CN104046687B - 一种Leber遗传性视神经病变基因诊断试剂盒或试剂 - Google Patents

一种Leber遗传性视神经病变基因诊断试剂盒或试剂 Download PDF

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Abstract

本发明涉及医药领域，具体涉及一种Leber遗传性视神经病变(Leber’s？hereditary？optic？neuropathy,LHON)基因诊断试剂盒或试剂，包括PCR引物混合液:所述的引物混合液包括用来封闭野生型线粒体(没有发生突变的正常人的线粒体)的脱氧核糖核酸(Deoxyribonucleic？acid，缩写为DNA)的肽核酸(pentose？nucleic？acid，缩写为PNA)探针和扩增突变型线粒体DNA的正反向引物，该发明操作简便，灵敏度高，特异性好，是一种高效、灵敏、稳定、特异的Leber遗传性视神经病变基因诊断检测技术。

Description

一种Leber遗传性视神经病变基因诊断试剂盒或试剂
技术领域
本发明属于医药试剂领域，尤其是涉及一种基因检测或诊断试剂盒。
背景技术
Leber遗传性视神经萎缩(Leber’shereditaryopticneuropathy,LHON)是一种主要累及青年人的常见眼科疾病，平均发病年龄27岁-34岁，但也有小于1岁或大于70岁发病的。患者一般表现为急性或亚急性的视觉损失，先是涉及一侧眼，后发展到双侧眼的高度近视甚至视觉完全丧失。临床检查患者视野中心暗点、视神经乳头周围血管屈张。分子水平上的研究发现线粒体基因组(mtDNA)的突变是导致该病发生的主要原因。
到1988年Wallance及其同事才首次报道了与LHON相关的线粒体烟酰胺腺嘌呤二核苷酸脱氢酶亚基4基因(NADH亚基4,缩写为ND4)G11778A点突变，该点突变导致了线粒体呼吸链NADH脱氢酶复合体Ⅰ的第4个亚基340位高度保守的精氨酸变为组氨酸。之后又在其他家系中依次发现了ND1(NADH亚基1,缩写为ND1)G3460A，ND6(NADH亚基6,缩写为ND6)T14484C这两个点突变。这三个点突变的存在都能单独导致LHON的发生，而且这三个点突变在家系中发现的点突变中出现的概率也是比较高的，因此被称为三个原发性LHON突变。在北欧有超过95％的家系携带这三个原发突变，在其他一些国家和地区也做了统计，发生ND4G11778A的有80％，ND1G3460A的33％-67％，ND6T14484C有68％。在家系中同时还发现了大量的次级突变，它们所起的作用还不是十分清楚，因为它们不像原发性突变一样出现的频率高，作用明显。推测次级突变可能在疾病的发生上起到了修饰的作用。例如在ND4G11778A点突变单独存在的情况下，家系中LHON的外显率是很低的，有家系报道在T3394C存在的情况下，疾病的外显率提高很多。临床检查中我们还发现在携带G11778A位点点突变的个体中，只有半数的男性和10％的女性才会表现出视觉损伤。对于这种现象的解释，我们认为可能原发突变对于疾病的发生是必需的，但又不足以导致视觉的损伤。
Leber遗传性视神经病变的早期临床诊断困难，与视神经炎的症状相似，所以目前基因诊断成为确诊该病的一个必不可少的手段。该病的发病机制是线粒体DNA出现突变。由于DNA的具有遗传异质性。每位患者体内的DNA突变的比例都是有不一样的。现在报道的一些方法各有缺点，很难满足临床需要。聚合酶链反应(PolymeraseChainReaction,PCR)直接测序法虽然被认为是检测基因突变的金标准，但是其灵敏度只有10％-20％，对于突变率较低的患者不能检出，容易造成误诊。等位基因特异性PCR被广泛应用于基因突变的检测，但是由于大量野生线粒体DNA的干扰，其灵敏度只能达到1％.其他非主流方法如SSCP-PCR(PCR-single-strandconformationpolymorphism,SSCP)，RFLP-PCR(RestrictionFragmentLengthPolymorphism，RFLP-PCR)等，在操作时间、操作简便性、抗污染、灵敏度方面都存在较大的缺陷。
