CN104884636B - Hbv对肝细胞癌癌症患者临床结果的影响 - Google Patents

Hbv对肝细胞癌癌症患者临床结果的影响 Download PDF

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Abstract

提供了预测肝细胞癌患者的预后(临床结果)的方法，其基于在此类患者的生物样品中检测乙型肝炎病毒、测定HBV基因型、鉴定HBV基因型菌株及其整合入基因组。

Description

HBV对肝细胞癌癌症患者临床结果的影响
本申请要求于2012年10月30日提交的新加坡专利申请第201208024-8号的优先权权益，其内容在此为了所有目的通过引用以其整体并入。
发明领域
本申请涉及使用来自患者样品中乙型肝炎病毒(HBV)的存在、基因型和毒株来测定肝细胞癌(HCC)患者的临床结果的方法。具体地，本发明涉及HCC患者的预后。
发明背景
肝细胞癌(HCC)是全球第5大最常见的实体瘤，并且在男性和女性中分别是第3和第6大最常见的癌症死因。HCC患者具有较高的死亡率和较高的复发率。较早确定HCC存活和HCC复发的能力是重要的。
当前，最常见的HCC诊断方法是基于测量血清甲胎蛋白(AFP)水平结合肝超声波检查。已发现超声波检查筛选符合成本效益，但是在肝硬化患者中仅具有60％灵敏度和97％特异性1。血清AFP仅在40-60％的HCC患者极晚期阶段上升或根本不产生AFP。
因为预期许多HCC病例由HBV和丙型肝炎病毒(HCV)诱导，所以患者样品中的HBV和HCV可以是临床结果的良好指标。对于HCV，之前的报道显示基因型增加了发展HCC的风险2，3。对于HBV，一些之前的报道显示HBV基因型可能在确定HBV-诱导的肝病的严重性和进程方面是重要的4。然而，尚未有结论性的结果。已知与HBV基因型B相比，HBV基因型C与HCC的较高风险相关，其可能与延迟性HBeAg血清转化、更活动性肝炎和基本核心启动子突变的更高患病率相关5，6，7。已知HBV基因的前核心(G1896A)和核心启动子(A1762T，G1764A)突变与成人中的免疫阶段变化或疑难性肝病进程相关。在前核心区核苷酸1856至1858处具有TCC的HBV可能代表了相比其它HBV基因型C毒株，与更具有攻击性的肝病相关的特定HBV毒株8。Sung等证明了与基因型B和Cs相比，HBV基因型Ce与HCC和肝硬化的更高风险相关9。然而，所述结果在统计学上不显著。
随着公众健康意识的发展，HCC在早期阶段受到了医疗关注，而早起阶段通常很难使用传统的诸如肿瘤多结节性和血管侵入的组织病理学测量来确定预后。
此外，所有之前的报告仅公开了基因型与HCC和/或肝硬化风险之间的关系。目前对HBV基因型与其它临床参数如存活率和复发率之间的关系没有可靠的指导。
发明概述
本公开提供了针对患者的肝细胞癌(HCC)的临床结果进行预后的方法，所述方法包括以下步骤：a)检测从所述患者获得的样品中乙型肝炎病毒(HBV)的存在；b)鉴定所述样品中的所述HBV的基因型；和c)基于经检测的HBV基因型的鉴定，针对HCC的临床结果进行预后。
定义
本部分意在提供对以下示出的词汇和短语(及其适当的语法变体)的解释的指导。对如本文所用的某些词汇和短语(及其适当的语法变体)的解释的进一步指导可另外见于本说明书的其它部分。
在本文中说明性描述的本发明可适于在没有本文未具体公开的任何元素、限制时实施。因此，例如，术语“包含/包括”、“包括”、“含有”等应当扩展性且无限制地理解。此外，将本文所采用的术语和表达用作描述而非限制的术语，并且使用此类术语和表达时并非意图排除任何显示和描述的特性或其部分的等同物，但应认识到，在本发明所要求的范围内的各种修改是可能的。因此，应理解的是，尽管通过优选的实施方案和任选的特性具体公开本发明，但是本领域技术人员可采用本文公开的其中实施的本发明的修改和变化，并且此类修改和变化被认为在本发明的范围内。
