KR100806868B1

KR100806868B1 - Ｐｒｖ, ｐｃｍｖ 및 ｐｃｖ에 특이적인 다중 프라이머세트 및 그를 이용한 바이러스 검출 방법 및 키트

Info

Publication number: KR100806868B1
Application number: KR1020060089267A
Authority: KR
Inventors: 박봉균; 이철승
Original assignee: 재단법인서울대학교산학협력재단
Priority date: 2006-09-14
Filing date: 2006-09-14
Publication date: 2008-02-22

Abstract

본 발명은 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열을 갖는 G1 프라이머 및 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열을 갖는 G2 프라이머를 포함하는 PRV의 gG 유전자 증폭용 프라이머 세트; 서열번호 3의 뉴클레오티드 서열을 갖는 B1 프라이머 및 서열번호 4의 뉴클레오티드 서열을 갖는 B2 프라이머를 포함하는 PCMV의 gB 유전자 증폭용 프라이머 세트; 및 서열번호 5의 뉴클레오티드 서열을 갖는 pcv1 프라이머 및 서열번호 6의 뉴클레오티드 서열을 갖는 pcv2 프라이머를 포함하는 PCV의 ORF1(open reading frame 1) 유전자 증폭용 프라이머 세트를 포함하는, PRV, PCMV 및 PCV에 특이적인 다중 PCR 프라이머 세트 및 그를 이용하여 표적 서열을 검출하는 방법 및 키트를 제공한다.

다중 PCR, 슈도레이비스바이러스(PRV), 사이토메갈로바이러스(PCMV), 써코바이러스(PCV)

Description

ＰＲＶ, ＰＣＭＶ 및 ＰＣＶ에 특이적인 다중 프라이머 세트 및 그를 이용한 바이러스 검출 방법 및 키트{Multiplex primer set specific for PRV, PCMV and PCV and method and kit of detecting virus using the same}

도 1은 PRV에 대한 바이러스의 정량화를 나타내는 그래프이다. (a)는 PCMV의 정량화 결과이며, (b)는 PCV2의 정량화 결과이다.

도 2는 PRV, PCMV, 및 PCV2의 다중 PCR 검출을 나타내는 아가로스 겔 전기영동 사진이다.

도 3은 각각의 바이러스 표적 유전자에 대한 단일 PCR의 민감도를 나타내는 아가로스 겔 전기영동 사진이다.

도 4는 모든 바이러스 표적 DNA의 동시 증폭을 위한 다중 PCR의 민감도를 나타내는 아가로스 겔 전기영동 사진이다.

본 발명은 PRV, PCMV 및 PCV에 특이적인 다중 PCR 프라이머 세트 및 그를 이용한 바이러스 검출 방법 및 검출용 키트에 관한 것이다.

인간 장기와 조직의 부족으로 이식 수술은 매우 제한적으로 이루어지고 있 다. 다른 종의 장기나 조직, 세포를 이식하는 이종 이식을 인간에게 적용하게 되면, 이식용 장기나 조직, 세포의 공급 가능성을 넓혀 인간 장기 기증자의 '만성적인' 부족 현상을 해결할 수 있을 것이다. 그러나 이종 이식을 임상적으로 현실화하기 전에 풀어야 할 실질적인 문제들이 있다. 하나는 이식받은 사람의 몸이 이식된 기관을 밀어내려고 하는 거부 반응이며, 다른 하나는 이식된 기관이 종의 차이를 극복하고 새로운 신체 안에서 정상적인 기능을 할 수 있도록 보장하는 일이다. 또한 이식을 통하여 새로운 감염원이 인간에게 유입될 가능성도 최소화하여야 한다.

이종장기 이식에 사용될 동물로는 돼지가 가장 적합하다고 알려져 있으며 인간에게 질병을 일으킬 가능성을 안고 있는 돼지의 감염원 60여 종이 확인되었다. 돼지 바이러스 중 인간에게도 전파되어 문제를 일으킬 가능성이 있는 바이러스 병원체에는 PRV(슈도레이비스바이러스), PCMV(사이토메갈로바이러스) 및 PCV(써코바이러스)가 존재한다.

PRV는 헤르페스비리대(Herpesviridae) 과의 알파헤르페스비리내(Alphaherpesvirinae) 서브패밀리의 멤버이다. PRV 감염된 돼지는 높은 사망율을 갖는 신경 증상 또는 호흡 증상을 보여준다.