专利CN1143117，公开Leber氏遗传性视神经病变检测方法及其试剂盒，该发明仅针对线粒体DNAG11778A点突变的患者，需要溶血液经过变性提取总DNA，PCR扩增目的基因片断以及SfaNI限制性内切酶消化和电泳等繁琐的步骤，不仅耗时而且增加了相应的费用。专利CN1288254C公开了Leber氏遗传性视神经病变的基因诊断试剂盒及其检测方法，能够同时检测3个原发性治病位点突变(T14484C，G3460A和G11778A)，但是其没有排除大量野生线粒体DNA的干扰，其灵敏度低。
因此，建立一个操作简便，灵敏度高，特异性好的的Leber遗传性视神经病变基因诊断检测技术是迫不及待的。同时，尚未有能够排除大量野生线粒体DNA的试剂盒及试剂的报道。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明采用PNA技术，通过的设计的PNA探针封闭掉大量的野生的线粒体DNA，只扩增突变的线粒体DNA，使其灵敏度和特异性大大提高。并且和定量PCR技术相结合，在3-4小时即可以完成Leber遗传性视神经病变3个主要突变位点的检测，该发明操作简便，灵敏度高，特异性好，是一种高效、灵敏、稳定、特异的Leber遗传性视神经病变基因诊断检测技术。
本发明通过以下技术方案实现的：
一种Leber遗传性视神经病变基因诊断试剂盒或试剂，包括PCR引物混合液，所述的引物混合液包括用来封闭野生线粒体DNA的PNA探针和扩增突变线粒体DNA的正反向引物。
上述所述的正向和反向引物的使用的终浓度范围为0.05-1μmol/L，PNA使用的终浓度为10-100nmol/L。
优选上述所述的物混合液包括用来封闭野生型线粒体DNA的PNA探针和扩增突变线粒体DNA的正反向引物，其中正向和反向引物的使用的浓度范围为0.5μmol/L，PNA使用的浓度为50nmol/L。
所述的野生线粒体DNA是指没有发生突变的正常人的线粒体。
所述PNA(PeptideNucleicacid),即多肽核酸，所述的PNA探针设计如下：以检测位点为中心向序列两端各延伸7-9个碱基，总长度为15-18碱基，用Giesen等提出的估算PNA-DNA杂交体Tm值的公式计算出Tm值，通过实验优选出一条在不降低灵敏度的情况下，能充分封闭野生线粒体DNA的序列。
本发明所述的用来封闭野生线粒体DNA的PNA探针是用来封闭线粒体DNA反义链的3460位点的野生DNA的SEQNo：1所示的寡核苷酸序列。
本发明所述的用来封闭野生线粒体DNA的PNA探针是用来封闭线粒体DNA反义链的11778位点的野生DNA的SEQNo：2所示的寡核苷酸序列。
本发明所述的用来封闭野生线粒体DNA的PNA探针是用来封闭线粒体DNA反义链的14484位点的野生DNA的SEQNo：3所示的寡核苷酸序列。
本发明所述的正反向引物是检测线粒体基因ND1G3460A点突变的正反向引物，分别是SEQNo：4和SEQNo：5所示的寡核苷酸序列。用于扩增含有3460位点的DNA序列。
本发明所述的正反向引物是检测线粒体基因ND1G11778A点突变的正反向引物，分别是SEQNo：6和SEQNo：7所示的寡核苷酸序列。用于扩增含有11778位点的DNA序列。
本发明所述的正反向引物是检测线粒体基因ND1G14484C点突变的正反向引物，分别是SEQNo：8和SEQNo：9所示的寡核苷酸序列。用于扩增含有14484位点的DNA序列。
为了更好的实现本发明：
优选所述的PCR引物混合液包括下述三组中的一组或一组以上，多组之间按照等比例组成。
具体包括:
用来封闭线粒体DNA反义链的3460位点的野生DNA的SEQNo：1和检测线粒体基因ND1G3460A点突变的正反向引物分别是SEQNo：4、SEQNo：5所示的寡核苷酸序列、
