CN106947760A - 番茄果实硬度性状的连锁标记及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种番茄果实硬度性状的连锁标记及其应用。本发明提供了一种引物组合，由引物对I和引物对II组成；所述引物对I由引物L‑1和引物R‑1组成；所述引物L‑1如序列表的序列1所示；所述引物R‑1如序列表的序列2所示；所述引物对II由引物L‑2和引物R‑2组成；所述引物L‑2如序列表的序列3所示；所述引物R‑2如序列表的序列4所示。本研究首次利用分子标记辅助育种的方法，开发了番茄果实硬度的连锁标记。利用果实硬度相关连锁标记来选育高硬度番茄果实品种可以在番茄的幼苗期就进行鉴定，不需要等到番茄结果后再进行表型测定，大大提早了鉴定时间，缩短了不必要的种植面积，减少了人力和物力的消耗。
Description
技术领域
本发明涉及一种番茄果实硬度性状的连锁标记及其应用。
背景技术
番茄是世界上广泛生产和消费的一种重要的蔬菜作物，番茄果实硬度是评价一个番茄品种优劣的重要因素。果实硬度与果实耐压力和果皮耐穿刺力直接相关，影响番茄果实耐储运性、货架期及口感等多个重要的品质指标。尤其对于加工番茄而言，原料采收后，需要经过长时间的运输和排队交售才能进入加工厂，在此过程中硬度较差的品种极易出现果实破裂，果汁外渗，严重时还会引起大量果实的霉变腐烂，影响了番茄的品质，也使农户们承受了巨大的经济损失。因此，利用分子标记辅助育种方法选择高硬度的番茄品种具有重要意义。
利用传统方法选育果实硬度大的品种，主要依赖于对果实硬度的评价和测定。待番茄果实成熟后，测定待鉴定品种的果实硬度，从中挑选出硬度较高的候选品种并观察下一代表型。这种方法耗时长，鉴定不准确且消耗过多的人力和物力。基于分子标记辅助选择(marker-assisted selectionMAS)技术的分子标记辅助育种(molecular marker-assistedbreeding)，是蔬菜分子育种的重要方面，由于其能快速高效获得含有目标基因的个体，现已在育种中得到广泛应用并在某些性状上取得成功。目前，关于番茄果实硬度性状，还没有可应用于生产中的分子标记，因此，开发能够被广泛利用于育种中的标记，变得尤为重要。
发明内容
本发明的目的是提供一种番茄果实硬度性状的连锁标记及其应用。
本发明提供了一种引物组合，由引物对I和引物对II组成；
所述引物对I由引物L-1和引物R-1组成；
所述引物L-1为如下(a1)或(a2)：
(a1)序列表的序列1所示的单链DNA分子；
(a2)将序列1经过一个或几个核苷酸的取代且与序列1具有相同功能的DNA分子；
所述引物R-1为如下(a3)或(a4)：
(a3)序列表的序列2所示的单链DNA分子；
(a4)将序列2经过一个或几个核苷酸的取代且与序列2具有相同功能的DNA分子；
所述引物对II由引物L-2和引物R-2组成；
所述引物L-2为如下(a5)或(a6)：
(a5)序列表的序列3所示的单链DNA分子；
(a6)将序列3经过一个或几个核苷酸的取代且与序列3具有相同功能的DNA分子；
所述引物R-2为如下(a7)或(a8)：
(a7)序列表的序列4所示的单链DNA分子；
(a8)将序列4经过一个或几个核苷酸的取代且与序列4具有相同功能的DNA分子。
所述引物组合的用途为如下(b1)-(b6)中的至少一种：
(b1)鉴定或辅助鉴定番茄果实硬度性状；
(b2)筛选或辅助筛选果实硬度高的番茄；
(b3)筛选或辅助筛选果实硬度低的番茄；
(b4)制备用于鉴定或辅助鉴定番茄果实硬度性状的试剂盒；
(b5)制备用于筛选或辅助筛选果实硬度高的番茄的试剂盒；
(b6)制备用于筛选或辅助筛选果实硬度低的番茄的试剂盒。
本发明还保护所述引物组合的应用，为如下(b1)-(b6)中的至少一种：
(b1)鉴定或辅助鉴定番茄果实硬度性状；
(b2)筛选或辅助筛选果实硬度高的番茄；
(b3)筛选或辅助筛选果实硬度低的番茄；
(b4)制备用于鉴定或辅助鉴定番茄果实硬度性状的试剂盒；
(b5)制备用于筛选或辅助筛选果实硬度高的番茄的试剂盒；
(b6)制备用于筛选或辅助筛选果实硬度低的番茄的试剂盒。
本发明还保护含有所述引物组合的试剂盒；所述试剂盒的应用为如下(c1)-(c3)中的至少一种：
(c1)鉴定或辅助鉴定番茄果实硬度性状；
