱导愈伤组织中是必须的，实验结果表明，浓度为0.25-0.5mg/L比较合适。浓度过低则愈伤生长太慢且质地坚硬，浓度过高则细胞疯长，且难以诱导出胚性愈伤组织。

二、胚性愈伤组织的诱导

使用1/2MS培养基的大量元素、微量元素及铁盐，B5培养基的维生素，附加30g/LSucrose、0.6g/L的2-(N-吗啡啉)乙磺酸(MES)、500mg/L水解酪蛋白、100mg/L肌醇、0.5g/L的活性碳、25mg/L的CuSO₄，pH调至5.8-6.0，加3g/L的植物凝胶(Gelrite Gellan Gum，GGG)，121℃高温高压灭菌20分钟后，培养基冷却至60℃左右，加入5mg/LAgNO₃、1mg/L 6-苄氨基嘌呤(6-BA)。

也即：胚性愈伤组织诱导培养基，是在1/2MS培养基的基础上添加B5培养基的维生素(盐酸硫胺素、盐酸吡哆醇、烟酸、肌醇)、MES、水解酪蛋白、肌醇、活性炭、GuSO₄、AgNO₃、6-BA、蔗糖和植物凝胶，得到的固体培养基；所述添加的物质在所述胚性愈伤组织诱导培养基中的终浓度是：盐酸硫胺素10mg/L、盐酸吡哆醇1mg/L、烟酸1mg/L、肌醇100mg/L、MES 0.6g/L、水解酪蛋白500mg/L、肌醇100mg/L、活性炭0.5g/L、CuSO₄ 25.025mg/L、AgNO₃ 5mg/L、6-BA 1.0mg/L；蔗糖和植物凝胶的终浓度分别是30g/L和3.0g/L。

实验中发现，在诱导胚性愈伤组织时，需要降低生长素的浓度，最好完全除去培养基中的2，4-D。将步骤一得到的愈伤组织接入本步骤培养基后，先在黑暗条件下培养10天左右，再转移至光下培养，温度为25℃、光照强度为30μmolm^-2s^-1、光周期为16小时光照、8小时黑暗。期间，生长速度变慢，倾向于形成组织致密、颗粒状的胚性愈伤组织。

培养约30天后，统计胚性愈伤组织形成的频率，结果如表4所示，在优化的培养基上，胚性愈伤组织形成的频率在80％以上。

表4.胚性愈伤组织的诱导率

重复次数	I	II	III
				接入分化培养基的愈伤组织(块)	56	45	36
形成的胚性愈伤组织(块)	48	39	31
				诱导率(％)	85.71％	86.67％	86.11％

三、体细胞胚胎的形成

将步骤二的得到的胚性愈伤组织接入诱导体胚的成熟和萌发培养基，基本成分为1/2MS培养基的大量元素、微量元素、铁盐、30g/L Sucrose、0.6g/L MES、500mg/L水解酪蛋白、100mg/L肌醇、25mg/L CuSO₄、pH调至5.8-6.0后，加入3g/L的Gelrite Gellan Gum(GGG)，121℃高温高压灭菌20分钟后，培养基冷却至60℃左右，附加B5培养基的维生素成分，5mg/L AgNO₃、0.5mg/L 6-BA、0.5mg/L NAA。

也即：成熟和萌发培养基是在步骤二所述的胚性愈伤组织诱导培养基的基础上去掉活性炭成分、6-BA减半并且添加NAA得到的培养基；所述成熟和萌发培养基中的NAA终浓度是0.5mg/L。

胚性愈伤组织在本步骤培养基中，置于培养室中培养，温度为25℃、光照强度为30μmolm^-2s^-1、光周期为16小时光照、8小时黑暗。3周左右，将愈伤分成小块儿，继代到本步骤培养基，再培养3-4周，即可形成成熟的体细胞胚胎(图1a和1b)，并逐渐萌发，形成小芽丛(图2a和2b)。

第45天时，统计体细胞胚胎的萌发情况，具体结果如表5所示，萌发率在15-20％。

表5.体细胞胚胎成熟后的萌发诱导率

重复次数	I	II	III
				实验中接种的愈伤(块)	41	42	52
萌发出芽的愈伤组织(块)	6	8	11
				萌发率(％)	14.63％	19.05％	21.15％

四、小芽的伸长

从步骤三得到的芽丛上切下小芽，插入伸长培养基。伸长培养基的基本成分为1/2MS培养基，添加30g/L蔗糖，0.6g/L MES、500mg/L水解酪蛋白、B5维生素、CH+100mg/L肌醇+0.5g/L活性碳+25mg/L CuSO₄+3g/L的Gelrite Gellan Gum(GGG)+5mg/LAgNO₃+0.5mg/L 6-BA+0.1mg/L GA₃。也即：伸长培养基在步骤二的胚性愈伤组织诱导培养基的基础上添加GA₃得到的培养基；伸长培养基中的GA₃终浓度是0.1mg/L。

培养条件：温度为25℃、光照强度为30μmolm^-2s^-1、光周期为16小时光照、8小时黑暗，小芽的茎能逐渐伸长，3周后，即可形成2cm高的小苗(图3a和3b)。

五、小苗生根

将步骤四得到的小苗切下，无菌条件下插入生根培养基，生根培养基的基本成分为1/2MS培养基，添加B5培养基的维生素、30g/L蔗糖，1g/L的Ca(NO₃)₂、100mg/L肌醇、0.6g/L MES、7.5g/L的琼脂+0.2mg/L IBA。也即：生根培养基是1/2MS培养基的基础上添加B5培养基的维生素(盐酸硫胺素、盐酸吡哆醇、烟酸、肌醇)、MES、水解酪蛋白、肌醇、活性炭、CuSO₄、AgNO₃、6-BA、碳源和凝胶剂，得到的固体培养基；添加的物质在生根培养基中的终浓度是：MES 0.6g/L、肌醇100mg/L、IBA 0.2mg/L、盐酸硫胺素10mg/L、盐酸吡哆醇1mg/L、烟酸1mg/L、肌醇100mg/L；1/2MS培养基的溶剂是水，溶质如表2所示。

