CN107058633A

CN107058633A - 一种鲤鱼浮肿病毒可视化快速检测试剂盒及其检测方法

Info

Publication number: CN107058633A
Application number: CN201710427557.7A
Authority: CN
Inventors: 潘晓艺; 沈锦玉; 蔺凌云; 袁雪梅; 徐洋; 姚嘉赟; 尹文林; 郝贵杰
Original assignee: Zhejiang Institute of Freshwater Fisheries
Current assignee: Zhejiang Institute of Freshwater Fisheries
Priority date: 2017-06-08
Filing date: 2017-06-08
Publication date: 2017-08-18

Abstract

本发明公开了一种鲤鱼浮肿病毒可视化快速检测试剂盒及其检测方法，其中，鲤鱼浮肿病毒可视化快速检测试剂盒包括病毒DNA提取试剂和反应试剂，所述的反应试剂中含有用于检测鲤鱼浮肿病毒扩增用核酸引物组，该引物组包含引物CEV‑F3、引物CEV‑B3、引物CEV‑FIP、引物CEV‑BIP、引物CEV‑LpF和引物CEV‑LpB；本发明的快速诊断试剂盒建立了一套经过优化的等温扩增反应体系，不但使得鲤鱼浮肿病毒定性检测更加简便快速、特异性高、灵敏度高，而且该试剂盒是检测鲤鱼浮肿病毒的第一个试剂盒，填补了鲤鱼浮肿病毒无检测方法的缺口，具有很高的科研和经济价值。

Description

一种鲤鱼浮肿病毒可视化快速检测试剂盒及其检测方法

技术领域

本发明属于靶基因片断的快速检测领域，具体地说，涉及一种鲤鱼浮肿病毒可视化快速检测试剂盒及其检测方法。

背景技术

鲤鱼浮肿病毒(Carp edema virus，CEV)是引起鲤鱼浮肿病和锦鲤昏睡病(Koisleepy disease，KSD)的病原，严重危害鲤鱼和锦鲤的健康养殖，疾病导致的死亡率高达80-100％。鲤鱼浮肿病是由属于痘病毒科的鲤鱼浮肿病毒引起的，该病已在全球迅速蔓延，于2016年被首次发现传入中国。该病发生期间，病鱼在水面下昏迷，或者躺在池底，症状主要表现为眼球内陷、鳃增生和肛门溃疡性炎症，在发病后的2周内死亡。

鲤鱼浮肿病毒作为我国新发传染病的病原，国际上缺乏针对鲤鱼浮肿病毒的高灵敏检测试剂盒，已不能满足该病毒引起疾病的检疫和预防工作。因此该病毒检测试剂盒的开发和检测技术的研究显得尤为重要。

发明内容

有鉴于此，本发明针对上述的问题，提供了一种鲤鱼浮肿病毒可视化快速检测试剂盒及其检测方法，本发明的试剂盒特异性强，敏感性高；本发明鲤鱼浮肿病毒快速检测方法利用所述试剂盒检测，该方法方便、灵敏、准确、快速。

为了解决上述技术问题，本发明公开了一种用于检测鲤鱼浮肿病毒扩增用核酸引物组，该引物组包含引物CEV-F3、引物CEV-B3、引物CEV-FIP、引物CEV-BIP、引物CEV-LpF和引物CEV-LpB；

所述的引物CEV-F3的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；

所述的引物CEV-B3的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；

所述的引物CEV-FIP的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；

所述的引物CEV-BIP的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示；

所述的引物CEV-LpF的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示；

所述的引物CEV-LpB的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示。

本发明还公开了一种鲤鱼浮肿病毒可视化快速检测试剂盒，包括病毒DNA提取试剂和反应试剂，所述的反应试剂中含有上述的用于检测鲤鱼浮肿病毒扩增用核酸引物组。

进一步地，反应试剂具体包括以下组分：

a)预反应液：20mM pH为8.8的Tris-HC1、8mM硫酸镁、15mM氯化钾、10mM硫酸按、0.l2％Tween-20、1.4mM dNTP、0.6M甜菜碱、0.2μM引物CEV-F3、0.2μM引物CEV-B3、1.6μM引物CEV-FIP、1.6μM引物CEV-BIP、0.8μM引物CEV-LpF和0.8μM引物CEV-LpB；