(c2)筛选或辅助筛选果实硬度高的番茄；
(c3)筛选或辅助筛选果实硬度低的番茄。
本发明还保护所述试剂盒的制备方法，包括将所述引物组合中的各条引物进行独立包装的步骤。
本发明还保护鉴定或辅助鉴定番茄果实硬度性状的方法(方法甲)，包括如下步骤：
(d1)以待测番茄的基因组DNA为模板，采用所述引物对I进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；
(d2)以待测番茄的基因组DNA为模板，采用所述引物对II进行PCR扩增，将扩增产物采用spe I酶切，得到酶切产物；
如果步骤(d1)得到的PCR扩增产物中具有126bp的DNA片段且不含有165bp的DNA片段，同时步骤(d2)得到的酶切产物中具有116bp的DNA片段且不具有146bp的DNA片段、待测番茄为或候选为果实硬度高的番茄，如果步骤(d1)得到的PCR扩增产物中具有165bp的DNA片段且不具有126bp的DNA片段，同时步骤(d2)得到的酶切产物中具有146bp的DNA片段且不具有116bp的DNA片段、待测番茄为或候选为果实硬度低的番茄。
本发明还保护鉴定或辅助鉴定番茄果实硬度性状的方法(方法乙)，包括如下步骤：检测待测番茄基因组DNA中是否含有特异DNA片段甲、特异DNA片段乙、特异DNA片段丙和特异DNA片段丁；如果所述基因组DNA中同时含有特异DNA片段甲和特异DNA片段丙且不含有特异DNA片段乙或特异DNA片段丁、待测番茄为或候选为果实硬度高的番茄，如果所述基因组DNA中同时含有特异DNA片段乙和特异DNA片段丁且不含有特异DNA片段甲或特异DNA片段丙、待测番茄为或候选为果实硬度低的番茄。
所述特异DNA片段甲为序列表的序列5所示的DNA分子。
所述特异DNA片段乙为序列表的序列6所示的DNA分子。
所述特异DNA片段丙为序列表的序列7所示的DNA分子。
所述特异DNA片段丁为序列表的序列8所示的DNA分子。
所述特异DNA片段甲、特异DNA片段乙、特异DNA片段丙或特异DNA片段丁均位于番茄10号染色体0.2M的区间内。
本发明还保护一种筛选或辅助筛选果实硬度高的番茄的方法(方法丙)，包括如下步骤：
(e1)按照所述方法甲或所述方法乙鉴定待测番茄果实硬度性状；
(e2)基于步骤(e1)的结果筛选或辅助筛选果实硬度高的番茄。
本发明还保护一种筛选或辅助筛选果实硬度低的番茄的方法(方法丁)，包括如下步骤：
(f1)按照所述方法甲或所述方法乙鉴定待测番茄果实硬度性状；
(f2)基于步骤(f1)的结果筛选或辅助筛选果实硬度低的番茄。
本发明还保护所述引物组合或以上任一所述方法在番茄育种中的应用。
本发明还保护番茄育种方法，为方法A或方法B。
所述方法A包括如下步骤：将所述方法丙筛选得到的果实硬度高的番茄作为育种材料；
所述方法B包括如下步骤：将所述方法丁筛选得到的果实硬度低的番茄作为育种材料。
以上任一所述待测番茄具体可为番茄‘Moneymaker’(Solanum lycopersicum‘Moneymaker’)及其自交后代。所述番茄‘Moneymaker’(Solanum lycopersicum‘Moneymaker’)在Tomato Genetics Resource Center的代码为LA2706。
以上任一所述待测番茄具体可为番茄LA1310及其自交后代。所述番茄LA1310在Tomato Genetics Resource Center的代码为LA1310。
以上任一所述待测番茄具体可为番茄‘Moneymaker’(Solanum lycopersicum‘Moneymaker’)和番茄LA1310的杂交后代。
以上任一所述果实硬度高的番茄为果实耐穿刺力大于等于2.55N和/或果实耐压力大于等于15N的番茄；所述果实硬度低的番茄为果实耐穿刺力小于2.55N和/或果实耐压力小于15N的番茄。
本研究首次利用分子标记辅助育种的方法，开发了番茄果实硬度的连锁标记，在近等基因系群体中进行了验证。利用果实硬度相关连锁标记来选育高硬度番茄果实品种可以在番茄的幼苗期就进行鉴定，不需要等到番茄结果后再进行表型测定，大大提早了鉴定时间，缩短了不必要的种植面积，减少了人力和物力的消耗。
附图说明
图1为BC4F2群体连锁标记引物对I鉴定结果。
图2为BC4F2群体连锁标记引物对II鉴定结果。
