CN102559938B

CN102559938B - Pcr结合核酸探针斑点杂交技术检测病料中i型马立克氏病病毒感染

Info

Publication number: CN102559938B
Application number: CN 201210081552
Authority: CN
Inventors: 崔治中
Original assignee: Shandong Agricultural University
Current assignee: Shandong Agricultural University
Priority date: 2010-04-09
Filing date: 2010-04-09
Publication date: 2013-09-11
Anticipated expiration: 2030-04-09
Also published as: CN102559938A

Abstract

本发明涉及一种PCR结合核酸探针斑点杂交检测病料中I型马立克氏病病毒感染的方法。本发明将疑是I型马立克氏病病毒感染的动物(已死亡动物)组织样品DNA用针对I型马立克氏病病毒的特异性引物PCR扩增后，对PCR产物再用该病毒特异性核酸探针做斑点杂交，不仅能显示PCR产物的特异性，也大大提高了检出率。本发明试验结果表明，PCR结合核酸探针斑点杂交技术检测病料中I型马立克氏病病毒感染，可显著提高病毒感染检测的灵敏度和特异性。

Description

PCR结合核酸探针斑点杂交技术检测病料中I型马立克氏病病毒感染

本申请是申请日为2010年04月09日、申请号为201010142266.1、发明创造名称为“PCR结合核酸探针斑点杂交技术检测病料中病毒感染”申请的分案申请。

技术领域

本发明涉及一种PCR结合核酸探针斑点杂交技术检测病料中I型马立克氏病病毒感染，属于兽医微生物学领域分子生物技术。

背景技术

目前，在规模化养禽业和养猪业，病毒的多重感染是普遍性的问题，也是临床发病的真正原因。但是，对多种病毒的病原学检测对养殖场来说是一个困难问题。这是因为，很难对多个个体的不同病料同时做不同病毒的分离培养。现代分子生物学技术PCR和核酸探针斑点分子杂交技术有助于解决这一问题。在一切条件完美时，PCR的灵敏度非常高。但在实际应用时，常常出现假阳性和假阴性问题。如，有时PCR产生的DNA条带虽染大小与预期的一样，但测序结果表明，却是一种无关核酸。此外，由于技术性原因，PCR的可重复性也较差，特别是其灵敏度的可重复性较差，常常PCR产物在电泳时看不到核酸条带。这是因为，PCR产物电泳时，如果加入的DNA量小于50pg，则很难看到条带。用特异性核酸探针做斑点分子杂交，其特异性较稳定，其检测灵敏度可达1pg的同源核酸。但如果病毒感染量小时，在1μg病料样品的总DNA中，特异性病毒的核酸可能不足1pg，因而也检测不出来。如过将PCR和斑点杂交结合起来，则既能确定PCR产物的特异性，也能提高PCR产物的检出灵敏度。但如果再结合斑点杂交，则只要1pg就可显现阳性了。而且，电泳显示的条带，并不代表是特异的。

发明内容

本发明的目的是为克服PCR在实际应用时，常常出现假阳性和假阴性问题；用特异性核酸探针做斑点分子杂交，但如果病毒感染量小时，在1μg病料样品的总DNA中，特异性病毒的核酸可能不足1pg，因而也检测不出来这些不足，而将PCR和斑点杂交结合起来，则既能确定PCR产物的特异性，也能提高PCR产物的检出灵敏度。但如果再结合斑点杂交，则只要1pg就可显现阳性了。先将疑是病毒感染的肉鸡样品DNA用针对可疑病毒的特异性引物PCR扩增后，再对PCR的产物用该病毒的特异性核酸探针做斑点杂交，不仅能显示PCR产物的特异性，也大大提高了检出率。