b)反应酶：每微升含8个活性单位的Bst 3.0DNA聚合酶；

c)反应封闭液：由矿物油或液体石蜡油组成；

d)反应显色液：含有10％SYBR Green I的荧光染料。

进一步地，病毒DNA提取试剂包含以下组分：成分为80mM Tris、50mMEDTA、500mMNaCl、1.5％SDS、0.01％β-巯基乙醇的pH 8.0的裂解液A；Tris饱和酚，pH8.0；乙酸钠水溶液，浓度3mol/L；无水乙醇；DEPC水配置的含75％无水乙醇的洗液A；DEPC水。

本发明还公开了一种利用上述的鲤鱼浮肿病毒的可视化快速检测试剂盒进行检测的方法，包括以下步骤：

1)DNA抽提：取鱼鳃丝或肾脏组织30-80mg于2mL离心管中，采用权利要求4所述的病毒DNA提取试剂进行DNA提取；

2)对鲤鱼浮肿病毒基因进行扩增；

3)对步骤2)中得到的扩增产物进行显色检测。

进一步地，步骤1)中取鱼鳃丝或肾脏组织30-80mg于2mL离心管中，采用上述的病毒DNA提取试剂进行DNA提取具体为：取鲤鱼脾脏或心脏组织30-80mg于2mL离心管中，于冰上用研磨棒研磨，加600μL裂解液A后，继续研磨充分后加600μLpH值8.0的Tris饱和酚，强烈振荡，11000g离心10min，取上清液，重复酚抽提；取上清液，加入0.1倍体积的浓度为3mo1/L的乙酸钠，混匀，再加两倍体积的冰冷无水乙醇，混匀后低温静置10min，15000g离心5min，弃上清，沉淀用75％乙醇洗涤2次，室温干燥5～10min后以30μL DEPC水重悬，-80℃保存备用。

进一步地，步骤2)中对鲤鱼浮肿病毒基因进行扩增具体为：

2.1)根据待检测样品的数目，设置所需反应管数N，N＝样品数+2，其中l管为阳性对照，l管为阴性对照；

2.2)吸取所述的预反应液的体积为N×22μL，加入一洁净的1.5mL离心管中，然后加入N μL反应酶，混合均匀，1500～2000rpm离心10秒，取上清之混合液；

2.3)向设定的N个反应管中分别加入23μL步骤2.2)得到的混合液，得到N个PCR反应管，向上述N个PCR反应管内按顺序依次分别加入阴性对照、待检DNA模板和阳性对照各2μL；

2.4)在上述步骤2.3)得到的反应管中再分别加入30μL反应封闭液，盖紧管盖并做好标记，2000rpm离心5秒；

2.5)在65℃下恒温反应50min。

进一步地，所述阳性对照为含有鲤鱼浮肿病毒基因的质粒；所述阴性对照为无核酸去离子水。

进一步地，步骤3)中对步骤2)中得到的扩增产物进行显色检测具体为：取出经步骤2)的反应管，冷却至室温，2000rpm离心5秒，按照阴性对照、待检样品和阳性对照的顺序依次分别加入lμL反应显色液，轻轻混匀，直接用肉眼观察颜色变化，绿色判断为阳性，浅黄色为阴性，观察结束后将反应管装入密封袋，丢弃至特定区域。

与现有技术相比，本发明可以获得包括以下技术效果：

1)本发明根据靶基因序列设计了鲤鱼浮肿病毒检测用引物组，能特异性识别靶序列上的六个独立区域，在Bst 3.0 DNA聚合酶的作用下启动循环链置换反应，并且只有在4条引物完全识别靶序列六个结合区的情况下才能顺利进行，所以本发明的引物组在很大程度上减少了扩增反应的背景影响，大大增强了鲤鱼浮肿病毒检测的特异性；

