CN113584194A - 一种检测青枯菌混合菌群复合侵染的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种检测青枯菌混合菌群复合侵染的方法，以及用于检测青枯菌混合菌群复合侵染的青枯菌基因RSp1073的引物对，所述引物对的序列如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示。该方法包括参考菌株和样本菌株的DNA提取，目标基因的PCR扩增，以及测序和序列比对、分析等具体步骤。该方法可用于检测或研究多个序列变种、多个菌株共存的复合侵染状况，为后续分析单个感病植株中不同菌株的复合侵染情况提供方法，为进一步解析青枯菌的自然发生规律提供一定基础。还可以用于烟草青枯菌混合菌群中各菌株的数量鉴定，判断感染植株中青枯菌优势菌。为植株防治青枯菌尤其是用微生物菌剂防治青枯菌有重要关键作用。

Description

一种检测青枯菌混合菌群复合侵染的方法

技术领域

本发明属于分子生物技术领域，涉及一种检测青枯菌混合菌群复合侵染的方法，还涉及用于该方法的引物对。

背景技术

青枯菌(Ralstonia solanacearum)是世界十大植物病原细菌之一，因其寄主范围大、分布范围广且具有丰富的遗传多样性而被认为是一个多变的复合种。目前有三种分类方法被广泛运用于青枯菌的分类中，包括早期的生理小种(Race)和生化变种(Biovar)，以及近年随着分子生物学技术的广泛应用被提出的演化型分类框架。Fegan和Prior于2005年在第三届青枯病国际会议上共同提出演化型分类框架(Phylotype classificationshemes)，该分类框架将青枯菌划分为种(Species)、演化型(Phylotype)、序列变种(Sequevar)以及克隆(Clone)四种不同水平的分类单元。演化型分类框架反应了青枯菌的种内遗传多样性与地理起源的密切关系：演化型Ⅰ即来自亚洲的菌株；演化型Ⅱ(包括演化型IIA和演化型IIB)即美洲菌株；演化型Ⅲ即来自非洲及其周边岛国的菌株；演化型Ⅳ即来自亚洲其他国家如印度尼西亚、澳大利亚等的菌株，及与青枯菌相近的R.syzygii和香蕉血液病细菌(Banana blood disease bacterium，BDB)。演化型之下依据内切葡聚糖酶基因(egl)的部分序列、hrpB基因等的系统发育分析又进一步分为不同的序列变种。青枯菌种具有丰富的多样性，在同一田块中有可能存在多个序列变种或者克隆菌株的情况，或是存在多个菌株的复合侵染。青枯菌基因型多样，适应性强，寄主范围广，病原菌菌株致病性差异明显，从而影响植物抗病品种的选育、种植年限等，以环境友好的微生物菌剂防治植物青枯病也是近些年植物病害研究的热点之一，但其防效不稳定，而植物青枯病菌的多样性是影响微生物菌剂防病效果的重要因素之一。

目前关于青枯菌的鉴定方法很多，对种的鉴定可以采用16S序列分析鉴定以及青枯菌种特异性引物对(759和760)；青枯菌种以下的菌株鉴定包括通过菌株对乳糖、麦芽糖、纤维二糖和甘露醇、山梨醇、甜醇的利用能力来鉴定生化变种的方法，采用演化型特异性复合PCR鉴定演化型的方法，利用egl基因部分序列进行系统发育分析来鉴定序列变种的方法。但是这一系列的方法均是对单一克隆的菌株进行鉴定，无法对被多种青枯菌株感染的鉴定。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种青枯菌基因RSp1073的引物对，由该引物对扩增出来的产物条带单一，引物特异性好。还提供一种检测青枯菌混合菌群复合侵染的方法。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

1.一种青枯菌基因RSp1073的引物对，所述引物对的正向引物序列如SEQ ID No.1所示，反向引物序列如SEQ ID No.2所示。

2.青枯菌基因RSp1073的引物对在检测青枯菌混合菌群复合侵染中的应用，所述引物对的正向引物序列如SEQ ID No.1所示，反向引物序列如SEQ ID No.2所示。

3.一种检测青枯菌混合菌群复合侵染的方法，包括以下步骤：

(1)、提取作为参考菌株的青枯菌DNA，菌株数量为大于1的整数；

(2)、提取待检测菌株样本DNA；

(3)、分别以提取的DNA为模版，利用权利要求1所述的引物对目标基因RSp1073进行PCR扩增；

(4)、以参考菌株的青枯菌DNA为模板得到的PCR产物，建立基因文库，为参考序列；

(5)、以待检测菌株样本DNA为模板得到的PCR产物，产物回收后测序，得到的序列和步骤(4)的参考序列进行比对，最后根据菌株测定数量来判断待检测菌株中多种青枯菌混合状态。

进一步，步骤(3)PCR扩增后还包括用凝胶电泳检测扩增产物。

进一步，凝胶电泳检测扩增产物是否扩增为单一条带，如为单一条带可用于后续检测步骤。

进一步，PCR扩增的反应体系：5×FastPfu Buffer 4μl，2.5mM dNTPs 2μl，Forward Primer(5μM)0.8μl，Reverse Primer(5μM)0.8μl，FastPfu Polymerase 0.4μl，BSA 0.2μl，Template DNA 10ng，补ddH₂O至20μl。

进一步，引物浓度为5μM。

进一步，PCR扩增步骤为：95℃预变性3min，95℃预变性30s；58℃退火30s；72℃延伸45s，30个循环；最后72℃延伸10min。

进一步，步骤(5)待测样本序列和参考序列比对时用Geneious软件进行比对。

进一步，步骤(5)比对步骤如下：

①选取参考菌株基因片段作为参考序列；

②测序得到的优化拼接后的有效序列；

③选择优化拼接后的有效序列进行组装，选择“de novo assemble”；

④与参考序列进行比对，选择"map to reference"，最后得到分析结果。

进一步，所述的参考菌株的基因RSp1073序列如SEQ ID No.4-SEQ ID No.11所示。

本发明的有益效果在于：本发明通过大量分析和筛选全国107株烟草青枯菌基因组的基础上，筛选出多个具有单核苷酸多态性差异的基因，再继续通过实验筛选并最终锁定到了一个具有丰富多态性的基因片段，基于该基因片段的可变序列片段，设计并验证了针对该靶基因的引物对和一套检测方法，用于检测或研究多个序列变种、多个菌株共存的复合侵染状况，为后续分析单个感病植株中不同菌株的复合侵染情况提供方法，为进一步解析青枯菌的自然发生规律提供一定基础。本发明提供的检测方法，不仅可以判断多种菌株中不同菌株的种类，还可以用于烟草青枯菌混合菌群中各菌株的数量鉴定，可用于评价混合菌群的比例情况。进一步以该方法分析混合菌群复合侵染情况时，可进一步研究青枯菌复合群体接种烟草后，各菌株进行随机侵染，哪种青枯菌菌株可以先进入烟株体内的会迅速繁殖占领生态位成为优势菌群。进一步为植株防治青枯菌尤其是用微生物菌剂防治青枯菌有重要关键作用，具有较大的经济价值。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：