PCMV는 헤르페스비리대(Herpesviridae) 과에 속하는 베타-헤르페스바이러스이다. 감수성 돼지 무리에서, 상기 바이러스는 유아 및 새끼돼지 사망, 왜소, 비염 및 폐렴을 야기할 수 있다. 헤르페스바이러스는 면역억제 동안 활성화되는 원형 바이러스이다(Mueller N.J., Fishman J.A., 2004, Xenotransplantation 11, 486-490). 이식에 대한 강화된 면역 반응성의 기간 동안 잠재 헤르페스바이러스 감염의 활성화는 인간 타가이식에 대한 중요한 문제이다 (Fishman J.A., Rubin R.H., 1998, N. Engl. J. Med. 338, 1741-1751).

PCV는 써코비리대(Circovirudae) 과에서 써코바이러스(Circovirus) 속의 멤버이다. PCV에는 2가지 유전형이 존재하며, 이는 PCV 타입 I (PCVl) 및 PCV 타입 II (PCV2)이다. PCVl은 원래 돼지 신장 (PK15) 세포주(ATCC-CCL31)에서 동정되었으며(Tischer I. 등, 1982, Nature 295, 64-66), PCV2는 이유후전신소모성증후군(PMWS)과 관련된다 (Nayar G.P. 등, 1997, Can. Vet. J. 38, 385-386).

현재의 통상의 PCR 분석법은 3종류의 바이러스를 구분하기 위하여 3개의 분리된 프라이머 세트 및 3개의 반응을 필요로 한다. 대조적으로, 다중 PCR은 복수 개의 프라이머 쌍을 사용하여 단일 반응 튜브에서 복수 개의 표적 서열을 증폭할 수 있도록 한다. 다중 PCR 증폭법을 이용하여 표적 서열을 증폭하는 경우, 신속하게 표적 서열의 존재 여부를 검출할 수 있다. 그러나, 이를 위하여는 다중 PCR에 사용되는 다중 프라이머 세트는 반응 중 서로 간섭을 일으키지 않아야 한다. 따라서, 높은 민감도 및 특이성을 가지고 표적 서열을 증폭할 수 있는 다중 PCR 프라이머 세트를 선발하는 것이 필요하다. 그러나, 이종장기 이식과 관련된 여러 가지 바이러스를 한번에 검출하여 빠르고 경제적으로 진단할 수 있는 기술은 아직 이루어지지 않고 있다.

상기한 바와 같은, 종래 기술에 의하더라도, PRV, PCMV 및 PCV에 특이적인 프라이머 쌍을 포함하는 다중 프라이머 세트로서, 표적 서열을 높은 민감도와 특이성을 가지고 증폭할 수 있는 다중 프라이머 세트는 알려진 바 없다.

본 발명의 목적은 높은 민감도와 특이성을 가지고 이종이식과 관련된 돼지 바이러스 병원체를 빠르고 정확히 검출할 수 있는, PRV, PCMV 및 PCV에 특이적인 표적서열을 증폭할 수 있는 다중 프라이머 세트를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 다중 프라이머 세트를 이용하여 PRV, PCMV 및 PCV를 검출하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 다중 프라이머 세트를 포함하는 PRV, PCMV 및 PCV를 검출하는 키트를 제공하는 것이다.

본 발명은 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열을 갖는 G1 프라이머 및 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열을 갖는 G2 프라이머를 포함하는 PRV의 gG(당단백질 G) 유전자 증폭용 프라이머 세트;

서열번호 3의 뉴클레오티드 서열을 갖는 B1 프라이머 및 서열번호 4의 뉴클레오티드 서열을 갖는 B2 프라이머를 포함하는 PCMV의 gB(당단백질 B) 유전자 증폭용 프라이머 세트; 및

서열번호 5의 뉴클레오티드 서열을 갖는 pcv1 프라이머 및 서열번호 6의 뉴클레오티드 서열을 갖는 pcv2 프라이머를 포함하는 PCV의 ORF1(open reading frame 1) 유전자 증폭용 프라이머 세트를 포함하는, PRV, PCMV 및 PCV에 특이적인 다중 PCR 프라이머 세트를 제공한다.