2)采用本发明的引物组对鲤鱼浮肿病毒进行检测，因为特异性高，所以可以根据是否扩增就能判断目标基因的存在与否；

3)本发明的快速诊断试剂盒是利用等温扩增技术快速检测鲤鱼浮肿病毒，检测灵敏度高，扩增模板仅需14拷贝；

4)本发明的快速诊断试剂盒不但反应条件温和，且所需仪器简单，也不需要特殊试剂，克服了传统PCR固有的检测时间长、容易污染及检测成本高等缺点；

5)本发明的快速诊断试剂盒扩增快速且高效，在不到1h即可完成扩增，且产率高；

6)本发明的快速诊断试剂盒鉴定简便，从dNTP析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的Mg²⁺结合，产生副产物——焦磷酸镁沉淀，可通过肉眼观察鉴定，并且加入显色液后，阴阳性结果显色差异显著，验证率高，更加明显可靠；

7)本发明的快速诊断试剂盒操作简单，对检测人员的技术素质要求较低，可建立成本低廉的快速筛选体系，实现现场高通量快速检测；

8)本发明的快速诊断试剂盒建立了一套经过优化的等温扩增反应体系，不但使得鲤鱼浮肿病毒定性检测更加简便快速、特异性高、灵敏度高，而且该试剂盒是检测鲤鱼浮肿病毒的第一个试剂盒，填补了鲤鱼浮肿病毒无检测方法的缺口，具有很高的科研和经济价值。

当然，实施本发明的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有技术效果。

附图说明

此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本发明的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：

图1是本发明引物特异性测试图；其中，1：鲤鱼浮肿病毒核酸；2：鲤疱疹II型病毒核酸；3：鲤疱疹III型病毒核酸；4：鲤春病毒核酸；5：罗氏沼虾双顺反子病毒核酸；6：草鱼出血病病毒核酸；7：嗜水气单胞菌核酸；8：健康鲤鱼DNA阴性对照；9：鲤鱼浮肿病毒基因阳性质粒对照；

图2是本发明灵敏性检测图；其中，1.1.4×10⁵copies；2.1.4×10⁴copies；3.1.4×10³copies；4.1.4×10²copies；5.1.4×10copies；6.1.4copies；7.健康鲤鱼DNA阴性对照。

具体实施方式

以下将配合实施例来详细说明本发明的实施方式，藉此对本发明如何应用技术手段来解决技术问题并达成技术功效的实现过程能充分理解并据以实施。

本发明的思路为：本发明采用链置换酶和等温扩增技术，通过检测鲤鱼浮肿病毒特定基因，来检测鲤鱼浮肿病毒，这是目前国内外首次建立的快速CEV检测方法。该方法的建立为鲤鱼浮肿病和锦鲤昏睡病的监测和预防奠定基础。

实施例1 鲤鱼浮肿病毒可视化快速检测试剂盒

鲤鱼浮肿病毒可视化快速检测试剂盒包括病毒DNA提取试剂和反应试剂，该试剂盒仅需常规离心机和水浴锅就可以完成核酸提取和检测，并且整个检测过程仅需2小时，检测产物封闭观察，不会污染环境，此外，检测结果可以通过肉眼观察颜色变化，就可以判断结果，实用强。

其中，病毒DNA提取试剂包括以下组分：80mM Tris、50mM EDTA、500mM NaCl、1.5％质量百分比的SDS、0.01％体积百分比β-巯基乙醇的pH 8.0的裂解液A；Tris饱和酚，pH8.0；乙酸钠水溶液，浓度3mol/L；无水乙醇；DEPC水配置的含75％无水乙醇的洗液A；DEPC水。