图1为实施例的实验设计步骤图；

图2为混合菌株样品(M1、M2、M3、M4)的DNA进行PCR扩增凝胶电泳结果图；

图3为接菌株后发病烟株中菌株样品DNA的PCR扩增凝胶电泳结果图；

图4为数据分析中实施例选取的8个菌株为基因片段作为参考序列示意图；

图5为数据分析中实施例M1样品序列测得的原始有效序列的序列示意图；

图6为数据分析中实施例M1样品序列组装操作示意图；

图7为数据分析中实施例M1样品序列与参考序列进行比对的参数设置操作示意图。

具体实施方式

下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1

1.基因筛选、引物设计及测序

本研究团队(西南大学天然产物农药研究室)于2013到2016年从全国各个植烟区采集并分离了代表青枯菌，建立了全国青枯菌菌种库，并选取了各个地区代表菌株107株，进行了其基因组测序。目前所有菌株均保存于本研究室。

通过前期的基因组分析，在107株菌株中，我们发现了多个在菌株间存在大量单核苷酸多态性的基因(部分大量单核苷酸多态性的基因见表1)，并通过大量前期实验筛选并最终锁定到基因编号OG11798的片段进行后续实验(注释结果为hemagglutinin-relatedprotein，比对NCBI上的R.solanacearum GMI1000菌株的基因RSp1073，RSp1073的序列如SEQ ID No.3所示，该基因对于后续研究烟草青枯菌菌株复合侵染或者研究不同的青枯菌复合侵染烟株时，容易成为优势菌株具有重要意义。本研究团队基于该基因的可变片段，设计了一系列引物，并从中筛选出一对引物可用于检测青枯菌混合菌群复合侵染，引物序列如表2所示。

表1部分大量单核苷酸多态性的基因

表2基因OG11798可变片段的引物序列

实施例2

提取样品DNA，合成带有barcode的引物OG-F2和OG-R2，并进行PCR扩增，PCR扩增使用TransGen AP221-02：TransStart Fastpfu DNA Polymerase，20μl PCR反应体系：5×FastPfu Buffer 4μl，2.5mM dNTPs 2μl，Forward Primer(5μM)0.8μl，Reverse Primer(5μM)0.8μl，FastPfu Polymerase 0.4μl，BSA 0.2μl，Template DNA 10ng，补ddH₂O至20μl。

PCR仪：ABI

9700型

PCR反应参数：

a.1×(95℃3min)

b.30个循环×(95℃30s；58℃30s；72℃45s)

c.72℃10min。

PCR扩增后，使用2％琼脂糖凝胶回收PCR产物，利用AxyPrep DNA Gel ExtractionKit(Axygen Biosciences,Union City,CA,USA)进行回收产物纯化，2％琼脂糖凝胶电泳检测，并用Quantus^TMFluorometer(Promega,USA)对回收产物进行检测定量。使用NEXTflexTMRapid DNA-Seq Kit(Bioo Scientific，美国)进行建库:(1)接头链接；(2)使用磁珠筛选去除接头自连片段；(3)利用PCR扩增进行文库模板的富集；(4)磁珠回收PCR产物得到最终的文库。利用Illumina公司的Miseq PE300平台进行测序(上海美吉生物医药科技有限公司)。

使用fastp(https://github.com/OpenGene/fastp，version 0.20.0)软件对原始测序序列进行质控，使用FLASH(http://www.cbcb.umd.edu/software/flash，version1.2.7)软件进行拼接：(1)过滤reads尾部质量值20以下的碱基，设置50bp的窗口，如果窗口内的平均质量值低于20，从窗口开始截去后端碱基，过滤质控后50bp以下的reads，去除含N碱基的reads；(2)根据PE reads之间的overlap关系，将成对reads拼接(merge)成一条序列，最小overlap长度为10bp；(3)拼接序列的overlap区允许的最大错配比率为0.2，筛选不符合序列；(4)根据序列首尾两端的barcode和引物区分样品，并调整序列方向，barcode允许的错配数为0，最大引物错配数为2。

以建立的基因片段文库为参考序列，利用Geneious软件对每个待检测样品经过优化、拼接后的有效序列进行分析，最后根据分析结果区分所有混合青枯菌菌株。

实施例3

混合菌群的比例鉴定以及复合侵染实验设计

随机选取8株OG11798基因序列存在差异的菌株，菌株信息如表3所示，SEQ IDNo.4-SEQ ID No.11所示基因序列分别为各菌株的基因片段信息。

表3实验用菌株

实验设计如图1所示，先将8株菌株活化后进行扩大培养至对数期(OD600nm≈1.0)，然后将各菌株进行稀释至OD600nm＝0.1(此步骤是为了尽量保证各个菌株的量是一致的)，再等比例混合各菌株稀释液(每个菌株5mL)，共设置4个重复，分别标记为M1、M2、M3、M4。然后将混合菌液分为两部分，一部分取10mL提取混合菌液DNA，作为接菌前的样品，收集菌饼并提取混合DNA，DNA提取采用细菌基因组DNA提取试剂盒(天根，DP302)进行，然后再按照实施例2中所述方法进行PCR扩增，采用二代MySeq illumina测序方法进行测序，依据分析后的测序结果判断混合菌株中各菌株情况。