如在本文说明书和权利要求书中所使用，“或”应当被理解为具有与如以上所定义的“和/或”相同的含义。例如，当将各项目分为一列时，“或”或“和/或”应当被理解为是包括性的，即包括许多或一列元素的至少一个，但也包括多于一个，和任选地，另外的未列出项目。仅在明确指明有相反情况，诸如“仅之一”或“确切的之一”或当用于权利要求中时“由……组成”，是指确切包括许多或一列元素中的一个元素。通常，如本文所用的术语“或”，当前缀有排他性术语诸如“两者中任何一个”，“之一”、“仅之一”或“确切的之一”时，应仅被理解为指示互斥替代品(即“一个/种或另一个/种，但不是两个/种”)。“基本上由……组成”当用于权利要求中时，应具有其在专利法领域中所用的常见含义。
如在本文的说明书和权利要求书中所使用，指代一列一个或多个元素的短语“至少一个/种”应被理解为至少一个元素选自元素列表的一个或多个元素，但不必需包括所述元素列表内具体列出的各个和每一个元素的至少一个，并不排除所述元素列表的元素的任何组合。该定义还允许元素可任选地存在而不是所述元素列表内具体鉴定的元素，对于其短语“至少一个”是指与那些具体鉴定的元素是否相关或不相关。因此，作为非限制性实例，“A和SET的至少一个(或等同地，“A或B的至少一个”，或等同地，“A和/或B的至少一个”)”在一实施方案中可指至少一个、任选地包括多于一个A而无B存在(和任选地包括除了B之外的元素)；在另一实施方案中可指至少一个、任选地包括多于一个B而无A存在(和任选地包括除了A之外的元素)；在再一实施方案中可指至少一个、任选地包括多于一个A和至少一个、任选地包括多于一个B(和任选地包括其它元素)；等。
如本文所用的术语“HCC”包括所有形式的HCC，包括I期、II期、III期(亚类IIIA、IIIB和IIIC)和IV期(亚类IVA和IVB)HCC。任选地，HCC可为：(a)I期；(b)II期；(c)I或II期；(d)II或III期；(e)I、II或III期；(f)II、III或IV期；或(g)I、II、III或IV期。
如本文所用的术语“患者”包括人患者和其它哺乳动物，并且包括患有或已患有HCC的任何个体或需要使用本发明的方法进行分析或治疗的个体。在本发明范围内的合适的哺乳动物包括但不限于，灵长类动物、家畜(如绵羊、牛、马、驴、猪)、实验室试验动物(如兔、小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠)、伴侣动物(如猫、狗)以及圈养的野生动物(如狐狸、鹿、澳州野狗)。优选地，患者是人患者。患者可为雄性或雌性。任选地，患者可针对HCC进行治疗，例如实验治疗。患者可患有I期、II期、III期(亚类IIIA、IIIB和IIIC)和IV期(亚类IVA和IVB)HCC。任选地，患者是：(a)I或II期患者；(b)II或III期患者。
如本文所用的术语“预后”，包括指代预测归因于HCC的死亡或进程的可能性，包括复发、Edmondson分级、静脉浸润、肿瘤大小、总存活和无病存活、静脉浸润、肝硬化及其它组织学异常。
如本文所用的术语“核酸”，表示包含一个或多个核苷酸或寡核苷酸或其片段的分子，包括但不限于RNA或DNA核苷酸或其组合。
如本文所用的术语“分离的”，意指核苷酸序列，例如基因、引物或寡核苷酸或其它序列基本上或实质上不含其它核酸或其它杂质。
如本文所用的术语“扩增子”、“经扩增的产物”或“扩增产物”是指扩增反应的产物。扩增子的实例是作为PCR、实时PCR、逆转录-PCR、竞争性RT-PCR、连接酶链反应(LCR)、缺口LCR、链替代扩增反应(SDA)、基于核酸序列的扩增(NASBA)、转录介导的扩增(TMA)、滚环扩增(RCA)等的结果产生的核苷酸序列。
术语“引物”在本文中用于意指能够用作例如PCR或RCA技术中的引物的任何单链寡核苷酸序列。因此，根据本公开的“引物”是指能够作为引物延伸产物合成的起始位点的单链寡核苷酸序列，其与待复制的核酸链基本上相同(对于正向引物)或基本上是待复制的核酸链的反向补体(对于反向引物)。引物可适用于例如，PCR技术中。单链包括，例如由单链核苷酸序列形成的发夹结构。引物的设计，例如其长度和特异性序列，取决于靶核苷酸序列的性质和使用引物的条件，例如温度和离子强度。
