CN108103241A - 柑橘黄脉病毒微滴数字pcr定量检测试剂盒及方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种柑橘黄脉病毒微滴数字PCR定量检测试剂盒，包括总RNA提取试剂，引物CP7、CP8和CP9，T7体外转录试剂盒，QX200 ddPCR EvaGreen supermix试剂盒。还公开了其检测方法，步骤：(1)抽提总RNA；(2)用CP7和CP9扩增总RNA，转录合成cRNA，利用CP9对cRNA标准品进行逆转录反应，获得cDNA；CP7：5′‑TAATACGACTCACTATAGGGAGGCTATCGGGAAAGCTTGG‑3′，CP9：5′‑CGTTTCGTTCAACAACGGGG‑3′；(3)以cDNA为模板，利用特异性引物CP8、CP9进行数字ddPCR检测。

Description

柑橘黄脉病毒微滴数字PCR定量检测试剂盒及方法
技术领域
本发明属于分子生物学领域，涉及一种柑橘黄脉病毒微滴数字PCR定量检测试剂盒及方法。
背景技术
柑橘黄脉病毒(Citrusyellow vein clearing virus，CYVCV)是α线性病毒科(Alphaflexiviridae)，印度柑橘病毒属(Mandarivirus)的正义单链RNA病毒，可引起柑橘黄脉病。CYVCV粒子呈弯曲线状，大小约为(13～14)nm×685nm。1988年首次在巴基斯坦的柠檬(Citrus limon)和酸橙(C.aurantium)上发现了一种新的柑橘病害，根据其产生的黄化脉明症状将其命名为柑橘黄脉病。随后在印度、土耳其的‘香橼’(C.medica)、‘尤力克’柠檬(C.limonia)和多种柠檬品种上也观察到类似症状，柠檬发病后减产可超过50％。2009年我国首次在云南瑞丽的‘尤力克’柠檬上观察到典型的柑橘黄脉病症状，随后在四川安岳地区也检测出柑橘黄脉病。目前柑橘黄脉病在我国分布较广，除云南、四川外，在广西、广东、江西和福建等多个柑橘主产区都有分布。
CYVCV寄主范围广泛，除可侵染柑橘属的大多数种及其杂种外，还可以侵染豇豆(Vigna unguiculata)、菜豆(Phaseolus vulgaris)、辣椒(Capsicum annuum)、藜麦(Chenopodium quinoa)等草本植物。近年来在锦葵(Malva sylvestris)，龙葵(Solanumnigrum)，野芥(Sinapis arvensis)和田野毛茛(Rananculus arvensis)上亦检测出了CYVCV。CYVCV在不同柑橘品种上引起的症状差异明显，其中以在柠檬、酸橙和‘德威特’橘橙(C.Reticulata×C.sinensis)上的症状最为显著。病株表现出叶脉黄化、脉明、叶背水浸状、叶片反卷和皱缩。叶片老熟后黄化症状消褪并转绿，但叶片皱缩症状不会恢复，且对光看脉明明显。此外，葡萄柚(C.paradisi)、琯溪蜜柚(C.grandis)和部分甜橙、宽皮柑橘(C.Reticulata)品种感病后仅春梢嫩叶表现出轻微脉明，且枝梢老熟后症状消失。CYVCV除通过感病苗木、接穗和嫁接传播外，还可通过豆蚜(Aphis craccivora)和绣线菊蚜(A.spiraecola)在菜豆之间，以及柠檬到菜豆间进行传播，其传毒率均高于40％。因而具有大面积流行风险，威胁柑橘生产安全。