混合菌液另一部分30mL分别各接种3株烟草，每株烟草10mL，待植株刚表现青枯病症状时，截取烟草茎部组织，将茎部组织用灭菌的小刀横剖开浸泡到无菌水中以收集茎秆组织中的青枯菌菌株，然后提取无菌水中收集细菌的DNA样品(天根，DP302提取)，作为接种后侵染烟株的样品。然后再按照实施例2中所述方法进行PCR扩增，采用二代MySeqillumina测序方法进行测序，利用Geneious软件，依据分析后的测序结果判断混合菌株中各菌株情况。

实验结果

1.引物的特异性

分别对混合菌株样品(M1、M2、M3、M4)的DNA进行PCR扩增，结果如图2所示，由结果可知，该引物对可以扩增出单一条带，可用于后续实验。接菌株后发病烟株中菌株样品DNA的PCR扩增结果如图3所示，其中1-1和1-2为混合M1菌液接菌发病烟株采集的1号样品，2-1和2-2为混合M2菌液接菌发病烟株采集的2号样品，3和4分别为M3菌液和M4菌液接菌发病烟株采集的3号和4号样品，同样该引物对可以扩增出单一条带，可用于后续实验。

Geneious软件分析过程：

①选取参考菌株基因片段作为参考序列，图4为本实施例选取的8个菌株为基因片段作为参考序列；

②测序得到的优化拼接后的有效序列；图5为本实施例M1样品序列测得的原始有效序列的序列示意图；

③选择优化拼接后的有效序列进行组装，选择“de novo assemble”；图6为本实施例M1样品序列组装操作示意图；

④与参考序列进行比对，选择"map to reference"，最后得到分析结果。图7为本实施例M1样品序列与参考序列进行比对的参数设置操作示意图。

图4-图7只是示意图，也可以根据Geneious软件厂家说明进行相关设置操作。

2.混合菌群的比例鉴定以及复合侵染实验结果分析

混合后菌群样品提取DNA并进行OG11798基因片段扩增后，各菌株OG11798基因片段数量检测结果如表4所示，表中每个Reads相当于测序基因数目，由该结果可知，混合菌群中各菌株比例相差不大，均在1*10³数量级左右浮动。考虑排除菌液混合误差、基因组提取损失情况、扩增倍数差异等因素后，该方法可用于评价混合菌群的比例情况。

表4实验菌株混合后各菌株的数量测定结果

注：Reads表示测序基因数目。

对混合菌群复合侵染烟草进行的PCR检测实验结果如表5所示，由结果可知，4个重复中，从发病初期烟株中收集的青枯菌优势菌株存在差异：M1样品中R537菌株为主要侵染菌株；M2样品中R603菌株为主要侵染菌株；M3样品中R574菌株在侵染群体中占主导地位，其次还存在R552菌株和R566菌株的同时侵染；M4样品中R632菌株和R574菌株数量相当，可能为同时侵染。由此说明，青枯菌复合群体接种烟草后，各菌株进行随机侵染，先进入烟株体内的菌株会迅速繁殖占领生态位成为优势菌群。

表5混合菌群接种烟苗后发病烟株茎秆内各菌株的数量测定结果

本发明基于107株烟草全国青枯菌菌株的基因组分析结果，筛选到一个存在大量单核苷酸多态性的基因(为其编号OG11798)，用该基因的多态性片段设计了引物用于烟草青枯菌混合菌群中各菌株的数量鉴定以及复合侵染菌株鉴定。由结果可知，该方法可用于评价混合菌群的比例情况，并且，以该方法分析混合菌群复合侵染情况时，可进一步研究青枯菌复合群体接种烟草后，各菌株进行随机侵染，哪种青枯菌菌株可以先进入烟株体内的会迅速繁殖占领生态位成为优势菌群。本发明的检测方法区别于以往的鉴定方法如16SrRNA序列分析，不能区分所研究中具体某株菌株，一般只能鉴别到某“属”，少数可鉴定到“种”。而本发明测试的8株菌株均属于青枯菌这一“种”，其16S rRNA序列是一致的，青枯菌16S rRNA序列如SEQ ID No.12所示。