본 발명의 다중 PCR 프라이머 세트는 PRV, PCMV 및 PCV에 각각 특이적인 프 라이머 세트, G1 및 G2, B1 및 B2, 및 pcv1 및 pcv2를 포함한다. G1 및 G2 프라이머 세트는 PRV의 gG 유전자에 특이적이며, B1 및 B2는 PCMV의 gB 유전자에 특이적이며, pcv1 및 pcv2는 PCV 타입 I 및 PCV 타입 II의 ORF1(open reading frame 1) 유전자에 특이적이다.

본 발명에 있어서 "특이적"이라는 용어는 다른 돼지 바이러스에 결합하지 않고 상기 바이러스에만 특이적으로 결합하는 것을 의미한다.

본 발명의 다중 PCR 프라이머 세트는 그를 구성하는 각 프라이머 사이에 간섭 현상 없이 3개의 표적 영역을 다중 PCR에 의하여 성공적으로 증폭하는 데 사용할 수 있다. 즉, 하나의 PCR 반응에 3가지 프라이머 세트 모두를 프라이머로 사용하여도 프라이머 이량체, 헤어핀 고리 등이 형성되지 않고, 각 프라이머 세트를 단일 PCR에 사용하였을 때 증폭되는 산물과 동일한 산물이 얻어지는 것을 의미한다. G1 및 G2 프라이머 세트를 이용한 증폭 산물은 294bp이며, B1 및 B2 프라이머 세트를 이용한 증폭 산물은 413bp이며, pcv1 및 pcv2 프라이머 세트를 이용한 증폭 산물은 565bp이다.

또한, 본 발명의 다중 PCR 프라이머 세트는 상기 바이러스를 보유하고 있는 돼지로부터 얻어진 시료로부터 유래된 게놈 DNA를 주형으로 한 다중 PCR에서 표적 핵산을 특이성 있고 높은 민감도로 증폭할 수 있다.

본 발명은 또한, 바이러스를 포함하는 시료로부터 바이러스 게놈 DNA를 추출하는 단계; 및

얻어진 게놈 DNA를 주형으로 하고 본 발명에 따른 다중 PCR 프라이머 세트를 프라이머로 한 다중 PCR을 수행하는 단계를 포함하는, 시료 중에 PRV, PCMV 및 PCV로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 바이러스의 존재 또는 부존재를 검출하는 방법을 제공한다.

본 발명의 방법은 돼지 바이러스를 포함하는 시료로부터 바이러스 게놈 DNA를 추출하는 단계를 포함한다. 상기 시료는 돼지로부터 채취된 시료, 예를 들면 PRV, PCMV 및 PCV로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 바이러스에 의하여 감염된 돼지로부터 얻어지는 시료일 수 있다. 상기 시료로부터 바이러스 게놈 DNA를 추출하는 것은 당업계에 잘 알려져 있다.

본 발명의 방법은 또한, 얻어진 게놈 DNA를 주형으로 하고 본 발명에 따른 다중 PCR 프라이머 세트를 프라이머로 한 다중 PCR을 수행하는 단계를 포함한다. 본 발명에 있어서 "PCR"이란 당업계에 잘 알려져 있는 것으로, 표적 핵산을 주형으로 사용하고, 상기 표적 핵산에 특이적인 프라이머를 사용하여, 변성, 어닐링 및 연장 반응의 과정을 반복함으로써 표적 핵산을 증폭하는 과정을 의미한다. 또한, "다중 PCR"이란 PCR에 사용되는 프라이머 2 세트 이상이 하나의 증폭 반응에 사용되는 것을 의미한다. 다중 PCR에 의하면, 2 이상의 표적 핵산을 하나의 반응에서 증폭할 수 있다.

본 발명의 방법에 있어서, 상기 다중 PCR 산물의 크기를 분석하는 단계를 더 포함한다. 다중 PCR 산물의 크기는 당업계에 알려진 임의의 방법이 사용될 수 있다. 예를 들면, 아가로스 또는 폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의하여 표적 크기 마커와의 비교를 통하여 증폭 산물의 크기를 알 수 있다. 본 발명의 방법에 있어 서, 상기 증폭 산물의 크기가 294bp, 413bp 및 565bp인 경우, 각각 PRV, PCMV 및 PCV인 것으로 판정할 수 있다.