和/或用来封闭线粒体DNA反义链的11778位点的野生DNA的SEQNo：2和检测线粒体基因ND1G11778A点突变的正反向引物分别是SEQNo：6、SEQNo：7所示的寡核苷酸序、
和/或用来封闭线粒体DNA反义链的14484位点的野生DNA的SEQNo：3和检测线粒体基因ND1G14484C点突变的正反向引物分别是SEQNo：8、SEQNo：9所示的寡核苷酸序列。
本发明所述的试剂盒或试剂，其中还包括PCR混合反应液。
所述的PCR混合反应液可以市购，如TransStartTMGreenqPCRSuperMix(2X)，也可以按照下述组分及比例自行配制
所述的PCR混合反应液包括dNTP，PCR缓冲液、taq酶、荧光染料。
所述的dNTP，是deoxy-ribonucleosidetriphosphate(脱氧核糖核苷三磷酸)的缩写，其是包括dATP,dGTP,dTTP,dCTP,dUTP等在内的统称，N是指含氮碱基，代表变量指代A、T、G、C、U等中的一种。在生物DNA、RNA合成中，以及各种PCR(RT-PCR、Real-timePCR)中起原料作用。
所述的PCR缓冲液：Tris-HClpH8.52-50mM、KCl10-200mM、MgCl21-10mM、Tween200.05％～1％。
所述的Taq酶即TaqDNA聚合酶。
所述的荧光染料包括但不限于Green，SYBRGreen，EvaGreen，SyberGreenⅠ等，优选SyberGreenⅠ染料。
本发明优选PCR混合反应液的成分为:Tris-HClpH8.52-50mM、KCl10-200mM、MgCl21-10mM、Tween200.05％～1％、taq酶0.1-0.5u/ul、SyberGreenⅠ0.01％-0.1％、dNTP0.1-0.5mM。
本发明最佳PCR混合反应液的成分为：Tris-HClpH8.5100mM、KCl50mM、MgCl22.5mM、Tween200.1％、taq酶0.2u/ul、SyberGreenⅠ0.05％、dNTP0.2mM。
本发明所述的试剂盒或试剂，优选包括PCR混合反应液与PCR引物混合液体积比4-1:1-4，优选PCR混合反应液与PCR引物混合液体积比2-1:1-3，最佳为1:1或2:1或2:3。
本发明所述的试剂盒或试剂还包括阳性对照、阴性对照。优选阴性对照品为野生线粒体DNA，阳性对照品为线粒体第3460、11778和14484突变位点的质粒的混合物。(附图3,4)
本发明所述的DNA扩增长度，对于3460位点，正向引物的设计区域可选择线粒体3300-3450碱基位置，反向引物的设计区域可选择3470-3600。优选正向引物的设计区域为3400-3450，反向引物的设计区域为3470-3520。最佳的正向引物为3400-3422序列，即SEQNo：4；反向引物为3481-3500碱基序列，即SEQNo：5。扩增片段长度100bp。
对于11778位点，正向引物的设计区域可选择线粒体11600-11760碱基位置，反向引物的设计区域可选择11780-11900。优选正向引物的设计区域为11700-11760，反向引物的设计区域为11790-11850。最佳的正向引物为11701-11718序列，即SEQNo：6；反向引物为11804-11820碱基序列，即SEQNo：7。扩增片段长度120bp。
对于14484位点，正向引物的设计区域可选择线粒体14350-14460碱基位置，反向引物的设计区域可选择14500-14600。优选正向引物的设计区域为14400-14460，反向引物的设计区域为14500-14550。最佳的正向引物为14423-14440序列，即SEQNo：6；反向引物为14510-14528碱基序列，即SEQNo：9。扩增片段长度105bp。
本发明所述的PNA探针、表1所示的引物、染料、酶、dNTP、溶剂等为市购或专业公司合成。
表1PNA探针及引物DNA序列表