最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 西南大学

中国烟草总公司重庆市公司烟草科学研究所

<120> 一种检测青枯菌混合菌群复合侵染的方法

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gagcgcttcg acaacacg 18

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ctgttatcga tctggcccgt 20

<210> 3

<211> 9969

<212> DNA

<213> Ralstonia solanacearum

<400> 3

atgaacaagc acctctaccg gatcgtattc aacaagacgc gcggcctgct gatggcggtg 60

gcggagaacg tcgccggcga cggcaagcag accggcacca gcgatgcgcc gcgcgccggc 120

agcgtgctgg ccacggtgcg gccgctgtgc ttctcgatcc tgctggcgtt cgggctggtc 180

ggcagcctgg cgcaggcgca gatcgtggcg gaccccggcg cgccgcgcgg ccagcagccg 240

accgtgctca atgccgccaa cggcgtgccg ctggtcaaca tccagacgcc cagcgcgggc 300

ggcgtgtcgc gcaacaccta cggccagttc gacgtcaacc agcagggcgc cgttctcaac 360

aacgcccgca ccagtacgca gacgcagctc ggcggctggg tgcagggcaa cccgtggctg 420

gccgccggta cggcgcgggt gatcctgaac gaagtcaact cgagcaaccc gagccggctg 480

cggggctacg tggaagtcgc cggcgaccgc gcgcaggtgg tgatcgccaa cccggcaggc 540

atcagctgcg acggctgcgg cttcatcaac tccaaccgcg tcacgctgac gaccggcacg 600

ccgatcctca acggcggcaa cctcgacggc taccgcgtgc agaacggcac cgtcagcatc 660

acgggcggcg gcctggacac cagccgcgcg gactacaccg acatcatcgc gcgctcggtg 720

caggtcaatg ccggcatctg ggccaatacg ctcaaggtca gcgcgggcgc caacgaggtc 780

agcgccgacc atgcccagac caccgccatt gccgcgaccg gccccgcgcc gtcgtacggc 840

atcgacgtcg cgagcctggg cggcatgtac gcgggcaaga tcacgttggt cggcaccgag 900

gccggcgtgg gcgtgcgcaa tgccgggcag atcggcgcct cggccggcga cgtgaccgtc 960

accgccgacg gccggctgga gaacagcggt cgcatcacgg ccagcggcaa tgtgcatgcc 1020

gacaccaacg gtggcgtcac gaacgcgggc acggtctacg cacagggcga tacgcaactc 1080

gccacgcgcg gcaacgtcgt caataccggc gtgatcgcgg cgcagggcaa tacgacgctc 1140

gccgcaaccg gcgcggcgag cacgatcgac agccaggccg gctccgtgct tggcgcgggc 1200

ctgctcagtg acggcaccgt gagcggcagc ggcgcgctgc agctgtcggc gacggggcag 1260

ctccaggccc agggccagaa cttcgcgggg gcggacctga cggcgggcgc cgcgtcgatc 1320

agcctggccg acagccggac cgccgcgcgc aacatcacgc tgacggccag cggcggcgat 1380

ctcgatgcga gccgcgcgac gctctcggcg tcgcaggcct ggacggcgaa cgcggccggc 1440

acgctgcgca ccgacggcgc gaacgcatcg gccgatcggc tggcgctgac ggcgcacgat 1500

ctctccaacg cgcagggcca gctggtccag accggcgcat cggacctgtc gatccaactg 1560

cccggccagc tggacaacac cggcgggcgc atcgcgacca acagcgccaa cctgtcgctc 1620

ggcgcgcaaa cgctggtcaa caccggcggc cgcatcgagc atgcgggcac cggcacgctg 1680

gcgatgaacg tgggcaccct gagcggcgcg cgcggcgtca tcggcaccaa cggcgcgctg 1740

cagctgacgg cgcaatcggc cacgctcgac ggggggcaga cctcggccga cacgctgcag 1800

atccgtgccg gcacgctgtc gaaccggagc ggccagatca gccagaccgg cacgggcggc 1860

gcatcgatcc aggcaagcgc gtcgctcgac aacaccggtg gcctcatcac ggccaacggc 1920

ccgaacctca cgctcgaggc gccgacgctc gtcaacaccg acgggcgggt cgcgcatgcg 1980

ggcaccggca cgctggccat caccggcacg accgtcgatg gcgcgcgcgg cacgatctcg 2040

ggcaacggcg cgctgacgct gaacgcccag tccgtcacgc tcgatggcgg gcagaccacg 2100

gccggcaacc tgacgatcga cgcggccacg ctgtcgaacc gctcgggcca actgctgcag 2160

accggcacgg gcgcggcgtc cgtccaggcc accgagcgct tcgacaacac gggcggccgc 2220

ctggcgacga acggctcgga cctgacgctt ggcgcggcga cactcaccaa cgtggacggc 2280

cgcatcgagc acgcgggcac cggggcactg gccatcaccg ccacgaccct cgacggcgcg 2340

cgcggcacga tcgccagcaa tggcacgttg gcgctgcgcg cgcagacggc cacgctcgac 2400

ggcgcacaga ccacggccga gcgcctgcag gtcgatacgg cggtgctgtc caatcgatcg 2460

ggccagctgg tgcagaccgg tagcggcgcg gcgtcggtac gggccacgac gctgctcgac 2520

aacaccggcg gcacgctcgc gggcaacggc gacctggcca tcggggcggg gcgcctggtc 2580

aaccagggcg gcacgctgca ggcggccggc gcgtccggcc tggccatcgc ggcaacgggc 2640

cagatcgata acagcgccca gggcaagatc ggcgcgggcg gcgcggcgac gatcgcggcg 2700

gcctcgctgt cgaacgctgg cggcacgctc accgccggcg acgcgctgca agtgcaggcg 2760

agcggcgcgg tggacaacac gcaaggggtg ctggcggcca accgggacgt atcggtcaac 2820

gcggcatcgg tggccaacgc gggcggtcgc atcggctcgg tgcagggcag cacggccgtt 2880

gtggccagcc agggcggcgt cagcaacgcg ggcggccgcg tggaggccgc gcaggcgctg 2940

accctcagcg gcaacggcat cgccaatacc gatggcgtgg tggcgggcca ggacgtgcgg 3000

ctcgacagcc gggcgcaggc cttcgacaac acccgcggca ccgtggccgc gcgcggcctg 3060

ctggatgtgc agagcggcca gctcaccaac gacgccggca tgctgcaggc ggccggcgcg 3120

