CN102140499B

CN102140499B - 辣椒细菌性斑点病菌检测用引物及探针

Info

Publication number: CN102140499B
Application number: CN2010105287781A
Authority: CN
Inventors: 赵文军; 董明明; 陈岩; 朱水芳; 陈洪俊
Original assignee: Chinese Academy of Inspection and Quarantine CAIQ
Current assignee: Chinese Academy of Inspection and Quarantine CAIQ
Priority date: 2010-11-02
Filing date: 2010-11-02
Publication date: 2012-11-21
Anticipated expiration: 2030-11-02
Also published as: CN102140499A

Abstract

本发明提供了一种辣椒细菌性斑点病菌检测用引物及探针，所述引物的核苷酸序列如序列表XCV-F& XCV-R所示，所述探针的核苷酸序列如序列表XCV-P所示。本发明还进一步提供了检测辣椒细菌性斑点病菌的方法，该方法以样品菌液为模板，利用上述引物和探针进行实时荧光PCR扩增，每个循环结束采集数据，反应结束后根据扩增曲线判定结果。本发明探针特异性好，检测方法快速简单，准确性高，灵敏度高，为进出口安全提供了保证。

Description

辣椒细菌性斑点病菌检测用引物及探针

技术领域

本发明涉及生物检测技术，具体地说涉及辣椒细菌性斑点病菌检测用引物及探针。

背景技术

辣椒细菌性斑点病(Xanthomonas campestris pv.vesicatoria)是世界性番茄及辣椒病害，是重要进境植物检疫性有害生物，主要侵染番茄及辣椒等多种番茄属及辣椒属植物，染病植株严重时可导致死亡及绝产。该病可通过植株及种子进行远距离传播。该病目前在欧洲、亚洲、非洲、美洲及大洋洲等国家和地区均有发生。近年来我国辣椒产业发展很快，辣椒远距离运输的频率及数量也大幅度增加，因此该病传播及扩散的风险日益增大。

本研究选择辣椒细菌性斑点病Rhs基因序列设计一条荧光标记探针和一对引物，建立了辣椒斑点病菌的荧光PCR检测方法，反应结束即可根据扩增曲线判定是否有辣椒斑点病菌。

发明内容

本发明目的在于提供用于辣椒细菌性斑点病菌实时荧光PCR检测的引物及探针序列。

本发明通过分析已报道辣椒细菌性斑点病菌Rhs基因序列的基础上，分别设计引物和荧光探针。所述的引物对由正向和反向引物组成，其核苷酸序列如序列表XCV-F好XCV-R所示；所述探针核苷酸序列如序列表XCV-P所示，该探针在5′端标记有FAM荧光染料，在3′端采用了BHQ淬灭基团。

TaqMan探针是一种寡核苷酸探针，它的荧光与目的序列的扩增有关。即将报告荧光染料标记在探针的5′端，而3′端标记了淬灭基团，两者构成能量转移结构，即报告荧光染料所发射的荧光可被淬灭基团吸收，当二者距离变远时，抑制作用减弱，报告荧光染料信号增强。当探针完整的情况下，报告基团发射的荧光信号被荧光淬灭基团淬灭。在进行退火的过程中，探针及引物先与目标基因结合，当引物延伸至荧光标记探针的结合位点时，TaqDNA聚合酶发挥其5′外切酶活性将探针切断，使报告基团与淬灭基团分离，产生荧光信号。随着扩增循环数的增加，释放出来的荧光基团不断积累，即荧光分子的数目与PCR扩增产物呈1∶1的关系，从而实现对辣椒细菌性斑点病菌的检测。

本发明还进一步给出了应用上述引物和探针的荧光PCR检测方法，其以样品菌液为模板，进行实时荧光PCR扩增，每个循环结束采集数据，反应结束后根据扩增曲线判定结果。

具体地说本发明以样品菌液为模板，进行实时荧光PCR反应，即在20μL反应体系中加入8μL超纯水，10μL2×Premix Ex Taq^TM，0.5μL引物XCV-F(20μmol/L)，0.5μL引物XCV-R(20μmol/L)，0.5μL TaqMan探针XCV-P(20μmol/L)，0.5μL菌液。Premix Ex Taq^TM购自Takara公司。

其中，上述反应条件可以是：第一个循环为95℃3min；随后40个循环，92℃5s，60℃30s。

当然，可以根据本发明给出的引物对或者其扩增产物序列设计其他类型的探针，以适用不同方法的荧光PCR检测。

进一步，还可以将本发明引物、探针以及相关试剂组装成试剂盒，以方便使用。

本发明根据辣椒细菌性斑点病菌Rhs基因序列设计引物及探针，该探针特异性好，用于荧光PCR检测灵敏性高。本发明检测方法准确性高、灵敏度高，其能够快速简单地判断样品是否有辣椒细菌性斑点病菌，为进出口安全提供了保证。