有益效果
为了更好的说明本发明的有益效果，通过下述试验例加以说明。
试验例一封闭野生线粒体3460位置PNA序列筛选过程
方法：PNA探针设计如下：以检测位点为中心向序列两端各延伸7-9个碱基，总长度为15-18碱基，用Giesen等提出的估算PNA-DNA杂交体Tm值公式计算出Tm值，通过实验优选出一条在不降低灵敏度的情况下，能充分封闭野生线粒体DNA的序列。我们设计、合成了3条序列PNA序列1即SEQNo：1，PNA序列2：H2N-ttcgctgacgccataaa-N2H，PNA序列3：H2N-cgctgacgccataaaac-N2H。使用引物的序列为SEQNo：4和SEQNo：5.将三条PNA序列分别加入含有10ng野生线粒体DNA和0.1ng突变型线粒体的反应液中，进行荧光PCR反应。另外将三条PNA序列分别加入含有10ng野生线粒体DNA的反应液中，也进行荧光PCR反应。结果如图1所示，SEQNo：1H2N-tcgctgacgccataaaa-N2H的效果最好，能够完全封闭掉野生的DNA，对突变型DNA也能检测出。PNA序列2的封闭效果不好，野生的线粒体也能够扩增。PNA序列3的灵敏度不行，突变型的DNA没有扩增出来。
结论：本发明精心设计的PNA序列可以在不影响灵敏度的情况下完全抑制住野生DNA，排除了野生DNA的干扰。
试验例二本发明的检测方法与直接测序法的试验及对比数据数据
方法：以扩增11778位点为例。用野生型线粒体DNA为母液，稀释11778突变型线粒体DNA，使突变的线粒体的量占野生型线粒体的比例为50％、10％、5％、1％和0.1％。用上面的DNA作为模板，进行检测，结果如图2所示：0.1％的突变也能够检测出来。
结论：本发明试剂盒检测的特异性和灵敏度大大提高，灵敏度可以达到0.1％，远远高于测序法的10％-25％的灵敏度。检测时间短，3-4个小时即可以完成检测。
试验例三本发明试剂盒对短链DNA的数据
本发明的三条最优引物扩增的片段大小分别为100bp、120bp和105bp。所以该试剂盒对短链DNA(120bp以上)也有很好扩增效果。
综上，本发明精心设计的PNA序列可以完全抑制住野生DNA，排除了野生DNA的干扰。另外我们筛选后确定的扩增引物序列在不同的DNA浓度下都没有二聚体的非特异性扩增。二者使试剂盒检测的特异性和灵敏度大大提高，灵敏度可以达到0.1％，远远高于测序法的10％-25％的灵敏度。检测时间短，三个突变位点一次反应，3-4个小时即可以完成检测。本发明的试剂可以在大多数荧光定量PCR机型上运行。本试剂盒对短链DNA(50-150bp)也可以获得理想的检测结果。
附图说明
图1:封闭野生线粒体3460位置PNA序列筛选结果图
图2:本发明的检测方法与直接测序法的试验及对比数据数据
图3：阴性对照扩增图,
图4：阳性对照扩增图
图5：12号样本，CT值23.2，11778突变。
图6：29号样本，CT值24.6，11778突变。
图7：8号样本，CT值21，14484突变。
图8:21号样本，CT值27.5，3460突变。
上述附图中所述AmplificationCurves为扩增曲线；Fluorescence为荧光强度；Cycles为循环数。
具体实施方式
下述实施例仅仅是详细描述本发明，所述实施例仅是意图举例说明本发明，而不是意图限制本发明的范围。
实施例1本发明的Leber遗传性视神经病变基因诊断试剂盒
表2该试剂盒的组成(10人份)
试剂盒组份 体积 作用
1、TransStartTM Green qPCR SuperMix(2X) 200ul PCR反应混合液
2、Primer solutionⅠ 100ul 检测3460突变的引物混合物
3、Primer solutionⅡ 100ul 检测11778突变的引物混合物
4、Primer solutionⅢ 100ul 检测14484突变的引物混合物
5、negtive control(1ng/ul) 50ul 阴性对照
