TWI681056B - 用於偵測微小脲原體血清型3的引子對及其套組 - Google Patents

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本發明提供一種用於偵測微小脲原體血清型3（Ureaplasma parvum serovar 3，UP-3）的引子對，其DNA序列如SEQ ID NO: 1及SEQ ID NO: 2所示。本發明之引子對可用於UP-3泌尿生殖系統感染的快速檢驗，以及感染引發的相關病症的風險評估。亦提供一種用於UP-3之PCR偵測之套組，其包含本發明之引子對。

Description

用於偵測微小脲原體血清型3的引子對及其套組
本發明係關於微小脲原體血清型3之核酸檢測方法，特別是用於偵測微小脲原體血清型3的引子對及其套組。
尿漿菌感染為泌尿生殖系統最常見之細菌感染，感染後常引起泌尿生殖系統相關之疾病如前列腺炎、陰道炎、尿道炎及不孕等，孕婦若感染尿漿菌，自然流產、早產、絨毛膜羊膜炎 (chorioamnionitis) 等疾病之風險將提高[1]，若進一步經由羊水進入嬰兒口、鼻、肺部，恐引起小兒肺支氣管發育不全 (bronchopulmonary dysplasia，BPD)、呼吸窘迫症候群 (respiratory distress syndrome，RDS) 或甚至新生兒死亡等[1-3] 。
因其潛伏期長且多無症狀，據估計，健康成年女性子宮頸或陰道感染尿漿菌之比例約為40至80% [2, 4]，孕婦由於妊娠期間荷爾蒙改變，抑制免疫反應，導致更容易受到尿漿菌之感染，而由母親垂直感染至新生兒之比例更達90%[2]。
尿漿菌 (Ureaplasma spp.) 分類上屬於柔膜菌綱 (Mollicutes)、支原體目 (Mycoplasmatales)、支原體科 (Mycoplasmataceae)、尿漿菌屬 (Genusureaplasma )，包括微小脲原體 (Ureaplasma parvum )及溶脲脲原體 (Ureaplasma urealyticum ) [2]，目前依據尿漿菌表面之多帶抗原 (Multiple banded antigen，MBA)可區分成14種血清型[2, 5]，其中4種屬於微小脲原體 (血清型 1、3、 6及14)，其他10種屬於溶脲脲原體 (血清型2、4、5及7-13)[1]。
特定血清型之尿漿菌常被探討其盛行率、抗藥性、致病性、侵入性、早產併發症及特定疾病之關聯性等[6-8]，Sung等人研究發現微小脲原體血清型3(UP-3)以及溶脲脲原體血清型10多在具有嚴重BPD及死亡之嬰兒之呼吸道分泌物中發現[4]，而Naessens等人提出溶脲脲原體血清型4常在反覆性流產之孕婦上發現[6]，顯示尿漿菌血清型之分型與辨別有助於釐清其致病機轉及流行病學研究。
尿漿菌檢測較常應用於婦女泌尿生殖道感染及新生兒呼吸道感染，檢測方法包含傳統培養法、聚合酶連鎖反應法(PCR)、即時定量聚合酶連鎖反應(real-time PCR)等，其中傳統培養法耗時、專一性與靈敏度較低。
即時定量聚合酶連鎖反應主要利用螢光染劑及聚合酶連鎖反應進行即時監測反應產物量，聚合酶連鎖反應以DNA聚合酶 (例如Taq聚合酶) 延長專一性引子所黏合之區域而合成新的雙股DNA。而螢光染劑可搭配Taqman探針或SYBR Green I等， 使用SYBR Green I具有快速、易操作及靈敏度佳之優勢[9]。
目前坊間診所及醫院檢驗科多以即時定量聚合酶連鎖反應法提供相關服務，可利用尿素酶 (urease) 基因片段為偵測目標設計引子，針對微小脲原體及溶脲脲原體之偵測極限分別為107 及104 複製體(copies)/mL。
中國 CN102094072 A 號專利揭示一種SYBR Green法檢測溶脲脲原體感染的PCR試劑盒。中國 CN10149726 B號專利則揭示一種快速同步檢測沙眼衣原體、微小脲原體和溶脲脲原體的試劑盒。
仍需要能夠專一地檢測特定血清型之微小脲原體或溶脲脲原體之核酸檢測方法。
在一方面，本發明提供一種用於偵測微小脲原體血清型3（Ureaplasma parvum serovar 3，UP-3）的引子對，其DNA序列如SEQ ID NO: 1及SEQ ID NO: 2所示。本發明之引子對能夠達成快速、穩定、具靈敏度、可準確定量與鑑別尿漿菌特定血清型 (UP-3) 的核酸診斷。