柑橘三级良繁体系的母本树鉴定、新建柑橘园引种以及CYVCV流行调查等都需要对植株进行鉴定，判断植株的病毒感染情况，排除带病植株，防止病毒的扩散传播，降低生产损失，维护产业安全。目前，柑橘黄脉病的检测方法主要有指示植物鉴定法、电子显微镜技术、血清学鉴定、(RT-)PCR、实时荧光定量RT-PCR检测体系、巢式(RT-)PCR以及(RT-)LAMP。但指示植物鉴定法费时费力，显症率低。电子显微镜技术，血清学鉴定灵敏度较低。PCR产物易产生交叉污染且只能定性检测，实时荧光定量PCR需要依赖Ct值和标准曲线才能对起始模板进行相对定量分析。
数字PCR(droplet digital PCR，dd PCR)克服了qPCR技术的一些不足，是一种能够实现复杂来源样品中极低含量核酸分子稳定检出的一种基于qPCR的无须标准曲线的绝对定量技术。目前，ddPCR在医学临床诊断上的应用逐渐兴起,但在植物学研究、植物病害检验检疫方面的报道很少。
发明内容
本发明的目的是提供一种特异性好、灵敏度高的可以准确定量检测柑橘黄脉病毒的微滴数字PCR检测试剂盒及方法。
一种柑橘黄脉病毒微滴数字PCR定量检测试剂盒，包括总RNA提取试剂，引物CP7、CP8和CP9，T7体外转录试剂盒，QX200ddPCR EvaGreen supermix试剂盒，所述CP7、CP8、CP9引物序列为：
CP7：5′-TAATACGACTCACTATAGGGAGGCTATCGGGAAAGCTTGG-3′，
CP8：5′-AGGCTATCGGGAAAGCTTGG-3′，
CP9：5′-CGTTTCGTTCAACAACGGGG-3′。
一种柑橘黄脉病毒微滴数字PCR定量检测方法，利用上述的柑橘黄脉病毒微滴数字PCR定量检测试剂盒进行，包括如下步骤：
(1)取待测植株的叶片，抽提总RNA；
(2)以提取的总RNA为模板，用引物CP7和CP9扩增总RNA，扩增产物纯化后，用T7体外转录试剂盒转录合成cRNA，利用特异性引物CP9对cRNA标准品进行逆转录反应，获得cDNA；
(3)以步骤(2)制得的cDNA为模板，利用特异性引物CP8、CP9进行微滴数字ddPCR检测。
所述步骤(3)中微滴数字ddPCR检测的扩增条件为:95℃5min；95℃30s，58℃30s，40个循环；4℃5min；90℃5min；4℃90min；每秒降低2℃。
所述步骤(3)中ddPCR反应体系为：2μL反转录得到的模板cDNA、浓度均为200nmol/L的引物CP8/CP9各0.4μL、10μL 2×QX200ddPCR EvaGreensupermix、余量为ddH2O。
本发明的有益效果是：提供了CYVCV快速准确定量的检测新方法，避免了常规PCR和实时荧光PCR方法鉴定的不精确性，复杂性和较低灵敏度等缺陷，用于解决现有技术中对带有CYVCV植株的鉴定不精确、检测方法复杂和不能检测到极低含量如虫体中的病毒、感染早期的病毒等缺陷。建立的微滴式数字PCR方法灵敏度高、特异性强、能快速检测到极低含量的病毒，灵敏度比实时RT-PCR检测灵敏度高100倍，为病毒检测和定量提供了一种切实可行的方法可用于柑橘苗木的快速鉴定、预测预报、病害流行调查，早期CYVCV的检控等，争取从源头和传播途径上控制该病的传播和流行，从而保障柑橘产业的可持续发展和进出口贸易安全。
附图说明
图1为引物浓度的筛选结果图，其中，C01、C02、C04和C05分别表示引物终浓度为100、200、300、400nmol·L-1。
图2为CYVCV 7个温度梯度微滴式PCR的拷贝数图，其中，1-7分别表示退火温度为56.7℃、57.2℃、58.0℃、59.0℃、60.0℃、61.1℃、62.1℃.