ctgacgatcg acacccacgg ccagacgctg ctcaacacgc attccggcac cacgggcggc 3180

attctcggcc aggacaaggt gacgctgcat agcggcaacc tggacaacag cgccggcttc 3240

atcggcgcga acggcgacct gagcgccacc gccgcgcaga tcaccaacgc gcagggcggc 3300

cagatcagcg gcgcgaaggc gatcgcgctc accagcacgg gtctggacaa ccggggcggc 3360

accatccagg cgatgggcaa cgtgacggcc gatgccggct cgggcgtggt cgacaacagc 3420

ggtagcctga tgcgctcggg cgccacgctc gacgtgcgcg ccgggtcggt gatcaacacc 3480

ggcacccagg gcgccaacca ggggctggag ggccagaacg ttgcactgac ggccgaccag 3540

atcagcaacc agggcggcgc catccgcgcg gacaaggcgc tgacgctgac cggctccggc 3600

gcgctcaaca acgcccaggg cctgatctcc tcggcccaga gcgtgcaggt gcaggaccgc 3660

aatccgggca gcaagacgca aagtgtcacc aacacgggcg gcacgctcat cgccggcaaa 3720

tcgctgggcg tggacagcgc cggcctgtcg ggcgatgggc gcatcctgtc gcaaggcgac 3780

ctgagcctga acctggccgg cgatttcacc aacaccggcg aactgcaggc caacggcaac 3840

gccaccgtga agaccagcgg cacgctgacc aaccagtcgg ggctgaaggc cgggaacacg 3900

ctcaccgtgt ccgcgggcaa catcgacaac accgccagcg gcgagatcag cgccggcacg 3960

accaacctca ccgccaccgg cacgctcacc aaccgggggc tgatcgacgg cggcaacacc 4020

aacatcgacg ccggcacgct caacaacctc ggcaccggcc gcatctatgg cgaccacgtg 4080

gcgatccagg cgggcaccgt caacaacgat gtcgagaacg gcacggcggc gaccatcgcc 4140

gcgcgcaacc ggctcgacct cggcgcgcag accctgaaca accgcgagca tgcgctgatc 4200

ttcagcggcg gcgacatggc gattggcggg gcgctggaca gcaaccgggt cgcgacgggc 4260

tcggccgcca cggtcaacaa caacagcgcg tcgatcgaat cgctcggcag cctggcgctg 4320

gcggccaacc ggatcaacaa caccaacgag cacttcagca cgggggtgca gtcgcagggc 4380

acgcagcaca tcgtcgagta ccagggcgac ggggcggcca accgctacaa gccgggggac 4440

cctgacgtct acatctacaa cgacgagtcg gaccacctgc acacgcccga gggcaactac 4500

gagagctggc acaagtacga gtacgaccgc tcgaccagcg cgaccgtcat caccggctcc 4560

gaccccggca agatcacctc ggccggcgcg atgcggatcg acgcggggac gctgttcaac 4620

gacaagagcc agatcatcgc cggcggcacg ctgtcggcca atgtcggctc gctgcagaac 4680

accgaggtga cggggcagca gaccgtgacc gatgcgggca cggccacgtc ctactggcgc 4740

caccagaaga aggggcgcga cgacaccggc agcagcagca cggcctacaa cccgcccgac 4800

gcgatcagcg acatccggct cacgcccacc gtctacaagg acaacaccgc gcccggcggc 4860

agcgggaccc aggtcggcac cctgacggtg ggaagcgtga cgcagggggc gcaaagcgcg 4920

gcggtggcca gcgtatccat cggcgcgggc cggaccgtgg gcgccgtgac gcaggggatg 4980

cagggcatcg gcagcgtcgg cggcgggcgg acggtgagcg ccatcacgga agtggcggcc 5040

gtcacgccgg ccgcgggcgg ccagtcgctg gtggtgcgca cgggcggggt caacaccacg 5100

ctgcccaaca acagcctgtt ccgcctgaac ccaaacccgg ggggcagcta cctggtcgag 5160

acggacccgc gcttcgcaag ctaccgcacg tggctgtcgt cggacaccat gctgacgcag 5220

ctgagcgtcg atccggccct gacgcagaag cgcctggggg atggcttcta cgagcagaag 5280

ctggtgcgcg agcaggtggc gcagctgacg ggtcggcgct tcctggatgg ctattcgagc 5340

gatgaggcgc aataccgcgc gctgatcgac aacggcgtca cctatgccaa ggcgtggggc 5400

ctgcgtccgg gcgtggcgct gacggccgcg cagatggcgc agctgaccag cgacatcgtc 5460

tggctggtcg agcaggaggt gacgctgccc aacggccaga ccacgcgcgc gctggtgccg 5520

caggtgtacg tgcacgtgaa gccgggcgac ctggacggct cgggcgcgct gatcgcgggg 5580

cagagcgtga gcctgaacgt gtcgggcgac ctggtgaacc agggcagcat cgccgggcgc 5640

gacgtggtgt cgatcacggc ggagaacgtg aagaacctgg gcggtcgcat cacgggcggc 5700

gacgtggcgg tgcgcgcgcg caccgacctc gacaacctgg gcggcatcat cgatgccaac 5760

aacagcctga gcgcgatggc cgggcgcgac ctgaacgttg ccagcaccac gcgcagcaac 5820

agcaacgcgc agggcagcat cacgaacgtc agccgcattg cgggcctgta tgtgacggcg 5880

ccctcgggcg gcacgctggt ggcgtccgcg gggcgcgacc tgacgctgtc cggcgcgcag 5940

atcggcaacg cgagcacggg cggccagacc gtggtggccg cggcgcggga cctgaacctg 6000

ggcacggtcg gcacgtcgag cgcgcagtcg ctggcgtggg acagcaagaa ctggcgcaag 6060

gacagcacgc ggcaggaggt cggctcatcg atccagacca atggtgactt gcgcctgtcg 6120

gcgggcaacg acctgaacgc gcggggcgcc tcggtgacga gcgagcaggg cgcgctggtg 6180

gcgacggcgg gcaacaacgt caacctgggc gcggcgcaga ccacgcgcga ggtggacgag 6240

gcgcaccagt tcaagggcag cagcagctgg ttctcgaaga agacgatcac gacgcgcaac 6300

acgctgtcgg agaccacgac gcagggcacg acgttctcgg gcaatacgac gtacgtgcag 6360

gcgggcaacg acatcaacgt gaagggcagc aacgtggtgt cgaccgatgg gacgacgctg 6420

atcgccaagc acgacgtcaa cattgatgcg gcgaccaatt cgactaccga gcggcatttc 6480

cgtgaggaga agaagtcggg gctgttcagc tcgggcggca ttggcttcac gatcggcacg 6540