본 발명의 방법에 있어서, 상기 다중 PCR은 93.5℃ 내지 94.5℃에서 43초 내지 47초, 59.5℃ 내지 60.5℃에서 43초 내지 47초, 71.5℃ 내지 72.5℃에서 58초 내지 62초를 30회 내지 34회 반복하는 단계, 바람직하게는 94℃에서 45초, 60℃에서 45초, 72℃에서 60초를 32회 반복하는 단계를 포함할 수 있다. 당업자는 주형의 변성 단계로서 상기 반복 사이클 전에 94℃에서 5분 정도 반응하고, 최종 연장 단계로서 상기 반복 사이클 후에 72℃에서 5분 정도 반응하는 것을 인식할 수 있다.

본 발명은 또한, 본 발명의 다중 PCR 프라이머 세트; dNTP 혼합물(dATP, dCTP, dGTP, dTTP); 내열성 중합효소; 및 PCR 완충액을 포함하는, 시료 중에 PRV, PCMV 및 PCV로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 바이러스의 존재 또는 부존재를 검출하는 키트를 제공한다. 상기 다중 PCR 프라이머 세트는 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열을 갖는 G1 프라이머 및 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열을 갖는 G2 프라이머를 포함하는 PRV의 gG 유전자 증폭용 프라이머 세트; 서열번호 3의 뉴클레오티드 서열을 갖는 B1 프라이머 및 서열번호 4의 뉴클레오티드 서열을 갖는 B2 프라이머를 포함하는 PCMV의 gB 유전자 증폭용 프라이머 세트; 및 서열번호 5의 뉴클레오티드 서열을 갖는 pcv1 프라이머 및 서열번호 6의 뉴클레오티드 서열을 갖는 pcv2 프라이머를 포함하는 PCV의 ORF1(open reading frame 1) 유전자 증폭용 프라이머 세트를 포함하는, PRV, PCMV 및 PCV에 특이적인 다중 PCR 프라이머 세트를 말한다. 내열성 중합효소는 Taq DNA 중합효소, Tth DNA 중합효소 등 시판되는 내열성 중합효소를 이용할 수 있다.

이하 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

재료 및 방법

세포 및 바이러스

연속적인 Vero 세포주 (ATCC-CCL-81)를 5% 소태아혈청, 페니실린(100 유닛/ml), 스트렙토마이신(100 ㎍/ml), 및 암포테리신 B(0.25 ㎍/ml)로 보충된 둘베코 변형 이글 배지(DMEM, WelGENE Inc.)에서 정규적으로 유지하였다. 병독성 PRV Yangsan (YS) 균주는 국립수의과학 검역원(한국)에서 제공받았다. PRV 역가측정은 Vero 세포를 이용하여 96-웰 마이크로플레이트를 이용하여 수행하였다. PRV에 대한 TCID₅₀ 을 측정하는 것은 [Gray J.: Assay for virus infection In: Virus culture, A Practical Approach, Alan J., Cann, Department of Microbiology and Immunology, University of Leicester, pp83-84]에 기재된 바와 같이 수행되었다. PCV2 DR673 균주가 이용되었다. DR673의 역가(50% 조직배양 감염량, TCID₅₀)는 10^5.0TCID₅₀/ml이었으며, 정량화 방법은 이전 보고에 기초하였다 (Yang J.S. 등, 2003, J. Vet. Diagn. Invest. 15, 369-373).

바이러스 게놈 DNA의 추출

27% 수크로스, SSC (15 mM 트리소듐 시트레이트 및 0.15 M NaCl, pH 7.0), 1 mM 에틸렌 디아민테트라아세트산(EDTA), 1% 소듐 도데실 설페이트, 및 200 ㎕/ml 프로테이나제 K를 포함하는 세포 용균 완충액(500㎕)을 200㎕의 시료 용액과 혼합하고, 상기 혼합물을 철저히 볼텍싱하고, 65℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. DNA의 추출을 이전에 기재된 바와 같이 수행하였다 (Yang J.S. 등, 2003, J. Vet. Diagn. Invest. 15, 369-373).

