CN103103249B - Q热贝纳柯克斯体TaqMan荧光定量PCR检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种Q热贝纳柯克斯体Taqman荧光定量PCR检测方法，其上游引物为：5’-GGGGTAAAGTGATCTACAC-3’；下游引物为：5’-CCCATAAACGTCCGATAC-3；探针为：5’-TCAGTATGTATCCACCGTAGCCA-3；其中所述探针的5’端用报告荧光染料标记，3’端用淬灭荧光染料标记。本发明建立了可以简便快速、准确检测Q热贝纳柯克斯体的荧光定量PCR检测方法，有利于区分Q热贝纳柯克斯体和其他病原体，对人和动物Q热诊断具有重要意义。

Description

Q热贝纳柯克斯体TaqMan荧光定量PCR检测方法

技术领域

本发明涉及一种Q热贝纳柯克斯体检测方法，具体地说，涉及一种Q热贝纳柯克斯体TaqMan荧光定量PCR检测方法。

背景技术

Q热(Q fever)是由贝纳柯克斯体(Coxiella bumetii)感染所致的一种人兽共患的自然疫源性疾病，该病被国际动物卫生组织(OfficeInternational Des Epizooties，OIE)定为B类动物传染病，我国将其列为二类动物疫病。

贝纳柯克斯体(Coxiella bumetii)是Q热的病原体，也是重要的生物战剂和生物恐怖剂，其主要通过呼吸道以气溶胶形式进入体内引起人和动物感染。Q热一般无特异性临床症状，确诊主要依靠实验室检查，包括血清学检测和病原的分离与鉴定。特异性抗体的检出一般在发病2周以后，所以血清学检测不能用于Q热感染的早期诊断。由于贝纳柯克斯体不能在人工培养基上生长，需要靠动物接种、细胞培养等对贝纳柯克斯体病原进行分离。贝纳柯克斯体病原分离操作复杂，费时费力且成功率低。

聚合酶链式反应(PCR)是上个世纪90年代发展起来的一种简便、敏感、特异的检测病原体的分子生物学检测方法，也在Q热贝纳柯克斯体感染诊断中应用。目前，贝纳柯克斯体的快速检测与鉴定主要方法有Maurin，M.和Raoult，D.的PCR法，研究者根据16S rRNA、IS1111a以及com1、sod与16S rDNA特异性基因设计引物，广泛应用于PCR检测哺乳动物、节肢动物及患者等各种标本的Q热病原体。但是传统的PCR技术在应用中还存在着不足，一是不能准确定量，二是容易交叉污染，产生假阳性。

实时荧光定量PCR(real-time PCR)则可以结合传统PCR的优点并克服不足，实现检测结果和检测样品之间的定性和定量关系，从而可以根据需要对样品进行准确定量。另外，该技术不仅实现了对DNA模板的定量，而且具有灵敏度高、特异性和可靠性更强、能实现多重反应、自动化程度高、无污染性、具实时性和准确性等特点，目前已广泛应用于分子生物学研究和医学研究等领域。

实时荧光定量PCR最突出的优点就是可以对核酸样品进行精确定量。TaqMan探针技术是由美国Perkin Elmer(PE)公司研发的一种实时PCR技术，它在一条20～24bp左右的寡核苷酸探针的5′端标记荧光报告基团(Reporter，R)，3′端标记荧光淬灭基团(Quencher，Q)，其序列与两引物包含序列内的一段DNA模板完全互补。当这条探针保持完整时，Q和R基团由于距离很近(7～10nm)，Q基团将淬灭R基团发出的荧光信号，即报告基团发出的荧光能被淬灭基团所吸收。PCR反应后，随着链的延伸，Taq酶沿着DNA模板移动到荧光标记探针结合位置，发挥其5′-3′外切核酸酶活性，将荧光探针切断，Q基团由于距离较远而失去对报告荧光的淬灭作用，R基团的荧光信号得以释放而被检测仪所捕获。如果在PCR过程中，探针序列与模板序列不能互补，探针仍然是游离的，未杂交的探针仍然保持完整，荧光信号也就不能被检测到，从而保证了扩增的特异性。模板每复制一次，就有一次荧光信号的释放，通过该技术可以对模板进行准确定量。常用的荧光报告基团有FAM、JOE、HEX、Texas-Red等，淬灭基团有TAMRA，Eclipse等。