6、positive control(0.2ng/ul) 50ul 阳性对照
表3其中PrimersolutionⅠ的DNA序列为：
表4其中PrimersolutionⅡ的序列为：
表5其中PrimersolutionⅢ的序列为：
实施例2
取实施1的试剂盒按下列方式进行：取30份临床血样，样品首先使用DNA提取试剂盒提取样本DNA，并将DNA的量调整为1ng/ul。每次检测都要使用Negtivecontrol和Positivecontrol作为对照。
1)按下列方式配置反应体系(20ul)，混匀置于Chromo4定量PCR上：
加样方式如下：
1号样本需反应管3管，每管检测一个突变点。其他样本以此类推2-30号样本。
阴性对照反应管3管
阳性对照反应管3管
2)按一下条件进行PCR反应
在延伸反应后检测SyberGreen1荧光。
3结果判定
1)阈值设定
综合分析仪器给出的各项结果，基线(baseline)以仪器给出的默认值作为参考，阈值(threshold)设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照样品扩增曲线的最高点为准，具体还需根据仪器噪声情况进行调整。
2)质控
阴性对照应无ct值，阳性对照的ct值应≤30，且呈现s型典型扩增曲线。否则，此次实验视为无效。
3)荧光PCR结果分析判定
阴性反应结果判定：检测结果呈现无ct值、无扩增曲线或反应曲线无明显对数增长期，判为荧光PCR阴性反应。
阳性反应结果判定：检测结果呈现ct值≤35、且扩增曲线有明显的对数增长期，判为荧光PCR阳性反应。
对于35<Ct值<40的样品，需重新取样进行重复检测。如果重复检测的ct值<40，且曲线有明显的对数增长期，判为阳性反应。否则判为荧光PCR阴性反应。
4、检测结果
30份样本，共检测出11778突变2份(图5、图6)，14484突变1份(图7)，3460突变1份(图8)。

Claims (8)

1.一种Leber遗传性视神经病变基因诊断试剂盒或试剂，是由PCR混合反应液与PCR引物混合液组成，其中所述的PCR引物混合液包括用来封闭野生线粒体DNA的PNA探针和扩增突变线粒体DNA的正反向引物，具体为
用来封闭线粒体DNA反义链的3460位点的野生DNA的PNA探针SEQNo：1和检测线粒体基因ND1G3460A点突变的正反向引物SEQNo：4、SEQNo：5所示的寡核苷酸序列；
用来封闭线粒体DNA反义链的11778位点的野生DNA的PNA探针SEQNo：2和检测线粒体基因ND4G11778A点突变的正反向引物SEQNo：6、SEQNo：7所示的寡核苷酸序列；
用来封闭线粒体DNA反义链的14484位点的野生DNA的PNA探针SEQNo：3和检测线粒体基因ND6T14484C点突变的正反向引物SEQNo：8、SEQNo：9所示的寡核苷酸序列。
2.如权利要求1所述的诊断试剂盒或试剂，其特征在于，所述的正向和反向引物的使用的终浓度范围为0.05-1μmol/L，PNA使用的终浓度为10-100nmol/L。
3.如权利要求1所述的诊断试剂盒或试剂，其特征在于，所述的正向和反向引物的使用的浓度范围为0.5μmol/L，PNA使用的浓度为50nmol/L。
4.如权利要求1所述的诊断试剂盒或试剂，其特征在于，所述PCR混合反应液的成分为:
5.如权利要求1所述的诊断试剂盒或试剂，其特征在于，所述PCR混合反应液的成分为：
6.如权利要求1所述的诊断试剂盒或试剂，是由PCR混合反应液与PCR引物混合液体积比4-1:1-4组成。
7.如权利要求6所述的诊断试剂盒或试剂，是由PCR混合反应液与PCR引物混合液体积比2-1:1-3组成。
8.如权利要求7所述的诊断试剂盒或试剂，是由PCR混合反应液与PCR引物混合液体积比1:1或2:1或2:3组成。
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