PCMV 및 PCV2 정량화

PRV를 연속적으로 10배 희석하였다 (10^5.5TCID₅₀/ml ~ 10^2.5TCID₅₀/ml). PCMV (OF1 균주) 및 PCV2의 미지의 역가를 또한 연속적으로 10배 내지 10⁵배 희석하였다. 각 희석액으로부터 바이러스 게놈 DNA를 이전에 기재된 바와 같이 추출하고 PCR에 의해 증폭하였다. PCR 산물을 1X 트리스 보레이트 EDTA (TBE) 완충액에서 에티디움 브로마이드(0.5 ㎍/ml)을 포함하는 1.5% 아가로스 (Sigma) 겔에서 분리하였다. 겔 밴드의 이미지를 Gel Doc를 이용하여 수득하였으며, 증폭된 DNA 밴드의 밀도를 Quantity One 정량화 분석 소프트웨어 패키지(Gel Doc XR, Gel Documentation System, Biorad)를 이용하여 측정하였다.

PRV에 대해 생성된 상대적인 OD 값을 PCMV에 대한 값과 비교하여 PCMV DNA의 양을 추론하였다. PRV PCR 밴드의 OD 값을 이용하여 표준 곡선을 만들었다. DNA 단편의 수는 동일하였지만, 밴드의 OD 값은 밴드 크기에 비례하여 증가하였다. PCMV 밴드의 각각의 OD 값을 PRV 밴드 크기/PCMV 밴드 크기 (294/413)에 의해 보정하였다. 도 1은 PRV에 대한 바이러스의 정량화를 나타내는 그래프이다. 도 1에서, (a)는 PCMV의 정량화 결과이며, (b)는 PCV2의 정량화 결과이다. PCMV DNA의 양을 도 1의 (a)에 보여준 바와 같이 각 밴드 강도를 이용하여 PRV 표준 곡선으로부터 계산하였다.

PCV2에 대한 정량화 방법은 PCMV에 대한 것과 유사하였다. 각각의 PCV2 OD 값을 PRV 밴드 크기/PCV2 밴드 크기 (294/565)에 의해 곱하였다. PRV는 이중가닥 바이러스이며, PCV2는 단일가닥 바이러스이므로, PCV2 OD 값을 2를 곱하여 보정하였다. PCV2 DNA를 도 1의 (b)에 보여준 바와 같이 각 밴드 강도를 이용하여 표준 곡선으로부터 계산하였다.

프라이머 디자인

PRV gG 유전자에 특이적인 프라이머는 [Huang C. 등, 2004, Vet. Microbiol. 101, 209-214]을 참고하여 디자인하였으며, PCMV에 특이적인 프라이머는 [Hamel A.L. 등, 1999, J. Clin. Microbiol. 37, 3767-3768]을 참고하여 디자인하였다. PCV1 및 PCV2 양자에 대해 특이적인 프라이머는 PCV 개방형해독틀 (ORF) 1 유전자에 기초하여 디자인하였다. 동일한 크기의 PCV의 검출용 프라이머 서열은 약간의 변형을 갖는 Primer 3 프로그램 (Whitehead Institute/MT Center for Genome Research)을 이용하여 수득하였다. 각 표적 유전자에 대한 PCR 프라이머 쌍 및 앰플리콘 크기를 하기 표 1에 요약한다.

표 1. 각 표적 유전자를 증폭하는데 이용되는 특이적인 프라이머 쌍

바이러스	표적 유전자	프라이머 서열(5'-3')	예상된 산물 크기
PRV	gG	GCCAGCCGTACACGCAG	294 bp
		CCGTAGCAGAGCTCCCG
PCMV	gB	CCCTGATCTTAAATGACGAGGACGTGAC	413 bp
		ACCGTCTGAGAGAGACTGAACTTCTCTGACAC
PCV	ORF 1	GCTGCCACATCGAGAAAG	565 bp
		GACAGCAGTTGAGGAGTACC

단일 PCR

단일 PCR에서, 하나의 프라이머 쌍을 이용하여 표적 바이러스를 검출하였다. 반응 혼합물은 DNA (2㎕), 10X Taq DNA 중합효소 완충액 (2.5㎕), 1.5mM MgCl₂, 2.0㎕ dNTPs (2.5 mM/㎕), 1㎕의 각각의 특이적인 프라이머 (각각 10 pmol), 및 1㎕ Taq DNA 중합효소 (Promega, USA)를 포함하였다. 증류수를 첨가하여 총 부피 25㎕로 맞추었다. PCR을 94℃, 5분에 이어, 32 사이클(94℃, 45초, 60℃, 45초, 및 72℃, 60초) 후, 72℃, 5분에서 최종 연장하고, 4℃에서 저장하였다. PCR 산물을 에티디움 브로마이드를 포함하는 1.5%-아가로스 겔 전기영동에 의해 분석하였다.

