CN102796829A - 罗氏沼虾诺蒂病毒的lamp检测试剂盒及其检测方法 - Google Patents

Abstract

罗氏沼虾诺蒂病毒的LAMP检测试剂盒及其检测方法，属于靶DNA片断的检测技术领域。该LAMP检测试剂盒包括病毒DNA提取试剂和LAMP反应试剂，所述的LAMP反应试剂中含有用于检测罗氏沼虾诺蒂病毒的LAMP扩增用核酸引物组，该引物组包含引物MRNuV-FIP、引物MRNuV-BIP、引物MRNuV-F3、引物MRNuV-B3、引物MRNuV-LF和引物MRNuV-LB。发明的试剂盒特异性强，敏感性高；本发明罗氏沼虾诺蒂病毒的LAMP检测方法利用所述试剂盒检测，该方法方便、灵敏、准确、快速。

Description

罗氏沼虾诺蒂病毒的LAMP检测试剂盒及其检测方法

技术领域

本发明涉及靶DNA片断的检测技术领域，具体涉及一种利用环介导等温扩增(Loop-mediated isothermal amplification, LAMP)技术快速检测罗氏沼虾诺蒂病毒所用的试剂盒及检测方法。

背景技术

罗氏沼虾诺蒂病毒（Macrobrachium rosenbergii Nudivirus，MRNuV）是引起罗氏沼虾幼体变态障碍综合症的主要病原之一，对罗氏沼虾育苗产业危害极大。MRNuV为双链DNA病毒，属于诺蒂病毒属，国际上对该属病毒并为明确其科分类地位。该病毒于2010年从患罗氏沼虾幼体变态障碍综合症的罗氏沼虾幼体中发现，其造成罗氏沼虾在幼体期出现大量死亡，特别是在幼体后期和变态为仔虾过程中尤为严重，死亡率一般为70～80%，严重的达到90%以上，近2年造成的经济损失无法估量。被发现以来，因缺少检测方法，严重阻碍了该病毒引起疾病的预防工作，因此该病毒检测试剂盒的开发和检测技术的研究显得尤为重要。

因此，本发明采用环介导等温扩增(Loop-mediated isothermal amplification, LAMP)技术，通过检测罗氏沼虾诺蒂病毒的PIF-2基因，来检测罗氏沼虾诺蒂病毒，这是目前国内外首次建立的MRNuV检测方法。该方法的建立为罗氏沼虾幼体变态障碍综合症的预防奠定基础。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于设计提供一种罗氏沼虾诺蒂病毒的LAMP检测试剂盒及其检测方法的技术方案。本发明的试剂盒特异性强，敏感性高；本发明罗氏沼虾诺蒂病毒的LAMP检测方法利用所述试剂盒检测，该方法方便、灵敏、准确、快速。

所述的罗氏沼虾诺蒂病毒的LAMP检测试剂盒，包括病毒DNA提取试剂和LAMP反应试剂，其特征在于所述的LAMP反应试剂中含有用于检测罗氏沼虾诺蒂病毒的LAMP扩增用核酸引物组，该引物组包含引物MRNuV-FIP、引物MRNuV-BIP、引物MRNuV-F3、引物MRNuV-B3、引物MRNuV-LF和引物MRNuV-LB；

所述的引物MRNuV-FIP序列如SEQ ID NO：1所示；

所述的引物MRNuV-BIP序列如SEQ ID NO：2所示；

所述的引物MRNuV-F3序列如SEQ ID NO：3所示；

所述的引物MRNuV-B3序列如SEQ ID NO：4所示；

所述的引物MRNuV-LF序列如SEQ ID NO：5所示；

所述的引物MRNuV-LB序列如SEQ ID NO：6所示。

所述的罗氏沼虾诺蒂病毒的LAMP检测试剂盒，其特征在于所述的病毒DNA提取试剂包含以下组分：含有5～15 mM Tris、0.5～1.5 mM EDTA ，pH 8.0的TE缓冲液；RNase A，浓度10 mg/mL；蛋白酶K溶液，浓度20 mg/mL，pH8.0； Tris饱和酚，pH8.0；乙酸钠水溶液，浓度3 mol/L；乙醇，浓度95%。