引物可由本文所述的核苷酸序列组成，或者可为包含或落入本文所述的序列范围内的10、15、20、25、30、35、40、45、50、75、100或更多个核苷酸，前提是它们在严格的条件下适于特异性结合靶核酸序列。在一实施方案中，引物序列的长度小于35个核苷酸，例如引物序列的长度小于34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11或10个核苷酸。可对引物或探针的长度或序列进行轻微修改以在给定情况下维持所需的特异性和灵敏度。在本公开的一实施方案中，本文所述的探针和/或引物的长度可例如在任一方向上延伸1、2、3、4或5个核苷酸，或者减少1、2、3、4或5个核苷酸。可使用本领域熟知的任何方法合成引物序列。
如本文所用的术语“扩增”，是指用于扩增特定靶核苷酸序列的扩增反应，例如酶介导的反应。通过扩增靶核苷酸序列，所述反应产生了许多拷贝的靶核苷酸序列，以产生扩增子、经扩增的产物或扩增产物。扩增反应的一个实例是“聚合酶链反应(PCR)”。PCR是在热循环仪的协助下，在含有聚合酶的酶、一组引物(例如一组正向和反向引物及可能需要的任何另外的引物)以及四种脱氧核糖核苷三磷酸-(dNTP)的混合物中进行。
如本文所用的术语“生物材料”或“生物样品”，是指任何材料或样品，其包括如本文所定义的分析物。例如，此类样品可包括源自以下或包括以下的样品：粪便、全血、血清、血浆、泪液、唾液、鼻液、痰、耳液、生殖器液、乳液、乳、初乳、胎水、羊膜液、汗液、滑液、腹水液、脑脊液、胆汁、胃液、眼房水、玻璃体液、胃肠液、渗出液、漏出液、胸膜液、心包液、精液、上呼吸道流体、腹膜液、从免疫应答部位收集的流体、从汇集的收集部位收集的流体、支气管灌洗液、尿液、如来自所有适合的器官(如肺、肌肉、脑、肝脏、皮肤、胰腺、胃等)的活检材料、有核细胞样品、与粘膜表面、头发或皮肤相关的流体。
术语“治疗”、“治疗性干预”和“疗法”可在本文中互换使用(除非上下文中另外说明)，并且这些术语是指治疗性治疗和预防性或防止性措施，其中目标是试图和预防或减缓(减轻)靶向的病理学疾病或病症。在肿瘤治疗中，治疗可直接降低肿瘤细胞的病状，或使肿瘤细胞对其它治疗剂的治疗(如辐射和/或化疗)更敏感。肿瘤治疗的目标或结果可包括，例如以下的一个或多个：(1)抑制(即减少、减缓或完全终止)肿瘤生长；(2)减少或消除症状或肿瘤细胞；(3)减小肿瘤大小；(4)抑制肿瘤细胞浸润至相邻的周围器官和/或组织中；(5)抑制转移；(6)增强抗肿瘤免疫应答，其可以但非必须导致肿瘤消退或排斥；(7)增加存活时间；和(8)降低治疗后特定时间点的死亡率。治疗可需要用单一药剂或药剂组合物(两种以上)来治疗。在本文中所用的“药剂”泛指，例如药物/化合物或治疗的其它方式，如放射治疗或手术。治疗的实例包括手术干预、肝移植、免疫疗法、用特定药物或药物组合物的化疗、放疗、综合性治疗、饮食、维生素疗法、激素疗法、基因疗法、细胞疗法、抗体疗法等。术语“治疗”还包括实验治疗，如在药物筛选或临床试验期间。
此外，将本文采用的术语和表达用作描述而非限制的术语，并且使用此类术语和表达并非意图排除任何显示和描述的特性或其部分的等同物，但应认识到，在本发明所要求的范围内的各种修改是可能的。因此，应理解的是，尽管通过优选的实施方案和任选的特性具体公开本发明，但是本领域技术人员可采用本文公开的其中实施的本发明的修改和变化，并且此类修改和变化被认为在本发明的范围内。
在本文中广泛且一般地描述了本发明。落入一般公开的较窄种类和亚群组中的每一种也形成本公开的一部分。这包括从属中去除任何主题的附带条件或否定限制的本发明的一般描述，不管去除的材料是否在本文具体列举。
任选实施方案的公开内容
现在描述针对患者中肝细胞癌(HCC)的临床结果进行预后的方法的示例性非限制性实施方案。在一实施方案中，所述方法可包括以下步骤：(a)检测获自所述患者获得的样品中乙型肝炎病毒(HBV)的存在；(b)鉴定所述样品中的所述HBV的基因型；以及(c)基于所检测的HBV基因型的鉴定，针对HCC的临床结果进行预后。