다중 PCR( mPCR )

mPCR 반응은 모든 3가지 프라이머 쌍의 혼합물을 포함하였으며, 일부 최적화와 함께 단일 PCR과 유사하게 수행하였다.

시퀀싱

수회의 필드 실험에서 mPCR로부터 수득된 크기 특이적인 PCR 산물 (294bp, 413bp 및 565bp)을 시퀀싱하여 분석의 특이성을 평가하였다. 특정 프라이머를 PCR 사이클 시퀀싱에 이용하였다. PCR 산물을 Genotech Research 사에 의뢰해 양 방향으로 완전히 시퀀싱하였다. 서열을 Clustal X (1.83) 복수 서열 정렬 프로그램을 이용하여 분석하였다.

필드 시료

이종 이식을 위한 무균동물 돼지의 생산을 연구하기 위해, 순종 Duroc 돼지를 바이러스 병원균 스크리닝을 위해 선발하였다. 돼지를 각각 3마리의 돼지의 4개의 그룹(10일-, 40일-, 70일- 및 110일-령)으로 나누었다. 바이러스 항원 검출을 위해, PRV, PCMV, 및 PCV에 대한 mPCR 방법을 각 돼지로부터 혼합된 기관(폐, 간, 심장, 신장, 비장)에 대해 수행하였다. 모든 동물 실험은 현재의 한국법에 따랐다. 동물의 관리 및 처리를 서울대 실험 동물관리위원회의 절차 및 지침서에 따라 수행하였다.

젖뗀 돼지로부터의 임상 시료를 또한 mPCR에 의해 스크리닝하였다. 폐, 간, 심장, 신장, 비장 및 림프절을 포함하는 총 30개의 필드 임상 시료를 2006년 1월에서 4월 동안 한국의 돼지 농장으로부터 무작위로 수집하였다.

시료 제조 및 DNA 추출

혼합된 조직 시료(폐, 간, 심장, 신장, 비장 및 림프절)의 균질물(20%)을 DMEM에서 제조하였다. 현탁액을 바이러스의 PCR 시험을 위해 분취하였다. DNA를 200㎕ 부피의 조직 균질물로부터 추출하였다. 추출을 바이러스 게놈 DNA의 추출과 유사하게 수행하였다.

실시예 1: 각 바이러스 표적 유전자에 대한 단일 PCR 및 mPCR 의 민감도

도 2는 PRV, PCMV, 및 PCV2의 다중 PCR 검출을 나타내는 아가로스 겔 전기영동 사진이다. 도 2에서 각 레인에 대한 설명은 하기와 같다: M: 분자량 마커, 레 인 1: PRV, YS 균주, 레인 2: PCMV, OF1 균주, 레인 3: PCV2, DR673, 레인 4: PRV+PCMV, 레인 5: PRV+PCV2, 레인 6: PCMV+PCV2, 레인 7: 음성 대조군, 레인 8: PRV+PCMV+PCV2. 10배 희석 시리즈에 대해, 양성 mPCR 결과를 갖는 가장 낮은 농도는 PRV에 대해 10^2.5TCID₅₀/ml, PCMV에 대해 10^1.8TCID₅₀/ml, PCV2에 대해 10^1.8TCID₅₀/ml 이었다. 도 3은 각각의 바이러스 표적 유전자에 대한 단일 PCR의 민감도를 나타내는 아가로스 겔 전기영동 사진이다. 도 3에서 각 레인에 대한 설명은 하기와 같다: (a) PRV; M: 분자량 마커, 레인 1~7: 단일 PCR에 대한 10배 연속 희석액 (10^5.5~10^-0.5 TCID₅₀/ml), 레인 8: 음성 대조군, (b) PCMV; M: 분자량 마커, 레인 1: 10^4.7 TCID₅₀/ml, 레인 2: 10^4.1 TCID₅₀/ml, 레인 3: 10^2.9 TCID₅₀/ml, 레인 4: 10^1.8 TCID₅₀/ml, 레인 5: 10^1.0 TCID₅₀/ml, 레인 6: 10⁰ TCID₅₀/ml, 레인 7: 10^-1.0 TCID₅₀/ml, 레인 8: 음성 대조군, (c) PCV2; M: 분자량 마커, 레인 1: 10^4.7 TCID₅₀/ml, 레인 2: 10^3.7 TCID₅₀/ml, 레인 3: 10^2.8 TCID₅₀/ml, 레인 4: 10^1.8 TCID₅₀/ml, 레인 5: 10^1.4 TCID₅₀/ml, 레인 6: 10^0.4 TCID₅₀/ml, 레인 7: 10^-0.6 TCID₅₀/ml, 레인 8: 음성 대조군. 대조적으로, 양성 단일 PCR 결과를 갖는 가장 낮 은 농도는 PRV에 대해 10^1.5TCID₅₀/ml, PCMV에 대해 10^1.0TCID₅₀/ml, PCV2에 대해 10^1.4TCID₅₀/ml 이었다. 그리하여, mPCR이 단일 PCR보다 약간 덜 민감하였다.