图3为不同浓度cRNA的微滴式数字ddPCR扩增图谱，其中，D01-D06：9×1010～9×105copies·μL-1；D10:9×104copies·μL-1；D11：9×103copies·μL-1；D12：NTC水对照。
图4为不同浓度cRNA的实时荧光RT-PCR扩增曲线，其中，1～6：9×1011～9×106copies·μL-1。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
本发明的实验材料：
本实验所用分别感染柑橘衰退病、柑橘碎叶病、温州蜜柑萎缩病、裂皮病、鳞皮病、黄龙病和柑橘黄脉病相关病毒的植株样品来源于西南大学柑桔研究所脱毒中心保存毒源。
主要试剂及生产者：
RNAsin、Rtase(Takara公司，日本)
T7体外转录试剂盒(Thermo公司,美国)
2×QX200ddPCR EvaGreen supermix(伯乐公司，美国)
实施例1柑橘黄脉病毒微滴数字PCR定量检测方法
按照如下步骤操作：
1、提取待测样品总核酸
选取表现CYVCV典型症状的叶片和无病毒苗木的叶片各30-50mg分别作为正对照和负对照。将叶片样品于液氮中充分研磨，再加Trizol试剂1.0mL，并用力充分摇匀，室温条件下(15～30℃)静置5min，使核酸蛋白复合物充分分离，再加200mL氯仿，剧烈手摇15s，4℃放置10min分层。12500rpm，4℃离心5min；吸取上层水相650μL至新的离心管，加入等体积的水饱和酚：氯仿：异丙醇(25:24:1)(650μL)，剧烈摇匀15s，室温静置10min后，12500rpm，4℃离心5min；取上清500μL至新管，加入等体积氯仿：异戊醇(24:1)(500μL)，剧烈摇匀15s，4℃静置5min。12500rpm，4℃离心3min，上清转至新管；加等体积的异丙醇(400μL),颠倒混匀，-20℃放置1-2h，12500rpm，4℃离心10min，弃上清；用75％乙醇1mL洗涤沉淀2-3次；(多次颠倒EP管并短暂涡旋)7500rpm，4℃离心5min，弃上清，通风厨中干燥RNA沉淀3～5min；加入50μL DEPC水溶解RNA；充分溶解后-20℃或-80℃长久保存；
2、微滴数字PCR和微滴读取
根据Gen Bank中CYVCV(JX040635,1)保守的外壳蛋白基因为靶标，利用Oligo 7生物学软件设计特异性引物CP8和CP9。
微滴式数字PCR反应包括配制体系、生成微滴、扩增循环和信号读取4个步骤。
用分光光度计测定cRNA纯度和浓度，同时参考Fronhoffs等的方法计算获得的cRNA的拷贝数为9×1013copies·μL-1。取1μL抽提的RNA，用引物CP7(序列为：5′-TAATACGACTCACTATAGGGAGGCTATCGGGAAAGCTTGG-3′)和CP9(序列为：5′-CGTTTCGTTCAACAACGGGG-3′)扩增总RNA，扩增产物纯化后，通过T7体外转录试剂盒转录合成cRNA，制备标准品cRNA，取5μL cRNA模板，2μL 10mM dNTPs，5μL 5×RT-buffer，0.5μLRNAsin，0.5μL Rtase，0.5μL引物CP9混匀，ddH2O补至25μL，42℃20min；94℃1min；12℃pause；得到cDNA。ddPCR反应体系：取2μL反转录得到的模板cDNA，上、下游引物CP8(序列为：5′-AGGCTATCGGGAAAGCTTGG-3′)、CP9(序列见前述)分别取0.4μL，10μL 2×QX200ddPCREvaGreen supermix,ddH2O补至20μL然后进行ddPCR扩增。扩增条件确定为:95℃5min；95℃30s，58℃30s，40个循环；4℃5min；90℃5min；4℃90min；每秒降低2℃。
3、微滴数字PCR条件的优化
在进行ddPCR之前，采用QX200ddPCR EvaGreen supermix试剂盒推荐的20L体系，以相同浓度的阳性质粒为模板，分别对引物终浓度(100～500nmol·L-1)、退火温度(54～62℃)进行优化。
1)引物浓度的优化