本發明之引子對由一正向引子及一反向引子組成，該正向引子為5’- GAAGCTTATATTGACTAAGAACTA-3’（序列如SEQ ID NO: 1所示），該反向引子為5’- GCATCTAAGGCACACATA-3’ （序列如SEQ ID NO: 2所示）。
本發明之引子對可用於PCR或RT-PCR。在本發明之一較佳具體實施例中，所述引子對配合SYBR Green I染劑而用於RT-PCR。
另一方面，本發明提供一種用於UP-3之PCR偵測之套組，其包含如上述之引子對。在本發明部分具體實施例中，該套組更包含一DNA結合染劑，例如，一SYBR Green I染劑。
應了解先前之一般描述及以下之詳述兩者皆僅為示例性及解釋性且並不限制本發明。
以下詳細描述都僅為示例性及解釋性的，而非對本發明之限制。
本發明提供一種用於偵測微小脲原體血清型3（Ureaplasma parvum serovar 3，UP-3）的引子對，其由一正向引子及一反向引子組成，該正向引子為5’- GAAGCTTATATTGACTAAGAACTA-3’（序列如SEQ ID NO: 1所示），該反向引子為5’- GCATCTAAGGCACACATA-3’ （序列如SEQ ID NO: 2所示）。
本發明之引子對可用於PCR或RT-PCR。在本發明之一較佳具體實施例中，所述引子對配合SYBR Green I 染劑而用於RT-PCR分析，具有可準確定量及專一地辨別UP-3之優勢，其準確定量範圍廣 (105 -1010 複製體/mL)、靈敏度高 (偵測極限為104 複製體/mL)。
另一方面，本發明提供一種用於UP-3之PCR偵測之套組，其包含如上述之引子對。根據本發明之部分具體實施例，該套組進一步包含一DNA結合染劑。所述DNA結合染劑包括但不限於：SYBR Green I、SYBR Green II、GelStar及SYBR Gold染劑，或其衍生物。
在本發明之較佳具體實施例中，所述PCR為RT-PCR，在一具體實施例中，該DNA結合染劑為一 SYBR Green I染劑。
本發明之引子對或套組能夠達成快速、穩定、具靈敏度、可準確定量與鑑別尿漿菌特定血清型 (UP-3) 的核酸診斷。此外，本發明之引子對或套組可用於UP-3感染及UP-3感染引起之疾病之風險評估試驗，所述UP-3感染引起之疾病包括但不限於小兒肺支氣管發育不全 (Bronchopulmonary dysplasia，BPD) 及其嚴重程度、腦膜炎、腦缺損疾病…等。
本發明透過以下實例進一步說明，其提供作為例示之用而非限制本發明。
下列實施例中未註明具體實驗條件和方法，通常按照常規條件，例如Sambrook等人主編之分子克隆：實驗室手冊 (New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) 中所述之條件，或參照試劑製造商所建議之條件及步驟。
實例
實例 1 ：微小脲原體血清型 3 之定量範圍及靈敏度分析
將微小脲原體血清型3（UP-3）陽性質體模板進行10倍序列稀釋為1011 複製體/mL、1010 複製體/mL、109 複製體/mL、108 複製體/mL、107 複製體/mL、106 複製體/mL、105 複製體/mL、104 複製體/mL及陰性控制組(non-template control，NTC)。所述UP-3陽性質體模板係將UP-3菌株 (美國標準菌株保存中心ATCC編號27815) 之特定152 bp (NCBI序列編號NC_010503.1的第108809-108960 bp) 序列插入pUC57質體以製備得到。
陰性控制組及UP-3陽性質體模版每濃度分別取5.0 μL，加入聚合酶反應液 (2X，包含SYBR Green I染劑) 10.0 μL，SEQ ID NO: 1之正向引子1.0 μL (終濃度 0.5 μM)，SEQ ID NO: 2之反向引子 1.0 μL (終濃度0.5 μM)，再以雙蒸水 (ddH2 O) 將每反應管反應總體積調整至20 μL，同一濃度進行三反應管之重複試驗。
在即時定量聚合酶反應儀進行檢測，儀器條件設定為：於50o C、2分鐘及95o C、10分鐘下進行1 次循環的預備程序，接著以95o C、15秒及60oC 、1分鐘之條件進行40次循環的擴增程序，最後於95oC 下持續15秒及60o C下持續1分鐘，並以每秒0.15o C之速度上升至95oC 進行熔解曲線 (melting curve) 測試。