图3为NIL群体果实硬度表型鉴定结果。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
番茄‘Moneymaker’，英文名称为Solanum lycopersicum‘Moneymaker’，是一种栽培品种。Tomato Genetics Resource Center，代码为LA2706。番茄‘Moneymaker’的果实耐穿刺力为13.2064±3.19N，耐压力为55.229±13.15N(平均值±标准差；检测方法同实施例3的步骤5)。
番茄LA1310，是一种栽培品种。番茄LA1310果实硬度低。Tomato GeneticsResource Center，代码为LA1310。番茄LA1310的果实硬耐穿刺力为2.4389±0.23N，耐压力为4.414±0.46N(平均值±标准差；检测方法同实施例3的步骤5)。
实施例1、连锁标记的发现
1、以番茄‘Moneymaker’和番茄LA1310为亲本材料进行杂交，并按单粒传法获得由200个重组自交系构成的F10代RILs群体。
2、通过对步骤1得到的RILs群体进行重测序及果实硬度相关性状的全基因组关联分析，获得了与果实硬度相关性状的QTLs，其中p＜0.01的QTL位点共7个，主效QTL位点的p值约为10-5，位于10号染色体0.2M的区间内。在此区间内设计合成了两对可应用的连锁标记引物对，命名为连锁标记引物对I(由引物L-1和引物R-1组成)和连锁标记引物对II(由引物L-2和引物R-2组成)，引物信息如表1所示。
表1引物信息
| 引物名称 | 引物序列(5’-3’) |
| L-1 | CTGTGACAGTCATTGTGAGCTC(序列表的序列1) |
| R-1 | AGCAAAATGGTACTCTAGTGAAC(序列表的序列2) |
| L-2 | ATTTTAATAAAACTTCACACCCCTGAAATACTAG(序列表的序列3) |
| R-2 | CTTGTTGAATTTTGCCATTCAACC(序列表的序列4) |
实施例2、使用连锁标记引物对鉴定待测番茄基因型的方法的建立
1、提取待测番茄的基因组DNA，以基因组DNA为模板，采用引物L-1和引物R-1进行PCR扩增，将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳。
2、提取待测番茄的基因组DNA，以基因组DNA为模板，采用引物L-2和引物R-2进行PCR扩增，将扩增产物用spe I酶切8h，将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳。
3、综合步骤1和步骤2的电泳结果进行如下分析：
如果步骤1得到的PCR扩增产物中具有126bp的DNA片段且不含有165bp的DNA片段，同时步骤2得到的酶切产物中具有116bp的DNA片段且不具有146bp的DNA片段，则将待测植株定义为MM纯合型；
如果步骤1得到的PCR扩增产物中具有165bp的DNA片段且不具有126bp的DNA片段，同时步骤2得到的酶切产物中具有146bp的DNA片段且不具有116bp的DNA片段，则将待测植株定义为CC纯合型。
采用上述方法对番茄‘Moneymaker’和番茄LA1310进行鉴定，番茄‘Moneymaker’为MM纯合型，番茄LA1310为CC纯合型。
实施例3、连锁标记引物对在判断番茄果实硬度中的应用
1、从实施例1的步骤1构建的重组自交系RILs群体中选择ST059株系(经抽样检测，该株系所有植株均为MM纯合型)和ST052株系(经抽样检测，该株系所有植株均为CC纯合型)。
2、以ST059株系和ST052株系为亲本杂交，得到F1代植株；将F1代植株与亲本ST059株系回交3代，再自交一代，获得BC4F2群体。
3、从步骤2得到的BC4F2群体中随机选取200棵单株，提取基因组DNA。
4、检测基因型
待测番茄分别为番茄‘Moneymaker’、番茄LA1310和步骤3得到的200棵单株。
采用实施例2的方法检测待测番茄的基因型。