由于采用了荧光和淬灭基团双末端标记，因此淬灭难以彻底，本底较高。针对此问题，2000年美国ABI公司推出了一种新的TaqMan-MGB探针。探针3’端采用了非荧光性的淬灭基团，吸收报告基团的能量后并不发光，大大降低了本底信号的干扰。同时探针上还连接有MGB(minor groove binder)修饰基团，可以将探针Tm值提高10℃左右。使得较短的探针同样能达到较高的Tm值并且短探针的荧光报告基团和淬灭基团的距离更近，淬灭效果更好，荧光背景更低，使得信噪比更高。另外，较短的探针也降低了成本，还使得探针设计的成功率大为提高。因为在模板的DNA碱基组成不理想的情况下，短的探针比长的更容易设计。

目前，在国内外已有应用于贝纳柯克斯体的诊断、疗效评价、药敏试验以及乳制品的质量监测。Klee等人应用此法与IFA法、captureELISA、普通PCR法、巢式PCR相比较说明荧光定量PCR的结果更加客观可靠，重复性好，灵敏度高，特异性好，操作简单，污染少，耗时短。张晶波等人根据贝氏柯克斯体特异的23S rRNA插入基因序列(intervening sequence，IVS)设计引物和探针，以克隆的23S rRNA插入基因片段作DNA模板，在荧光定量检测仪上建立实时荧光定量检测方法。结果建立的定量标准曲线的循环阈值(Ct)与模板拷贝数呈良好的线性关系；与套式PCR相比较，荧光定量PCR检测敏感性是其100倍。用荧光定量PCR检测其它相关立克次体，检出结果均为0。亚红祥等人根据贝纳柯克斯体IS1111a基因设计引物和探针，以克隆的IS1111a基因片断(485bp)作标准DNA模板，建立实时荧光定量PCR检测方法，并与普通巢式PCR方法进行比较。结果实时荧光定量PCR的灵敏度为巢式PCR的10倍。

但是由于PCR是一种敏感的定性检测方法，如检测样本或试剂受到微量目的DNA污染后很容易产生假阳性结果，严重影响检测结果的可靠性。因此，急需建立快速、敏感、稳定可靠的Q热贝纳柯克斯体特异性检测方法。

由于TaqMan荧光定量PCR技术具有特异性强、操作简便等优点，近年来在研究领域被广泛采用，本研究拟运用实时荧光定量PCR技术建立检测贝纳柯克斯体的TaqMan探针法为Q热贝纳柯克斯体检测试剂盒的研发奠定基础。

发明内容

本发明的目的是提供Q热贝纳柯克斯体Taqman荧光定量PCR检测方法。

为了实现本发明目的，本发明提供一种Q热贝纳柯克斯体Taqman荧光定量PCR检测用引物及探针，其上游引物为：5’-GGGGTAAAGTGATCTACAC-3’；下游引物为：5’-CCCATAAACGTCCGATAC-3；探针为：5’-TCAGTATGTATCCACCGTAGCCA-3；所述探针的5’端用报告荧光染料标记，3’端用淬灭荧光染料标记。

其中，所述的报告荧光染料为报告荧光染料FAM，淬灭荧光染料为淬灭荧光染料Eclipse。

本发明还提供含有上述引物及探针的检测试剂盒。

本发明进一步提供利用上述引物及探针检测Q热贝纳柯克斯体的方法，包括以下步骤：

1)目的基因的扩增

以Q热贝纳柯克斯体基因组DNA为模板，进行PCR反应，回收PCR扩增产物；

2)目的基因的克隆

将步骤1)的目的基因连接在PGEM-T easy载体上并转化至大肠杆菌感受态细胞，筛选阳性转化子，进行PCR检测并测序，提取阳性重组质粒，计算重组质粒的拷贝数；

3)Taqman荧光定量PCR检测

以阳性重组质粒DNA为模板，利用引物及探针，其中，上游引物为：5’-GGGGTAAAGTGATCTACAC-3’；下游引物为：5’-CCCATAAACGTCCGATAC-3；探针为：5’-FAM-TCAGTATGTATCCACCGTAGCCA-Eclipse-3，进行Taqman荧光定量PCR检测。

