JP2014100140A - 鶏封入体肝炎ウイルス検出用オリゴヌクレオチド - Google Patents
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Abstract
【解決手段】特定な配列の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び、前記オリゴヌクレオチドとは異なる別の特定な配列の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドからなるプライマーペア、又は当該塩基配列に対応する相補的配列からなるプライマーペア。
【選択図】なし
Description
したがって、FAdVを正確且つ簡便に検出することは重要である。
しかしながら、12種類の血清型の全てを検出可能な分析法の報告は無い。
1)配列番号1に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号2に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドからなるプライマーペア、又は当該塩基配列に対応する相補的配列からなるプライマーペア。
2)配列番号3に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号4に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドからなるプライマーペア、又は当該塩基配列に対応する相補的配列からなるプライマーペア。
3)配列番号5に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号6に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドからなるプライマーペア、又は当該塩基配列に対応する相補的配列からなるプライマーペア。
4)検体から抽出したDNAを鋳型として、上記1)〜3)の何れかに記載のプライマーペアを用いてPCRを行う工程と、増幅産物を測定する工程とを含む、鶏封入体肝炎ウイルスの検出方法。
表1に、本発明のプライマーペアの一覧とそれを用いてPCRを行った場合の増幅産物の大きさを示す。各プライマーペアは、PCR等の核酸増幅反応においてフォワードプライマー及びこれと組み合わせるリバースプライマーとして使用できる。
また、配列番号1〜6に示される塩基配列や当該塩基配列に対応する相補的配列において1〜3個、好ましくは2個以下、好ましくは1個の塩基が欠失、置換、付加又は挿入された塩基配列からなり、配列番号1〜6に示される塩基配列又はその相補的配列からなるオリゴヌクレオチドと其々プライマーとして同等の機能を有するオリゴヌクレオチドは、本発明のオリゴヌクレオチドと同等に扱われる。
また、オリゴヌクレオチド中には、修飾ヌクレオチドがあってもよい。
PCRによる高い検出感度を得るためには、高濃度なDNAを取得することが望ましく、一方で、発育鶏卵からの核酸抽出液中にはPCRを阻害する物質が混在するため、これら阻害物質を可能な限り除去した高純度なDNAを取得することが望ましい。この目的のため、例えば、高濃度かつ高純度のDNAが抽出できるQIAGEN社製QIAamp MinElute Virus Kit等を用いることができる。
FAdVのHexon L1、Hexon L1・P1及びHexon Gene Completeの各遺伝子領域を標的とし、それぞれに特異的なプライマーを以下の手順で設計した。
文献情報(Aust Vet J. 2011 May;89(5):184-92、Journal of Clinical Microbiology (2009) 47(2):311-321)より下記表2〜4に示す参照配列を収集し、遺伝子情報処理ソフトウェアを用いたMultiple Alignment解析により血清型間で高度に保存された領域を選択し、前記表1に示すプライマーを設計した。
下記の試験に用いるためのプライマーは、株式会社ジーンネットへ委託して合成した。
鶏胎児初代腎細胞(以下、CEK細胞)にて調製した鶏封入体肝炎ウイルス溶液(Ote株、血清型:FAdV1、感染力価:6.0×107TCID50/mL)を検体としてQIAamp MinElute Virus Kit(QIAGEN社製)にてウイルスゲノム抽出液を調製した。調製したウイルスゲノム抽出液をDNase/RNaseフリー滅菌水(ライフテクノロジーズ社製)にて10倍希釈したものを鋳型ウイルスゲノム溶液とした。5μLの鋳型ウイルスゲノム溶液、10μLのSsoFast EvaGreen