A发明的详细描述

1本发明主要步骤

(1)病料的收集及样品DNA的制备

取因患病引起不同临床表现的动物、病死动物的肝脏、脾脏、心脏、肾脏、胸腺、骨髓等。按常规方法提取组织DNA，溶解于适量TE缓冲液制备成为样品DNA。

(2)扩增样品中可疑病毒的特异性核酸片段

设计可疑病毒特异性引物(F2/R2)扩增出样品DNA可疑病毒特异性核酸片段(样品PCR扩增的片段大小长于探针)，如图1所示。用于扩增样品的引物(F2/R2)序列必须在探针标记用引物(F1/R1)序列之外，即被标记探针DNA序列之外；其扩增的产物长于标记探针DNA序列。

(3)地高辛PCR法标记病毒核酸探针制备及特异性及敏感性的测定

利用已知病毒基因组DNA克隆用于标记病毒核酸探针。设计引物(F1/R1)采用地高辛PCR法标记技术，进行地高辛标记制备探针，将纯化的病毒的特异性DNA片段作为标记DNA探针的模板，探针标记方法按以上试剂盒操作说明书进行。

(4)各样品及其相应PCR产物用标记的病毒核酸探针进行斑点杂交检测。

2本发明的具体描述(以鸡贫血病病毒为例)

(1)病料的收集及样品DNA的制备

取疑似鸡贫血病病毒(CAV)感染引起不同鸡群临床表现的鸡、死鸡的肝脏、脾脏、心脏、肾脏、胸腺、骨髓等。对组织样品，各取0.02g研磨，加入0.5mL DNA抽提缓冲液(100mmol/L NaCl，10mmol/L Tris-Cl，pH 8.0，0.25mmol/L EDTA，pH 8.0，0.5％SDS)和终浓度为100μg/mL的蛋白酶K，55℃消化过夜。次日，按常规方法(J.萨姆布鲁克、E.F.弗里奇、T.曼尼阿蒂斯著.金冬雁，黎孟枫等译.分子克隆实验指南第二版.科学出版社，1996)提取组织DNA，溶解于适量TE缓冲液(加适量核糖核酸酶)中，即为样品DNA。同时提取无特异性病原(SPF)鸡相应组织的DNA作阴性对照。

(2)样品DNA针对CAV的特异性核酸片段的扩增

利用提取的样品DNA分别用设计的一对引物CAV-vp1-F2和CAV-vp1-R2扩增出样品DNA的特异性核酸片段(样品1-12)，片段长度及引物序列如表1所示，样品PCR扩增的片段大小长于探针，如图1所示。

表1：样品PCR所用的引物序列

(3)地高辛PCR法标记病毒核酸探针

1)病毒核酸探针的标记

利用本发明人保存的鸡贫血病毒CAV-vp1基因(李延鹏，崔治中.一株鸡传染性贫血病毒野毒株致病性及全基因组序列比较.微生物学报，2007年47卷5期)作为CAV特异性探针模板DNA用于标记CAV-vp1探针。用Primer5.0软件设计一对引物见表1(由上海生物工程公司合成)。采用地高辛PCR法标记技术，用罗氏公司的试剂盒(PCR DIG ProbeSynthesis Kit，Cat.No.11636090910，Version December 2005)进行地高辛标记制备探针，探针标记方法按以上试剂盒操作说明书进行。

表2：CAV病毒制备核酸探针所用的引物序列

2)标记探针特异性和敏感性的测定

取适当大小的尼龙膜(罗氏公司)，将上述PCR扩增的探针模板(CAV-vp1基因)DNA片段稀释成500、50、5、0.5、0.05pg/μL系列浓度，分别取2μL在处理过的尼龙膜上点样。按照核酸探针标记及检测试剂盒(PCR DIG Probe Synthesis Kit，Cat.No.11636090910，Version December 2005；DIG Nucleic Acid Detection Kit，Cat.No.11175041910，VersionOctober 2008)操作说明进行预杂交、杂交和显色等步骤，以检测所制备探针的敏感性。