反应试剂含有用于检测鲤鱼浮肿病毒扩增用核酸引物组，该引物组包含引物CEV-F3、引物CEV-B3、引物CEV-FIP、引物CEV-BIP、引物CEV-LpF和引物CEV-LpB；

所述的引物CEV-F3的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；

所述的引物CEV-B3的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；

所述的引物CEV-FIP的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；

所述的引物CEV-BIP的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示；

所述的引物CEV-LpF的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示；

所述的引物CEV-LpB的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示。

实施例2 利用实施例1所述的鲤鱼浮肿病毒可视化快速检测试剂盒进行检测的方法

(1)DNA抽提：

取鲤鱼脾脏或心脏组织30-80mg于2mL离心管中，于冰上用研磨棒研磨，加600μL裂解液A后，继续研磨充分后加600μLpH值8.0的Tris饱和酚，强烈振荡，11000g离心10min，取上清液，重复酚抽提；取上清液，加入0.1倍体积的浓度为3mo1/L的乙酸钠水溶液，混匀，再加两倍体积的冰冷无水乙醇，混匀后低温静置10min，15000g离心5min，弃上清，沉淀用DEPC水配置的含75％无水乙醇的洗液A洗涤2次，室温干燥5～10min后以30μL DEPC水重悬，-80℃保存备用，其中，裂解液A含有80mM Tris、50mM EDTA、500mM NaCl、1.5％SDS、0.01％β-巯基乙醇，pH 8.0。

(2)鲤鱼浮肿病毒基因的快速扩增：

根据待检测样品的数目，设置所需快速反应管数N，N＝样品数+2，其中l管为阳性对照(含有鲤鱼浮肿病毒基因的质粒)，l管为阴性对照(无核酸去离子水)；吸取预反应液的体积为N×23μL，加入一洁净的1.5mL离心管中，然后加入N μL反应酶，混合均匀，1500～2000rpm离心10秒，向设定的N个反应管中分别加入24μL混合液，并向N个PCR反应管内按顺序依次分别加入阴性对照、待检DNA模板和阳性对照各lμL；然后在每个反应管中再分别加入30μL封闭液，盖紧管盖并做好标记，2000rpm离心5秒；在65℃下恒温反应50min。

(3)显色观察：

取出经步骤(2)的反应管，冷却至室温，2000rpm离心5秒，按照阴性对照、待检样品和阳性对照的顺序依次分别加入lμL显色液，轻轻混匀，直接用肉眼观察颜色变化，若显示绿色，说明样品中含有鲤鱼浮肿病毒核酸，显示为浅黄色则无鲤鱼浮肿病毒核酸。

上述预反应液含有：20mM pH为8.8的Tris-HC1、8mM硫酸镁、15mM氯化钾、10mM硫酸按、0.l2％Tween-20、1.4mM dNTP、0.6M甜菜碱、0.2μM引物CEV-F3、0.2μM引物CEV-B3、1.6μM引物CEV-FIP、1.6μM引物CEV-BIP、0.8μM引物CEV-LpF和0.8μM引物CEV-LpB，其中所述的引物CEV-F3序列如SEQ ID NO：1所示；所述的引物CEV-B3序列如SEQ ID NO：2所示；所述的引物CEV-FIP序列如SEQ ID NO：3所示；所述的引物CEV-BIP序列如SEQ ID NO：4所示；所述的引物CEV-LpF的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示；所述的引物CEV-LpB的核苷酸序列如SEQID NO：6所示。

实施例3 试剂盒特异性检测

(1)DNA抽提：

取鲤鱼浮肿病毒阳性鲤鱼组织样品30-80mg于2mL离心管中，于冰上用研磨棒研磨，加600μL裂解液A后，继续研磨充分后加600μLpH值8.0的Tris饱和酚，强烈振荡，11000g离心10min，取上清液，重复酚抽提；取上清液，加入0.1倍体积的浓度为3mo1/L的乙酸钠水溶液，混匀，再加两倍体积的冰冷无水乙醇，混匀后低温静置10min，15000g离心5min，弃上清，沉淀用DEPC水配置的含75％无水乙醇的洗液A洗涤2次，室温干燥5～10min后以30μLDEPC水重悬，-80℃保存备用。