PRV, PCMV, 및 PCV2의 10배 연속 희석액을 이용하여 바이러스 DNA를 증폭하는 mPCR 및 단일 PCR의 민감도 수준을 비교하였다. mPCR 및 단일 PCR을 각 희석 시리즈에 대해 동시에 수행하였다. mPCR의 민감도 시험을 PRV, PCMV, 및 PCV2의 혼합된 감염에 대해 시험하였다. 도 4는 모든 바이러스 표적 DNA의 동시 증폭을 위한 다중 PCR의 민감도를 나타내는 아가로스 겔 전기영동 사진이다. 도 4에서 각 레인에 대한 설명은 하기와 같다: M: 분자량 마커, 레인 1: 10^5.5 TCID₅₀/ml(PRV), 10^4.7 TCID₅₀/ml(PCMV), 10^4.7 TCID₅₀/ml(PCV2), 레인 2: 10^4.5 TCID₅₀/ml(PRV), 10^4.1 TCID₅₀/ml(PCMV), 10^3.7 TCID₅₀/ml(PCV2), 레인 3: 10^3.5 TCID₅₀/ml(PRV), 10^2.9 TCID₅₀/ml(PCMV), 10^2.8 TCID₅₀/ml(PCV2), 레인 4: 10^2.5 TCID₅₀/ml(PRV), 10^1.8 TCID₅₀/ml(PCMV), 10^1.8 TCID₅₀/ml(PCV2), 레인 5: 10^1.5 TCID₅₀/ml(PRV), 10^1.0 TCID₅₀/ml(PCMV), 10^1.4 TCID₅₀/ml(PCV2), 레인 6: 10^0.5 TCID₅₀/ml(PRV), 10⁰ TCID₅₀/ml(PCMV), 10⁰ TCID₅₀/ml(PCV2), 레인 7: 음성 대조군.

모든 3 쌍의 프라이머를 다중 PCR의 민감도 시험에서 첨가하였다. 3 쌍의 프라이머를 동시에 이용하는 다중 PCR을 수행한 결과, PRV, PCMV, 및 PCV2 바이러스를 동시에 효율적으로 검출할 수 있었다.

실시예 2: 단일 PCR 및 mPCR 의 특이성

아가로스 겔 전기영동에 의해 측정된 증폭된 산물의 크기는 PRV에 대해 294 bp, PCMV에 대해 413 bp, 및 PCV에 대해 565 bp이었다 (도 2). 돼지 유행성설사 바이러스(PEDV), 전염성 위장염 바이러스(TGEV), 돼지 인플루엔자 바이러스(SIV) 타입 H3N2, 마이코플라즈마 하이오뉴모니애(Mycoplasma hyopneumoniae), 해모필루스 파라수이스(Haemophilus parasuis) (1, 4, 5), 보데텔라 브론키셉타카(Bordetella bronchiseptica), 파스튜렐라 멀토시다(Pasteurella multocida) (3A, 4D), 및 흉막폐렴균(Actinobacillus pleuropneumoniae) (S2, 5)를 포함하는 음성 대조군에 대해서는 어떠한 앰플리콘도 생성되지 않았다 (데이타 미제시).

따라서, 본 발명의 프라이머 세트는 PRV, PCMV 및 PCV에 대해 특이적이라는 것을 알 수 있다.

실시예 3: mPCR 에 의한 임상 시료의 스크리닝

PCMV 및 PRV는 순종 Duroc 돼지에서는 검출되지 않았으나, PCV는 40일령 이상의 모든 돼지에서 검출되었다 (총 돼지의 75%)(표 2).