cagcagcaga gccaggacaa ccaggacgcg cgcaccacgg cggcggcgtc cacggtgggc 6600

tcgaccaacg gcaacgttgc catcggcgcg ggcaaccact accagcaggt gggcagcaac 6660

gtggtagcgc cgcagggcga catcaccatc caggccaaga aggtcgacat cctggaagcg 6720

caggagacca gccacagcac gcaggagacg cagttcaagc aatcgggcct gacggtggcg 6780

gtgacggcgc cggtgatcgc ggcgatccag acggcgcagc agatgggccg tgcggcaggg 6840

cagacgtcgg acgggcggat gaaggtgctg gccggtgcga cgacggcatt ggctggcaag 6900

aacgcggcgg atgcggtggc ggccgatccg aagtcgggcg gcggggtgag catctcgatc 6960

acggtgggtg ggagcaagag ccagagcaag acgacgcagg acgcgacgca ggcggcgggc 7020

tcgcaggtgg cggcgggcgg caacgtcagc atccaggcca cgggcgcggg gcaggattcg 7080

acgctgacgg tgcagggcag cgacatcaag ggcggcggcg acgtgagcct gaaggccgat 7140

ggcgacatcg acctgctggc cgcgcgcaac gcgagcgaga tgcaccgctc aagcagcagc 7200

gtgagcggcg gggtaggcgt ggcggtgagc ctgggctcca acggcgcggc cttcggcgtg 7260

acggccaacg cgagcgcctc gcgcggcaag ggcgagggct cggacgtgag ctggaccaac 7320

acgcacgtat cggccggcaa cacgctgacg ctggaatcgg gcggcaacac gaacctgaag 7380

ggcgcggtcg ccagcggcaa gcaggtggtg gccaacgtgg gcggcgacct gaacatcgaa 7440

agcctgcagg acacgagcac gtaccacacc aaggatcagt cgatcggcgg tagcgtgacg 7500

gtgggctttg gcttctcggg cagcgccaac ttcagccagc agaagatcga cagcgatttc 7560

gccagcgtga cggagcagtc gggcatcaag gcgggcgatc ggggcttcca ggtcaacgtg 7620

cacggcaaca ccgacctgaa gggcgcggtg atcgccagca cagacaaggc ggtgcaggac 7680

ggggtcaaca gcctgacgac ggcgacgctg acgcagagcg agattcacaa ccgggcggag 7740

tacagcgcga gcagcatcgg catcggcggg ggctacagct acggtggcgg cggcatgatg 7800

ccggtcggtg gcggcaacgg tggcggtggc aacaccacgg ccggtggcgt gggcaccaac 7860

cagcagggcc aggccacaac gggcggcgac aaggtgccgg gcagcaacgt gccgaccagc 7920

ggcaactgga gcgccacgcc cccggtcgtg atgggcgcgt cgggcagcgg cagcagcgtg 7980

acgggcagcg gcatcagcgg cggcgcgatc cacatcacgg acgacgcgaa acagcaggcg 8040

ctgacgggca aggacggcga gcagacggtg gcgagcgtca accggaacgt cagcaccgag 8100

cgggatagca gcaatgcgct caagccgatc tttaatgaga gggagattca ggcggggttc 8160

gagatcaccg gtgccttcct gcgtgaagcc ggcaccttca tcggcaaccg cgccaaggag 8220

gcgcaggaca aggaacgcct cgccaaggac ccgaaggcca agaaccccga cggcacgccg 8280

gttaccgacg agcagcgcgt gcaatatgcc aaggaagccc aggagctgaa agacacctgg 8340

ggcccgggcg gcacgtaccg gcagatcgcg acggccctga tggccggcgc gggcggcaac 8400

gtgaccggcg gcatgggcaa cttcgtacag aacgcctccg tggcctatct gcaggagctt 8460

ggcgcgaacc aggtcaagca gatcgcggat gcgctggaca gtgacacggc ccgtgcggca 8520

ctgcatgccg tagtgggctg cgcgggcgcg gccgcctcca gccagtcgtg cgcgtccggt 8580

gctctgggcg cggcgggcgg cagcatcatc aacaacctgc tggatcagat caacaaggac 8640

aagctgaccc cggaagagaa ggaagcgcgc tcgaatctgg tcagcagcct gatcgccggg 8700

atcacggcgg ccgcgggggg caatgccgtg accgcgacca atgcggcacg gatcgagacc 8760

gagaacaacc ggttggcgac ttcggcggag gtgaagcgga ttcaccagct gtcccagggc 8820

gaccccagga aggaggcccg gctgacggcg gctgcctgtg cgctgcttca ctgcgagcgc 8880

gagtatccgg aaggcagcga agcgtacaac ttctacaagc ggctgtcgga cgcggggagc 8940

agccccgaac tggcacagga gcgtctgctg ctggaatcgc agaagggctt ccagatccgt 9000

ggggggctga gcgtggagcc gctattcctg tacaacctca tcagcgacaa cgtcgccgac 9060

gccgcgaagc gcgttgacaa cacctatcag ctcagcaccc gggcaatggg tggcttacag 9120

gcggcgggcg gcacggccac cgcgatcgca ggcggcacga ttacagcggg cggcgcggcg 9180

tcttgcggcc cgaccgccgg ggcaggttgc cttgtcgcgg cgggtggcgt tgcgctgagc 9240

ttctgggggc tggatcaggc gaaggctggt gtttccacca tgatcagcgg ccagccgcag 9300

gccacggtgg gtggcattgt gttgcagcag gtctttggca tctcgccgca ggcggcggag 9360

ctgctgtatg gtgtggcggg cggtgtggct gggattgcgg cggatgcggc gctggcgcgg 9420

caggctgggg cggttgttgc caagagtggg gcggctgacg ccaccgcagc caacgggcaa 9480

cgcggcccga atctggggca atacaagggc gctgataccg cggctgacga gacgacattc 9540

ttcttgacgg aacgggagct gaaacccaag cagggtagct tgtctgggcc gccggaggct 9600

ccacccaaga atgctagtga cgagatggtt cgctccatca atcggcagaa tgaggctgct 9660

cagacgttgg cggaccatgg tctcgcggtc gagaatttgc ccaacaccgg gaagggtgtg 9720

gcaaatcctg atttgaagat taatggagcg attgctgatg tgtactcgcc aagaagcgga 9780

aatttgcaat ctatacgcga cactattgta gagaaatcaa ataagcaggc cccaaatatt 9840

gttgtgaatt tggtggattc acctttgtcg atctcggagg tgactcaata tcttcagagg 9900