ddPCR反应条件优化分别选用100、200、300、400nmol·L-1的CP8和CP9的引物终浓度。采用矩阵法检测筛选引物的最佳反应浓度，且在200nmol·L-1的引物终浓度是事件数最多。结果表明，200nmol·L-1的引物终浓度(见图1)为最佳浓度。因此确定200nmol·L-1为该体系的引物终浓度。
2)退火温度的优化
微滴式dd PCR的退火温度是最重要的参数，对于反应的特异性有重要影响，退火温度太低可能引起非特异性扩增，退火温度过高会降低反应的灵敏度。退火温度范围：56.7℃～62.1℃，在EppendorfPCR上设置温度梯度，梯度设置为56.7℃、57.2℃、58.0℃、59.0℃、60.0℃、61.1℃、62.1℃共7个梯度。结果表明，58.0℃时检测样品的拷贝数和事件数最高(见图2)，因此确定该体系的退火温度为58.0℃。最佳循环条件：95℃5min；95℃30s，58.0℃30s，40个循环；4℃5min；90℃5min；4℃，90min；每秒降低2℃。
4、微滴式数字PCR方法检测CYVCV的灵敏度和特异性实验
以10倍梯度稀释获得的9×103～9×1011copies·μL-1拷贝cRNA为模板分别进行微滴式数字ddPCR和实时荧光RT-PCR检测发现，微滴式数字ddPCR能检测到9×104copies·μL-1拷贝的cRNA(见图3)，而实时荧光RT-PCR能检测到9×106copies·μL-1拷贝的cRNA(见图4)，表明ddPCR比实时RT-PCR检测灵敏度高100倍。此外，采用柑橘衰退病、柑橘碎叶病、温州蜜柑萎缩病、裂皮病、鳞皮病、黄龙病和柑橘黄脉病的毒株基因组RNA进行ddPCR验证，结果表明：除了CYVCV得到了特异性扩增,其它菌株的检测均为阴性，NTC中没有检测到阳性微滴，可见该体系中没有污染或非特异性扩增，表明建立的ddPCR方法特异性良好。
以上试验结果证明，本研究建立的微滴式数字PCR方法灵敏度高、特异性强、能快速检测到极低含量的病毒，为病毒检测和定量提供了一种切实可行的方法可用于柑橘苗木的快速鉴定、预测预报、病害流行调查，早期CYVCV的检控等，争取从源头和传播途径上控制该病的传播和流行，从而保障柑橘产业的健康发展和进出口贸易安全。因此，本发明建立了CYVCV快速准确定量的检测新方法。

Claims (4)

1.一种柑橘黄脉病毒微滴数字PCR定量检测试剂盒，其特征在于：包括总RNA提取试剂，引物CP7、CP8和CP9，T7体外转录试剂盒，QX200 ddPCR EvaGreen supermix试剂盒，所述CP7、CP8、CP9引物序列为：
CP7：5′-TAATACGACTCACTATAGGGAGGCTATCGGGAAAGCTTGG-3′，
CP8：5′-AGGCTATCGGGAAAGCTTGG-3′，
CP9：5′-CGTTTCGTTCAACAACGGGG-3′。
2.一种柑橘黄脉病毒微滴数字PCR定量检测方法，其特征在于：利用权利要求1所述的检测试剂盒进行，包括如下步骤：
(1)取待测植株的叶片，抽提总RNA；
(2)以提取的总RNA为模板，用引物CP7和CP9扩增总RNA，扩增产物纯化后，用T7体外转录试剂盒转录合成cRNA，利用特异性引物CP9对cRNA标准品进行逆转录反应，获得cDNA；
(3)以步骤(2)制得的cDNA为模板，利用特异性引物CP8、CP9进行微滴数字ddPCR检测。
3.如权利要求2所述的柑橘黄脉病毒微滴数字PCR定量检测方法，其特征在于：所述步骤(3)中微滴数字ddPCR检测的扩增条件为:95℃5min；95℃30s，58℃30s，40个循环；4℃5min；90℃5min；4℃90min；每秒降低2℃。
4.如权利要求2或3所述的柑橘黄脉病毒微滴数字PCR定量检测方法，其特征在于：所述步骤(3)中ddPCR反应体系为：2μL反转录得到的模板cDNA、浓度均为200nmol·L-1的引物CP8/CP9各0.4μL、10μL 2×QX200 ddPCR EvaGreen supermix、余量为ddH2O。
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