采用引物对I(引物L-1和引物R-1)进行检测时，部分待测番茄的电泳图见图1。图1A和图1B中，向上箭头指向的为番茄‘Moneymaker’，显示一条特异条带(命名为特异条带1)，向下箭头指向的为番茄LA1310，显示一条特异条带(命名为特异条带2)，其余泳道分别为步骤3得到的不同单株(有的与番茄‘Moneymaker’带型一致，有的与番茄LA1310带型一致，有的显示为番茄‘Moneymaker’和番茄LA1310的叠加带型)。将番茄‘Moneymaker’以及与番茄‘Moneymaker’带型一致的各个单株中的特异条带均进行测序，均如序列表的序列5所示(126bp)，这些单株均为候选MM纯合型单株。将番茄LA1310以及与番茄LA1310带型一致的各个单株中的特异条带均进行测序，均如序列表的序列6所示(165bp)，这些单株均为候选CC纯合型单株。将显示为番茄‘Moneymaker’和番茄LA1310的叠加带型的各个单株中的两条特异条带均进行测序，其中一条特异条带均如序列表的序列5所示(126bp)，其中另一条特异条带均如序列表的序列6所示(165bp)。
采用引物对II(引物L-2和引物R-2)进行检测时，部分待测番茄的电泳图见图2。图2A和图2B中，向上箭头指向的为番茄‘Moneymaker’，显示一条特异条带(命名为特异条带3)，向下箭头指向的为番茄LA1310，显示一条特异条带(命名为特异条带4)，其余泳道分别为步骤3得到的不同单株(有的与番茄‘Moneymaker’带型一致，有的与番茄LA1310带型一致，有的显示为番茄‘Moneymaker’和番茄LA1310的叠加带型)。将番茄‘Moneymaker’以及与番茄‘Moneymaker’带型一致的各个单株中的特异条带均进行测序，均如序列表的序列7所示(116bp)，这些单株均为候选MM纯合型单株。将番茄LA1310以及与番茄LA1310带型一致的各个单株中的特异条带均进行测序，均如序列表的序列8所示(146bp)，这些单株均为候选CC纯合型单株。将显示为番茄‘Moneymaker’和番茄LA1310的叠加带型的各个单株中的两条特异条带均进行测序，其中一条特异条带均如序列表的序列7所示(116bp)，其中另一条特异条带均如序列表的序列8所示(146bp)。
采用引物对I和引物对II同时筛选为候选MM纯合型单株的为MM纯合型单株。
采用引物对I和引物对II同时筛选为候选CC纯合型单株为CC纯合型单株。
5、取步骤4鉴定为MM纯合型的所有单株(组成M型株系)和步骤4鉴定为CC纯合型的所有单株(组成C型株系)作为待测样本，进行果实耐穿刺力(ST，skin toughness)和耐压力(CR，compress resistence)检测。利用INSTRON5542型质构仪(美国Instron公司)测定果实耐压力和耐穿刺力，测定方法：选择待测样本完整番茄果实为试验对象，各待测样本随机取果实20个进行测定，采用P/2n针状探头(直径2mm)测定耐穿刺力，选用直径为100mm的不锈钢圆盘(P/100)探头测定耐压力，测前速度5mm/s，贯入速度1mm/s，测后速度5mm/s，最小感知力2g。
结果如图3所示。图3A为果实耐穿刺力分析结果，图3B为果实耐压力分析结果。图3A中，1为M型株系的分析结果，2为C型株系的分析结果，纵坐标为果实耐穿刺力，单位为N。图3B中，1为M型株系的分析结果，2为C型株系的分析结果，纵坐标为果实耐压力，单位为N。
结果显示，M型株系果实的耐穿刺力最大值是3.81，最小值是2.41，平均值是2.99，标准差是0.36；耐压力最大值是29.19，最小值是14.83，平均值是21.75，标准差是4.22。C型株系的耐穿刺力最大值是2.55，最小值是1.08，平均值是2.03，标准差是0.26；耐压力的最大值是24.53，最小值是9.44，平均值是15.48，标准差是4.39。果实耐穿刺力在M型和C型株系之间存在显著差异(p＝9.44E-05)，86％以上的M型株系果实耐穿刺力均大于C型株系果实耐穿刺力的最大值，同时耐压力在M型和C型株系之间也有明显差异(p＝2.82E-03)，以耐压力程度15为标准，M型株系果实的耐压力有93％均大于等于15，而C型株系果实中有60％的耐压力均小于15。因此，说明筛选的QTL位点是与果实硬度紧密连锁主要的位点，连锁标记引物对L和连锁标记引物对R可应用于果实硬度性状的鉴定。
<110> 中国农业科学院蔬菜花卉研究所
<120> 番茄果实硬度性状的连锁标记及其应用
<160> 8
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 1