표 2. mPCR에 의한 순종 Duroc 돼지로부터 수집된 혼합 기관에서 표적 바이러스의 검출

돼지의 연령	돼지 수	결과
돼지의 연령	돼지 수	PRV	PCMV	PCV
10 일	3	0	0	0
40 일	3	0	0	3
70 일	3	0	0	3
110 일	3	0	0	3
합계	12	0 (0%)	0 (0%)	9 (75.0%)

젖뗀 돼지 유래의 임상 시료를 또한 mPCR에 의해 스크리닝하였다. 모든 시료는 mPCR에 의해 PRV, PCMV, 및 PCV에 대해 시험하였다 (표 3).

표 3. 2006년 1월에서 4월까지 한국 농장으로부터 수집된 젖뗀 돼지 유래의 30개의 시료에서 바이러스 병원균의 스크리닝.

돼지의 연령	돼지 수	결과
돼지의 연령	돼지 수	PRV	PCMV	PCV	PCMV+PCV
30 일 이상	30	0	10 (33.3%)	28 (93.3%)	8 (26.7%)

순종 Duroc 돼지와 대조적으로, PCMV는 10마리의 돼지(33.3%)에서 검출되었다. PCV는 28마리의 돼지(93.3%)에서 검출되었으며, PRV는 검출되지 않았다. PCMV 및 PCV의 조합된 경우는 8개의 시료(26.7%)에서 확인되었다.

본 발명에 따르면, 돼지로부터 신속하고 저렴하게 이종이식과 관련된 세 가지 바이러스인 PRV, PCMV 및 PCV를 검출할 수 있다. 또한 본 발명을 통한 효과적인 진단을 통해서 이종이식과 관련된 다른 분야의 다른 연구에도 긍정적인 파급효과가 나타날 것이다. 특히, 무균돼지 생산시 돼지에서 바이러스성 병원체들을 경제적으로 스크리닝할 수 있다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims

서열번호 1의 뉴클레오티드 서열을 갖는 G1 프라이머 및 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열을 갖는 G2 프라이머를 포함하는 PRV(슈도레이비스바이러스)의 gG(당단백질 G) 유전자 증폭용 프라이머 세트;

서열번호 3의 뉴클레오티드 서열을 갖는 B1 프라이머 및 서열번호 4의 뉴클레오티드 서열을 갖는 B2 프라이머를 포함하는 PCMV(사이토메갈로바이러스)의 gB(당단백질 B) 유전자 증폭용 프라이머 세트; 및

서열번호 5의 뉴클레오티드 서열을 갖는 pcv1 프라이머 및 서열번호 6의 뉴클레오티드 서열을 갖는 pcv2 프라이머를 포함하는 PCV(써코바이러스)의 ORF1(open reading frame 1) 유전자 증폭용 프라이머 세트를 포함하는, PRV, PCMV 및 PCV에 특이적인 다중 PCR 프라이머 세트.
바이러스를 포함하는 시료로부터 바이러스 게놈 DNA를 추출하는 단계; 및

얻어진 게놈 DNA를 주형으로 하고 제1항에 따른 다중 PCR 프라이머 세트를 프라이머로 한 다중 PCR을 수행하는 단계를 포함하는, 시료 중에 PRV, PCMV 및 PCV로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 바이러스의 존재 또는 부존재를 검출하는 방법.
제2항에 있어서, 상기 다중 PCR 산물의 크기를 분석하는 단계를 더 포함하 는, 시료 중에 PRV, PCMV 및 PCV로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 바이러스의 존재 또는 부존재를 검출하는 방법.
제2항에 있어서, 상기 다중 PCR은 93.5℃ 내지 94.5℃에서 43초 내지 47초, 59.5℃ 내지 60.5℃에서 43초 내지 47초, 71.5℃ 내지 72.5℃에서 58초 내지 62초를 30회 내지 34회 반복하는 단계를 포함하는 방법.
제1항에 따른 다중 PCR 프라이머 세트; dNTP 혼합물(dATP, dCTP, dGTP, dTTP); 내열성 중합효소; 및 PCR 완충액을 포함하는, 시료 중에 PRV, PCMV 및 PCV로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 바이러스의 존재 또는 부존재를 검출하는 키트.