(2)鲤鱼浮肿病毒基因的快速扩增：

设置9个快速反应管数，吸取预反应液的体积为9×22μL，加入一洁净的1.5mL离心管中，然后加入9μL反应酶，混合均匀，1500～2000rpm离心10秒，向设定的9个反应管中分别加入23μL混合液，并向9个PCR反应管内按顺序依次分别加入健康鲤鱼DNA阴性对照、鲤鱼浮肿病毒核酸、鲤疱疹II型病毒核酸、鲤疱疹III型病毒核酸、鲤春病毒核酸、罗氏沼虾双顺反子病毒核酸、草鱼出血病病毒核酸、嗜水气单胞菌核酸和鲤鱼浮肿病毒基因阳性质粒对照各2μL；然后在每个反应管中再分别加入30μL封闭液，盖紧管盖并做好标记，2000rpm离心5秒；在65℃下恒温反应50min。

(3)显色观察：

取出经步骤(2)的反应管，冷却至室温，2000rpm离心5秒，按照阴性对照、待检样品和阳性对照的顺序依次分别加入lμL显色液，轻轻混匀，直接用肉眼观察颜色变化，若显示绿色，说明样品中含有鲤鱼浮肿病毒核酸，显示为浅黄色则无鲤鱼浮肿病毒核酸。检测结果如附图1所示,仅鲤鱼浮肿病毒和鲤鱼浮肿病毒基因模版扩增后显色为阳性绿色，其它病毒或细菌显色都为阴性浅黄色，表明对其它病毒和细菌无交叉扩增性。

实施例4试剂盒灵敏度检测

(1)DNA模板设置：

取已被定量的鲤鱼浮肿病毒DNA样品进行梯度稀释，设置鲤鱼浮肿病毒核酸拷贝数浓度分别为：1.4×10⁵copies、1.4×10⁴copies、1.4×10³copies、1.4×10²copies、1.4×10copies、1.4copies和健康鲤鱼DNA阴性对照；-80℃保存备用。

(2)鲤鱼浮肿病毒基因的快速扩增：

设置7个快速反应管数，吸取预反应液的体积为7×22μL，加入一洁净的1.5mL离心管中，然后加入7μL反应酶，混合均匀，1500～2000rpm离心10秒，向设定的7个反应管中分别加入23μL混合液，并向7个PCR反应管内按顺序依次分别加入健康鲤鱼DNA阴性对照和待检6个稀释度的鲤鱼浮肿病毒DNA样品各2μL；然后在每个反应管中再分别加入30μL封闭液，盖紧管盖并做好标记，2000rpm离心5秒；在65℃下恒温反应50min。

(3)显色观察：

取出经步骤(2)的反应管，冷却至室温，2000rpm离心5秒，按照阴性对照、待检样品和阳性对照的顺序依次分别加入lμL显色液，轻轻混匀，直接用肉眼观察颜色变化，若显示绿色，说明样品中含有鲤鱼浮肿病毒核酸，显示为浅黄色则无鲤鱼浮肿病毒核酸。检测结果如附图2所示,经Real-timePCR定量后的鲤鱼浮肿病毒DNA系列稀释的扩增显色图，当反应体系中加入14个病毒拷贝的DNA，扩增显色结果就为阳性。说明该试剂盒检测灵敏度可达14个拷贝的病毒核酸。

上述说明示出并描述了发明的若干优选实施例，但如前所述，应当理解发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述发明构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离发明的精神和范围，则都应在发明所附权利要求的保护范围内。

SEQUENCE LISTING

<110> 浙江省淡水水产研究所

<120> 一种鲤鱼浮肿病毒可视化快速检测试剂盒及其检测方法

<130> 2017

<160> 6

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

agcaacaact tgacgagg 18

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

aactagagag actagaagtt gc 22

<210> 3

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ggcatacact tattctccag atcattttgt atatcttgag aagcagc 47