supermix(Bio−Rad社製)、0.8μLの10μMに調製した各プライマー及び3.4μLのDNase/RNaseフリー滅菌水(ライフテクノロジーズ社製)をPCR反応チューブ(ライフテクノロジーズ社製)に添加して、混合した。調製した反応溶液にて、ライフテクノロジーズ社製StepOnePlusTMリアルタイムPCRシステムを用いた分析を実施した。なお、PCR条件は、98℃2分間のポリメラーゼの活性化、98℃5秒間及び56℃20秒間を40サイクル繰り返すことによる標的配列の増幅反応にて実施し、使用したPrimerの一覧は表5に示す通りである。
表5に示すPrimerペアのうち、FAdV Primer4は非特許文献1に記載されるプライマーペアである。表1に示すプライマーに上記プライマーを加えてプライマーの性能を評価した。
CEK細胞にて調製した鶏封入体肝炎ウイルス(FAdV)溶液、産卵低下症候群−1976ウイルス(EDSV)溶液、トリレオウイルス(ARV)溶液、鶏初代腎細胞(CK細胞)破砕上清及びDNase処理したCK細胞破砕上清を検体として、QIAGEN社製QIAamp MinElute Virus Kitにて核酸抽出液を調製した。2μLの各核酸抽出液、10μLのSsoFast EvaGreen supermix(Bio−Rad社製)、0.8μLの10μMに調製したプライマー及び6.4μLのDNase/RNaseフリー滅菌水(ライフテクノロジーズ社製)をPCR反応チューブ(ライフテクノロジーズ社製)に添加して、混合した。調製した反応溶液にて、ライフテクノロジーズ社製StepOnePlusTMリアルタイムPCRシステムを用いた分析を実施した。
なお、PCR条件は、98℃2分間のポリメラーゼの活性化、98℃5秒間及び69℃20秒間を40サイクル繰り返すことによる標的配列の増幅反応にて実施し、プライマーペアは、上記(1)ウイルス検出の試行に示すFAdV Primer3を使用した。
これにより図2に示す結果が得られ、設計したFAdV Primer3の分析では、シグナルの立ち上がりが確認されたのはFAdVに対してのみであり、他のウイルスや鶏のゲノム若しくはゲノム断片に対して交差反応性を示さない。特に、EDSVはFAdVと同じアデノウイルス科であり、近縁種のウイルスに対して交差反応性を示さないことは、設計したプライマーペアを用いた分析法の特異性の高さを示す結果である。
CEK細胞にて調製した鶏封入体肝炎ウイルス(FAdV)溶液をEagle’s MEM(和光純薬工業社製)にて10-1〜107TCID50/mLの9濃度に調製し、各濃度のFAdV溶液からQIAGEN社製QIAamp MinElute Virus Kitにて鋳型ウイルスゲノム溶液を調製した。調製した各鋳型ウイルスゲノム溶液を上記(2)交差反応性に示す条件にてリアルタイムPCRによる分析を実施した。
図3に102〜107TCID50/mLのFAdV溶液より調製した各鋳型ウイルスゲノム溶液の分析結果を示し、図4に10-1〜102TCID50/mLのFAdV溶液より調製した各鋳型ウイルスゲノム溶液の分析結果を示す。
これらの結果より、FAdV Primer3は、101TCID50/mL以上の濃度にてウイルスが検出可能であることが示された。したがって、本分析法は高感度な分析法であると考えられる。
表3の各血清型の標的配列を人工合成した遺伝子(BIOMATIK社製)を1mLのTEバッファーに溶解して測定検体を調製した。調製した各検体を上記(2)交差反応性に示す条件にてリアルタイムPCRによる分析を実施した。
図5に分析結果を示す。FAdV Primer3は、いずれの血清型の配列も検出可能であることが示された。したがって、本分析法は12種類の血清型を網羅的に検出可能であると考えられる。
Claims (4)
- 配列番号1に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号2に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドからなるプライマーペア、又は当該塩基配列に対応する相補的配列からなるプライマーペア。
- 配列番号3に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号4に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドからなるプライマーペア、又は当該塩基配列に対応する相補的配列からなるプライマーペア。
- 配列番号5に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号6に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドからなるプライマーペア、又は当該塩基配列に対応する相補的配列からなるプライマーペア。
- 検体から抽出したDNAを鋳型として、請求項1〜3の何れか1項に記載のプライマーペアを用いてPCRを行う工程と、増幅産物を測定する工程とを含む、鶏封入体肝炎ウイルスの検出方法。
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