培养条件：温度为25℃、光照强度为30μmolm^-2s^-1、光周期为16小时光照、8小时黑暗，3-4周即可形成完整的再生植株(图4a和4b)。

30天后，统计生根情况，结果如表6所示，小苗生根率在20-30％。

表6.生根比例统计结果

重复次数	I	II	III
				接种的小芽(个)	39(13+13+13)	42(13+13+14)	35(13+13+9)
生根的小芽(个)	8(3+5+0)	10(2+5+3)	11(4+5+2)
				生根率(％)	20.51％	23.81％	31.43％

Claims

1.四合木的胚性愈伤组织诱导培养基，是在1/2MS培养基的基础上添加MES、水解酪蛋白、肌醇、活性炭、CuSO₄、AgNO₃、6-BA、盐酸硫胺素、盐酸吡哆醇、烟酸、肌醇、碳源和凝胶剂，得到的固体培养基；

所述1/2MS培养基的溶剂是水，溶质如表2所示。

2.如权利要求1所述的胚性愈伤组织诱导培养基，其特征在于：所述添加的物质在所述胚性愈伤组织诱导培养基中的终浓度是：MES 0.6g/L、水解酪蛋白500mg/L、肌醇100mg/L、活性炭0.5g/L、CuSO₄ 25.025mg/L、AgNO₃ 5mg/L、盐酸硫胺素10mg/L、盐酸吡哆醇1mg/L、烟酸1mg/L、肌醇100mg/L、6-BA 1.0mg/L。

3.如权利要求1或2所述的胚性愈伤组织诱导培养基，其特征在于：所述凝胶剂是琼脂、卡拉胶或植物凝胶，优选是植物凝胶；所述植物凝胶的终浓度是2-5g/L，优选为3.0g/L；

所述碳源是葡萄糖、麦芽糖或蔗糖，优选为蔗糖；所述蔗糖的终浓度是25-40g/L，优选为30g/L。

4.一种生产四合木再生植株的方法，包括如下步骤：

1)将切下的四合木的茎诱导，形成愈伤组织；

2)将步骤1)得到的愈伤组织接入权利要求1-3中任一所述的胚性愈伤组织诱导培养基中，形成胚性愈伤组织；

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于：步骤1)中，所述诱导是将所述切下的四合木的茎接入愈伤培养基中进行培养的；所述愈伤培养基是在MS培养基的基础上添加2，4-D、6-BA、碳源和凝胶剂得到的固体培养基；所述2，4-D和6-BA在所述愈伤培养基中的终浓度是如下a)或b)：

a)2，4-D 0.15-1.35mg/L和6-BA 0.05-1.5mg/L；

b)2，4-D 0.25mg/L和6-BA 0.1mg/L；

所述MS培养基的溶剂是水，溶质如表1所示。

6.如权利要求4或5所述的方法，其特征在于：所述方法还包括步骤1)和步骤2)之间的继代培养，所述继代培养是将所述步骤1)得到的愈伤组织接入继代培养基中进行继代培养；所述继代培养基与所述愈伤培养基相同。

7.如权利要求4-6中任一所述的方法，其特征在于：步骤3)中，所述成熟和萌发培养包括如下步骤：将所述步骤2)得到的胚性愈伤组织接入成熟和萌发培养基中培养得到芽；所述成熟和萌发培养基是在权利要求1-3中任一所述的胚性愈伤组织诱导培养基的基础上去掉所述活性炭、所述6-BA浓度减半并且添加NAA得到的培养基；所述成熟和萌发培养基中的NAA终浓度是0.1-0.5mg/L，优选是0.5mg/L。

8.如权利要求4-7中任一所述的方法，其特征在于：所述方法还包括步骤3)之后的芽伸长；所述芽伸长包括如下步骤：将步骤3)得到的芽插入伸长培养基中进行培养，得到小苗；所述伸长培养基在权利要求1-3中任一所述的胚性愈伤组织诱导培养基的基础上添加GA₃得到的培养基；所述伸长培养基中的GA₃终浓度是0.1-0.2mg/L，优选是0.1mg/L。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于：所述方法还包括芽伸长之后的生根培养，所述生根培养包括如下步骤：将所述小苗插入生根培养基中进行生根培养，得到带根的植株；所述生根培养基是1/2MS培养基的基础上添加MES、水解酪蛋白、肌醇、活性炭、CuSO₄、AgNO₃、6-BA、盐酸硫胺素、盐酸吡哆醇、烟酸、肌醇、碳源和凝胶剂，得到的固体培养基；

所述添加的物质在生根培养基中的终浓度是：MES 0.4-1.0g/L、肌醇80-120mg/L、IBA 0.2-0.5mg/L、盐酸硫胺素10mg/L、盐酸吡哆醇1mg/L、烟酸1mg/L、肌醇100mg/L；

所述1/2MS培养基的溶剂是水，溶质如表2所示。

10.如权利要求4-9中任一所述的方法，其特征在于：所述愈伤培养基、所述继代培养基和所述生根培养基中的凝胶剂均是琼脂、卡拉胶或植物凝胶，均优选是琼脂；所述琼脂的终浓度均是5-10g/L，均优选为8.0g/L；

所述愈伤培养基、所述继代培养基和所述生根培养基中的碳源均是葡萄糖、麦芽糖或蔗糖，均优选为蔗糖；所述蔗糖的终浓度均是25-40g/L，均优选为30g/L。