<210> 4

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ttaggattga agcaagagct gctttttgtt ggagatggtg gtaac 45

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

tggaattgta gcaggtggag 20

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

gcactcttag gaggacaagt aa 22

Claims

1.一种用于检测鲤鱼浮肿病毒扩增用核酸引物组，其特征在于，该引物组包含引物CEV-F3、引物CEV-B3、引物CEV-FIP、引物CEV-BIP、引物CEV-LpF和引物CEV-LpB；

所述的引物CEV-F3的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；

所述的引物CEV-B3的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；

所述的引物CEV-FIP的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；

所述的引物CEV-BIP的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示；

所述的引物CEV-LpF的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示；

所述的引物CEV-LpB的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示。

2.一种鲤鱼浮肿病毒可视化快速检测试剂盒，其特征在于，包括病毒DNA提取试剂和反应试剂，所述的反应试剂中含有权利要求1所述的用于检测鲤鱼浮肿病毒扩增用核酸引物组。

3.根据权利要求2所述的鲤鱼浮肿病毒可视化快速检测试剂盒，其特征在于，所述反应试剂具体包括以下组分：

b)反应酶：每微升含8个活性单位的Bst 3.0DNA聚合酶；

c)反应封闭液：由矿物油或液体石蜡油组成；

d)反应显色液：含有10％SYBR Green I的荧光染料。

4.根据权利要求2所述的鲤鱼浮肿病毒可视化快速检测试剂盒，其特征在于，所述病毒DNA提取试剂包含以下组分：成分为80mM Tris、50mM EDTA、500mM NaCl、1.5％SDS、0.01％β-巯基乙醇的pH 8.0的裂解液A；Tris饱和酚，pH8.0；乙酸钠水溶液，浓度3mol/L；无水乙醇；DEPC水配置的含75％无水乙醇的洗液A；DEPC水。

5.一种利用权利要求2所述的鲤鱼浮肿病毒的可视化快速检测试剂盒进行检测的方法，其特征在于，包括以下步骤：

2)对鲤鱼浮肿病毒基因进行扩增；

3)对步骤2)中得到的扩增产物进行显色检测。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤1)中取鱼鳃丝或肾脏组织30-80mg于2mL离心管中，采用权利要求4所述的病毒DNA提取试剂进行DNA提取具体为：取鲤鱼脾脏或心脏组织30-80mg于2mL离心管中，于冰上用研磨棒研磨，加600μL裂解液A后，继续研磨充分后加600μLpH值8.0的Tris饱和酚，强烈振荡，11000g离心10min，取上清液，重复酚抽提；取上清液，加入0.1倍体积的浓度为3mo1/L的乙酸钠，混匀，再加两倍体积的冰冷无水乙醇，混匀后低温静置10min，15000g离心5min，弃上清，沉淀用75％乙醇洗涤2次，室温干燥5～10min后以30μL DEPC水重悬，-80℃保存备用。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤2)中对鲤鱼浮肿病毒基因进行扩增具体为：

2.2)吸取所述的预反应液的体积为N×22μL，加入一洁净的1.5mL离心管中，然后加入NμL反应酶，混合均匀，1500～2000rpm离心10秒，取上清之混合液；

2.5)在65℃下恒温反应50min。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述阳性对照为含有鲤鱼浮肿病毒基因的质粒；所述阴性对照为无核酸去离子水。

9.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤3)中对步骤2)中得到的扩增产物进行显色检测具体为：取出经步骤2)的反应管，冷却至室温，2000rpm离心5秒，按照阴性对照、待检样品和阳性对照的顺序依次分别加入lμL反应显色液，轻轻混匀，直接用肉眼观察颜色变化，绿色判断为阳性，浅黄色为阴性，观察结束后将反应管装入密封袋，丢弃至特定区域。