aatcctgtgg gtaaggcaaa ttctgtgatt cttataaaga acgggaaagt tattgttttg 9960

ggaggataa 9969

<210> 4

<211> 461

<212> DNA

<213> Ralstonia solanacearum

<400> 4

gagcgcttcg acaacacggg cggccgcctg gcgacgaacg gctcggacct gacgcttggc 60

gcggcaacac tcaccaacgt ggacggccgc atcgagcacg cgggcactgg agcactggcc 120

atcaccgcca cgaccctcga cggcgcgcgc ggcacgatcg ccagcaacgg cacgctggcg 180

ctgcgcgcgc agacggccac gctcgacggc gcacagacca cggccgagcg cctgcaggtc 240

gatacggcgg tgctgtccaa tcgatcgggc cagctggtgc agaccggcgg cggcgcggcg 300

tcggtacggg ccacgacgct gctcgacaac accggcggca cgctcgcggg caacggcgac 360

ctggccatcg cggcggggcg cctggtcaac cagggcggca cgctgcaggc ggccggcgca 420

tccggcctgg ccatcgcggc gacgggccag atcgataaca g 461

<210> 5

<211> 461

<212> DNA

<213> Ralstonia solanacearum

<400> 5

gagcgcttcg acaacacggg cggccgcctg gcgacgaacg gctcggacct gacgctcggc 60

gcggcgacac tcaccaacgt ggacggccgc atcgagcacg cgggcaccgg ggcactggcc 120

attactgcta cgactctcga cggcgcgcgc ggcacgatcg ccagcaacgg cacgctggcg 180

ctgggcgcgc agacggccac gctcgacggc gcacagacca cggccgagcg cctgcaggtc 240

gatacggcgg tgctgtccaa tcgatcgggc cagctggtgc agaccggcag cggcgcggcg 300

tcggtgcggg ccacgacgct gctcgacaac accggcggca cgctggcggg caacggcgac 360

ctggccatcg cggcggggcg cctggtcaac cagggcggca cgctgcaggc ggccggcgca 420

tccggtctgg ccatcgcggc gacgggccag atcgataaca g 461

<210> 6

<211> 461

<212> DNA

<213> Ralstonia solanacearum

<400> 6

gagcgcttcg acaacacggg cggccgcctg gcgacgaacg gctcggacct gacgctcggc 60

gcggcaacac tcaccaacgt ggacggccgc atcgagcacg cgggcaccgg ggcactggcc 120

atcaccgcca cgaccctcga cggcgcgcgc ggcacgatcg ccagcaatgg cacgctggcg 180

ctgcgcgcgc agacggccac gctcgacggc gcacagacca cggccgagcg cctgcaggtc 240

gatacggcgg tgctgtccaa tcgatcgggc cagctggtgc agaccggcag cggcgcggcg 300

tcggtacggg ccacgacgct gctcgacaac accggcggca cgctcgcggg caacggcgac 360

ctggccatcg cggcggggcg cctggtcaac cagggcggca cgctgcaggc ggccggcgcg 420

tccggtctgg ccatcgcggc gacgggccag atcgataaca g 461

<210> 7

<211> 461

<212> DNA

<213> Ralstonia solanacearum

<400> 7

gagcgcttcg acaacacggg cggccgcctg gcgacgaacg gctcggacct gacgcttggc 60

gcggcgacac tcaccaacgt ggacggccgc atcgagcacg cgggcaccgg ggcactggcc 120

atcaccgcca cgaccctcga cggcgcgcgc ggcacgatcg ccagcaacgg cacgctggcg 180

ctgcgcgcgc agacggccac gctcgacggc gcacagacca cggccgagcg cctgcaggtc 240

gatacggcgg tgctgtccaa tcgatcgggc cagctggtgc agaccggcag cggcgcggcg 300

tcggtacggg ccacgacgct gctcgacaac accggcggca cgctcgcggg caacggcgac 360

ctggccatcg cggcggggcg cctggtcaac cagggcggca cgctgcaggc ggccggcgcg 420

tccggcctgg ccatcgcggc gacgggccag atcgacaaca g 461

<210> 8

<211> 461

<212> DNA

<213> Ralstonia solanacearum

<400> 8

gagcgcttcg acaacacggg cggccgcctg gcgacgaacg gctcggacct gacgcttggc 60

gcggcaacac tcaccaacgt ggacggccgc atcgagcacg cgggcaccgg ggcactggcc 120

atcaccgcca cgaccctcga cggcgcgcgc ggcacgatcg ccagcaatgg cacgctggcg 180

ctgcgcgcgc agacggccac gctcgacggc gcacagacca cggccgagcg cctgcaggtc 240

gatacggcgg tgctgtccaa tcgatcgggc cagctggtgc agaccggcgg cggcgcggcg 300

tcggtacggg ccacgacgct gctcgacaac accggcggca cgctcgcggg caacggcgac 360

ctggccatcg cggcggggcg cctggtcaac cagggcggca cgctgcaggc ggccggcgcg 420

tccggcctgg ccatcgcggc gacgggccag atcgataaca g 461

<210> 9

<211> 461

<212> DNA

<213> Ralstonia solanacearum

<400> 9

gagcgcttcg acaacacggg cggccgcctg gcgacgaacg gctcggacct gacgcttggc 60

gcggcaacac tcaccaacgt ggacggccgc atcgagcacg cgggcactgg agcactggcc 120

atcaccgcca cgaccctcga cggcgcgcgc ggcacgatcg ccagcaatgg cacgctggcg 180

ctgcgcgcgc agacggccac gctcgacggc gcacagacca cggccgagcg cctgcaggtc 240

gatacggcgg tgctgtccaa tcgatcgggc cagctggtgc agaccggcgg cggcgcggcg 300

tcggtacggg ccacgacgct gctcgacaac accggcggca cgctcgcggg caacggcgac 360

ctggccatcg cggcggggcg cctggtcaac cagggcggca cgctgcaggc ggccggcgcg 420

tccggcctgg ccatcgcggc gacgggccag atcgataaca g 461

<210> 10

<211> 461

<212> DNA

<213> Ralstonia solanacearum

<400> 10

gagcgcttcg acaacacggg cggccgcctg gcgacgaacg gctcggacct gacgctcggc 60

gcggcaacac tcaccaacgt ggacggccgc atcgagcacg cgggcaccgg ggcactggcc 120

atcaccgcca cgaccctcga cggcgcgcgc ggcacgatcg ccggcaacgg cacgctggcg 180