在一实施方案中，所述检测HBV的所述基因型的存在的步骤可进一步包括检测所述HBV基因型是否已整合入所述患者的基因组中。
在一实施方案中，所述确定所述HBV基因型是否已整合入所述基因组中的步骤可进一步包括鉴定所述HBV基因型是否已整合入所述基因组的一种或多种基因中。在一实施方案中，所述一种或多种基因可选自hTERT、MLL4、CCNE1、SENP5和ROCK1。在一实施方案中，所述一种或多种基因可为hTERT、MLL4或CCNE1。
在一实施方案中，所述样品可包含获自生物材料的核酸。
在一实施方案中，所述核酸可选自单链或双链RNA或DNA分子、cDNA和基因组DNA。在一实施方案中，所述核酸可为基因组DNA。
在一实施方案中，所述生物材料可选自新鲜组织、冷冻组织、石蜡保存的组织和/或乙醇保存的组织的样品。在另一实施方案中，生物材料可选自全血或其组分、淋巴、胆汁液、脑脊液、支气管肺泡灌洗液、滑液、精液、腹水瘤液、乳汁、羊膜液、颊部涂片和脓。
在一实施方案中，HBV的基因型可选自HBV基因型A、HBV基因型B、HBV基因型C、HBV基因型D、HBV基因型E、HBV基因型F、HBV基因型G和HBV基因型H。
在一实施方案中，HBV基因型A可选自亚型A1、A2和A3。
在一实施方案中，HBV基因型B可选自亚型B1、B2、B3和B4。在一实施方案中，HBV基因型B可为HBV-B2。
在一实施方案中，HBV基因型D可选自亚型D1、D2、D3和D4。
在一实施方案中，HBV基因型F可选自亚型F1和F2。
在一实施方案中，HBV基因型C可选自亚型C1、C2、C3、C4和C5。在另一实施方案中，HBV基因型C可选自CHN-H155、GZ-DYH、CHN-H172、HK2100、HK858和I182及其变体，包括其生物活性变体。在又一实施方案中，HBV基因型C可为CHN-H155。在一实施方案中，CHN-H155可包含突变C2288A。
在一实施方案中，核酸样品可通过聚合酶链反应扩增成一个或多个扩增子。在一实施方案中，所述一个或多个扩增子可进行测序。在一实施方案中，可将所述一个或多个扩增子的序列与已知的HBV基因型的序列比较，以确定样品中的HBV基因型。
在一实施方案中，HBV毒株可选自CHN-H155、GZ-DYH、CHN-H172、HK2100、HK858、I182和HBV-B2。
在一实施方案中，针对临床结果进行预后的步骤可包括相对于具有另一HBV基因型的患者，使所述患者样品中的所述HBV的基因型与一种或多种因素相关联，所述一种或多种因素与所述患者中的所述HBV基因型有关。
在一实施方案中，所述一种或多种因素可选自HBV基因组整合、所述患者的基因组数据、所述样品中鉴定的HBV毒株的突变状态或转录组图谱的一种或多种。
附图简述
当结合非限制性实施例和附图时，参考详述将更好地理解本发明。附图说明了公开的实施方案，并用来解释所公开实施方案的原则。然而，应理解的是，所述附图仅被设计用于说明的目的，而非对本发明的界限进行定义。
图1是88名HCC患者的84名中鉴定的7个HBV毒株的系统发生树。所述88名患者被诊断患有HCC，并在玛丽医院(中国香港)进行根治性原发性肝切除术或肝移植。
图2是GZ-DYH、CHN-H155和CHN-172的存活率曲线。图2(a)描绘了与具有其它HBV基因型的HCC患者相比，20名携带有HBVGZ-DYH的HCC患者的总存活曲线。图2(b)和(c)描绘了与具有其它HBV基因型的HCC患者相比，31名携带有HBV CHN-H155的HCC患者的总存活和疾病存活曲线。图2(d)描绘了与具有其它HBV基因型的HCC患者相比，6名携带有HBV CHN-H172的HCC患者的无病存活曲线。
附表简述
表1.HBV毒株、基因型和临床数据之间的关系总结。临床数据包括在玛丽医院(中国香港)的88名被诊断患有HCC且进行了根治性原发性肝切除术或肝移植的中国患者的静脉浸润、复发、总存活和无病存活、Edmondson分级和组织学。
表2.HBV毒株、基因型和基因组变异之间的关系总结。表达亚类S1、S2和S3是基于Hoshida等所定义的基因标志。p53SNP和CTNNB1SNP代表了p53和CTNNB1基因上的单核苷酸多态性。