上述方法，所述Taqman荧光PCR扩增条件为95℃预变性3min；然后采用二步法进行反应：95℃，15s；60.6℃，45s；收集荧光；共45个循环。

上述方法，引物用量优选为1μL，探针用量优选为0.5μL，引物和探针的终浓度分别为0.4μM和0.2μM。

上述方法，步骤(1)目的基因的扩增所用引物为：

上游引物：5’-CAATGAAATGGACCCACC-3’，

下游引物：5’-ATCGCGTATCTTTAACAGC-3’。

本发明至少具有下列优点及有益效果：

(1)本发明应用blast对测序后的序列进行了同源性分析，其扩增序列与原序列有99％的同源性，通过琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，其扩增的片段大小与预期大小一致，说明所扩增的片段为目的片段，可以用于对Q热贝纳柯克斯体的检测，用含有目的片段的质粒做标准质粒，并且通过计算得出其拷贝数，进行准确定量，提高了建立Q热贝纳柯克斯体检测方法的准确性。

(2)本实验建立了TaqMan荧光定量PCR法，制作出了标准曲线。曲线的相关系数为0.995，大于0.98，说明曲线线性关系很好。经计算扩增效率在0.8到1.2之间，说明扩增效率很高，可用于定量未知样品，通过Ct值得出样品初始拷贝数。

(3)本发明根据130bp对Q热贝纳柯克斯体的高度特异性，建立了可以简便快速、准确检测Q热贝纳柯克斯体的荧光定量PCR检测方法，有利于区分Q热贝纳柯克斯体和其他病原体，对人和动物Q热贝纳柯克斯体的防控和治疗、Q热得临床检测具有重要意义。

(4)本发明的TaqMan探针法能够更灵敏的检出10¹拷贝数阳性质粒。TaqMan探针法与传统PCR相比，灵敏度提高1000倍。

附图说明

图1为本发明Q热贝纳柯克斯体基因组DNAPCR扩增电泳结果，1为目的产物，2为阴性对照；

图2为本发明PCR产物克隆测序序列与GenBank中IS1111基因B1ast比对结果；

图3为本发明不同退火温度与荧光信号强度关系曲线；

图4为本发明引物和探针的不同使用量与荧光信号强度关系曲线；

图5为本发明IS1111标准质粒的扩增曲线(左)与标准曲线(右)；

图6为本发明IS1111序列特异性实验结果曲线；

图7为本发明血液样品DNA的检测结果图。

具体实施方式

下面结合实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1  Q热贝纳柯克斯体标准质粒的构建

1实验材料

1.1菌液、核酸、载体及宿主

Q热标准株菌已在Chen C等，2009 Clin.Microbiol.infect.15：2：156-157中公开，其菌株由本实验室保存。PGEM-T Easy载体由Promega公司生产，DH5α购自北京天根生物技术有限公司。

1.2试剂及试剂盒

1.3主要试剂的配制

(1)LB液体培养基：

胰化蛋白胨(Tryptone)         10g

酵母提取物(Yeast Extract)    5g

NaCl                         10g

以上试剂溶于900mL去离子水，用5mol/L氢氧化钠调pH7.0，定容到1000mL，121℃高温湿热灭菌20min，4℃保存。

(2)氨苄青霉素Amp贮存液(100mg/mL)：1g氨苄青霉素溶解于10mL双蒸水中，0.22μm微孔滤膜过滤除菌，分装后-20℃保存。

(3)Amp抗性液体培养基：在灭菌的LB液体培养基中加入Amp贮存液至终浓度为50μg/mL，4℃保存。

(4)Amp抗性固体培养基：琼脂粉1.5g溶于100mLLB液体培养基中，121℃灭菌20min，冷却至50℃左右，加入Amp至终浓度为50μg/mL，浇制平板，无菌检验后4℃贮存备用。

(5)IPTG(20％，m/V，0.8mol/L)：在8mL蒸馏水中溶解2g IPTG，用蒸馏水定容至10ml，0.22μm滤器过滤除菌，分装成1ml小份于-20℃冰箱保存备用。

(6)X-Gal(20mg/mL)：称取1g X-Gal置于5OmL容量瓶中，加入40mL DMF(二甲基甲酰胺)，充分混匀溶解后定容至50mL，用0.22μm过滤器过滤除菌，分装成1mL每小份，并用铝箔纸包裹，然后置于-20℃冰箱保存备用。