ctgcgcgcgc agatggccac gctcgacggc gcacagacca cggccgagcg cctgcaggtc 240

gatacggcgg tgctgtccaa tcgatcgggc cagctggtgc agaccggcag cggcgcggcg 300

tcggtacggg ccacgacgct gctcgacaac accggcggca cgctcgcggg caacggcgac 360

ctggccatcg cggcggggcg cctggtcaac cagggcggca cgctgcaggc ggccggcgcg 420

tccggcctgg ccatcgcggc gacgggccag atcgataaca g 461

<210> 11

<211> 461

<212> DNA

<213> Ralstonia solanacearum

<400> 11

gagcgcttcg acaacacggg cggccgcctg gcgacgaacg gctcggacct gacgcttggc 60

gcggcgacac tcaccaacgt ggacggccgc atcgagcacg cgggcaccgg ggcactggcc 120

atcaccgcca cgaccctcga cggcgcgcgc ggcacgatcg ccagcaacgg cacgctggcg 180

ctgcgcgcgc agacggccac gctcgacggc gcacagacca cggccgagcg cctgcaggtc 240

gatacggcgg tgctgtccaa tcgatcgggc cagctggtgc agaccggcag cggcgcggcg 300

tcggtacggg ccacgacgct gctcgacaac accggcggca cgctcgcggg caacggcgac 360

ctggccatcg cggcggggcg cctggtcaac cagggcggca cgctgcaggc ggccggcgcg 420

tccggcctgg ccatcgcggc gacgggccag atcgataaca g 461

<210> 12

<211> 1536

<212> DNA

<213> Ralstonia solanacearum

<400> 12

gaactgaaga gtttgatcct ggctcagatt gaacgctggc ggcatgcctt acacatgcaa 60

gtcgaacggc agcgggggta gcttgctacc tgccggcgag tggcgaacgg gtgagtaata 120

catcggaacg tgccctgtag tgggggataa ctagtcgaaa gactagctaa taccgcatac 180

gacctgaggg tgaaagtggg ggaccgcaag gcctcatgct ataggagcgg ccgatgtctg 240

attagctagt tggtggggta aaggcccacc aaggcgacga tcagtagctg gtctgagagg 300

acgatcagcc acactgggac tgagacacgg cccagactcc tacgggaggc agcagtgggg 360

aattttggac aatgggggca accctgatcc agcaatgccg cgtgtgtgaa gaaggccttc 420

gggttgtaaa gcacttttgt ccggaaagaa atcgcactgg ttaatacctg gtgtggatga 480

cggtaccgga agaataagga ccggctaact acgtgccagc agccgcggta atacgtaggg 540

tccaagcgtt aatcggaatt actgggcgta aagcgtgcgc aggcggttgt gcaagaccga 600

tgtgaaatcc ccgggcttaa cctgggaatt gcattggtga ctgcacggct agagtgtgtc 660

agagggaggt agaattccac gtgtagcagt gaaatgcgta gagatgtgga ggaataccga 720

tggcgaaggc agcctcctgg gataacactg acgctcatgc acgaaagcgt ggggagcaaa 780

caggattaga taccctggta gtccacgccc taaacgatgt caactagttg ttggggattc 840

atttccttag taacgtagct aacgcgtgaa gttgaccgcc tggggagtac ggtcgcaaga 900

ttaaaactca aaggaattga cggggacccg cacaagcggt ggatgatgtg gattaattcg 960

atgcaacgcg aaaaacctta cctacccttg acatgccact aacgaagcag agatgcatta 1020

ggtgctcgaa agagaaagtg gacacaggtg ctgcatggct gtcgtcagct cgtgtcgtga 1080

gatgttgggt taagtcccgc aacgagcgca acccttgtct ctagttgcta cgaaagggca 1140

ctctagagag actgccggtg acaaaccgga ggaaggtggg gatgacgtca agtcctcatg 1200

gcccttatgg gtagggcttc acacgtcata caatggtgca tacagagggt tgccaagccg 1260

cgaggtggag ctaatcccag aaaatgcatc gtagtccgga tcgtagtctg caactcgact 1320

acgtgaagct ggaatcgcta gtaatcgcgg atcagcatgc cgcggtgaat acgttcccgg 1380

gtcttgtaca caccgcccgt cacaccatgg gagtgggctt taccagaagt agttagccta 1440

accgcaagga gggcgattac cacggtaggg ttcatgactg gggtgaagtc gtaacaaggt 1500

agccgtatcg gaaggtgcgg ctggatcacc tccttt 1536

Claims (10)

1.一种青枯菌基因RSp1073的引物对，其特征在于，所述引物对的正向引物序列如SEQID No.1所示，反向引物序列如SEQ ID No.2所示。

2.权利要求1所述的青枯菌基因RSp1073的引物对在检测青枯菌混合菌群复合侵染中的应用。

3.一种检测青枯菌混合菌群复合侵染的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)、提取作为参考菌株的青枯菌DNA，菌株数量为大于1的整数；

(2)、提取待检测菌株样本DNA；

(3)、分别以提取的DNA为模版，利用权利要求1所述的引物对目标基因RSp1073进行PCR扩增；

(4)、以参考菌株的青枯菌DNA为模板得到的PCR产物，建立基因文库，为参考序列；

(5)、以待检测菌株样本DNA为模板得到的PCR产物，产物回收后测序，得到的序列和步骤(4)的参考序列进行比对，最后根据菌株测定数量来判断待检测菌株中多种青枯菌混合状态。

4.根据权利要求3所述的检测青枯菌混合菌群复合侵染的方法，其特征在于，步骤(3)PCR扩增后还包括用凝胶电泳检测扩增产物。

5.根据权利要求3所述的检测青枯菌混合菌群复合侵染的方法，其特征在于，PCR扩增的反应体系：5×FastPfu Buffer 4μl，2.5mM dNTPs 2μl，Forward Primer 0.8μl，ReversePrimer 0.8μl，FastPfu Polymerase 0.4μl，BSA 0.2μl，Template DNA 10ng，补ddH₂O至20μl。

6.根据权利要求3所述的检测青枯菌混合菌群复合侵染的方法，其特征在于，引物浓度为5μM。

7.根据权利要求3所述的检测青枯菌混合菌群复合侵染的方法，其特征在于，PCR扩增步骤为：95℃预变性3min，95℃预变性30s；58℃退火30s；72℃延伸45s，30个循环；最后72℃延伸10min。

8.根据权利要求3所述的检测青枯菌混合菌群复合侵染的方法，其特征在于，步骤(5)待测样本序列和参考序列比对时用Geneious软件进行比对。

9.根据权利要求8所述的检测青枯菌混合菌群复合侵染的方法，其特征在于，步骤(5)比对步骤如下：

①选取参考菌株基因片段作为参考序列；

②测序得到的优化拼接后的有效序列；

③选择优化拼接后的有效序列进行组装，选择“de novo assemble”；

④与参考序列进行比对，选择"map to reference"，最后得到分析结果。

10.根据权利要求3-9任一项所述的检测青枯菌混合菌群复合侵染的方法，其特征在于，所述的参考菌株的基因RSp1073序列如SEQ ID No.4-SEQ ID No.11所示。

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