所述的罗氏沼虾诺蒂病毒的LAMP检测试剂盒，其特征在于所述的LAMP反应试剂包括以下组分：

1）LAMP预反应液：20～25mM pH为8.2～9.0的Tris-HC1、5～10mM硫酸镁、10～12mM氯化钾、6～12mM硫酸按、0.l～0.2% Triton X-100、1～1.6 mM dNTP、0.5～1.0 M甜菜碱、1.5～2.2μM引物MRNuV-FIP、1.5～2.2μM引物MRNuV-BIP、0.15～0.3μM引物MRNuV-F3、0.15～0.3μM引物MRNuV-B3、0.6～1.2μM引物MRNuV-LF和0.6～1.2μM引物MRNuV-LB； 

2）聚合酶：每微升含8个活性单位的Bst DNA聚合酶；

3）LAMP反应稳定液：由矿物油或液体石蜡油组成；

4）LAMP反应显色液：含有10 % SYBR Green I的荧光染料。

所述的罗氏沼虾诺蒂病毒的LAMP检测试剂盒进行LAMP检测的方法，其特征在于包括以下工艺步骤：

1）DNA抽提：取罗氏沼虾幼体去眼后的头胸部或是成虾鳃组织抽提出待检测DNA的数目；

2）罗氏沼虾诺蒂病毒的LAMP扩增：

①根据待检测DNA的数目，设置所需LAMP反应管数N，N=样品数+2，其中l管为阳性对照，l管为阴性对照；

②吸取所述的LAMP预反应液的体积为N×23μL，加入一洁净的1.5mL离心管中，然后加入NμL Bst DNA聚合酶，混合均匀，1500～2000转/分钟离心10秒，取上清之混合液；

③向设定的N个LAMP反应管数中分别加入24uL步骤②得到的混合液，得到N个PCR反应管，向上述N个PCR反应管内按顺序依次分别加入阴性对照、待检DNA模板和阳性对照各luL；

④在上述步骤③得到的反应管中再分别加入30uL LAMP反应稳定液，盖紧管盖并做好标记，2000转/分钟离心5秒；

⑤在63℃下恒温反应30分钟；

3）显色检测：

取出经步骤2）的反应管，冷却至室温，2000转/分钟离心5秒，按照阴性对照、待检样品和阳性对照的顺序依次分别加入l uL LAMP反应显色液，轻轻混匀，直接用肉眼观察颜色变化或1.5%琼脂糖凝胶进行电泳后用溴化乙锭染色后进行观察。

所述的LAMP检测试剂盒还具有阳性对照试样和阴性对照试样，所述阳性对照试样为含有罗氏沼虾诺蒂病毒PIF-2基因的质颗，所述的阴性对照试样为无核酸去离子水。

本发明所述的引物是根据在线软件PrimerExplorer V4(http://primerexplorer.jp/e/)设计和手工修改而得，本发明涉及的六条引物能特异识别靶序列的八个不同位点，增加了扩增的特异性，并在反应中产生茎环结构。

本发明中罗氏沼虾诺蒂病毒PIF-2基因序列如SEQ ID NO：7所示，该序列为现有序列。

 

与现有技术相比，本发明具有如下优点:

（1）本发明根据靶基因序列设计了罗氏沼虾诺蒂病毒检测用引物组，能特异性识别靶序列上的八个独立区域，在BstDNA聚合酶的作用下启动循环链置换反应，在靶标DNA区启动互补链合成，在同一链上互补序列周而复始形成有很多环的花椰菜结构的茎一环DNA混合物，由于LAMP技术只有在四条引物完全识别靶序列六个结合区的情况下才能顺利进行，所以本发明的引物组在很大程度上减少了扩增反应的背景影响，大大增强了罗氏沼虾诺蒂病毒检测的特异性；

（2）采用本发明的引物组对罗氏沼虾诺蒂病毒进行检测，因为特异性高，所以可以根据是否扩增就能判断目标基因的存在与否；

（3）本发明的快速诊断试剂盒是利用环介导等温扩增技术快速检测罗氏沼虾诺蒂病毒，检测灵敏度高，扩增模板仅需12拷贝；

（4）本发明的快速诊断试剂盒不但反应条件温和，且所需仪器简单，也不需要特殊试剂，克服了传统PCR固有的检测时间长、容易污染及检测成本高等缺点；

（5）本发明的快速诊断试剂盒扩增快速且高效，在不到1h即可完成扩增，且产率高；

（6）本发明的快速诊断试剂盒鉴定简便，从dNTP析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的Mg²⁺结合，产生副产物——焦磷酸镁沉淀，可通过肉眼观察鉴定，并且加入显色液后，阴阳性结果显色差异显著，验证率高，更加明显可靠；