(7)电泳缓冲液(50×TAE贮存液)：称取Tris 242g，冰乙酸57.1mL，加入100mL 0.5mol/L EDTA溶液(pH8.0)，定容至1L，用前以蒸馏水稀释为1×工作液。

(8)SYBR Green I染料(电泳级)工作液：取TAE电泳工作缓冲液与SYBR Green I染料以1∶3的比例配置。

1.4仪器

2方法

2.1引物的设计与合成

根据Genbank发表的Q热贝纳柯克斯体编码转位酶的IS1111基因序列(索取号M80806)，应用Primer premer5.0软件设计PCR的引物，使用BLAST检索，确认各引物的特异性。引物退火温度为51.4℃。引物由上海英骏生物技术有限公司合成。Q热贝纳柯克斯体的普通PCR引物如下：

F：5’-CAATGAAATGGACCCACC-3’

R：5’ATCGCGTATCTTTAACAGC-3’

扩增片段大小：463bp

2.2标准质粒的构建

2.2.1目的基因的扩增

以Q热贝纳柯克斯体基因组DNA为模板，用普通PCR引物，扩增出IS1111序列的目的片段。在0.2mLPCR管中加入以下试剂，反应体系(25μL)如下：

将上述液体混匀后放入PCR扩增仪中按以下程序进行扩增：

反应结束后，产物经0.8％的琼脂糖凝胶电泳鉴定片段大小，与标准DNA Marker条带进行比较，如果与引物所限定的目的片段大小一致，则可进行后续实验。

2.2.2PCR产物的回收

用OMEGA公司的Gel extraction kit对普通PCR产物进行切胶回收，步骤如下：

(1)将PCR产物进行0.8％的琼脂糖凝胶电泳；

(2)在紫外透照台上将目的片段快速切下，放入已经称重的两个1.5mL离心管中，然后称重，得出胶块的重量；

(3)根据胶重按每毫克加一微升的量加入Binding Buffer，放55-65℃金属浴中加热直至胶完全溶解，期间每隔2-3min振荡混合，使之充分融化；

(4)吸取200μLBuffer GPS平衡缓冲液至装有Hibind DNA结合柱的2mL收集管，室温放置3-5min，室温下12000xg离心2min，弃掉收集管中滤液，将柱子重新装回收集管；

(5)将溶胶转入结合柱中，室温下10000xg离心1min；

(6)弃掉滤液，向结合柱加入300μL Binding Buffer，10000xg离心1min

(7)弃掉滤液，向结合柱中加入700μL SPW Wash Buffer(含无水乙醇)，10000xg离心1min；

(8)弃掉滤液，重复(7)一次；

(9)弃掉滤液，13000xg离心2min，将液体甩干。

(10)将结合柱转移至一新的1.5mL离心管中，加入30μL ddH₂O或Elution Buffer于结合柱中，室温静置2min，13000xg离心1min，弃掉结合柱，管中为回收的DNA片段，置于-20℃保存；

(11)取2μL回收的DNA，用微量分光光度计测定其浓度和纯度。

2.2.3目的基因的克隆

(1)连接

将切胶回收目的片段连接在PGEM-T Easy载体上，依次加入以下试剂，连接反应体系(10μL)如下：

置于16℃恒温水浴箱连接过夜。

(2)连接产物的转化

①将感受态细胞从-80℃冰箱中取出之后置于冰上融化；

②取5μL连接产物加入融化后的感受态细胞中，轻轻混匀；

③冰浴30min；

④42℃水浴热激90s，再在冰上冷激2min；

⑤加入800μL无氨苄抗性的经37℃预热的LB液体培养基，37℃，150r/min震荡培养90min；

⑥3000r/min离心2min，弃掉部分上清，留下约50μL液体，然后重悬，加入7μL IPTG和40μL X-gal，用涂布棒涂布于有氨苄青霉素抗性的LB固体培养基平板上，置于37℃恒温培养箱中倒置培养约12～16小时，然后进行蓝白斑鉴定。