ctgtgacagt cattgtgagc tc 22
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 2
agcaaaatgg tactctagtg aac 23
<210> 3
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 3
attttaataa aacttcacac ccctgaaata ctag 34
<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 4
cttgttgaat tttgccattc aacc 24
<210> 5
<211> 126
<212> DNA
<213> 番茄（Lycopersicon esculentum Mill.）
<400> 5
ctgtgacagt cattgtgagc tctatttaac ggaactctta tcaaattgca cgtctgttct 60
ctataacaat atttcacgta tttcatgtta tgttatataa tatgttcact agagtaccat 120
tttgct 126
<210> 6
<211> 165
<212> DNA
<213> 番茄（Lycopersicon esculentum Mill.）
<400> 6
ctgtgacagt cattgtgagc tctatttaac ggaactctta tcaaattgca cgtctgttct 60
ctataacaat atttcacgtg tcctataaca accaagttat ctatttctag aggctgtttt 120
ttcatgttat gttatataat atgttcacta gagtaccatt ttgct 165
<210> 7
<211> 116
<212> DNA
<213> 番茄（Lycopersicon esculentum Mill.）
<400> 7
ctagtcaaca gaacacacca taattactcg ttaatttaca aagcacaaca ttgttcacaa 60
accaaagaag gaaacattaa ccacaattag aaggttgaat ggcaaaattc aacaag 116
<210> 8
<211> 146
<212> DNA
<213> 番茄（Lycopersicon esculentum Mill.）
<400> 8
attttaataa aacttcacac ccctgaaatt ctagccaaca gaacacacca taattactcg 60
ttaatttaca aagcacaaca ttgttcacaa accaaagaag gaaacattaa ccacaattag 120
aaggttgaat ggcaaaattc aacaag 146
Claims (10)
1.引物组合，由引物对I和引物对II组成；
所述引物对I由引物L-1和引物R-1组成；
所述引物L-1为如下(a1)或(a2)：
(a1)序列表的序列1所示的单链DNA分子；
(a2)将序列1经过一个或几个核苷酸的取代且与序列1具有相同功能的DNA分子；
所述引物R-1为如下(a3)或(a4)：
(a3)序列表的序列2所示的单链DNA分子；
(a4)将序列2经过一个或几个核苷酸的取代且与序列2具有相同功能的DNA分子；
所述引物对II由引物L-2和引物R-2组成；
所述引物L-2为如下(a5)或(a6)：
(a5)序列表的序列3所示的单链DNA分子；
(a6)将序列3经过一个或几个核苷酸的取代且与序列3具有相同功能的DNA分子；
所述引物R-2为如下(a7)或(a8)：
(a7)序列表的序列4所示的单链DNA分子；
(a8)将序列4经过一个或几个核苷酸的取代且与序列4具有相同功能的DNA分子。
2.权利要求1所述引物组合的应用，为如下(b1)-(b6)中的至少一种：
(b1)鉴定或辅助鉴定番茄果实硬度性状；
(b2)筛选或辅助筛选果实硬度高的番茄；
(b3)筛选或辅助筛选果实硬度低的番茄；
(b4)制备用于鉴定或辅助鉴定番茄果实硬度性状的试剂盒；
(b5)制备用于筛选或辅助筛选果实硬度高的番茄的试剂盒；