（7）本发明的快速诊断试剂盒操作简单，对检测人员的技术素质要求较低，可建立成本低廉的快速筛选体系，实现现场高通量快速检测；

（8）本发明的快速诊断试剂盒建立了一套经过优化的环介导等温扩增反应体系，不但使得罗氏沼虾诺蒂病毒定性检测更加简便快速、特异性高、灵敏度高，而且该试剂盒是检测罗氏沼虾诺蒂病毒的第一个试剂盒，填补了罗氏沼虾诺蒂病毒无检测方法的缺口，具有很高的科研和经济价值。

附图说明

图1引物特异性测试图；

M：DL 1000 DNA Marker； 1：罗氏沼虾诺蒂病毒；2：正常罗氏沼虾DNA； 3：嗜水气单胞菌；4：对虾白斑综合症病毒；5：对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒；6：阴性对照。

图2灵敏性检测图；

M：1000 bp DNA Marker；1：1.2×10⁴ copies；2：1.2×10³ copies；3： 1.2×10² copies；4：1.2×10 copies；5：1.2 copies；6：阴性对照。

具体实施方式

以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。

（1）DNA抽提：

取罗氏沼虾幼体去眼后的头胸部或是成虾鳃组织0.1～0.2g，于冰上用研磨棒研磨，加400μL TE缓冲液（含有5～15 mM Tris、0.5～1.5 mM EDTA ，pH 8.0）和1μL 浓度为10mg/mL的RNase A后，继续研磨充分后加浓度为20mg/mL、pH值8.0的蛋白酶K溶液20μL ，旋涡震荡1分钟后，56℃水浴30min，加同体积pH值8.0的Tris饱和酚，强烈振荡，11000g离心3分钟，取上清液，重复酚抽提；取上清液，加入0.1倍体积的浓度为3mo1/L的乙酸钠，混匀，再加等体积的冰冷乙醇，混匀后低温静置10分钟，15000g离心5分钟，弃上清，沉淀用70％乙醇洗涤2次，室温干燥5～10min后以30μL去离子水重悬。

（2）罗氏沼虾诺蒂病毒的LAMP扩增：

根据待检测样品的数目，设置所需LAMP反应管数N，N=样品数+2，其中l管为阳性对照（含有罗氏沼虾诺蒂病毒PIF-2基因的质粒），l管为阴性对照（无核酸去离子水）；吸取LAMP预反应液的体积为N×23 μL，加入一洁净的1. 5mL离心管中，然后加入N μL每微升含8个活性单位的Bst DNA聚合酶，混合均匀，1500～2000转/分钟离心10秒，向设定的N个反应管中分别加入24 u L混合液，并向N个PCR反应管内按顺序依次分别加入阴性对照、待检DNA模板和阳性对照各luL；然后在每个反应管中再分别加入30 u L由矿物油或液体石蜡油组成的 LAMP反应稳定液，盖紧管盖并做好标记，2000转/分钟离心5秒；在63℃下恒温反应30分钟。

（3）显色检测：

取出经步骤（2）的反应管，冷却至室温，2000转/分钟离心5秒，按照阴性对照、待检样品和阳性对照的顺序依次分别加入l uL含有10 % SYBR Green I的荧光染料的LAMP反应显色液，轻轻混匀，直接用肉眼观察颜色变化，绿色为阳性，橙色为阴性。也可以用1.5%琼脂糖凝胶进行电泳后用溴化乙锭染色。电泳结果在紫外分析仪下观察，如果发现有阶梯状的扩增特征条带，说明样品中有罗氏沼虾诺蒂病毒。

上述LAMP预反应液含有：20～25mM pH为8.2～9.0的Tris-HC1、5～10mM硫酸镁、10～12mM氯化钾、6～12mM硫酸按、0.l～0.2% Triton X-100、1～1.6 mM dNTP、0.5～1.0 M甜菜碱、1.5～2.2μM引物MRNuV-FIP、1.5～2.2μM引物MRNuV-BIP、0.15～0.3μM引物MRNuV-F3、0.15～0.3μM引物MRNuV-B3、0.6～1.2μM引物MRNuV-LF和0.6～1.2μM引物MRNuV-LB，其中所述的引物MRNuV-FIP序列如SEQ ID NO：1所示；所述的引物MRNuV-BIP序列如SEQ ID NO：2所示；所述的引物MRNuV-F3序列如SEQ ID NO：3所示；所述的引物MRNuV-B3序列如SEQ ID NO：4所示；所述的引物MRNuV-LF序列如SEQ ID NO：5所示；所述的引物MRNuV-LB序列如SEQ ID NO：6所示。