2.2.4重组质粒的筛选与鉴定

(1)挑取白斑于5mL含有氨苄青霉素抗性的LB液体培养基，37℃200r/min振荡培养12-16个小时；

(2)以培养好的菌液为模板分别进行PCR鉴定；

(3)将PCR测定为阳性的菌液进行保菌，取700μL菌液加300μL灭菌甘油于1.5mL离心管中，混匀并标记后放入-80℃冰箱中保存待用；

(4)将PCR鉴定阳性的菌液进行测序，测序由北京诺赛基因组研究中心有限公司完成。

2.2.5重组质粒的提取

将测序阳性的菌液用OMEGA公司的Plasmid mini kit I进行阳性质粒的提取，步骤如下：

(1)取测序阳性的保存菌液200μL于3mL有氨苄青霉素抗性的LB液体培养基中，37℃ 200r/min振荡培养12-16个小时；

(2)取2mL菌液于1.5mL离心管中，室温下10000xg离心1min；

(3)弃掉上层培养液，向细菌沉淀中加入250μL Solution I(含RNase A)，进行彻底地涡旋混匀。

(4)加入250μL Solution II，上下颠倒4-6次，轻轻混匀，室温下温育2min；

(5)加350μL Solution III，轻轻混匀至出现白色絮状物，然后室温下13000xg离心10min；

(6)小心转移上清液到一个2mL的装有DNA结合柱的收集管中(DNA结合柱的平衡方法同切胶回收)，注意不要吸进沉淀，室温下10000xg离心1min；

(7)弃滤液，加500μL Buffer HB，10000xg离心1min，除去蛋白；

(8)弃滤液，加700μL DNA Wash Buffer(含无水乙醇)，10000xg离心1min；

(9)弃滤液，重复(8)一次；

(10)弃滤液，13000xg离心2min，将液体甩干；

(11)将结合柱转移至一新的1.5mL离心管中，加入30μL ddH2O或Elution Buffer于结合柱中，室温静置2min，13000xg离心1min，弃掉结合柱，管中为提取的质粒DNA，置于-20℃保存；

(12)取2μL质粒DNA，用微量分光光度计测定其浓度和纯度。

2.2.6质粒拷贝数的计算和稀释

通过测出的阳性质粒浓度，计算重组质粒的拷贝数。公式如下：

拷贝数＝质粒浓度(g/μL)×加样体积×阿氏常数/(质粒总长度×一个碱基对的平均分子量)。

3结果与分析

3.1PCR扩增电泳结果

以提取的Q热贝纳柯克斯体基因组DNA为模板，用IS1111序列的普通PCR引物进行PCR扩增，产物经0.8％的琼脂糖凝胶电泳检测，以DL2000 DNA Marker为标准，从图1结果中可以看出，扩增出的特异性片段，与预期的大小一致，IS1111序列的普通PCR扩增产物大小近似463bp。可以进行后续实验。

3.2菌液序列测定及相似性分析

对制得的菌液测序，经NCBI BLAST比对，所克隆IS1111基因序列与GenBank登陆的序列有99％的同源性，证明目的序列已成功重组入载体质粒。比对结果如图2所示。

3.3质粒浓度及纯度测定

微型紫外分光光度计测定质粒DNA浓度为127.4ng/μL其OD₂₆₀/OD₂₈₀比值为1.82，符合要求。

3.4质粒拷贝数计算结果

拷贝数＝质粒浓度(g/μL)×加样体积×阿弗加德罗常数/(质粒总长度×一个碱基对的平均分子量)，阿弗加德罗常数(每mol的微粒数)是6.02×10²³拷贝/mol，一个碱基对的平均分子量是660道尔顿，最后根据拷贝数将质粒进行10倍的倍比稀释。

PGEM-T Easy载体长度为3015bp，IS1111序列的目的片段长度463bp，计算如下：

IS1111序列质粒拷贝数为：

124.7ng/μL×10^-9×1μL×6.02×10²³/(3015+463)×660＝3.24×10¹⁰copy。

4小结

(1)本研究根据Q热贝纳柯克斯体特有的IS1111序列设计普通PCR引物，经PCR扩增出463bp的目的片段，然后将目的片段与pGEM-T Easy载体连接，转入感受态细胞DH5α，进行蓝白斑筛选并挑取白斑摇菌，通过测序表明该重组质粒序列正确，为阳性重组质粒，作为标准质粒DNA，可用于后续实验。