分别取2μL MDV-pp38基因、REV-pol基因和CAV-vp1基因(病毒特异性的DNA)作阴性对照和阳性对照，点于取适当大小的尼龙膜上，与变性的核酸探针杂交，加底物显色，以检测所制备探针的特异性。

PCR法标记的核酸探针，均只与自身病毒核酸反应显示棕褐色斑点，而与其它病毒的核酸均不显颜色，特异性很强(见图2-1)。每种核酸探针可检测到1pg量的特异性核酸片段，具有很高的灵敏度(见图3-1)。

(3)针对CAV病毒样品的PCR-电泳检测

利用提取的样品DNA扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果见图5-1(样品1-12，并设分子量大小的标志M：2000DL)。

(4)各样品及其相应PCR产物用CAV-vp1探针，进行斑点杂交检测

将提取的样品DNA和各样品的PCR产物分别点在NC膜上，经变性、中和、烤膜、预杂交、杂交、洗膜、碱性磷酸酶标记的ELASA检测后，通过斑点的有无判断结果。具体步骤如下(本发明所用试剂购自罗氏公司PCR DIG Probe Synthesis Kit，Cat.No.11636090910和DIG Nucleic Acid Detection Kit，Cat.No.11175041910)：

1)取一张适当大小的硝酸纤维素膜(NC膜，购自罗氏公司)，划好格子(0.7cm×0.7cm)，做好标记。

2)把每个提取的样品DNA分别点到NC膜上。

3)NC膜(点样面朝上)放于已用变性液(0.5mol/LNaOH，1.5mol/LNaCl)饱和的双层滤纸上变性10min，再放于已用中和液(0.5mol/LTris-Cl，3.0mol/LNaCl，pH7.4)饱和的双层滤纸上中和5min。

4)NC膜室温干燥30min，然后在80℃干烤2h固定DNA。

5)将NC膜放于预杂交液(5×SSC，0.2％SDS，2％Blocking Reagen，)于68℃反应2h，期间经常摇动NC膜。

6)将探针于沸水中变性10min，取出后立即置于冰浴中冷却5min。

7)将变性的探针倒入预杂交液中，充分混匀即成杂交液，使NC膜在其中68℃(温度可调整)杂交6h以上。

8)将NC膜放于洗液I(2×SSC，0.1％SDS)中室温洗涤15min，2次。

9)将NC膜放于洗液II(0.5×SSC，0.1％SDS)中68℃洗涤15min，2次。

10)置NC膜于缓冲液I(0.1mol/L Tris-Cl，0.15mol/LNaCl，pH7.5)中洗1min。

11)置NC膜于缓冲液II(Buffer I中加入2％Blocking Reagen)中反应30min，再用缓冲液I洗1min。

12)在20ml缓冲液II中加入4μl抗狄可辛抗体的碱性磷酸酶标记物，用之前经10000r/min离心5min，)，将膜放于其中37℃浸泡30min。

13)用缓冲液I洗涤NC膜；5min×5次。

14)置NC膜于缓冲液III(0.1mol/LTris-Cl，0.1mol/LNaCl，0.05mol/LMgCl₂，pH9.5)中反应浸泡2min。

15)在适当大小的容器中加入10ml缓冲液III和100μl显色液(NBT和BCIP混合物)，将NC膜放入其中显色一定时间，加入蒸馏水终止显色反应。

探针片段的阳性PCR产物、阴性PCR产物和长于探针片段的阳性PCR产物，斑点杂交，尼龙膜上出现了明显的褐色斑点，斑点杂交呈现阳性结果。而长于探针片段的阴性PCR产物，尼龙膜上没有出现任何斑点，斑点杂交呈现阴性结果，如图4-1所示。