檢測結束後，以即時定量聚合酶反應儀搭配之軟體分析各組樣品經閾值界定後所得出之循環數 (Ct)。三重複結果平均為：1011 複製體/mL、1010 複製體/mL、109 複製體/mL、108 複製體/mL、107 複製體/mL、106 複製體/mL、105 複製體/mL及104 複製體/mL之Ct值分別為7.68、11.38、15.10、18.84、22.81、26.17、29.61及29.74，陰性對照組無擴增曲線產生。參見圖 1 。
將UP-3陽性質體模板濃度1011 複製體/mL、1010 複製體/mL、109 複製體/mL、108 複製體/mL、107 複製體/mL、106 複製體/mL、105 複製體/mL及其對應之Ct值進行迴歸分析，R2 為0.9993，如圖 2 所示，顯示此範圍濃度下可進行準確定量。
重複此操作試驗三次，PCR效率皆介於85-100%之間，線性迴歸R2 均高於0.99，定量範圍為1010 至105 複製體/mL，靈敏度可至104 複製體/mL，三次獨立試驗間(inter-assay) 及相同試驗三重複間 (intra-assay) 之精確度 (變異係數 = 標準差/平均值x100%) 小於15%，顯示不同批次間檢驗結果穩定，再現性高，見下表 1 。
表1. 三次獨立試驗分析之結果
Figure 106110283-A0304-0001
實例 2 ： 對 UP-3 之專一性之分析
如實例1所述之UP-3陽性質體模版各取5.0 μL，加入聚合酶反應液 (2X，包含SYBR Green I染劑) 10.0 μL，正向引子 1.0 μL (終濃度 0.5 μM)，反向引子 1.0 μL (終濃度0.5 μM)，再以雙蒸水 (ddH2 O) 將每反應管反應總體積調整至20 μL，同一濃度進行三反應管之重複試驗。
在即時定量聚合酶反應儀進行檢測，儀器條件設定為：於50o C、2分鐘及95o C、10分鐘下進行1次循環的預備程序，接著以95o C、15秒及60oC 、1分鐘之條件進行40次循環的擴增程序，最後於95oC 下持續15秒及60o C下持續1分鐘，並以每秒0.15o C之速度上升至95oC 進行熔解曲線 (melting curve) 測試。
檢測結束後，以即時定量聚合酶反應儀搭配之軟體分析熔解曲線圖，如圖 3 所示，結果為單一熔解曲線，表示引子對僅擴增單一產物，具有專一性。
實例 3 ：對 UP-3 之專一性之電腦分析
將本發明及相關前案之引子及探針，以NCBI提供之BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) 分析可偵測之尿漿菌血清型，結果見下表 2 。由結果可知，本發明之引子對能夠專一性地辨認UP-3，而不辨認其他血清型之尿漿菌。
表2. 比較本發明之引子與前案之引子或探針可偵測之尿漿菌血清型
Figure 106110283-A0304-0002
 *表示經BLAST分析可偵測之血清型。
熟悉本技術之人士應理解可對上述之實施例進行改變而不背離其廣泛之發明概念。因此，應了解本發明不受限於所揭示之特定實施例，而是意欲涵蓋在如申請專利範圍所定義之本發明之精神與範疇內之修改。
參考文獻： [1] Viscardi, Rose M. "Ureaplasma species: role in diseases of prematurity." Clinics in perinatology 37.2 (2010): 393-409. [2] Paralanov, V., et al. "Comparative genome analysis of 19 Ureaplasma urealyticum and Ureaplasma parvum strains." BMC microbiology 12.1 (2012): 88. [3] Kallapur, Suhas G., Boris W. Kramer, and Alan H. Jobe. "Ureaplasma and BPD." Seminars in perinatology. Vol. 37. No. 2. WB Saunders, 2013. [4] Sung, T. J., et al. "Frequency of Ureaplasma serovars in respiratory secretions of preterm infants at risk for bronchopulmonary dsyplasia." The Pediatric