(2)用R＝OD₂₆₀/OD₂₈₀来检测DNA样品的纯度。若样品DNA的比值大于2.0，则说明样品中存在RNA，可以考虑用RNase酶处理样品；如果其比值小于1.8，则说明样品中存在蛋白质或酚污染。本实验测定OD₂₆₀/OD₂₈₀比值为1.82，符合要求。

实施例2  Q热贝纳柯克斯体TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立

1实验材料

1.1菌液、核酸

经测序后的带阳性质粒菌液，由实施例1制备。康氏立克次体(Rickettsia conorii)、立氏立克次体(Rickettsia rickettsii)、莫氏立克次体(Rickettsii mooseri)、普氏立克次体(Rickettsia prowazekii)DNA均由本实验室保存。

1.2试剂及仪器

2方法

2.1引物的设计与合成

根据已发表的Q热贝纳柯克斯体的插入序列IS1111，应用Primerpremer5.0软件设计荧光定量PCR的引物和探针。引物、探针由上海英骏生物技术有限公司合成。

FF1：5’-GGGGTAAAGTGATCTACAC-3’

FR1：5’-CCCATAAACGTCCGATAC-3

P：5’-FAM-TCAGTATGTATCCACCGTAGCCA-Eclipse-3’

扩增产物片段大小：130bp

2.2 Q热贝纳柯克斯体TaqMan荧光定量PCR方法的初步建立

取1μL提取的标准质粒DNA作为模板，按照如下体系配置阴性对照，以无菌水代替质粒DNA模板进行，PCR Mix反应体系(25μL)如下：

反应液配好后，瞬时离心，将样品管放入Bio-Rad公司的miniopticon PCR仪，用Opticon Monitor 3软件进行程序设置及结果分析，PCR反应程序如下：

2.2.1PCR反应条件的优化

2.2.1.1退火温度的优化

根据引物Tm值，退火温度按57.7℃、58.9℃、60.6℃、62.6℃、64.2℃、65.4℃、66.0℃依次递增，进行退火温度的优化，选择最佳退火温度进行后续实验。

2.2.1.2引物和探针浓度的优化

将上下游引物(10μM)按体积比1∶1混合，依次加0.6μL、1μL、1.4μL、2μL、2.6μL、3.4μL、4μL，探针(10μM)依次加0.3μL、0.5μL、0.7μL、1μL、1.3μL、1.7μL、2μL同时进行优化，根据最大ΔRn值和最小Ct值确定最佳引物用量。

2.2.2敏感性检测

将IS1111的阳性重组质粒，按10¹～10⁷ copies/μL浓度梯度进行10倍倍比稀释，在最佳反应条件下同时扩增，每个稀释度均作重复，由计算机自动绘制一条标准曲线。根据曲线的荧光强度、斜率和相关系数等判定敏感性。

2.3特异性检测

分别用康氏立克次体、立氏立克次体、莫氏立克次体、普氏立克次体的核酸样品为模板，用IS1111序列的荧光定量PCR引物，在相同的条件下进行荧光定量PCR扩增，每次扩增设阴阳性对照，鉴定该引物的特异性。

2.4血液样品的检测

用建立的对Q热贝纳柯克斯体特异的TaqMan荧光定量PCR检测方法，对20份牛血液样品进行检测。

3结果与分析

3.1反应条件优化结果

3.1.1退火温度的优化结果

退火温度对PCR反应有一定的影响，温度越高，反应的特异性越强，但是扩增效率则会下降；反之，温度降低，虽然扩增效率有所提高，但是特异性却可能受到影响。PCR反应过程中，如果退火温度过低就会产生非特异性扩增，一般来讲，应选择较高的退火温度，以减少引物和模板之间的非特异结合，提高PCR反应的特异性。

不同退火温度与荧光信号强度关系曲线如图3所示，不同退火温度与对应Ct值如下所示，结合表和图可以看出57.7℃扩增效率最高，因而57.7℃为最佳退火温度。

退火温度(℃)  57.7  58.9   60.6   62.6   64.2  65.4 66

Ct值          24.96 25.11  25.63  26.86  36.36 N/A  N/A

3.1.2引物、探针浓度的优化结果

引物的浓度是一个影响PCR反应的关键因素，若浓度太低，会致使反应不完全，若引物太多，则发生错配以及产生非特异性产物的可能性会大大增加，还会使背景荧光值增加。非特异性产物和引物二聚体也多与靶序列竞争DNA聚合酶、dNTP底物，从而使靶序列的扩增量降低。引物和探针的不同使用量与荧光信号强度关系曲线如图4所示，引物和探针的不同使用量与对应Ct值如下所示，根据最大荧光信号强度和最小Ct值综合考虑，确定本发明的最佳引物用量为1μL，探针用量为0.5μL，引物和探针的终浓度分别为0.4μM和0.2μM。