(6)样品PCR电泳、斑点杂交、PCR产物斑点杂交结果

分别用PCR-电泳、斑点杂交和PCR产物斑点杂交(PCR-斑点杂交)检测各样品，检测结果见表3。PCR-电泳、斑点杂交和PCR-斑点杂交的部分结果见图5-1，图6-1。经PCR-电泳检测为阴性的某些样品，样品DNA直接经斑点杂交检测却有阳性反应；相应样品的PCR产物经斑点杂交检测却有较强的信号；某些经PCR-电泳检测目的条带模糊的样品，相应PCR产物经斑点杂交检测却有很强的信号。这些现象说明，核酸探针斑点杂交方法比PCR-电泳灵敏，运用PCR产物斑点杂交方法会更灵敏，能有效地减少漏检，充分避免PCR中的假阴性现象。

表3：PCR-电泳、斑点杂交PCR-斑点杂交结果比较

附图说明

图1两对引物位置及扩增片段长度

图2-1CAV探针的灵敏性检测结果、2-2MDV-pp38探针的灵敏性检测结果、2-3REV-pol探针的灵敏性检测结果A1：SPF鸡胚组织DNA，B1：1ng量的探针模板DNA，C1：100pg量的1ng量的探针模板DNA，D1：10pg量的探针模板DNA，E1：1pg量的探针模板DNA，F1：0.1pg量的探针模板DNA。

图3-1CAV探针的特异性检测结果 B1：CAV探针模板DNA；C1：SPF鸡胚组织DNA；A2：MDV-pp38基因DNA；B2：REV-pol基因DNA。

图3-2MDV-pp38探针的特异性检测结果A1：MD-pp38探针DNA；B1：SPF鸡胚组织DNA；A2：CAV-vp3DNA；B2：REV-pol DNA。

图3-3REV-pol探针的特异性检测结果A1：SPF鸡胚组织DNA；B1：REV-pol探针模板DNA；C1：MD-pp38DNA；D1：CAV-vp3DNA。

图4-1CAV-vp3两段片段的斑点杂交结果A1：探针外片段阳性PCR产物；B1：探针外片段阴性PCR产物；C1：探针阳性PCR产物；D1：探针阴性PCR产物。

图4-2：MD-pp38两段片段的斑点杂交结果A1：探针阴性PCR产物，B1：探针阳性PCR产物，C1：探针外片段阴性PCR产物，D1：探针外片段阳性PCR产物。

图4-3：REV-pol两段片段的斑点杂交结果A1：SPF鸡胚组织DNA；B1：长于探针片段DNA；C1：长于探针片段阴性PCR产物；D1：探针片段DNA；E1：探针片段阴性PCR产物

图5-1：部分样品的CAV-vp1基因的PCR-电泳结果M：2000DL；1-12：样品PCR产物结果。

图5-2：部分样品的MDV₁-pp38基因的PCR-电泳结果M：2000DL；A：阳性对照；1-7：样品PCR产物结果。

图5-3：部分样品的REV-pol基因的PCR-电泳结果M：2000DL；A：阴性对照；B：阳性对照；1-7：样品PCR产物结果。

图6-1：部分样品DNA和样品PCR产物斑点杂交结果A1：双蒸水；B1：SPF鸡胚组织DNA；C1：TE buffer；D1/F1：空白对照；E1：CAV探针模板DNA；A2-F2/A4-F4：样品DNA直接斑点杂交结果；A3-F3/A5-F5：相应样品PCR产物斑点杂交结果。

图6-2部分样品DNA和样品PCR产物斑点杂交结果A1：双蒸水；1：SPF鸡胚组织DNA；C1：马立克肿瘤组织DNA；D1：探针模板DNA；A2-D3：样品DNA直接斑点杂交结果；F3-I4：样品PCR产物斑点杂交结果。

图6-3部分样品DNA和样品PCR产物斑点杂交结果A1：双蒸水，B1：SPF鸡胚组织DNA，C1：REV探针模板DNA，D1/C4：空白对照，E1-B4：样品DNA直接斑点杂交结果，D4-H6：相应样品PCR产物斑点杂交结果。