(b6)制备用于筛选或辅助筛选果实硬度低的番茄的试剂盒；
所述果实硬度高的番茄为果实耐穿刺力大于等于2.55N和/或果实耐压力大于等于15N的番茄；所述果实硬度低的番茄为果实耐穿刺力小于2.55N和/或果实耐压力小于15N的番茄。
3.含有权利要求1所述引物组合的试剂盒；所述试剂盒的应用为如下(c1)-(c3)中的至少一种：
(c1)鉴定或辅助鉴定番茄果实硬度性状：
(c2)筛选或辅助筛选果实硬度高的番茄；
(c3)筛选或辅助筛选果实硬度低的番茄；
所述果实硬度高的番茄为果实耐穿刺力大于等于2.55N和/或果实耐压力大于等于15N的番茄；所述果实硬度低的番茄为果实耐穿刺力小于2.55N和/或果实耐压力小于15N的番茄。
4.权利要求3所述试剂盒的制备方法，包括将权利要求1所述引物组合中的各条引物进行独立包装的步骤。
5.鉴定或辅助鉴定番茄果实硬度性状的方法，包括如下步骤：
(d1)以待测番茄的基因组DNA为模板，采用权利要求1中所述的引物对I进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；
(d2)以待测番茄的基因组DNA为模板，采用权利要求1中所述的引物对II进行PCR扩增，将扩增产物采用spe I酶切，得到酶切产物；
如果步骤(d1)得到的PCR扩增产物中具有126bp的DNA片段且不含有165bp的DNA片段，同时步骤(d2)得到的酶切产物中具有116bp的DNA片段且不具有146bp的DNA片段、待测番茄为或候选为果实硬度高的番茄，如果步骤(d1)得到的PCR扩增产物中具有165bp的DNA片段且不具有126bp的DNA片段，同时步骤(d2)得到的酶切产物中具有146bp的DNA片段且不具有116bp的DNA片段、待测番茄为或候选为果实硬度低的番茄；
所述果实硬度高的番茄为果实耐穿刺力大于等于2.55N和/或果实耐压力大于等于15N的番茄；所述果实硬度低的番茄为果实耐穿刺力小于2.55N和/或果实耐压力小于15N的番茄。
6.鉴定或辅助鉴定番茄果实硬度性状的方法，包括如下步骤：
检测待测番茄基因组DNA中是否含有特异DNA片段甲、特异DNA片段乙、特异DNA片段丙和特异DNA片段丁；如果所述基因组DNA中同时含有特异DNA片段甲和特异DNA片段丙且不含有特异DNA片段乙或特异DNA片段丁、待测番茄为或候选为果实硬度高的番茄，如果所述基因组DNA中同时含有特异DNA片段乙和特异DNA片段丁且不含有特异DNA片段甲或特异DNA片段丙、待测番茄为或候选为果实硬度低的番茄；
所述特异DNA片段甲为序列表的序列5所示的DNA分子；
所述特异DNA片段乙为序列表的序列6所示的DNA分子；
所述特异DNA片段丙为序列表的序列7所示的DNA分子；
所述特异DNA片段丁为序列表的序列8所示的DNA分子；
所述果实硬度高的番茄为果实耐穿刺力大于等于2.55N和/或果实耐压力大于等于15N的番茄；所述果实硬度低的番茄为果实耐穿刺力小于2.55N和/或果实耐压力小于15N的番茄。
7.一种筛选或辅助筛选果实硬度高的番茄的方法，包括如下步骤：
(e1)按照权利要求6或7所述方法鉴定待测番茄果实硬度性状；
(e2)基于步骤(e1)的结果筛选或辅助筛选果实硬度高的番茄；
所述果实硬度高的番茄为果实耐穿刺力大于等于2.55N和/或果实耐压力大于等于15N的番茄。
8.一种筛选或辅助筛选果实硬度低的番茄的方法，包括如下步骤：
(f1)按照权利要求6或7所述方法鉴定待测番茄果实硬度性状；
(f2)基于步骤(f1)的结果筛选或辅助筛选果实硬度低的番茄；
所述果实硬度低的番茄为果实耐穿刺力小于2.55N和/或果实耐压力小于15N的番茄。
9.权利要求1所述的引物组合，或，权利要求5-8任一所述的方法在番茄育种中的应用。
10.番茄育种方法，为方法A或方法B；
所述方法A包括如下步骤：将权利要求7筛选得到的果实硬度高的番茄作为育种材料；
所述方法B包括如下步骤：将权利要求8筛选得到的果实硬度低的番茄作为育种材料；
所述果实硬度高的番茄为果实耐穿刺力大于等于2.55N和/或果实耐压力大于等于15N的番茄；所述果实硬度低的番茄为果实耐穿刺力小于2.55N和/或果实耐压力小于15N的番茄。
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