infectious disease journal 30.5 (2011): 379. [5] Kong, F., et al. "Species identification and subtyping of Ureaplasma parvum and Ureaplasma urealyticum using PCR-based assays." Journal of clinical microbiology 38.3 (2000): 1175-1179. [6] Naessens, A., et al. "Serotypes of Ureaplasma urealyticum isolated from normal pregnant women and patients with pregnancy complications." Journal of clinical microbiology 26.2 (1988): 319-322. [7] Quinn, P. A., et al. "Serologic evidence of Ureaplasma urealyticum infection in women with spontaneous pregnancy loss." American journal of obstetrics and gynecology 145.2 (1983): 245-250. [8] Zhang, Y., et al., “Ureaplasma urealyticum serotypes distribution and drug resistance.” Chinese journal of zoonoses 32.1 (2016): 45-50. [9] Ponchel, F., et al. "Real-time PCR based on SYBR-Green I fluorescence: an alternative to the TaqMan assay for a relative quantification of gene rearrangements, gene amplifications and micro gene deletions." BMC biotechnology 3.1 (2003): 18.
無
配合圖式閱讀可更佳也了解本發明如前之概述和以下之詳細說明。圖式中顯示目前較佳之實施例。
圖 1 顯示不同濃度下 (1011 -104 複製體/mL)之UP-3陽性質體模板及陰性控制組之擴增曲線圖 (amplification plot)。
圖 2 顯示1010 -105 複製體/mL濃度下UP-3陽性質體模板之線性迴歸。
圖 3 顯示不同濃度下之UP-3陽性質體模板及UP-3引子之熔解曲線圖 (melting curve plot)。
無
＜110＞ 宣捷幹細胞生技股份有限公司 ＜120＞ 用於偵測微小脲原體血清型3的引子對及其套組 ＜130＞ MRD0005TW ＜160＞ 2 ＜170＞ PatentIn version 3.5 ＜210＞ 1 ＜211＞ 24 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ 正向引子 ＜400＞ 1 gaagcttata ttgactaaga acta 24 ＜210＞ 2 ＜211＞ 18 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ 反向引子 ＜400＞ 2 gcatctaagg cacacata 18

Claims (5)

  1. 一種用於偵測微小脲原體血清型3的引子對，由一正向引子及一反向引子組成，該正向引子為5’-GAAGCTTATATTGACTAAGAACTA-3’(SEQ ID NO：1)，該反向引子為5’-GCATCTAAGGCACACATA-3’(SEQ ID NO：2)。
  2. 一種用於微小脲原體血清型3的PCR偵測的套組，其包含如請求項1所述之引子對。
  3. 如請求項2之套組，其更包含一DNA結合染劑。
  4. 如請求項3之套組，其中該PCR為RT-PCR。
  5. 如請求項4之套組，其中該DNA結合染劑為SYBR Green I染劑。
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