本发明的积极意义在于本发明涉及一种PCR结合核酸探针斑点杂交检测病料中I型马立克氏病病毒感染的方法。本发明将疑是I型马立克氏病病毒感染的动物(已死亡动物)组织样品DNA用针对I型马立克氏病病毒的特异性引物PCR扩增后，对PCR产物再用该病毒特异性核酸探针做斑点杂交，不仅能显示PCR产物的特异性，也大大提高了检出率。本发明试验结果表明，PCR结合核酸探针斑点杂交技术检测病料中I型马立克氏病病毒感染，可显著提高病毒感染检测的灵敏度和特异性。

实施例

本发明提供的实施例为进一步阐述本发明，但这些实施例不构成对本发明作出限制。

实施例1

PCR结合斑点杂交技术检测自然发病鸡群中MDV的感染(以I型鸡马立克氏病病毒为例)。

1病料的收集及样品DNA的制备

取疑似鸡I型马立克氏病病毒(MDV)感染引起不同鸡群临床表现的鸡、死鸡的肝脏、脾脏、心脏、肾脏、胸腺、骨髓等。对组织样品，各取0.02g研磨，加入0.5mLDNA抽提缓冲液(100mmol/L NaCl，10mmol/L Tris-Cl，pH 8.0，0.25mmol/L EDTA，pH 8.0，0.5％SDS)和终浓度为100μg/mL的蛋白酶K，55℃消化过夜。次日，按常规方法(J.萨姆布鲁克、E.F.弗里奇、T.曼尼阿蒂斯著.金冬雁，黎孟枫等译.分子克隆实验指南第二版.科学出版社，1996)提取组织DNA，溶解于适量TE缓冲液(加适量核糖核酸酶)中，即为样品DNA。同时提取无特异性病原(SPF)鸡相应组织的DNA作阴性对照。

2样品DNA针对MDV特异性核酸片段的扩增

利用提取的样品DNA分别用设计的一对引物MDV-pp38-F2和MDV-pp38-R2扩增出样品DNA特异性核酸片段(样品1-7)，片段长度及引物序列如表4所示，样品PCR扩增的片段大小长于探针，如图1所示。

表4：样品PCR所用的引物序列(序列9，序列10)

3地高辛PCR法标记病毒核酸探针

(1)病毒核酸探针的标记利用MDV pp38基因克隆质粒(姜世金，丁家波，孟珊珊等.型马立克氏病病毒pp38和pp24基的真核表达.中国病毒学，2005年20卷4期)，大小为981bp用于标记MDV-pp38探针。用Primer5.0软件设计一对引物见表5(由上海生物工程公司合成)。采用地高辛PCR法标记技术，用罗氏公司的试剂盒进行地高辛标记制备探针，探针标记方法按试剂盒操作说明进行。

表5：MD病毒制备核酸探针所用的引物序列(序列6，序列7)

(2)标记探针特异性和敏感性的测定

取适当大小的尼龙膜(罗氏公司)，将上述PCR扩增的探针模板(MDV-pp38基因)DNA片段稀释成500、50、5、0.5、0.05pg/μL系列浓度，分别取2μL在处理过的尼龙膜上点样。按照核酸探针标记及检测试剂盒操作说明进行预杂交、杂交和显色等步骤，以检测所制备探针的敏感性。

分别取2μL CAV-vp基因1、REV-pol基因、和MDV-pp38基因(病毒特异性的DNA)点于取适当大小的尼龙膜上，与变性的核酸探针杂交，加底物显色，以检测所制备探针的特异性。

PCR法标记的核酸探针，均只与自身病毒核酸反应显示棕褐色斑点，而与其它病毒的核酸均不显颜色，特异性很强(见图2-2)。每种核酸探针可检测到1pg量的特异性核酸片段，具有很高的灵敏度(见图3-2)。