附图说明

图1是实时荧光PCR技术检测辣椒细菌性斑点病菌的结果；

图2是本发明检测方法的灵敏度实验。

具体实施方式

下面实施例用于对本发明的进一步说明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1引物及探针的设计和合成

根据辣椒细菌性斑点病菌Rhs基因序列，采用探针设计软件Express 2.0设计引物及探针，引物序列为：

XCV-F(正向)：5′-GGATGGGCAGCGTATCTTTC-3′

XCV-R(反向)：5′-CAAACAGCATTTCCACCTTGAA-3′

所述探针的序列为：

XCV-P：5′-CCTGAAGCGAAGCTCTGCCAAGTCG-3′，

该探针的5′端用报告荧光染料标记，3′端标记有荧光淬灭基团。

实施例2总DNA的提取

1)采集适量幼嫩叶片，用液氮研成粉末，0.4g装入1.5ml离心管中(-20℃预冷)

2)预热1.5×CTAB到95℃，加1ml到装有叶片粉末的离心管中，混匀(防止冻融)。

3)立即置于65℃水浴30min，每5min，上下颠倒1次，12000g离心5min。

4)吸取上清液约600μl，加入等体积(600μl)氯仿/异戊醇(24∶1)，上下颠倒数次，至下层液相呈深绿色为止，12000g离心5分钟。

5)取450μl上清液于一新1.5ml离心管，加入1ml 95％乙醇和45μl 10M NH₄AC，混匀，室温放置10min。

6)12000g离心10min，去上清液，用75％乙醇浸洗沉淀，自然干燥约30min。

7)加入50μl 1/10TE或无菌水(含20μg RNase)，置于4℃过夜，待DNA溶解后，检测DNA浓度及质量。

实施例3Real-time PCR扩增方法的建立

1、实时荧光PCR反应体系

以菌液为模板，进行实时荧光PCR反应，即在20μL反应体系中加入8μL超纯水，10μL 2×PremixEx Taq^TM，0.5μL引物XCV-F(20μmol/L)，0.5μL引物XCV-R(20μmol/L)，0.5μL TaqMan探针XCV-P(20μmol/L)，0.5μL菌液。

2、实时荧光PCR反应条件

将样品管放入Roche公司的LightCycler1.0荧光PCR仪后，设置如下条件进行反应：第一个循环为95℃3min；随后40个循环，92℃5s，60℃30s。每个循环结束后采集数据。反应结束后根据扩增曲线判定结果。

实施例4 辣椒细菌性斑点病菌Real-time PCR方法的特异性确定

以发病后显症及未显症的辣椒叶片总DNA为模板，以健康辣椒为对照，通过实时荧光PCR检测荧光强度变化。

试验结果：

以发病后显症及未显症的辣椒叶片的总DNA为模板，通过实时荧光PCR检测可观察到明显的荧光强度变化，而健康对照的荧光强度没有变化，结果见图1。

实施例5 灵敏度实验

用超纯水分别稀释细菌菌液，进行相对灵敏度检测，在20μL反应体系中，分别加入0.5μL如下浓度的稀释菌液：1.8×10⁹cfu/mL，1.8×10⁸cfu/mL，1.8×10⁷cfu/mL，1.8×10⁶cfu/mL，1.8×10⁵cfu/mL，1.8×10⁴cfu/mL，1.8×10³cfu/mL，1.8×10²cfu/mL，1.8×10¹cfu/mL，1.8×10⁰cfu/mL。检测结果如图2所示，最低检测限是9个细菌。

Claims

1.一种辣椒细菌性斑点病菌检测用引物及探针，引物序列为：XCV-F：5′-GGATGGGCAGCGTATCTTTC -3′，XCV-R：5′-CAAACAGCATTTCCACCTTGAA-3′，探针序列为XCV-P：5′-CCTGAAGCGAAGCTCTGCCAAGTCG-3′，该探针一端标记有荧光染料，另一端标记有荧光淬灭基团。

2.一种检测辣椒细菌性斑点病菌的方法，该方法以样品菌液为模板，利用权利要求1所述的引物及探针进行实时荧光PCR扩增，每个循环结束采集数据，反应结束后根据扩增曲线判定结果。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，实时荧光PCR的反应过程中的退火温度为60℃。

4.含有权利要求1所述引物及探针的试剂盒。