MRNuV-FIP：GTACCGGTAGTATTTTGTGGGATTAGAATTCCGTCATATTTACAGTT

AAGGGGT；

MRNuV-BIP：CAAGCCGTTATAGCGGTTGCGAATTCCTTGTCGTACGAAATATCCAA；

MRNuV-F3：CCGGTAATAATTCGTCTTCG；

MRNuV-B3：AGCTACGGTTAATAGCGTTA；

MRNuV-LB：GGTTTCTCCACCAAACATAT；

MRNuV-LF：CGCTAACAATGAAGCCGTAG。

采用上述快速诊断试剂盒和方法进行LAMP检测罗氏沼虾诺蒂病毒特异性和灵敏性试验结果如附图1和2所示。

图1引物种特异性测试图，如图所示，仅罗氏沼虾诺蒂病毒能扩增出阶梯状的扩增特征条带，其它病毒无阶梯状的扩增特征条带，表明对其它病毒无交叉扩增性。

图2罗氏沼虾诺蒂病毒灵敏性检测图，如图所示，经Real-time PCR定量后的罗氏沼虾诺蒂病毒DNA系列稀释的扩增特征条带显示，当反应体系中加入12个病毒拷贝的DNA，就能扩增出特征条带。

本发明利用环介导等温扩增技术快速检测罗氏沼虾诺蒂病毒的检测方法，在已试验的4种不同的病毒（其中一个是诺蒂病毒）进行了检测，检测结果仅诺蒂病毒检测为阳性，其它均为阴性，说明该检测方法特异性高。

                                                      SEQUENCE LISTING

 

<110>  浙江省淡水水产研究所

 

<120>  罗氏沼虾诺蒂病毒的LAMP检测试剂盒及其检测方法

 

<130>  11

 

<160>  7    

 

<170>  PatentIn version 3.3

 

<210>  1

<211>  54

<212>  DNA

<213>  人工合成

 

<400>  1

gtaccggtag tattttgtgg gattagaatt ccgtcatatt tacagttaag gggt           54

 

 

<210>  2

<211>  47

<212>  DNA

<213>  人工合成

 

<400>  2

caagccgtta tagcggttgc gaattccttg tcgtacgaaa tatccaa                   47

 

 

<210>  3

<211>  20

<212>  DNA

<213>  人工合成

 

<400>  3

ccggtaataa ttcgtcttcg                                                 20

 

 

<210>  4

<211>  20

<212>  DNA

<213>  人工合成

 

<400>  4

agctacggtt aatagcgtta                                                 20

 

 

<210>  5

<211>  20

<212>  DNA

<213>  人工合成

 

<400>  5

cgctaacaat gaagccgtag                                                 20

 

 

<210>  6

<211>  20

<212>  DNA

<213>  人工合成

 

<400>  6

ggtttctcca ccaaacatat                                                 20

 

 

<210>  7

<211>  929

<212>  DNA

<213>  罗氏沼虾诺蒂病毒

 

<400>  7

aagcgaatct aaatgatcca tccggtaata attcgtcttc gtgcgtcata tttacagtta     60

 

aggggtctac ggcttcattg ttagcgtaat cccacaaaat actaccggta cttgggtatt    120

 

tttcattatt acaagccgtt atagcggttg cggtttctcc accaaacata tttggatatt    180

 

tcgtacgaca agtaacgcta ttaaccgtag ctactacgta accagtatta tgattacagt    240

 

ttacgggatc taccgtacag tatacacctt ttttcacaaa tttattatca tatacaaaat    300

 

cattatcatt ttccaccact tgtaaattac cagcacctcc acatttgttt ttgcataaat    360

 

ttaagtaatt atccatttta ttttcatcta tgggccctaa atattttaat ttgtttttac    420

 

aatcaactaa agcgtctatt tgttcgttat cagtttttaa aattatattt ggcaaattag    480

 

cgatagtatt agcatttttt agattcatta ttttatcatt aactacgtca actcgtaatt    540

 

tggtaagata tttttcgtat acttcgggat ttatctttaa gatagcaaaa tacgaaacta    600

 

aaactacgat gattataatc gataatacaa ggaagtaata tttcccaata gtatgttttt    660

 

taagttccat atcgaaaaat tattaatctt tttctgtttt agtttttttc cagtaaaatc    720

 

aattgtcgtt aagttcttaa aagttttaag ctctttataa tgttctttaa tcgcatcaaa    780

 

tttattttca attaactctt tacttttcgc gtaatcgtca atttcaactt tatacgaaga    840

 

attagtgtaa atatcacaag ctaatctaaa aactgtattt tgaacaaata cgtatctcct    900

 

agcataatat tcatcaaatt cataaccca                                      929

 