(3)针对MDV样品的PCR-电泳检测

利用提取的样品DNA扩增产物(样品1-7)，并设M：2000DL和阳性对照(MDV-pp38基因DNA片段)进行琼脂糖凝胶电泳，结果见图5-2。

(4)各样品及其相应PCR产物用MD-pp38探针，进行斑点杂交检测

将提取的样品DNA和各样品的PCR产物分别点在NC膜上，经变性、中和、烤膜、预杂交、杂交、洗膜、免疫学检测后，通过斑点的有无判断结果。

探针片段的阳性PCR产物、阴性PCR产物和长于探针片段的阳性PCR产物，斑点杂交，尼龙膜上出现了明显的褐色斑点，斑点杂交呈现阳性结果。而长于探针片段的阴性PCR产物，尼龙膜上没有出现任何斑点，斑点杂交呈现阴性结果，如图4-2所示。

(5)样品PCR电泳、斑点杂交、PCR产物斑点杂交结果

分别用PCR-电泳、斑点杂交和PCR产物斑点杂交(PCR-斑点杂交)检测各样品，检测结果见表3。PCR-电泳、斑点杂交和PCR-斑点杂交的部分结果见图5-2，图6-2。经PCR-电泳检测为阴性的某些样品，样品DNA直接经斑点杂交检测却有阳性反应；相应样品的PCR产物经斑点杂交检测却有较强的信号；某些经PCR-电泳检测目的条带模糊的样品，相应PCR产物经斑点杂交检测却有很强的信号。这些现象说明，核酸探针斑点杂交方法比PCR-电泳灵敏，运用PCR产物斑点杂交方法会更灵敏，能有效地减少漏检，充分避免PCR中的假阴性现象。

PCR-电泳和斑点杂交和PCR-斑点杂交比较结果见表6。

表6MDV₁PCR-电泳、斑点杂交PCR-斑点杂交结果比较

实施例2

PCR结合斑点杂交技术检测自然发病鸡群中REV病毒的感染

1病料的收集及样品DNA的制备

取疑似禽网状内皮增生病病毒(REV)感染引起不同鸡群临床表现的鸡、死鸡的肝脏、脾脏、心脏、肾脏、胸腺、骨髓等。对组织样品，各取0.02g研磨，加入0.5mLDNA抽提缓冲液(100mmol/L NaCl，10mmol/L Tris-Cl，pH 8.0，0.25mmol/L EDTA，pH 8.0，0.5％SDS)和终浓度为100μg/mL的蛋白酶K，55℃消化过夜。次日，按常规方法(J.萨姆布鲁克、E.F.弗里奇、T.曼尼阿蒂斯著.金冬雁，黎孟枫等译.分子克隆实验指南第二版.科学出版社，1996)提取组织DNA，溶解于适量TE缓冲液(加适量核糖核酸酶)中，即为样品DNA。同时提取无特异性病原(SPF)鸡相应组织的DNA作阴性对照。

2样品DNA针对REV特异性核酸片段的扩增

利用提取的样品DNA分别用设计的一对引物REV-pol-F2和REV-pol-R2扩增出样品DNA特异性核酸片段(样品1-7)，片段长度及引物序列如表7所示，样品PCR扩增的片段大小长于探针，如图1所示。

表7：样品PCR所用的引物序列

3地高辛PCR法标记病毒核酸探针

(1)病毒核酸探针的标记利用本发明人保存的REV-pol(王玉，崔治中，姜世金.网状内皮组织增生症病毒中国分离株HA9901全基因组核苷酸序列的测定与分析，中国科学，C辑，2005，35：1-9)，基因大小为3482bp，用于标记REV-pol探针。用Primer5.0软件设计一对引物见表8(由上海生工合成)。采用地高辛PCR法标记技术，用罗氏公司的试剂盒进行地高辛标记制备探针，作为标记DNA探针的模板，探针标记方法按试剂盒操作说明进行。