表3.具有不同HBV毒株的HCC患者的HBV整合数目。
表4.具有不同HBV毒株的HCC患者的HBV整合位置。所述位置在基因的外显子、内含子或启动子区中。
表5.携带有不同HBV毒株的HCC患者的潜在治疗和预防方案。
实验部分
本发明的非限制性实施例，包括最佳模式和比较实施例，将通过参考特定实施例进一步更详细地描述，其不应被理解为以任何方式限制本发明的范围。
实施例1-HBV对HCC癌症患者的临床结果的影响
材料和方法
患者样品和数据准备
将玛丽医院(中国香港)的总共88名被诊断患有HCC且进行了根治性原发性肝切除术或肝移植的中国患者纳入本研究中。给予所有患者如Hao等10之前所述使用肿瘤(T)和非肿瘤(N)肝组织进行研究的书面知情同意书。根据如Xu11等之前所报道的方法纯化基因组DNA用于至少30倍覆盖率的双末端(PE)测序。
对每个基因组DNA样品构建具有不同插入大小的两个测序文库。通过超声发生器Covaris E-210(Covaris，Woburn，MA)将DNA片段化。通过调整成相关的最佳剪切参数，将DNA片段设置为170bp和800bp峰处浓缩，用于它们的相关文库。将这些片段纯化、末端钝化、加“A”尾和连接适配子。在凝胶中大小选择后，进行10至12个循环的PCR。文库的浓度通过生物分析仪(Agilent Technologies，Santa Clara，CA)和使用ABI StepOne Plus实时PCR系统(Life Technologies，Carlsbad，CA)的qPCR方法进行定量。为了在流动池和精确信号捕获中获得最佳聚类数，将170bp和800bp文库以2∶3的比率上样至流动池。双末端90bp读长测序是用HiSeq 2000测序仪根据制造商的说明进行的(Illumina，San Diego，CA)。
测定每个样品中的HBV毒株
对于每个样品，回收不能定位至hg19的双末端读长(reads)。使用BLAST，将那些双末端读长定位到1901HBV完全基因组。将每个读长的最佳命中分配到各自的HBV基因组。基于命中数目和覆盖率，将最佳HBV毒株分配给样品。
统计学分析
进行统计学分析以确定每个HBV毒株是否影响基因组数据和临床数据，特别是Edmondson分级、静脉浸润、复发率、肿瘤大小、总存活和无病存活。对于分离数据，进行费希尔精确检验(Fisher exact test)以检测所述数据和HBV毒株之间是否存在任何关系。对于存活和无病存活，进行Kaplan-Meier分析。
结果
从88名患者中产生HBV毒株
在88名患者中，有84名发现了HBV毒株。对于84名患者中的81名，在肿瘤和相邻的非肿瘤中预测的HBV毒株是相同的。未预测HBV毒株的4个样品全部是HbsAg阴性样品。证据均表明所述方法可从样品中精确地鉴定正确的HBV毒株。在84个样品中，鉴定出7种不同的HBV毒株：CHN-H155、HBV-B2、GZ-DYH、CHN-H172、HK2100、HK858和I182。这些HBV毒株分别由31名、23名、20名、6名、2名、1名和1名HCC患者携带。表1总结了在所述患者中鉴定出的7种HBV毒株的细节。图1显示了7种HBV菌株的系统发生树。除了含有HBV-B2的23个样品是基因型B，剩余的样品都是基因型C。
与HBV整合的相关性
对于相同的88个样品，Sung等在那些基因组中发现了399个HBV整合。一个问题是不同的HBV毒株是否具有不同的HBV整合模式。首先检测了HBV毒株是否影响HBV整合频率。参考表3，携带有CHN-H155的患者倾向于具有更多的HBV整合(p-值＝0.000223)。发现CHN-H155优先整合入启动子(p-值＝0.013)和内含子(p-值＝0.087)区中(表4)。携带有HBV-B2的患者倾向于具有更少的HBV整合(p-值＝0.006397，表3)。最后，对于携带有CHN-H172的患者，HBV倾向于整合入基因间区(p-值＝0.063，表4)。