 

Claims (4)

1.罗氏沼虾诺蒂病毒的LAMP检测试剂盒，包括病毒DNA提取试剂和LAMP反应试剂，其特征在于所述的LAMP反应试剂中含有用于检测罗氏沼虾诺蒂病毒的LAMP扩增用核酸引物组，该引物组包含引物MRNuV-FIP、引物MRNuV-BIP、引物MRNuV-F3、引物MRNuV-B3、引物MRNuV-LF和引物MRNuV-LB；

所述的引物MRNuV-FIP序列如SEQ ID NO：1所示；

所述的引物MRNuV-BIP序列如SEQ ID NO：2所示；

所述的引物MRNuV-F3序列如SEQ ID NO：3所示；

所述的引物MRNuV-B3序列如SEQ ID NO：4所示；

所述的引物MRNuV-LF序列如SEQ ID NO：5所示；

所述的引物MRNuV-LB序列如SEQ ID NO：6所示。

2.如权利要求1所述的罗氏沼虾诺蒂病毒的LAMP检测试剂盒，其特征在于所述的病毒DNA提取试剂包含以下组分：含有5～15 mM Tris、0.5～1.5 mM EDTA ，pH 8. 0的TE缓冲液；RNase A，浓度10 mg/mL；蛋白酶K溶液，浓度20 mg/mL， pH8.0； Tris饱和酚，pH8.0；乙酸钠水溶液，浓度3 mol/L；乙醇，浓度95%。

3.如权利要求1所述的罗氏沼虾诺蒂病毒的LAMP检测试剂盒，其特征在于所述的LAMP反应试剂包括以下组分：

1）LAMP预反应液：20～25mM pH为8.2～9.0的Tris-HC1、5～10mM硫酸镁、10～12mM氯化钾、6～12mM硫酸按、0.l～0.2% Triton X-100、1～1.6 mM dNTP、0.5～1.0 M甜菜碱、1.5～2.2μM引物MRNuV-FIP、1.5～2.2μM引物MRNuV-BIP、0.15～0.3μM引物MRNuV-F3、0.15～0.3μM引物MRNuV-B3、0.6～1.2μM引物MRNuV-LF和0.6～1.2μM引物MRNuV-LB； 

2）聚合酶：每微升含8个活性单位的Bst DNA聚合酶；

3）LAMP反应稳定液：由矿物油或液体石蜡油组成；

4）LAMP反应显色液：含有10 % SYBR Green I的荧光染料。

4.利用权利要求3所述的罗氏沼虾诺蒂病毒的LAMP检测试剂盒进行LAMP检测的方法，其特征在于包括以下工艺步骤：

1）DNA抽提：取罗氏沼虾幼体去眼后的头胸部或是成虾鳃组织抽提出待检测DNA的数目；

2）罗氏沼虾诺蒂病毒的LAMP扩增：

①根据待检测DNA的数目，设置所需LAMP反应管数N，N=样品数+2，其中l管为阳性对照，l管为阴性对照；

②吸取所述的LAMP预反应液的体积为N×23 μL，加入一洁净的1.5mL离心管中，然后加入NμL Bst DNA聚合酶，混合均匀，1500～2000转/分钟离心10秒，取上清之混合液；

③向设定的N个LAMP反应管数中分别加入24uL步骤②得到的混合液，得到N个PCR反应管，向上述N个PCR反应管内按顺序依次分别加入阴性对照、待检DNA模板和阳性对照各luL；

④在上述步骤③得到的反应管中再分别加入30uL LAMP反应稳定液，盖紧管盖并做好标记，2000转/分钟离心5秒；

⑤在63℃下恒温反应30分钟；

3）显色检测：

取出经步骤2）的反应管，冷却至室温，2000转/分钟离心5秒，按照阴性对照、待检样品和阳性对照的顺序依次分别加入l uL LAMP反应显色液，轻轻混匀，直接用肉眼观察颜色变化或1.5%琼脂糖凝胶进行电泳后用溴化乙锭染色后进行观察。

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