表8：REV病毒制备核酸探针所用的引物序列

(2)标记探针特异性和敏感性的测定

取适当大小的尼龙膜(罗氏公司)，将上述PCR扩增的探针模板(REV-pol基因)DNA片段稀释成500、50、5、0.5、0.05pg/μL系列浓度，分别取2μL在处理过的尼龙膜上点样。按照核酸探针标记及检测试剂盒操作说明进行预杂交、杂交和显色等步骤，以检测所制备探针的敏感性。

分别取2μL CAV-vp1、MDV-pp38和REV-pol探针模板DNA点于取适当大小的尼龙膜上，与变性的核酸探针杂交，加底物显色，以检测所制备探针的特异性。

PCR法标记的核酸探针，均只与自身病毒核酸反应显示棕褐色斑点，而与其它病毒的核酸均不显颜色，特异性很强(见图2-3)。每种核酸探针可检测到1pg量的特异性核酸片段，具有很高的灵敏度(见图3-3)。

(3)针对REV样品的PCR-电泳检测

利用提取的样品DNA分别扩增REV特异性核酸片段(样品1-7)，并设M：2000DL、阴性对照(SPF鸡相应组织的DNA作为模板的PCR产物)和阳性对照(用已知REV-pol基因为模板的PCR产物)进行琼脂糖凝胶电泳，结果见图5-3。

(4)各样品及其相应PCR产物用REV-pol探针，进行斑点杂交检测

探针片段的阳性PCR产物、阴性PCR产物和长于探针片段的阳性PCR产物，斑点杂交，尼龙膜上出现了明显的褐色斑点，斑点杂交呈现阳性结果。而长于探针片段的阴性PCR产物，尼龙膜上没有出现任何斑点，斑点杂交呈现阴性结果，如图4-3所示。

(5)样品PCR电泳、斑点杂交、PCR产物斑点杂交结果

分别用PCR-电泳、斑点杂交和PCR产物斑点杂交(PCR-斑点杂交)检测各样品，检测结果见表9。PCR-电泳、斑点杂交和PCR-斑点杂交的部分结果见图5-3，图6-3。经PCR-电泳检测为阴性的某些样品，样品DNA直接经斑点杂交检测却有阳性反应；相应样品的PCR产物经斑点杂交检测却有较强的信号；某些经PCR-电泳检测目的条带模糊的样品，相应PCR产物经斑点杂交检测却有很强的信号。这些现象说明，核酸探针斑点杂交方法比PCR-电泳灵敏，运用PCR产物斑点杂交方法会更灵敏，能有效地减少漏检，充分避免PCR中的假阴性现象。

PCR-电泳和斑点杂交和PCR-斑点杂交比较结果见表9。

表9：REV PCR-电泳、斑点杂交PCR-斑点杂交结果比较

Claims

1.一种PCR结合核酸探针斑点杂交检测病料中I型马立克氏病病毒感染的方法，其特征在于所述病料取自病死动物的肝脏、脾脏、心脏、肾脏、胸腺、骨髓，使用针对可疑病毒的特异性引物对病料DNA进行PCR扩增后，再用该可疑病毒的特异性核酸探针对PCR扩增产物做斑点杂交；

其中：扩增病料DNA的引物MDV-pp38-F2和MDV-pp38-R2，其序列如序列表中序列9和10所示；制备检测探针的引物MDV-pp38-F1和MDV-pp38-R1其序列如序列表中序列6和7所示。

2.如权利要求1所述一种PCR结合核酸探针斑点杂交检测病料中I型马立克氏病病毒感染的方法，其特征在于在利用PCR结合核酸探针斑点杂交检测病料时，用于扩增病料DNA的引物MDV-pp38-F2和MDV-pp38-R2必须在探针标记用引物MDV-pp38-F1和MDV-pp38-R1之外，即MDV-pp38-F2在MDV-pp38-F1的5’-端上游而MDV-pp38-R2在MDV-pp38-R1的3’-端的下游。