然后，研究不同的HBV毒株是否具有有差别的优选整合区。根据Sung等，存在3种复发性HBV整合。它们是HBV-TERT、HBV-MLL4和HBV-CCNE1。
表2显示了取决于HBV毒株的这些HBV整合的分布。发现CHN-H155毒株优先整合在TERT基因附近。在具有HBV-TERT整合的18名患者中，他们中的13个携带有CHN-H155(p-值＝0.000404)。对于携带有HBV-B2的患者，HBV优先整合在MLL4基因附近。在9名具有HBV-MLL4整合的患者中，他们中的5名携带有HBV-B2(p-值＝0.04854)。
表3.具有不同HBV毒株的HCC患者的HBV整合数目
表4.具有不同HBV毒株的HCC患者的HBV整合位置
与患者的基因组数据的相关性
研究了HBV毒株和点突变之间的关系。HCC中的两个关键突变基因是p53和CTNNB1。具有HBV-B2的患者更可能具有p53突变(比值比＝2.008，p-值＝0.1285，表2)。对于具有GZ-DYH的患者，他们更不可能具有CTNNB1突变(比值比＝4.49，p-值＝0.1167)。
然后，研究了HBV毒株是否与转录组相关。使用Hoshida等定义的基因标志13(细分为3个类别S1、S2和S3)，之前已经测定了88个样品的基因表达谱12。表2显示了S1、S2和S3针对不同HBV毒株的分布。观察到具有CHN-H155和GZ-DYH的患者不可能具有基因标志亚类S2(p-值分别＝0.0304和0.0977)。另一方面，具有HBV-B2的患者可能具有基因标志亚类S2(p-值＝0.03473)，但不可能具有亚类S3(p-值＝0.0163)。这些数据显示，HBV毒株影响HCC患者的转录组性质。
与患者的临床结果的相关性
接着，研究了HBV毒株和临床结果之间的关系。图2描绘了具有GZ-DYH、CHN-H155和CHN-172毒株的患者的存活曲线。携带CHN-H155的患者比具有GZ-DYH和CHN-H172毒株的患者具有更好的存活。
复发性和静脉浸润更可能在携带有CHN-H172的患者中出现(p-值分别＝0.01303和0.03323)。另一方面，复发性和静脉浸润更不可能在携带有CHN-155的患者中出现(p-值分别＝0.006756和0.07714)。考虑到所述患者携带有特定类型的HBV毒株，计算患者具有复发性和静脉浸润的机会。携带有CHN-H172、GZ-DYH和HBV-B2的患者具有复发性和静脉浸润的机会更大(p-值＝0.0、0.02384和0.1837)，而携带有CHN-155的患者更可能不具有复发性和静脉浸润(p-值＝0.178)。
还研究了其它临床参数，并且一些重要的关联如下。携带有GZ-DYH的患者具有硬化的机会更大(p-值＝0.01959，表1)。携带有HBV-B2的患者具有更大的肿瘤(p-值＝0.05546)，并且他们的Edmondson分级可能是低分化的(p-值＝0.02964，表1)。
CHN-H155和HBV-TERT整合的突变C2288A
在携带有CHN-H155的31名患者中，他们中的13名具有HBV-TERT整合。研究了HBV-TERT整合是否与CHN-H155中的突变特别是经鉴定的C2288A突变相关。这种突变影响了CHN-H155上的前核心/核心蛋白并且将密码子“CCC”(编码非极性脯氨酸，P)突变为“ACC”(编码极性苏氨酸，T)。观察到该突变显著减小了HBV-TERT整合的机会(p-值＝0.02，比值比＝6.2)。在31个样品中，它们的15个具有突变C2288A。这15个样品中仅3个具有HBV-TERT整合。这15个样品与临床结果不具有显著的相关性。
对于不具有C2288A突变的其余16个样品，它们中的10个具有HBV-TERT整合，这与临床结果显著相关。在这些患者样品中，这些样品中不存在静脉浸润(p-值＝0.0507)，未观察到复发率(p-值＝0.00412)，并且总存活和无病存活良好(p-值分别＝0.00518和0.00456)。
通过核酸测序或适合的PCR方法检测HBV毒株。
为了在鉴定HBV毒株期间增加置信度，可使用如Naito等14所述的引物来确定样品是否具有基因型B或C。
讨论