引物优化(μL)  0.6    1      1.4    2      2.6    3.4    4

探针优化(μL)  0.3    0.5    0.7    1      1.3    1.7    2

Ct值           27.04  26.75  27.50  26.73  26.69  26.30  26.36

3.2标准曲线的建立及灵敏度检测

如图5(左)所示，为S1111标准质粒的扩增曲线，其中横轴代表Ct值，纵轴代表荧光值。图中曲线组由左向右所代表的起始浓度成10倍依次递减，最右边为空白对照。

如图5所示(右)，为S1111标准质粒的标准曲线，其中横轴表示Ct值，纵轴表示起始模板浓度(lg)。将标准质粒进行10倍梯度稀释，取7个浓度的稀释样品做模板。

相关系数＝0.995(＞0.98)，表明不同梯度定量模板的对数值与Ct值之间呈现良好的线性关系，由PCR扩增通式可知标准曲线的斜率为-log(1+E)，即扩增效率E＝10^-斜率-1＝10^-(-03089)-1＝1.03  (1.2＞E＞0.8)，拷贝数与Ct值之间的线性关系表达式为Y＝-0.3089X+12.79。

IS1111序列质粒DNA不同稀释倍数与对应Ct值如下：

粒DNA拷贝数  10¹    10²    10³   10⁴   10⁵   10⁶    10⁷

Ct值         37.44  34.98  32.03 29.23 25.36 21.60  18.52

3.3特异性检测

用建立起来的TaqMan荧光定量PCR法分别检测了康氏立克次体、立氏立克次体、莫氏立克次体、普氏立克次体的DNA样本，结果均未见荧光信号，呈阴性，表明特异性很好，用IS1111序列的这对引物和探针可以检测到Q热贝纳柯克斯体。IS1111序列特异性实验结果曲线如图6所示。

3.4血液样品的检测结果

血液样品DNA的检测结果如图7所示，最左边的一条扩增曲线为阳性对照，最右边没有扩增的一条为阴性对照，其余为20份血液样品的DNA，检出率为0％，说明这20份血液样品均未感染Q热。

4小结

(1)将IS1111阳性重组质粒用ddH₂O进行10倍倍比稀释，获得10¹～10⁷拷贝的标准质粒。然后用IS1111序列的特异性引物和探针进行荧光定量PCR，用PCR Mix建立标准曲线，同时完成了敏感性测定。结果得出使用PCR Mix时曲线方程Y＝-0.3089X+12.79，相关系数0.995，扩增效率103％，检测到10个拷贝。

(2)对康氏立克次体、立氏立克次体、莫氏立克次体、普氏立克次体的DNA样本用建立的TaqMan荧光定量PCR法检测，检测结果表明，该方法具有较强的特异性。TaqMan探针法能够更灵敏的检出10¹拷贝数阳性质粒。TaqMan探针法与传统PCR相比，灵敏度提高1000倍。

(3)对20份牛血液样品DNA进行TaqMan荧光定量PCR检测，阳性检出率为0％，说明这20份牛血液中不存在Q热贝纳柯克斯体。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (3)

1.一种Q热贝纳柯克斯体Taqman荧光定量PCR检测用引物及探针，其上游引物为：5’-GGGGTAAAGTGATCTACAC-3’；下游引物为：5’-CCCATAAACGTCCGATAC-3’；探针为：5’-TCAGTATGTATCCACCGTAGCCA-3’；所述探针的5’端用报告荧光染料标记，3’端用淬灭荧光染料标记。

2.如权利要求1所述的引物及探针，其特征在于，所述的报告荧光染料为报告荧光染料FAM，淬灭荧光染料为淬灭荧光染料Eclipse。

3.一种含权利要求1或2所述引物及探针的检测试剂盒。

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