携带有不同HBV菌株的HCC患者具有不同的基因组谱，这继而产生不同的临床结果。一种观察是HBV的临床结果不仅仅取决于基因型。例如，尽管CHN-H155和GZ-DYH都具有亚基因型Cs，但CHN-H155和GZ-DYH具有不同的临床结果。CHN-H155携带者具有更好的存活和更低的复发，而GZ-DYH携带者倾向于具有最差的存活和更多的复发。
特别地，本公开更理解了CHN-H155的机制。在88个样品中，31名患者携带CHN-H155。在这31名患者中，他们中的13名具有HBV-TERT整合。因为仅存在18个样品具有HBV-TERT整合，所以携带有CHN-H155的患者具有HBV-TERT整合的风险更高(通过费希尔精确检验p-值为0.000404)。这些样品的表达谱大部分是S3(13名中的10名)。具有表达谱S3的患者具有更好的存活。这解释了为何CHN-H155携带者具有更好的存活(注意：在18名具有HBV-TERT整合的患者中，他们中的3名、2名和13名分别处于S1、S2和S3。因此，具有HBT-TERT的患者可能具有表达谱S3。)
此外，鉴定CHN-H155上的突变C2288A以确定具有HBV-TERT整合的风险。在31名患者中，他们中的16名不具有该突变，并且他们倾向于具有HBV-TERT整合(10个案例，p-值＝0.02)。
该研究表明，对于HBV携带者，知道他们所携带的确切的HBV毒株是重要的。根据HBV携带者所携带的HBV毒株，可将患者分配成不同的治疗和/或预防方案(参见表5)。
当HBV携带者发展成HCC时，HBV毒株可有助于表明潜在的治疗(参见表5)。
最后，本研究是使用来自香港的患者样品进行的，其中所述患者的HBV毒株主要是基因型C。研究来自其他亚洲国家的样品是重要的。
表5.携带有不同HBV菌株的HCC患者的潜在治疗和预防方案
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Claims (10)

1.从获自肝细胞癌(HCC)患者的样品中检测的HBV毒株基因型在制备诊断试剂中的用途，所述诊断试剂用于基于所检测HBV基因型的鉴定在体外确定所述HCC患者的治疗和/或预防方案，
其中所述毒株和基因型选自CHN-H155基因型C、GZ-DYH基因型C、CHN-H172基因型C和HBV-B2基因型B；并且
其中当检测到CHN-H155时，所述患者需要监测HBV是否整合入TERT基因中，并且如果整合已经发生，用TERT相关的药物和/或肝切除术进行治疗；
其中当检测到GZ-DYH时，所述患者需要监测HBV是否整合入MLL4基因中，并且如果整合已经发生，用p53相关的药物进行治疗；
其中当检测到HBV-B2时，所述患者需要监测HBV是否整合入MLL4基因中以及p53基因是否突变，并且如果整合和突变已经发生，用p53相关的药物进行治疗；
其中当检测到CHN-H172时，所述患者需要用手术治疗来移除肿瘤并监测肿瘤复发。
2.如权利要求1所述的用途，其中所述样品包括获自生物材料的核酸。
3.如权利要求2所述的用途，其中所述核酸选自单链或双链RNA或DNA分子、cDNA和基因组DNA。
4.如权利要求3所述的用途，其中所述核酸是基因组DNA。
5.如权利要求2至4中任一项所述的用途，其中所述生物材料选自以下的样品：新鲜组织、冷冻组织、石蜡保存的组织和/或乙醇保存的组织。
6.如权利要求2至4中任一项所述的用途，其中所述生物材料选自全血或其组分、淋巴、胆汁液、脑脊液、支气管肺泡灌洗液、滑液、精液、腹水瘤液、乳汁、羊膜液、颊部涂片和脓汁。
7.如权利要求1所述的用途，其中所述CHN-H155包括突变C2288A。
8.如权利要求2所述的用途，其中所述核酸样品通过聚合酶链反应扩增成一个或多个扩增子。
9.如权利要求8所述的用途，其中对所述一个或多个扩增子进行测序。
10.如权利要求9所述的用途，其中将所述一个或多个扩增子的序列与已知的HBV基因型的序列相比较，以确定所述样品中的HBV基因型。
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